UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Biochemie, Fysiologie en Microbiologie Laboratorium voor Microbiologie Academiejaar 2009-2010
NIEUWE ONTWIKKELINGEN IN DE TAXONOMIE VAN CAMPYLOBACTER LARI EN MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK VAN ONGEWONE CAMPYLOBACTER ISOLATEN
Sophie DESPRIET Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. dr. Peter Vandamme Commissarissen
Prof. dr. Hans Nelis Prof. dr. Tom Coenye
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Biochemie, Fysiologie en Microbiologie Laboratorium voor Microbiologie Academiejaar 2009-2010
NIEUWE ONTWIKKELINGEN IN DE TAXONOMIE VAN CAMPYLOBACTER LARI EN MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK VAN ONGEWONE CAMPYLOBACTER ISOLATEN
Sophie DESPRIET Eerste master in de Farmaceutische Zorg
Promoter
Prof. dr. Peter Vandamme Commissarissen
Prof. dr. Hans Nelis Prof. dr. Tom Coenye
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
1 juni 2010
Promotor Prof. dr. Peter Vandamme
Auteur Sophie Despriet
DANKWOORD
In de eerste plaats wil ik mijn promotor, professor Peter Vandamme, bedanken voor het aanreiken van het interessante onderwerp en voor het beschikbaar stellen van zijn laboratorium. Ondanks zijn fysieke afwezigheid op het labo zorgde hij toch voor een uitmuntende begeleiding. Professor, ik waardeer heel erg de uren die u aan mijn masterproef gespendeerd hebt. Eerst en vooral hebt u een stukje van uw rijke kennis doorgegeven en daarna heb u mij bij het schrijfwerk enorm begeleid. Door u heb ik niet alleen het vakgebied microbiologie nog meer leren appreciëren, maar ook heb ik plezier in het schrijven gevonden. Dank u wel! In de tweede plaats wil ik graag Evie bedanken die mij begeleid heeft bij het praktische werk. Evie, een grote merci voor al je goede zorgen, je bekommernis en de vele nuttige tips. Voor mij was het in ieder geval een grote, verrijkende, leerrijke ervaring. Ook wil ik graag alle andere medewerkers van het labo bedanken. Jullie stonden steeds met enthousiasme klaar om antwoord te geven op mijn vragen. Dank voor de vier aangename maanden. Tot slot wil ik mijn ouders, zus, oma en opa, tante en Olivier bedanken voor hun grootste steun. Jullie hebben mij steeds door dik en dun bijgestaan. Merci!
INHOUDSOPGAVE
1. INLEIDING ………………………………..……………………………………………………………………………………. 1 1.1. TAXONOMIE ……………………………………………………………………………………………………………… 1 1.1.1. Inleiding ………………………………………………………………………………..……………………………. 1 1.1.2. Polyfasische taxonomie ………………………………………………………………………………....…… 2 1.2. DE FAMILIE CAMPYLOBACTERACEAE …………………………………………………………………………. 4 1.2.1. Taxonomie van de familie Campylobacteraceae …………………………………................ 4 1.2.2. Het genus Campylobacter ……………………………………………………………………….............. 5 1.2.3. Medisch belang van Campylobacter ……………………………………………………………..……. 6 1.2.3.1. Etiologie van acute gastro-enteritis ………………………………………………………………… 7 1.2.3.2. Pathogenese van Campylobacter-infecties …………………………………………………….. 7 1.2.3.3. Pathologie van Campylobacter-infecties ………………………………………………………… 8 1.2.3.4. Complicaties van Campylobacter-infecties …………………………………………..………… 9 1.2.3.5. Diagnose van Campylobacter-infecties ……………………………………………………..…… 9 1.2.3.6. Preventie van reizigersdiarree ………………………………………………………………………. 11 1.2.3.7. Behandeling van reizigersdiarree ………………………………………………………….……… 12 1.2.4. Campylobacter lari ………………………………………………………………………….................... 14 1.2.4.1. Eerste beschrijving van Campylobacter lari ……………………………………………..…… 14 1.2.4.2. Biochemische varianten van C. lari ………………………………………………………….……. 15 1.2.4.3. Polyfasische taxonomie van de “C. lari-groep” campylobacters …………………… 15 2. OBJECTIEVEN ………………………………………………………………………………………………..………………. 18 3. MATERIAAL EN METHODEN …………………………………………………………………………………………. 21 3.1. INLEIDING …………………………………………………………………………………………………………….…. 21 3.1.1. hsp60-gen sequentie analyse ……………………………………………………………………………. 21 3.1.2. 16S rRNA-gen sequentie analyse ………………………………………………………………………. 21 3.1.3. Amplified Fragment Length Polymorphism ………………………………………………………. 21 3.1.4. DNA-DNA-hybridisatie ………………………………………………………………………………………. 21 3.2. ONDERZOCHTE STAMMEN ………………………………………………………………………………………. 21 3.3. CELKWEEK EN GROEICONDITIES ………………………………………………………………………………. 22 3.4. GEBRUIKTE TECHNIEKEN …………………………………………………………………………………………. 22 3.4.1. Polymerase Chain Reaction …………………………………………………………….………………… 22
3.4.2. Agarose gel elektroforese …………………………………………………………….…………………… 25 3.4.3. Cycle sequencing …………………………………………………………….………………………..…….… 26 3.4.4. Amplified Fragment Lenght Polymorphism …………………….……………………..……….… 27 3.4.5. DNA-DNA-hybridisatie …………………………………………………………….……………….…….… 28 3.5. HSP60 GEN SEQUENTIE ANALYSE ……………………………………………………….…………..…….… 29 3.5.1. Extractie van DNA ……………………………………………………….…….……………………..…….… 29 3.5.1.1. DNA-bereiding volgens alkalische lyse ………………………………………………….…….… 29 3.5.1.2. DNA-bereiding volgens Pitcher et al. (1989) …………………………………………………. 30 3.5.2. Meten van de optische densiteit van het DNA …………………………………………………. 30 3.5.3. Verdunnen van het DNA …………………………………………………..………………………………. 31 3.5.4. Uitvoeren van amplificatie PCR …………………………………………………..……………………. 31 3.5.5. Uitvoeren van agarose gel elektroforese …………………………………………….……………. 32 3.5.6. Opzuiveren van het amplificatie PCR-product ……………………………………………….…. 32 3.5.7. Uitvoeren van sequentie PCR ……………………………………………………..………………….…. 33 3.5.8. Opzuiveren van het sequentie PCR-product en sequenering ……..………………….…. 34 3.5.9. Verwerking van de resultaten ……..………………………………………………………………..…. 34 3.6. 16S rRNA-GEN SEQUENTIE ANALYSE ……..……………………………………………………………..…. 34 3.6.1. Extractie van DNA ……..…………………………………………………………………………………..…. 34 3.6.2. Meten van de optische densiteit van het DNA ……..……………………………..………..…. 35 3.6.3. Verdunnen van het DNA ……..……………………………………………………………..…………….. 35 3.6.4. Uitvoeren van amplificatie PCR ……..………………………………………….…………………..…. 35 3.6.5. Uitvoeren van agarose gel elektroforese ……..………………………………………………..…. 35 3.6.6. Opzuiveren van het amplificatie PCR-product ……..………………………………………..…. 35 3.6.7. Uitvoeren van sequentie PCR ……..…………………………………………….…………………..…. 35 3.6.8. Opzuiveren van het sequentie PCR-product en sequenering …….…………………..…. 36 3.6.9. Verwerking van de resultaten ……..…………………..……………………….…………………..…. 36 3.7. AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM ……..………………………………………..…. 36 3.7.1. Bereiding van DNA ……..………………………………….………………………….…………………..…. 36 3.7.2. Bereiding van template DNA (tDNA) ……..………………………………….…………………..…. 36 3.7.3. Bereiding van selectief PCR-product ……..………………………………….…………………..…. 38 3.7.4. Capillaire elektroforese ……..………………………………….…………………………………………. 38 3.7.5. Analyse van de profielen ……..………………………………….………………………..…………..…. 39
3.8. DNA-DNA-HYBRIDISATIE ……..………………………………….………………………..………………....…. 39 3.8.1. Isolatie van totaal DNA uit bacteriën volgens Pitcher et al. (1989): MIDI-10 ……. 39 3.8.2. Fixatie van DNA ……..………………………………….………………………..………………...........…. 40 3.8.3. Bereiding van probe DNA ……..………………………………….………………………..…………….. 40 3.8.4. Pre-hybridisatie ……..………………………………….………………………..………………...........…. 41 3.8.5. Hybridisatie ……..………………………………….………………………………………………...........…. 41 3.8.6. Data verwerking ……..………………………………….……………………....………………...........…. 41 4. RESULTATEN ……..………………………………….………………………………………………...........…………… 42 4.1. RESULTATEN VAN DE HSP60-GEN SEQUENTIE ANALYSE ……..……………………………....…. 42 4.2. RESULATEN VAN DE 16S rRNA-GEN SEQUENTIE ANALYSE ……..……………………………..... 43 4.3. RESULTATEN VAN DE AFLP-ANALYSE ……..……………………………..................................... 43 4.4. RESULTATEN VAN DE DNA-DNA-HYBRIDISATIES ……..…………………………………….……..... 44 5. DISCUSSIE ……..………………………………….…………………………………..………………...........…………… 45 6. CONCLUSIE ……..………………………………….…………………………………..………………...........…………. 50
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
A
:
adenine
AFLP
:
Amplified Fragment Length Polymorphism
AMP
:
adenosinemonofosfaat
C
:
cytosine
C.
:
Campylobacter
CBA
:
Columbia Blood Agar
cpn60
:
60 kDa chaperonine
DNA
:
deoxyribonucleic acid
dNTP’s
:
deoxynucleotide precursoren
ddNTP’s
:
dideoxynucleotide precursoren
DOI
:
Digital Object Identifier
EBI
:
European Bioinformatics Institute
EtBr
:
ethidiumbromide
G
:
guanine
GyrB
:
DNA gyrase subunit B
hsp60
:
heat shock protein 60
kDa
:
kilodalton
LM-UGent
:
Laboratory of Microbiology Universiteit Gent
MALDI-TOF MS
:
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time Of Flight Mass Spectrometry
NARTC
:
nalidixinezuur-resistente thermofiele campylobacters
NASC
:
nalidixinezuur-gevoelige Campylobacters
OD
:
optische densiteit
ORS
:
oral rehydratation solution
PCR
:
Polymerase Chain Reaction
RAPD
:
Random Amplification of Polymorphic DNA
RNA
:
ribonucleic acid
rRNA
:
ribosomal ribonucleic acid
rpm
:
rotaties per minuut
SDS-PAGE
:
sodium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gel elektroforese
sp.
:
species
subsp.
:
subspecies
T
:
thymine
Tpm
:
toeren per minuut
TSA
:
Tryptic Soy Agar
UPTC
:
urease-positieve thermofiele campylobacters
1. INLEIDING
1.1. TAXONOMIE
1.1.1. Inleiding
Taxonomie is een essentiële discipline in de microbiologie. Ze schept een, weliswaar artificiële, ordening in de bacteriële wereld en maakt het mogelijk om accuraat te communiceren over alle aspecten van individuele micro-organismen.
Taxonomie kan in drie subdisciplines worden onderverdeeld: classificatie, nomenclatuur en identificatie. Classificatie is de organisatie van micro-organismen in taxonomische groepen of taxa op basis van fenotypische gelijkenissen en/of evolutionaire relaties. Het geven van een gepaste naam aan deze groepen valt binnen het vakgebied van de nomenclatuur. De naamgeving moet voldoen aan de regels vastgelegd in de “Bacteriological Code International Code of Nomenclature of Bacteria”. Tijdens de identificatie tenslotte wordt nagegaan of een isolaat behoort tot één van de in de classificatie vastgelegde en in de nomenclatuur benoemde taxa (Cowan, 1968; Staley & Krieg, 1984). Taxonomie is onderdeel van de studie van de diversiteit van micro-organismen en hun relaties, ook wel (bio)systematiek genoemd. De twee andere onderdelen zijn fylogenie, waarin de evolutionaire geschiedenis van een groep micro-organismen wordt bestudeerd, en populatie genetica, waarin men op zoek gaat naar de theorie achter de variabiliteit die waargenomen wordt in populaties van bacteriën.
Een duidelijke omschrijving van de verschillende taxonomische eenheden is onontbeerlijk. Het species is de basiseenheid in de bacteriële taxonomie. Het geven van een definitie aan een soort is kunstmatig maar praktisch noodzakelijk. De definitie werd al vele malen gewijzigd naargelang de state-of-the-art in de wetenschap en de techniek. Coenye et al. (2005) stelden de volgende definitie op: “Praktisch gezien worden bacteriële species beschouwd als groepen van stammen die gekarakteriseerd worden door een bepaalde graad van fenotypische standvastigheid, door een significante graad (50-70%) van DNA-DNAhybridisatie en meer dan 97% 16S ribosomaal RNA-gen sequentie gelijkenis.”
1.1.2. Polyfasische taxonomie
Genotypische informatie is de informatie die verkregen wordt uit de nucleïnezuren (DNA en RNA) aanwezig in een cel. Fenotypische informatie is afkomstig van de eiwitten en hun functies, van de verschillende chemotaxonomische merkers en van een brede waaier aan andere geuite karakteristieken (Vandamme et al., 1996). Fylogenetische informatie wordt verkregen van de zogenaamde chronometers, genen of proteïnen die een maatstaaf zijn voor de evolutionaire verandering. De verschillende soorten data en informatie (zowel fenotypisch, genotypisch als fylogenetisch) worden in de polyfasische taxonomie gecombineerd om tot een consensus type taxonomie te komen. Wel moet er steeds het besef heersen dat er nooit een definitieve, volledig correcte classificatie van bacteriën zal bestaan. Verschillende molecules zijn reeds aan taxonomisch onderzoek onderworpen en de analyses die erop toegepast worden zijn nog veelzijdiger. Bij de keuze van een methode moet men steeds de vraag stellen op welk niveau ze informatie verschaft en hoe arbeidsintensief, tijdrovend of apparatuurvragend ze is. Figuur 1.1. geeft een overzicht van de methodes die kunnen worden gebruikt voor de karakterisatie van bacteriën en het niveau waarop ze informatie verschaffen.
FIGUUR 1.1.: VERSCHILLENDE TECHNIEKEN VOOR DE KARAKTERISATIE VAN BACTERIËN EN HUN TAXONOMISCH NIVEAU VAN RESOLUTIE. (P. Vandamme, ongepubliceerde figuur)
Bij fenotypische analyse worden de morfologie, de fysiologie en/of de biochemie van de bacteriën onderzocht. Bij morfologisch onderzoek kunnen zowel cellulaire karakteristieken (zoals grootte, vorm, flageltype, sporevorming en Gram reactie) als eigenschappen van kolonies worden geobserveerd. Voor fysiologisch onderzoek worden onder andere data over de groei van de bacteriën bij verschillende temperatuur, pH, O2-spanning en zoutconcentratie verzameld. Bestudering van de activiteit van enzymen en van de metabolisatie van componenten behoort bijvoorbeeld tot het domein van de biochemie. Wel moet opgemerkt worden dat deze eigenschappen individueel weinig waarde bezitten. Wanneer we meerdere eigenschappen tegelijk onderzoeken, kunnen we toch tot de juiste identificatie komen. Bovendien moeten de onderzoeken onder strikt gestandaardiseerde omstandigheden worden uitgevoerd om reproduceerbare resultaten te bekomen. Bijgevolg werden automatisatie en miniaturisatie ingevoerd om de snelheid, de standaardisatie en de accuraatheid te verbeteren.
DNA-DNA-hybridisatie studies, rRNA-similariteit studies, DNA-typeringsmethoden en G+Cverhouding bepaling zijn enkele methoden die gebruikt worden bij genotypische analyse.
Oorspronkelijk was classificatie en identificatie (en dus taxonomie) van micro-organismen volledig gesteund op hun fenotypische eigenschappen. Vanaf de jaren 1970, met onder andere de komst van een techniek voor DNA-DNA-hybridisatie, kwam hier verandering in en zag men een stijging in het gebruik van genetische informatie. Sinds de invoering van de 16S rRNA-gen sequentieanalyse reflecteert de taxonomie beter de natuurlijke relaties tussen bacteriën, namelijk de fylogenetische relaties zoals die gecodeerd zijn in het 16S of het 23S ribosomaal RNA. De volgende stap in de evolutie van taxonomie is deze in de richting van een genomische taxonomie.
Taxonomie werd lang beschouwd als één van de saaiste en minst geliefde disciplines in de microbiologie. Vroeger was de classificatie, de naamgeving en de identificatie van microorganismen inderdaad onderhevig aan willekeur. Met de beschikbaarheid van de huidige onderzoekstechnieken en datasets denken we echter een betere taxonomie verkregen te hebben. Ook stonden de wetenschap en de techniek niet stil. Sequeneringstechnieken zijn
de dag van vandaag niet meer weg te denken. Deze twee evoluties hebben geleid tot een drastische verandering van het beeld over taxonomie.
1.2. DE FAMILIE CAMPYLOBACTERACEAE 1.2.1. Taxonomie van de familie Campylobacteraceae De familie Campylobacteraceae behoort tot het domein Bacteria, het phylum of de afdeling Proteobacteria, de klasse Epsilonproteobacteria en de orde Campylobacterales. De familie Campylobacteraceae bestaat uit de genera Arcobacter, Campylobacter en Sulfurospirillum, met Campylobacter als type genus (Sebald & Véron, 1963; http://www.bacterio.cict.fr/). Campylobacter en Arcobacter komen voor als commensalen of als parasieten in mens en dier. Sulfurospirillum komt voor als vrijlevende omgevingsbacterie, net als sommige Arcobacter species (Debruyne et al., 2008). De cellulaire morfologie van de familie Campylobacteraceae is zeer divers. De cellen zijn meestal gebogen, S-vormige of spiraalvormige staafjes met een breedte van 0,2 tot 0,8 μm en een lengte tussen 0,5 en 5 μm (Debruyne et al., 2008). Tijdens verouderen verliezen deze cellen rap hun morfologie en in culturen die meer dan 24 uur geïncubeerd werden, hebben de cellen eerder een bolvormig of coccoid uitzicht (Vandamme et al., 1996). De cellen zijn Gram-negatief en niet-sporevormend. Ook ziet men een enorme diversiteit in de beweeglijkheid van de familie Campylobacteraceae. Er zijn verschillende flageltypes. De meeste cellen worden gekarakteriseerd door één enkele polaire, niet-omhulde flagel aan één of beide uiteinden van de cel die zorgt voor een kurkentrekkerachtige beweging (Vandamme et al., 1996; Debruyne et al., 2008). De leden van de familie groeien preferentieel onder microaërobe groeiomstandigheden. Sommige stammen groeien echter ook in een anaërobe of aërobe atmosfeer. Een optimale groei wordt bereikt bij een temperatuur van 30 tot 37°C (Debruyne et al., 2008). In het algemeen halen de meeste bacteriën hun energie uit de fermentatie en/of oxidatie van suikers. Campylobacters echter bezitten geen enzymen om koolhydraten af te breken. Bijgevolg gebruiken ze organische zuren of aminozuren als bron van koolstof en energie (Vandamme & De Ley, 1991). Ze zijn dus chemoörganotroof. Alle species met uitzondering van Campylobacter gracilis geven een positieve oxidase test. Dit toont aan dat de familie Campylobacteraceae een respiratoir metabolisme heeft.
Om de beschrijving van de familie te vervolledigen moet nog gezegd worden dat het G+Cgehalte laag is. De DNA base samenstelling varieert tussen 27 en 47 mol% (Debruyne et al., 2008).
1.2.2. Het genus Campylobacter Het genus Campylobacter bestaat uit 24 species en 8 subspecies. Campylobacter fetus is het type species (Sébald & Véron, 1963 ; http://www.bacterio.cict.fr/). In tabel 1.1. wordt een overzicht gegeven van de species en de subspecies die behoren tot dit genus. De auteur en de datum van publicatie worden weergegeven in de rechterkolom.
TABEL 1.1.: OVERZICHT VAN DE SPECIES EN SUBSPECIES DIE BEHOREN TOT HET GENUS CAMPYLOBACTER EN HUN AUTEUR EN DATUM VAN PUBLICATIE. 1 2 3 4 5 6 7
Species Campylobacter avium Campylobacter canadensis Campylobacter coli Campylobacter concisus Campylobacter cuniculorum Campylobacter curvus Campylobacter fetus
8 9 10 11
Campylobacter gracilis Campylobacter helveticus Campylobacter hominis Campylobacter hyointestinalis
12 13
Campylobacter insulaenigrae Campylobacter jejuni
14 15
Campylobacter lanienae Campylobacter lari
16 17 18 19 20 21 22 23 24
Campylobacter mucosalis Campylobacter peloridis Campylobacter rectus Campylobacter showae Campylobacter sputorum Campylobacter subantarcticus Campylobacter upsaliensis Campylobacter ureolyticus Campylobacter volucris
Subspecies
C. fetus subsp. Fetus C. fetus subsp. Venerealis
C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis C. hyointestinalis subsp. lawsonii C. jejuni subsp. doylei C. jejuni subsp. jejuni C. lari subsp. lari C. lari subsp. concheus
Referentie Rossi et al. (2009) Inglis et al. (2007) Véron & Chatelain (1973) Tanner et al. (1981) Zanoni et al. (2009) Vandamme et al. (1991a) Sebald and Véron (1963) Véron & Chatelain (1973) Vandamme et al. (1995) Stanley et al. (1993) Lawson et al. (2001) Gebhart et al. (1985) On et al. (1995) Foster et al. (2004) Steele & Owen (1988) Véron & Chatelain (1973) Logan et al. (2000) Benjamin et al. (1984) Debruyne et al. (2009) Roop et al. (1985) Debruyne et al. (2009) Vandamme et al. (1991a) Etoh et al. (1993) Véron & Chatelain (1973) Debruyne et al. (2010) Sandstedt & Ursing (1991) Vandamme et al. (in druk) Debruyne et al (in druk)
Campylobacter komt voor in de gastro-intestinale tractus, in het voortplantingsstelsel en in de mondholte van mens en dier. Bijna alle Campylobacter species zijn geassocieerd met ziektes. Van sommige species is hun pathogene rol effectief aangetoond (Debruyne et al., 2008). De meeste cellen van de Campylobacter species zijn dunne spiraalvormig-gebogen staafjes. De cellen van sommige species lijken echter eerder op gebogen of rechte staafjes. Cellen uit oude culturen tenslotte kunnen bolvormig worden. De cellen hebben een lengte tussen 0,5 en 5 μm en een breedte tussen 0,2 en 0,8 μm (Debruyne et al., 2008). Cellen van de meeste Campylobacter species zijn beweeglijk. Men neemt een kurkentrekkerachtige beweging waar. Deze beweging wordt veroorzaakt door één enkele polaire, niet-omhulde flagel aan één of beide uiteinden van de cel. Ook zijn cellen met een bipolair flagel gerapporteerd. C. showae heeft polaire bundels van 2 tot 5 flagellen. Cellen van C. gracilis zijn niet beweeglijk (Vandamme et al., 1996). Het genus Campylobacter kent dus net als de familie Campylobacteraceae een sterke diversiteit, zowel in morfologie, als in beweeglijkheid. De biochemische eigenschappen van het genus Campylobacter zijn grotendeels dezelfde als deze van de familie Campylobacteraceae. Wel moet opgemerkt worden dat sommige species onder anaërobe omstandigheden groeien, met nitraat of fumaraat als elektronenacceptor. Wanneer we deze species onder microaërobe atmosfeer willen incuberen, moet ofwel waterstof ofwel formiaat ofwel succinaat als elektronenbron worden toegevoegd (Debruyne et al., 2008). Het genus Campylobacter heeft een laag G+C-gehalte en schommelt tussen 29 en 47 mol%.
1.2.3. Medisch belang van Campylobacter Campylobacter veroorzaakt een brede waaier aan ziektes. C. fetus bijvoorbeeld veroorzaakt bloedinfecties bij mensen maar kan ook steriliteit en spontane abortus induceren bij schapen en koeien. Campylobacter kent het grootste belang als veroorzaker van enteritis bij mensen. Volgende tekst is algemeen opgesteld voor het genus Campylobacter hoewel C. jejuni de meest voorkomende verwekker van gastro-enteritis is. Diagnose gebeurt echter meestal niet tot op soortniveau.
Bronnen: Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische Informatie Folia mei 2001 Folia mei 2007 Folia augustus 2008 Folia mei 2009 Prins Leopold Instituut voor Tropische Geneeskunde Teksten van de consensusvergadering van de Wetenschappelijke Studiegroep Reisgeneeskunde (editie 2009-2010) p 25 Gezondheidsadviezen voor reizigers (editie 2008-2009) (uitgave bestemd voor het medisch korps) p 61 Rijksinstituut voor ziekte- en invaliditeitsverzekering Juryrapport consensusvergadering 24 oktober 2001: Doelmatig gebruik van antibiotica bij acute enteritis en bij acute urogenitale infecties in de ambulante praktijk Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu Nederland Campylobacter (PDA) Food and Drug Administration Bad Bug Book: Foodborne pathogenic microorganisms and natural toxins handbook, Campylobacter jejuni Nederlands Huisartsen Genootschap MHG-standaard M34: Acute diarree (maart 2007) Campylobacter, 3th Edition 1.2.3.1. Etiologie van acute gastro-enteritis Acute gastro-enteritis is in onze streken veelal van virale oorsprong. Reizigersdiarree daarentegen wordt meestal veroorzaakt door bacteriën, voornamelijk door Escherichia coli, Campylobacter, Shigella of Salmonella. Bovendien is C. jejuni, samen met andere Campylobacter species, de voornaamste oorzaak van bacteriële enteritis in vele geïndustrialiseerde landen.
1.2.3.2. Pathogenese van Campylobacter-infecties Campylobacter komt voor in de residentiële flora van de gastro-intestinale tractus van gevogelte en de karkassen van kippen, kalkoenen en varkens zijn dikwijls gecontamineerd. Campylobacter wordt naar de mens overgedragen via gecontamineerd voedsel, vooral via kip, maar ook via varkensvlees, rauwe schaaldieren of oppervlakte water. Na ingestie tracht de bacterie de verdedigingsmechanismen van het menselijk lichaam te omzeilen. De zure pH in de maag vormt een belangrijke barrière. Campylobacter is gevoelig voor maagzuur, waardoor zo’n 10000 cellen nodig zijn om infectie te induceren. Wanneer echter de bacteriën in voedsel ingebed zijn, of wanneer de maagzuurproductie lager is dan normaal,
dan daalt de minimaal infecterende dosis tot 500 bacteriën. Campylobacter vermenigvuldigt zich vervolgens in het jejunum en ileum, produceert entero- en cytotoxines en veroorzaakt diarree. Van het enterotoxine hecht een deel zich aan de receptor. Het andere gedeelte gaat naar binnen. Binnenin de darmcel stimuleert dat deel adenylaatcyclase met een verhoogde vorming van cyclisch AMP tot gevolg. Hierdoor daalt de natriumabsorptie en stijgt de chloridesecretie. Er is dus meer zout aanwezig in de darm waardoor het osmotisch evenwicht verstoord wordt. De balans wordt terug hersteld door een verhoogde secretie van water wat aanleiding geeft tot waterige diarree. Campylobacter-infectie is gewoonlijk niet invasief. Soms worden toch cytotoxinen geproduceerd, met beschadiging van het epitheel en bloederige diarree tot gevolg.
1.2.3.3. Pathologie van Campylobacter-infecties
De binnengekregen dosis, de gevoeligheid van de patiënt en de virulentie van de infecterende stam bepalen de klinische gevolgen van infectie voor de patiënt. Infectie door Campylobacter kan hoge koorts, hoofdpijn, malaise, misselijkheid, braken, abdominale pijn en waterige, slijmerige, etterige of bloederige diarree veroorzaken. Bloed in de stoelgang wijst erop dat de infectie zich heeft verder gezet vanuit het jejunum en ileum naar de weefsels van de colon en het rectum. De symptomen treden op 1 tot 9 dagen na ingestie. Meestal ziet men een spontane genezing na 7 à 10 dagen, hoewel er kans op herval bestaat. In figuur 1.2. wordt een karakteristiek verloop van een Campylobacter-infectie weergegeven hoewel veel variaties mogelijk zijn. A- of hypochlorhydrie komt voor bij patiënten die antacida of maagzuursecretieremmers innemen, bij patiënten met gastritis of bij personen waarbij gastrectomie werd uitgevoerd. Deze mensen lopen meer risico op gastro-intestinale infecties omdat de natuurlijke zuur-barrière verminderd of opgeheven wordt.
FIGUUR 1.2.: KARAKTERISTIEK VERLOOP VAN CAMPYLOBACTER ENTERITIS. (Greenwood et al., 1997)
1.2.3.4. Complicaties van Campylobacter-infecties Extra-intestinale infecties kunnen voorkomen die we kunnen beschouwen als een complicatie van enteritis of als een schijnbaar spontaan voorval. Ze komen relatief zelden voor, maar toch kunnen Campylobacter-infecties worden geassocieerd met reactieve arthritis, met hemolytisch uremisch syndroom en met infecties van verschillende organen ten gevolge van sepsies. Meninigitis, terugkerende colitis, acute cholecystitis en GuillainBarre syndroom, een acute paralyse van het perifeer zenuwstelsel, worden nog minder gerapporteerd. Een fatale afloop komt zeer zelden voor.
1.2.3.5. Diagnose van Campylobacter-infecties
De diagnose wordt gesteld op basis van de kliniek. Klinisch kan Campylobacter enteritis echter niet onderscheiden worden van infectie veroorzaakt door Salmonella of Shigella. Daarom is in bepaalde gevallen aanvullend onderzoek aangewezen. Zowel bij ernstige Campylobacter-infectie van kinderen, als bij infectie van immuungedeprimeerde patiënten is een specifieke diagnose noodzakelijk. Voor isolatie en identificatie van Campylobacter species in een laboratorium zijn fecale stalen nodig. Hoewel zeker niet ideaal kunnen ook rectale uitstrijkjes worden gebruikt. Occasioneel wordt Campylobacter geïsoleerd uit bloedculturen.
Een snelle diagnose van Campylobacter enteritis kan gesteld worden op basis van microscopisch onderzoek van stoelgangstalen maar de gevoeligheid van microscopie is variabel waardoor de resultaten met enige voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd. Gram kleuring waarbij niet safranine maar wel basisch fuchsine als tegenkleurstof wordt gebruikt, is een relatief specifieke en gevoelige methode voor de directe detectie van Campylobacter in de feces gedurende de actieve fase van de ziekte. Ook werden stoelgang antigentesten ontwikkeld voor Campylobacter.
Beter worden de stalen uitgeplaat. Voor een optimaal herstel van de meeste Campylobacter species is een microaërobe atmosfeer, die ongeveer 5% O2, 10% CO2 en 85% N2 bevat, noodzakelijk. Sommige species, zoals o.a. C. curvus, C. concisus en C. rectus, hebben echter ook een zekere H2 concentratie in het gasmengsel nodig. Er zijn twee manieren voor de isolatie van Campylobacter. Uitplaten op selectieve media die antibiotica bevatten en zo de groei van andere enterische pathogenen tegengaan, is een eerste mogelijkheid. Sommige Campylobacter species zijn echter gevoelig aan bepaalde antibiotica aanwezig in de meeste selectieve media waardoor naar een alternatief werd gezocht. Campylobacter-cellen zijn klein en zeer beweeglijk en kunnen in tegenstelling tot andere bacteriën doorheen het membraan van een 0.65 μm cellulose acetaat filter op een antibioticavrije agarbodem diffunderen. Deze agarbodems moeten vervolgens bij 37°C en onder een microaërobe atmosfeer (die een zekere concentratie aan H2 bevat) worden geïncubeerd. Voor de belangrijkste Campylobacter species betrokken bij humane infecties volstaan selectieve media en een normale microaërobe atmosfeer.
Een fenotypische identificatie van Campylobacter is moeilijk. Het genus Campylobacter wordt gekenmerkt door een biochemische inertie waardoor de klassieke fenotypische testen gebruikt voor de identificatie van klinisch significante bacteriën variabele of negatieve resultaten geven. Slechts een klein aantal testen is bruikbaar. Door deze grote variabiliteit kunnen isolaten meestal niet op soortniveau worden geïdentificeerd. Kolonies die bij Gram kleuring het typisch beeld van blauw-paarse gebogen staafjes vertonen en die een positieve oxidase test geven, moeten worden onderworpen aan verder onderzoek daar het mogelijk gaat om kolonies van Campylobacter species.
Indien gewenst kunnen de bekomen resultaten genotypisch bevestigd worden. Bepaling van de sequentie van het 16S rRNA-gen is een optie hoewel de taxonomische resolutie hiervan beperkt is en de soortidentificatie bijgevolg tentatief.
Na isolatie en identificatie volgt een antibioticagevoeligheidstest. Er zijn verschillende methoden voorhanden, maar meestal gebruikt men de agardiffusiemethode. Op een agarbodem die homogeen met het isolaat is geënt, plaatst men schijfjes die geïmpregneerd zijn met verschillende antibiotica. Na incubatie meet men de diameter van de inhibitiezones die een maat zijn voor de gevoeligheid van het isolaat voor het antibioticum. Het “Clinical Laboratory Standards Institute” bepaalt de gestandaardiseerde omstandigheden waaronder het antibiogram moet worden opgesteld en voorziet kwaliteitcontrole-marges die bepalen of een kiem gevoelig of resistent is voor verschillende antibiotica.
1.2.3.6. Preventie van reizigersdiarree
Voedselhygiëne is de hoeksteen van de preventie van reizigersdiarree. Wanneer namelijk de inname van pathogenen beperkt wordt, blijft de ingenomen hoeveelheid onder de minimaal infecterende dosis en daalt de kans op ernstige diarree. Sommige voedingswaren en dranken worden dus beter vermeden.
Voor een adequate voedselhygiëne geldt de
eenvoudige regel: “Cook it, boil it, peel it or forget it”. Deze regel omvat een aantal eenvoudige tips om infectie te beperken. Als voorbeelden kunnen worden gesteld dat verse groenten enkel mogen worden gegeten als ze grondig gewassen zijn in gekookt water of flessenwater (geen kraantjeswater), dat ongekookte melk best wordt vermeden, en dat vers fruit beter wordt geschild. Om infectie door Campylobacter te voorkomen, moet speciale aandacht uitgaan naar de voedselbereiding. Kip of ander risicovoedsel moet voldoende worden gekookt en moet tijdens het bewaren bij voldoende lage temperatuur worden bewaard. Alle materialen zoals messen en schotels, en handen die in contact zijn gekomen met het rauwe voedsel moeten grondig worden gereinigd voor ze voor de verdere verwerking van het voedsel worden gebruikt. Ook niet-gepasteuriseerde melk moet worden vermeden.
Naast voedselhygiëne is ook een elementaire handhygiëne zeker van belang. Handen dienen regelmatig met water en zeep gewassen te worden. Eventueel kunnen ontsmettende alcoholhoudende gels worden gebruikt.
In geval van avontuurlijk reizen, is koken, ontsmetten met chloor of filteren van het drinkwater een noodzaak.
Al deze maatregelen kunnen de kans op infectie drastisch verminderen, maar kunnen deze niet absoluut vermijden. Daarom kent chemoprofylaxis ook een plaats. Er zijn echter verschillende argumenten tegen dit preventief gebruik van antibiotica: niet alleen werkt het de resistentieontwikkeling in de hand, ook de mogelijke nevenreacties mogen niet over het hoofd worden gezien, en vaak geeft medicatie de mensen een vals gevoel van veiligheid. Bovendien is een snelle zelfbehandeling (wanneer de eerste symptomen optreden) een goed alternatief. Chemoprofylaxis dient echter toch te worden overwogen voor risicopatiënten: patiënten met diabetes, immuundepressie, nierziekten, hartaandoeningen, achloorhydrie, inflammatoire darmaandoeningen en patiënten die diuretica innemen.
1.2.3.7. Behandeling van reizigersdiarree
In de eerste plaats dienen maatregelen ter preventie en ter behandeling van dehydratatie te worden getroffen. Rehydratatie is vooral van belang bij kinderen, maar ook bij bejaarden, vooral zij die diuretica innemen. Bij overvloedige waterige diarree moet er een voldoende inname van vocht, met de nodige zouten en suikers, voorzien worden om het vochtverlies te compenseren. Hiervoor zijn verschillende manieren voorhanden. -
Bij kleine kinderen volstaat de inname van vocht alleen niet. Er wordt aangeraden om extra rehydratatievloeistof ( ORS of Oral Rehydratation Solution) toe te dienen. ORS is verkrijgbaar onder de vorm van zakjes met een welbepaalde hoeveelheid zouten en suikers. Deze moeten worden opgelost in de juiste hoeveelheid (mineraal)water. In de juiste concentratie zorgen ze ervoor dat de darmen het water uit de oplossing beter opnemen dan zuiver water.
-
De rehydratatievloeistof kan ook zelf bereid worden door 5 koffielepels suiker en een halve koffielepel zout op te lossen in 1L vloeistof (bij voorkeur water waaraan wat fruitsap werd toegevoegd). Deze bereiding is niet zo precies, waardoor de voorkeur uitgaat naar ORS, zeker bij risicopatiënten.
-
Volwassenen kunnen kiezen welke drank zij prefereren. Thee, bouillon, frisdrank en fruitsap zijn goede alternatieven.
Wanneer de diarree hinderlijk of pijnlijk is of blijft duren, kunnen naast de rehydratatievloeistoffen ook nog transitremmers ingenomen worden om de symptomen te verlichten. De patiënt moet worden ingelicht dat diarree over het algemeen spontaan overgaat, en dat transitremmers enkel gegeven worden om het comfort van de patiënt te verhogen. Er wordt gestart met een dosis loperamide van 4mg; daarna kan 2 mg ingenomen worden, in functie van de noden. Loperamide is tegenaangewezen bij kleine kinderen (en bij kinderen onder de 2 jaar volledig afgeraden), bij zwangere vrouwen (de toxiciteit is echter niet bewezen) en bij het voorkomen van een bloederige stoelgang of bij hoge koorts (omwille van het risico op toxisch megacolon). Bij gewone diarree zijn geen antibacteriële middelen noodzakelijk. Wanneer er echter bloed, etter of slijm in de ontlasting terug te vinden is (dit noemt men een dysenteriebeeld) of wanneer de patiënt koorts, hevige buikkrampen of meer dan 6 ontlastingen in 24u heeft, of wanneer de diarree langer aanhoudt dan 24 tot 48u, kan het gebruik van antibiotica aangewezen zijn. Fluorochinolonen zijn eerste keus, want ze zijn actief tegen het overgrote deel van de bacteriën die reizigersdiarree veroorzaken. 1 gram ciprofloxacine in 2 giften, 800 mg norfloxacine in 2 giften of 400 mg ofloxacine in 1 of 2 giften kan worden gegeven, dit gedurende 3 à 5 dagen. Fluorochinolonen zijn gecontra-indiceerd tijdens de zwangerschap. Recent ziet men in Azië een sterke toename van de resistentie van Campylobacter sp., voornamelijk Campylobacter jejuni, tegen fluorochinolonen . Voor reizen naar India tot het Verre Oosten is azithromycine eerste keus. Ook voor kinderen jonger dan 15 jaar en voor zwangere vrouwen wordt azithromycine verkozen. De dosering voor volwassenen bedraagt 500 mg per dag, dit gedurende 3 dagen. Aan kinderen geeft men een dosis van 10 mg per kilogram lichaamsgewicht per dag, ook gedurende 3 dagen. Een snelle zelfbehandeling met antibiotica vermindert de ziekteduur en verlaagt de kans op ziekenhuisopname in een vreemd land met vaak een minder goede gezondheidszorg.
1.2.4. Campylobacter lari Zoals hoger vermeld, worden Campylobacter-infecties routinematig zelden tot op soortniveau geïdentificeerd. Nochtans is er nood aan klinische studies waarbij de identificatie tot op het speciesniveau gebeurt. Dit is niet alleen van academisch belang, maar ook van praktisch belang. Zo kunnen we immers inzicht verkrijgen in het voorkomen, de verspreiding en de bestrijding van de verschillende Campylobacter species. C. lari bijvoorbeeld kon reeds uit uiteenlopende bronnen worden geïsoleerd (Duim et al., 2004). Zeemeeuwen worden verondersteld de bron van contaminatie te zijn. C. lari komt voor als commensaal in het darmkanaal van deze vogels. Hun uitwerpselen komen vaak in zee terecht. Zo kunnen het oppervlaktewater maar ook de schaaldierbanken worden gecontamineerd. Het is dus niet onlogisch dat C. lari werd teruggevonden in mosselen en oesters en in rivierwater (Endtz et al., 1997). In recente onderzoeken werden grote aantallen C. lari stammen uit verschillende soorten vogels geïsoleerd. Het C. lari species is dus niet enkel tot zeemeeuwen beperkt (Waldenstrom et al., 2007; Hughes et al., 2009). C. lari is een potentieel humaan pathogeen en is geassocieerd met diarree en bacteriëmie bij immuuncompentente en immuungedeprimeerde patiënten. C. lari-infecties na het eten van gecontamineerde schaaldieren werden gerapporteerd (Abeyta et al., 1993). Ook werd een gemeenschappelijke-bron-epidemie beschreven waarbij de bacterie via gecontamineerd water was overgedragen (Nachamkin et al., 1984). Algemeen wordt aangenomen dat deze incidentiële meldingen enkel het topje van de ijsberg zijn en dat het aantal niet-gerapporteerde C.lari-infecties groot is. C.lari is fenotypisch moeilijk van de andere Campylobacter species te onderscheiden (vooral niet van C. jejuni en C. coli (Kaijser & Mégraud, 1992) ) en veel klinische laboratoria beschikken niet over de apparatuur die nodig is voor moleculaire identificatiemethoden. Daarom wordt identificatie vaak beperkt tot op het niveau van het genus en is de correcte incidentie van infectie veroorzaakt door dit species niet gekend.
1.2.4.1. Eerste beschrijving van Campylobacter lari
Skirrow & Benjamin (1980) onderzochten de culturele karakteristieken van 1220 Campylobacter isolaten van diverse oorsprong. Ze ontdekten 42 thermofiele isolaten die zich
door verschillende eigenschappen van de andere thermofiele campylobacters, C. jejuni en C. coli onderscheidden. Het meest opvallende verschil was de resistentie van deze isolaten tegen nalidixinezuur, een antibioticum dat selectief de DNA-synthese van Gram-negatieve bacteriën inhibeert. Uit de stoelgang van een zes jaar oude jongen zonder symptomen werd in 1976 voor het eerst een nalidixinezuur-resistente thermofiele Campylobacter stam geïsoleerd. Andere isolaten waren voornamelijk afkomstig van vogels, vooral van zeemeeuwen. Skirrow en Benjamin beschikten echter niet over DNA-DNA-hybridsatie data om de fenotypische informatie te ondersteunen. Ze classificeerden deze stammen bijgevolg als nalidixinezuur-resistente thermofiele campylobacters (NARTC). Drie jaar na de ontdekking volgde de officiële beschrijving van het nieuwe species door Benjamin et al. (1984) als Campylobacter laridis. De naam C. laridis werd later verbeterd in Campylobacter lari (von Graevenitz, 1990).
1.2.4.2. Biochemische varianten van C. lari
In 1985 werden de eerste urease-positieve thermofiele Campylobacter (UPTC) organismen beschreven door Bolton et al. (1985). Deze organismen waren afkomstig uit de omgeving: ze werden afgezonderd uit rivierwater, zeewater, mosselen en kokkels. In 1986, 1987 en 1989 konden UPTC-organismen worden geïsoleerd uit respectievelijk de faeces, de appendix en de urine van patiënten met diarree, met appendicitis en met urineweginfecties (Mégraud et al., 1988; Bézian et al., 1990). Dit was meteen ook de laatste keer dat humane UPTC-infecties werden gerapporteerd. Bovendien classificeerden Mégraud et al. (1988) deze UPTCorganismen als een variant van C. lari, dit op basis van een hybridisatie dot blot analyse van het volledig genomisch DNA. Nog een andere biochemische variant van C. lari werd beschreven door Bolton et al. (1987) met name C. lari organismen die gevoelig zijn voor nalidixinezuur maar die geen urease produceren. Deze nalidixinezuur-gevoelige campylobacters (NASC) werden geïsoleerd uit rivierwater uit Lancashire in Engeland.
1.2.4.3. Polyfasische taxonomie van de “C. lari-groep” campylobacters Om inzicht te verwerven in de epidemiologie van C. lari-infecties die te wijten zijn aan de consumptie van schaaldieren in Nederland onderzochten Endtz et al. (1997) een groot aantal
mossel- en oesterstalen. 69% van de loten mosselen en 27% van de loten oesters bleken met Campylobacter gecontamineerd te zijn. 39 van de geïsoleerde Campylobacter stammen werden verder onderzocht aan de hand van fenoptypische testen (naar morfologie, fysiologie en biochemie), eiwitprofilering door polyacrylamide gel elektroforese van volledige cel proteïnen (SDS-PAGE) en DNA-analyse door “random amplification of polymorphic DNA” (RAPD). 37 van de 39 isolaten bleken C. lari te zijn. Hun gevoeligheid voor nalidixinezuur en hun urease-activiteit waren variabel. Numerische analyse van de proteïne patronen toonde geen aparte clustering van de UPTC-, NASC- of NARTC-stammen. Deze stammen kunnen dus enkel als biovars worden beschouwd. Niettemin onthulde DNAanalyse een hoge graad van genetische diversiteit binnen de “C. lari-groep”. Uit verschillende studies was gebleken dat C. lari zowel fenotypisch als genotypisch een divers species is (Owen et al., 1988; Owen et al., 1993; Endtz et al., 1997). Dit werd later bevestigd door multilocus enzym elektroforetisch onderzoek (Meinersmann et al., 2002) en door multilocus sequentie typeringsonderzoek (Miller et al., 2005). C. lari bestaat uit de klassieke, eerst beschreven NARTC-stammen, maar ook uit de biochemische varianten UPTC en NASC. (Mégraud et al., 1988; Owen et al., 1988; Vandamme et al., 1991b). Om inzicht te verkrijgen in de taxonomische en de epidemiologische relaties tussen de verschillende C. lari varianten onderzochten Duim et al. (2004) 55 stammen aan de hand van “amplified fragment length Polymorphism” (AFLP) en volledige cel proteïne profiel analyse. Duim et al. bevestigden dat de C. lari-groep zeer heterogeen is en konden vier subgroepen onderscheiden. De NARTC-stammen werden onderverdeeld in 2 clusters, cluster I en cluster IV. Cluster II bestond uit zowel urease-producerende als niet-urease-producerende NASCstammen. Cluster III tenslotte bevatte enkel niet-urease-producerende NASC-stammen. Dit onderzoek werd verder gezet in de doctoraatsstudie van L. Debruyne (2009). Aan de hand van AFLP- en SDS-PAGE-analyse werd de diversiteit binnen een C. lari-groep stammencollectie van uiteenlopende isolatiebronnen en geografische regio’s verder onderzocht. Uit de genogroepen I, III, en IV van Duim et al. (2004) werden verschillende isolaten geselecteerd en aan verder onderzoek onderworpen: zowel een fenotypische analyse als een 16S rRNA- en een hsp60-gen sequentie analyse werden uitgevoerd. Tenslotte werd de G+C-verhouding bepaald en vonden relevante DNA-DNA-hybridisaties plaats. Door deze polyfasische aanpak ontdekten Debruyne et al. (2009) dat genogroep III kon beschreven worden als een nieuw subspecies binnen C. lari, namelijk C. lari subsp. concheus
subsp. nov. Volgens de regels van de bacteriële nomenclatuur diende dan de naam C. lari subsp. lari subsp. nov. voorgesteld te worden voor genogroep I dat de typestam van C. lari bevat. Tevens toonden Debruyne et al. (2009) ook aan dat genogroep IV als een nieuw species kon worden voorgesteld, waarvoor de naam Campylobacter peloridis sp. nov. werd gekozen. In een volgende studie werden C. lari-achtige bacteriën van wilde vogels op Bird Island in Subantartica onderzocht (Debruyne et al., 2010). Drie ervan waren afkomstig van grijskopalabtrossen (Diomedea chrysostoma), twee van wenkbrauwalbatrossen (Diomedea melanophris) en één van een ezelspinguïn (Pygoscelis papua). AFLP- en SDS-PAGE-analyse toonden aan dat de isolaten verschilden van C. lari en van alle andere gekende Campylobacter species. Verdere genomische, fylogenetische en fenotypische analyses werden uitgevoerd om te bewijzen dat deze isolaten behoren tot een nieuw species, waarvoor de naam Campylobacter subantarticus sp. nov. werd voorgesteld. Ook werden drie isolaten, bekomen tijdens een studie naar de prevalentie van C. jejuni in kokmeeuwen (Larus ridibundus) in Zweden (Broman et al., 2002), ingesloten in het polyfasisch taxonomisch onderzoek. Deze isolaten waren oorspronkelijk als C. lari geïdentificeerd door middel van een 23S rRNA PCR-RFLP-methode. Aan de hand van AFLPanalyse en SDS-PAGE analyse ontdekten Debruyne et al. (in druk) dat de isolaten opnieuw een afzonderlijke groep binnen het genus Campylobacter vormen. De resultaten van AFLP en SDS-PAGE werden bevestigd door fenotypische analyse, 16S rRNA- en hsp60-gen sequentie analyse en DNA-DNA-hybridisaties. Deze isolaten vertegenwoordigen dus ook een nieuw species, waarvoor de naam Campylobacter volucris sp. nov. werd voorgesteld. Tenslotte werd een laatste groep van een tiental C. lari-achtige isolaten afkomstig van zeezoogdieren uit Noord- en Zuid-Amerika geïdentificeerd als Campylobacter insulaenigrae (P. Vandamme en L. Debruyne, niet-gepubliceerde resultaten), een nieuw species dat eerder geïsoleerd was uit gewone zeehonden (Phoca vitulina) (Foster et al., 2004), uit een bruinvis (Phocoena phocoena) (Foster et al., 2004) en uit een persoon met gastro-enteritis en septicemie (Chua et al., 2007).
2. OBJECTIEVEN In het LM-UGent laboratorium wordt sinds de jaren 1980 onderzoek gedaan naar de taxonomie en de identificatie van ongewone campylobacters. De onderzoeksgroep fungeert daarbij als internationaal referentiecentrum voor de diagnostiek van dergelijke infecties. In deze masterproef zullen de identiteit en de verwantschappen van drie groepen van isolaten worden onderzocht. Een eerste groep van isolaten behoort tot de C. lari-groep. Zoals hierboven vermeld, wordt reeds een dertigtal jaar onderzoek gedaan naar de taxonomie van C. lariachtige bacteriën. Alle studies komen tot dezelfde eindconclusie: de taxonomie van C. lari is zeer complex. Daarom spreekt men nu eerder over de C. lari-groep dan over het C. lari-species. De groep bestaat voorlopig uit de vijf volgende taxa: C. lari subsp. lari, C. lari subsp. concheus, C. subantarticus, C. peloridis en C. volucris. In één van de onderzoeken werd de taxonomie van C. lari aan de hand van AFLP en SDS-PAGE geanalyseerd (Duim et al., 2004). Vier subgroepen konden met behulp van deze methodes worden onderscheiden. Genogroepen I, III en IV werden verder onderzocht in de doctoraatstudie van Lies Debruyne (2009). Genogroep II bestaat voornamelijk uit UPTC-stammen en wordt in deze masterproef aan verder onderzoek onderworpen. Ook zijn op het laboratorium een aantal C. lari stammen aanwezig die in het licht van de nieuwe taxonomie van C. lari nooit werden geherïdentificeerd. Deze stammen, waaronder eveneens een aantal UPTC-stammen werden in het kader van deze masterproef opnieuw onderzocht. Een tweede groep betreft een set van 21 stammen die in de loop van de voorbije twee decennia werden ontvangen en door middel van eiwitelektroforese hetzij als atypische stammen van bestaande species, hetzij als behorend tot nieuwe Campylobacter species werden geïdentificeerd. Een derde groep betreft een reeks van 19 oppervlaktewater-isolaten uit Canada. Deze werden, voor ze naar het LM-UGent laboratorium werden opgezonden, reeds aan hsp60-gen sequentie analyse en aan AFLP-analyse onderworpen en zouden vier nieuwe Campylobacter taxa vertegenwoordigen. Aan het laboratorium werd gevraagd om deze resultaten te bevestigen of te weerleggen.
Zoals hoger gemeld, is de identificatie van Campylobacter tot op speciesniveau van academisch en van praktisch belang: we willen de epidemiologie en de impact van de verschillende Campylobacter soorten op de volksgezondheid beter leren begrijpen. Toch stelt zich een probleem: het genus Campylobacter wordt gekenmerkt door een biochemische inertie. Op basis van fenotypische eigenschappen kan men vaak niet tot een identificatie op speciesniveau komen (On & Holmes, 1995; On, 1996). De klassieke diagnostiek kent dus tekortkomingen. In die gevallen waar men toch een accurate soortidentificatie wil bekomen, zijn een hele reeks alternatieven uit de literatuur beschikbaar. SDS-PAGE, AFLP, maar ook nieuwere methoden zoals MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight Mass Spectrometry) behoren tot de mogelijkheden voor dit genus. Het bepalen van de sequentie van de huishoudgenen (zoals hsp60 en GyrB) is een techniek die vaak wordt gebruikt, een hoge resolutie heeft en geschikt is voor Campylobacter. Lies Debruyne stelde tijdens haar doctoraatstudie naar de biodiversiteit in de familie Campylobacteraceae een referentiedatabank op, zowel voor AFLP-patronen als voor hsp60gen sequenties. Hierdoor ontstaan nieuwe mogelijkheden om de identiteit van bovenvermelde stammencollecties te evalueren.
Het heat shock protein 60 (hsp60), ook wel 60 kDa chaperonine (cpn60) of GroEL genoemd, is een subeenheid van 60 kDa uit een complex dat tussenkomt in de driedimensionale opvouwing van bacteriële proteïnen (Fink, 1999). Het gen dat codeert voor dit proteïne is aanwezig in het genoom van bijna alle bacteriën en is sterk geconserveerd (Segal & Ron, 1996). Deze eigenschappen dragen bij tot het gebruik ervan als moleculaire chronometer. Het nut van deze molecule voor de identificatie en de fylogenetische analyse van campylobacters werd reeds meerdere malen aangetoond (Kärenlampi et al., 2004; Hill et al., 2006). De topologie van de fylogenetische boom geconstrueerd aan de hand van de hsp60gen sequenties is gelijkaardig aan deze van de boom die geconstrueerd werd aan de hand van de 16S rRNA-gen sequenties. Wel heeft hsp60 een hogere resolutie dan 16S rRNA voor de Campylobacter species, wat afgeleid kan worden uit de lagere interspecies sequentiesimilariteit en de hoge intraspecies sequentiesimilariteit (Kärenlampi et al., 2004). Hsp60-gen sequentie analyse zal dan ook worden uitgevoerd op alle stammen, C. lari-achtige en andere Campylobacter species, waarvan de identiteit diende geherevalueerd te worden.
In het kader van een polyfasische aanpak zal op de Canadese isolaten ook een AFLP-analyse worden uitgevoerd. “Amplified fragment length Polymorphism” is een techniek die door Vos et al. (1995) werd geïntroduceerd. De techniek kent een hoge resolutie en een hoge reproduceerbaarheid en kan bovendien op een brede waaier organismen worden toegepast. Het is dan ook niet onlogisch dat het gebruik van AFLP sindsdien reeds vele malen werd gerapporteerd (Savelkoul et al., 1999).
Ook zullen vertegenwoordigers van bepaalde clusters van Campylobacter stammen door middel van DNA-DNA-hybridisatie worden onderzocht om na te gaan of ze nieuwe species vertegenwoordigen. DNA-DNA-hybridisatie wordt aanzien als de gouden standaard. De techniek is echter zeer tijdrovend waardoor ze enkel gebruikt wordt in de taxonomie en in uitzonderlijke gevallen voor de identificatie van micro-organismen.
3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1. INLEIDING 3.1.1. hsp60-gen sequentie analyse In de stammenlijst van de hsp60-gen sequentie analyse werden 103 stammen opgenomen. Van 85 stammen kon de DNA-sequentie van het hsp60-gen effectief bepaald worden, 18 stammen konden niet gerecupereerd worden. 3.1.2. 16S rRNA-gen sequentie analyse Voor 6 stammen was verder onderzoek noodzakelijk. Deze stammen werden onderworpen aan volledige 16S rRNA-gen sequentie analyse. 3.1.3. Amplified Fragment Length Polymorphism In de stammenlijst van de AFLP-analyse werden 21 stammen ingesloten. Bevestiging van de resultaten bekomen aan de hand van hsp60-gen sequentie analyse werd verkregen door Amplified Fragment Length Polymorphism. 3.1.4. DNA-DNA-hybridisatie Tenslotte werd ook nog DNA-DNA-hybridisatie uitgevoerd op 8 stammen. 3.2. ONDERZOCHTE STAMMEN In deze studie werden drie groepen isolaten onderzocht. Een eerste groep wordt gevormd door 39 stammen die aan de hand van eiwitelektroforese werden onderzocht en als C. lari werden geclassificeerd. 36 ongewone Campylobacter stammen van diverse afkomst die oorspronkelijk op basis van eiwitelektroforese werden geïndentificeerd, vormen een tweede groep van onderzochte stammen. Een derde groep van isolaten is afkomstig uit Canada en werd aan de hand van hsp60-gen sequentie analyse en AFLP-analyse opgedeeld in 4 groepen en 1 unieke stam. De identiteit van deze 19 Campylobacter stammen werd in deze studie opnieuw onderzocht. Ook werden 9 referentiestammen ingesloten. In
bijlage
1
wordt
de
stammenlijst
van
het
hsp60-onderzoek
weergegeven.
De stammen waarop 16S rRNA-gen sequentie analyse werd uitgevoerd, worden in bijlage 2 weergegeven. In bijlage 3 wordt een overzicht gegeven van de onderzochte stammen in het AFLPonderzoek. In bijlage 4 vindt men het kader van de DNA-DNA-hybridisatie.
3.3. CELKWEEK EN GROEICONDITIES Campylobacter stammen zijn fastidieus. Ze worden opgekweekt op Columbia agar waaraan steriel schapenbloed werd toegevoegd (Oxoid, Wesel, Duitsland). Ook vereisen ze microaërobe groeicondities. Ze worden geïncubeerd in jars onder volgende atmosfeer: ongeveer 4% O2, 6.5% CO2, 6.5% H2 en 83% N2. Aan elke stam uit de collectie wordt een R-nummer of een LMG-nummer toegekend. Stammen met een LMG-nummer worden bewaard in glazen ampules onder gelyofiliseerde toestand. Door met een glassnijder een kras in de ampule te maken, kan de ampule in 2 delen gebroken worden. Vervolgens wordt met een steriele pasteurpipet een klein volume vloeibaar Mueller-Hinton medium opgezogen en overgebracht in de geopende ampule. Tikken tegen de wand van de ampule bevordert het in suspensie gaan van de bacteriën. De vloeistof, die medium en cellen bevat, wordt tenslotte terug opgezogen en verdeeld over een CBA-plaat. Stammen met een R-nummer worden bewaard bij een temperatuur van -80°C op pareltjes (Microbank
TM
) of in bloed (steriel paardenbloed). Met behulp van een steriele entoog
kunnen één of twee parels worden overgebracht en uitgestreken op een klein oppervlak van de CBA-plaat waarna een uitdunningsent kan worden gemaakt. Met behulp van een steriele pasteurpipet kan het bloed worden opgezogen en over een CBA-plaat worden uitverdeeld. De CBA-platen worden gedurende 2 dagen bij 37°C geïncubeerd. Wanneer op dag 3 groei zichtbaar is, wordt een uitdunningsent gemaakt. Hiervoor wordt een kolonie of 2 met behulp van een entoog op een nieuwe CBA-plaat overgebracht en uitgestreken. Om groei van contaminanten uit te sluiten, enten we ook een kleine hoeveelheid celmateriaal over op een TSA-plaat. Op dag 5 moet groei hierop afwezig zijn. Campylobacters zijn bioveiligheidsklasse II organismen. Al deze handelingen moeten bijgevolg uitgevoerd worden in de biohazard.
3.4. GEBRUIKTE TECHNIEKEN 3.4.1. Polymerase Chain Reaction PCR of Polymerase Chain Reaction werd op punt gesteld door Kary Mullis in de jaren 1980 en wordt gebruikt om in vitro een enorme hoeveelheid kopieën van een welbepaalde DNAsequentie te verkrijgen.
PCR buit bepaalde kenmerken van de DNA-replicatie uit. Door dubbelstrengig DNA te verhitten tot bijna kooktemperatuur wordt enkelstrengig DNA bekomen. DNA-polymerase gebruikt dit enkelstrengig DNA als template voor de synthese van de complementaire nieuwe streng. DNA-polymerase heeft eveneens een klein stukje dubbelstrengig DNA nodig om een synthese te starten (de primer). Wanneer we een oligonucleotide primer aan de reactie toevoegen, zal deze zich op een bepaald punt aan de template binden. Het startpunt voor de DNA-synthese kan op deze manier dus worden gespecifieerd. DNA-polymerase kan dus worden gedirigeerd om een specifieke regio van het DNA te synthetiseren. Beide strengen kunnen dienst doen als template op voorwaarde dat een oligonucleotide primer voor elke streng wordt toegevoegd. Voor een bepaalde PCR-reactie worden de primers zo gekozen dat ze de regio van het DNA die moet vermenigvuldigd worden omsluiten. Op deze manier zullen de nieuw gesynthetiseerde strengen zich uitstrekken voorbij de primer op de tegenovergestelde streng. Hierdoor worden nieuwe primer bindingsplaatsen gecreëerd op elke nieuwe gesynthetiseerde DNA-streng. Deze nieuw gesynthetiseerde strengen zijn nu ook beschikbaar voor cycli van denaturatie, primer hybridisatie en DNA-synthese. Op het einde van n cycli wordt een theoretisch maximum van 2n dubbelstrengige DNA-moleculen verkregen die kopieën zijn van de DNA-sequentie tussen beide primers. Het reactiemengsel (25 à 100 μL) voor Polymerase Chain Reaction is samengesteld uit: -
DNA
-
DNA-polymerase
-
Twee oligonucleotide primers
-
Vier deoxynucleotide precursoren (dNTP’s)
-
MgCl2
-
Buffer
Hierbij worden volgende opmerkingen gemaakt: -
Het DNA moet de sequentie inhouden die moet worden geamplificeerd. In normale labo-experimenten is minder dan een μg totaal genomisch DNA nodig, maar er kan ook PCR worden uitgevoerd op één enkele DNA molecule.
-
Oorspronkelijk werd het warmtegevoelige Escherichia coli DNA-polymerase gebruikt in de PCR-reactie. Maar bij de temperaturen nodig voor de denaturatie van het dubbelstrengig DNA werd ook het enzym gedenatureerd. Na iedere cyclus moest dus nieuw DNA-polymerase worden toegevoegd. Nu wordt het
thermostabiele Thermus aquaticus DNA-polymerase gebruikt. Het enzym is stabiel tot een temperatuur van 95°C en moet dus enkel bij de start van de PCR worden toegevoegd. Het blijft voldoende actief gedurende alle cycli. Bovendien kunnen in vergelijking met E. coli DNA-polymerase hogere temperaturen gebruikt worden waardoor minder aspecifieke annealing optreedt. -
De primers worden synthetisch aangemaakt. Ze zijn meestal 20 tot 30 basen lang en enkelstrengig. Het 3’ uiteinde is preferentieel rijk aan G en C en mag zeker geen misprime bevatten. De primers zijn complementair aan de uiteinden van het te amplificeren DNA-fragment.
-
Er moeten nucleotiden met zowel adenine, guanine, thymine en cytosine als base in het reactiemengsel aanwezig zijn.
-
De MgCl2-concentratie heeft een belangrijke invloed op de PCR-reactie. MgCl2 bevordert de complexatie van dNTP’s en verhoogt de activiteit van het Taqpolymerase. Een te hoge concentratie aan Mg2+ geeft aanleiding tot vorming van aspecifieke PCR-producten, een te lage concentratie leidt tot geen of weinig PCRproduct.
-
De PCR-buffer creëert een optimaal milieu voor DNA-polymerase.
De Polymerase Chain Reaction verloopt in verschillende stappen (zie Figuur 3.1.) : -
In de eerste stap wordt het reactiemengsel gedurende 5 minuten opgewarmd tot 94°C. Bij deze temperatuur worden de waterstofbruggen tussen de twee strengen van dubbelstrengig DNA verbroken, scheiden de twee DNA-strengen zich van elkaar en worden enkelvoudige strengen gevormd die dienst doen als template voor de primers en het DNA-polymerase. -
Vervolgens wordt het reactiemengsel gekoeld (tot 30-65°C) zodat de primers kunnen binden aan de template. De annealing temperatuur is verantwoordelijk voor de specificiteit van de PCR-reactie: als de temperatuur te hoog is kunnen de primers niet hybridiseren, wanneer de temperatuur te laag is kan aspecifieke binding optreden. De annealing temperatuur (Ta) wordt gekozen op basis van de smelttemperatuur (Tm, d.i. de temperatuur waarbij de helft van de basen van het dubbelstrengig DNA ongepaard zijn).
-
Nadien wordt de temperatuur opnieuw verhoogd tot 72°C. Dit is de temperatuur waarbij het Taq-polymerase optimaal werkzaam is. Deze temperatuur wordt gedurende 1 à 2 minuten aangehouden zodat de synthese van DNA kan doorgaan.
-
Tenslotte wordt de temperatuur verder verhoogd tot 94°C waardoor opnieuw denaturatie optreedt. De korte stukjes dubbelstrengig DNA worden vlotter gescheiden (en het genomische DNA renatureert niet volledig) waardoor deze hoge temperatuur slecht gedurende 20 seconden moet worden aangehouden.
Hierna kan het hele proces opnieuw starten. Meestal worden er 30 tot 60 cycli van denaturatie, annealing en DNA-synthese doorlopen. Tenslotte is er een finale elongatiestap van 5 tot 10 minuten bij 72°C.
FIGUUR 3.1. : TEMPERATUUR (IN °C) IN FUNCTIE VAN DE TIJD (IN MINUTEN) TIJDENS EEN PCR-CYCLUS 3.4.2. Agarose gel elektroforese Elektroforese is een procedure waarmee geladen molecules kunnen worden gescheiden onder invloed van een elektrisch veld. De mobiliteit van de molecules is afhankelijk van hun lading (q), maar ook van hun grootte en hun vorm (f). De molecules hebben een bepaalde elektroforetische mobiliteit: μ = v/ε = q/f = Ze/f met:
μ = elektroforetische mobiliteit (m2/volt.s) v = snelheid (m/s) ε = elektrische veldsterkte (volt/m) q = lading (C) f = frictiecoëfficiënt Z = atoomnummer e = elektronlading ( C)
Bij gel elektroforese worden de molecules gescheiden in een poreuze gel. Gels op basis van agarose, een polysaccharide, worden gebruikt voor de scheiding van DNA-fragmenten. Wanneer een elektrisch veld wordt aangelegd, migreren de DNA-fragmenten doorheen de gel naar de positieve pool, dit omwille van de negatief geladen fosfaatgroepen in DNA bij neutrale pH. Voor het DNA of het amplicon op gel wordt gebracht, wordt loading dye toegevoegd. Loading dye bevat sucrose en kleurstof waardoor het DNA of het amplicon wordt verzwaard en kan worden gevolgd op gel. Nadat elektroforese is uitgevoerd, kan de gel worden gekleurd. Meestal wordt ethidiumbromide gebruikt, een rode fenanthridinekleurstof die intercaleert tussen de basenparen van het DNA. Intercalatie verhoogt de fluorescentie waardoor het DNA kan worden gevisualiseerd wanneer de gel onder UV-licht wordt bekeken.
3.4.3. Cycle sequencing Sequenering is het achterhalen van de precieze volgorde van de nucleotiden in een DNAmolecule. De genetische informatie is namelijk vervat in die specifieke opeenvolging van de 4 nucleotiden A, T, G en C. Sequentie PCR gebeurt volgens de dideoxy-methode van Sanger. Het reactiemengsel bevat naast template DNA, DNA-polymerase, primer, deoxyribonucleoside trifosfaten (dNTP’s) en sequentiebuffer ook een kleine hoeveelheid dideoxyribonucleoside trifosfaten (ddNTP’s) die basenspecifiek gelabeld zijn. In het dideoxy-suiker ontbreekt de 3’ hydroxylgroep die nodig is om de volgende fosfordiësterbinding te vormen. Wanneer dus een dideoxynucleotide wordt ingebouwd in plaats van een deoxynucleotide kan de ketenverlenging niet meer verder gaan. De ddNTP’s kunnen tijdens de DNA-synthese op elke complementaire base in de template binden waardoor de ketenverlenging dan ook op elke plaats kan worden gestopt. Er moet worden opgemerkt dat bij sequentie PCR slechts één primer wordt gebruikt, in tegenstelling tot amplificatie PCR, waar twee primers in het reactiemengsel aanwezig zijn. Hierdoor stijgt het reactieproduct lineair in plaats van exponentieel. Dit heeft tot gevolg dat er veel meer startmateriaal nodig is. Daarom gaan amplificatie PCR en opzuivering van de amplicons sequentie PCR vooraf. Finaal worden dus DNA-fragmenten van verschillende lengte die eindigen op 1 van de 4 basen en die fluorescent gelabeld zijn, gegenereerd. Deze fragmenten kunnen vervolgens gescheiden worden aan de hand van gel elektroforese. De
positie van de fragmenten wordt gevisualiseerd door fluorescentie en de sequentie kan zo van de gel worden afgelezen. Voor de stalen op de sequenator worden geplaatst, vindt een opzuiveringsstap plaats. Xterminator (Apllied Biosystems, Californië, VS) bindt de resterende, niet-ingebouwde dideoxynucleotiden en de vrije zouten. SAM (Applied Biosystems, Californië, VS) stabiliseert het DNA. Detectie van de DNA-fragmenten gebeurt met behulp van het ABI PRISM 3010 sequenator toestel (Applied Biosystems, Californië, VS). Dit is een geautomatiseerd elektroforese detectiesysteem dat aangepast is aan de scheiding, de detectie en de identificatie van fluorescent gemerkte moleculen.
3.4.4. Amplified Fragment Lenght Polymorphism Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) is een techniek die gebaseerd is op de selectieve amplificatie van restrictie fragmenten van het totaal genomisch DNA aan de hand van PCR (zie Figuur 3.2.). Het totaal cellulair DNA wordt geknipt met 2 restrictie enzymen, een hexa cutter (H) die een sequentie van 6 basenparen herkent en een gemiddelde knip frequentie heeft en een tetracutter (T) met een 4 basenparen herkenningssequentie en een hoge knip frequentie. Er ontstaan zo drie types restrictie fragmenten: H-H, H-T en T-T. Fragmenten van 50 tot 500 basenparen zijn het best geschikt voor verdere analyse. Na digestie volgt ligatie van adapters aan beide uiteinden van de restrictie fragmenten. Adapters zijn korte stukjes dubbelstrengig DNA die zo ontworpen zijn dat de oorspronkelijke restrictie site niet wordt hersteld na ligatie van de adapter aan het fragment en zodat template DNA voor amplificatie ontstaat. Er zijn 2 soorten adapters: hexa adapters (die specifiek binden op de H restrictie plaats) en tetra adapters ( die specifiek binden op de T restrictie plaats). Beide adapters zijn gefosforyleerd, waardoor adapter-adapter ligatie wordt vermeden. Na digestie en ligatie volgt selectieve PCR. De PCR primers zijn adapter specifiek en bevatten aan hun 3’ uiteinde één tot drie selectieve nucleotiden. Hierdoor worden enkel de fragmenten, waarvan de nucleotiden die volgen op de restrictie plaats complementair zijn aan de selectieve nucleotiden, geamplificeerd. Theoretisch wordt voor iedere selectieve base die wordt gebruikt ongeveer één vierde van de fragmenten geamplificeerd. Het aantal fragmenten dat zo op polyacrylamide gel wordt gebracht schommelt tussen 40 en 200. De hexa primer is gemerkt
met een fluorescent label aan het 5’uiteinde. Tenslotte worden de PCR-producten gescheiden volgens grootte door middel van polyacrylamide gel elektroforese of capillaire elektroforese. Alleen de producten die een fluorescent label bezitten worden gevisualiseerd wat tot gevolg heeft dat de T-T fragmenten niet zichtbaar zijn. De elektroforetische profielen worden genormaliseerd en kunnen vervolgens met elkaar worden vergeleken met behulp van de gepaste computersoftware. Wij maakten gebruik van de HindIII en de HhaI restrictie-enzymen voor digestie van het DNA. Dit zijn respectievelijk een hexa cutter en een tetra cutter. Vervolgens werden de HindIII- en de HhaI-adapters geligeerd aan de restrictie fragmenten. De primers gebruikt voor selectieve PCR waren het fluorescent gelabelde H01-6FAM en tH01. Aan de mastermix voor op de sequenator werd LIZ-600 toegevoegd als interne standaard. Verwerking van de resultaten gebeurde in BioNumerics.
FIGUUR 3.2. : VERLOOP AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM-ANALYSE (DEBRUYNE, 2009) 3.4.5. DNA-DNA-hybridisatie In de taxonomie wordt DNA-DNA-hybridisatie als gouden standaard gebruikt om bacteriën op soortniveau te classificeren of te identificeren. Hybridisatie is een renaturatie reactie tussen enkelstrengig DNA van verschillende oorsprong. Hybridisatie zal enkel plaatsvinden wanneer er een zeker graad sequentie gelijkenis tussen de twee verschillende DNA-strengen bestaat.
Wij maakten gebruik van de microplaatmethode van Ezaki et al. (1989) (zie Figuur 3.3.). Hierbij wordt het DNA van het eerste micro-organisme gedenatureerd en verdund in PBSMgCl2 waarna het niet-covalent aan de polystyreenplaat wordt gebonden. Het DNA van het tweede micro-organisme wordt gemengd met fotobiotine waarna het wordt belicht. De overmaat aan fotobiotine wordt geëxtraheerd met butanol. Tenslotte kan de hybridisatie plaatsvinden: het probe DNA wordt aan het gefixeerde DNA toegevoegd en de platen worden bij 30°C, de hybridisatietemperatuur berekend voor Campylobacter, geïncubeerd. Na 3 uur incubatie worden de platen met 1xSSC gewassen zodat het niet gebonden probe DNA wordt verwijderd. Om de graad van hybridisatie te bepalen vindt een enzymatische ontwikkeling plaats. Eerst wordt streptavidine-β-galactosidase gebonden op het fotobiotine waarmee het DNA gelabeld is. Vervolgens wordt 4-methylumbelliferyl-β-D-galactosidase omgezet naar 4-methylumbelliferone. Tenslotte kan de fluorescentie gemeten worden met de microtiterplaatlezer. De hybridisatiewaarden worden in relatie met de homologe reactie berekend.
FIGUUR 3.3. : VERLOOP DNA-DNA-HYBRIDISATIE
3.5. HSP60-GEN SEQUENTIE ANALYSE 3.5.1. Extractie van DNA 3.5.1.1. DNA-bereiding volgens alkalische lyse Van de uitdunningsent wordt met de tip van een pipet één kolonie opgepikt. Deze kolonie wordt overgebracht en gesuspendeerd in een epje dat 20 μL lysebuffer bevat. Het eppendorfbuisje wordt gedurende 15 minuten in een hitteblok bij 95°C verwarmd. Om de reactie te stoppen, wordt het epje onmiddellijk op ijs gekoeld. Vervolgens voeren we een short spin centrifugatie uit (Eppendorf Centrifuge 5417C, Hamburg, Duitsland). Hierna wordt er 180 μL steriel MilliQ-water toegevoegd en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 13000 rpm. Het staal kan bewaard worden bij -20°C.
3.5.1.2. DNA-bereiding volgens Pitcher et al. (1989) We verzamelen met een plastic entoog een kleine hoeveelheid cellen van de uitdunningsent en brengen deze over in een epje dat 500 μL RS buffer bevat. Het epje wordt gedurende 2 minuten bij 13000 rpm gecentrifugeerd en het supernatans wordt verwijderd. De overblijvende cellen worden gesuspendeerd in 100 μL 1xTE buffer. Vervolgens voegen we 500 μL GES oplossing toe en mengen we door inversie zodanig dat cellyse kan optreden. Ook kan zo, tijdens het koelen op ijs gedurende 10 min, de GES oplossing onderaan niet uitkristalliseren. Hierna voegen we 250 μL 7,5 M NH4OAc toe, kantelen we het epje en koelen we het gedurende 10 min op ijs. Vervolgens voegen we 500 μL koude chloroform/isoamylalcohol toe en schudden we het epje krachtig tot een homogene suspensie wordt verkregen. Er wordt 20 minuten gecentrifugeerd bij 13000 rpm. De bovenste waterige fase, die het DNA bevat, brengen we over in een vers epje, waaraan we 0,54 V koude isopropanol toevoegen. We mengen tot het DNA neerslaat, wat te zien is als een wit wolkje dat verschijnt. We centrifugeren gedurende 30 minuten en we pipetteren de vloeistof af. We wassen 3 maal met 100 μL 70% ethanol en laten uiteindelijk drogen aan de lucht . Na ongeveer 1 uur, wanneer geen ethanoldruppels meer zichtbaar zijn, voegen we 100 μL 1xTE buffer toe en stockeren we het epje overnacht bij 4°C. De volgende dag, of wanneer het DNA volledig in oplossing is, voeren we de RNAse stap uit: we voegen 25 μL 250μg/mL RNAse toe en incuberen het epje 1 uur bij 37°C. Het staal kan daarna bewaard worden bij -20°C. Om te controleren of de DNA-extractie succesvol is verlopen en of het DNA niet afgebroken is, zetten we een kleine hoeveelheid materiaal op gel. (Zie 3.5.5.)
3.5.2. Meten van de optische densiteit van het DNA Van de verkregen DNA-oplossing wordt in een 1,5 mL eppendorfbuisje een 10x verdunning gemaakt. De verdunning wordt gevortexed, gecentrifugeerd en vervolgens in een well van de 96 well plaat overgebracht. De optische densiteit bij 260 nm wordt met de Spectra Max Plus 384 (Molecular devices, VS) gemeten.
3.5.3. Verdunnen van het DNA Aan de hand van de regel van drie berekenen we de hoeveelheid initiële DNA-oplossing die nodig is om een verdunning met optische densiteit 1 of 0.2 te bekomen. Initieel streefden we naar een oplossing met een optische densiteit bij 260 nm van 1, wat wil zeggen dat in 1 μL oplossing 50 ng DNA aanwezig is . Wanneer met OD 1 niet de gewenste resultaten bekomen werden, probeerden we een oplossing met een optische densiteit bij 260 nm van 0.2, dit is 10 ng DNA per μL oplossing, uit.
3.5.4. Uitvoeren van amplificatie PCR Bij het aanmaken van de mastermix voor PCR gelden 3 regels: de bench moet vooraf gereinigd worden met umonium, er moeten handschoenen gedragen worden en de gebruikte producten moeten tussendoor op ijs bewaard worden. De samenstelling van de mastermix voor 1 reactie (50 μL), gebruik makend van DNA met een OD 1, is: MilliQ 10xPCR buffer (Qiagen, Hilden, Duitsland) dNTP’s (2mM) (Pharmacia, Uppsala, Zweden) H729 (10µM) (Sigma-Aldrich, Sint-Louis, VS) H730 (10µM) (Sigma-Aldrich, Sint-Louis, VS) Taq-polymerase (1U/µl) ((Qiagen, Hilden, Duitsland)
36 μL 5 μL 5 μL 1 μL 1 μL 1 μL 49 μL De samenstelling van de mastermix voor 1 reactie (50 μL), gebruik makend van DNA met een OD 0,2, is: MilliQ 10xPCR buffer (Qiagen, Hilden, Duitsland) dNTP’s (2mM) (Pharmacia, Uppsala, Zweden) H729 (10µM) (Sigma-Aldrich, Sint-Louis, VS) H730 (10µM) (Sigma-Aldrich, Sint-Louis, VS) Taq-polymerase (1U/µl) (Qiagen, Hilden, Duitsland)
32 μL 5 μL 5 μL 1 μL 1 μL 1 μL 45 μL Deze samenstelling vermenigvuldigen we met het aantal DNA-stalen (vermeerderd met een controle staal en een blanco staal) zodat de mastermix kan worden aangemaakt. De mix wordt vervolgens gevortexed en gecentrifugeerd. Van de mix brengen we ofwel 49 μL ofwel 45 μL over in de PCR-buisjes waaraan we vervolgens respectievelijk 1 μL DNA (OD 1) of 5 μL DNA (OD 0.2) toevoegen. De PCR-strips worden in het PCR-toestel geplaatst. Wij maakten gebruik van een
automatisch thermocyclisch PCR-toestel, PTC-100 Peltier Thermal Cycler ( MJ research, Waltham, MA, VS). Het volgende programma wordt gekozen: 2 min bij 95°C 40 cycli (30 s bij 95°C, 30 s bij 46°C, 30 s bij 72°C ) 5 min bij 72°C Nadien wordt het reactieproduct bewaard bij 4°C.
3.5.5. Uitvoeren van agarose gel elektroforese Om een 1%-agarosegel te verkrijgen, warmen we 1 g agarose (Biozym B.V., Landgraaf, Nederland) op in 100 mL 1xTBE buffer tot kookpunt. Wanneer er geen kristallen meer zichtbaar zijn, en de agarose dus volledig in oplossing is, laten we de agarosevloeistof even afkoelen vooraleer we hem in de elektroforesehouder met kammetjes gieten. We laten de vloeistof stollen, zodat na ongeveer 30 minuten een gel wordt bekomen. De kammetjes kunnen dan uit de gel worden losgemaakt en de elektroforesehouder met gel mag in de elektroforesetank (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, VS) worden geplaatst. We voegen 1xTBE buffer toe zodat de gel volledig is ondergedompeld. Aan 5 μL van het amplificatie PCR-product (of Pitcher-DNA, zie 3.5.1.) voegen we 1 μL loading dye toe. Deze 6 μL laden we in de slotjes van de gel. Vooraan elke reeks slotjes laden we 5 μL smartladder (Eurogentec, Luik, België). Ten slotte kan de elektroforese worden gestart: we leggen een spanning aan van 75 V en een stroom van 400 mA, dit gedurende 45 min. Na elektroferse wordt de gel gedurende 30 tot 45 minuten gekleurd in een ethidiumbromide-bad en vervolgens bekeken onder UV-licht. Er wordt een foto van het beeld gemaakt.
3.5.6. Opzuiveren van het amplificatie PCR-product Wanneer op de agarosegel een amplicon met juiste grootte zichtbaar was, mogen we het amplificatie PCR-product opzuiveren: de resterende dNTP’s en primers worden weggewassen. Opzuivering kan op 2 manieren gebeuren. Wanneer we werken met een groot aantal stalen maken we gebruik van de Tecan Workstation genesis 200 (Tecan Trading AG, Männedorf, Zwitserland) en een nucleofast 96
well-plaat, waarvan de bodem van elke well bestaat uit een ultrafiltratiemembraan met een cut offwaarde van 150 baseparen. De resterende 45 μL van de stalen worden op de plaat gebracht en de plaat wordt op het werkstation geplaatst. Er wordt een vacuüm gecreëerd waardoor de vloeistof doorheen het membraan wordt gezogen. Wanneer geen druppels meer zichtbaar zijn, wordt het vacuüm verbroken. De staaltjes worden vervolgens gewassen met 100 μL MilliQ-water en er wordt opnieuw een vacuüm aangelegd gedurende ongeveer 10 minuten. Ten slotte wordt aan iedere well een bepaalde hoeveelheid water toegevoegd en brengen we het geheel over in nieuwe PCR-strips. Het toe te voegen volume water wordt berekend door de intensiteit van het amplicon op de gel te vergelijken met de smartladder. We streven naar een concentratie aan amplicon van 8 ng/ μL. Wanneer we slechts over een klein aantal stalen beschikken, gebruiken we een alternatieve methode voor de opzuivering van het amplicon. We maken dan gebruik van de QIAquick ® PCR Purification Kit (250) (Qiagen, Hilden, Duitsland). In het kolommetje in het epje brengen we 250 μL PBI binding buffer en 45 μL amplicatie PCR-product. Het amplicon wordt door de binding buffer gebonden op de filter van de kolom. We centrifugeren gedurende 1 min bij 14000 rpm waardoor de vloeistof en de resterende primers en dNTP's doorheen de filter worden gezogen. We verwijderen deze vloeistof uit het epje. Vervolgens voegen we 750 μL PE wash buffer toe en centrifugeren we opnieuw 1 min bij maximaal aantal rotaties. We verwijderen de vloeistof en wederom voeren we een short spin centrifugatie uit. We brengen de kolommetjes over in een nieuw epje en voegen het berekende volume MilliQwater toe. We laten de kolommetjes even rusten in de epjes en centrifugeren ten slotte een laatste maal gedurende 1min aan 14000 rpm.
3.5.7. Uitvoeren van sequentie PCR Op ieder staal voeren we twee reacties uit: één maal voegen we de forwardprimer toe en één maal de reverseprimer. Hiermee moeten we rekening houden bij de berekening van de mastermix. De samenstelling van de mastermix voor 1 reactie (10 μL) is: MilliQ 5xSB ( Apllied Biosystems, Californië, VS) Big dye (v3.1) ( Apllied Biosystems, Californië, VS)
1.857 μL 1.857 μL 0.286 μL 4 μL
Deze samenstelling vermenigvuldigen we met het aantal reacties, wat dus het dubbele van het aantal stalen is. De mastermix wordt aangemaakt, lichtjes gevortexed en gecentrifugeerd. Vervolgens verdelen we de mix over twee vials. Aan de ene vial voegen we per staal 3 μL forwardprimer toe, namelijk M13(-40)F;aan de andere vial voegen we per staal 3 μL reverseprimer, M13(48)R toe. De twee vials worden ook gevortexed en gecentrifugeerd. Van elke mix brengen we 7 μL over in PCR-buisjes, waaraan we vervolgens 3 μL opgezuiverd amplificatie PCR-product toevoegen. De PCR-strips worden in het PCR-toestel geplaatst en het volgende programma wordt gestart: 30 cycli (15 s bij 96°C, 1 s bij 35°C, 4 min bij 60°C) Nadien wordt het reactieproduct bewaard bij 4°C of bij -20°C.
3.5.8. Opzuiveren van het sequentie PCR-product en sequenering Voor de opzuivering van de sequentie PCR-producten werken we in de trekkast en worden handschoenen gedragen. In iedere well van een 96 well-reactieplaat (MicroAmp Optical 96well reaction plate (Applied Biosystems, Californië, VS) ) voegen we 45 μL SAM en 10 μL Xterminator toe. Vervolgens brengen we in elke well ook de 10 μL sequentie PCR-product. We dekken de plaat af met een drukfolie en plaatsen die op het schudtoestel (MixMate PCR 96, Eppendorf, Hamburg, Duitsland) bij 2000 rpm gedurende 30 min. Tenslotte vervangen we de drukfolie door een septum (Apllied Biosystems, Californië, VS) en centrifugeren we de plaat 3 min aan 1000g in de centrifuge 5804R (Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland). De plaat is nu klaar voor de sequenator.
3.5.9. Verwerking van de resultaten De sequenties worden verwerkt met behulp van Bionumerics 5.1 (AppliedMaths, SintMartens-Latem, België). Een fylogenetische boom wordt geconstrueerd met de UPGMA en neighbor joining methodes.
3.6. 16S rRNA-GEN SEQUENTIE ANALYSE 3.6.1. Extractie van DNA Zie 3.5.1.
3.6.2. Meten van de optische densiteit van het DNA Zie 3.5.2. 3.6.3. Verdunnen van het DNA Zie 3.5.3. 3.6.4. Uitvoeren van amplificatie PCR De amplificatie van het 16S rRNA-gen verloopt op dezelfde manier als deze van het hsp60gen, enkel de samenstelling van de mastermix verschilt. De samenstelling van de mastermix voor 1 reactie (50 μL), gebruik makend van DNA met een OD 1, is: MilliQ 10xPCR buffer (Qiagen, Hilden, Duitsland) dNTP’s (2mM) (Pharmacia, Uppsala, Zweden) pA (10µM) (Sigma-Aldrich, Sint-Louis, VS) pH (10µM) (Sigma-Aldrich, Sint-Louis, VS) Taq-polymerase (1U/µl) ((Qiagen, Hilden, Duitsland)
37 μL 5 μL 5 μL 0,5 μL 0,5 μL 1 μL 49 μL
3.6.5. Uitvoeren van agarose gel elektroforese Zie 3.5.5. 3.6.6. Opzuiveren van het amplificatie PCR-product Zie 3.5.6.
3.6.7. Uitvoeren van sequentie PCR Op ieder staal voeren we acht reacties uit. Er zijn immers acht primers, namelijk BKL1, *PD, γ, * γ, З, * З, *O en *R, nodig om het volledige 16S rRNA-gen te omsluiten. Hiermee moeten we rekening houden bij de berekening van de mastermix. De samenstelling van de mastermix voor 1 reactie (10 μL) is: MilliQ 5xSB ( Apllied Biosystems, Californië, VS) Big dye (v3.1) ( Apllied Biosystems, Californië, VS)
1.857 μL 1.857 μL 0.286 μL 4 μL
Deze samenstelling vermenigvuldigen we met het aantal reacties, wat dus 8 maal het aantal stalen is. De mastermix wordt aangemaakt, lichtjes gevortexed en gecentrifugeerd. Vervolgens verdelen we de mastermix over acht vials. Aan iedere vial voegen we per staal
3 μL van één van de acht primers toe. De acht vials worden ook lichtjes gevortexed en gecentrifugeerd. Van elke mix brengen we 7 μL over in PCR-buisjes, waaraan we vervolgens 3 μL opgezuiverd amplificatie PCR-product toevoegen. De PCR-strips worden in het PCR-toestel geplaatst en het volgende programma wordt gestart: 30 cycli (15 s bij 96°C, 1 s bij 35°C, 4 min bij 60°C) Nadien wordt het reactieproduct bewaard bij 4°C of bij -20°C.
3.6.8. Opzuiveren van het sequentie PCR-product en sequenering Zie 3.5.8. 3.6.9. Verwerking van de resultaten Zie 3.5.9.
3.7. AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM 3.7.1. Bereiding van DNA De extractie van DNA verloopt volgens Pitcher et al. (1989) zoals beschreven voor hsp60-gen sequentie analyse. Ook de meting van de optische densiteit van het DNA verloopt analoog. Standaard wordt vertrokken van 1 μg DNA. Hiervoor delen we 20 door de optische densiteit bij 260 nm en verkrijgen we het aantal μL DNA dat in een epje moet worden gebracht. Indien dit volume minder dan 30 μL bedraagt, lengen we aan met steriel MilliQ-water tot 30 μL.
3.7.2. Bereiding van template DNA (tDNA) De bereiding van het template DNA verloopt in 3 stappen: digestie, ligatie en precipitatie. De eerste stap is digestie van het DNA. De digestiemix kent volgende samenstelling voor 10 stalen: NEB4 buffer (10x) BSA (10mg/ml) MilliQ HindIII (20U/μL) HhaI (20U/μL)
40 μL 4 μL 51 μL 2,5 μL 2,5 μL -------100 μL
De producten moeten tussendoor steeds koel worden gehouden in een koelblok (0°C). Na bereiding wordt de mix gevortexed, gecentrifugeerd (short spin centrifugatie) en uitverdeeld. Aan ieder epje met 1 μg DNA wordt 10 μL van de digestiemix toegevoegd. De digestiemix wordt door middel van inversie gemengd met het DNA, gecentrifugeerd en vervolgens gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Tot slot volgt een short spin centrifugatie. Onmiddellijk na digestie volgt de ligatiestap. De ligatiemix kent volgende samenstelling voor 10 stalen: NEB4 buffer (10x) BSA (10mg/ml) ATP (10mM) HindIII adapter (2μM) HhaI adapter (20μM) MilliQ T4 ligase
10 μL 1 μL 50 μL 10 μL 10 μL 18 μL 1 μL -------100 μL De producten moeten tussendoor in een koelblok bij 0°C worden bewaard. De ligatiemix wordt aangemaakt, gevortexed en gecentrifugeerd. Aan ieder epje wordt 10 μL mix toegevoegd. Het epje wordt gekanteld en gecentrifugeerd en vervolgens gedurende 1 uur bij 37°C in een verwamblok geplaatst. Tenslotte wordt een short spin centrifugatie uitgevoerd. Het zo verkregen template DNA kan worden ingevroren bij -20°C of kan worden geprecipiteerd. Voor precipitatie worden volgende stoffen aan elk epje toegevoegd: + 66 μL MilliQ + 84 μL NH4OAc (6M) + 200 μL isopropanol (100%) We mengen door inversie tot een homogene vloeistof ontstaat. Vervolgens laten we de epjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur rusten om ze erna 15 minuten bij 14000 tpm gekoeld te centrifugeren. Er wordt zo een pellet gevormd, het supernatans mag verwijderd worden. Op de pellet brengen we 200 μL 70% ethanol. De epjes worden opnieuw gekoeld gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 14000 tpm en het supernatans wordt verwijderd. Om het geprecipiteerde tDNA te drogen, worden de epjes 10 minuten in de vacuümcentrifuge geplaatst. Tot slot voegen we aan ieder epje 100 μL T0,1E pH 8,0 toe en pipetteren we 5 maal zachtjes op en neer.
3.7.3. Bereiding van selectief PCR-product Voor selectieve PCR maken we een mix met volgende samenstelling voor 10 stalen aan: H01-6FAM tH01 PCR buffer (10x) dNTP’s (2mM elk) MilliQ AT (1U/μL)
5 μL 5 μL 10 μL 10 μL 49 μL 6 μL --------85 μL De producten moeten tussendoor in een koelblok bij 0°C worden bewaard. De PCR-mix wordt aangemaakt, gevortexed en gecentrifugeerd. Van de mix wordt 8,5 μL overgebracht in steriele PCR-buisjes. Vervolgens voegen we aan elk buisje 1,5 μL template DNA toe. De PCRstrips worden kort afgecentrifugeerd voor ze in het PCR-toestel Perkin Elmer GeneAmp 9600 (Perkin Elmer Inc., Wellesley, VS) worden geplaatst. Het volgende PCR-programma wordt gelopen: 2 min 94°C + (20s 94°C) (30s 66°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 65°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 64°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 63°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 62°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 61°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 60°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 59°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 58°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 57°C) (2min 72°C) (20s 94°C) (30s 56°C) (2min 72°C) + 30min 60°C + ongedefinieerd 4°C
-> 1x -> 1x -> 1x -> 1x -> 1x -> 1x -> 1x -> 1x -> 1x -> 1x -> 20x
Na het aflopen van het programma worden de PCR-strips opnieuw kort afgecentrifugeerd. De selectieve PCR-producten kunnen worden bewaard bij -15 tot -35°C wanneer ze met aluminiumfolie worden afgedekt.
3.7.4. Capillaire elektroforese Er wordt een mix gemaakt bestaande uit 8,6 μL formamide en 0,4 μL Liz-600 interne standaard per staal. Deze mix wordt uitverdeeld (9μL/well) in een 96 well plaat (MicroAmp Optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems, Californië, VS) ). Vervolgens wordt 1μL
selectief PCR-product toegevoegd. Alvorens de plaat op het ABI PRISM 3010 toestel te plaatsen, wordt deze kort gecentrifugeerd in de centrifuge 5804R.
3.7.5. Analyse van de profielen De AFLP-fingerprints worden verwerkt met behulp van Bionumerics 5.1 door middel van de curve methode. Een dendrogram werd geconstrueerd aan de hand van de pearson correlatie en de UPGMA matrix.
3.8. DNA-DNA-HYBRIDISATIE 3.8.1. Isolatie van totaal DNA uit bacteriën volgens Pitcher et al. (1989): MIDI-10 Deze DNA-extractie verloopt zoals beschreven onder 3.5.1.2. met volgende aanpassingen: - De gewichten en volumes zijn groter: we starten met 250-500 mg bacteriën en voegen achtereenvolgens 5 mL RS buffer, 1 mL 10mM Tris-100mM EDTA pH 8,0 (in plaats van 1xTE), 5 mL GES, 2,5 mL 7,5 M NH4OAc, 5 mL chloroform/isoamylalcohol (24:1) en 4,8 mL isopropanol toe. - Vervolgens draaien we het DNA op op een steriele staaf en wassen we het in een EtOH-reeks (70, 80 en 90%). Daarna laten we het DNA drogen aan de lucht waarna we het oplossen in 1 mL 0,1x TE pH 8,0. Bijkomend wordt het RNA verwijderd. Hiervoor voegen we 10 μL RNAse (10mg/ml) toe, mengen we door inversie en plaatsen we het epje gedurende 1 uur bij 37°C. Vervolgens voegen we achtereenvolgens 112 μL Acetaat-EDTA en 700 μL chloroform/isoamylalcohol toe en mengen we zachtjes door inversie. De epjes worden gedurende 20 minuten bij 11800 tpm gecentrifugeerd en de bovenste fase wordt overgebracht in een glazen potje. We voegen 2 mL 100% EtOH toe waardoor het DNA precipiteert en zichtbaar wordt als een vlok. Tenslotte kan het DNA terug op een steriel staafje worden opgedraaid en gewassen in een EtOH-reeks. Daarna laten we het DNA drogen aan de lucht waarna we het oplossen in 500 μL 0,1 x SSC pH 8,0.
3.8.2. Fixatie van DNA Het DNA met optische densiteit 10 wordt verdund met 0,1 SSC (Standaard Saline Citraat) tot een DNA-oplossing met optische densiteit 2 wordt bekomen. Deze oplossing plaatsen we gedurende 10 minuten in een hitteblok bij 100°C zodat denaturatie kan optreden. Om de reactie te stoppen worden de epjes minstens 5 minuten op ijs gekoeld. Vervolgens kan de fixatie mix worden aangemaakt. We verdunnen hiervoor het DNA met PBS-Mg (fosfaatgebufferd saline met MgCl2) naar een oplossing met OD 0,2. PBS-Mg zorgt namelijk voor de niet-covalente fixatie van het DNA aan de polystyreenplaten. Van de fixatie mix voegen we 100 μL per well toe, en dit in viervoud voor elk van de te hybridiseren stammen. We dekken de platen af met zelfklevende folie en plaatsen ze ten minste 4 uur bij 30°C. Na incubatie wordt de vloeistof uit de platen gegoten en worden de platen gedroogd in een oven bij 52°C gedurende 10 à 20 minuten.
3.8.3. Bereiding van probe DNA In een steriel epje van 1,5 μL brengen we 10μL DNA-oplossing met optische densiteit 10. Hieraan voegen we een gelijk volume fotobiotine toe. We mengen en centrifugeren vervolgens kort af. De epjes worden geopend en in een ijzeren houder op ijs geplaatst. We belichten de epjes gedurende 30 minuten onder een 400W Mercury lamp. Tijdens het wachten kan de pre-hybridisatie stap reeds uitgevoerd worden (3.8.4.). Vervolgens voegen we aan ieder epje 185 μL Tris-HCl (pH 9,0) en 200 μL BuOH toe. We mengen zodat het DNA kan oplossen in de Tris-HCl-fase, het fotobiotone gaat over naar de organische fase. Na centrifugatie kan deze bovenste fase afgehaald worden zodat de overmaat aan fotobiotine (dit is het fotobiotine dat niet gebonden is aan het DNA) wordt verwijderd. We herhalen deze BuOH-extractie totdat de bovenste fase helder wordt en dus geen (of slechts weinig) ongebonden fotobiotine molecules meer aanwezig zijn. De epjes worden vervolgens gesoniceerd met behulp van een Microson Ultrasonic DNA/cell disruption apparatus. Op deze manier worden kleine probe DNA-fragmenten verkregen die gemakkelijker kunnen binden aan het gefixeerde DNA. De opgezuiverde en gesoniceerde probe oplossing wordt vervolgens gedurende 10 minuten bij 100°C gedenatureerd. De epjes worden hierna even geopend om het overblijvende BuOH te laten ontsnappen voor ze op ijs worden geplaatst. Tenslotte mengen we 50 μL van deze probe-oplossing met 950 μL hybridisatieoplossing (prehybridisatievloeistof waaraan dextraansulfaat werd toegevoegd).
3.8.4. Pre-hybridisatie Pre-hybridisatie gaat de hybridisatie vooraf. Blanco strips worden aan de microplaat toegevoegd ter controle van de techniek. Deze blanco strips werden gefixeerd met zalm sperma DNA. Aan het gefixeerde DNA wordt 200 μL prehybridisatie oplossing toegevoegd. Het polyvinylpyrolidon en het zalm sperma DNA uit deze oplossing verhinderen de nietspecifieke binding van het bacteriële DNA aan de polystyreenplaten. De platen worden afgedekt met zelfklevende folie en in een oven bij de optimale renaturatie temperatuur voor minstens 30 minuten geïncubeerd. Na incubatie wordt de vloeistof uit de platen gegoten.
3.8.5. Hybridisatie Aan iedere well wordt 100 μL probe DNA toegevoegd. De plaat wordt bedekt met zelfklevende folie en geïncubeerd bij de optimale renaturatie temperatuur. Na 3 uur hybridisatie wordt de plaat gewassen met 1xSSC met behulp van het wellwash apparatus. Vervolgens voegen we aan iedere well 100 μL streptavidine-β-D-galactosidase oplossing toe en plaatsen we de plaat in een oven bij 37°C. Iedere plaat wordt bedekt met een reeds voorverwarmde plaat. Na 10 minuten incubatie wordt de plaat opnieuw gewassen met 1xSSC. Tenslotte wordt 100 μL 4-MUF oplossing toegevoegd en wordt de fluorescentie van elke well onmiddellijk gemeten met behulp van de HTS 7000 Bio Assay Reader. De plaat wordt vervolgens terug geïncubeerd bij 37°C en opnieuw gelezen na 15, 30 en 45 minuten.
3.8.6. Data verwerking De percentage gelijkenis waarden worden berekend aan de hand van volgende formule: % (Ap x Bf) = 100 x fluo (Ap x Bf) – fluo (blanco x Bf) fluo (Bp x Bf) – fluo (blanco x Bf) en % (Bp x Af) = 100 x fluo (Bp x Af) – fluo (blanco x Af) fluo (Ap x Af) – fluo (blanco x Af)
met
A = DNA A B = DNA B p = probe DNA f = gefixeerd DNA fluo = fluorescentie
4. RESULTATEN
4.1. RESULTATEN VAN DE HSP60-GEN SEQUENTIE ANALYSE
Van de stammen die behoren tot de C. lari-groep werden de verkregen hsp60-gen sequenties onderling vergeleken, maar ook vergeleken met de sequenties uit de hsp60databank die opgesteld werd door Lies Debruyne. Er werd een fylogenetische boom opgemaakt die te zien is in bijlage 5. Op een 98,5% similariteitsniveau werden 10 clusters gevormd en waren 8 apart gelegen isolaten te zien. Een eerste cluster bevat 8 isolaten waaronder de typestam van C. volucris, namelijk LMG 24380T. De sequenties van deze isolaten zijn voor 98,54% gelijk. Een tweede cluster bestaat uit 2 isolaten, waarvan de ene uit een zeevogel en de andere uit zeewater, beide uit het Verenigd Koninkrijk, werd geïsoleerd. De sequenties van deze 2 isolaten zijn voor 98,77% gelijk. Een derde cluster bevat 8 isolaten, namelijk 4 isolaten van Antartica en 4 van gevarieerde oorsprong, waarvan de hsp60-gen sequenties voor 98,77% gelijk zijn. Eén van de 9 stammen is de typestam van C. lari subsp. lari, namelijk LMG 8846T. Vier humane isolaten en 2 isolaten afkomstig uit schaaldieren vormen een volgend cluster waarvan de sequenties een similariteitspercentage van 98,78% vertonen. Een vijfde cluster wordt gevormd door 2 isolaten afkomstig van schaaldieren en 3 humane isolaten. De hps60-gen sequenties van deze isolaten zijn voor 98.68% gelijk. Een zesde cluster bestaat uit 2 isolaten van schaaldieren waarvan de hsp60-gen sequenties volledig gelijk zijn. Twee isolaten afkomstig van schaaldieren en 1 isolaat uit een pinguïn op Antartica groeperen in een zevende cluster dat 99,03% sequentiesimilariteit vertoont. Een isolaat afkomstig uit het darmstelsel van een paard uit Zweden groepeert in een achtste cluster dat ook de typestam C. lari subsp. concheus, namelijk LMG 21009T, bevat. De hsp60-gen sequenties van beide stammen zijn voor 98,74% gelijk. Een negende cluster wordt gevormd door 2 isolaten, waarvan 1 afkomstig van een vogel en 1 geïsoleerd uit water, beide uit het Verenigd Koninkrijk. De hsp60-gen sequenties van deze 2 isolaten vertonen 99.82% gelijkenis. 4 isolaten van variabele oorsprong vormen een tiende en laatste cluster waarvan de sequenties voor 99,17% gelijk zijn. Daarenboven zijn er nog 8 stammen die een afzonderlijke plaats in het dendrogram innemen.
Van de stammen die niet behoren tot de C. lari-groep werd de similariteit van de hsp60-gen sequentie met de sequentie van de typestammen van de verschillende Campylobacter species bepaald met behulp van het Bionumerics softwarepakket. In bijlage 6 vindt men een tabel waarin respectievelijk de typestam met de hoogste, de tweede hoogste en de derde hoogste sequentiesimilariteit en het similariteitspercentage wordt weergegeven.
4.2. RESULATEN VAN DE 16S rRNA-GEN SEQUENTIE ANALYSE
De 16S rRNA-gen sequentie van de stam LMG 9235 werd vergeleken met de sequenties aanwezig in de publieke EBI-databank (http://www.ebi.ac.uk/Tools/fasta33/nucleotide.html) met behulp van het softwarepakket beschikbaar op de EBI-website. De 16S rRNA-gen sequentie van LMG 9235 vertoont 99,5% similariteit met de sequentie van een stam die behoort tot de familie Microbacteriaceae. De ampules van LMG 9235 blijken dus gecontamineerd te zijn.
Wanneer we de 16S rRNA-gen sequenties van LMG 25451, LMG 25459, LMG 25460, LMG 25467 en LMG 25468 onderling vergelijken, zien we dat de sequenties voor minstens 99,96% gelijk zijn. Wanneer we de sequentie van de voorgestelde typestam van groep 2 van de Canadese isolaten, namelijk LMG 25468, vergelijken met de 16S rRNA-gen sequentie van de typestammen van de verschillende Campylobacter species met behulp van het Bionumerics softwarepakket, dan zien we dat de stammen een sequentiesimilariteit van respectievelijk 98,6%, 98,6%, 98,4%, 98,3% en 98,2% met C. subantarticus, C. lari subsp. concheus, C. jejuni subsp. jejuni, C. insulaenigrae en C. jejuni subsp. doylei vertonen.
4.3. RESULTATEN VAN DE AFLP-ANALYSE
De AFLP-patronen van de Canadese stammen en de 2 controle-stammen (LMG 8846 en R-37456) werden onderling vergeleken, maar ook vergeleken met de patronen uit de AFLPdatabank opgesteld door Lies Debruyne. In bijlage 7 wordt de numerische analyse van de Canadese stammen en een selectie van de stammen uit de databank weergegeven.
4.4. RESULTATEN VAN DE DNA-DNA-HYBRIDISATIES
De DNA-DNA-hybridisaties tussen de 8 stammen onderling werden twee maal uitgevoerd. Hierbij werden enkel waarden weerhouden waarvan de reciproke waarden 22% of minder van elkaar verschilden. De (gemiddelde) homologe waarden worden weergegeven in bijlage 8.
5. DISCUSSIE In deze masterproef werden de identiteit en de verwantschappen van drie groepen Campylobacter isolaten onderzocht. Initieel maakten we gebruik van hsp60-gen sequentie analyse en AFLP-analyse. Deze methodes laten toe om de isolaten op soortniveau te identificeren (Kärenlampi et al., 2004, Hill et al., 2006). Bovendien is het ook doenbaar, zowel economisch als praktisch, om hiermee een grote reeks stammen te onderzoeken. Tenslotte konden we hierbij ook gebruik maken van de reeds in de onderzoeksgroep aanwezige databanken. Sommige stammen werden verder onderzocht door middel van 16S rRNA-gen
sequentie
analyse
en
DNA-DNA-hybridisatie;
dit
zijn
namelijk
de
referentiemethoden voor soortafbakening. In het eerste deel van deze studie hebben we de taxonomie van de C. lari-groep verder onderzocht. De taxonomie van C. lari heeft doorheen de jaren veel bijsturing en verfijning ondergaan. In de loop van dit proces zijn reeds drie nieuwe species (C. peloridis, C. volucris en C. subantarticus) en twee nieuwe subspecies (C. lari subsp. lari en C. lari subsp. concheus) beschreven (Debruyne et al., 2009a; Debruyne et al., 2009b;
Debruyne et al., 2010).
Niettemin is op basis van de resultaten van 16S rRNA-gen sequentie analyse en op basis van de resultaten van DNA-DNA-hybridisatie gebleken dat deze vijf taxa meer verwant zijn met elkaar dan met andere Campylobacter species (Debruyne, 2009). De C. lari-genogroep II uit het onderzoek van Duim et al. (2004), die voornamelijk uit UPTC-stammen bestaat, en een nieuwe reeks C. lari stammen waaronder opnieuw enkele UPTC-stammen, die in het laboratorium beschikbaar waren, werden in dit deel van de masterproef verder bestudeerd. De diversiteit van deze 41 stammen werd geanalyseerd door middel van hsp60-gen sequenering. De gen sequenties werden ingesloten in de hsp60-databank opgesteld in de loop van het doctoraat van Lies Debruyne (2009), waarna ze onderling konden worden vergeleken. Deze analyse bevestigt ons dat alle onderzochte stammen groeperen in de C. lari-groep maar dat deze groep zeer divers is. Toch kunnen op een 98,5% similariteitsniveau tien clusters met zeer gelijkaardige hsp60-gen sequenties en acht apart gelegen isolaten onderscheiden worden (zie fylogenetische boom in bijlage 5). In een volgende stap van het onderzoek werd de taxonomische status van drie van de tien clusters verder onderzocht aan de hand van DNA-DNA-hybridisatie. Dit is namelijk de referentiemethode om uit te maken of de aparte clusters ook verschillende species
vertegenwoordigen. Een grenswaarde van ongeveer 70% wordt hierbij voorgesteld voor soortafbakening (Stackebrandt & Goebel, 1994). Wanneer de homologe waarden meer dan deze 70% bedragen, veronderstellen we dat de twee stammen tot hetzelfde species behoren. Behoren de stammen tot een verschillend species, dan bedragen de DNA-DNAhybridisatie waarden doorgaans rond de 20%. In deze hybridisatiereeks, waarvan de resultaten worden weergegeven in bijlage 8, zien we dat vele waarden in het grensgebied van 60-70% DNA-DNA-hybridisatie liggen. Deze waarden werden echter in een tweede reeks van hybridisatie experimenten bevestigd. Bovendien zijn de hybridisatiewaarden verkregen door hybridisatie tussen het DNA van de typestam van C. subantarticus, namelijk LMG 24377T, en het DNA van de typestammen van C. lari subsp. lari en C. lari subsp. concheus, respectievelijk LMG 8846T en LMG 21009T, zeer gelijkaardig aan eerder door Lies Debruyne verkregen resultaten (Debruyne et al., 2010). De DNA-DNA-hybridisatie resultaten tonen aan dat de vertegenwoordigers van twee clusters, namelijk de UPTC-stammen LMG 19452 en LMG 19454, tot het species C. lari behoren. De hybridisatiewaarden schommelen tussen 71 en de 78% en liggen dus net boven de grenswaarde van 70%. Hybridisatie tussen deze twee UPTC-stammen en de dichtste buur van C. lari, namelijk C. subantarticus, geeft lagere, maar niettemin vrij hoge, waarden die variëren tussen 56 en 65%. Een studie van de biochemische eigenschappen van deze twee clusters van UPTC-stammen zou moeten uitwijzen of deze stammen in een afzonderlijk taxon, als subspecies van C. lari, zouden kunnen geklasseerd worden. Hybridisatie tussen het DNA van de Antarctische stam LMG 23908 en het DNA van de typestammen van C. lari subsp. lari en C. lari subsp. concheus geeft relatief lage homologe waarden, respectievelijk 58 en 62%. Hybridisatie tussen deze stam en de typestam van C. subantarticus geeft een hogere waarde, namelijk 69%. Deze stam is dus dichter verwant met C. subantarticus dan met C. lari. Bijkomend polyfasisch taxonomisch onderzoek is noodzakelijk om uit te maken of deze stam best als een nieuw species of als behorend tot C. subantarticus wordt geclassificeerd. In het onderzoek van Duim et al. (2004) groepeerden vrijwel alle UPTC-stammen samen in genogroep II. Toch werd ook een duidelijke heterogeniteit binnen deze tweede genogroep beschreven. In ons onderzoek liggen de UPTC-stammen verspreid
over 6 van de 10 clusters. Bovendien nemen 3 UPTC-stamen een afzonderlijke plaats in de fylogenetische boom in (zie afbeelding in bijlage 5). We kunnen besluiten dat ons onderzoek de gekende diversiteit in de C. lari-groep in het algemeen (Owen et al., 1988; Owen et al., 1993; Endtz et al., 1997; Meinersmann et al., 2002; Miller et al., 2005) en in de UPTC-groep in het bijzonder (Duim et al., 2004) heeft bevestigd. Onze resultaten bevestigen ook dat minstens twee clusters van UPTC-stammen best binnen het species C. lari worden geklasseerd.
Een tweede doel van deze masterproef betrof een herevalueren van de identiteit van 21 atypische Campylobacter stammen. Een aantal van deze stammen kon op basis van eiwitelektroforese niet tot op soortniveau worden geïdentificeerd, anderen bleken atypische patronen te vertonen. De identiteit van deze stammen werd nagegaan aan de hand van de hsp60-gen sequentie. Voor Campylobacter species ziet men hierbij een interspecies sequentiesimilariteit tussen 65 en 94%; de intraspecies sequentiesimilariteit schommelt tussen de 95 en de 100% met een gemiddelde van 99% (Kärenlampi et al., 2004, Hill et al., 2006). Van negen stammen, waaronder één C. coli (R-2159), één C. hominis (R-37456), één C. curvus (LMG 11247) en zes C. concisus stammen (LMG 11241, LMG 14441, LMG 14442, LMG 14443, LMG 14444, LMG 14445 en LMG 11247) werd de identiteit bevestigd op basis van een miniem verschil in hsp60-gen sequentie tussen de onbekende
stam
en
de
typestam,
samen
met
een
groot
verschil
in
similariteitspercentage tussen de typestam met de hoogste sequentiesimilariteit en deze met de tweede hoogste sequentiesimilariteit. Aan vier stammen kon om dezelfde redenen een nieuwe identiteit worden gegeven, meer bepaald aan LMG 11766 (C. ureolyticus), R-40771 (Helicobacter pullorum) en R-44944 en R-44945 (C. fetus subsp. fetus). De nieuwe identificatie wordt weergegeven in de rechterkolom uit de tabel in bijlage 6. Vier stammen, namelijk LMG 7974, LMG 8286, R-37786, en LMG 14247 vertonen een lage sequentiesimilariteit ten opzichte van elke Campylobacter typestam en kunnen dus niet geïdentificeerd worden op basis van de hsp60-gen sequentie analyse. De resultaten
suggereren
wel
dat
deze
stammen
allemaal
nieuwe
species
vertegenwoordigen. Nog twee stammen (R-912 en LMG 14437) vertonen ook een lage
sequentiesimilariteit ten opzichte van elke Campylobacter typestam maar hun hsp60gen sequenties zijn wel 100% gelijk. Deze resultaten suggereren dat deze twee stammen ook een nieuw species vertegenwoordigen. Om te bewijzen dat deze 6 stammen inderdaad tot 5 nieuwe species behoren, is bijkomend onderzoek noodzakelijk, met name DNA-DNA-hybridisatie ten opzichte van de dichtste buren en biochemische
testen.
Eén stam (LMG 14335) vertoont ongeveer 95% sequentiesimilariteit ten opzichte van de typestammen van C. coli, C. jejuni subsp. doylei en C. jejuni subsp. jejuni. Dit resultaat suggereert dat deze stam tot een apart species behoort. Anderzijds zijn in de literatuur een aantal gelijkaardige stammen beschreven die allen als C. coli werden beschouwd (Hill et al., 2006). Deze identificatie zou moeten worden bevestigd aan de hand van AFLP-analyse en DNA-DNA-hybridisatie. Als deze methodes ook aangeven dat deze stammen inderdaad tot C. coli behoren, dan wijst dit erop dat er binnen C. coli twee versies (of allelen) van het hsp60-gen aanwezig zijn. Een laatste stam tenslotte, LMG 11767, vertoont een vrije hoge en gelijkaardige sequentiesimilariteit ten opzichte van de typestammen van C. showae (93,2%), C. rectus (91,0%) en C. concisus (80,7%). De resultaten van de hsp60-gensequentie analyse zijn niet eenduidig om LMG 11767 op soortniveau te classificeren. Opnieuw zou de identificatie aan de hand van AFLP-analyse en DNA-DNA-hybridisatie verder kunnen worden onderzocht.
Een derde en laatste doel van deze masterproef betrof het verdere onderzoek van negentien oppervlaktewater isolaten uit Canada. Preliminaire gegevens wezen erop dat deze collectie in 4 groepen (1a, 1b, 2 en 3) en 1 unieke stam kon worden opgedeeld (zie stammenlijst in bijlage 1). De 19 stammen werden eerst bestudeerd door middel van hsp60-gen sequentie analyse en AFLP-analyse. Vervolgens werden de stammen onderling vergeleken en vergeleken met de beschikbare databanken. Beide types van analyses gaven vrij gelijkaardige resultaten. Deze worden hieronder kort besproken. Groep 1a en groep 1b stammen vormen aparte clusters binnen de C. lari-groep (zie fylogenetische boom in bijlage 5 en dendrogram in bijlage 7). DNA-DNAhybridisatieresultaten bevestigen vervolgens dat deze groepen effectief behoren tot het C. lari species: de hybridisatiewaarden van de tentatieve typestammen van groep
1a en groep 1b met de typestammen van C. lari subsp. lari en C. lari subsp. concheus zijn namelijk hoog, en schommelen tussen de 66 en de 82% (zie tabel in bijlage 8). Biochemisch onderzoek is noodzakelijk om uit te wijzen of deze groepen als nieuwe subspecies binnen C. lari kunnen worden geklasseerd. Er moet worden opgemerkt dat de hybridisatiewaarden van de referentiestammen van groep 1a en groep 1b met de typestam van C. subantarticus eveneens vrij hoog zijn, namelijk 65%. Deze hoge hybridisatieresultaten ten opzichte van meerdere species zouden kunnen verklaard worden als een fenomeen van recente evolutie. Groep 2 stammen vormen een apart cluster in het dendrogram van de AFLP-profielen (zie bijlage 7). Ook is de similariteit van de hsp60-gen sequentie van de groep 2 stammen met de sequentie van de verschillende typestammen laag (zie tabel in bijlage 6). Deze resultaten suggereren dat groep 2 stammen een nieuw species vertegenwoordigen. Om na te gaan welke de dichtste fylogenetische buren zijn, werd 16S rRNA-gen sequentie analyse uitgevoerd. De sequenties vertonen de hoogste similariteit ten opzichte van de 16S rRNA-gen sequenties van de typestammen van C. subantarticus, C. lari subsp. concheus, C. jejuni subsp. jejuni, C. insulaenigrae en C. jejuni subsp. doylei (zie hoofdstuk 4.2.). Om te bevestigen dat groep 2 effectief een nieuw species vertegenwoordigt, zouden ook voor deze groep DNA-DNA-hybridisaties ten opzichte van deze (sub)species en biochemische testen moeten worden uitgevoerd. AFLP-analyse en hsp60-gen sequentie analyse tonen ons vervolgens dat groep 3 stammen tot C. volucris behoren (zie fylogenetische boom in bijlage 5 en dendrogram in bijlage 7). De unieke stam tenslotte neemt zowel in de fylogenetische boom opgesteld aan de hand van de hsp60-gen sequenties als in het dendrogram van de AFLP-profielen een aparte plaats in. Opnieuw suggereren de resultaten dat deze stam een nieuw species vertegenwoordigt. Verder onderzoek is aangewezen.
6. CONCLUSIE
De identiteit en de verwantschappen van drie groepen Campylobacter stammen werden in deze masterproef door middel van hsp60-gen sequentie analyse, 16S rRNA-gen sequentie analyse, AFLP-analyse en DNA-DNA-hybridisatie onderzocht. -
In het eerste deel van de studie werd de taxonomie van de C. lari-groep verder bestudeerd. Ons onderzoek bevestigde de gekende diversiteit in de C. lari-groep in het algemeen en in de UPTC-groep in het bijzonder. Bovendien konden wij besluiten dat minstens twee van de clusters met UPTC-stammen in het species C. lari dienen geklasseerd te worden.
-
Een tweede doel van deze masterproef betrof het herevalueren van de identiteit van 21 atypische Campylobacter stammen. Van 9 stammen werd de oorspronkelijk identiteit bevestigd en aan 4 stammen kon een nieuwe identiteit worden
gegeven.
Zes
van
de
atypische
stammen
vertegenwoordigen
hoogstwaarschijnlijk vijf nieuwe species. Voor deze stammen is verder onderzoek noodzakelijk indien men ze formeel als nieuwe species zou willen beschrijven. Voor de 2 overige stammen, die niet met redelijke zekerheid konden worden geïdentificeerd, is verder identificatieonderzoek vereist. -
In het laatste deel van deze studie werden 19 oppervlaktewaterisolaten uit Canada verder onderzocht. Onze resultaten bekrachtigden de initiële opdeling van deze stammencollectie in 4 groepen en 1 unieke stam. Bovendien konden we besluiten dat groepen 1a en 1b binnen het species C. lari dienen te worden ondergebracht. Onze resultaten suggereerden tevens dat groep 2 en de unieke stam twee nieuwe Campylobacter species vertegenwoordigen. Groep 3 stammen tenslotte konden als C. volucris worden geklasseerd.
Ter algemene conclusie kunnen we stellen dat de taxonomie van C. lari zeer complex en nog steeds niet volledig opgehelderd is. We toonden tevens aan dat in de onderzochte stammencollectie vertegenwoordigers van minstens 7 nieuwe Campylobacter species aanwezig zijn. In de toekomst zal bijkomend polyfasisch taxonomisch onderzoek, waaronder DNA-DNA-hybridisatie experimenten en biochemische analyses moeten worden uitgevoerd om deze veronderstelling te bevestigen.
LITERATUURLIJST
Abeyta, C.; Deeter, F. G.; Kaysner, C. A.; Stott, R. F.; Wekell, M. M. (1993). CampylobacterJejuni in A Washington-State Shellfish Growing Bed Associated with Illness. Journal of Food Protection, 56, 323-325. Benjamin, J.; Leaper, S.; Owen, R. J.; Skirrow, M. B. (1984). Description of CampylobacterLaridis, A New Species Comprising the Nalidixic-Acid Resistant Thermophilic Campylobacter (Nartc) Group. Current Microbiology, 8, 231-238. Bezian, M. C.; Ribou, G.; Barberisgiletti, C.; Megraud, F. (1990). Isolation of A Urease Positive Thermophilic Variant of Campylobacter-Lari from A Patient with Urinary-Tract Infection. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 9, 895-897. Bolton, F. J.; Holt, A. V.; Hutchinson, D. N. (1985). Urease-Positive Thermophilic Campylobacters. Lancet, 1, 1217-1218. Bolton, F. J.; Coates, D.; Hutchinson, D. N.; Godfree, A. F. (1987). A Study of Thermophilic Campylobacters in A River System. Journal of Applied Bacteriology, 62, 167-176. Broman, T.; Palmgren, H.; Bergstrom, S.; Sellin, M.; Waldenstrom, J.; Danielsson-Tham, M. L.; Olsen, B. (2002). Campylobacter jejuni in black-headed gulls (Larus ridibundus): Prevalence, genotypes, and influence on C. jejuni epidemiology. Journal of Clinical Microbiology, 40, 4594-4602. Chua, K.; Gurtler, V.; Montgomery, J.; Fraenkel, M.; Mayall, B. C.; Grayson, M. L. (2007). : Campylobacter insulaenigrae causing septicaemia and enteritis. Journal of Medical Microbiology, 56, 1565-1567. Coenye, T.; Gevers, D.; Van de Peer, Y.; Vandamme, P.; Swings, J. (2005). Towards a prokaryotic genomic taxonomy. Fems Microbiology Reviews, 29, 147-167. Cowan, S. T. (1968). A dictionary of microbial taxonomic usage. Oliver & Boyd, Edinburgh.
Debruyne, L.; Gevers, D.; Vandamme P. (2008) Taxonomy of the family Campylobacteraceae. In: Campylobacter, 3rd edition, Nachamkin, I.; Szymanski, C. M.; Blaser, M. J. (Eds.), ASM Press, Washington D.C., USA, pp. 3-26. Debruyne L. (2009). Biodiversity in the family Campylobacteraceae: advancements in taxonomy and diagnostics. Doctoral thesis at Ghent University, Belgium. Debruyne, L.; On, S. L.; De, B. E.; Vandamme, P. (2009). Novel Campylobacter lari-like bacteria from humans and molluscs: description of Campylobacter peloridis sp. nov., Campylobacter lari subsp. concheus subsp. nov. and Campylobacter lari subsp. lari subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 59, 1126-1132. Debruyne, L.; Broman, T.; Bergstrom, S.; Olsen, B.; On, S. L.; Vandamme, P. (2010). Campylobacter subantarcticus sp. nov., isolated from birds in the sub-Antarctic region. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 815-819. Debruyne, L.; Broman, T.; Bergstrom, S.; Olsen, B.; On, S. L.; Vandamme, P. (in druk). Campylobacter volucris sp. nov., isolated from black-headed gulls (Larus ridibundus). Int. J. Syst. Evol. Microbiol., published ahead-of-print as doi: 10.1099/ijs.0.017194-0. Duim, B.; Wagenaar, J. A.; Dijkstra, J. R.; Goris, J.; Endtz, H. P.; Vandamme, P. A. R. (2004). Identification of distinct Campylobacter lari genogroups by amplified fragment length polymorphism
and
protein
electrophoretic
profiles.
Applied
and
Environmental
Microbiology, 70, 18-24. Endtz, H. P.; Vliegenthart, J. S.; Vandamme, P.; Weverink, H. W.; vandenBraak, N. P.; Verbrugh, H. A.; vanBelkum, A. (1997). Genotypic diversity of Campylobacter lari isolated from mussels and oysters in The Netherlands. International Journal of Food Microbiology, 34, 79-88. Etoh, Y.; Dewhirst, F. E.; Paster, B. J.; Yamamoto, A.; Goto, N. (1993). Campylobacter-Showae Sp-Nov, Isolated from the Human Oral Cavity. International Journal of Systematic Bacteriology, 43, 631-639.
Ezaki, T.; Hashimoto, Y.; Yabuuchi, E. (1989). Fluorometric deoxyribonucleic aciddeoxyribonucleic acid hybridization in microdilution wells as an alternative to membrane filter hybridization in which radioisotopes are used to determine genetic relatedness among bacterial strains. International Journal of Systematic Bacteriology, 39, 224-229. Fink, A. L. (1999). Chaperone-mediated protein folding. Physiological Reviews, 79, 425-449. Foster, G.; Holmes, B.; Steigerwalt, A. G.; Lawson, P. A.; Thorne, P.; Byrer, D. E.; Ross, H. M.; Xerry, J.; Thompson, P. M.; Collins, M. D. (2004). Campylobacter insulaenigrae sp nov., isolated from marine mammals. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 2369-2373. Gebhart, C. J.; Edmonds, P.; Ward, G. E.; Kurtz, H. J.; Brenner, D. J. (1985). CampylobacterHyointestinalis Sp-Nov - A New Species of Campylobacter Found in the Intestines of Pigs and Other Animals. Journal of Clinical Microbiology, 21, 715-720. Greenwood, R.; Slack, R.; Peutherer, J. (1997). Medical Microbiology, 15th edition. Churchill Livingstone, Edinburgh, United Kingdom. Hill, J. E.; Paccagnella, A.; Law, K.; Melito, P. L.; Woodward, D. L.; Price, L.; Leung, A. H.; Ng, L. K.; Hemmingsen, S. M.; Goh, S. H. (2006). Identification of Campylobacter spp. and discrimination from Helicobacter and Arcobacter spp. by direct sequencing of PCIR-amplified cpn60 sequences and comparison to cpnDB, a chaperonin reference sequence database. Journal of Medical Microbiology, 55, 393-399. http://www.bacterio.cict.fr/c/campylobacter.html (10-04-2010). Hughes, L. A.; Bennett, M.; Coffey, P.; Elliott, J.; Jones, T. R.; Jones, R. C.; Lahuerta-Marin, A.; Leatherbarrow, A. H.; McNiffe, K.; Norman, D.; Williams, N. J., Chantrey, J. (2009). Molecular Epidemiology and Characterization of Campylobacter spp. Isolated from Wild Bird Populations in Northern England. Applied and Environmental Microbiology, 75, 3007-3015. Inglis, G. D.; Hoar, B. M.; Whiteside, D. P.; Morck, D. W. (2007). Campylobacter canadensis sp nov., from captive whooping cranes in Canada. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57, 2636-2644.
Kaijser, B.; Megraud, F. (1992) Diagnosis of Campylobacter infections. In: Campylobacter jejuni, Current Status and Future Trends, Nachamkin, I.; Blaser, M. J.; Tompkins, L. S. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington D.C., USA, pp. 89-92. Karenlampi, R. I.; Tolvanen, T. P.; Hanninen, M. L. (2004). Phylogenetic analysis and PCRrestriction fragment length polymorphism identification of Campylobacter species based on partial groEL gene sequences. Journal of Clinical Microbiology, 42, 5731-5738. Lawson, A. J.; On, S. L. W.; Logan, J. M. J.; Stanley, J. (2001). Campylobacter hominis sp nov., from the human gastrointestinal tract. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 651-660. Logan, J. M. J.; Burnens, A.; Linton, D.; Lawson, A. J.; Stanley, J. (2000). Campylobacter lanienae sp nov., a new species isolated from workers in an abattoir. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, 865-872. Madigan, M.; Martinko, J.; Dunlap, P.; Clark, T. (2008) Brock, Biology of microorganisms (Pearson International Edition). Benjamin Cummings, London, UK. Megraud, F.; Chevrier, D.; Desplaces, N.; Sedallian, A.; Guesdon, J. L. (1988). Urease-Positive Thermophilic Campylobacter (Campylobacter-Laridis Variant) Isolated from An Appendix and from Human Feces. Journal of Clinical Microbiology, 26, 1050-1051. Meinersmann, R. J.; Patton, C. M.; Wachsmuth, I. K.; Fields, P. I. (2002). Genetic diversity and relationships of Campylobacter species and subspecies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52, 1789-1797. Miller, W. G.; On, S. L. W.; Wang, G. L.; Fontanoz, S.; Lastovica, A. J.; Mandrell, R. E. (2005). Extended multilocus sequence typing system for Campylobacter coli, C lari, C-upsaliensis, and C-helveticus. Journal of Clinical Microbiology, 43, 2315-2329. Nachamkin, I.; Stowell, C.; Skalina, D.; Jones, A. M.; Hoop, R. M.; Smibert, R. M. (1984). Campylobacter-Laridis Causing Bacteremia in An Immunosuppressed Patient. Annals of Internal Medicine, 101, 55-57.
Nachamkin, I.; Szymanski, C. M.; Blaser, M. J. (2008). Campylobacter, 3rd edition. ASM Press, Washington D.C., USA. On, S. L. W.; Bloch, B.; Holmes, B.; Hoste, B.; Vandamme, P. (1995). CampylobacterHyointestinalis Subsp Lawsonii Subsp-Nov, Isolated from the Porcine Stomach, and An Emended Description of Campylobacter-Hyointestinalis. International Journal of Systematic Bacteriology, 45, 767-774. On, S. L. W.; Holmes, B. (1995). : Classification and identification of Campylobacters, Helicobacters and allied taxa by numerical analysis of phenotypic characters. Systematic and Applied Microbiology, 18, 374-390. On, S. L. W. (1996). Identification methods for Campylobacters, Helicobacters, and related organisms. Clinical Microbiology Reviews, 9, 405-+. Owen, R. J.; Costas, M.; Sloss, L.; Bolton, F. J. (1988). Numerical-Analysis of Electrophoretic Protein-Patterns of Campylobacter-Laridis and Allied Thermophilic Campylobacters from the Natural-Environment. Journal of Applied Bacteriology, 65, 69-78. Owen, R. J.; Desai, M.; Garcia, S. (1993). Molecular Typing of Thermotolerant Species of Campylobacter with Ribosomal-Rna Gene Patterns. Research in Microbiology, 144, 709-720. Pitcher, D. G.; Saunders, N. A.; Owen, R. J. (1989). Rapid Extraction of Bacterial Genomic Dna with Guanidium Thiocyanate. Letters in Applied Microbiology, 8, 151-156. Roop, R. M.; Smibert, R. M.; Johnson, J. L.; Krieg, N. R. (1985). Campylobacter-Mucosalis (Lawson, Leaver, Pettigrew, and Rowland 1981) Comb-Nov - Emended Description. International Journal of Systematic Bacteriology, 35, 189-192. Rossi, M.; Debruyne, L.; Zanoni, R. G.; Manfreda, G.; Revez, J.; Vandamme, P. (2009). Campylobacter avium sp nov., a hippurate-positive species isolated from poultry. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59, 2364-2369. Sandstedt, K.; Ursing, J. (1991). Description of Campylobacter-Upsaliensis Sp-Nov Previously Known As the Cnw Group. Systematic and Applied Microbiology, 14, 39-45.
Savelkoul, P. H. M.; Aarts, H. J. M.; de Haas, J.; Dijkshoorn, L.; Duim, B.; Otsen, M.; Rademaker, J. L. W.; Schouls, L.; Lenstra, J. A. (1999). : Amplified-fragment length polymorphism analysis: the state of an art. Journal of Clinical Microbiology, 37, 3083-3091. Sebald, M.; Veron, M. (1963). Teneur en bases de l’ADN et classification des vibrions. Annales de l’ Institut Pasteur, 105, 897-910. Segal, G.; Ron, E. Z. (1996). Regulation and organization of the groE and dnaK operons in Eubacteria. Fems Microbiology, 138, 1-10. Skirrow, M. B.; Benjamin, J. (1980). '1001' Campylobacters: cultural characteristics of intestinal campylobacters from man and animals. J. Hyg. (Lond), 85, 427-442. Stackebrandt, E.; Goebel, B. M. (1994). A place for DNA-DNA reassociation and 16S ribosomal RNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. International Journal of Systematic Bacteriology, 44, 846-849. Staley, J. T.; Krieg, N. R. (1984). Classification of prokaryotic organisms: an overview. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology volume 1, Krieg, N. R. & Holt, J. G. (Eds.), The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA, pp. 1-4. Stanley, J.; Burnens, A. P.; Linton, D.; On, S. L. W.; Costas, M.; Owen, R. J. (1992). Campylobacter-Helveticus Sp-Nov A New Thermophilic Species from Domestic-Animals Characterization, and Cloning of A Species-Specific Dna Probe. Journal of General Microbiology, 138, 2293-2303. Steele, T. W.; Owen, R. J. (1988). Campylobacter-Jejuni Subsp Doylei Subsp Nov, A Subspecies of Nitrate-Negative Campylobacters Isolated from Human Clinical Specimens. International Journal of Systematic Bacteriology, 38, 316-318. Tanner, A. C. R.; Badger, S.; Lai, C. H.; Listgarten, M. A.; Visconti, R. A.; Socransky, S. S. (1981). Wolinella Gen-Nov, Wolinella-Succinogenes (Vibrio-Succinogenes-Wolin Et-Al) Comb-Nov, and Description of Bacteroides-Gracilis Sp-Nov, Wolinella-Recta Sp-Nov, CampylobacterConcisus Sp-Nov, and Eikenella-Corrodens from Humans with Periodontal-Disease. International Journal of Systematic Bacteriology, 31, 432-445.
Vandamme, P.; Deley, J. (1991). Proposal for A New Family, Campylobacteraceae. International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 451-455. Vandamme, P.; Falsen, E.; Rossau, R.; Hoste, B.; Segers, P.; Tytgat, R.; Deley, J. (1991a). Revision of Campylobacter, Helicobacter, and Wolinella Taxonomy - Emendation of Generic Descriptions and Proposal of Arcobacter Gen-Nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 88-103. Vandamme, P.; Pot, B.; Kersters, K. (1991b). Differentiation of Campylobacters and Campylobacter-Like Organisms by Numerical-Analysis of One-Dimensional Electrophoretic Protein-Patterns. Systematic and Applied Microbiology, 14, 57-66. Vandamme, P.; Daneshvar, M. I.; Dewhirst, F. E.; Paster, B. J.; Kersters, K.; Goossens, H.; Moss, C. W. (1995). Chemotaxonomic Analyses of Bacteroides-Gracilis and BacteroidesUreolyticus and Reclassification of B-Gracilis As Campylobacter-Gracilis Comb-Nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 45, 145-152. Vandamme, P.; Pot, B.; Gillis, M.; Devos, P.; Kersters, K.; Swings, J. (1996). Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiological Reviews, 60, 407438. Vandamme, P.; Debruyne, L.; De Brandt, E.; Falsen, E. (in druk) Reclassification of Bacteroides ureolyticus as Campylobacter ureolyticus comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol, published ahead-of-print as doi:ijs.0.017152-0 Véron, M.; Chatelain, R. (1973). Taxonomic study of the genus Campylobacter Sebald and Véron and designation of the neotype strain for the type species, Campylobacter fetus (Smith and Taylor) Sebald and Véron. International Journal of Systematic Bacteriology, 23, 122-134. Vongraevenitz, A. (1990). Revised Nomenclature of Campylobacter-Laridis, EnterobacterIntermedium, and Flavobacterium-Branchiophila. International Journal of Systematic Bacteriology, 40, 211.
Vos, P.; Hogers, R.; Bleeker, M.; Reijans, M.; Vandelee, T.; Hornes, M.; Frijters, A.; Peleman, J.; Kuiper, M.; Zabeau, M. (1995) AFLP – A new technique for DNA-fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 1107-4414. Waldenstrom, J.; On, S. L. W.; Ottvall, R.; Hasselquist, D.; Olsen, B. (2007). Species diversity of campylobacteria in a wild bird community in Sweden. Journal of Applied Microbiology, 102, 424-432. Zanoni, R. G.; Debruyne, L.; Rossi, M.; Revez, J.; Vandamme, P. (2009). Campylobacter cuniculorum sp. nov., from rabbits. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 59, 1666-1671.
