UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bio-analyse Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse Academiejaar 2008-2009
DE INVLOED VAN LEVERLIJDEN OP DE METABOLISERENDE CAPACITEIT VAN DE LEVER BIJ KINDEREN: BEREIDING, KARAKTERISATIE EN KWALITATIEVE CONTROLE VAN MICROSOMEN.
Els DUMOULIN
Eerste master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Dr. Apr. J. Van Bocxlaer
Commissarissen Prof. Dr. Apr. S. De Saeger Prof. Dr. Apr. W. Lambert
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
28 mei 2009
Promotor Prof. Dr. Apr. J. Van Bocxlaer
Auteur Els Dumoulin
DANKWOORD
Eerst en vooral wil ik van de gelegenheid gebruik maken om mijn promotor, Prof. Dr. Apr. J. Van Bocxlaer, van harte te bedanken voor de uitstekende begeleiding van deze leerrijke ervaring en om mij deze kans te bieden mijn kennis uit te breiden.
Vervolgens wil ik mijn begeleidster, Apr. Lies De Bock, van harte bedanken voor de goede begeleiding. Bedankt voor het grondig verbeteren van mijn masterproef, het begeleiden van alle experimenten en de talrijke leuke momenten tijdens mijn onderzoekstage.
Daarnaast wil ik Dr. Apr. Koen Boussery, Apr. Julie De Smet, Ing. Sofie Vande Casteele, Dr. Apr. Ruben t’Kindt, Wim Goeteyn, en Nadine Cloetens van harte bedanken voor de begeleiding en aangename sfeer tijdens mijn onderzoeksstage.
Eveneens wil ik mijn medestudenten, Maaike Godefroid, Léonie Van Aelst en Charlotte Van Impe, bedanken voor de dagelijkse steun en de gezellige sfeer.
Ten laatste wil ik ook mijn ouders, zus en vrienden bedanken voor hun niet te onderschatten steun bij het verwezenlijken van deze masterproef.
INHOUDSOPGAVE Auteursrecht Dankwoord Inhoudsopgave Lijst met gebruikte afkortingen 1
INLEIDING ...................................................................................................................... 1
1.1
ALGEMEEN .................................................................................................................. 1
1.2
FARMACOKINETIEK ................................................................................................. 2
1.2.1
Absorptie ............................................................................................................... 2
1.2.2
Distributie ............................................................................................................. 3
1.2.3
Metabolisatie......................................................................................................... 4
1.2.4
Excretie.................................................................................................................. 8
1.3
PROTEÏNEBEPALINGEN ........................................................................................... 9
1.3.1
Algemeen ............................................................................................................... 9
1.3.2
Proteïnebepaling volgens Lowry en Bradford................................................. 10
1.3.3
CYP450-bepaling volgens Omura en Matsubara............................................ 11
1.3.4
MPPGL – Recovery Factor ............................................................................... 12
1.4
CYP450-ACTIVITEITSBEPALING........................................................................... 13
1.4.1
Incubatie.............................................................................................................. 13
1.4.2
Chromatografische scheiding............................................................................ 15
1.4.3
Massaspectrometrische detectie en kwantificatie............................................ 16
1.4.4
Activiteitsbepaling .............................................................................................. 17
1.5
PBPK-MODELLEN..................................................................................................... 17
2
OBJECTIEVEN ............................................................................................................. 19
3
MATERIALEN EN METHODEN ............................................................................... 21
3.1
BEREIDING BUFFERS .............................................................................................. 21
3.1.1 3.1.1.1
Buffer 1................................................................................................................ 21 Materialen......................................................................................................... 21
3.1.1.2 3.1.2
Methode............................................................................................................ 21 Buffer 2................................................................................................................ 21
3.1.2.1
Materialen......................................................................................................... 21
3.1.2.2
Methode............................................................................................................ 22
3.1.3
Buffer 3................................................................................................................ 22
3.1.3.1
Materialen......................................................................................................... 22
3.1.3.2
Methode............................................................................................................ 22
3.1.4
Buffer 4................................................................................................................ 22
3.1.4.1
Materialen......................................................................................................... 22
3.1.4.2
Methode............................................................................................................ 22
3.2
BEREIDING MICROSOMEN .................................................................................... 23
3.2.1
Materialen ........................................................................................................... 23
3.2.2
Methode............................................................................................................... 23
3.3
PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY ........................................................... 25
3.3.1
Materialen ........................................................................................................... 25
3.3.2
Methode............................................................................................................... 25
3.4
PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD .................................................... 25
3.4.1
Materialen ........................................................................................................... 25
3.4.2
Methode............................................................................................................... 26
3.5
CYP450-BEPALING VOLGENS OMURA ............................................................... 26
3.5.1
Materialen ........................................................................................................... 26
3.5.2
Methode (Schenkman & Jansson, 1998)........................................................... 26
3.6
CYP450-BEPALING VOLGENS MATSUBARA ..................................................... 27
3.6.1
Materialen ........................................................................................................... 27
3.6.2
Methode (Matsubara et al., 1976) ...................................................................... 27
3.7
CONTROLE MICROSOMEN EN KARAKTERISATIEMETHODEN .................... 28
3.7.1
Kwalitatieve controle microsomen ................................................................... 28
3.7.1.1
Materialen......................................................................................................... 28
3.7.1.2
Methode............................................................................................................ 29
3.7.2
4
Controle karakterisatiemethoden ..................................................................... 30
3.7.2.1
Materialen......................................................................................................... 30
3.7.2.2
Methode............................................................................................................ 30
RESULTATEN EN DISCUSSIE .................................................................................. 32
4.1
BEREIDING MICROSOMEN .................................................................................... 32
4.2
PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY ........................................................... 33
4.3
PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD .................................................... 34
4.4
CYP450-BEPALING VOLGENS OMURA ............................................................... 36
4.5
CYP450-BEPALING VOLGENS MATSUBARA ..................................................... 38
4.6
CONTROLE MICROSOMEN EN KARAKTERISATIEMETHODEN .................... 41
4.6.1
Kwalitatieve controle microsomen ................................................................... 41
4.6.2
Controle karakterisatiemethoden ..................................................................... 45
5
CONCLUSIES................................................................................................................ 47
6
LITERATUURLIJST .................................................................................................... 49
7
BIJLAGEN ........................................................................................................................I
7.1
BIJLAGE 1......................................................................................................................I
7.2
BIJLAGE 2.....................................................................................................................II
7.3
BIJLAGE 3................................................................................................................... III
7.4
BIJLAGE 4................................................................................................................... IV
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
ADME: Absorptie, Distributie, Metabolisatie en Excretie BSA: Bovine Serum Albumine CO: Koolstofmonoxide CYP450: Cytochroom P450 DMSO: Dimethylsulfoxide EDTA: Ethyleendiaminetetraacetaat Dinatriumzout Dihydraat (C10H14N2Na2O8.2H2O) EMS: Elektromagnetische Spectrum ER: Endoplasmatisch Reticulum ESI: Electrospray Ionisatie FDA: Food and Drug Administration (HP)LC-MS/MS: (High Performance) Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry MG: Moleculair Gewicht MPPGL: Microsomal Protein Per Gram of Liver MRM: Multiple Reaction Monitoring MS: Massaspectrometer MSP: Microsomaal Proteïnegehalte NADPH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Fosfaat NP: Normal Phase PBPK: Physiologically Based Pharmacokinetics RP: Reversed Phase UV: Ultraviolet VC: Variatiecoëfficiënt
1
INLEIDING
1.1
ALGEMEEN De lever is veruit het belangrijkste metaboliserende orgaan in ons lichaam (Benedetti &
Baltes, 2003). Om deze belangrijke functie uit te kunnen voeren beschikt het over een hele reeks aan enzymen. Daartoe behoort onder andere het cytochroom P450-enzymsysteem dat instaat voor de oxidatieve metabolisatie van een groot aantal lichaamseigen componenten en xenobiotica. Xenobiotica zijn lichaamsvreemde componenten (xeno = vreemd) zoals bijvoorbeeld geneesmiddelen. Er zijn verschillende factoren die een invloed kunnen hebben op de activititeit van dit metaboliserend systeem, zoals genetisch polymorfisme, leeftijd, geslacht, omgevingsfactoren en ziektetoestanden (Frye, 2004). Bij een verminderde leverfunctie door leverlijden wordt verwacht dat de metaboliserende capaciteit zal beïnvloed worden. De lever zal hierdoor geneesmiddelen minder goed kunnen verwerken, waardoor een dosisaanpassing essentieel is (Verbeeck, 2008). In de literatuur kan reeds veel informatie gevonden worden over de invloed van leverlijden op de metaboliserende capaciteit van de lever bij volwassenen, maar over kinderen als specifieke doelgroep is dit beperkt.
Figuur 1.1 toont de lever van een zes maanden oud meisje met biliaire atresie, een aandoening die gekenmerkt wordt door een afwijking aan de galwegen. De oorzaak is nog ongekend. Door de afwijking kan de gal niet van de lever naar de darm vloeien, wat voor een beschadiging van de lever zorgt. Bij deze aandoening is een levertransplantatie meestal noodzakelijk (Bassett & Murray, 2008). Uit leverstalen afkomstig van een lever zoals in Figuur 1.1 zou meer informatie kunnen bekomen worden over de invloed van leverlijden op de metaboliserende capaciteit van de lever bij kinderen.
FIGUUR 1.1: LEVER VAN EEN MEISJE (6 MAANDEN) MET BILIAIRE ATRESIE. DE GELE KLEUR EN UITSTULPINGEN ZIJN KENMERKEND BIJ EEN ZIEKE LEVER.
1
1.2
FARMACOKINETIEK De farmacokinetiek bestudeert wat het lichaam met een geneesmiddel doet, m.a.w. het
volgt de concentratie van een geneesmiddel in het lichaam in functie van de tijd. De basis van de farmacokinetiek wordt gevormd door de zogenaamde ADME-processen: Absorptie, Distributie, Metabolisatie en Excretie.
1.2.1 Absorptie De absorptie of resorptie van een geneesmiddel is afhankelijk van de manier waarop het wordt toegediend. Dit kan enteraal (bv. oraal, sublinguaal of rectaal) of parenteraal (bv. intramusculair, subcutaan, transdermaal, via de mucosa of intrathecaal) zijn. Wanneer een geneesmiddel oraal wordt toegediend, zal het via de dunne darmwand in de bloedbaan worden opgenomen. Dit bloed wordt afgevoerd via de vena portae naar de lever. Bij deze eerste passage doorheen de lever kan er reeds metabolisatie optreden. Ook kunnen er reeds enzymatische omzettingen gebeuren in de darmwand. Deze twee fenomenen samen worden het ‘first-pass’ effect genoemd, dit wordt ook weergegeven in Figuur 1.2. Wanneer een geneesmiddel sterk onderhevig is aan dit effect, kunnen er grote variaties in plasmaconcentratie optreden. Door rectale, sublinguale of parenterale toediening kan het ‘first-pass’ effect gedeeltelijk of volledig vermeden worden.
FIGUUR 1.2: ‘FIRST-PASS’ FENOMEEN: PRESYSTEMISCHE METABOLISATIE IN DE DARMWAND EN DE LEVER.
(Rowland & Tozer, 1995)
2
Door het ‘first-pass’ effect zal slechts een fractie van de toegediende dosis van een geneesmiddel de algemene circulatie bereiken. Wanneer de moedermolecule het werkzame bestanddeel is, zal de plasmaconcentatie lager liggen en zal het effect kleiner zijn. Wanneer echter een metaboliet van de moedermolecule het werkzame bestanddeel is, dan zal de plasmaconcentratie hoger liggen en het effect bijgevolg groter zijn.
De lever speelt een cruciale rol in de farmacokinetiek van geneesmiddelen, ook op niveau van absorptie: bij patiënten met een hepatische dysfunctie zal er minder presystemische metabolisatie optreden waardoor een hogere fractie van het geneesmiddel de algemene circulatie zal bereiken. Dit is hoofdzakelijk van belang bij geneesmiddelen met een hoge hepatische extractie ratio (= efficiëntie waarmee een geneesmiddel door lever uit de bloedbaan verwijderd wordt): deze geneesmiddelen kennen een belangrijk ‘first-pass’ effect. Bij bijvoorbeeld patiënten met levercirrose is een verhoogde orale biologische beschikbaarheid waargenomen. Deze patiënten zijn gevoeliger voor zowel de gewenste als ongewenste effecten van een geneesmiddel, aanpassing van de dosering kan bijgevolg noodzakelijk zijn (Verbeeck, 2008).
1.2.2 Distributie De distributie of verdeling is het proces waarbij een geneesmiddel zich verplaatst van de bloedbaan naar de weefsels. Er zijn tal van factoren die dit proces bepalen. Een eerste factor is de passage doorheen membranen. Daarbij zijn onder andere de vetoplosbaarheid, de ionisatiegraad en de grootte van de geneesmiddelmolecule van belang. Dit komt omdat geneesmiddelen membranen hoofdzakelijk passeren door passieve niet-ionische diffusie. Ook het bloeddebiet bepaalt de distributie. De doorbloeding in het hart, de lever en de nieren is beter dan bijvoorbeeld in de spieren en het vetweefsel. Daardoor zal het geneesmiddel eerst vervoerd worden naar het hart, de lever en de nieren. Verder bepaalt de eiwitbinding in plasma en weefsels ook de distributie van het geneesmiddel. De eiwitbinding in plasma is belangrijk omdat enkel ongebonden geneesmiddel zich kan verplaatsen naar de weefselcompartimenten. Eiwitten, die het geneesmiddel in plasma kunnen binden, zijn onder andere albumine en α1-zure glycoproteïne. Albumine heeft vele bindingsplaatsen met een wisselende affiniteit en kan zowel zure als basische farmaca binden. α1-zure glycoproteïne heeft één hoge affiniteitsbindingsplaats en bindt enkel farmaca met een basische structuur.
3
Bij geneesmiddelen die sterk eiwitgebonden zijn, is de fractie ongebonden geneesmiddel vaak hoger bij patiënten met een chronische leveraandoening dan bij gezonde personen. Hiervoor bestaan verschillende oorzaken: minder synthese van albumine en α1-zure glycoproteïne door de lever, accumulatie van endogene componenten (zoals bilirubine) waardoor competitie voor de plasma-eiwitten optreedt en eventuele kwalitatieve veranderingen in de plasma-eiwitten. Als de fractie ongebonden geneesmiddel hoger is, kan meer geneesmiddel zich verplaatsen naar de weefsels. Dit kan aanleiding geven tot wijzigingen in plasmaconcentratie en hierbij kunnen ook neveneffecten optreden. Dit wijst er opnieuw op dat een aanpassing van de dosering van een geneesmiddel noodzakelijk kan zijn bij patiënten met een chronische leveraandoening (Verbeeck, 2008).
1.2.3 Metabolisatie De metabolisatie of de biotransformatie van een geneesmiddel is de omzetting van de moedermolecule naar een meer polaire, wateroplosbare molecule die in de urine kan uitgescheiden worden. Deze omzetting gebeurt door fase I en fase II reacties in de lever. Fase I reacties zijn zogenaamde functionalisatiereacties: hydrolyses, reducties en oxidaties, waarvan de laatste veruit de belangrijkste zijn. Deze functionalisatiereacties hebben een meer polaire molecule als resultaat en kunnen eventueel aanleiding geven tot meer reactieve of toxische componenten. Fase II reacties zijn zogenaamde conjugatiereacties. Dit kan de conjugatie van het geneesmiddel of een fase I metaboliet met onder andere glucuronzuur, glutathion of sulfaat voorstellen. Het resultaat hiervan is een meer wateroplosbare en meestal minder actieve molecule (Donato & Castell, 2003).
De lever is het belangrijkste metaboliserende orgaan in het lichaam (Benedetti & Baltes, 2003). Zoals te zien is in Figuur 1.3, is de lever onderverdeeld in twee delen, een rechter- en een linkerlob. De twee lobben zijn verder opgebouwd uit vele lobules. Een lobule is opgebouwd uit levercellen of hepatocyten. De leverlobules bevatten sterk permeabele capillairen, de sinusoïden. In de sinusoïden zijn de Kupffer cellen aanwezig, dit zijn gefixeerde fagocyten die deel uit maken van het immuunsysteem (Tortora & Derrickson, 2006).
4
FIGUUR 1.3: ANATOMIE VAN DE LEVER
(http://www.biomed.metu.edu.tr/courses/term_papers/bioartf-liver_kenar.htm)
De belangrijkste detoxificatiereacties in de lever zijn de oxidatiereacties door de microsomale cytochroom P450 enzymen (CYP450-enzymen). Deze enzymen komen hoofdzakelijk tot expressie in de lever, maar komen ook in extrahepatisch weefsel, zoals de longen, de nieren, de gastro-intestinale tractus en de placenta (Donato & Castell, 2003). Deze enzymen maken deel uit van het ‘microsomale mixed function oxidase’ systeem: een systeem gelokaliseerd ter hoogte van het glad endoplasmatische reticulum, bestaande uit de CYP450enzymen, het NADPH-afhankelijke CYP450-reductase en het cytochroom b5. Deze enzymen zorgen samen voor een fase I oxidatie. De cofactoren van deze enzymen zijn zuurstof en NADPH (Verbeeck, 2008). In Figuur 1.4 staat weergegeven hoe een geneesmiddel (DH) geoxideerd wordt door het ‘microsomale mixed function oxidase’ systeem.
CYP450-enzymen zijn hemoproteïnen. Dit werd voor het eerst aangetoond door Omura in 1964. Ze bevatten een niet-covalent gebonden heemfunctie, wat een protoporphyrine IX ring is met een ijzeratoom, zie Figuur 1.5 (Schenkman & Jansson, 1998).
5
FIGUUR 1.4: OXIDATIE VAN EEN GENEESMIDDEL DOOR HET ‘MICROSOMALE MIXED FUNCTION OXIDASE’ SYSTEEM (DH = GENEESMIDDEL, DOH = GEOXIDEERD GENEESMIDDEL).
(Rang et al., 2003)
FIGUUR 1.5: PROTOPORPHYRINE IX RING MET IJZERATOOM, AANWEZIG IN DE HEEMFUNCTIE VAN HEMOPROTEÏNEN ZOALS DE CYP450-ENZYMEN, MYOGLOBINE, HEMOGLOBINE, EN ANDERE.
6
De CYP450-enzymen zijn een verzameling van verschillende iso-enzymen die ingedeeld worden in families en subfamilies op basis van hun homologie op genniveau in nucleotidensequentie, waar de eerste pogingen om ze te classificeren gebeurden op basis van de reacties die ze katalyseren. Bij de huidige indeling krijgt elke iso-vorm een 3-delige code. Daarbij wijst bij bijvoorbeeld CYP1A2: de 1 op de familie, de A op de subfamilie en de 2 op het specifiek enzym. In mensen zijn er tot nu toe 16 families en 29 subfamilies gekend. Familie 1, 2 en 3 zijn het belangrijkst voor de biotransformatie van geneesmiddelen. De belangrijkste iso-enzymen zijn: CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 en CYP3A4. CYP3A4 maakt 30-40% van het totale CYP450-gehalte in de lever uit (Donato & Castell, 2003).
Er kunnen grote interindividuele verschillen optreden in de metabolisatie van geneesmiddelen. Dit komt meestal door een variabiliteit in de CYP450-genexpressie tussen verschillende individuen. Er bestaan verschillende varianten van de CYP450-genen, en de resulterende enzymen hebben elk hun eigen katalytische activiteit. Afhankelijk van welke variant wordt overgeërfd, wordt een geneesmiddel minder of meer gemetaboliseerd. Dit wordt respectievelijk aangeduid als een trage metabolizeerder en een snelle metabolizeerder. Dit verschil in genetische aanleg wordt ook genetisch polymorfisme genoemd. Wanneer een geneesmiddel grotendeels door één bepaald CYP450-enzym gemetaboliseerd wordt, kan dit leiden tot grote verschillen in farmacokinetiek en farmacodynamiek (Donato & Castell, 2003).
Bij de geboorte kunnen de metabolische pathways nog immatuur zijn. Naarmate een pasgeborene ouder wordt, ontwikkelen de verschillende enzymsystemen zich. Dit wordt de maturatie van de metabole enzymen genoemd. Het totale CYP450-gehalte van een foetale lever is slechts één derde van dat van een volwassene. Er wordt meestal aangenomen dat enkel de isovormen van de CYP3A subfamilie aanwezig zijn (Benedetti & Baltes, 2003). Wanneer de CYP450-activiteit zou bestudeerd worden bij kinderen met leverlijden, wordt verwacht dat de activiteit lager ligt door het leverlijden zelf, echter de activiteit zal ook afhankelijk zijn van de leeftijd. Wanneer bij kinderen een levertransplantatie wordt uitgevoerd, kan een deel van een volwassen lever worden gebruikt (de ‘split-liver’-techniek, (Spada et al., 2009)). Daarbij is nog weinig geweten over hoe de metaboliserende capaciteit van de volwassen lever evolueert na transplantatie in het kind.
7
Om de CYP450-enzymen te bestuderen en de activiteit ervan in vitro te bepalen, wordt de microsomale fractie van leverstalen afgezonderd. Deze subcellulaire fractie wordt bekomen door disruptie van het endoplasmatisch reticulum (ER). Ze bevat gesloten vesikels (microsomen), meestal omsloten met het buitenste membraan van het ER, met daarin alle componenten uit het ER. De microsomen in de microsomale fractie kunnen zowel van het glad als van het ruw ER afkomstig zijn. In de microsomen zijn tal van enzymen aanwezig, zoals het ‘microsomale mixed function oxidase’ systeem, het deacetylase, en de UDPglucuronyltransferasen. De microsomale fractie kan bekomen worden door homogenisatie en differentiële ultracentrifugatie (Onbekend, 2009). Ze bevat 96% van het CYP450-gehalte in de lever. De andere 4% zijn niet-microsomale CYP450-enzymen en zijn gebonden op de mitochondriën. (Wilson et al., 2003).
Bij patiënten met een chronische leveraandoening wordt een daling van de enzymactiviteit en eiwitconcentratie gezien, en de daling neemt toe naarmate de ziekte erger wordt. Dit zal natuurlijk een negatieve invloed hebben op de metaboliserende capaciteit van de lever. Daarbij komt nog de capillarisatie van de sinusoïden, waardoor de transfer van geneesmiddelen en zuurstof van het bloed naar de hepatocyten in het gedrang kan komen (Le Couteur et al., 2005). Ook dit heeft een negatieve invloed op de metaboliserende capaciteit van de lever. Dit alles toont nógmaals aan dat een aanpassing van de dosering van een geneesmiddel nodig is bij chronische leveraandoeningen (Verbeeck, 2008).
1.2.4 Excretie De excretie van een onveranderd geneesmiddel of een metaboliet van het geneesmiddel kan op verschillende manieren gebeuren. De belangrijkste is daarbij de uitscheiding via de nieren in de urine. Daarnaast kan ook biliaire excretie (via gal en faeces) optreden. Minder belangrijke vormen van excretie zijn o.a. traanvocht, huid, speeksel, melk en longen.
Vergevorderd leverlijden gaat heel vaak gepaard met nierfalen. Het wordt aangeduid als het hepatorenaal syndroom: een onverklaarbaar progressief nierfalen bij patiënten met een chronische leveraandoening. Bij deze patiënten kan het dus nodig zijn om niet enkel de dosis van geneesmiddelen die hoofdzakelijk door lever worden geklaard te verminderen, maar ook van geneesmiddelen die hoofdzakelijk door de nieren worden geklaard (Verbeeck, 2008).
8
Geneesmiddelen die in grote mate biliair uitgescheiden worden, zullen bij een eventuele galwegenobstructie accumuleren in het lichaam. Daardoor kan er ook schade optreden aan de hepatocyten waardoor de metaboliserende capaciteit van de lever achteruitgaat. Bij patiënten met cholestasis (galstuwing) zal dosisaanpassing bijgevolg ook noodzakelijk zijn (Verbeeck, 2008). 1.3
PROTEÏNEBEPALINGEN
1.3.1 Algemeen Een eiwit of proteïne is een polypeptide opgebouwd uit aminozuren. De aminozuren zijn met elkaar verbonden via een peptidebinding. In Figuur 1.6 worden de peptidebindingen tussen meerdere aminozuren weergegeven. Wanneer een groot aantal aminozuren verbonden wordt met elkaar, wordt gesproken van een polypeptide.
FIGUUR 1.6: PEPTIDEBINDING.
De in vitro evaluatie van de activiteit van CYP450-enzymen gebeurt in een microsomale suspensie. Naast de CYP450-enzymen als hemoproteïnen zijn er natuurlijk ook nog andere proteïnen aanwezig in de suspensie. Voor het bestuderen van de CYP450enzymen is het belangrijk om de suspensie op twee manieren de karakteriseren, enerzijds door een totale proteïnebepaling en anderzijds door een specifieke CYP450-bepaling. In de literatuur wordt voor de proteïnebepaling meestal een colorimetrische methode gebruikt. De methoden van Lowry en van Bradford zijn de meest toegepaste. Voor de CYP450-bepaling wordt een spectrofotometrische methode gebruikt, dit kan de methode van Omura of de methode van Matsubara zijn.
9
1.3.2 Proteïnebepaling volgens Lowry en Bradford De methoden van Lowry en Bradford zijn beiden spectrofotometrische bepalingen in het zichtbare gebied (380-780 nm). Ze zijn gebaseerd op een chemische reactie waardoor chromoforen gegenereerd worden. Een chromofoor is het deel van een molecule die absorptie in het UV-gebied of het zichtbare gebied van het elektromagnetisch spectrum (EMS) vertoont. Geconjugeerde dubbele bindingen kunnen licht met een golflengte in het UV-gebied of het zichtbare gebied absorberen. Chromogene groepen van eiwitten zijn bijvoorbeeld aminozuren met een aromatische ringstructuur (Lucarini & Kilikian, 1999). Twee voorbeelden zijn weergegeven in Figuur 1.7.
FIGUUR 1.7: TRYPTOFAAN (LINKS) EN TYROSINE (RECHTS).
Bij de methode van Lowry wordt gebruik gemaakt van twee kleurvormende reacties. In de eerste reactie complexeren de peptidebindingen met de koperionen van kopersulfaat, dit gebeurt in aanwezigheid van een base en natriumkaliumtartraat. Dit is in principe de biureet reactie. Het resultaat is een blauwe kleur (Lucarini & Kilikian, 1999). In de tweede reactie wordt het fosfomolybdaat bevattende Folin-Ciocalteu reagens toegevoegd. Chromogene groepen zoals tryptofaan, tyrosine (en in mindere mate cysteïne en histidine) reduceren het fosfomolybdaat waardoor ook een blauwe kleur ontstaat. Hierbij worden de aromatische groepen geoxideerd via een koper-gekatalyseerd mechanisme. Het uiteindelijke resultaat is een intense blauwe kleur die gemeten wordt bij 750 nm (Lucarini & Kilikian, 1999). De gevormde kleur is niet recht evenredig met het proteïnegehalte. Met behulp van een gekende standaardoplossing (BSA) wordt op voorhand een standaardcurve opgesteld en uit de standaardcurve kan dan het onbekende proteïnegehalte bepaald worden (Lowry et al., 1977). Het nadeel aan de methode van Lowry is dat ze zeer gevoelig is aan interferenties. Dit kan zorgen voor verhoging of vermindering van de absorbantie, maar ook kan een precipitaat gevormd worden bij hoge zoutconcentraties. Voorbeelden van interfererende substanties zijn: detergenten, glucose, sucrose, kalium, glycerol en magnesium (Peterson, 1979). 10
Bij de methode van Bradford wordt gebruikt gemaakt van het Coomassie Brilliant Blue G-250, een kleurstof dat in twee verschillende gekleurde vormen bestaat, namelijk rood en blauw. In zuur milieu treedt binding op tussen de kleurstof en de proteïne waarbij de rode vorm wordt omgezet in de blauwe vorm. Bij deze interactie zijn hoofdzakelijk basische aminozuren zoals arginine, lysine en histidine betrokken. De blauw kleur kan gemeten worden bij 595 nm (Bradford, 1976; Lucarini & Kilikian, 1999). De methode van Bradford biedt enkele voordelen t.o.v. die van Lowry: ze is vlugger, minder omslachtig en er zijn veel minder interferenties (Bradford, 1976).
1.3.3 CYP450-bepaling volgens Omura en Matsubara De heemmolecule in de CYP450-enzymen is enkel in zijn gereduceerde vorm in staat om kleine moleculen, zoals koolstofmonoxide (CO), te binden (Garfinkel, 1958). Van deze eigenschap wordt gebruik gemaakt om specifiek het CYP450-gehalte te bepalen in microsomen. Wanneer dit complex gevormd wordt, ontstaat een molecule die een absorptiemaximum vertoont in het zichtbare gebied van het EMS. Op deze manier kan het gehalte bepaald worden door gebruik te maken van de Wet van Lambert-Beer (zie vergelijking 1).
(vergelijking 1)
E = ε.c.l waarin:
E: extinctie ε: molaire extinctiecoëfficient (mM-1.cm-1) c: concentratie (mM) l : weglengte (cm)
Bij de methode van Omura worden zowel de referentie als het staal (beiden een verdunde hoeveelheid microsomen) gereduceerd, waarna enkel het staal verzadigd wordt met CO. De bekomen verbinding, een complex van het gereduceerde CYP450-enzym met CO, vertoont een absorptiepiek bij 450 nm. Aangezien referentie en staal op een andere manier behandeld worden, ontstaan er spectrale verschillen. De twee spectra worden van elkaar afgetrokken en zo wordt een ‘difference’ spectrum bekomen. Op deze manier worden interfererende bestanddelen uitgeschakeld. In dit spectrum worden 2 pieken teruggevonden. Een piek bij 450 nm, die de gereduceerde CYP450-enzymen in complex met CO voorstellen, en een piek bij 420 nm. Deze laatste piek kan zowel de gedenatureerde, inactieve vorm van de CYP450-enzymen (aangeduid als CYP420) in complex met CO als het carboxyhemoglobine 11
voorstellen. Met behulp van de wet van Lambert-Beer kan de concentratie vervolgens berekend worden (Omura & Sato, 1964).
In aanwezigheid van hemoglobine verschuift de piek in het spectrum van 450 nm naar 454 nm. Bij stalen die gecontamineerd zijn met hemoglobine, wordt bijgevolg beter de methode van Matsubara toegepast. Hierbij worden zowel de referentiecuvet als de staalcuvet doorborreld met CO, waarna enkel het staal gereduceerd wordt. De piek bij 420 nm stelt bij de methode van Matsubara de gedenatureerde, inactieve vorm van de CYP450-enzymen (aangeduid als CYP420) in complex met CO en het gereduceerde cytochroom b5 voor. Het hemoglobine wordt als interferentie uitgeschakeld omdat het carboxyhemoglobine in beide stalen gevormd wordt. Ook hier kan met behulp van de wet van Lambert-Beer de concentratie afgeleid worden (Matsubara et al., 1976).
Cytochroom b5 is ook een hemoproteïne: het bevat een niet-covalent gebonden heemfunctie (Figuur 1.5). In tegenstelling tot de CYP450-enzymen kan dit hemoproteïne geen CO binden. Het speelt een belangrijke rol in de transfer van elektronen naar de CYP450enzymen, een proces waarbij ook het NADPH-afhankelijke CYP450-reductase betrokken is (Schenkman & Jansson, 2003).
1.3.4 MPPGL – Recovery Factor Om de microsomen verder te karakteriseren, wordt gebruik gemaakt van een extra factor: de MPPGL, of Microsomal Protein Per Gram of Liver. Om de MPPGL-waarden te berekenen moet rekening gehouden worden met het verlies aan microsomale eiwitten tijdens de bereiding van microsomen. Door de bepaling van een bepaalde merker die specifiek is voor de microsomale fractie, bijvoorbeeld het totale CYP450-gehalte, kan het verlies berekend worden. Aangezien meer dan 96% van het CYP450-gehalte in de lever microsomaal is, kan het totale CYP450-gehalte in het homogenaat en in de microsomale suspensie gebruikt worden. De recovery factor geeft weer hoeveel microsomale eiwitten overblijven na de bereiding van de microsomen en kan berekend worden met vergelijking 2. Met behulp van deze waarde en het microsomaal proteïnegehalte (MSP) kan de MPPGL bepaald worden (vergelijking 3) (Barter et al., 2008; Wilson et al., 2003).
12
f = CYP450microsomaal / CYP450homogenaat waarin:
(vergelijking 2)
f: recovery factor CYP450microsomaal: CYP450-gehalte in de microsomen (nmol/g lever) CYP450homogenaat: CYP450-gehalte in het homogenaat (nmol/g lever)
MPPGL = MSP / f waarin:
(vergelijking 3)
MPPGL: microsomal protein per gram of liver (mg/g lever) MSP: microsomaal proteïnegehalte (mg/g lever) f: recovery factor
1.4
CYP450-ACTIVITEITSBEPALING Een CYP450-activeitsbepaling gebeurt in verschillende stappen (hieronder beschreven): 1) Incubatie van de microsomale suspensie met selectieve probes. 2) Chromatografische scheiding. 3) Massaspectrometrische detectie en kwantificatie. 4) Activiteitsbepaling en vergelijking met een referentie.
1.4.1 Incubatie Om de CYP450-activiteit te bepalen wordt de microsomale suspensie met specifieke probes of substraten geïncubeerd. De probes worden daarbij door de CYP450-enzymen omgezet tot metabolieten. Bij een ideale probe weerspiegelt de vormingssnelheid van de metaboliet de activiteit van het enzym. Bij voorkeur ondergaat de gevormde metaboliet geen verdere omzettingen meer. De reactie moet selectief zijn, d.w.z. dat de vorming van de metaboliet zoveel mogelijk door één enkel enzym moet worden uitgevoerd (Yuan et al., 2002). Een aantal veelgebruikte probes zijn weergegeven in Tabel 1.1.
TABEL 1.1: PROBES EN HUN METABOLIETEN VOOR DE BEPALING VAN DE ACTIVITEIT VAN CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, EN CYP3A4.
(Kim et al., 2005) CYP450-enzym probe metaboliet CYP1A2 phenacetine acetaminophen CYP2C9 tolbutamide 4-hydroxytolbutamide CYP2C19 s-mephenytoïne 4'-hydroxyphenytoïne CYP2D6 dextromethorphan dextrorphan CYP2E1 chlorzoxazone 6-hydroxychlorzoxazone CYP3A4 midazolam 1-hydroxymidazolam
13
De concentratie van de probes tijdens de incubatie moet rond de Michaëlis-Menten constante (Km) liggen. Km is de substraatconcentratie waarbij de helft van de maximale reactiesnelheid van het enzym bereikt wordt. Bij deze concentratie is er een lineair verband tussen de reactiesnelheid en de probeconcentratie, zoals weergegeven in Figuur 1.8. De concentratie moet echter wel hoog genoeg zijn om een metabolietconcentratie te bekomen die met de gebruikte analysemethode kan gedetecteerd worden (Walsky & Obach, 2004).
FIGUUR 1.8: MICHAËLIS-MENTEN PLOT: V=REACTIESNELHEID, VMAX=MAXIMALE REACTIESNELHEID (VERZADIGING VAN DE ENZYMEN), KM=MICHAËLISMENTENCONSTANTE, S=PROBECONCENTRATIE.
(http://depts.washington.edu/wmatkins/kinetics/michaelis-menten.html)
Om de analysetijd te verkorten en de methode minder arbeidsintensief te maken, wordt tegenwoordig gebruik gemaakt van een zogenaamde cocktail-strategie. Waar vroeger de microsomen apart met elke probe werden geïncubeerd en de metabolieten elk afzonderlijk werden gedetecteerd, worden in
een cocktail-methode alle probes in één incubatie
toegevoegd. Vervolgens worden de metabolieten allen tegelijk gescheiden en gedetecteerd met LC-MS/MS (zie 1.4.2). Bij cocktail-incubaties kunnen echter problemen optreden zoals interacties tussen de verschillende probes. Door de lipofiele aard van veel probes is het nodig om een organisch solvent te gebruikten voor de solubilisatie. Busby en Chauret toonden reeds aan dat organische solventen een belangrijke invloed kunnen hebben op de enzymactiviteit (Busby et al., 1999; Chauret et al., 1998). Methanol bij een concentratie van 0,5 % of 1% wordt het meest aangeraden. Bij andere solventen zoals DMSO en acetonitrile of hogere concentraties van methanol vindt inhibitie van de CYP450-enzymen plaats (Kim et al., 2005). 14
1.4.2 Chromatografische scheiding Vloeistofchromatografie of ‘Liquid Chromatography’ (LC), is een analytische techniek die gebruikt wordt om verschillende componenten in een mengsel te scheiden. Na injectie wordt het mengsel via een mobiele fase langs een stationaire fase (op een kolom) geleid. Voor de eigenlijke kolom is er ook meestal een pre-kolom aanwezig, dit om eventuele contaminatie en storende elementen tegen te houden. De verschillende componenten die in het mengsel aanwezig zijn verdelen zich over de beide fasen. Als een component interactie vertoont met de stationaire fase dan wordt die vertraagd. Verschillende componenten vertonen een verschillende affiniteit voor de stationaire fase en zullen op verschillende tijdstippen de kolom verlaten (= elueren). Het tijdstip waarop dit gebeurt wordt de retentietijd (tr) genoemd. Het scheidingsproces kan gevisualiseerd worden met behulp van een detector, in dit geval de massaspectrometer (zie 1.4.3). De visualisatie van het elutieprofiel wordt een chromatogram genoemd. Op basis van de retentietijd kan afgeleid worden welke component elueert. Ook kan op basis van de piekhoogte of piekoppervlakte de concentratie van het eluerende bestanddeel bepaald worden. Bij vloeistof-vaste fase chromatografie onder verhoogde druk (‘High Performance Liquid Chromatography’, HPLC) is de mobiele fase vloeibaar en de stationaire fase vast. De mobiele fase wordt samen met het staal onder verhoogde druk over de kolom gestuurd. Dit kan gebeuren volgens isocratische elutie, wat wil zeggen dat gedurende de volledige run dezelfde mobiele fase gebruikt wordt, of het kan gebeuren volgens gradiëntelutie. Bij gradiëntelutie wordt er overgeschakeld van een zwak naar een sterk eluens. Voordelen hierbij zijn onder andere een beter scheiding, een kortere analysetijd, en een toename in gevoeligheid. Als stationaire fase kan een apolair adsorbens gebruikt, waardoor van omgekeerde fase chromatografie gesproken wordt (reversed phase chromatography, RP). In geval van een polair adsorbens als stationaire fase wordt er gesproken van normale fase chromatografie (normal phase chromatography, NP) (Simpson, 1976).
De in de literatuur beschreven methoden voor de CYP450-activiteitsbepaling maken meestal gebruik van RP-LC met gradiëntelutie. Als mobiele fase kan bijvoorbeeld water met mierenzuur en acetonitrile met mierenzuur worden gebruikt die volgens een bepaalde gradient gepompt worden (Kim et al., 2005). Mierenzuur wordt toegevoegd om de ionisatie van de componenten in de massaspectrometer te vergemakkelijken. Water is hier het zwakke eluens, terwijl acetonitrile het sterke eluens is. De hoeveelheid acetonitrile wordt geleidelijk aan opgevoerd. De polaire verbindingen zullen daardoor eerst elueren en de apolaire pas later. Als
15
stationaire fase wordt meestal een C18-RP kolom gebruikt (Lahoz et al., 2008). Deze stationaire fase is chemisch gemodificeerd silica met daarop een lange alkylketen gebonden. De interacties die zullen plaatsvinden tussen deze stationaire fase en de eluerende componenten zijn Van der Waalse attractiekrachten (Perry et al., 1972). Dit zijn krachten ten gevolge van het elektronencorrelatie-effect. Elektronen veranderen continu van positie waardoor kortstondig plaatsen kunnen ontstaan met een teveel of een tekort aan elektronendensiteit. Zo kunnen aantrekkingskrachten ontstaan tussen plaatsen met een teveel en een tekort aan elektronendensiteit. Deze krachten zijn afhankelijk van afstand, van zodra de elektronenwolken elkaar overlopen ontstaat er repulsie tussen de 2 moleculen.
1.4.3 Massaspectrometrische detectie en kwantificatie De detectie en visualisatie van de metabolieten die elueren van de kolom gebeurt met behulp van een massaspectrometer (MS)
(Kim et al., 2005). Een massaspectrometer is
gebaseerd op de vorming van ionen. Bij deze techniek wordt de vloeistof (mobiele fase en metabolieten) die van de kolom elueert, geleid naar een capillair. Dit capillair staat onder spanning en daardoor vernevelt de vloeistof. Er ontstaat zo een spray van geladen druppels en deze ionisatie methode wordt ‘electrospray’ ionisatie (ESI) genoemd (Manisali et al., 2006). Afhankelijk van het ionisatieproces kunnen positieve of negatieve ionen gevormd worden. Door een stroom van warm stikstofgas rond het capillair verdampt de mobiele fase en ontstaan ionen in de gasfase aan het uiteinde van het capillair. Deze stap gebeurt bij atmosferische druk, alle volgende stappen gebeuren echter in vacuüm. Na ionisatie worden de ionen gescheiden volgens hun massa-over-ladingsverhouding (m/z) door de quadrupolen. Wanneer MS gebruikt wordt als detectiemethode na LC, wordt vaak gebruik gemaakt van ‘multiple reaction monitoring’, of MRM. Daarbij wordt het precursorion (meestal het moleculair ion) van de te detecteren component geselecteerd en doorgelaten door een eerste quadrupool. In een botsingscel wordt het precursorion gefragmenteerd in productionen bij een bepaalde spanning (botsingsenergie) en door botsing met argongas. De productionen worden geleid naar een tweede quadrupool waar ook één bepaald production geselecteerd en doorgelaten wordt. Op deze manier wordt slechts één precursorion en één production gevolgd en verhogen de selectiviteit en gevoeligheid van de detectie. Het algemene schema van MRM is weergegeven in Figuur 1.9. Vervolgens gaan de productionen richting de detector, een elektronenmultiplier. Het resultaat is een (massa-)chromatogram.
16
FIGUUR 1.9: PRINCIPE MULTIPLE REACTION MONITORING
(http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=514467)
1.4.4 Activiteitsbepaling De hoeveelheid gevormde metaboliet is een maat voor de activiteit van de CYP450isovorm (uitgedrukt in pmol/mg proteïne x min). Deze activiteiten kunnen vergeleken worden met de CYP450-activiteit van commercieel beschikbare referentie-microsomen. Op deze manier kan bepaald worden of de metaboliserende capaciteit van de lever veranderd is en in welke mate. 1.5
PBPK-MODELLEN PBPK-modellen,
of
Physiologically
Based
PharmacoKinetics-modellen,
zijn
wiskundige modellen die gebruikt worden om de plasmaspiegels van geneesmiddelen te voorspellen in specifieke populaties op basis van de populatiekarakteristieken en de fysicochemische eigenschappen van het geneesmiddel (Nestorov, 2007). Deze modellen kunnen gebruikt worden om op een efficiëntere manier betere doseringsschema’s op te stellen voor nieuwe geneesmiddelen. In vergelijking met de conventionele farmacokinetische modellen bevatten de PBPK-modellen veel meer informatie. De conventionele modellen zijn eenvoudige één-, twee-, of driecompartimentele structuren die enkel gebruikt worden om het verloop van de plasmaspiegels te beschrijven. De PBPK-modellen proberen het transport van een geneesmiddel in het lichaam op een zo realistisch mogelijke manier weer te geven. Ze maken gebruik van alle informatie die reeds gekend is over de onderliggende (patho)fysiologische mechanismen die de farmacokinetische eigenschappen van een geneesmiddel bepalen (deze modellen worden daarom ook vaak aanzien als “mechanistische modellen”) (Nestorov, 2007). Het is bijvoorbeeld gekend dat bij volwassenen met levercirrose de activiteit van verschillende CYP450-isovormen sterk gedaald is (Verbeeck, 2008). Deze informatie kan dan – samen met informatie over andere fysiologische processen die beïnvloed worden door levercirrose – gebruikt worden in een PBPK-model dat de invloed van levercirrose op de farmacokinetiek van geneesmiddelen voorspelt. Op deze manier houden PBPK-modellen dus rekening met alle organen die betrokken zijn in het proces, waardoor ze 17
veel meer compartimenten bezitten. In bijvoorbeeld een twee-compartimenteel model wordt het lichaam enkel onderverdeeld in een centraal (bloed) en een perifeer (weefsels) compartiment (Nestorov, 2007). In Figuur 1.10 wordt een PBPK-model vergeleken met een twee-compartimenteel model. Een PBPK-model is duidelijk veel complexer en vollediger dan een twee-compartimenteel model.
FIGUUR 1.10: EEN PBPK-MODEL (LINKS; Q=BLOEDDEBIET, CLINT=INTRINSIEKE KLARING) IN VERGELIJKING MET EEN EENVOUDIG TWEE-COMPARTIMENTEEL MODEL (RECHTS; D=DOSIS, KE=ELIMINATIESNELHEIDSCONSTANTE, VC=VOLUME CENTRAAL COMPARTIMENT, VT=VOLUME PERIFEER COMPARTIMENT).
(Nestorov, 2007) Met behulp van de bekomen resultaten uit de evaluatie van de CYP450-activiteit bij specifieke doelgroepen, kunnen parameters bepaald worden om PBPK-modellen te ontwikkelen voor deze specifieke doelgroepen. Er is al veel geweten over de invloed van leverlijden op de CYP450-activiteit bij volwassenen, maar praktisch niets bij kinderen als doelgroep. Door meer onderzoek te verrichten kunnen er in de toekomst ook parameters bepaald worden voor deze specifieke doelgroep en kunnen geneesmiddelen veiliger gedoseerd worden.
18
2
OBJECTIEVEN Over de invloed van leverlijden op de activiteit van de CYP450-enzymen bij
volwassenen is al veel geweten, maar bij kinderen als doelgroep is er nog maar zeer weinig informatie ter beschikking. Wanneer dit aspect beter bij kinderen zou bestudeerd worden, kunnen met behulp van PBPK-modellen betere doseringsschema’s bepaald worden voor kinderen met leverlijden.
Het doel van deze masterproef is vierledig. 1) microsomen bereiden 2) proteïnebepaling 3) CYP450-bepaling 4) controle van microsomen en karakterisatiemethoden
Eerst en vooral is het de bedoeling om een methode op punt te stellen om microsomen te bereiden. Hierbij wordt uitgegaan van het protocol dat gebruikt wordt aan de University of Sheffield (UK) en in Janssen Farmaceutica te Beerse (België). De microsomen zullen bereid worden door homogenisatie en differentiële ultracentrifugatie.
Vervolgens zal ook bepaald worden welke methode kan gebruikt worden om het totale proteïnegehalte van de microsomen te bepalen. Dit is nodig omdat het CYP450-gehalte van de microsomen wordt uitgedrukt in functie van de proteïneconcentratie. In deze masterproef zullen de methoden van Lowry en Bradford, beiden spectrofotometrische methoden, met elkaar vergeleken worden. De meest accurate en minst arbeidsintensieve methode zal uiteindelijk gekozen worden.
Ten derde zal het CYP450-gehalte in het homogenaat (bekomen na homogenisatie van het leverstaal) en in de microsomale suspensie bepaald worden. Om dit te doen kan gebruik gemaakt worden van de methode van Omura of Matsubara. Dit zijn twee spectrofotometrische bepalingen die gebaseerd zijn op de binding van koolstofmonoxide aan de CYP450-enzymen. Doordat het homogenaat en de microsomale suspensie meestal gecontamineerd zijn met hemoglobine zal het waarschijnlijk beter zijn om de methode van Matsubara te gebruiken. De methode van Omura is gevoelig aan deze interferentie. Het CYP450-gehalte in het homogenaat en de microsomale suspensie zullen nodig zijn om de MPPGL te bepalen.
19
Aangezien de kwantificatiemethoden nog niet gevalideerd zijn, kunnen nog geen kwantitatieve activiteitsbepalingen worden uitgevoerd. Wel zal door incubatie met midazolam en dextromethorphan een kwalitatieve controle van de microsomen uitgevoerd worden. Hierbij wordt gebruik gemaakt van het incubatieprotocol dat aan de University of Sheffield (UK) gebruikt wordt. Na incubatie van de microsomen met midazolam en na centrifugatie wordt het supernatans gecontroleerd op de aanwezigheid van 1-hydroxymidazolam met behulp van een LC-MS/MS methode. Analoog wordt na incubatie van de microsomen met dextromethorphan en na centrifugatie, het supernatans gecontroleerd op de aanwezigheid van dextrorphan. De omzetting van midazolam gebeurt door CYP3A4 en van dextromethorphan door CYP2D6. Als 1-hydroxymidazolam en dextrorphan aanwezig zijn, kan besloten worden dat de CYP450-enzymen nog actief zijn en de microsomen op een adequate manier bereid worden. Om te controleren of de gebruikte proteïnebepaling en CYP450-bepaling nauwkeurig worden uitgevoerd, worden volledig gekarakteriseerde microsomen gekocht om daar de gebruikte methoden op te testen.
20
3 3.1
MATERIALEN EN METHODEN BEREIDING BUFFERS
3.1.1 Buffer 1 Buffer 1 is een fosfaatbuffer met kaliumchloride bij pH 7,25. Deze buffer wordt gebruikt voor de homogenisatie in de bereiding van microsomen. De voorkeur gaat daarbij uit naar kaliumzouten in plaats van natriumzouten omwille van hun grotere oplosbaarheid bij lage temperaturen. Kaliumchloride helpt bij de verwijdering van hemoglobine tijdens de bereiding van de microsomen (Onbekend, 2009). 3.1.1.1 Materialen Di-kaliumwaterstoffosfaat
(K2HPO4),
kaliumdiwaterstoffosfaat
(KH2PO4)
en
kaliumchloride (KCl) worden aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België. Millipore-water wordt gebruikt om alle oplossingen te maken (Brussel, België). Om de pH te meten wordt een Consort C831 (Consort nv., Turnhout, België) gebruikt met een magnetische roerder 851 ECO_MAG_STIR (Labinco, Breda, Nederland). 3.1.1.2 Methode Buffer 1 wordt bereid uit de volgende twee componenten: 1) 0,25 M K2HPO4 (MG = 174,18) met 1,15% KCl (MG = 74,55) 2) 0,25 M KH2PO4 (MG = 136,09) met 1,15% KCl (MG = 74,55) Component 2 wordt geleidelijk bij component 1 toegevoegd tot een pH van 7,25 bereikt wordt.
3.1.2 Buffer 2 Buffer 2 is een 30% glycerolbevattende fosfaatbuffer met kaliumchloride bij pH 7,25. Deze buffer wordt gebruikt om de finale suspensie van microsomen te bereiden. Glycerol is een cryoprotectant: het beschermt de microsomen tegen beschadiging tijdens invriezen. Glycerol heeft geen invloed op de pH. Deze buffer wordt gekozen omdat de activiteit van de enzymen behouden wordt bij lang bewaren (Onbekend, 2009). 3.1.2.1 Materialen Dezelfde materialen worden gebruikt als bij buffer 1, daarnaast wordt ook glycerol (C3H5(OH)3) aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België.
21
3.1.2.2 Methode Buffer 2 wordt bereid door aan een hoeveelheid buffer 1 30% glycerol toe te voegen.
3.1.3 Buffer 3 Buffer 3 is een fosfaatbuffer met de dihydraatvorm van het natriumzout van ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) bij pH 7,4. EDTA is een antioxidans: het complexeert metaalionen. Deze buffer is nodig voor de CYP450-bepaling volgens Omura en Matsubara. 3.1.3.1 Materialen Dezelfde materialen (behalve kaliumchloride) worden gebruikt als bij buffer 1, daarnaast
wordt
ook
ethyleendiaminetetraacetaat
dinatriumzout
dihydraat
(C10H14N2Na2O8.2H2O) aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België. 3.1.3.2 Methode Buffer 3 wordt bereid uit de volgende twee componenten: 1) 0,5 M K2HPO4 (MG = 174,18) met 10 mM EDTA (MG = 372,24) 2) 0,5 M KH2PO4 (MG = 136,09) met 10 mM EDTA (MG = 372,24) Component 2 wordt geleidelijk bij component 1 toegevoegd tot een pH van 7,4 bereikt wordt.
3.1.4 Buffer 4 Buffer 4 is een fosfaatbuffer bij pH 7,4. Deze buffer wordt gebruikt om de incubatie uit te voeren bij de kwalitatieve controle van de microsomen. 3.1.4.1 Materialen Dezelfde materialen (behalve kaliumchloride) worden gebruikt als bij buffer 1. 3.1.4.2 Methode Buffer 4 wordt bereid uit de volgende twee componenten: 1) 0,2 M K2HPO4 (MG = 174,18) 2) 0,2 M KH2PO4 (MG = 136,09) Component 2 wordt geleidelijk bij component 1 toegevoegd tot een pH van 7,4 bereikt wordt.
22
3.2
BEREIDING MICROSOMEN
3.2.1 Materialen Om te homogeniseren worden een Potter-elvehjem systeem met teflon pestle (VWR®, Leuven, België), bevestigd op een automatische roerder (Heidolph, Duitsland), en een Ultraturrax T8 (Ika Works, Duitsland) gebruikt. Om te centrifugeren wordt een Beckman ultracentrifuge L8-70M (Beckman, USA) gebruikt.
3.2.2 Methode
FIGUUR 3.1: ALGEMENE PROCEDURE BEREIDING MICROSOMEN.
1) Homogenisatie. o Ontdooi het leverstaal op ijs. Elke stap gebeurt op ijs! Ook de rotor van de centrifuge en de centrifugebuisjes moeten reeds de dag op voorhand in de koelkast (4°C) staan. o Was het staal met buffer 1, dit tot de buffer niet meer rood kleurt. o Dep het staal droog met een kompres. o Weeg het staal. o Snij het staal in kleine stukjes met een schaartje en een scalpel. o Breng het staal over in het Potter-elvehjem systeem. o Voeg hieraan 5 ml (dispensor) buffer 1 toe.
23
o Spoel het petrischaaltje en de pincet na met 5 ml buffer en voeg dit ook toe aan het Potter-elvehjem systeem. o Homogeniseer: 7x op en neer (stand 5). o Veeg de pestle af om de gal te verwijderen. o Homogeniseer: 7x op en neer (stand 5) en giet alles over in een centrifugebuisje. o Homogeniseer met de Ultra-turrax en giet alles opnieuw in het Potter-elvehjem systeem. o Homogeniseer: 7x op en neer (stand 5) en giet alles over in hetzelfde centrifugebuisje. o Spoel het Potter-elvehjem systeem 2 keer na met 5 ml buffer 1 en voeg dit ook toe aan het centrifugebuisje (totale hoeveelheid buffer 1=20 ml, de hoeveelheid is niet van belang maar voeg maximum 20 ml toe anders loopt het centrifugebuisje over). o Indien het nog niet homogeen genoeg is: alles nogmaals homogeniseren met de Ultra-turrax en het Potter-elvehjem systeem (bij menselijke stalen is dit meestal nodig). o Sluit het centrifugebuisje af en zwenk het een aantal keer om. Neem hieruit 150 µl, breng het in een cupje en plaats het in de koelkast (Matsubara).
2) Differentiële centrifugatie. o Een centrifugebuisje met water tegenwegen en tegenover het staal zetten in de rotor van de centrifuge. o Centrifugeer bij 4°C, 20 min bij 10 500 r.p.m. o Breng met een pasteurpipetje het supernatans over in een nieuw centrifugebuisje. o Een centrifugebuisje met water tegenwegen en tegenover het staal zetten in de rotor van de centrifuge. o Centrifugeer bij 4°C, 1u 15min bij 33 000 r.p.m. o Verwijder het supernatans met een pasteurpipet. o Voeg 5 ml buffer 1 toe aan de pellet en maak los met een roerstaaf. o Homogeniseer op dezelfde manier als bij stap 1 (homogenisatie), maar gebruik enkel het Potter-elvehjem systeem. Voeg opnieuw maximum 20 ml buffer 1 toe. 24
o Een centrifugebuisje met water tegenwegen en tegenover het staal zetten in de rotor van de centrifuge. o Centrifugeer bij 4°C, 1u 15min bij 33 000 r.p.m. o Verwijder het supernatans met een pasteurpipet. o Voeg buffer 2 toe aan de pellet, nl. ongeveer 3 ml per gram lever. Voeg niet alles in één keer toe maar hou wat over om na te spoelen. Maak de pellet los met een roerstaaf. o Homogeniseer op dezelfde manier als bij stap 1 (homogenisatie), maar gebruik enkel het Potter-elvehjem systeem. o Sluit het centrifugebuisje en zwenk het om zodanig dat een homogene suspensie bekomen wordt. Neem hieruit 250 µl, breng het in een cupje en plaats het in de koelkast (Bradford en Matsubara). o Breng vervolgens de bekomen suspensie per 0,5 ml over in cryovials. o Breng deze cryovials in vloeibare stikstof om ze onmiddellijk in te vriezen. o Bewaar de cryovials bij -80°C. De microsomen zijn tot 5 jaar lang stabiel bij -80°C (Yamazaki et al., 1997). 3.3
PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY
3.3.1 Materialen Om de proteïnebepaling uit te voeren wordt een Modified Lowry Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, USA) en een VV3 vortex (VWR®, Leuven, België) gebruikt. Een Ultrospec 2000 spectrofotometer (Pharmacia Biotech, Cambridge, UK) wordt gebruikt om de absorbantie te meten.
3.3.2 Methode De handleiding voor de proteïnebepaling volgens Lowry wordt meegeleverd met de kit (zie bijlage 1). 3.4
PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD
3.4.1 Materialen Om de proteïnebepaling uit te voeren wordt een Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, USA) gebruikt en een Ultrospec 2000 spectrofotometer (Pharmacia Biotech, Cambridge, UK) wordt gebruikt om de absorbantie te meten. 25
3.4.2 Methode De handleiding voor de proteïnebepaling volgens Bradford wordt meegeleverd met de kit (zie bijlage 2). 3.5
CYP450-BEPALING VOLGENS OMURA
3.5.1 Materialen Natriumthiosulfaat (Na2S2O4) wordt aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België.
De
verdunning
wordt
gemaakt
met
Millipore
water
(Brussel,
België).
Koolstofmonoxide (CO) wordt door het laboratorium voor Toxicologie verschaft (cilindergas, Air Liquide, Luik, België). Een Ultrospec 2000 spectrofotometer (Pharmacia Biotech, Cambridge, UK) wordt gebruikt om een spectrum op te nemen. SWIFT II Wavescan wordt daarbij als software gebruikt.
3.5.2 Methode (Schenkman & Jansson, 1998) o Ontdooi een cryovial met microsomale suspensie op ijs. o Maak volgende verdunning in een proefbuisje van 5 ml:
TABEL 3.1: VERDUNNING BIJ DE METHODE VAN OMURA. water buffer 3 onverdunde microsomen
0,875 0,250 0,125
ml ml ml
totaal volume verdunningsfactor
1,250 10
ml
o Voeg een spatelpunt Na2S2O4 toe aan het proefbuisje en laat het proefbuisje 5 minuten staan. o Breng de helft van de inhoud van het proefbuisje in een cuvet (referentie) en laat de rest in het proefbuisje. o Laat 1 min CO borrelen door het proefbuisje, de snelheid daarbij is 1 à 2 bubbels per seconde. Breng daarna de vloeistof in een tweede cuvet (sample). o Neem een spectrum op tussen 400 en 500 nm en bepaal het ‘difference’ spectrum tussen referentie en sample. o Bepaal het verschil tussen ∆A450 en ∆A490.
26
o Bereken de concentratie aan CYP450-enzymen met behulp van de wet van Lambert-Beer (zie vergelijking 1). In dit geval wordt de wet van Lambert-Beer herschreven tot (zie vergelijking 4):
c=(A(450-490)*f*1000)/91 waarin:
(vergelijking 4)
c: CYP450-concentratie (nmol/ml) A(450-490): extinctieverschil tussen 450 nm en 490 nm f: verdunningsfactor 91: extinctiecoëfficient (mM-1.cm-1)
3.6
CYP450-BEPALING VOLGENS MATSUBARA
3.6.1 Materialen Zie 3.5 CYP450-bepaling volgens Omura.
3.6.2 Methode (Matsubara et al., 1976) o Ontdooi een cryovial met microsomale suspensie op ijs. o Maak dezelfde verdunning als bij de CYP450-bepaling volgens Omura (zie Tabel 3.1). o Laat 1 minuut CO borrelen door het proefbuisje, de snelheid daarbij is 1 à 2 bubbels per seconde. o Breng de helft van de inhoud van het proefbuisje in een cuvet (referentie) en laat de rest in het proefbuisje. o Voeg een spatelpunt Na2S2O4 toe aan het proefbuisje en hou het gesloten zodanig dat het CO niet ontsnapt. o Breng de vloeistof na 5 minuten in een tweede cuvet (sample). o Neem een spectrum op tussen 400 en 500 nm en bepaal het ‘difference’ spectrum tussen referentie en sample. o Bepaal het verschil tussen ∆A450 en ∆A490. o Bereken de concentratie aan CYP450-enzymen met behulp van de wet van Lambert-Beer. De formule is analoog als bij de methode van Omura (zie vergelijking 4) maar de extinctiecoëfficient is nu 104 mM-1.cm-1 in plaats van 91 mM-1.cm-1.
27
3.7
CONTROLE MICROSOMEN EN KARAKTERISATIEMETHODEN
3.7.1 Kwalitatieve controle microsomen 3.7.1.1 Materialen o Buffer 4 (zie 3.1.4). o Kaliumchloride (KCl), aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België. o Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (C21H26N7Na4O17P3, NADPH.4Na), aangekocht bij AppliChem, Darmstadt, Duitsland. o Midazolam (C18H13CIFN3), gedoneerd door Roche, Brussel, Belgïe. o Dextromethorphan (C18H25NO.HBr.H2O), aangekocht bij Sigma-Aldrich, Bornem, België. o Acetonitrile (CH3CN), aangekocht bij Biosolve, Valkenswaard, Nederland. o Millipore-water, Brussel, België.
Verder wordt een Multi Blok Heater (Lab-Line Instruments, Melrose Park, Illinois, USA) in combinatie met een schudtoestel, VXR basic IKA-VIBRAX (IKA®, Staufen, Duitsland), gebruikt tijdens de incubatie. Om de cupjes te centrifugeren wordt een Sigma 2-16 K centrifuge (Sartorius, Vilvoorde, België) gebruikt.
Om de scheiding en detectie van 1-hydroxymidazolam en dextrorphan uit te voeren wordt een LC-MS/MS methode gebruikt (Kim et al., 2005). De volgende toestellen en materialen worden hierbij gebruikt: o HPLC Autosampler 460, Kontron Instruments Ltd., Bletchley, UK. o Phenomenex Luna C18(2) kolom (50 mm x 2 mm, partikelgrootte: 3 µm), Utrecht, Nederland. o Phenomenex Security Guard C18 (4 mm x 200 mm), Utrecht, Nederland. o Acetonitrile UPLC (CH3CN), aangekocht bij Biosolve, Valkenswaard, Nederland. o Mierenzuur UPLC (HCOOH), aangekocht bij VWR® BDH Prolabo®, Leuven, België. o VG Quattro II, Micromass® Waters, Manchester, UK. o Masslynx 4.0 software, Micromass® Waters, Manchester, UK. o Millipore-water, Brussel, België.
28
3.7.1.2 Methode 1) Voorbereiding: bereiding van de oplossingen. o Buffer 4. o 1,15 % KCl (MG = 74,55). o 5 mM NADPH.4Na (MG = 83,35). o 25 µM midazolam (MG = 325,78). o 50 µM dextromethorphan (MG = 370,32). o Verdun de microsomale suspensie tot een proteïneconcentratie van 1,25 mg/ml.
2) Pre-incubatie. o Breng 50 µl van de midazolam oplossing of de dextromethorphan oplossing, de fosfaatbuffer en de KCl oplossing in een cupje. o Plaats ze in een schudtoestel bij 37°C tot alles op temperatuur is. o Voeg 50 µl van de NADPH.4Na oplossing toe, vortex en plaats exact 3 minuten op het schudtoestel bij 37°C.
3) Incubatie. o Start de reactie door 50 µl verdunde microsomen toe te voegen en laat de reactie exact 15 minuten doorgaan in het schudtoestel bij 37°C. o Stop de reactie door 100 µl koude acetonitrile toe te voegen. Vortex en plaats de cupjes op ijs. o Centrifugeer de cupjes 10 minuten bij 20000g (4°C) en breng het supernatans over in een auto-injector vial.
Voor de scheiding van de metabolieten en de detectie wordt gebruik gemaakt van een LC-MS/MS methode (Kim et al., 2005). Er wordt 20 µl supernatans op de kolom geïnjecteerd. De scheiding wordt uitgevoerd met gradiëntelutie bij een debiet van 200 µl/min. Eluens A bestaat uit water en 0,1% mierenzuur (zwak eluens). Eluens B bestaat uit acetonitrile en 0,1% mierenzuur (sterk eluens). De gebruikte gradiënt wordt weergegeven in Figuur 3.2.
29
percentage eluens B (%)
100 80 60 40 20 0 0
5
10
15
tijd (min) FIGUUR 3.2: GRADIËNT.
De vloeistof die van de kolom elueert wordt geleid naar de massaspectrometer waar de metabolieten, 1-hydroxymidazolam en dextrorphan, geïoniseerd worden met behulp van ‘electrospray’ ionisatie (ESI) in de positieve modus. Er wordt gebruik gemaakt van ‘multiple reaction monitoring’ (MRM). De m/z-waarden van de geanalyseerde precursor- en productionen en de instellingen van de massaspectrometer zijn weergegeven in Tabel 3.2.
TABEL 3.2: INSTELLINGEN MASSASPECTROMETER, 1 = 1-HYDROXYMIDAZOLAM, 2 = DEXTRORPHAN. m/z precursorion 1 342,20 2
258,29
m/z productionen 203,00 324,00 157,00 133,10
botsingsenergie (eV) 20 25
capillair (kV) T (°C) cone (V) 4 110 25 4
110
25
3.7.2 Controle karakterisatiemethoden 3.7.2.1 Materialen Commerciële rattenmicrosomen worden aangekocht bij BD Biosciences Discovery Labware, Woburn, Massachusetts, USA. 3.7.2.2 Methode o De methode van Bradford wordt uitgevoerd op de microsomen (zie 3.4). o De methode van Matsubara wordt uitgevoerd op de microsomen (zie 3.6). o Vervolgens wordt nagegaan of de bekomen totale proteïneconcentratie en het bekomen
CYP450-gehalte
overeenstemmen
met
de
meegeleverde
karakteristieken van de rattenmicrosomen (weergegeven in Tabel 3.3).
30
TABEL 3.3: GEGEVENS COMMERCIËLE RATTENMICROSOMEN. Catalogus nummer Lot nummer Inhoud Proteïneconcentratie Totaal CYP450-gehalte
452511 6176 0,5 ml 20 mg/ml in 250 mM sucrose 740 pmol/mg proteïne
31
4 4.1
RESULTATEN EN DISCUSSIE BEREIDING MICROSOMEN De bereiding van de microsomen is gebaseerd op de methode die gebruikt wordt aan de
University of Sheffield (UK) en in Janssen Farmaceutica te Beerse (België). Om de methode op punt te stellen wordt eerst geëxperimenteerd met ratten- en muizenlevers. De microsomen kunnen tot 5 jaar bij -80°C bewaard worden, met zeer weinig tot geen verlies aan CYP450activiteit (Yamazaki et al., 1997).
Door een fysiologisch zoutoplossing (natriumchloride oplossing) via de portale vene door de geëxplanteerde lever te laten circuleren, kan een microsomale suspensie vrij van hemoglobine bekomen worden (Onbekend, 2009). In dit onderzoek gebeurt dit echter niet, waardoor contaminatie met hemoglobine onvermijdelijk is. Om toch zoveel mogelijk hemoglobine te verwijderen is het belangrijk om het leverstaal na ontdooien zo goed mogelijk te wassen met buffer 1. Kaliumchloride helpt bij de verwijdering van hemoglobine (Onbekend, 2009).
Om de leverstalen te homogeniseren wordt het best gebruik gemaakt van zowel een Ultra-turrax als een Potter-elvehjem systeem. Na het snijden van het staal in kleine stukjes met een scalpel en een schaartje, wordt alles overgebracht in het Potter-elvehjem systeem. Na een eerste keer homogeniseren met het Potter-elvehjem systeem is het belangrijk om de gal te verwijderen van de pestle, alvorens een tweede keer te homogeniseren. De gal treedt op als glijmiddel tussen de pestle en de glazen buis van het Potter-elvehjem systeem, waardoor de efficiëntie waarmee het Potter-elvehjem systeem homogeniseert vermindert. Vervolgens kan de massa eventueel verder gehomogeniseerd worden met de Ultra-turrax en nog een derde keer met het Potter-elvehjem systeem. Wanneer eerst gehomogeniseerd wordt met de Ultraturrax treedt er verlies op van het staal doordat grote stukken staal blijven kleven aan de Ultra-turrax. De stukjes die na homogeniseren met het Potter-elvehjem systeem blijven kleven aan de Ultra-turrax zijn voornamelijk vetweefsel en galwegen. In deze weefsels zijn geen CYP450-enzymen aanwezig, en er is bijgevolg geen verlies aan activiteit als deze stukjes achterblijven.
32
Het is uiterst belangrijk dat elke stap in het proces op ijs gebeurt. Indien het staal bij een hogere temperatuur behandeld zou worden, bestaat de kans dat de CYP450-enzymen niet meer actief zullen zijn. Wanneer het staal gehomogeniseerd wordt met behulp van de Ultraturrax of het Potter-elvehjem systeem moet zéker in ijs gewerkt worden: door de wrijving komt warmte vrij, waardoor de proteïnen kunnen denatureren en bijgevolg de activiteit van de CYP450-enzymen verloren gaat. Zowel het centrifugebuisje als het Potter-elvehjem systeem moeten daarom in een beker met ijs geplaatst worden, om samen op en neer bewogen te worden bij het homogeniseren.
Na de eerste keer centrifugeren bij 10000g wordt verder gewerkt met het supernatans. In het supernatans zijn de microsomen en tal van oplosbare en membraangebonden enzymen aanwezig. De pellet bevat de mitochondria, de kernen en celafval en mag bijgevolg weggegooid worden (Onbekend, 2009). Na een tweede centrifugatie bij 100000g wordt een pellet bekomen waarin de microsomen aanwezig zijn. De pellet wordt gehersuspendeerd in buffer 1 en nog eens aan centrifugatie bij 100000g onderworpen als wasstap (om zo veel mogelijk van de overgebleven hemoglobine te verwijderen). De volgende pellet die bekomen wordt, moet gehersuspendeerd worden in buffer 2. De bekomen microsomale suspensie kan ingevroren worden met behulp van vloeibare stikstof. 4.2
PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY Vooraleer het proteïnegehalte kan bepaald worden in de microsomale suspensie moet
een standaardcurve opgesteld worden. De standaardcurve wordt opgesteld met een verdunningsreeks van BSA, waarbij als verdunningsmiddel buffer 2 moet gebruikt worden. De proteïnebepaling volgens Lowry kan echter niet gebruikt worden om het totale proteïnegehalte in de microsomale suspensie te bepalen: de kaliumionen interfereren met de bepaling (Peterson, 1979). Kaliumionen worden getolereerd bij een concentratie van 12 mM. Buffer 2 bevat een hogere concentratie, ook wanneer de microsomale suspensie 1 op 20 verdund wordt, namelijk iets meer dan 37,5 mM. Hierdoor ontstaat een precipitaat dat interfereert met de meting (Peterson, 1979). Glycerol wordt getolereerd bij een concentratie van 100 µl/ml, in buffer 2 is echter 300 µl/ml aanwezig. Wanneer de microsomale suspensie 1 op 20 verdund wordt, is er slecht 15 µl/ml aanwezig. Dus, interferentie door een verhoging van de absorbantie van de blanco en een verlaging van de absorbantie van de standaardreeks is niet mogelijk (Peterson, 1979). De bovengenoemde interferentie met de kaliumionen is
33
bijgevolg reeds een aanwijzing dat de voorkeur uit zal gaan naar de methode van Bradford om het proteïnegehalte in de microsomale suspensie te bepalen.
Wanneer een standaardreeks bereid wordt met buffer 2 en de absorbantie wordt gemeten, is het onmogelijk om stabiele waarden te bekomen, zodanig dat het ook onmogelijk is om een standaardcurve op te stellen. Wanneer een standaardreeks bereid wordt met water kan echter wel een standaardcurve opgesteld worden. Deze is weergegeven in Figuur 4.1. Zonder standaardcurve kunnen er geen proteïnebepalingen uitgevoerd worden, bijgevolg zal de methode van Lowry niet gebruikt worden om de totale proteïneconcentratie in de microsomale suspensie te bepalen. 2,5
absorbantie
2 1,5
y = -8E-07x2 + 0,0025x + 0,0163 R2 = 0,9986
1 0,5 0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
concentratie (µg/ml)
FIGUUR 4.1: STANDAARDCURVE LOWRY MET WATER ALS VERDUNNINGSMIDDEL.
4.3
PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD Net zoals bij de proteïnebepaling volgens Lowry moet eerst een standaardcurve
opgesteld worden. De standaardcurve wordt opgesteld met een verdunningsreeks van BSA, en als verdunningsmiddel moet opnieuw buffer 2 gebruikt worden (Figuur 4.2).
1,6 1,4
absorbantie
1,2 1
y = -3E-07x2 + 0,0013x + 0,0099 2 R = 0,9985
0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
500
1000
1500
2000
2500
concentratie (µg/ml)
FIGUUR 4.2: STANDAARDURVE BRADFORD MET BUFFER 2 ALS VERDUNNINGSMIDDEL.
34
Om de onbekende proteïneconcentratie van de microsomale suspensie te bepalen worden de microsomen eerst twintig maal verdund (Wilson et al., 2003). Daarna wordt de absorbantie, na toevoegen van het Coomassie Brilliant Blue G-250, bepaald en met behulp van de vergelijking van de standaardcurve kan de onbekende concentratie berekend worden. Wanneer geen verdunning wordt gebruikt, wordt een absorbantie bekomen die hoger is dan de bekomen absorbanties in de standaardcurve. Dit wijst erop dat de concentratie hoger is dan het interval van de standaardcurve. De microsomen worden zodanig verdund dat de totale proteïneconcentratie in het desbetreffende interval ligt.
In Tabel 7.3 (zie bijlage 3) worden de gemeten absorbanties, de totale proteïneconcentraties en de variatiecoëfficiënten (VC) per staal weergegeven van negen stalen. Deze stalen zijn afkomstig van dezelfde humane, gezonde lever. ID 2, ID 3, en ID 4 werden op dag 1 verwerkt tot microsomen. ID 5, ID 6, en ID 12 werden op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en ID 19 werden op dag 3 verwerkt. Eerst zal de precisie onder herhaalbaarheidsvoorwaarden van de methode van Bradford worden nagegaan. Elk staal werd onder deze voorwaarden drie maal gemeten (met uitzondering van ID 13). Om te besluiten dat de variabiliteit op de methode van Bradford aanvaardbaar is, mogen de variatiecoëfficiënten niet meer dan 15% bedragen, zoals aanbevolen wordt in ‘Guidance for Industry – Bioanalytical Method Validation’, opgesteld door de FDA. Alle variatiecoëfficiënten zijn kleiner dan 15 %. Er kan bijgevolg besloten worden dat de methode van Bradford herhaalbaar is.
Vervolgens worden de ‘within-day’ en ‘between-day’ variabiliteit van de totale proteïneconcentratie nagegaan door de intermediaire precisie te bepalen. Hiervoor worden in dit experiment stalen afkomstig van dezelfde lever op dezelfde dag en op verschillende dagen verwerkt. Om de ‘within-day’ variabiliteit te bepalen, wordt de variatiecoëfficiënt berekend van de gemiddelde totale proteïneconcentratie op dag 1, dag 2 en dag 3 afzonderlijk. Om de ‘between-day’ variabiliteit te bepalen, wordt de variatiecoëfficiënt berekend van de gemiddelde totale proteïneconcentratie van de 3 dagen. De resultaten zijn samengevat in Tabel 4.1 en Tabel 4.2.
35
TABEL 4.1: TOTALE PROTEÏNECONCENTRATIE VOLGENS BRADFORD VAN GEZOND, HUMAAN LEVERWEEFSEL. staala ID 2 ID 3 ID 4 ID 5 ID 6 ID 12 ID 13 ID 18 ID 19 a
aantal gram lever 3,45 3,68 3,35 3,71 3,76 2,79 3,39 3,96 4,37
[proteïne](mg/ml) 4,15 4,41 4,32 4,30 4,19 4,30 3,25 4,26 3,84
[proteïne](mg/gram lever) 12,03 13,19 12,88 12,76 12,27 12,32 9,59 12,92 11,43
ID 2, ID 3 en ID 4 werden op dag 1 verwerkt. ID 5, ID 6 en ID 12 werden op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en
ID 19 werden op dag 3 verwerkt.
TABEL 4.2: ‘WITHIN-DAY’ VARIABILITEIT EN ‘BETWEEN-DAY’ VARIABILITEIT VAN DE TOTALE PROTEÏNECONCENTRATIE. dag 1 2 3 1+2+3
gemiddelde [proteïne](mg/gram lever) 12,70 12,45 11,31 12,15
variantie 0,3601 0,0714 2,7737 0,5452
standaarddeviatie 0,6001 0,2672 1,6654 0,7384
VC (%) 4,72 2,15 14,72 6,07
Uit de variatiecoëfficiënten kan besloten worden dat de ‘within-day’ variabiliteit op dag 1 (4.72%), dag 2 (2,15%) en dag 3 (14,72%) aanvaardbaar is. De ‘between-day’ variabiliteit is ook aanvaardbaar (6.07%). Dit is een eerste indicatie dat de microsomen op een reproduceerbare manier worden bereid. De gemiddelde totale proteïneconcentratie van dit gezond leverweefsel bedraagt 12,15 mg/gram lever. 4.4
CYP450-BEPALING VOLGENS OMURA De methode van Omura is niet de meest geschikte methode om het CYP450-gehalte te
bepalen. De ratten- en muizenlevers die gebruikt worden om te experimenteren worden niet behandeld met een fysiologische zoutoplossing net na verwijdering, waardoor het moeilijk is om een staal te bekomen dat volledig vrij is van hemoglobine (Onbekend, 2009). Vooral het homogenaat is sterk gecontamineerd met hemoglobine, bij de microsomale suspensie is dit door de extra wasstap in de bereiding minder uitgesproken. Ook bij de humane stalen zal na transplantatie geen fysiologische zoutoplossing gebruikt worden, zodanig dat ook hier contaminatie met hemoglobine onvermijdelijk is. Door deze contaminatie schuift de
36
golflengte van de piek in het difference spectrum op van 450 nm naar 454 nm. Het verschil in absorbantie bij 450 nm en 490 nm daalt hierdoor (Matsubara et al., 1976).
Wanneer het CYP450-gehalte bepaald wordt met behulp van de methode van Omura is het moeilijk om bij eenzelfde verdunning overeenstemmende spectra te bekomen (zie bijvoorbeeld Figuur 4.3, Figuur 4.4 en Figuur 4.5). De bekomen concentraties met behulp van vergelijking 4 zijn ook niet reproduceerbaar en soms worden er zelfs negatieve waarden bekomen (zie Tabel 4.3).
FIGUUR 4.3: SPECTRUM VOLGENS DE METHODE VAN OMURA (OMURA20/04E1).
FIGUUR 4.4: SPECTRUM VOLGENS DE METHODE VAN OMURA (OMURA20/04E2).
FIGUUR 4.5: SPECTRUM VOLGENS DE METHODE VAN OMURA (OMURA20/04E3).
37
TABEL 4.3: CYP450-GEHALTE VOLGENS OMURA VAN EEN GEZONDE RATTENLEVER. staala
A(450nm-490nm)
concentratie (nmol/ml)b
verdunningsfactor
Omura20/04E1 Omura20/04E2 Omura20/04E3 Omura20/04E4 Omura20/04E5 Omura20/04E6
0,005 -0,010 -0,004 -0,006 -0,002 0,000
1,10 -2,20 -0,88 -0,66 -0,22 0,00
20 20 20 10 10 10
a
Deze microsomen zijn allemaal afkomstig van hetzelfde leverstaal (rattenlever 8,01 gram). b
4.5
In de weergegeven concentraties is reeds rekening gehouden met de verdunningsfactor.
CYP450-BEPALING VOLGENS MATSUBARA Om de gebreken van de methode van Omura te omzeilen, wordt de methode van
Matsubara gebruikt om het CYP450-gehalte te bepalen. De interferentie van hemoglobine wordt bij deze methode uitgeschakeld doordat zowel het referentiecuvet als het staalcuvet doorborreld worden met CO. Een voorbeeld van een ‘difference’ spectrum is weergegeven in Figuur 4.6. Het CYP450-gehalte moet bepaald worden in het homogenaat en in de microsomale suspensie om de recovery factor te bepalen. Deze waarde is nodig om de MPPGL te bereken. Het homogenaat en de microsomale suspensie worden tien maal verdund om het CYP450-gehalte te bepalen. Bij de bepalingen op het homogenaat stellen zich op dit moment nog enkele problemen, dus er zijn nog geen gegevens beschikbaar. Er zijn onder andere nog tal van interfererende componenten (zoals bindweefsel) aanwezig in het homogenaat, waardoor een bepaling nog niet mogelijk is (Matsubara et al., 1976). Een eventuele oplossing zou het gebruik van een soort zeef of filter kunnen zijn, zoals ook bij Wilson et al. wordt toegepast (Wilson et al., 2003). De bepaling kan daarentegen wel reeds uitgevoerd worden op de microsomale suspensie.
FIGUUR 4.6: SPECTRUM VOLGENS DE METHODE VAN MATSUBARA (ID18).
38
In Tabel 7.4 (zie bijlage 4) worden de absorbantieverschillen, de CYP450-gehaltes (microsomale suspensie) en de variatiecoëfficiënten per staal weergegeven van dezelfde negen stalen als in Tabel 7.3 (zie bijlage 3). Ook hier zal eerst de precisie onder herhaalbaarheidsvoorwaarden van de methode van Matsubara worden nagegaan. Elk staal werd onder deze voorwaarden drie maal gemeten. Om te besluiten dat de variabiliteit op de methode van Matsubara aanvaardbaar is, mogen de variatiecoëfficiënten opnieuw niet meer dan 15% bedragen, zoals aanbevolen wordt in ‘Guidance for Industry – Bioanalytical Method Validation’, opgesteld door de FDA. De variatiecoëfficiënten liggen per staal meestal beneden de 15 % (behalve bij ID 4 en ID 13 – merk op: bij ID 4 werd een buisje gebroken en het totale proteïnegehalte van ID 13 ligt duidelijk lager dan bij de andere stalen), zodus kan besloten worden dat de methode van Matsubara herhaalbaar is.
Vervolgens worden ook de ‘within-day’ en ‘between-day’ variabiliteit van het CYP450gehalte nagegaan door de intermediaire precisie te bepalen (analoog aan de methode van Bradford). De resultaten zijn weergegeven in Tabel 4.4 en Tabel 4.5.
TABEL 4.4: CYP450-GEHALTE VOLGENS MATSUBARA VAN GEZOND, HUMAAN LEVERWEEFSEL. staala ID 2 ID 3 ID 4 ID 5 ID 6 ID 12 ID 13 ID 18 ID 19 a
[CYP450] (nmol/ml) 1,57 1,70 1,35 1,92 1,38 0,99 1,92 1,63 1,28
[CYP450] (pmol/mg proteïne) 378,38 384,99 311,94 446,99 326,38 231,25 617,68 383,49 333,54
ID 2, ID 3 en ID 4 werden op dag 1 verwerkt. ID 5, ID 6 en ID 12 werden
op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en ID 19 werden op dag 3 verwerkt.
TABEL 4.5: ‘WITHIN-DAY’ VARIABILITEIT EN ‘BETWEEN-DAY’ VARIABILITEIT VAN HET CYP450-GEHALTE. dag 1 2 3 1+2+3
gemiddelde [CYP450] (pmol/mg proteïne) 358,44 334,87 444,90 379,41
39
variantie 1632 11690 23013 11601
standaarddeviatie 40,4034 108,1197 151,7006 107,7081
VC (%) 11,27 32,29 34,10 28,39
Uit de waarden kan besloten worden dat de ‘within-day’ variabiliteit op dag 1 (11,27%) aanvaardbaar is. Op dag 2 (32,29%) en dag 3 (34,10%) is deze echter niet aanvaardbaar. De ‘between-day’ variabiliteit is ook niet aanvaardbaar (28,39%). Alle stalen zijn afkomstig van dezelfde lever, dus in principe zou het CYP450-gehalte in elk staal hetzelfde moeten zijn. Dit is, zoals blijkt uit Tabel 4.4, niet het geval. De totale proteïneconcentraties in elk staal komen echter wel goed overeen (zie Tabel 4.1). Hoe kan het dan zijn dat het CYP450-gehalte in elk staal zo sterk verschilt? De uitvoering van de methode kan niet aan de basis van het probleem liggen, eerder werd reeds aangetoond dat de methode van Matsubara herhaalbaar is (zie bijlage 4). De bereiding van de microsomen werd hoogstwaarschijnlijk op een reproduceerbare manier uitgevoerd want de totale proteïneconcentraties komen overeen. Als dit niet het geval zou zijn dan zouden er bij het ene staal meer proteïnen verloren gaan dan in het ander, en dat zou zich zowel weerspiegelen in de totale proteïneconcentratie als in het CYP450-gehalte en niet - zoals hier het geval - enkel in het CYP450-gehalte.
Een eerste mogelijke oorzaak zou de gevoeligheid van de spectrofotometer kunnen zijn. Een absorbantieverschil van bijvoorbeeld 0,013 geeft een concentratie van 1,25 nmol CYP450 per ml, een absorbantieverschil van 0,017 geeft een concentratie van 1,63 nmol CYP450 per ml. Dit is een groot verschil in CYP450-gehalte, maar een klein verschil in absorbantie (0,004). Zelfs wanneer altijd dezelfde cuvetjes worden gebruikt, kan dit verschil niet uitgesloten worden. Wanneer het gemiddelde wordt genomen van een groot aantal metingen, speelt de variatie op de waarden geen zo’n grote rol meer. Maar dit is in dit onderzoek echter praktisch gezien niet haalbaar omdat er te weinig staal ter beschikking is. Echter, in theorie zou de methode robuust genoeg moeten zijn om dit probleem, zijnde de gevoeligheid van de spectrofotometer, te overwinnen.
Een tweede mogelijke oorzaak zou de locatie in de lever van het genomen staal kunnen zijn. De verschillende stukjes lever zijn afkomstig van verschillende locaties in de lever. Bij ratten werden reeds significante verschillen in het CYP450-gehalte tussen verschillende zones vastgesteld. Bij de mens werden geen significante verschillen aangetoond. Hieromtrent is echter nog maar één studie uitgevoerd, dus verder onderzoek is nodig (Wilson et al., 2003).
40
4.6
CONTROLE MICROSOMEN EN KARAKTERISATIEMETHODEN
4.6.1 Kwalitatieve controle microsomen Om na te gaan of de microsomen adequaat bereid zijn, kan een kwalitatieve controle uitgevoerd worden. Hierbij worden de microsomen geïncubeerd met de selectieve probes midazolam (CYP3A4) en dextromethorphan (CYP2D6). Deze twee componenten werden gekozen omdat hun metabolieten, 1-hydroxymidazolam en dextrorphan, reeds goed kunnen gedetecteerd worden met de huidige methode. Door infusie van standaardoplossingen werden de m/z-waarden van de precursor- en productionen bepaald (zie Tabel 3.2) en door injectie van standaardoplossingen werden de retentietijden bepaald. De retentietijd (tr) van 1hydroxymidazolam bedraagt ongeveer 5,07 min, en deze van dextrorphan bedraagt ongeveer 4,49 min. De methode is echter nog niet gevalideerd zodus kunnen nog geen kwantitatieve bepalingen uitgevoerd worden. Om de incubatie uit te voeren wordt uitgegaan van het protocol dat aan de University of Sheffield (UK) wordt gebruikt.
Een eerste experiment dat wordt uitgevoerd is het incuberen van een blanco. Deze blanco bevat buffer 4, kaliumchloride, NADPH en microsomen. Er worden geen probes toegevoegd, dus er kan geen vorming van metabolieten plaatsvinden. In het resulterende chromatogram zouden dan ook geen pieken mogen waargenomen worden op de geselecteerde m/z-kanalen. Dit blijkt - zoals te zien is in Figuur 4.7 - het geval te zijn en bewijst dat er geen andere interfererende bestanddelen aanwezig zijn.
In het volgende experiment wordt nagegaan of de metabolieten wel degelijk in het supernatans aanwezig zijn na incubatie en centrifugatie. Hierbij wordt het incubatieprotocol gevolgd zonder het toevoegen van een probe. Na het inhiberen van de enzymen door toevoegen van acetonitrile worden de incubaten gespiked met een mengsel van 1hydroxymidazolam en dextrorphan in een concentratie van 140 ng/ml, 350 ng/ml, 700 ng/ml en 1750 ng/ml. Dit geeft respectievelijk een concentratie van 20 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, en 250 ng/ml 1-hydroxymidazolam en dextrorphan in het incubaat. De chromatogrammen van zo’n reeks zijn weergegeven in Figuur 4.8 en Figuur 4.9. Door de aanwezigheid van een piek op de juiste retentietijden kan besloten worden dat de metabolieten in het supernatans aanwezig zijn.
41
IncBl 090506 03 100
2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203 1.46e3
4.92
4.88
5.32 5.28 5.34
4.85 5.19
4.82
5.44
%
0 IncBl 090506 03
1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157 1.80e3
4.47
100
4.49 4.11
4.62 4.67
4.33 4.03
4.68
4.01
4.78
%
0
Time 3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
FIGUUR 4.7: CHROMATOGRAM BLANCO: KANAAL 1-HYDROXYMIDAZOLAM (BOVEN) EN KANAAL DEXTRORPHAN (ONDER). 090511 Spike250 1 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203 1.67e5
5.06
100
%
0 090511 Spike100 1 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203 5.20e4
5.15
100
%
0 090511 Spike50 1 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203 3.64e4
5.04
100
%
0 090511 Spike20 1 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203 8.93e3
5.15
100
%
0
Time 3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
FIGUUR 4.8: CHROMATOGRAM NA SPIKEN MET EEN MENGSEL VAN 1-HYDROXYMIDAZOLAM EN DEXTRORPHAN: KANAAL 1-HYDROXYMIDAZOLAM (VAN BOVEN NAAR ONDER: 250, 100, 50 EN 20 NG/ML).
42
090511 Spike250 1 Sm (Mn, 2x3)
1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157 5.39e5
4.53
100
%
0 090511 Spike100 1 Sm (Mn, 2x3)
1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157 2.85e5
4.43
100
%
0 090511 Spike50 1 Sm (Mn, 2x3)
1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157 1.89e5
4.46
100
%
0 090511 Spike20 1 Sm (Mn, 2x3)
1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157 6.64e4
4.59
100
%
0
Time 3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
FIGUUR 4.9: CHROMATOGRAM NA SPIKEN MET EEN MENGSEL VAN 1-HYDROXYMIDAZOLAM EN DEXTRORPHAN: KANAAL DEXTRORPHAN (VAN BOVEN NAAR ONDER: 250, 100, 50 EN 20 NG/ML).
Daarna wordt bepaald of er wel degelijk metaboliet wordt gevormd in het incubaat wanneer het incubatieprotocol gevolgd wordt. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van commercieel aangekochte rattenmicrosomen, want hiervan is zeker dat de CYP450-enzymen nog actief zijn. De concentratie van de probes tijdens de incubatie moet rond de MichaëlisMenten constante (Km) liggen. Voor midazolam is een finale concentratie van 5 µM vereist en voor dextromethorphan 10 µM. Uit Figuur 4.10 kan besloten worden dat de metabolieten aanwezig zijn en dat het incubatieprotocol bijgevolg geschikt is.
Ten laatste wordt een kwalitatieve controle op de zelfbereide microsomen uitgevoerd. Dezelfde negen stalen als bij de methode van Bradford en Matsubara (zie bijlage 3 en 4) worden nu geïncubeerd met midazolam en dextromethorphan. Bij alle stalen konden de metabolieten gedetecteerd worden. Dit wijst erop dat de zelfbereide microsomen actieve CYP450-enzymen bevatten, wat opnieuw bewijst dat de microsomen op een adequate manier worden bereid. Het chromatogram van ID 18 is weergegeven in Figuur 4.11.
43
090511 Com MDZ2 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203 4.21e4
5.17
100
%
4.81
0 090511 Com DM2 Sm (Mn, 2x3)
1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157 5.33e5
4.46
100
%
0
Time 3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
FIGUUR 4.10: CHROMATOGRAM COMMERCIËLE MICROSOMEN: KANAAL 1HYDROXYMIDAZOLAM (BOVEN) EN KANAAL DEXTRORPHAN (ONDER). 090511 ID18 MDZ3 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 2 Channels ES+ 342.2 > 203 1.03e5
5.09
100
%
0 090511 ID18 DM3 Sm (Mn, 2x3)
1: MRM of 2 Channels ES+ 258.29 > 157 2.49e5
4.58
100
%
0
Time 3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
FIGUUR 4.11: CHROMATOGRAM ID 18: KANAAL 1-HYDROXYMIDAZOLAM (BOVEN) EN DEXTRORPHAN (ONDER).
44
4.6.2 Controle karakterisatiemethoden Bij aankoop van commerciële microsomen zorgt de fabrikant steeds voor een volledige karakterisatie. Zowel de totale proteïneconcentratie als het CYP450-gehalte en de activiteit van verschillende isovormen van de CYP450-enzymen worden bepaald. Om na te gaan of de methode van Bradford en Matsubara nauwkeurig worden uitgevoerd, worden deze methoden toegepast op de volledig gekarakteriseerde commerciële rattenmicrosomen (zie Tabel 3.3).
Eerst wordt nagegaan of de methode van Bradford nauwkeurig wordt uitgevoerd. In Figuur 4.12 wordt de gebruikte standaardcurve weergegeven en in Tabel 4.6 worden de gemeten absorbanties van de commerciële rattenmicrosomen weergegeven. Met behulp van de vergelijking van de standaardcurve kan vervolgens de proteïneconcentratie bepaald worden: deze bedraagt in dit geval 20,19 mg/ml. De meegeleverde waarde is 20 mg/ml. Dit bewijst dat de methode van Bradford op punt staat.
1,6 1,4
absorbantie
1,2 1
y = -3E-07x2 + 0,0013x + 0,0176 R2 = 0,9985
0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
500
1000
1500
2000
2500
concentratie (µg/ml)
FIGUUR 4.12: STANDAARDURVE BRADFORD MET BUFFER 2 ALS VERDUNNINGSMIDDEL.
TABEL 4.6: METINGEN COMMERCIËLE RATTENMICROSOMEN. absorbantie meting 1a
0,137
a
absorbantie meting 2
0,133
a
absorbantie meting 3
0,165
a
absorbantie meting 4
0,148
gemiddelde proteïneconcentratie (mg/ml) a
0,14575 20,1855
De metingen werden uitgevoerd op 200 maal verdunde microsomen en de
absorbantie van de blanco is reeds afgetrokken van de weergegeven absorbanties.
45
Daarna wordt gecontroleerd of methode van Matsubara nauwkeurig wordt uitgevoerd. De microsomale suspensie wordt eerst 5 maal verdund, zodanig dat de suspensie een totale proteïneconcentratie bevat die gelijkaardig is aan wat bekomen wordt met het gebruikte protocol in deze masterproef. De bekomen absorbanties zijn: 0,017; 0,023 en 0,017 (gemiddelde 0,019). Met behulp van de wet van Lambert-Beer wordt een gemiddeld CYP450gehalte van 452,43 pmol/mg proteïne bekomen. De meegeleverde waarde is 740 pmol/mg proteïne. Dit bewijst dus ook dat er nog problemen zijn met de methode van Matsubara. Om de meegeleverde concentratie te bekomen zou een absorbantieverschil van 0,031 waargenomen moeten worden. Hoogstwaarschijnlijk is dit te wijten aan de gevoeligheid van de spectrofotometer, maar dit kan niet met zekerheid gezegd worden. Dit probleem moet nog verder onderzocht worden.
46
5
CONCLUSIES Het doel van deze masterproef was vierledig. 1) microsomen bereiden 2) proteïnebepaling 3) CYP450-bepaling 4) controle van microsomen en karakterisatiemethoden
Het eerste doel van deze masterproef was de ontwikkeling van een protocol voor de bereiding van humane microsomen. Daarbij werd eerst geëxperimenteerd met ratten- en muizenlevers en vervolgens werd ook een stuk gezond, humaan leverweefsel verwerkt. Een aantal belangrijke bevindingen waren onder andere dat elke stap zoveel mogelijk op ijs moet gebeuren zodanig dat de enzymactiviteit behouden blijft. Daarnaast is een goede homogenisatie van het staal van uiterst belang. Menselijke stalen, afkomstig van zieke levers, zijn vaak taai om te verwerken en een goede homogenisatie verloopt daarom moeizamer dan bij rattenlevers.
Om het totale proteïnegehalte te bepalen van microsomen werd gekozen voor de methode van Bradford. De methode van Lowry kan niet gebruikt worden omwille van een te hoge
kaliumconcentratie
in
de
buffer:
deze
kaliumionen
interfereren
met
de
bepalingsmethode. De methode van Bradford is de beste methode omdat er geen interferenties zijn en omdat het de minst arbeidsintensieve methode is. Experimenten hebben aangetoond dat de methode van Bradford op een herhaalbare manier werd uitgevoerd. De ‘within-day’ variabiliteit en ‘between-day’ variabiliteit op de bekomen totale proteïneconcentraties waren aanvaardbaar en bijgevolg kan besloten worden dat de microsomen op een reproduceerbare manier werden bereid.
Doordat het homogenaat en de microsomale suspensie gecontamineerd zijn met hemoglobine, werd geopteerd om de methode van Matsubara te gebruiken om het CYP450gehalte te bepalen. Er werd aangetoond dat de methode van Omura gevoelig is aan deze interferentie. De bepaling van het CYP450-gehalte in het homogenaat lukt nog niet door de aanwezigheid van interfererende bestanddelen. Een eventuele oplossing zou het gebruik van een soort zeef of filter kunnen zijn, zoals ook bij Wilson et al. wordt toegepast (Wilson et al., 2003). De bepaling van het CYP450-gehalte in de microsomale suspensie lukt echter wel al. Experimenten (microsomale suspensie) hebben aangetoond dat de methode van Matsubara op 47
een herhaalbaare manier werd uitgevoerd. De ‘within-day’ variabiliteit en ‘between-day’ variabiliteit op de bekomen CYP450-gehaltes waren echter niet aanvaardbaar. Het is nog niet duidelijk wat hiervan de oorzaak is. Mogelijks is er een probleem met de gevoeligheid van de spectrofotometer, ook de locatie in de lever van het genomen staal zou mogelijks een verklaring kunnen zijn. Wat betreft de gevoeligheid van de spectrofotometer: dit is een probleem dat moeilijk op te lossen is. Eventueel zou een groot aantal metingen kunnen uitgevoerd worden en vervolgens het gemiddelde berekend worden, maar om praktische redenen is dit echter niet haalbaar.
Om een kwalitatieve controle van de microsomen uit te voeren, werd eerst nagegaan of er geen interfererende bestanddelen aanwezig zijn in een blanco incubaat. Daarna werd gecontroleerd of de metabolieten wel effectief in het supernatans van het incubaat aanwezig zijn na centrifugatie. Vervolgens werd het incubatieprotocol getest op commerciële rattenmicrosomen. Na incubatie konden metabolieten gedetecteerd worden, waaruit besloten kon worden dat de gebruikte incubatiemethode geschikt is voor de bepaling van de enzymactiviteit. Ten laatste werd gecontroleerd of de CYP450-enzymen in de zelfbereide microsomen nog actief zijn. Na incubatie en centrifugatie konden de metabolieten in het supernatans gedetecteerd worden, wat bewijst dat de CYP450-enzymen nog actief zijn en dat de microsomen op een adequate manier werden bereid.
Om na te gaan of de methoden van Bradford en Matsubara nauwkeurig werden uitgevoerd,
werden
ze
uitgevoerd
op
volledig
gekarakteriseerde
commerciële
rattenmicrosomen. De bekomen totale proteïneconcentratie was 20,19 mg/ml, terwijl de meegeleverde waarde 20 mg/ml was. Dit bewijst dat de methode van Bradford op een punt staat. Het bekomen CYP450-gehalte was 452,43 pmol/mg proteïne, terwijl de meegeleverde waarde 740 pmol/mg proteïne was. Dit bewijst dat er nog een probleem is met de methode van Matsubara, wat nog verder onderzocht moet worden.
Tot slot, deze masterproef heeft geleid tot een reproduceerbaar en adequaat protocol voor de bereiding van humane microsomen, en er werd besloten dat de methoden van Bradford en Matsubara de beste methoden zijn voor respectievelijk de bepaling van de totale proteïneconcentratie en het CYP450-gehalte. De methode van Bradford staat op punt, maar de methode van Matsubara nog niet. Ook werd besloten dat het gebruikte incubatieprotocol bij de bepaling van de activiteit van de CYP450-enzymen geschikt is. 48
6
LITERATUURLIJST
Barter, Z. E.; Chowdry, J. E.; Harlow, J. R.; Snawder, J. E.; Lipscomb, J. C.; RostamiHodjegan, A. (2008). Covariation of Human Microsomal Protein Per Gram of Liver with Age: Absence of Influence of Operator and Sample Storage May Justify Interlaboratory Data Pooling. Drug Metabolism and Disposition, 36, 2405-2409. Bassett, W. D.; Murray, K. F. (2008). Biliary artesia - Recent progress. Journal of Clinical Gastroenterology, 42, 720-729. Benedetti, M. S.; Baltes, E. L. (2003). Drug metabolism and disposition in children. Fundamental & Clinical Pharmacology, 17, 281-299. Bradford, M. M. (1976). Rapid and Sensitive Method for Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254. Busby, W. F.; Ackermann, J. M.; Crespi, C. L. (1999). Effect of methanol, ethanol, dimethyl sulfoxide, and acetonitrile on in vitro activities of cDNA-expressed human cytochromes P450. Drug Metabolism and Disposition, 27, 246-249. Chauret, N.; Gauthier, A.; Nicoll-Griffith, D. A. (1998). Effect of common organic solvents on in vitro cytochrome P450-mediated metabolic activities in human liver microsomes. Drug Metabolism and Disposition, 26, 1-4. Donato, M. T.; Castell, J. V. (2003). Strategies and molecular probes to investigate the role of cytochrome P450 in drug metabolism - Focus on in vitro studies. Clinical Pharmacokinetics, 42, 153-178. Frye, R. E. (2004). Probing the world of cytochrone P450 enzymes. Molecular Interventions, 4, 157-162. Garfinkel, D. (1958). Studies on Pig Liver Microsomes .1. Enzymic and Pigment Composition of Different Microsomal Fractions. Arch. Biochem. Biophys., 77, 493-509. http://www.azg.nl/azg/nl/professionals/5139/5158/104089/108327 (7 maart) http://www.biomed.metu.edu.tr/courses/term_papers/bioartf-liver_kenar.htm (10 maart) http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=514467 (10 maart)
49
Kim, M. J.; Kim, H.; Cha, I. J.; Park, J. S.; Shon, J. H.; Liu, K. H.; Shin, J. G. (2005). Highthroughput screening of inhibitory potential of nine cytochrome P450 enzymes in vitro using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 19, 2651-2658. Lahoz, A.; Donato, M. T.; Castell, J. V.; Gomez-Lechon, M. J. (2008). Strategies to in vitro assessment of major human CYP enzyme activities by using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Current Drug Metabolism, 9, 12-19. Le Couteur, D. G.; Fraser, R.; Hilmer, S.; Rivory, L. P.; Mclean, A. J. (2005). The hepatic sinusoid in aging and cirrhosis - Effects on hepatic substrate disposition and drug clearance. Clinical Pharmacokinetics, 44, 187-200. Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; Randall, R. J. (1977). Citation Classics - Protein Measurement with Folin Phenol Reagent. Current Contents, 7. Lucarini, A. C.; Kilikian, B. V. (1999). Comparative study of Lowry and Bradford methods: interfering substances. Biotechnology Techniques, 13, 149-154. Manisali, I.; Chen, D. D. Y.; Schneider, B. B. (2006). Electrospray ionization source geometry for mass spectrometry: past, present, and future. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 25, 243-256. Matsubara, T.; Koike, M.; Touchi, A.; Tochino, Y.; Sugeno, K. (1976). QuantitativeDetermination of Cytochrome-P-450 in Rat-Liver Homogenate. Analytical Biochemistry, 75, 596-603. Nestorov, I. (2007). Whole-body physiologically based pharmacokinetic models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 3, 235-249. Omura, T.; Sato, R. (1964). Carbon Monoxide-Binding Pigment of Liver Microsomes .I. Evidence for Its Hemoprotein Nature. Journal of Biological Chemistry, 239, 2370-&. Onbekend (2009). Methods In Drug Metabolism - Analytical Methodology, Onbekend, Onbekend. Perry, S. G.; Amos, R.; Brewer, P. I. (1972). Adsorption Chromatography: Mechanism and Materials. In: Practical Liquid Chromatography.Plenum Press, London, UK, pp. 41-75. 50
Peterson, G. L. (1979). Review of the Foline Phenol Protein Quantitation Method of Lowry, Rosebrough, Farr and Randall. Analytical Biochemistry, 100, 201-220. Rang, H. P.; Dale, M. M.; Ritter, J. M.; Moore, P. K. (2003). Pharmacology, Churchill Livingstone, Edinburgh. Rowland, M.; Tozer, N. T. (1995). Clinical Pharmacokinetics - Concepts and Applications, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, United States of America. Schenkman, J. B.; Jansson, I. (1998). Spectral Analyses of Cytochomes P450. In: Cytochrome P450 Protocols - Methods in Molecular Biology, vol 107, Phillips, I. R.; Shepard, E. A. (Eds.), Humana Press Inc., Totowa, pp. 25-33. Schenkman, J. B.; Jansson, I. (2003). The many roles of cytochrome b5. Pharmacology & Therapeutics, 97, 139-152. Simpson, C. F. (1976). Theoretical Background to HPLC. In: Practical High Performance Liquid Chromatography. London, UK, pp. 1-69. Spada, M.; Riva, S.; Maggiore, G.; Cintorino, D.; Gridelli, B. (2009). Pediatric liver transplantation. World Journal of Gastroenterology, 15, 648-674. Tortora, G. J.; Derrickson, B. (2006). The digestive system. In: Principles of anatomy and physiology. John Wiley and Sons, United States of America. Verbeeck, R. K. (2008). Pharmacokinetics and dosage adjustment in patients with hepatic dysfunction. European Journal of Clinical Pharmacology, 64, 1147-1161. Walsky, R. L.; Obach, R. S. (2004). Validated assays for human cytochrome P450 activities. Drug Metabolism and Disposition, 32, 647-660. Wilson, Z. E.; Rostami-Hodjegan, A.; Burn, J. L.; Tooley, A.; Boyle, J.; Ellis, S. W.; Tucker, G. T. (2003). Inter-individual variability in levels of human microsomal protein and hepatocellularity per gram of liver. British Journal of Clinical Pharmacology, 56, 433-440. Yamazaki, H.; Inoue, K.; Turvy, C. G.; Guengerich, F. P.; Shimada, T. (1997). Effects of freezing, thawing, and storage of human liver samples on the microsomal contents and activities of cytochrome p450 enzymes. Drug Metabolism and Disposition, 25, 168-174.
51
Yuan, R.; Madani, S.; Wei, X. X.; Reynolds, K.; Huang, S. M. (2002). Evaluation of cytochrome P450 probe substrates commonly used by the pharmaceutical industry to study in vitro drug interactions. Drug Metabolism and Disposition, 30, 1311-1319.
52
7 7.1
BIJLAGEN BIJLAGE 1 o Bereid de standaardreeks volgens Tabel 7.1 in een reeks cupjes (hiervoor zijn 2 ampulen BSA nodig). Er moet een standaardcurve opgesteld worden met buffer 2, want de totale proteïneconcentratie wordt in de microsomale suspensie bepaald.
TABEL 7.1: BEREIDING STANDAARDREEKS (BSA) BIJ DE PROTEÏNEBEPALING VOLGENS LOWRY. vial A B C D E F G H I J
volume buffer 2 (µl) 250 625 310 625 625 625 800 800 800 1000
volume BSA (µl) 750 stock 625 stock 310 A 625 B 625 D 625 E 200 F 200 G 200 H 0
BSA concentratie (µg/ml) 1500 1000 750 500 250 125 25 5 1 0
o Bereid het Folin-Ciocalteu reagens door de 2 N oplossing in de kit te verdunnen tot een 1 N oplossing. Bereid zoveel als nodig door één deel water te mengen met één deel Folin-Ciocalteu reagens (2 N). o Breng van elke standaard (x3) en onbekende (x3) 200 µl in een cupje. o Voeg om de 30 seconden aan elk cupje 1 ml gemodificeerd Lowry reagens. Zwenk de cupjes om en laat ze exact 10 min incuberen. o Voeg 100 µl Folin-Ciocalteu reagens (1 N) toe en vortex onmiddellijk. o Laat de cupjes 30 minuten incuberen. o Meet de absorbantie bij 750 nm, zet de spectrofotometer eerst op nul met een cuvetje gevuld met water. o Trek de blancowaarde (J) af van alle absorbanties van de standaarden en zet de bekomen waarden uit in functie van de concentratie. Trek ook de blancowaarde (J) af van de absorbantie van de onbekende. o Bepaal op basis van de bekomen ijklijn de concentratie van de onbekende.
i
7.2
BIJLAGE 2 o Breng een hoeveelheid Coomassie kleurstof na omzwenken in een bekertje voor equilibratie bij kamertemperatuur. o Bereid de standaardreeks volgens Tabel 7.2 in een reeks proefbuisjes (hiervoor is 1 ampule BSA nodig). Er moet een standaardcurve opgesteld worden met buffer 2 want de totale proteïneconcentratie wordt in de microsomale suspensie bepaald.
TABEL 7.2: BEREIDING STANDAARDREEKS (BSA) BIJ DE PROTEÏNEBEPALING VOLGENS BRADFORD. vial A B C D E F G H I
volume buffer 2 (µl) 0 125 325 175 325 325 325 400 400
volume BSA (µl) 300 stock 375 stock 325 stock 175 B 325 C 325 E 325 F 100 G 0
BSA concentratie (µg/ml) 2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0
o Breng van elke standaard (x3) en onbekende (x3) 30 µl in een proefbuisje. o Voeg om de 30 seconden aan elk proefbuisje 1,5 ml Coomassie kleurstof toe, sluit het proefbuisje met een dopje en zwenk het een aantal keer om. o Laat alle proefbuisjes 10 min incuberen. o Meet de absorbantie bij 595 nm, zet de spectrofotometer eerst op nul met een cuvetje gevuld met water. o Trek de blancowaarde (I) af van alle absorbanties van de standaarden en zet de bekomen waarden uit in functie van de concentratie. Trek ook de blancowaarde (I) af van de absorbantie van de onbekende. o Bepaal op basis van de bekomen ijklijn de concentratie van de onbekende.
ii
7.3
BIJLAGE 3
TABEL 7.3: TOTALE PROTEÏNECONCENTRATIE VOLGENS BRADFORD VAN GEZOND, HUMAAN LEVERWEEFSEL. staala ID 2 ID 2 ID 2 gemiddelde ID 3 ID 3 ID 3 gemiddelde ID 4 ID 4 ID 4 gemiddelde ID 5 ID 5 ID 5 gemiddelde ID 6 ID 6 ID 6 gemiddelde ID 12 ID 12 ID 12 gemiddelde ID 13 ID 13 ID 13 ID 13 ID 13 ID 13 gemiddelde ID 18 ID 18 ID 18 gemiddelde ID 19 ID 19 ID 19 gemiddelde a
absorbantie 0,744 0,720 0,747 0,737 0,755 0,754 0,748 0,752 0,756 0,716 0,768 0,747 0,738 0,762 0,755 0,752 0,732 0,762 0,742 0,745 0,750 0,753 0,751 0,751 0,716 0,673 0,704 0,648 0,706 0,689 0,689 0,734 0,759 0,755 0,749 0,707 0,742 0,725 0,725
[proteïne](mg/ml) 4,27 3,86 4,32 4,15 4,46 4,44 4,34 4,41 4,48 3,79 4,68 4,32 4,07 4,48 4,36 4,30 3,97 4,48 4,14 4,19 4,27 4,33 4,29 4,30 3,70 2,98 3,50 2,57 3,53 3,25 3,25 4,00 4,43 4,36 4,26 3,55 4,14 3,85 3,84
[proteïne](mg/g lever) 12,38 11,20 12,52 12,03 13,33 13,27 12,97 13,19 13,36 11,33 13,97 12,88 12,07 13,28 12,93 12,76 11,61 13,10 12,10 12,27 12,25 12,40 12,30 12,32 10,91 8,79 10,31 7,58 10,41 9,58 9,59 12,13 13,42 13,21 12,92 10,55 12,31 11,45 11,43
VC (%)
6,06
1,47
10,75
4,90
6,21
0,61
12,86
5,37
7,69
ID 2, ID 3 en ID 4 werden op dag 1 verwerkt. ID 5, ID 6 en ID 12 werden op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en ID 19 werden op dag 3 verwerkt.
iii
7.4
BIJLAGE 4
TABEL 7.4: CYP450-GEHALTE (MICROSOMALE SUSPENSIE) VOLGENS MATSUBARA VAN GEZOND, HUMAAN LEVERWEEFSEL. staala ID 2
gemiddelde ID 3
gemiddelde ID 4
gemiddelde ID 5
gemiddelde ID 6
gemiddelde ID 12
gemiddelde ID 13
gemiddelde ID 18
gemiddelde ID 19
gemiddelde a
A(450nm-490nm) 0,018 0,015 0,016 0,0163 0,018 0,018 0,017 0,0177 0,017 0,014 0,011 0,0140 0,021 0,020 0,019 0,0200 0,014 0,014 0,015 0,0143 0,009 0,011 0,011 0,0103 0,018 0,024 0,018 0,0200 0,017 0,017 0,017 0,0170 0,013 0,013 0,014 0,0133
[CYP450] (nmol/ml) 1,73 1,44 1,54 1,57 1,73 1,73 1,63 1,70 1,63 1,35 1,06 1,35 2,02 1,92 1,83 1,92 1,35 1,35 1,44 1,38 0,87 1,06 1,06 0,99 1,73 2,31 1,73 1,92 1,63 1,63 1,63 1,63 1,25 1,25 1,35 1,28
[CYP450] (pmol/mg proteïne) 416,99 347,50 370,66 378,38 392,26 392,26 370,46 384,99 378,79 311,94 245,10 311,94 469,34 446,99 424,64 446,99 318,79 318,79 341,56 326,38 201,41 246,17 246,17 231,25 555,91 741,22 555,91 617,68 383,49 383,49 383,49 383,49 325,20 325,20 350,21 333,54
VC (%)
9,35
3,27
21,43
5,00
4,03
11,17
17,32
0,00
4,33
ID 2, ID 3 en ID 4 werden op dag 1 verwerkt. ID 5, ID 6 en ID 12 werden op dag 2 verwerkt. ID 13, ID 18 en ID 19 werden op dag 3 verwerkt.
iv
