UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Biochemische en Microbiële Technologie Laboratorium voor Microbiële Ecologie en Technologie Academiejaar 2012-2013
FLOW CYTOMETRISCHE FINGERPRINTING VOOR DE ANALYSE VAN PROBIOTISCHE STAMMEN
Kathleen Verbrugge Eerste Master Farmaceutische Zorg
Promotoren Prof. Dr. Ir. N. Boon Prof. Dr. Ir. T. Van de Wiele
Commissarissen Prof. Dr. Apr. H. Nelis Prof. Dr. T. Coenye
Auteursrecht “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
31 mei 2013
Promotor Prof. Dr. Ir. N. Boon & Prof. Dr. Ir. T. Van de Wiele
Auteur Kathleen Verbrugge
Samenvatting Flow cytometry is met zijn snelle en nauwkeurige analyses een alternatief voor tijdrovende uitplatings- en moleculaire technieken. Door de combinatie van fluorescente kleuringen met SYBR Green en propidium iodide en flow cytometry kan de viabiliteit van micro-organismen gevisualiseerd worden. Het bestuderen van de viabiliteit is belangrijk om de overleving van probiotica tijdens processing en de maag-darm passage te verbeteren. De staalvoorbereiding en het kleuringsproces van de probiotische stammen Lactobacillus rhamnosus GG en Bifidobacterium longum werden geoptimaliseerd. Bacteriële suspensies kunnen voorafgaand aan de flow cytometrische metingen verdund worden om een nauwkeurig resultaat te krijgen. De gemeten celconcentratie bleef tijdens de meting van B. longum en LGG verdund in gebufferde fosfaatoplossing meer constant dan in fysiologische oplossing. Na toevoegen van de kleurstof resulteerde incubatie gedurende 15 minuten bij 37°C in een maximale fluorescentie intensiteit. In de toekomst kan het kleuringsprotocol nog verder geoptimaliseerd worden: het effect van EDTA op de kleuring van Gram negatieve bacteriën en de invloed van verschillende kleurconcentraties kunnen bepaald worden. De zwakke plek van flow cytometry blijft de subjectieve beoordeling van de verschillende data. Flow cytometrische fingerprinting kan gebruikt worden om verschillende microbiële gemeenschappen aan de hand van een statistische methode objectief met elkaar te vergelijken, te differentiëren en eventueel te classificeren. Om 29 verschillende Lactobacillus stammen, behorend tot vijf clusters, met deze methode te kunnen onderscheiden moest minstens gekend zijn tot welke cluster de stam behoort. Door de grote variabiliteit tussen herhaalde metingen is eerst verder onderzoek naar de stabiliteit en reproduceerbaarheid van het systeem nodig. Verder onderzoek kan in de toekomst uitwijzen of het mogelijk is om onbekende stalen te classificeren met flow cytometrische fingerprinting. Vooraleer kan beslist worden of de snelle techniek een alternatief kan zijn voor de dure en tijdrovende moleculaire technieken die vandaag gebruikt worden, is uitgebreid verder onderzoek dus noodzakelijk.
Dankwoord
Graag wil ik iedereen bedanken die meegeholpen heeft om deze thesis tot een goed eind te brengen. Niet in het allerminst mijn promotors Prof. Dr. N. Boon & Prof. Dr. T. Van de Wiele om mij de kans te geven mijn onderzoeksstage in LabMET uit te voeren.
Verder dank ik Ir. Karen De Roy & Ir. Annelies Geirnaert om mij wegwijs te maken in de wereld van probiotica en flow cytometry. Jullie stonden steeds klaar met tips en trics om deze thesis tot een goed einde te brengen. Ook bedankt voor het corrigeer- en naleeswerk.
Uiteraard gaat mijn dank ook uit naar alle andere mensen van het LabMET team voor de fijne samenwerking. Een speciaal woordje van dank gaat nog naar Jana De Bodt. Dankjewel Jana voor het opgroeien van alle Lactobacillus stammen tijdens mijn gipsperiode!
Deze onderzoeksstage verliep door enkele onvoorziene omstandigheden niet van een leien dakje. Daarom dankjewel aan iedereen voor de extra inspanning om deze thesis toch te doen slagen!!!
Als laatste ook een woordje van dank aan mijn ouders & vriend voor de onvoorwaardelijke steun al 4 jaar lang!
Inhoudsopgave 1
INLEIDING .................................................................................................................. 1 1.1
DARMMICROBIOTA VAN DE MENS ............................................................................. 1
1.1.1
Algemeen .............................................................................................................. 1
1.1.2
Opbouw van de darmmicrobiota vanaf de geboorte ........................................... 2
1.1.3
Belang en functie van de darmmicrobiota ........................................................... 3
1.2
HET STUREN VAN DE DARMMICROBIOTA M.B.V. PROBIOTICA .................................. 4
1.2.1
Algemeen .............................................................................................................. 5
1.2.2
Oorsprong ............................................................................................................. 5
1.2.3
Werking ................................................................................................................. 5
1.2.4
Klinisch gebruik: een overzicht van de belangrijkste toepassingen ..................... 6
1.3
OVERLEVING VAN PROBIOTICA DOORHEEN DE MAAG-DARM PASSAGE ................... 8
1.3.1
Conventionele methoden ..................................................................................... 9
1.3.2
Flow cytometry als alternatieve methoden ........................................................ 10
1.4
1.3.2.1
Fluorescente kleuringen ............................................................................. 12
1.3.2.2
Optimalisatie kleuring en flow cytometrische analyse ............................... 16
PHENOTYPING VAN PROBIOTICA .............................................................................. 16
2
OBJECTIEVEN ........................................................................................................... 19
3
MATERIAAL EN METHODEN ..................................................................................... 21 3.1
GROEI- EN VERDUNNINGSMEDIA .............................................................................. 21
3.2
OPGROEIEN VAN BACTERIËN .................................................................................... 21
3.3
FLOW CYTOMETRY .................................................................................................... 23
3.3.1
Kleuring en meetprotocol ................................................................................... 23
3.3.2
FCM meting ......................................................................................................... 24
3.3.2.1
PBS versus FO .............................................................................................. 24
3.3.2.2
Incubatietijd en –temperatuur ................................................................... 25
3.3.2.3
Fingerprinting .............................................................................................. 26
3.3.3 4
Statistische analyse van flow cytometrische data .............................................. 26
RESULTATEN ............................................................................................................ 28 4.1
LIVE/DEAD-ASSAY: SYBR GR EN SYBR GR+PI ............................................................. 28
4.1.1
Verdunnen van bacteriële suspensies ................................................................ 28
4.1.2
Incubatietijd en –temperatuur ........................................................................... 31
4.2
FLOWCYTOMETRISCHE FINGERPRINTING VAN LACTOBACILLUS STAMMEN ............ 33
4.2.1
Onderscheid tussen Lactobacillus clusters ......................................................... 35
4.2.2
Onderscheid tussen stammen binnen groep ...................................................... 36
4.2.2.1 4.2.3
Onderscheid tussen de verschillende stammen binnen een cluster .................. 37
4.2.3.1
L. rhamnosus cluster ................................................................................... 37
4.2.3.2
L. brevis cluster............................................................................................ 37
4.2.3.3
L. salivarius cluster ...................................................................................... 38
4.2.3.4
L. farciminis cluster ..................................................................................... 38
4.2.3.5
L. acidophilus cluster ................................................................................... 39
4.2.4 5
L. rhamnosus en L. paracasei groep............................................................ 36
Onderscheid tussen alle 29 Lactobacillus stammen ........................................... 39
DISCUSSIE ................................................................................................................ 40 5.1
STAALVOORBEREIDING: PBS VS FO BIJ HET VERDUNNEN VAN BACTERIËLE SUSPENSIES ................................................................................................................ 40
5.2
KLEURINGSPROTOCOL ............................................................................................... 41
5.2.1 5.3
Suggesties............................................................................................................ 42
POST PROCESSING ..................................................................................................... 42
6
CONCLUSIE .............................................................................................................. 45
7
LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 47
Lijst met gebruikte afkortingen
AAD
antibiotica-geassocieerde diarree
AGE
agarose gel elektroforese
CFDA
carboxyfluorescine diacetaat
CU
colitis ulcerosa
DMSO
dimethylsulfoxide
DNA
desoxyribonucleïnezuur
FCM
flow cytometry
FDA
fisher discriminant analyse
FO
fysiologische oplossing
FSC
forward scatter
IBD
inflammatory bowel disease
IECs
intestinale epitheliale cellen
KKVZ
korte keten vetzuren
KVE
kolonievormende eenheden
MRS
Man, Rogosa and Sharpe Agar
nm
nanometer
OD
optische densiteit
ORS
oral rehydratation salts
PB
probability binning
PBS
fosfaatgebufferde zoutoplossing
PCA
principal component analyse
PI
propidium iodide
PMT’s
photomultiplier tubes
RAPD
random amplified polymorphic DNA assay
RCT
randomized clinical trial
SSC
side scatter
SYBR Gr
SYBR Green
VBNC
viable but non culturable
1 1.1
INLEIDING DARMMICROBIOTA VAN DE MENS
1.1.1 Algemeen
Naar schatting leven 10-100 triljoen symbiotisch levende microbiële cellen in het menselijk lichaam. De grootste aantallen micro-organismen, voornamelijk bacteriën, komen voor in het maag-darm kanaal, maar ze koloniseren daarnaast ook de huid en de vagina bij de vrouw (Ursell et al. 2012). Gewoonlijk zijn in de maag en het proximale deel van de dunne darm slechts 10 1-103 bacteriën per mL aanwezig. De overleving van micro-organismen is er immers erg laag omwille van de aanwezigheid van onder meer maagzuur en gal en een snelle transit (O'Hara and Shanahan 2006, Ramakrishna 2007). Helicobacter pylori is de belangrijkste kolonisator van de maag (Ramakrishna 2007). De bacteriële densiteit stijgt in het distale deel van de dunne darm tot 107 kolonievormende eenheden (kve)/mL en is maximaal in het colon waar het aantal bacteriën geschat wordt op 1011-1012 per gram darminhoud (O'Hara and Shanahan 2006).
Figuur 1.1:
De bacteriële gemeenschap aanwezig in de humane gastro-intestinale tractus (O'Hara and Shanahan 2006)
Het duodenum, het jejunum en het proximale deel van het ileum zijn voornamelijk gekoloniseerd door Gram positieve stammen zoals Lactobacillus en Streptococcus. Ook gisten kunnen voorkomen. Gewoonlijk zijn in dit deel van het gastro intestinaal kanaal tot 103 bacteriën/mL aanwezig. In het distale ileum kunnen daarnaast strikt anaerobe bacteriën zoals Clostridium stammen gevonden worden (Ramakrishna 2007).
1
In het colon komen vooral anaerobe bacteriën (90%) voor. Het colon van een individu telt minstens 160 verschillende species en er kunnen wel 400 tot 500 verschillende stammen aanwezig zijn (Ramakrishna 2007, Qin et al. 2010). De complexe samenstelling van de microbiota is het gevolg van een natuurlijk selectiemechanisme waardoor de unieke werking en stabiliteit van dit systeem verzekerd wordt (O'Hara and Shanahan 2006). Het aantal genen aanwezig in de intestinale microbiota is 50 tot 100 maal het aantal in ons eigen genoom, wat nogmaals de immense omvang en potentieel van de microbiota benadrukt (Hart et al. 2002). Toch is het moeilijk om te definiëren wat een normale darmgemeenschap is. Er is immers een zekere verscheidenheid van darmmicrobiota in de populatie. Ook kan de samenstelling van de darmmicrobiota tijdens de levensloop van een individu nog veranderen. Bij het ouder worden neemt de diversiteit van de intestinale microbiota gewoonlijk toe. Daarnaast heeft ook de voeding een invloed (Ramakrishna 2007). Zo wordt bijvoorbeeld bij vegetariërs een andere samenstelling van de darmmicrobiota gezien, waarbij het totaal aantal micro-organismen aanwezig in de intestinale microbiota gelijk blijft (Zimmer et al. 2012). Studies worden vaak uitgevoerd in een bepaalde populatie, waarbij extrapolatie naar gezonde personen wereldwijd niet steeds van toepassing is. Ook worden frequent fecale stalen gebruikt bij het bestuderen van de normale microbiota. De fecale samenstelling is vaak niet representatief voor de samenstelling van de microbiële gemeenschap in het darmlumen. Ten slotte kan het verkeerd bewaren of vervoeren van fecale stalen een verandering in samenstelling als gevolg hebben (Hart et al. 2002).
1.1.2 Opbouw van de darmmicrobiota vanaf de geboorte
Tijdens de ontwikkeling in de baarmoeder is de darm van een foetus steriel. De microbiota in het colon van de mens wordt pas vanaf de geboorte opgebouwd. De samenstelling is afhankelijk van een groot aantal factoren waaronder de geboorte (natuurlijk of via keizersnede), leefomgeving van de baby (ook hygiëne), dieet (borst- of flessenvoeding), de darmmicrobiota van de moeder en ook genetische factoren kunnen een rol spelen (Kaur et al. 2002). 2
Al snel na de geboorte koloniseren facultatieve anaerobe bacteriën, zoals Streptococcus, Enterobacteriaceae en Staphylococcus de gastro-intestinale tractus (Ramakrishna 2007). Initieel zijn weinig anaerobe stammen in de darm aanwezig, daar een hoge oxidatie-reductiepotentiaal de groei van anaeroben remt. Naarmate er door aerobe bacteriën meer zuurstof verbruikt wordt en de oxidatie-reductiepotentiaal daalt, kan een meer anaerobe en diverse intestinale gemeenschap gecreëerd worden (Orrhage and Nord 1999). Zo neemt vanaf de eerste levensweek het aantal Bifidobacterium gestaag toe, vooral bij baby’s die borstvoeding krijgen. Over het algemeen zijn bij deze baby’s ook meer bacteriën in de darm aanwezig dan bij baby’s gevoed met flessenmelk (Ramakrishna 2007). Na de eerste levensweek, maar tijdens de periode waarin enkel borstvoeding of flessenvoeding gegeven wordt, zijn Enterobacteriaceae en Enterococcus nog steeds prominent aanwezig. Toch wordt de bovenhand genomen door Bifidobacterium spp. Ook het aantal Bacteroides en Lactobacillus nemen toe, maar veel trager. Wanneer overgeschakeld wordt op vaste voeding, wordt een toename gezien van Enterococcus en Bacteroides (Orrhage and Nord 1999). Op tweejarige leeftijd bestaat de darmmicrobiota van een kind uit een 150-tal bacterie species en is die vergelijkbaar met de intestinale biota van een volwassene (Ramakrishna 2007, Qin et al. 2010).
1.1.3 Belang en functie van de darmmicrobiota
Een gezonde intestinale microbiële gemeenschap oefent een metabolische, structurele en protectieve werking uit (O'Hara and Shanahan 2006). Indien gegeven is dat een enkel organisme zoals E. Coli een enorme metabolische capaciteit heeft, spreekt het voor zich dat de metabolische capaciteit van de volledige intestinale microbiële gemeenschap immens is (Hart et al. 2002). De belangrijkste metabolische activiteit van de darmmicrobiota is om niet-geabsorbeerde koolhydraten die in het colon terechtkomen te fermenteren tot korte keten vetzuren (KKVZ) (Ramakrishna 2007). Deze KKVZ worden geabsorbeerd en zorgen zo mede voor energie voor de gastheer, maar anderzijds kunnen KKVZ ook dienen als energiebron voor de andere darmbacteriën (O'Hara and Shanahan 2006). Daarnaast bevorderen de gevormde KKVZ de absorptie van natrium en chloride en 3
zorgen ze voor een betere proliferatie, differentiatie en herstel van darmepitheelcellen (Ramakrishna 2007). Bacteriën staan ook in voor de synthese van bepaald essentiële stoffen, zoals vitamine K (Resta 2009). Een andere rol van de darmmicrobiota is zijn protectieve werking en het behoud van de integriteit van de darmwand (Orrhage and Nord 1999). Door interactie van mucosale bacteriën met intestinale epitheliale cellen (IECs) kunnen de immuunrespons en inflammatieprocessen in de darm gereguleerd worden (Ramakrishna 2007). Dit doen IECs door immunologische moleculen (bijvoorbeeld IgA) te produceren die instaan voor de homeostase van de darmmicrobiota. Daarnaast vormen IECs een fysieke barrière voor de invasie van pathogenen en secreteren ze antimicrobiële peptides en mucine (BermudezBrito et al. 2012, Goto and Kiyono 2012). Uiteraard zijn de beschikbaarheid van voedingsstoffen en de leefomgeving belangrijke factoren die de samenstelling van de darmmicrobiota mee helpen bepalen (He et al. 2010). De intestinale biota zou ook de groei van schadelijke bacteriën remmen, door bijvoorbeeld competitie met potentiële pathogenen voor nutriënten en receptoren en de productie van antimicrobiële stoffen (O'Hara and Shanahan 2006).
1.2
HET STUREN VAN DE DARMMICROBIOTA M.B.V. PROBIOTICA
Bij een verstoring van de biologische processen die instaan voor homeostase van IECs kunnen zich bepaalde ziektebeelden ontwikkelen, bijvoorbeeld inflammatoire darmziekten. De oorzaak van die verstoring kan van genetische aard zijn, maar ook omgevingsfactoren kunnen een rol spelen (Goto and Kiyono 2012). Bij de onderbreking van de intestinale barrière kunnen bacteriën en voedselantigenen de submucosa bereiken en zo inflammatie induceren (Bermudez-Brito et al. 2012). Om deze verstoring van de darmmicrobiota op te vangen of te voorkomen kan de inname van probiotica aanbevolen zijn. Dit is het geval voor patiënten met chronische of acute darmproblemen. Probiotica kunnen daarnaast ook toegepast worden bij nosocomiale infecties of allergieën. Ook oudere personen, van wie de darmmicrobiota gewijzigd is, kunnen baat hebben bij de inname van probiotica (Fooks and Gibson 2002).
4
1.2.1 Algemeen
Volgens de WHO zijn probiotica levende micro-organismen die indien in voldoende hoeveelheid ingenomen, gunstige gezondheidseffecten voor de gastheer als gevolg hebben (Bermudez-Brito et al. 2012). Deze micro-organismen kunnen de darm koloniseren en zijn bestand tegen chemische (maagzuur en galzouten) en fysische (temperatuur en druk) invloeden (Zuccotti et al. 2008). De geschikte dosis (zowel dosering als doseringsschema) is nog steeds voer voor discussie, maar zou echter wel belangrijk zijn om voldoende effectiviteit te bereiken. In de literatuur varieert de aanbevolen dosering voor orale toediening van 1 x 10 9 tot 1 x 1010 KVE per dosis en het doseerschema van 2 maal daags tot een maal wekelijks. Een dagelijkse inname van 109 levende cellen zou volstaan voor volwassenen (Zuccotti et al. 2008). Probiotica worden over het algemeen als ‘veilig’ aanzien, toch is bijvoorbeeld een fungemie of bacteremie mogelijk. Deze bijwerkingen zijn echter zeldzaam en komen eerder voor bij patiënten met ernstige comorbiditeiten (Oudhuis et al. 2011). Alert blijven voor ongewenste bijwerkingen is echter raadzaam.
1.2.2 Oorsprong
Probiotica kunnen geïsoleerd worden uit gefermenteerd voedsel, moedermelk of de darmmicrobiota zelf. Lactobacillus species komen het vaakst voor in gefermenteerd voedsel, maar ook Bifidobacterium species kunnen teruggevonden worden. In moedermelk zijn de melkzuurproducerende bacteriën Bifidobacterium en Lactobacillus aanwezig, alsook Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus en Enterococcus. Probiotica kunnen daarnaast ook uit de intestinale biota geïsoleerd worden. Niet enkel de darmmicrobiota van de mens is daarvoor geschikt, maar ook die van de rat, het varken en pluimvee (Fontana et al. 2013). Andere geschikte probiotische micro-organismen zijn bijvoorbeeld gisten zoals Saccharomyces boulardii (Kaur et al. 2002).
1.2.3 Werking
5
Het gunstig effect van probiotica voor de gastheer is onder meer het gevolg van competitie met pathogenen voor nutriënten en adhesie aan epitheliale cellen, de productie van antimicrobiële metabolieten zoals ammoniak (NH3) en vrije vetzuren, verandering van het intestinale leefmilieu en stimuleren van de aangeboren immuniteit van de gastheer (Saad et al. 2013).
Figuur 1.2:
Werkingsmechanismen probiotica (Saad et al. 2013)
Ook het behoud van de darmwand integriteit heeft een positief effect. Dit door de genexpressie van genen betrokken bij ‘tight junction signaling’ te sturen en mucussecretie te bevorderen. Probiotica kunnen beschadigingen van de darmwand herstellen. Daarnaast draagt de regulatie van de immuunrespons – via het inhiberen van de productie van proinflammatoire cytokines – bij tot het gezondheidbevorderend effect (Alvarez-Olmos and Oberhelman 2001, Bermudez-Brito et al. 2012, Saad et al. 2013). Boterzuur-producerende probiotische stammen zorgen voor een versnelde turnover van enterocyten en zijn in staat om de schadelijke invloed van carcinogene stoffen te beperken (Kaur et al. 2002).
1.2.4 Klinisch gebruik: een overzicht van de belangrijkste toepassingen
Een eerste vaak voorkomende toepassing is infectieuze diarree. Deze kent meestal een virale oorsprong en is zeer vaak zelflimiterend. De primaire behandeling bestaat eruit goed te hydrateren met ORS ter preventie van dehydratatie (Wolvers et al. 2010, BCFI folia 6
augustus 2005). Er zijn echter voldoende overtuigende argumenten dat vroege inname van een probioticum, zoals LGG, een meerwaarde voor de behandeling kan zijn. Er bestaat evidentie dat de duur van symptomen, alsook de frequentie van het ongemak verminderd wordt, voornamelijk bij waterige (virale) diarree (Zuccotti et al. 2008, Wolvers et al. 2010). Bij bacteriële, invasieve infecties is echter geen gunstig effect merkbaar (Kaur et al. 2002, Zuccotti et al. 2008). De inname van probiotica kan ook zijn nut hebben bij antibiotica-geassocieerde diarree (AAD). Dit is een vaak voorkomende ongewenste nevenwerking van een antibioticakuur waarbij niet enkel pathogenen, maar ook de nuttige microbiële gemeenschap van het colon wordt aangetast. AAD komt voor bij 5-35% van de patiënten en dit percentage is nog hoger in hospitaalmilieu, waar infecties met Clostridium difficile vaak voorkomen (McFarland 2008, Zuccotti et al. 2008, Saad et al. 2013). AAD is meestal zelflimiterend, toch tonen verschillende studies aan dat voor bepaalde risicogroepen de inname van probiotica tijdens een antibioticakuur het risico op AAD doet afnemen. Voornamelijk S. boulardii lijkt zeer effectief. Ook de inname van LGG vermindert de frequentie en duur van de diarree. Lactobacillus en Bifidobacterium stammen worden gebruikt om de incidentie van AAD ten gevolge van een Clostridium difficile infectie te verminderen (Zuccotti et al. 2008, Saad et al. 2013). Ook patiënten met inflammatoire darmziekten kunnen baat hebben bij de inname van probiotica. ‘Inflammatory bowel disease’ (IBD) is een verzamelnaam voor inflammatoire darmziekten, zoals colitis ulcerosa (CU) en de ziekte van Crohn (CD). Bij analyse van een fecesstaal van IBD patiënten, worden afwijkingen gezien in de samenstelling van de microbiële gemeenschap. CD-patiënten hebben bijvoorbeeld significant meer Enterobacteriaceae en minder Bifidobacterium dan personen zonder darmproblemen (Seksik et al. 2001, Zuccotti et al. 2008). Het lijkt dus dat probiotica nuttig zouden kunnen zijn bij de behandeling van de ziekte. Waarschijnlijk kunnen ze de immuunrespons beïnvloeden door competitie met commensalen en pathogene bacteriën (Butterworth et al. 2008). De behandeling bij CD, alsook bij CU, bestaat uit het induceren van remissie van de ziekte, gevolgd door een onderhoudsbehandeling. De ziekte zelf is niet te genezen, maar er zijn geneesmiddelen, en dus ook probiotica, beschikbaar teneinde de aandoening onder controle te houden (Zuccotti et al. 2008, Saad et al. 2013). 7
In de darmmicrobiota van CU patiënten zijn minder Lactobacillus bacteriën aanwezig. Verschillende soorten probiotica zoals LGG, E. Coli en Bifidobacterium species werden getest op hun effectiviteit. In een studie werd aangetoond dat E. Coli Nissle 1917 effectief is in de onderhoudsbehandeling van colitis ulcerosa (Zuccotti et al. 2008, Saad et al. 2013). Voor de genoemde indicaties zoals infectieuze (reizigers)diarree en AAD zijn er voldoende studies waaruit voor bepaalde probiotica kan besloten worden dat ze uitkomst kunnen bieden (Wolvers et al. 2010). Het positief effect mag niet veralgemeend worden, want het is vaak species- en individu-afhankelijk (Fooks and Gibson 2002). Er kan gesteld worden dat er probiotica zijn die in bepaalde omstandigheden een gunstige invloed hebben bij sommige patiënten (Wolvers et al. 2010). Voor vele indicaties, zoals lactose intolerantie, irritable bowel syndroom, urineweginfecties, kankerpreventie, cardiovasculaire aandoeningen, IBD en allergieën, suggereren de data die op dit moment voorhanden zijn een gunstig effect. De resultaten zijn echter niet steeds consistent en goede RCT’s zijn vrij zeldzaam. Vaak worden onvoldoende personen in de trials geïncludeerd en er is een grote variatie in leeftijd, dosis en hoe lang probiotica toegediend worden. Om een goed onderbouwd besluit te kunnen nemen zijn daarom meer (en betere) welomlijnde studies noodzakelijk (Wolvers et al. 2010, Friedman 2012).
1.3
OVERLEVING VAN PROBIOTICA DOORHEEN DE MAAG-DARM PASSAGE
Om effectief te zijn, moeten probiotica processing, transport, stockage en ook de maag-darm passage in voldoende mate overleven. Probiotica kunnen tijdens processing aan oxidatieve en osmotische stress, extreme temperaturen en verhoogde druk blootgesteld worden. Tijdens de maag-darm passage, komen bacteriën terecht in het zuur milieu van de maag en in het duodenum komen ze in contact met galzouten. Deze stresstoestanden kunnen dodelijk zijn voor micro-organismen. Bacteriën hebben echter een aantal verdedigingsmechanismen waardoor ze hun weerstand tegen dergelijke extreme leefomstandigheden kunnen verhogen (Mills et al. 2011). De bacterie kan enerzijds een verhoogde productie van verschillende enzymen vertonen. Zo kan bijvoorbeeld de synthese van lipasen en proteasen voor het opruimen van 8
beschadigd celmateriaal verhoogd zijn. Ook superoxide dismutase en katalase voor het neutraliseren van reactieve zuurstofdeeltjes kunnen in hogere concentraties voorkomen. Protonpompen en decarboxylasen kunnen pH dalingen (deels) opvangen (Mills et al. 2011). Anderzijds zullen bacteriën blootgesteld aan stress vaak voorkomen in een niet- of toch zeer traag groeiende toestand met lage metabolische activiteit, waardoor ze viable but nonculturable (VBNC) worden. Sommige bacteriën, zoals Bacillus ssp., zullen zelfs endosporen vormen (Matin 1992). Bij gunstigere condities zoals in het colon, kunnen VBNC cellen opnieuw metabool actief en cultiveerbaar worden (Oliver 2005). Bovendien kunnen VBNC cellen, ondanks hun lage metabole activiteit, toch invloed hebben op industriële fermentatie en andere bioprocessen (Diaz et al. 2010). Bepaalde technieken kunnen helpen om de overleving van probiotica te verhogen. Voorbeelden hiervan zijn zuurstof ondoorlaatbare verpakkingen, micro-encapsulatie, toevoegen van anti-oxidantia, selectie van zuurresistente stammen… (Sarkar 2010). Omdat het aantal levende bacteriën die het colon bereiken van essentieel belang is voor de effectiviteit van probiotica zijn geschikte, efficiënte viabiliteitstesten nodig om de overleving van probiotica te bestuderen en te verbeteren (Doherty et al. 2010).
1.3.1 Conventionele methoden
Traditioneel
wordt
de
viabiliteit
van
micro-organismen
nagegaan
met
uitplatingstechnieken. Hierbij worden dode bacteriën echter niet gedetecteerd, maar ook inactieve, beschadigde, rustende of levende niet-cultiveerbare cellen worden niet gezien. Het aandeel VBNC cellen kan een belangrijke fractie van de totale celpopulatie uitmaken (Breeuwer and Abee 2000). Daarnaast kunnen met de traditionele uitplatingen geen realtime metingen uitgevoerd worden (Doherty et al. 2010). Daarom zijn tijdrovende uitplatingen niet echt geschikt om op een efficiënte wijze de viabiliteit te bepalen. Het geeft eerder een indicatie over hoeveel cellen in de gegeven omstandigheden kunnen vermenigvuldigen (Ben Amor et al. 2002). Om dezelfde reden kan de telling van het totaal aantal microbiële cellen aanwezig in een waterig staal niet gebeuren met de conventionele uitplatingstechnieken. Toch kan het voor een bioloog belangrijk zijn om te weten hoeveel micro-organismen er in een bepaalde 9
natuurlijke leefomgeving aanwezig zijn. Als alternatief kan de telling van het totaal aantal microbiële cellen aanwezig in een waterig staal gebeuren met een microscoop. Deze werkwijze is echter eveneens tijdrovend en is bovendien weinig accuraat (Wang et al. 2010). Andere mogelijke technieken zoals het meten van de verandering van optische densiteit (OD) of geleidbaarheid zijn niet steeds toepasbaar. Bijvoorbeeld in het geval van een zeer lage densiteit, de aanwezigheid van veel abiotische partikels of gekleurde oplossing moet naar alternatieven gezocht worden (Muller and Nebe-von-Caron 2010).
1.3.2 Flow cytometry als alternatieve methoden
Cultuuronafhankelijke technieken waarbij een beter beeld van de dode, beschadigde en levende niet-cultiveerbare populatie wordt geschetst, zijn dus uiteraard gewenst. Alternatieven zijn gevoelige fluorescente technieken met een hoge resolutie. Bacteriën kunnen, voornamelijk na kleuring, geanalyseerd worden met flow cytometry (FCM). Flow cytometry is een krachtige techniek gebruikt voor de analyse van bacteriën op celniveau (Wang et al. 2010). FCM ontstond in de jaren zestig van de vorige eeuw. Meteen werd de techniek toegepast in het onderzoek van zoogdiercellen. Toch liet het gebruik ervan door microbiologen nog een tiental jaar op zich wachten, want zij waren er toen niet meteen van bewust welke enorme mogelijkheden FCM bood (Steen 2000). Gaandeweg evolueerde de techniek naar een zeer precieze en snelle methode voor het analyseren van verschillende intrinsieke en extrinsieke celparameters. Het is een populaire techniek voor onder andere het bestuderen van de celcycli en eigenschappen zoals grootte, complexiteit, viabiliteit en activiteit van bacteriën op celniveau, het opvolgen van micro-organismen in waterig milieu en het sorteren van cellen (Steen 2000). Mede door de grote beschikbaarheid van kleurstoffen, zijn de mogelijke toepassingen zeer uitgebreid. Toch zijn er nog beperkingen omwille van de vereiste uitgebreide data-analyse en de beperking tot de analyse van vloeibare stalen (Wang et al. 2010).
10
Figuur 1.3:
De opbouw van de flow cytometer (Diaz et al. 2010)
Algemeen bestaat een flow cytometer uit een krachtige lichtbron, een vloeistofsysteem, verschillende filters (bandpass, shortpass of longpass filters), photodiode en photomultiplier tube (PMT) detectoren, en tenslotte een systeem voor data processing. Een sample wordt in de flow cell geïnjecteerd in een vloeistofstroom, de sheath fluid. Door middel van hydrodynamische focusing worden cellen afzonderlijk doorheen de lichtbron (vaak een laser, maar een kwiklamp of xenonlamp zijn ook mogelijk) geleid. Welke lichtbron gebruikt wordt, is afhankelijk van welke golflengten nodig zijn voor de excitatie van de gebruikte fluorescente markers (Diaz et al. 2010). De intensiteit van de gegenereerde signalen (lichtverstrooiing of fluorescentie) is gerelateerd met functionele en structurele celparameters. Lichtverstrooiing geeft een idee over de intrinsieke eigenschappen van een cel. Het licht verstrooid in dezelfde richting van het laserlicht, wordt Forward Scatter (FSC) genoemd en is een indicatie voor de grootte van de cel. Side Scatter (SSC) en fluorescentie worden opgevangen in een hoek van 90° tegenover de laser. SSC is een maat voor de complexiteit van de cel (Diaz et al. 2010). Stofdeeltjes en andere abiotische partikels kunnen echter ook zorgen voor lichtverstrooiing. Daarom kunnen targetcellen best fluorescent gelabeld worden om specifieke detectie mogelijk te maken (Wang et al. 2010). Bovendien kunnen ook extrinsieke parameters bestudeerd worden na fluorescente kleuring (Diaz et al. 2010). De digitale data verkregen na meting met FCM kunnen gevisualiseerd worden in een histogram of scatter plot. Voorbeelden van scatter plots zijn het uitzetten van de FSC tegenover SSC of het plotten van twee fluorescente parameters. Uit deze laatste kunnen de fluorescente eigenschappen van de (bacteriële) cellen bepaald worden. Door gating kunnen
11
subpopulaties binnen een sample onderscheiden worden bij multiparameter analyse met verschillende fluorochromen (Diaz et al. 2010).
1.3.2.1 Fluorescente kleuringen
Cellen kunnen gekarakteriseerd worden aan de hand van hun celstructuur en functionaliteit, wat bestudeerd kan worden met behulp van fluorescente kleuringen. Er zijn veel verschillende fluorescente kleurstoffen voorhanden die elk bepaalde karakteristieken hebben. Hiermee kunnen verschillende fysiologische parameters van de cel, bijvoorbeeld membraanintegriteit en enzymactiviteit, weergeven worden (Diaz et al. 2010, Zotta et al. 2012). SYBR®Green Ethidium bromide
total cell count
DiBac4
efflux pump activity
membrane potential
EB is pumped from active cells
Excluded from polarised cells
proteins
DNA/RNA esterase enzymes
RedoxSensorTM reductase activity
PI is excluded from intact cells
CFDA esterase substrate
Propidium iodide membrane integrity
Figuur 1.4: Een overzicht van verschillende fluorochromen die kunnen gebruikt worden bij het bestuderen van cellen (Overgenomen uit een presentatie van Frederik Hammes)
Totale kleuringen In het verleden werd aangetoond dat flow cytometry gecombineerd met kleuringen een waardig alternatief is voor de telling van het aantal microbiële cellen in een waterig staal (Hammes et al. 2008). Met deze techniek kan in enkele minuten het totaal aantal microbiële cellen in een staal bepaald worden. Het is belangrijk dat kleurstoffen voor deze toepassing alle cellen kleuren, ongeacht hun fysiologische toestand. Voorbeelden van geschikte kleurstoffen zijn SYTO9 en SYBR Green (Wang et al. 2010). SYBR Green is een groenfluorescerende kleurstof die een zeer grote affiniteit voor dubbelstrengig DNA vertoont, maar ook met een lagere affiniteit kan binden met enkelstrengig DNA of RNA (Marie et al. 1997). De binding van SYBR Green aan DNA 12
resulteert in een exponentiële toename van zijn fluorescentie. Niet gebonden aan DNA is de achtergrondfluorescentie van SYBR Gr verwaarloosbaar. De excitatie en emissie maxima van SYBR Green gebonden aan DNA zijn respectievelijk 497 nm en 520 nm (Invitrogen.com).
Figuur 1.5: De excitatie en emissie maxima van SYBR Green zijn respectievelijk 497 nm en 520 nm. (http://www.invitrogen.com)
Het kleuren van cellen met SYBR Green is pH-afhankelijk. Om een optimale sensitiviteit te bereiken, ligt de pH van de kleurstofoplossing ideaal tussen 7,5 en 8. Daarom is een verdunning van SYBR Green in buffer vaak stabieler dan in een niet-gebufferde oplossing (Invitrogen.com). SYTO 9 is eveneens een groenfluorescerende stof en kleurt levende en dode Gram positieve en Gram negatieve bacteriën. De excitatie en emissie maxima van deze fluorochroom zijn respectievelijk 485 nm en 498 nm (Invitrogen.com). In vroegere studies werd gezien dat Gram negatieve cellen, die een cytoplasmatisch membraan hebben, minder efficiënt gekleurd worden door SYTO9. Door dit membraan te permeabiliseren met EDTA kan de kleuring verbeterd worden (Berney et al. 2007).
Viabiliteitskleuring Voor vele wetenschappelijke toepassingen is het interessant om een onderscheid te kunnen maken tussen ‘dode’ en ‘levende’ cellen, hoewel ‘intact’ en ‘beschadigd’ correctere benamingen zijn. Met FCM in combinatie met fluorescente kleuringen is het mogelijk om de viabiliteit van micro-organismen te bestuderen (Wang et al. 2010). Traditionele uitplatingsmethoden zijn minder geschikt om de viabiliteit te bestuderen, zeker van bacteriën blootgesteld aan stress. Deze bacteriën zijn vaak beschadigd waardoor ze niet meer groeien op vaste bodems, maar later toch terug functioneel kunnen zijn. Daarom geven uitplatingen vaak een onderschatting van de viabiliteit (Shen et al. 2010). Welk 13
fluorochroom gebruikt wordt, is afhankelijk van de bestudeerde celfunctie, bijvoorbeeld membraan integriteit en membraanpotentiaal (Muller and Nebe-von-Caron 2010). Een vaak gebruikte kleuring is de Live/Dead kleuring. Hierbij worden cellen gekleurd met propidium iodide (PI) en membraanpermeabele groene fluorochromen zoals SYTO9 of SYBR Green. PI is een roodfluorescerende kleurstof die kan binden tussen de basenparen van DNA en RNA. Gebonden aan DNA neemt de fluorescentie van PI 20 tot 30 keer toe. PI heeft een excitatie en emissie maximum van respectievelijk 535 nm en 617 nm (Invitrogen.com). PI geeft een indicatie over de integriteit van het cytoplasmatisch celmembraan: terwijl SYBR Green alle cellen in een staal groen kleurt, dringt PI enkel in de cellen binnen waarvan het membraan permeabel is. In de cel bindt PI stoechiometrisch aan het DNA (Wang et al. 2010). Hoe hoger de rode fluorescentie, hoe meer beschadigd het celmembraan en hoe lager de viabiliteit. Bovendien wordt de groene kleuring in de aanwezigheid van PI verminderd: de energie van de geëxciteerde donor (SYBR Green) wordt getransfereerd naar de acceptor molecule (PI) volgens het fluorescentie resonantie energie transfer (FRET) principe (Falcioni et al. 2008). Door overlap van het emissie spectrum van SYBR Green en het excitatie spectrum van PI (Figuur 1.6), wordt het emissielicht van SYBR Green bij dode of beschadigde cellen deels gebruikt als excitatielicht voor PI. Dit resulteert in een verlaagde groene en een verhoogde rode fluorescentie bij dode of beschadigde cellen.
Figuur 1.6: De excitatie en emissie maxima van PI zijn respectievelijk 535 nm en 617 nm. Het emissie maximum van SYBR Green ligt rond 520 nm, in dezelfde range als het excitatiemaximum van PI. Het emissielicht van SYBR Gr kan gebruikt worden als excitatielicht voor PI volgens het FRET principe. (http://www.invitrogen.com; Fluorescence spectra viewer)
14
Dergelijke analyses zijn interessant voor slapende of beschadigde cellen die opnieuw gereactiveerd worden (Diaz et al. 2010). Er kan dus niet enkel een dode en levende populatie onderscheiden worden, maar ook tussenliggende toestanden kunnen geobserveerd worden. Toch is de interpretatie hiervan niet makkelijk. Daarom worden best meerdere parameters gebruikt voor de analyse van de viabiliteit (Berney et al. 2007).
Activiteitskleuring Verschillende fluorochromen zijn beschikbaar voor analyse van de cellulaire enzymatische activiteit. Een niet-fluorescerende kleurstof die door intracellulaire enzymen van de cel wordt omgezet tot een fluorescerende verbinding is zeer geschikt voor dergelijke toepassingen
(Muller
and
Nebe-von-Caron
2010).
Voorbeelden
van
dergelijke
fluorochromen zijn fluoresceïne diacetaat (FDA), carboxyfluoresceine diacetaat (CFDA) en 5cyano-2,3 ditolyl tetrazolium chloride (CTC) (Diaz et al. 2010). Deze laatste is een indicator voor de respiratoire activiteit van de cel (Wang et al. 2010). Gezonde, levende respireerders nemen de kleurstof op en reduceren CTC intracellulair via de elektronentransportketen tot een rood fluorescerende, onoplosbare component (Gasol and Aristegui 2007). Het lipofiele en op zich niet-fluorescerende CFDA dringt de cel binnen en wordt intracellulair omgezet door niet-specifieke esterasen naar een polaire, fluorescerende, membraan impermeabele component, carboxyfluoresceine. Dit impliceert dat cellen met een intacte esterase-activiteit en intact celmembraan de kleurstof kunnen weerhouden en dat dode cellen, zonder enzymactiviteit, niet zullen gekleurd worden (Ben Amor et al. 2002). Vaak wordt CFDA gebruikt in combinatie met PI om een onderscheid te maken tussen dode en levende cellen (Zotta et al. 2012). De optimale concentratie CFDA voor cel labeling is afhankelijk van het te bestuderen celtype (Wang et al. 2005). Glutaraldehyde kan de efficiëntie van celkleuring met CFDA verhogen (Morono et al. 2004). FDA is minder geschikt dan het meer hydrofobe CFDA omdat FDA een minder sterke fluorescentie oplevert en minder goed vastgehouden wordt door de cel (Diaz et al. 2010). Andere voorbeelden van bruikbare fluorochromen, die een indicatie zijn voor celactiviteit, zijn 2-[N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amion]-2-deoxy-D-glucose (2-NDBG) en ethidium bromide (EB). Deze verbindingen zijn respectievelijk een indicator voor de glucose opname van de cel en de activiteit van effluxpompen (Wang et al. 2010).
15
1.3.2.2 Optimalisatie kleuring en flow cytometrische analyse
Om een duidelijke, goed interpreteerbare meting te verkrijgen zijn een goede staalvoorbereiding en een geschikt kleuringsprotocol belangrijk. Daarom moeten waterige stalen vooraf vaak verdund worden. Uiteraard mogen de gebruikte verdunningsmedia geen invloed hebben op de viabiliteit van de micro-organismen. Voorbeelden van oplossingen gebruikt om bacteriële suspensies te verdunnen zijn fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en fysiologische oplossing. Naast de staalvoorbereiding is ook een goede kleuring belangrijk. Het opstellen van een ideaal kleuringsprotocol die een hoge fluorescentie intensiteit oplevert, wordt bemoeilijkt door verschillende factoren (Zotta et al. 2012). Onder andere incubatietijd en – temperatuur na kleuring, al dan niet voorbehandelen met EDTA en kleurstofconcentratie kunnen de efficiëntie van fluorescente kleuring verminderen (Miyanaga et al. 2007). Daarnaast kan ook de fysiologische toestand van de bacterie een invloed hebben (Berney et al. 2007). In de literatuur zijn reeds zeer veel verschillende protocols beschreven voor verschillende kleuringen van allerhande soorten bacteriën (Jernaes and Steen 1994, Holm and Jespersen 2003, Miyanaga et al. 2007). Toch werd in het verleden gezien dat een enkel protocol niet geschikt is voor de fluorescente kleuring van alle bacteriestammen (Zotta et al. 2012). Vaak wordt tijdens de meting een 96-well plaat gebruikt, om een snelle en efficiënte flow cytometrische analyse mogelijk te maken. Tussen de eerste en de laatste meting verstrijkt echter een 2-tal uur. De voorwaarde om een correcte meting te krijgen is uiteraard dat de tijd geen invloed heeft op de kleuring en de fysiologische toestand van de bacterie.
1.4
PHENOTYPING VAN PROBIOTICA
Het is bij onderzoek naar en productie van probiotica vaak nodig om een authenticiteitscontrole uit te voeren op de isolaten waarmee gewerkt wordt. Voor de identificatie van pure bacterieculturen zijn vandaag de dag fenotypische en moleculaire technieken beschikbaar. Fenotypische methoden worden vaak gebruikt voor een 16
preliminaire beschrijving van micro-organismen. De combinatie van morfologische, fysiologische en biochemische eigenschappen van een bacterie kan vaak al duidelijkheid brengen. Onder morfologische eigenschappen wordt bijvoorbeeld de grootte, vorm en kleur van de bacterie verstaan. Fysiologische eigenschappen zijn incubatietemperatuur, gevoeligheid voor pH en zuurstoftolerantie. Enzymactiviteit, gasproductie en metabolisme zijn voorbeelden van biochemische parameters (Donelli et al. 2013). Voor bijkomende informatie worden dikwijls moleculaire technieken gebruikt. Een eerste mogelijkheid is random amplified polymorphic DNA assay (RAPD). Bij deze techniek worden korte niet-specifieke primers gebruikt die met het chromosomale DNA kunnen hybridiseren bij een lage annealing temperatuur. Het visualiseren van de geamplificeerde PCR producten met agarose gel elektroforese (AGE), levert een bandenpatroon op typisch voor een bacteriestam. Een techniek met een hogere resolutie en gevoeligheid dan RAPD is amplified fragment length polymorphism (AFLP). DNA fragmenten verkregen na vertering van genomisch DNA door restrictie-enzymen, worden selectief geamplificeerd. Dit levert opnieuw een typisch bandenpatroon op na visualisatie met AGE. Dit maakt de methode geschikt voor het detecteren van polymorfismen in DNA (Donelli et al. 2013). Ook het verschil tussen rRNA van verschillende bacteriële stammen kan helpen met de classificatie. Ribotyping wordt de laatste decennia vaak gebruikt bij de differentiatie van Lactobacilli (Donelli et al. 2013). Daarnaast kan denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE) helpen bij het onderscheiden van bacteriën. DGGE van geamplificeerde fragmenten levert een karakteristiek bandenpatroon op. Deze techniek wordt ook vaak gebruikt voor identificatie van Lactobacillus stammen (Donelli et al. 2013). Toch zijn al deze technieken omwille van hun DNA/RNA extractiestap tijdrovend en duur. Daarom zijn alternatieven voor een snelle identificatie gewenst. Als alternatief wordt flow cytometry in combinatie met een fingerprinting pipeline voorgesteld. In het verleden toonden preliminaire experimenten reeds aan dat het mogelijk is om twee E. coli stammen van elkaar te onderscheiden met deze methode (Figuur 1.7).
17
Figuur 1.7: Preliminaire experimenten toonden aan dat 2 E. coli stammen konden onderscheiden worden met behulp van flow cytometric fingerprinting.
De Roy et al. ontwikkelden een FCM methode die het mogelijk maakt om microbiële gemeenschappen objectief te vergelijken. Ze slaagden erin om verschillende watermerken van elkaar te onderscheiden, onbekende stalen te classificeren en verschuivingen in de microbiële samenstelling waar te nemen (De Roy et al. 2012). De subjectieve manier waarop een histogram of een dot plot gewoonlijk wordt geïnterpreteerd (bijvoorbeeld door visuele interpretatie), blijft een zwakke plek van flow cytometry. Ook de visuele beoordeling van FCM data is vaak niet eenvoudig. Met de genoemde, nieuw ontwikkelde methode wordt een subjectieve beoordeling van de FCM data overbodig: de data werden via een statistische methode vergeleken en geanalyseerd. De betrouwbaarheid van deze nieuwe werkwijze werd geconfirmeerd door de resultaten te vergelijken met die van PCR-DGGE. Uiteraard moet steeds volgens een gestandaardiseerd protocol gewerkt worden om vergelijkingen tussen verschillende metingen mogelijk te maken. Om de genoemde methode te kunnen gebruiken bij het classificeren van onbekende stalen dient het systeem eerst getraind te worden. Dit wil zeggen dat alle micro-organismen die onderscheiden moeten worden, vooraf geanalyseerd worden. Van die micro-organismen wordt een databank aangelegd van FCM metingen. Daarna kunnen data van nieuwe, onbekende stalen vergeleken worden met de data uit de database (De Roy et al. 2012).
18
2
OBJECTIEVEN
Probiotica zijn een veelbelovende therapeutische behandeling bij vele ziektebeelden. Om hun overleving tijdens onder meer processing en de maag-darm passage te verbeteren, is een snelle en nauwkeurige techniek nodig om de viabiliteit van micro-organismen te bestuderen. Fluorescente kleuringen in combinatie met flow cytometry wordt daarom gebruikt om de viabiliteit van micro-organismen te analyseren. Er is echter geen eenduidig protocol voorhanden voor het kleuren en meten van veel gebruikte probiotische genera zoals Bifidobacterium en Lactobacillus. Daarom is het doel om in dit onderzoek de staalvoorbereiding en kleuring voor de veelgebruikte probiotische stammen Bifidobacterium longum en Lactobacillus rhamnosus GG te optimaliseren. Tijdens staalvoorbereiding worden bacteriële suspensies vaak verdund. Welk verdunningsmedium het meest geschikt is, fysiologische oplossing of fosfaatgebufferde zoutoplossing, wordt onderzocht aan de hand van de evolutie van de gemeten celconcentratie (events/µL) in de tijd. Na verdunnen kan de kleurstof aan het staal toegevoegd worden. Het staal moet vervolgens gedurende enige tijd geïncubeerd worden om de bacterie de kans te geven de kleurstof op te nemen. Een optimale incubatietijd bij een correcte incubatietemperatuur resulteert in de gewenste, maximale fluorescentie-intensiteit. Een continue meting bij constante temperatuur wordt aangewend om de ideale incubatietijd en –temperatuur te bepalen. Bij het onderzoek naar en productie van probiotica is het nodig om de isolaten waarmee gewerkt wordt regelmatig ter controle te identificeren. De hiervoor beschikbare technieken zijn tijdsrovend en duur. Preliminaire experimenten toonden aan dat flow cytometrische fingerprinting mogelijk een alternatief is om verschillende stammen van elkaar te onderscheiden. Daarom bestaat het tweede deel van deze scriptie enerzijds uit het opbouwen van een databank van flow cytometrische data van 29 verschillende Lactobacillus stammen, die behoren tot 5 clusters. Anderzijds wordt met een statistische pipeline nagegaan of flow cytometrische fingerprinting inderdaad geschikt is om Lactobacillus stammen te differentiëren. Er wordt bijvoorbeeld verwacht dat de verschillende clusters van elkaar kunnen onderscheiden worden. Daarnaast wordt nagegaan of het mogelijk is om binnen een 19
cluster verschillende groepen, of misschien zelfs binnen een groep stammen te onderscheiden.
20
3
MATERIAAL EN METHODEN
3.1
GROEI- EN VERDUNNINGSMEDIA
LGG werd opgegroeid op MRS Agar (Oxoid, Basingstoke, UK) of in MRS Broth (Oxoid, Basingstoke, UK). De samenstelling van het Bifidobacterium medium wordt weergegeven in Tabel 3.1.
Tabel 3.1: GROEIMEDIA BIFIDOBACTERIUM (http://bccm.belspo.be/index.php) Speciaal pepton (Oxoid, Basingstoke, UK)
23 g
Oplosbaar zetmeel (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland)
1,0 g
NaCl (Analar Normapur VWR, Leuven, België)
5,0 g
Cysteïne hydrochloride (Calbiochem EMD Millipore, San Diego, USA)
0,30 g
Glucose (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Duitsland)
5,0 g
Agar (indien vast medium) (Oxoid, Basingstoke, UK)
15 g
Gedestilleerd water
ad 1,0 L
Voor het verdunnen van bacteriële suspensies wordt fosfaat gebufferde zoutoplossing (Tabel 3.2) en fysiologische oplossing (0,9% NaCl) gebruikt. Tabel 3.2: SAMENSTELLING VAN FOSFAATGEBUFFERDE ZOUTOPLOSSING Kaliumdiwaterstoffosfaat (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Duitsland)
6,8 g
Dikaliumwaterstoffosfaat (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Duitsland)
8,8 g
NaCl (Analar Normapur VWR, Leuven, België)
8,5 g
Gedestilleerd water
3.2
ad 1,0 L
OPGROEIEN VAN BACTERIËN
Bifidobacterium longum en Lactobacillus rhamnosus GG (LMG 18243) werden uit de glycerolstock bij -80°C overgeënt op vaste (steriele) agarbodems. De Bifidobacterium agarplaten werden geïncubeerd in een candle jar bij 37°C. De zuurstof initieel aanwezig in de candle jar werd tijdens de ‘anaerobic cycle’ vervangen door een zuurstofvrij gasmengsel (90% N2, 10% CO2) met het Anoxomat toestel (Mart Microbiology B.V., Drachten, Nederland). 21
Van de agarplaten werden vervolgens kolonies overgeënt naar 10 mL vloeibaar medium. Voor B. longum gebeurde de overenting naar vloeibaar medium in Hungate tubes die nadien geflushed werden met N2/CO2-mengsel. Na nogmaals overenten van vloeibaar naar vloeibaar medium was de cultuur geschikt voor staalname voor FCM meting. Dagelijks werd 1 mL cultuur overgeënt naar 10 mL (1/10 v/v) zuiver vloeibaar medium. Bij staalname, steeds na 20 uur opgroeien, werd de optische densiteit (OD) gemeten.
Na 20 uur Optische densiteit Figuur 3.1: Het opgroeien en staalvoorbereiding van B. longum en L. rhamnosus GG.
Wekelijks werd een PCR uitgevoerd op enkele zuivere kolonies (Tabel 3.3).
Tabel 3.3: DETAILS PCR Bacterie
Primers
Temperatuurprogramma
Bifidobacteria
BIF164F, BIF662R
7’ 95°C; [1’ 94°C, 1’ 62°C, 2’ 72°C] x 35; 10’ 72°C
Lactobacilli
SBMAB0159F, SBLAB667R
7’ 95°C; [1’ 94°C, 1’ 56°C, 2’ 72°C] x 35; 10’ 72°C
De Lactobacillus stammen (Figuur 3.2), afkomstig uit de BCCM/LMG collectie, werden uit de glycerolstock bij -80°C overgeënt op vaste MRS agarbodems. Na drie dagen werden kolonies opgepikt en overgeënt naar vloeibaar MRS medium (in viervoud). Dagelijks werd overgeënt naar zuiver vloeibaar MRS medium in een verhouding van 1/10 v/v. Staalname 22
gebeurde steeds na 20 uur opgroeien. Anaerobe stammen (LMG 8151, LMG 9433, LMG 11428, LMG 11430, LMG 6400, LMG 10775, LMG 12166, LMG 18030) werden geïncubeerd bij 37°C in anaerobe jars met Anaerogen (Oxoid, Basingstoke, UK). De andere stammen werden allen aeroob geïncubeerd bij 28°C, met uitzondering van R32689 die geïncubeerd werd bij 37°C. LMG 6400 LMG 10775 L. rhamnosus
LMG 18030 LMG 12166 R-32689
L. casei
LMG 6904
L. zeae
LMG 17315
L. rhamnosus cluster
LMG 13087 LMG 10774 L. paracasei
LMG 13729 LMG 9191
LMG 6906
R-21695
LMG 7761 L. brevis
LMG 11993 LMG 11774 LMG 18022
Lactobacillus
LMG 9477 LMG 9476 L. salivarius
LMG 22873 LMG 14476 LMG 14477 LMG 9200
L. farciminis
R-42629 R-46564 LMG 9433
L. acidophilus
LMG 8151 LMG 11428 LMG 11430
Figuur 3.2: Alle 29 Lactobacillus stammen gebruikt voor flow cytometrische fingerprinting
3.3
FLOW CYTOMETRY
3.3.1 Kleuring en meetprotocol
De bacteriën werden gemeten met flow cytometry na kleuring met (i) SYBR Gr of (ii) SYBR Gr en PI. De werkoplossing van SYBR Gr en PI werd gemaakt door PI (20 mM in 23
dimethyl sulfoxide (DMSO), LIVE/DEAD BacLight Kit, Invitrogen) 50 keer te verdunnen en SYBR Gr (10.000x geconcentreerd in DMSO, Invitrogen) 100 keer te verdunnen in 0,22 µm gefilterd DMSO. Stalen, 1/1000 v/v verdund in 0,22 µm gefilterd PBS of FO oplossing (afhankelijk van het experiment), werden gekleurd met 10 µL/mL werkoplossing en vervolgens in het donker geïncubeerd bij 37°C gedurende 15 minuten. De metingen werden uitgevoerd met een BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Erembodegem, België). Groene en rode fluorescentie werden respectievelijk in fluorescentie kanaal FL1 (533/30 nm) en FL3 (670 nm LP ) gemeten. Als sheath fluid werd Milli-Q water gebruikt. De stalen werden, tenzij anders vermeld, gedurende 30 seconden gemeten op medium snelheid, bij een threshold van FL1H<500 en FSC-H<5000.
3.3.2 FCM meting 3.3.2.1 PBS versus FO
De metingen uitgevoerd voor zowel LGG als B. longum, worden weergegeven in Figuur 3.3. Er werd steeds een niet afgedood en afgedood staal (12 minuten op 75°C) gemeten. Elke meting werd 8 keer herhaald. Na de horizontale meting van elke rij werd gedurende 1 minuut gespoeld aan hoge snelheid (flow rate 66 µL/min) met 5% hypochlorietoplossing en gefilterd Evian. De 5% hypochlorietoplossing werd gemaakt door hypochloriet stockoplossing (Sodium hypochlorite solution (purum, 10%), Sigma-Aldrich, Schnelldorf) 20 keer te verdunnen in 0,22 µm gefiltreerd Evian.
24
SYBR Gr
PBS
SYBR Gr+PI
Niet afgedood
SYBR Gr
FO
SYBR Gr+PI
LGG/B. longum
SYBR Gr
PBS
SYBR Gr+PI
Afgedood
SYBR Gr
FO
Gefiltreerd Evian
Gefiltreerd Evian
5% hypochlorietoplossing
SYBR Gr+PI
Figuur 3.3: Proefopzet bij de keuze tussen PBS en FO.
3.3.2.2 Incubatietijd en –temperatuur
LGG en B. longum, gekleurd met SYBR Gr of SYBR Gr+PI, werden gedurende 1 uur continu gemeten op medium snelheid met een threshold van FL1-H<500 en FSC-H<5000. Zowel een levend als afgedood (12 minuten op 75°C) staal werd gemeten in het donker (m.b.v. zilverpapier) bij kamertemperatuur, 37°C of 50°C. De temperatuur werd constant gehouden met behulp van een warmwaterbad verwarmd door een magnetische roerder met verwarmingsplaat.
25
Figuur 3.4:Opstelling voor een continue meting met FCM. Het staal werd gemeten in het donker (zilverpapier) bij een constante temperatuur. De temperatuur werd constant gehouden met behulp van een warmwaterbad verwarmd door een magnetische roerder met verwarmingsplaat.
3.3.2.3 Fingerprinting
Na staalname werden de stammen 1/1000 verdund in PBS en gekleurd met (i) SYBR Gr of (ii) SYBR Gr en PI (10 µL/mL werkoplossing). Vervolgens werden de stalen 12 minuten geïncubeerd in het donker bij 37°C. De stalen werden gemeten met de BD Accuri C6 flow cytometer. De groene en rode fluorescentie werden opnieuw in fluorescentie kanaal FL1 en FL3 gemeten en als sheath fluid werd terug Milli-Q water gebruikt. Alle stalen werden gedurende 30 seconden gemeten op medium snelheid bij een treshold van FL1-H<500 en FSC-H<5000.
3.3.3 Statistische analyse van flow cytometrische data
De statistische analyse van de flow cytometrische data werd uitgevoerd zoals beschreven door De Roy et al. (2012). De flow cytometrische data van K verschillende groepen (K=29 Lactobacillus stammen) worden vergeleken. Eerst wordt een kwantitatieve multi-dimensionele fingerprint gecreëerd en vervolgens worden hieruit de eigenschappen gehaald die representatief zijn voor de verschillen tussen de Lactobacillus stammen.
26
Uit de FCM distributie wordt een kwantitatieve fingerprint afgeleid met behulp van het recursief probability binning (PB) algoritme voor FCM data behorend tot de Bioconductor package FlowFP. Alle FCM data (pool van alle cellen van de verschillende stalen gemeten met FCM) wordt samengenomen en verdeeld in twee bins die elke evenveel cellen bezitten. Deze twee bins worden elk opnieuw onderverdeeld in twee bins met evenveel cellen. De stap wordt steeds herhaald zodat er na l onderverdelingen 2 l bins zijn met variabele grootte maar telkens met eenzelfde aantal cellen. Op deze manier wordt de FCM data weergegeven aan de hand van rechthoekige bins met een verschillende vorm en grootte. Deze bins fungeren als model voor het maken van de fingerprint van de individuele stalen. Hiervoor wordt voor elke Lactobacillus stam afzonderlijk het aantal cellen per bin bepaald en weergegeven, dit wordt ook de fingerprint genoemd. In de tweede stap wordt een dimensiereductie van de fingerprint doorgevoerd met behulp van principal component analyse (PCA) en nadien Fisher discriminant analyse (FDA). Dit heeft als doel om uit te maken hoe de K verschillende groepen van elkaar verschillen. PCA geeft de meest nauwkeurige voorstelling van de data weer in een lagere dimensie, zodat de variatie tussen de K groepen maximaal is. FDA drukt de verschillen tussen de K groepen uit door de input variabelen te projecteren op discriminanten en wel op die manier dat ze bruikbaar zijn voor data classificatie. De discriminanten zijn die lineaire projecties van de input variabelen die de variatie tussen de K groepen maximaal uitdrukt tegenover de variatie binnen de K groepen. In 1 dimensie kan een goed onderscheid gemaakt worden indien de variatie tussen de K groepen groot is tegenover de variatie binnen de K groepen. Hoe sterk de discriminant in staat is om de variatie binnen de K groepen weer te geven kan kwantitatief uitgedrukt worden.
27
4 4.1
RESULTATEN LIVE/DEAD-ASSAY: SYBR GR EN SYBR GR+PI
4.1.1 Verdunnen van bacteriële suspensies
Om een ideale, niet te hoge event rate (events/s) te bekomen tijdens FCM metingen, is het nodig om bacteriële suspensies te verdunnen. De event rate ligt bij voorkeur rond 1000 events/s, maar mag zeker niet groter zijn dan 5000 events/s. Dit zou er voor zorgen dat er te veel cellen tegelijk de laser passeren, wat een minder nauwkeurig meetresultaat als gevolg heeft. De verdunningsoplossing mag geen invloed hebben op de bacteriële cellen. De gemeten celconcentratie in de tijd is hier een weerspiegeling van en is bij voorkeur constant. Er werd nagegaan welke oplossing, PBS of FO, het meest geschikt is door de totale celconcentratie (cellen/µL) en de celconcentratie van levende en dode cellen (bij SYBR Gr+PI) uit te zetten in functie van de tijd. Zowel LGG als B. longum werden verdund in PBS en FO. Alle stalen werden gekleurd met SYBR Gr of SYBR Gr+PI. Elke meting werd acht keer herhaald, zodat het effect van PBS en FO op de celconcentratie in de tijd kon gevolgd worden. Er werd eveneens een afgedood staal (12 min op 75°C) gemeten, om een goed onderscheid te kunnen maken tussen dode en levende cellen. Tijdens de meting van B. longum in PBS oplossing (Figuur 4.1), fluctueerde de celconcentratie wel, maar globaal bekeken bleef deze vrij constant in functie van de tijd. Dit wordt weerspiegeld door de rico’s van de trendlijnen die een kleine absolute waarde hebben: 0, -2, -1, 0 (Tabel 4.1). Een uitzondering was de meting van het niet-afgedood staal gekleurd met SYBR Gr+PI, waar de celconcentratie van de levende cellen daalde in functie van de tijd (rico=-6). Ook tijdens de laatste 20 minuten van de meting van het afgedood staal gekleurd met SYBR Gr, verminderde de celconcentratie sterk. Dit resulteerde in een trendlijn met rico = -7. Tijdens de meting van B. longum in FO (Figuur 4.2) was een dalende trend te zien van de celconcentratie in de tijd (rico ≤ -5). Enkel de celconcentratie van de dode cellen bleef meer constant (rico = -2; rico = 0). Zeker tegenover de meting in PBS, daalde de celconcentratie in FO algemeen gezien veel sneller. De celconcentratie van levende en dode
28
cellen tijdens de meting van het afgedood staal was zeer gelijkaardig als tijdens de meting van het niet-afgedood staal.
Figuur 4.1: De celconcentratie in functie van de tijd tijdens de meting van B. longum in PBS. De totale celconcentratie en de celconcentratie van de levende en dode cellen ifv de tijd blijft vrij constant (grafiek B,C). Tijdens de meting van het onbehandeld staal gekleurd met SYBR Gr+PI, daalt de celconcentratie van de levende cellen in de tijd (grafiek A). De celconcentratie daalt ook tijdens de laatste 20 minuten van de meting van het afgedood staal gekleurd met SYBR Green (grafiek D).
Figuur 4.2: De celconcentratie in functie van de tijd tijdens de meting van B. longum in FO. Algemeen is duidelijk een dalende trend van de celconcentratie in de tijd te zien. Enkel de celconcentratie van de dode cellen blijft meer constant (C).
29
Een gelijkaardige vaststelling kon gedaan worden bij LGG. Tijdens de meting van LGG in PBS (Figuur 4.3) daalde de celconcentratie licht, maar bleef de celconcentratie in de tijd constanter dan tijdens metingen in FO (Figuur 4.4). Dezelfde vaststellingen konden ook gedaan worden op basis van richtingscoëfficiënt (rico) van de trendlijn. Deze worden weergegeven in Tabel 4.1.
Figuur 4.3:
De celconcentratie in functie van de tijd tijdens de meting van LGG in PBS. De celconcentratie blijft globaal gezien vrij constant in de tijd, toch is ook een lichte daling te zien tijdens de meting van de stalen gekleurd met SYBR Green (grafiek B,D).
Figuur 4.4: De celconcentratie tijdens de meting van LGG in FO. De celconcentratie tijdens de metingen van LGG in FO daalt veel sterker in vergelijking met de metingen van LGG in PBS.
30
Tabel 4.1: RICHTINGSCOËFFICIËNTEN VAN DE TRENDLIJN DIE DE EVOLUTIE VAN DE
B. longum in PBS B. longum in FO LGG in PBS LGG in FO
CELCONCENTRATIE IFV DE TIJD BESCHRIJFT
Niet afgedood
SYBR Gr+PI
Celconcentratie levende cellen
-6
-8
1
-10
Niet afgedood
SYBR Gr+PI
Celconcentratie dode cellen
0
-2
0
-2
Afgedood
SYBR Gr+PI
Celconcentratie levende cellen
0
-8
0
0
Afgedood
SYBR Gr+PI
Celconcentratie dode cellen
-1
0
-1
-6
Niet afgedood
SYBR Gr
Celconcentratie totaal cel aantal
-2
-5
-4
-6
Afgedood
SYBR Gr
Celconcentratie totaal cel aantal
-7
-12
-2
-4
Hoe meer de rico afneemt, hoe sterker de gemeten celconcentratie een dalende trend vertoont. Vrijwel overal is de rico van de metingen in FO kleiner tegenover PBS.
4.1.2 Incubatietijd en –temperatuur
De volgende stap in de optimalisatie van het kleuringsprotocol, is het bepalen van de ideale incubatietijd en –temperatuur. Daarvoor werden stalen gekleurd met SYBR Gr of SYBR Gr+PI en gedurende 1 uur continu gemeten bij een constante temperatuur (kamertemperatuur, 37°C of 50°C). Er werd een continue meting uitgevoerd om de fluorescentie intensiteit in de tijd op te volgen. De ideale incubatietijd en –temperatuur is deze waarbij de fluorescentie intensiteit maximaal is. Daarom werd de mediaan van de fluorescentie uitgezet in functie van de tijd. Tijdens de continue meting bij kamertemperatuur van B. longum gekleurd met SYBR Gr nam de intensiteit van de groene fluorescentie langzaam toe. Bij 37°C steeg de fluorescentie intensiteit veel sneller en werd reeds een maximum bereikt na 10 minuten.
31
10 Figuur 4.5: De mediaan van de groene fluorescentie intensiteit in functie van de tijd tijdens de meting van B. longum gekleurd met SYBR Gr bij kamertemperatuur en 37°C. De maximale intensiteit bij 37°C (na 10 minuten) wordt sneller bereikt dan bij kamertemperatuur.
B. longum gekleurd met SYBR Gr+PI (Figuur 4.6) werd gedurende 1 uur gemeten bij kamertemperatuur, 37°C en 50°C. Opnieuw steeg de fluorescentie intensiteit bij kamertemperatuur langzaam. De maximale intensiteit werd bij 50°C en 37°C nagenoeg tegelijk bereikt en dit na 15 minuten. De fluorescentie-intensiteit bleef bij 50°C vrij constant tot het einde van de meting, terwijl de intensiteit bij 37°C al na 20 minuten afnam.
15
15
Figuur 4.6: De evolutie van de groene en rode fluorescentie in de tijd, tijdens de continue meting van B. longum gekleurd met SYBR Gr+PI bij kamertemperatuur, 37°C en 50°C. De maximale intensiteit wordt bij 37°C en 50°C even snel bereikt en dit na 15 minuten. Bij 50°C blijft zowel de groene als de rode fluorescentie langer constant.
In Figuur 4.7 wordt de intensiteit van de groene fluorescentie intensiteit afgebeeld tijdens de meting van LGG gekleurd met SYBR Gr. De groene fluorescentie-intensiteit is in de grafiek maximaal na 15 minuten. Dit punt is vermoedelijk een outlier. Toch wordt verwacht dat de maximale intensiteit wordt bereikt tussen 10 en 20 minuten. Opmerkelijk is wel dat de fluorescentie intensiteit tijdens de meting van LGG tot 3 keer lager is dan tijdens de meting van B. longum.
32
15 Figuur 4.7: De mediaan van de groene fluorescentie in functie van de tijd tijdens de meting van LGG gekleurd met SYBR Gr bij 37°C. Het punt waarop de maximale groene fluorescentie-intensiteit bij deze grafiek bereikt wordt (na 15 minuten) is waarschijnlijk een outlier. Toch wordt verwacht dat de maximale intensiteit bereikt wordt tussen 10 en 20 minuten.
De intensiteit van de groene en rode fluorescentie, tijdens de continue meting van LGG gekleurd met SYBR Gr+PI (Figuur 4.8), was maximaal na respectievelijk 15 en 20 minuten. Opnieuw was de intensiteit veel lager dan tijdens dezelfde meting van B. longum.
15
20
Figuur 4.8: De evolutie van de groene en rode fluorescentie afgebeeld in functie van de tijd tijdens de meting van LGG gekleurd met SYBR Gr+PI bij 37°C. De maximale fluorescentie wordt bereikt na respectievelijk 15 en 20 minuten.
4.2
FLOWCYTOMETRISCHE FINGERPRINTING VAN LACTOBACILLUS STAMMEN
In het tweede deel van deze thesis is het doel om na te gaan of het mogelijk is om Lactobacillus stammen te onderscheiden met behulp van flow cytometrische fingerprinting. Hiervoor werden 4 onafhankelijk stalen van 29 verschillende Lactobacillus stammen na kleuring met SYBR Gr+PI geanalyseerd met flow cytometry. Gedurende een halve minuut werden data geregistreerd in het SS, FL1 (groene fluorescentie) en FL3 (rode fluorescentie) kanaal. 33
Met behulp van het probabilistic binning (PB) algoritme werden voor alle stammen kwantitatieve fingerprints gecreëerd. Daarvoor werd de pool van de cellen van alle stalen (4 keer 29 stalen) onderverdeeld in bins, zodat elke bin even veel cellen bevat (Figuur 4.9). Dit resulteerde in een voorstelling van de FCM data aan de hand van rechthoeken met een verschillende vorm en grootte.
Figuur 4.9: De onderverdeling van alle data in bins zodat elke bin even veel cellen bevat.
Vervolgens werd het aantal cellen van elke stam aanwezig in elke bin uitgezet zodat een fingerprint patroon voor elke stam verkregen werd (Figuur 4.10). Alle 4 de metingen van eenzelfde stam worden weergegeven in eenzelfde grafiek. Als de 4 individuele metingen reproduceerbaar zijn, moet de grafiek van elke meting zo veel mogelijk op elkaar liggen.
Figuur 4.10:
De fingerprint van LMG 18022, LMG 18030, LMG 6400, LMG 6904. Het aantal cellen van elke meting binnen elke bin wordt weergegeven. De 4 individuele metingen van LMG 18030 zijn voorbeelden van reproduceerbare metingen. Bij de 4 metingen van de andere stammen is er meer variatie.
34
Nadien werd nagegaan in welke mate het mogelijk was om de verschillende clusters, groepen en stammen van elkaar te onderscheiden (Figuur 4.11). LMG 6400 LMG 10775 L. rhamnosus groep
LMG 18030 LMG 12166 R-32689
L. casei groep
LMG 6904
L. zeae groep
LMG 17315
L. rhamnosus cluster
LMG 13087 LMG 10774 L. paracasei groep
LMG 13729 LMG 9191
LMG 6906
R-21695
LMG 7761 L. brevis cluster
LMG 11993 LMG 11774 LMG 18022
Lactobacillus
LMG 9477 LMG 9476 L. salivarius cluster
LMG 22873 LMG 14476 LMG 14477 LMG 9200
L. farciminis cluster
R-42629 R-46564 LMG 9433
L. acidophilus cluster
LMG 8151 LMG 11428 LMG 11430
Figuur 4.11: De 29 verschillende Lactobacillus stammen behoren tot 5 verschillende clusters: L. rhamnosus, L. brevis, L. salivarius, L. farciminis en L. acidophilus. Binnen de L. rhamnosus clusters wordt er een onderscheid gemaakt tussen 4 verschillende groepen: L. rhamnosus, L. zeae, L. casei en L. paracasei.
4.2.1 Onderscheid tussen Lactobacillus clusters
Als eerste werd nagegaan of het mogelijk is om de verschillende clusters van elkaar te onderscheiden. Zelfs op basis van discriminant 1 (54% van discriminatie potentieel) is het niet mogelijk om clusters van elkaar te onderscheiden. Dit impliceert een vrij grote overlap tussen de verschillende Lactobacillus clusters. In Figuur 4.12 was daarnaast een grote
35
variatie binnen de clusters te zien. Omwille van de variatie en overlap was het niet mogelijk om met zekerheid te zeggen tot welke cluster een stam behoort.
Figuur 4.12: Discriminant waarden van de verschillende clusters na PCA en FDA.
4.2.2 Onderscheid tussen stammen binnen groep 4.2.2.1 L. rhamnosus en L. paracasei groep
Binnen de L. rhamnosus groep was de variatie tussen de verschillende metingen kleiner dan de variatie tussen de verschillende stammen. Daarom konden alle stammen met discriminant 1 en 2 duidelijk van elkaar onderscheiden worden. Binnen de L. paracasei groep konden met discriminant 1 en 2 vier van de vijf stammen duidelijk van elkaar gedifferentieerd worden. LMG 13729 kon moeilijker van de rest onderscheiden worden door een grotere variatie tussen de vier verschillende metingen.
Figuur 4.13: Discriminant waarden van de stammen binnen de L. rhamnosus groep (A) en de L. paracasei groep (B) na PCA en FDA.
36
4.2.3 Onderscheid tussen de verschillende stammen binnen een cluster
In de volgende stap werd nagegaan of de verschillende stammen behorend tot een cluster van elkaar kunnen onderscheiden worden.
4.2.3.1 L. rhamnosus cluster
Binnen de L. rhamnosus cluster was de overlap tussen de verschillende stammen klein en waren de 4 individuele metingen reproduceerbaar. Dit zorgde ervoor dat een goed onderscheid tussen de verschillende stammen kon gemaakt worden: discriminant 1 en 2 (respectievelijk 61,9% en 18,4% discriminatie potentieel) lieten toe om LMG 10774, LMG 10775, LMG 12166, LMG 13087, LMG 17315, LMG 18030, R21695 en R32689 te onderscheiden. De vier andere stammen, LMG 6904, LMG 13729, LMG 6400 en LMG 9191 konden niet gedifferentieerd worden.
Figuur 4.14: Discriminant waarden van de stammen binnen de L. rhamnosus cluster na PCA en FDA.
4.2.3.2 L. brevis cluster
Op basis van discriminant 1 (77,6% discriminatie potentieel) was het mogelijk om LMG 11774 te onderscheiden van de andere 4 stammen. Ook LMG 18022 kon onderscheiden worden van LMG 11993, LMG 11774 en LMG 6906. Discriminant 2 liet toe om LMG 7761 van alle andere stammen te onderscheiden. LMG 11993 en LMG 6906 waren moeilijker om van elkaar te differentiëren.
37
Figuur 4.15: Discriminant waarden van de verschillende stammen van de L. brevis cluster na PCA en FDA.
4.2.3.3 L. salivarius cluster
Binnen de L. salivarius cluster was er overlap tussen de verschillende stammen. Ook de variatie tussen de vier herhaalde metingen van 1 stam was vrij groot. Dit maakte een duidelijke differentiatie tussen de verschillende stammen niet mogelijk.
Figuur 4.16: Discriminant waarden van de stammen binnen de L. salivarius cluster na PCA en FDA.
4.2.3.4 L. farciminis cluster
Binnen de L. farciminis cluster konden de 3 stammen op basis van discriminant 1 (91% discriminatie potentieel) zeer duidelijk van elkaar onderscheiden worden. Het maximaal aantal mogelijke discriminanten bij K groepen is K-1, dus 2 in dit geval.
Figuur 4.17: Discriminant waarden van de stammen binnen de L. farciminis cluster na PCA en FDA. De drie stammen kunnen zeer duidelijk van elkaar gedifferentieerd worden.
38
4.2.3.5 L. acidophilus cluster
Op basis van discriminant 1 kon LMG 8151 duidelijk van de andere drie worden onderscheiden. Discriminant 2 liet toe om LMG 9433 te differentiëren van de andere stammen binnen de L. acidophilus cluster. Met behulp van discriminant 3 kon een onderscheid gemaakt worden tussen LMG 11428 en LMG 11430.
Figuur 4.18: Discriminant waarden van de stammen binnen de L. acidophilus cluster na PCA en FDA.
4.2.4 Onderscheid tussen alle 29 Lactobacillus stammen
Van alle 29 Lactobacillus stammen kunnen enkele stammen toch duidelijk van de rest onderscheiden worden. Dit is bijvoorbeeld het geval voor LMG 9200, LMG 10775, LMG 18030, LMG 18022, LMG 10774 en LMG 7761.
Figuur 4.19: Discriminant waarden van alle 29 stammen na PCA en FDA
39
5
DISCUSSIE
Met flow cytometry kunnen microbiële gemeenschappen in waterige stalen snel geanalyseerd worden. Onder meer de grote nauwkeurigheid en de snelle analyses met FCM maken de techniek populair. Het is daarom niet verwonderlijk dat de toepassingen ervan zeer uitgebreid zijn (Wang et al. 2010). Door de combinatie van fluorescente kleuringen met FCM kunnen verschillende celeigenschappen van microbiële gemeenschappen gevisualiseerd worden. Vaak wensen onderzoekers het totale celaantal te kennen, maar ook de celgrootte, viabiliteit en enzymactiviteit van de micro-organismen kunnen bestudeerd worden (De Roy et al. 2012). Om de viabiliteit van de micro-organismen te visualiseren kunnen de fluorochromen SYBR Green en propidium iodide gebruikt worden. SYBR Green kleurt alle cellen, terwijl enkel de celwand van beschadigde of dode cellen permeabel is voor propidium iodide. Een kleuring enkel met SYBR Green wordt uitgevoerd als meer info gewenst is over het totale celaantal van het staal.
5.1
STAALVOORBEREIDING: PBS VS FO BIJ HET VERDUNNEN VAN BACTERIËLE SUSPENSIES
Vaak worden bacteriële suspensies voorafgaand aan de FCM meting verdund met als doel een goed interpreteerbare en nauwkeurige meting te verkrijgen. De stalen kunnen bijvoorbeeld met fysiologische oplossing (FO) of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) verdund worden. Beide oplossingen zijn isotoon. Daarnaast kan PBS, dankzij zijn buffercapaciteit, zorgen voor een constante pH. Om een geschikt verdunningsmedium te zijn mag de oplossing geen invloed hebben op de cellen aanwezig in het staal. Er werd gekozen om dit te onderzoeken door het gemeten celaantal per µL te volgen in de tijd. Er werd vastgesteld dat de gemeten celconcentratie tijdens de meting van B. longum en LGG, verdund in PBS meer constant bleef in de tijd vergeleken met FO. Voornamelijk bij de celconcentratie van de levende cellen en totale celconcentratie was het duidelijk dat de celconcentratie stabieler bleef in PBS dan in FO. De resultaten van de meting van het afgedood staal van B. longum verdund in FO waren afwijkend van de andere metingen.
40
Omdat de vaststellingen in de lijn liggen van de niet-afgedode stalen (veel levende, weinig dode cellen), is het afdoden bij dit staal waarschijnlijk niet goed gebeurd. Het grootste verschil tussen FO en PBS is de buffercapaciteit van PBS. Mogelijk is de pH van de verdunning in FO anders dan die in PBS. SYBR Gr is pH gevoelig dus kan een gewijzigde pH zorgen voor een minder efficiënte kleuring. Toch lijkt het weinig waarschijnlijk dat de pH van de oplossing bij kamertemperatuur in zo’n korte tijd (2 uur) zo sterk afneemt (pH 3) dat de kleuring met SYBR Gr hierdoor beïnvloed wordt (Vitzthum et al. 1999, Baldock et al. 2013). Meerdere herhaalde metingen zijn nodig om uit te maken of de licht dalende trend van de celconcentratie gezien tijdens de metingen in PBS significant is. Indien wel, is de meting van een volledige 96-well plaat niet aan te raden vanwege het tijdsverschil tussen de eerste en de laatste meting.
5.2
KLEURINGSPROTOCOL
Tijdens de FCM meting is naast een constante celconcentratie ook een maximale fluorescentie intensiteit gewenst. Om dit laatste te bekomen zijn een optimale incubatietijd en –temperatuur na toevoegen van de kleurstof belangrijk. Deze werden bepaald door een continue meting bij constante temperatuur na kleuring met SYBR Green of SYBR Green en PI. Zowel de rode als groene fluorescentie waren maximaal na 15 à 20 minuten. Dit is in overeenkomst met de bevindingen van Boulos et al. (1999) voor de kleuring met SYTO9 en PI. In hun experiment ontbrak echter een continue meting, wat minder efficiënt is voor het volgen van de fluorescentie in de tijd. Incubatie gedurende 15 minuten bij 37°C heeft de voorkeur over incubatie bij kamertemperatuur. De maximale fluorescentie intensiteit wordt bij een hogere temperatuur van 37°C immers veel sneller bereikt. Nog hogere temperaturen, zoals 50°C, hebben geen voordeel tegenover 37°C om snel een maximale fluorescentie intensiteit te bereiken. Na 1 uur meten bleek dat de fluorescentie intensiteit bij 50°C gedurende de hele meting constant bleef, terwijl de intensiteit tijdens de meting bij 37°C vaak na een half uur al verminderde. Mogelijks is een meting bij een hoge temperatuur voordelig voor het behoud van de fluorescentie intensiteit. Deze vaststelling kan echter zeker niet veralgemeend 41
worden. Slechts 1 bacteriestam werd immers gemeten bij 50°C. Bovendien is het niet ondenkbaar dat bij dergelijke temperaturen sommige bacteriën beschadigd worden of zelfs afsterven. Dit zou uiteraard een vertekend resultaat als gevolg hebben (Oliver 2010). Toch stierven de bacteriën tijdens deze meting niet af. Indien de rode fluorescentie hoog bleef door de beschadiging of het afsterven van de bacteriën, dus door een toenemend aantal met PI gekleurde cellen, moest de groene intensiteit tegelijkertijd afnemen volgens het FRETprincipe (Falcioni et al. 2008). Er werd eveneens een groot verschil in fluorescentie intensiteit waargenomen tussen LGG en B. longum. De kleuringsefficiëntie kan afhangen van de fysiologische toestand waarin de bacterie zich bevindt. In het verleden toonde Barbesti et al. (2000) reeds aan dat E. coli bacteriën uit de exponentiële fase gekleurd met SYBR Gr en PI, een hogere groene fluorescentie vertonen dan de bacteriën in de stationaire fase. Dit kan het gevolg zijn van aanpassingen van de celwand in de stationaire fase, maar ook van een grotere hoeveelheid DNA en RNA aanwezig in de exponentiële fase (Berney et al. 2007).
5.2.1 Suggesties
Doordat de kleuring afhankelijk is van de fysiologische toestand van de bacterie, zijn celstructuur en de gebruikte fluorochroom, is het aan te raden de geschiktheid van een kleuringsprotocol voor andere bacteriën of kleuringen eerst te controleren. Bovendien worden best nog andere parameters getest om het kleuringsproces nog verder te optimaliseren. Het effect van EDTA op de kleuring van Gram negatieve bacteriën en de invloed van verschillende kleurstofconcentraties kunnen bijvoorbeeld bepaald worden. EDTA is een chelerende stof die het buitenste membraan van Gram negatieve bacteriën kan destabiliseren. De destabilisatie leidt tot meer homogene FCM resultaten die een mooi onderscheid tussen dode en levende bacteriën mogelijk maken (Berney et al. 2007). Stocks (2004) toonde aan dat de concentratieverhoudingen van de gebruikte kleurstoffen ook uitermate belangrijk zijn bij het bestuderen van de viabiliteit van micro-organismen.
5.3
POST PROCESSING
42
Een histogram (met 1 parameter) of dot plot (met 2 parameters) wordt gebruikt voor verdere interpretatie van de data. Vaak gebeurt het interpreteren van data nog op een subjectieve manier: het selecteren van subsets van data gebeurt bijvoorbeeld met behulp van gates die visueel toegekend worden. Dat het visueel beoordelen van data zorgt voor een grote variabiliteit in het eindresultaat is niet te verwonderen. Bovendien is het niet altijd mogelijk om verschillen tussen plots visueel waar te nemen. De subjectieve beoordeling van de verschillende data is dan ook de zwakke plek van de FCM methode (De Roy et al. 2012). De Roy et al. (2012) ontwikkelde een methode om op een objectieve manier fingerprints te creëren uit FCM data van microbiële gemeenschappen die gebaseerd zijn op eigenschappen van individuele cellen. De fingerprints van de verschillende microbiële gemeenschappen kunnen dan aan de hand van een objectieve statistische methode met elkaar vergeleken worden en zo worden gedifferentieerd en eventueel geclassificeerd. Ze slaagden erin om op die manier verschillende watermerken van elkaar te onderscheiden en onbekende waterstalen te identificeren. In deze thesis werd nagegaan of het mogelijk is om 29 verschillende Lactobacillus stammen, behorend tot 5 clusters, te onderscheiden met flow cytometrische fingerprinting. De Lactobacillus stammen hebben vaak gelijkaardige fysiologische en fenotypische eigenschappen, waardoor ze niet zo gemakkelijk van elkaar kunnen gedifferentieerd worden (Singh et al. 2009). Daarom worden vandaag voor de identificatie van bacteriële stammen vaak dure en vooral tijdrovende moleculaire technieken, zoals RAPD, gebruikt. Om na te gaan of flow cytometrische fingerprinting een mogelijk alternatief kan zijn, werd getest of verschillende Lactobacillus clusters of zelfs stammen van elkaar kunnen onderscheiden worden. Hiervoor werd een database aangelegd van FCM metingen van 29 Lactobacillus stammen die gestandaardiseerd werden opgegroeid, gekleurd met SYBR Gr of SYBR Gr en PI en gemeten. De dotplots van de 29 verschillende stammen waren visueel verschillend, maar toch vergelijkbaar (resultaten niet weergegeven). De data van de verschillende Lactobacillus stammen werden automatisch verwerkt: er werden fingerprints gecreëerd (gebaseerd op 3 parameters: FL1, FL3 en SSC) en deze werden op een objectieve manier vergeleken. Er kon geen onderscheid gemaakt worden tussen de verschillende clusters. Om de verschillende stammen van elkaar te onderscheiden moest dus minstens gekend zijn tot welke cluster een stam behoort. Dit was voldoende om alle L. farciminis ssp. en L. 43
acidophilus ssp. van elkaar te onderscheiden, maar niet om stammen behorend tot de L. brevis en L. salivarius cluster te differentiëren. Binnen de L. rhamnosus cluster kon onderscheid gemaakt worden tussen de stammen indien gekend was tot welke groep ze behoren. Mogelijk konden sommige subspecies niet gedifferentieerd worden omdat de variatie tussen de vier onafhankelijke metingen te groot was. Dit was bijvoorbeeld mogelijk het geval binnen de L. salivarius cluster. Ook de fingerprints (zie Figuur 4.10) tonen een zekere spreiding van de 4 onafhankelijke metingen. Toch moet net reproduceerbaarheid een belangrijke eigenschap van het systeem zijn om variabiliteit van de meetresultaten toe te kunnen schrijven aan veranderingen in de microbiële gemeenschap (De Roy et al. 2012). Uiteraard moet om hieraan te kunnen voldoen steeds op een gestandaardiseerde wijze te werk gegaan worden. Ondanks de standaardisatie was toch soms een vrij grote variatie tussen de metingen van de 4 onafhankelijk opgegroeide stammen te zien. Deze verschillen moeten, net als alle overeenkomsten, wel nog statistisch bevestigd worden. Als de verschillen statistisch significant zijn, moet verder onderzocht worden wat hiervan de oorzaak is. Eventueel kan voor staalname de optische densiteit (OD) van de culturen gecontroleerd worden. Ook kan nagegaan worden of het tijdsverschil tussen de eerste en de laatste meting een rol speelt (de 4 onafhankelijke metingen werden uitgevoerd in een 96-well plaat). Om de stabiliteit van het systeem al dan niet aan te tonen, worden de experimenten best ook over een langere periode met verschillende metingen herhaald. Een andere suggestie voor verder onderzoek is om na te gaan of het mogelijk is om onbekende stalen te identificeren of contaminatie te detecteren. Dit door de fingerprint van het onbekende staal te vergelijken met de data opgeslagen in de interne database. Dan zou de grote tijdswinst uiteraard het grootste voordeel van flow cytometric fingerprint zijn.
44
6
CONCLUSIE
Het bestuderen van de viabiliteit is onmisbaar om de overleving van probiotica tijdens bijvoorbeeld processing en de maag-darm passage te verbeteren en zo hun effectiviteit te verhogen. Om de overleving van de bacteriën op te volgen kunnen fluorescente kleuringen in combinatie met flow cytometry gebruikt worden. In dit onderzoek werd de staalvoorbereiding en kleuringsproces van B. longum en LGG geoptimaliseerd. Er werd vastgesteld dat fosfaatgebufferde zoutoplossing meer geschikt is dan fysiologische oplossing om bacterie suspensies te verdunnen. De invloed van het verdunningsmedium op de cellen werd onderzocht door de celconcentratie (events/µL) van de dode en levende cellen op te volgen in de tijd. De celconcentratie bleef in PBS meer constant in de tijd. Na het toevoegen van de fluorescente kleurstof aan stalen kunnen een ideale incubatietijd en –temperatuur zorgen voor een maximale fluorescentie-intensiteit. Een continue meting bij constante temperatuur toonde aan dat stalen van beide species best geïncubeerd werden bij 37°C, gedurende 15 minuten. Het is aan te raden om de geschiktheid van een kleuringsprotocol voor andere species/kleuringen eerst te controleren, eventueel uitgebreid met extra parameters zoals het toevoegen van EDTA bij Gram negatieve bacteriën of de optimalisatie van kleurstofconcentraties.
Bij het onderzoek naar en productie van probiotica wordt de identiteit van de isolaten waarmee gewerkt wordt regelmatig gecontroleerd. Misschien kan flow cytometrische fingerprinting een alternatief zijn voor de dure en tijdrovende technieken die hiervoor gebruikt worden. De fingerprints van 29 verschillende Lactobacillus werden met elkaar vergeleken. Verwacht werd dat verschillende clusters en eventueel stammen en groepen van elkaar konden onderscheiden worden. De 5 clusters konden echter niet van elkaar onderscheiden worden. Het is wel mogelijk om stammen met gelijkaardige fysiologische en fenotypische eigenschappen te onderscheiden met flow cytometrische fingerprinting op voorwaarde dat gekend is tot welke groep of cluster de stam behoort. Toch is door de grote variabiliteit tussen
herhaalde
metingen
eerst
verder
onderzoek
naar
de
stabiliteit
en 45
reproduceerbaarheid van het systeem nodig. Verder onderzoek kan in de toekomst uitwijzen of het mogelijk is om onbekende stalen te classificeren met flow cytometrische fingerprinting. Vooraleer kan beslist worden of de snelle flow cytometrische fingerprinting techniek een alternatief kan zijn voor de dure en tijdrovende moleculaire technieken die vandaag gebruikt worden, is uitgebreid verder onderzoek dus noodzakelijk.
46
7
LITERATUURLIJST
Alvarez-Olmos, M. I. and R. A. Oberhelman (2001). "Probiotic agents and infectious diseases: A modern perspective on a traditional therapy." Clinical Infectious Diseases 32(11): 15671576. Baldock, D., et al. (2013). "Effect of acidic pH on flow cytometric detection of bacteria stained with SYBR Green I and their distinction from background." Methods and Applications in FluorescenceEmail alert RSS feed 1(4). Barbesti, S., et al. (2000). "Two and three-color fluorescence flow cytometric analysis of immunoidentified viable bacteria." Cytometry 40(3): 214-218. BCFI (folia augustus 2005). "Aanpak van Acute Diarree." (geraadpleegd op 23 maart 2013): http://www.bcfi.be/Folia/2005/F2032N2008B.cfm. Ben Amor, K., et al. (2002). "Multiparametric flow cytometry and cell sorting for the assessment of viable, injured, and dead bifidobacterium cells during bile salt stress." Applied and Environmental Microbiology 68(11): 5209-5216. Bermudez-Brito, M., et al. (2012). "Probiotic Mechanisms of Action." Annals of Nutrition and Metabolism 61(2): 160-174. Berney, M., et al. (2007). "Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry." Appl Environ Microbiol 73(10): 3283-3290. Boulos, L., et al. (1999). "LIVE/DEAD BacLight : application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water." J Microbiol Methods 37(1): 77-86. Breeuwer, P. and T. Abee (2000). "Assessment of viability of microorganisms employing fluorescence techniques." International Journal of Food Microbiology 55(1-3): 193-200. Butterworth, A. D., et al. (2008). "Probiotics for induction of remission in Crohn's disease." Cochrane Database of Systematic Reviews(3). De Roy, K., et al. (2012). "Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting." Water Research 46(3): 907-919. 47
Diaz, M., et al. (2010). "Application of flow cytometry to industrial microbial bioprocesses." Biochemical Engineering Journal 48(3): 385-407. Doherty, S. B., et al. (2010). "Use of viability staining in combination with flow cytometry for rapid viability assessment of Lactobacillus rhamnosus GG in complex protein matrices." Journal of Microbiological Methods 82(3): 301-310. Donelli, G., et al. (2013). "Phenotyping and genotyping are both essential to identify and classify a probiotic microorganism." Microbial Ecology in Health & Disease 24: 20105. Falcioni, T., et al. (2008). "Evaluating the flow-cytometric nucleic acid double-staining protocol in realistic situations of planktonic bacterial death." Appl Environ Microbiol 74(6): 1767-1779. Fontana, L., et al. (2013). "Sources, isolation, characterisation and evaluation of probiotics." British Journal of Nutrition 109: S35-S50. Fooks, L. J. and G. R. Gibson (2002). "Probiotics as modulators of the gut flora." British Journal of Nutrition 88: S39-S49. Friedman, G. (2012). "The Role of Probiotics in the Prevention and Treatment of AntibioticAssociated Diarrhea and Clostridium Difficile Colitis." Gastroenterology Clinics of North America 41(4): 763-+. Gasol, J. M. and J. Aristegui (2007). "Cytometric evidence reconciling the toxicity and usefulness of CTC as a marker of bacterial activity." Aquatic Microbial Ecology 46(1): 71-83. Goto, Y. and H. Kiyono (2012). "Epithelial barrier: an interface for the cross-communication between gut flora and immune system." Immunological Reviews 245: 147-163. Hammes, F., et al. (2008). "Flow-cytometric total bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment processes." Water Research 42(1-2): 269-277. Hart, A. L., et al. (2002). "Review article: the role of the gut flora in health and disease, and its modification as therapy." Alimentary Pharmacology & Therapeutics 16(8): 1383-1393. He, X., et al. (2010). "In vitro communities derived from oral and gut microbial floras inhibit the growth of bacteria of foreign origins." Microb Ecol 60(3): 665-676.
48
Holm, C. and L. Jespersen (2003). "A flow-cytometric gram-staining technique for milkassociated bacteria." Applied and Environmental Microbiology 69(5): 2857-2863. http://bccm.belspo.be/index.php (12 februari 2013). http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp01304.pdf (18 april 2013) http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp07567.pdf (11 april 2013) http://products.invitrogen.com/ivgn/product/S34854 (20 april 2013) Jernaes, M. W. and H. B. Steen (1994). "Staining of Escherichia-Coli for Flow-Cytometry Influx and Efflux of Ethidium-Bromide." Cytometry 17(4): 302-309. Kaur, I. P., et al. (2002). "Probiotics: potential pharmaceutical applications." European Journal of Pharmaceutical Sciences 15(1): 1-9. Marie, D., et al. (1997). "Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I." Applied and Environmental Microbiology 63(1): 186-193. Matin, A. (1992). "Genetics of bacterial stress response and its applications." Ann N Y Acad Sci 665: 1-15. McFarland, L. V. (2008). "Antibiotic-associated diarrhea: epidemiology, trends and treatment." Future Microbiol 3(5): 563-578. Mills, S., et al. (2011). "Enhancing the stress responses of probiotics for a lifestyle from gut to product and back again." Microbial Cell Factories 10. Miyanaga, K., et al. (2007). "Optimization of distinction between viable and dead cells by fluorescent staining method and its application to bacterial consortia." Biochemical Engineering Journal 37(1): 56-61. Morono, Y., et al. (2004). "Application of glutaraldehyde for the staining of esterase-active cells with carboxyfluorescein diacetate." Biotechnology Letters 26(5): 379-383. Muller, S. and G. Nebe-von-Caron (2010). "Functional single-cell analyses: flow cytometry and cell sorting of microbial populations and communities." Fems Microbiology Reviews 34(4): 554-587. O'Hara, A. M. and F. Shanahan (2006). "The gut flora as a forgotten organ." Embo Reports 7(7): 688-693. 49
Oliver, J. D. (2005). "The viable but nonculturable state in bacteria." J Microbiol 43 Spec No: 93-100. Oliver, J. D. (2010). "Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria." FEMS Microbiol Rev 34(4): 415-425. Orrhage, K. and C. E. Nord (1999). "Factors controlling the bacterial colonization of the intestine in breastfed infants." Acta Paediatrica 88: 47-57. Oudhuis, G. J., et al. (2011). "Probiotics for prevention of nosocomial infections: efficacy and adverse effects." Current Opinion in Critical Care 17(5): 487-492. Qin, J. J., et al. (2010). "A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing." Nature 464(7285): 59-U70. Ramakrishna, B. S. (2007). "The normal bacterial flora of the human intestine and its regulation." Journal of Clinical Gastroenterology 41(5): S2-S6. Resta, S. C. (2009). "Effects of probiotics and commensals on intestinal epithelial physiology: implications for nutrient handling." Journal of Physiology-London 587(17): 4169-4174. Saad, N., et al. (2013). "An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field." Lwt-Food Science and Technology 50(1): 1-16. Sarkar, S. (2010). "Approaches for enhancing the viability of probiotics: a review." British Food Journal 112(4): 329-349. Seksik, P., et al. (2001). "Molecular analysis of the fecal flora of patients with inactive colonic Crohn's disease." Gastroenterology 120(5): A519-A519. Shen, Y., et al. (2010). "Bacterial viability in starved and revitalized biofilms: comparison of viability staining and direct culture." J Endod 36(11): 1820-1823. Singh, S., et al. (2009). "Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: A review." Lwt-Food Science and Technology 42(2): 448-457. Steen, H. B. (2000). "Flow cytometry of bacteria: glimpses from the past with a view to the future." Journal of Microbiological Methods 42(1): 65-74. Stocks, S. M. (2004). "Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight." Cytometry Part A 61A(2): 189-195. 50
Ursell, L. K., et al. (2012). "Defining the human microbiome." Nutrition Reviews 70: S38-S44. Vitzthum, F., et al. (1999). "A quantitative fluorescence-based microplate assay for the determination of double-stranded DNA using SYBR Green I and a standard ultraviolet transilluminator gel imaging system." Anal Biochem 276(1): 59-64. Wang, X. Q., et al. (2005). "Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling." Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 37(6): 379-385. Wang, Y. Y., et al. (2010). "Past, present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology." Trends in Biotechnology 28(8): 416-424. Wolvers, D., et al. (2010). "Guidance for Substantiating the Evidence for Beneficial Effects of Probiotics: Prevention and Management of Infections by Probiotics." Journal of Nutrition 140(3): 698S-712S. Zimmer, J., et al. (2012). "A vegan or vegetarian diet substantially alters the human colonic faecal microbiota." Eur J Clin Nutr 66(1): 53-60. Zotta, T., et al. (2012). "A comparison of fluorescent stains for the assessment of viability and metabolic activity of lactic acid bacteria." World Journal of Microbiology & Biotechnology 28(3): 919-927. Zuccotti, G. V., et al. (2008). "Probiotics in clinical practice: An overview." Journal of International Medical Research 36: 1A-53A.
51
