UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2014-2015
METHODEONTWIKKELING EN VALIDATIE VOOR HET SCREENEN VAN SYNTHETISCHE CANNABINOÏDEN EN ANDERE DESIGNERDRUGS (O.A. CATHINONEN) MET BEHULP VAN UPLC®-MS/MS
Laura KERCKHOF Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Dr. Apr. C. Stove
Commissarissen Dr. Apr. J. Cordonnier Dr. Apr. K. Van Uytfanghe
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2014-2015
METHODEONTWIKKELING EN VALIDATIE VOOR HET SCREENEN VAN SYNTHETISCHE CANNABINOÏDEN EN ANDERE DESIGNERDRUGS (O.A. CATHINONEN) MET BEHULP VAN UPLC®-MS/MS
Laura KERCKHOF Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Dr. Apr. C. Stove
Commissarissen Dr. Apr. J. Cordonnier Dr. Apr. K. Van Uytfanghe
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
2 juni 2015
Promotor
Auteur
Prof. Dr. Apr. C. Stove
Laura Kerckhof
SAMENVATTING Nieuwe psychoactieve stoffen (NPS) of designerdrugs zijn moleculen die in illegale laboratoria gesynthetiseerd worden en die gebaseerd zijn op de chemische structuur van illegale drugs en andere psychotrope stoffen. Door de snelle evolutie en het grote gamma aan designerdrugs is het moeilijk om deze stoffen te detecteren. Vandaar de nood aan gevoelige toxicologische methoden voor de detectie van deze designerdrugs. In het laboratorium Eurofins Forensic Belgium wordt nagegaan of de ultra performance liquid chromatography tandem massaspectrometrie methode (UPLC®-MS/MS methode) die gebruikt wordt voor het screenen van verdovende en psychotrope stoffen ook toepasbaar is voor de designerdrugs in de matrices bloed en urine. Het eerste deel van de masterproef gaat over de optimalisatie van de UPLC®-MS/MS-parameters. Hierbij worden de transities, de cone voltage en de collisie energie bepaald aan de hand van een infusie experiment. Voor de methode van de synthetische cathinonen en andere designerdrugs wordt er gebruik gemaakt van een ACQUITY UPLC ® HSS C18 (150 mm x 2.1, 1.8 µm) kolom en een gradiëntelutie met als mobiele fase A, 5 mM ammoniumformiaat buffer pH 3 en als mobiele fase B, 0,1 % mierenzuur in ACN. Voor de synthetische cannabinoïden wordt er gebruik gemaakt van een ACQUITY UPLC ® BEH C18 (100 mm x 2.1, 1,7 µm) kolom en een gradiëntelutie met als mobiele fase A en B respectievelijk 0,05 % mierenzuur in 5 mM ammoniumformiaat en methanol. Het tweede deel van de masterproef behandelt de validatie van de methode voor de cathinonen aan de hand van 10 gecertificeerde standaarden in de matrices bloed en urine, dit volgens de richtlijnen van de Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX). De methode voor de synthetische cannabinoïden kon wegens gebrek aan tijd niet gevalideerd worden. Deze methode kan dus enkel gebruikt worden voor het identificeren van de respectievelijke synthetische cannabinoïden in inbeslaggenomen drugs. Uit de validatie in de matrix bloed kan besloten worden dat er een screeningsmethode ten opzichte van de rapporteringsgrens van 10 ng/mL bekomen is voor de componenten MDPV, pentylone, βethylmethcathinone, methedrone, butylone, 5-APB, 3-MeO-PCP en cathinone. Voor de componenten methedrone, butylone, 5-APB, 3-MeO-PCP en cathinone werd voor de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid niet voldaan aan de vooropgestelde eisen (< 20 %), waardoor bijgevolg de ‘grijze zone’ zal moeten verbreed worden afhankelijk van de CV van ieder component. Naphyrone en bufotenine kunnen enkel kwalitatief bepaald worden aan de hand van deze methode aangezien de kalibratiecurve van bufotenine niet lineair is en de berekende LOD-waarden van beide componenten groter zijn dan 10 ng/mL. Ditzelfde geldt voor de andere cathinonen die geïnfuseerd maar niet gevalideerd werden wegens het niet beschikbaar zijn van de gecertificeerde referentiestandaarden in het laboratorium. In de matrix urine kan deze methode enkel voor bufotenine niet toegepast worden als screeningsmethode aangezien het kalibratiemodel, de herhaalbaarheid, de reproduceerbaarheid, de matrixeffecten en het extractierendement niet voldoen aan de specificaties. Voor de andere componenten is een succesvolle screeningsmethode ontwikkeld ten opzichte van een rapporteringsgrens van 200 ng/mL.
DANKWOORD
Graag zou ik van de gelegenheid gebruik willen maken om alle mensen die geholpen hebben bij het tot stand komen van deze thesis te bedanken.
Eerst en vooral wil ik mijn promotoren Prof. Dr. Apr. C. Stove en Dr. Apr. J. Cordonnier bedanken om mij de kans te geven deze thesis uit te voeren in het laboratorium Eurofins Forensics Belgium. Bovendien wil ik hen bedanken voor het nalezen en verbeteren van de thesis.
Een welgemeende dankjewel gaat naar mijn stagebegeleidster Apr. V. Coopman. Bedankt voor de begeleiding van het onderzoek, het regelmatig nalezen en verbeteren van mijn masterproef en voor de tijd die je vrijmaakte voor het beantwoorden van mijn vele vragen.
Als laatste wil ik mijn ouders, zussen, broer en vrienden bedanken voor de motivatie, steun en ontspanning.
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN ACN: acetonitrile API: atmospheric pressure ionisation BEH: Bridged Ethylene Hybrid BEWSD: Belgian Early Warning System on Drugs CB1: cannabinoïd receptor type 1 CB2: cannabinoïd receptor type 2 CID: collision-induced dissociation COMT: catechol-O-methyl transferase CV (%): variatiecoëfficiënt DAT: dopamine transporter DMT: dimethyltryptamine ESI: elektrospray ionisatie FAGG: Federaal Agentschap voor Geneesmiddelen en Gezondheidsproducten GC-MS: gaschromatografie-massaspectrometrie HPLC: high performance liquid chromatography IS: interne standaard LLE: vloeistof-vloeistofextractie/ liquid-liquid extraction LOD: limit of detection/ detectielimiet LSC: liquid solid chromatography LSD: lysergeenzuurdiethylamide MAO: monoamino-oxidase MF: mobiele fase MG: moleculair gewicht MRM: multiple reaction monitoring MS: massaspectrometrie m/z: massa/ladingsverhouding N2: stikstofgas NET: noradrenaline transporter NPS: nieuwe psychoactieve stoffen PABS: psychoactieve badzouten (‘bath salts’)
P.I.E.D: performance and image enhancing drug QP: quadrupool rf: radiofrequentie RP: reversed phase RSD: relatieve standaarddeviatie RT: retentietijd SD: standaarddeviatie SERT: serotonine transporter SF: stationaire fase SSRI: selectieve serotonine reuptake inhibitor SWGTOX: Scientific Working Group for Forensic Toxicology THC: delta-9-tetrahydrocannabinol UPLC-MS/MS: ultra performance liquid chromatography tandem massaspectrometrie UPW: ultrapuur water
INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING ........................................................................................................................................ DANKWOORD ............................................................................................................................................ LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN ....................................................................................................... INHOUDSOPGAVE...................................................................................................................................... 1
INLEIDING ........................................................................................................................................ 1 1.1
NIEUWE PSYCHOACTIEVE STOFFEN ........................................................................................ 1
1.1.1
Algemeen......................................................................................................................... 1
1.1.2
Wetgeving........................................................................................................................ 1
1.1.3
6 klassen .......................................................................................................................... 2
1.2
SYNTHETISCHE CANNABINOÏDEN ............................................................................................ 4
1.2.1
Algemeen......................................................................................................................... 4
1.2.2
Oorsprong ........................................................................................................................ 5
1.2.3
Effecten ........................................................................................................................... 5
1.2.4
Toedieningswijze ............................................................................................................. 6
1.2.5
Andere toepassingen ....................................................................................................... 6
1.3
SYNTHETISCHE CATHINONEN (‘BATH SALTS’) ......................................................................... 6
1.3.1
Algemeen......................................................................................................................... 6
1.3.2
Werkingsmechanisme ..................................................................................................... 7
1.3.3
Effecten ........................................................................................................................... 8
1.3.4
Gebruikspatroon.............................................................................................................. 8
1.3.5
Medische toepassing ....................................................................................................... 9
1.4
UPLC-MS/MS DETECTIE METHODE ......................................................................................... 9
1.4.1
Vloeistofchromatografie (LC) .......................................................................................... 9
1.4.2
Tandem massaspectroscopie ........................................................................................ 10
2
OBJECTIEVEN ................................................................................................................................. 14
3
MATERIAAL EN METHODEN .......................................................................................................... 16 3.1
MATERIAAL ............................................................................................................................ 16
3.1.1
Gebruikte apparatuur .................................................................................................... 16
3.1.2
Gebruikte chemicaliën................................................................................................... 16
3.1.3
Aangemaakte reagentia ................................................................................................ 16
3.1.4
Gecertificeerde standaarden en interne standaarden .................................................. 17
3.2
METHODEN............................................................................................................................ 18
3.2.1
UPLC-MS/MS toestel ..................................................................................................... 18
3.2.1.1
Algemene instellingen methode cathinonen en andere designerdrugs ................... 18
3.2.1.2
Algemene instellingen methode synthetische cannabinoïden ................................. 18
3.2.1.3
Infusie experiment..................................................................................................... 19
3.2.1.4
LC-condities cathinonen en andere designerdrugs ................................................... 20
3.2.1.5
LC-condities synthetische cannabinoïden ................................................................. 21
3.2.2 3.2.2.1
Validatie in bloed ....................................................................................................... 22
3.2.2.2
Validatie in urine ....................................................................................................... 27
3.2.2.3
Controle van de werking van de autosampler: herhaalbaarheid van de injectie ..... 28
3.2.2.4
Stabiliteit in de autosampler ..................................................................................... 28
3.2.2.5
Specificiteit ................................................................................................................ 29
3.2.3 3.2.3.1 4
Methodevalidatie synthetische cathinonen.................................................................. 21
Methodevalidatie synthetische cannabinoïden ............................................................ 29 Validatie in bloed ....................................................................................................... 29
RESULTATEN EN DISCUSSIE ........................................................................................................... 30 4.1
METHODEVALIDATIE CATHINONEN EN ANDERE DESIGNERDRUGS IN BLOED ..................... 30
4.1.1
Lineariteit....................................................................................................................... 30
4.1.2
Detectielimiet (LOD) ...................................................................................................... 31
4.1.3
Carry-over ...................................................................................................................... 32
4.1.4
Herhaalbaarheid (CV %) ................................................................................................ 33
4.1.5
Accuraatheid (% bias) en reproduceerbaarheid (CV %) ................................................ 34
4.1.6
Matrixeffecten ............................................................................................................... 36
4.1.7
Matrixinterferenties ...................................................................................................... 37
4.1.8
Interferenties afkomstig van andere analieten ............................................................. 37
4.1.9
Extractierendement....................................................................................................... 37
4.2
METHODEVALIDATIE CATHINONEN EN ANDERE DESIGNERDRUGS IN URINE ...................... 38
4.2.1
Lineariteit....................................................................................................................... 38
4.2.2
Carry-over ...................................................................................................................... 39
4.2.3
Herhaalbaarheid (CV %) ................................................................................................ 40
4.2.4
Accuraatheid ( % bias) en reproduceerbaarheid (CV %) ............................................... 42
4.2.5
Matrixeffecten ............................................................................................................... 43
4.2.6
Matrixinterferenties ...................................................................................................... 44
4.2.7
Extractierendement....................................................................................................... 44
4.3
CONTROLE VAN DE WERKING VAN DE AUTOSAMPLER: HERHAALBAARHEID VAN INJECTIE 45
4.4
STABILITEIT IN DE AUTOSAMPLER......................................................................................... 46
4.5
SPECIFICITEIT ......................................................................................................................... 48
5
CONCLUSIE .................................................................................................................................... 50
6
REFERENTIELIJST ............................................................................................................................ 52
7
BIJLAGEN .......................................................................................................................................... i
1 INLEIDING 1.1 NIEUWE PSYCHOACTIEVE STOFFEN 1.1.1 Algemeen Nieuwe psychoactieve stoffen (NPS) zijn drugs die gebaseerd zijn op de chemische structuur van illegale drugs en andere psychotrope stoffen. Een kleine wijziging van deze structuur zorgt ervoor dat ze de wetten omzeilen, waardoor ze niet gereguleerd zijn. Ze behouden hierdoor wel min of meer dezelfde werking als de overeenkomstige klassieke drug. Andere termen voor NPS zijn ‘legal highs’, ‘research chemicals’, ‘designerdrugs’, ‘smart drugs’, … Veel van deze nieuwe psychoactieve stoffen zijn momenteel nog niet opgenomen in de drugswetgevingen en staan niet onder controle van de Drug Control Conventions van de United Nations. Hierdoor zijn de producenten vrij om deze drugs te synthetiseren en te verkopen zonder dat ze hiervoor vervolgd worden. Designerdrugs worden voornamelijk verkocht via internet, in coffeeshops en op muziekfestivals en worden vaak gecommercialiseerd als potpourri, plantenvoeding, badzouten of wierook met het label ‘niet voor menselijke consumptie’. (1)
Figuur 1.1 Designerdrug gecommercialiseerd als ‘research chemical’ met het label: ‘not for human consumption’
1.1.2 Wetgeving Door de wijziging van een R-groep van een illegale drug wordt de wetgeving vaak omzeild en valt de drug niet onder de noemer illegaal. Om dit te verhinderen zou de wet telkens aangepast moeten worden. Maar doordat de NPS-markt zo snel evolueert (figuur 1.2), kan de wetgeving niet volgen. Een oplossing hiervoor is de ‘generieke wetgeving’. Deze is op dit moment nog in ontwikkeling en wordt in België verwacht in 2016. Hierbij wordt een wetgeving vastgelegd voor stoffen met een gedeeltelijk gemeenschappelijke chemische structuur waardoor alle reeds bestaande en toekomstige derivaten nu onder dezelfde wet vallen. Een nadeel van de generieke classificatie is dat sommige geneesmiddelen hierdoor ook aan deze wetgeving onderworpen 1
zullen zijn, waardoor geneesmiddelen zoals bupropion illegaal zullen worden. Hiervoor worden echter uitzonderingen gemaakt door het Belgian Early Warning System on Drugs (BEWSD) en het Federaal Agentschap voor Geneesmiddelen en Gezondheidsproducten (FAGG). (2) Momenteel zijn van de synthetische cannabinoïden waarvoor we deze methode willen ontwikkelen, JWH-210, JWH-018, JWH-307, AM-2233, AM-694, WIN48.098, JWH-073 en HU-210 opgenomen in het Belgisch Staatsblad. Van de cathinonen zijn pentylone, naphyrone, cathinone, MDPV en methedrone opgenomen in de wetgeving en van de andere designerdrugs zijn bufotenine, 4-fluoroamfetamine, 5-IT, psilocybine, PMMA en 5-APB gereguleerd.
Figuur 1.2 Weergave van het aantal gerapporteerde NPS in functie van de tijd (https://ewsd.wivisp.be/default.aspx)
1.1.3 6 klassen Op basis van de chemische structuur of farmacologische werking worden de NPS ingedeeld in 6 verschillende klassen. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen amfetaminederivaten, piperazinen, tryptaminen, synthetische cathinonen, synthetische cannabinoïden en andere drugs. De eerste 4 klassen zijn ingedeeld op basis van de chemische structuur. De synthetische cannabinoïden daarentegen bevatten grote variaties in de chemische structuur, maar hebben dezelfde farmacologische werking. (1) De synthetische cannabinoïden en synthetische cathinonen worden verder meer in detail besproken. Figuur 1.3 geeft een overzicht van de 6 klassen van designerdrugs met hun belangrijkste effecten, chemische structuur en enkele voorbeelden. (1)
2
Figuur 1.3 Overzicht van de 6 klassen van NPS (1)
Fenethylaminederivaten De fenethylaminederivaten hebben voornamelijk stimulerende en hallucinogene eigenschappen en veroorzaken een gevoel van welbehagen. Meestal worden ze verkocht onder de vorm van tabletten, een alternatieve vorm is poeder dat gesnoven wordt. Deze laatste toedieningsvorm kan pijnlijk zijn voor de neus door irritatie of erosie. Een andere naam voor deze klasse van drugs is ‘2C drugs’ of ‘smiles’. Velen hebben een serotonerge werking waardoor ze bij een overdosis of in combinatie met monoamino-oxidase inhibitoren (MAO-inhibitoren), selectieve serotonine reuptake inhibitoren (SSRI’s) en catechol-O-methyl transferase inhibitoren (COMT-inhibitoren) aanleiding kunnen geven tot het serotoninesyndroom met hyperthermie. Voorbeelden van deze klasse zijn 2C-I en 2C-B, die als basisstructuur 2,5 dimethoxyfenethylamine hebben en als R-groep respectievelijk jood en broom. (1)(2) Piperazinen De piperazinen hebben vooral stimulerende eigenschappen. Ze zijn oorspronkelijk ontwikkeld als anthelminticum, een middel tegen worminfecties. Vaak voorkomende neveneffecten zijn slapeloosheid, tremor, angst en hallucinaties. Ze worden verkocht onder de vorm van tabletten, capsules of losse poeders. Meestal worden ze oraal ingenomen. Snuiven, injectie en roken zijn alternatieven, vloeibare vormen daarentegen komen niet vaak voor. (1)(2) Tryptaminen De meeste stoffen die tot deze klasse behoren kunnen teruggevonden worden in de natuur, 3
maar veel componenten kunnen ook synthetisch aangemaakt worden. De hoofdcomponenten zijn psilocybine en psilocine, die geëxtraheerd kunnen worden uit paddenstoelen, dimethyltryptamine (DMT) en het semisynthetische lysergeenzuurdiethylamide (LSD). Deze klasse veroorzaakt voornamelijk hallucinogene eigenschappen. Ze worden verkocht onder de vorm van capsules, tabletten, poeders en vloeibare vormen. Ze worden meestal oraal ingenomen, ook snuiven, roken of injectie zijn mogelijke toedieningswegen. (1)(2) Andere drugs Dit is de verzamelnaam voor de componenten die niet behoren tot één van de hierboven besproken klassen. Deze klasse bestaat uit 2 grote groepen, enerzijds de componenten die gebaseerd zijn op geneesmiddelen, vb. phenibut, en anderzijds de “performance and image enhancing drugs” (P.I.E.D). Dit zijn componenten die de fysieke activiteit verbeteren. Deze behoren eigenlijk meer tot de groepen ‘spierversterkers’ en ‘doping’. Voorbeelden van deze P.I.E.D’s zijn de anabole steroïden ‘gear, roids en juice’. (1)(2)
1.2 SYNTHETISCHE CANNABINOÏDEN 1.2.1 Algemeen De synthetische cannabinoïden zijn een verzameling van chemisch niet verwante componenten, die interageren met de cannabinoïd receptor type 1 (CB1) en type 2 (CB2) in de hersenen en de perifere organen. Deze veroorzaken gelijkaardige effecten als ∆9-tetrahydrocannabinol (THC), een psychoactieve stof die als hoofdcomponent voorkomt in Cannabis sativa (hasj, marihuana). De CB1 receptoren bevinden zich in het centraal- en perifeer zenuwstelsel, het beenmerg, de lever, het vasculair endotheel, het hart, de longen en het voortplantingssysteem. De CB2 receptoren daarentegen bevinden zich voornamelijk op de cellen van het immuunsysteem, ook in het centraal zenuwstelsel maar in een lagere hoeveelheid dan de CB1 receptoren. (3) Ze worden voornamelijk gecommercialiseerd als potpourri (figuur 1.4), de synthetische cannabinoïden worden hierbij opgelost in aceton of methanol en vervolgens gesproeid over de kruiden. Ze zijn om verschillende redenen enorm populair. Eerst en vooral omdat ze gelijkaardige psychoactieve effecten veroorzaken als vb. marihuana, daarnaast worden ze voorgesteld als veilige drugs. Bovendien zijn velen op dit moment nog niet opgenomen in de wetgeving, makkelijk verkrijgbaar en moeilijk detecteerbaar in bloed- en urinestalen. (4)
4
Figuur 1.4 ‘Legal highs’ gecommercialiseerd als potpourri en plantenvoeding Leg
1.2.2 Oorsprong De synthetische cannabinoïden zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor medische doeleinden maar het bleek moeilijk te zijn om de gewenste eigenschappen te scheiden van de ongewenste psychoactieve effecten. (5) 1.2.3 Effecten De synthetische cannabinoïden oefenen sterke cannabisachtige effecten uit. Doordat de concentratie en mogelijk ook het actieve bestanddeel van de drugs varieert van batch tot batch, resulteert dit vaak in overdoseringen met bijgevolg ziekenhuisopnames. Bovendien is er nog maar weinig gekend over de farmacologie en de toxicologie van deze synthetische cannabinoïden, dit maakt hen net zo gevaarlijk. (4) Over het algemeen zijn de gewenste effecten van deze drugs het geven van een gevoel van empathie en welzijn. Vaak voorkomende neveneffecten zijn misselijkheid, agitatie, paniekaanvallen, tachycardie, hallucinaties, waanbeelden en angstaanvallen. (4)
5
1.2.4 Toedieningswijze Synthetische cannabinoïden worden voornamelijk gerookt, dit onder de vorm van een joint of waterpijp. (4) De meeste gebruikers verkiezen deze vorm van inname omdat deze aanleiding geeft tot onmiddellijke effecten. Soms worden ze ook ingenomen door orale consumptie, het ontstaan van de effecten kan hierbij verschillen van persoon tot persoon door de diversiteit in first-pass-effect. Hierdoor is het mogelijk dat de gebruiker niet het verwachte effect ondervindt door onder- of overdosering. Synthetische cannabinoïden worden door hun lipofiel karakter en lage wateroplosbaarheid niet verwerkt in kruidentheeën of onder de vorm van injecties. Ook parenterale toediening heeft geen plaats in de toediening van de synthetische cannabinoïden. (3) 1.2.5 Andere toepassingen Synthetische cannabinoïden worden ook gebruikt in de medische sector. Een voorbeeld hiervan is Rimonabant (Acomplia®), dit is een selectieve CB1 receptor antagonist die gebruikt werd voor de behandeling van obesitas. Door het veroorzaken van ernstige neveneffecten, zijn ze van de markt verdwenen. Een ander voorbeeld is Nabilone (Cesamet®), dit is een synthetisch cannabinoïd dat gebruikt wordt voor de behandeling van anorexia en anti-emetische eigenschappen heeft bij patiënten die behandeld zijn met chemotherapie. (3)(6) Synthetische cannabinoïden worden ook vaak gebruikt in de industrie voor farmacologische onderzoeken, zoals structuur-activiteit relaties en receptor binding studies. (3)
1.3 SYNTHETISCHE CATHINONEN (‘BATH SALTS’) 1.3.1 Algemeen Synthetische cathinonen zijn derivaten van cathinon (β-ketoamfetamine), een component met amfetamineachtige eigenschappen en het werkzame bestanddeel van de drug ‘qat’. (7) Qat zijn de bladeren van de plant ‘Catha edulis’, door het kauwen van de bladeren of door de bladeren te drogen en te consumeren via thee wordt er een stimulerend effect bekomen. De synthetische afgeleiden worden verkocht onder de naam ‘badzouten’ zodat het lijkt alsof ze niet voor menselijke consumptie bedoeld zijn. In 1920 werden de eerste synthetische cathinonen, methcathinone en mephedrone, ontwikkeld. Vanaf dan ontstonden er vele andere derivaten, maar omwille van de neveneffecten werden ze niet gebruikt voor therapeutische doeleinden. Sinds 2000 werden deze synthetische cathinonen populair als designerdrugs. (8) Ze worden vaak verkocht onder de naam ‘badzouten’ of 6
‘plantenvoeding’ en krijgen het label ‘niet voor menselijke consumptie’, dit om de wetgeving omtrent drugsmisbruik te omzeilen. Het feit dat ze makkelijk verkrijgbaar zijn en omschreven worden als veilige drugs kan de enorme populariteit van deze synthetische cathinonen verklaren. Bovendien kunnen de synthetische cathinonen momenteel moeilijk gedetecteerd worden door standaard toxicologische testen waaronder de immunologische testen, wat ook een rol speelt in hun populariteit als synthetische drugs. (9) 1.3.2 Werkingsmechanisme De synthetische cathinonen oefenen hun stimulerende werking uit door de toename van de concentratie van de catecholamines (noradrenaline, dopamine en serotonine) ter hoogte van de synaptische spleet. Dit kan enerzijds door de verhoogde vrijstelling van de catecholamines, anderzijds door het blokkeren van de heropname ervan, veroorzaakt door interactie met de monoaminetransporters. (10) De monoaminetransporters, waaronder de noradrenaline transporter (NET), de dopamine transporter (DAT) en de serotonine transporter (SERT), behoren tot de familie van proteïnen die de Na-afhankelijke opname van de catecholamines reguleert. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen amfetamineachtige substraten en cocaïneachtige blokkers (Figuur 1.5). Beiden zorgen ze voor een stijging van de extracellulaire concentratie van de monoamines. (11)
Figuur 1.5 Voorstelling werkingsmechanisme cocaïneachtige-blokkers en amfetamineachtige substraten (12)
7
1.3.3 Effecten De gewenste effecten van de psychoactieve bath salts (PABS) die waargenomen worden door de gebruikers zijn een gevoel van euforie, een gestegen energie, toename van de alertheid, een gestegen libido, empathie, openheid… De meest voorkomende ongewenste effecten zijn cardiale, psychiatrische en neurologische problemen. Andere neveneffecten zijn nausea, zweten, hoofdpijn, duizeligheid, gedaalde werking van het korte termijn geheugen, braken en spierschokken. (7) Tabel 1.1 geeft een overzicht van de meest voorkomende psychische en neuropsychiatrische effecten van de synthetische cathinonen. (9) Tabel 1.1 Fysische en neuropsychiatrische effecten van de 'badzouten' (9)
1.3.4 Gebruikspatroon De toediening van synthetische cathinonen gebeurt meestal via nasale of orale inname. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen ‘bombing’ en ‘keying’. Bombing is een methode waarbij het poeder verpakt wordt in sigarettenpapier vooraleer het ingeslikt wordt. Bij keying wordt een sleutel ‘key’ ondergedompeld in poeder en wordt een kleine hoeveelheid van de tip opgesnoven. Ook andere toedieningswegen zoals inhalatie, rectale toediening, gingivale toediening, intraveneuze- en intramusculaire injectie zijn gebruikelijk. Er wordt vaak afgewisseld tussen de verschillende toedieningsmethoden omdat er bij een te lange nasale of orale inname respectievelijk nasale irritatie of erosie en dyspepsie kan optreden. (9) De effecten zijn onafhankelijk van de toedieningswijze. De duur van de effecten daarentegen verschilt wel, bij niet-orale inname kan over het algemeen een kortere duur waargenomen
8
worden. De synthetische cathinonen worden vaak ingenomen in combinatie met andere drugs om op die manier de gewenste effecten te verhogen en de neveneffecten te verminderen. (8) 1.3.5 Medische toepassing Er werd onderzoek gedaan naar de medische toepassing van de synthetische cathinonen. Op dit moment is bupropion het enige cathinone derivaat dat een functie heeft in de medische sector in Europa en de VS. (7) Het is een amfetaminederivaat dat de heropname van de catecholamines (dopamine en noradrenaline) inhibeert. Bovendien is het een niet-competitieve acetylcholine nicotinereceptor antagonist. Het wordt gebruikt voor de behandeling van depressies (Wellbutrin®) en bij rookstop (Zyban®). Het precieze werkingsmechanisme hiervan is nog niet gekend. Ook pyrovalerone werd onderzocht als geneesmiddel voor de behandeling van chronische vermoeidheid, lethargie en obesitas. Het werd echter van de markt teruggetrokken omwille van de afhankelijkheid en het misbruik van het geneesmiddel. Methcathinone en andere derivaten werden onderzocht voor de behandeling van depressie, wegens te ernstige neveneffecten werden deze niet op de markt gebracht. Over het algemeen hebben de synthetische cathinonen geen belangrijke rol in de medische toepassing door de vele neveneffecten die er aan verbonden zijn. (7)
1.4 UPLC®-MS/MS DETECTIE METHODE In deze masterproef wordt voor het screenen van de designerdrugs gebruik gemaakt van ultra perfomance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC®-MS/MS). UPLC zorgt voor de scheiding van de verschillende componenten die vervolgens gedetecteerd worden met behulp van tandem massaspectrometrie. 1.4.1 Vloeistofchromatografie (LC) Chromatografie is een analytische techniek die gebruikt wordt om mengsels te scheiden. Deze techniek bestaat uit 2 fasen, een stationaire fase (SF) en een mobiele fase (MF). Bij vloeistof kolomchromatografie is de SF geïmmobiliseerd in een kolom en is de MF een vloeistof. Het staal wordt op de top van de kolom aangebracht en wordt, via de lopende mobiele fase die continu toegevoegd wordt, over de kolom gebracht. Afhankelijk van de affiniteit van het staal voor beide fasen zal de component zich over deze fasen verdelen. Indien er geen interactie is met de SF zullen de componenten zich gedragen als de mobiele fase en van de kolom elueren. Hoe groter de affiniteit met de stationaire fase, hoe langer de component in de kolom verblijft, hoe groter
9
de retentietijd (RT). Het is belangrijk dat de componenten een verschillende affiniteit vertonen voor beide fasen zodat alle componenten op een ander tijdstip elueren en op die manier optimaal van elkaar kunnen onderscheiden worden. De pomp zorgt dat de mobiele fase met een constante snelheid over de kolom gepompt wordt. De injector brengt het staal op de top van de kolom, dit gebeurt automatisch via een autosampler. Wanneer de componenten uit de kolom elueren komen ze terecht ter hoogte van de detector, de tandem massaspectrometer. Als laatste wordt dit via de computer geregistreerd in een chromatogram, die het elektrisch signaal uitzet ten opzichte van de retentietijd.
Figuur 1.6 Schematische weergave UPLC-MS/MS (www.chromedia.org)
Ultra performance liquid chromatography (UPLC) In de masterproef wordt gebruik gemaakt van UPLC. Deze techniek biedt verschillende voordelen ten opzichte van high performance liquid chromatography (HPLC). Het grootste verschil is dat UPLC werkt bij een hogere druk en een kleinere partikeldiameter. Dit zorgt voor een betere resolutie, hogere gevoeligheid en kortere retentietijden, wat afgeleid kan worden uit de Van Deemter vergelijking. (13) 1.4.2 Tandem massaspectroscopie Massaspectrometrie is een spectrometrische techniek die gebaseerd is op de vorming van ionen door middel van een bepaald ionisatieproces. Vervolgens worden de ionen gescheiden volgens hun massa/ladingverhouding (m/z). Afhankelijk van de abundantie waarin de gevormde ionen voorkomen wordt een spectrum geregistreerd. Aangezien de aard en het aantal van de gevormde moleculaire- en fragmentionen specifiek is voor een bepaald component, kan men stellen dat het spectrum een vingerafdruk is van deze component. De belangrijkste onderdelen van de massaspectrometer zijn het inlaatsysteem, de ionenbron, de massafilter en de detector. Bij UPLCMS/MS is het inlaatsysteem ultraperformance liquid chromatografie. 10
Figuur 1.7 Weergave belangrijkste onderdelen MS (cursus instrumentele analytische chemie)
Ionisatieproces: elektrospray positief (ESI +) Dit is een vorm van atmospheric pressure ionisatie (API), de ionisatie zal dus gebeuren onder atmosferische druk (760 Torr). De mobiele fase, al dan niet beladen met analiet, wordt door een capillair gestuurd waarop aan het uiteinde een potentiaal van ongeveer 5 kV is aangelegd. Deze spanning op de cone zorgt ervoor dat er een fijne spray van geladen druppels gevormd wordt. Vervolgens wordt het solvent verdampt en verwijderd met behulp van drooggas vb. N2. Dit zorgt er bovendien voor dat de druppels kleiner worden en de ladingsconcentratie aan het oppervlakte verhoogt, dit proces wordt ook wel ionenevaporatie genoemd. Daarnaast zijn de Coulombse repulsiekrachten in staat om de oppervlaktespanning van deze gevormde druppeltjes te overwinnen waardoor ze uiteenvallen tot een reeks kleinere, minder geladen druppels. Dit proces wordt herhaald zodat individueel geladen ‘naakte’ analietionen gevormd worden. ESI is een zachte ionisatietechniek waardoor voornamelijk moleculaire ionen gevormd worden.
Figuur 1.8 Weergave elektrospray ionisatie (cursus instrumentele analytische chemie)
Massafilter: quadrupool Na het ionisatieproces worden de gevormde ionen via een capillair overgebracht naar de massaanalysator die deze ionen zal scheiden volgens massa/ladingverhouding. De massafilter die hier gebruikt wordt is de quadrupool (QP). Een quadrupool bestaat uit 4 parallelle hyperbolische staven met een radiofrequentie (rf) en een directe stroomspanning. Als de ionen bij een bepaalde
11
combinatie van radiofrequentie en stroomspanning een golfbeweging beschrijven die synchroon is met de radiofrequentie dan zullen deze de detector bereiken. Dit is afhankelijk van de m/zwaarde.
Figuur 1.9 Weergave quadrupool (www.chromedia.org)
Detector: elektron multiplier De detector heeft als functie om de gevormde ionen om te zetten in een elektrisch signaal. Hierbij vallen de gevormde ionen in op een kathode uit alkalimetaal. Het gevolg hiervan is dat er elektronen vrijgesteld worden die door een anode aangetrokken worden. Bij het contact met de volgende anodes wordt het proces van multiplicatief emitteren van de elektronen herhaald. Het uiteindelijk elektrische signaal is evenredig met het aantal invallende ionen.
Figuur 1.10 Weergave van een elektronmultiplier (cursus instrumentele analytische chemie)
Tandem massaspectroscopie: collision-induced dissociaton Hierbij wordt gebruikt gemaakt van een triple quadrupool. Deze bestaat uit twee quadrupolen, MS1 en MS2, en een collision cel. De eerste quadrupool (MS1) selecteert één precursor ion, deze wordt doorgelaten naar de collision cel die de twee quadrupolen met elkaar verbindt. Daar worden met behulp van collisie energie product ionen gevormd door het laten botsen van de precursor ionen met de atomen van een edelgas (meestal argon) of van stikstofgas, we spreken 12
hier over collision-induced dissociation (CID). De tweede massafilter (MS2) selecteert deze fragment ionen. Bij multiple reaction monitoring (MRM) selecteert de quadrupool meerdere product ionen afkomstig van het precursor ion. (14) Er zullen twee transities gedetecteerd worden. De meest abundante transitie zal gebruikt worden voor kwantificatie, de transitie met een lagere intensiteit zal dienen voor de bepaling van de ion ratio.
Figuur 1.11 Weergave triple quadrupool massaspectrometer (15)
13
2
OBJECTIEVEN
Sinds enkele jaren is de populariteit van designerdrugs enorm gestegen. De omzeiling van de wetgeving en de afwezigheid van een standaard toxicologische methode voor de detectie van deze designerdrugs in bloed en urine spelen hierbij een belangrijke rol. Vandaar het belang voor de
ontwikkeling
van
een
methode
voor
het
screenen
van
synthetische
drugs.
Wanneer men wil achterhalen of iemand synthetische drugs heeft ingenomen wordt momenteel in het laboratorium Eurofins Forensics Belgium de analytische methode gaschromatografie massaspectrometrie-full scan (GC-MS-full scan) toegepast. Het nadeel hiervan is dat deze analyse enkel gebeurt op urine en maagvocht, in bloed is de concentratie echter te laag om te kunnen detecteren aan de hand van deze methode. Bovendien is deze methode gelimiteerd tot nietpolaire of vluchtige componenten, vereist het een complexe staalvoorbereiding en ook de vaak noodzakelijke derivatisatie zorgt ervoor dat deze methode niet de beste optie is. Vandaar wil men een methode ontwikkelen voor het screenen van designerdrugs. Het doel van het onderzoek is om na te gaan of de analytische methode die hier in het laboratorium in routine toegepast wordt voor de screening op de aanwezigheid van verdovende en psychotrope stoffen (o.a. geneesmiddelen en illegale drugs) ook toepasbaar is voor de designerdrugs. De analytische methode is UPLC-MS/MS in de modus multiple reaction monitoring (MRM). De analyse wordt voorafgegaan door een alkalische vloeistof-vloeistofextractie (LLE). De MS-condities voor de detectie van designerdrugs worden geoptimaliseerd en tot slot gevalideerd. Hierbij zal gebruik gemaakt worden van gecertificeerd referentiemateriaal (kwantitatieve bepaling) en door politiediensten in beslaggenomen producten waarin het actief bestanddeel werd geïdentificeerd door middel van GC-MS (kwalitatief). De volgende stappen werden hierbij uitgevoerd: Infuseren in de massaspectrometer van de synthetische cannabinoïden (JWH-210, JWH018, JWH-122, JWH-307, JWH-081, AM-2201, AM-2233, AM-694, WIN48.098, MAM2201, UR-144,
JWH-073,
THJ-018
en
HU210),
de
cathinonen
(methylbuphedrone,
methylmethcathinone, dimethylmethcathinone, pentedrone, butylone, pentylone, methylone, MDPV, naphyrone, β-ethylmethcathinone, cathinone en methedrone) en de andere designerdrugs (2C-I, phenibut, 5-IT, 4-fluoroamfetamine, diclazepam, 5-APB, psylocibine, etizolam, methoxphinidine, diphenidine, methoxetamine, bufotenine, 314
MeO-PCP, ocfentanil, PMMA en scopolamine). Dit om de transities en de optimale parameters voor MS (cone voltage en collisie energie) per component te bepalen. Vervolgens werden deze MRM-transities opgenomen in de routine screening methode. Bepalen van de retentietijden van de synthetische cathinonen en andere designerdrugs door injectie met de ‘in routine toegepaste’ methode. Voor de synthetische cannabinoïden werd als uitgangspunt de LC-condities voor de bepaling van THC gebruikt, waarvan de gradiëntelutie werd aangepast. Ook hiervan worden de retentietijden bepaald. Validatie van de in routine toegepaste methode voor de cathinonen en andere designerdrugs in bloed en urine. De parameters lineariteit, detectielimiet, carry-over, accuraatheid,
herhaalbaarheid,
reproduceerbaarheid,
matrixeffecten,
matrixinterferenties, interferenties afkomstig van andere analieten, extractierendement, specificiteit en de stabiliteit in de autosampler werden bepaald. Het voordeel van UPLC-MS/MS is dat het een snellere methode is omdat er niet hoeft gederivatiseerd te worden. Bovendien is deze methode gevoeliger. Het nadeel is dat er enkel specifiek gescreend wordt naar hetgeen je vermoedt dat in het staal aanwezig is. Vandaar dat er ook een full scan GC-MS moet uitgevoerd worden om op die manier ook de aanwezigheid van andere drugs te kunnen detecteren. Dit spectrum wordt dan vergeleken met het spectrum uit de bibliotheek. Aan de hand van het getal (‘qualifier’) die weergeeft in welke mate beide spectra overeenkomen, kun je bepalen of de drug al dan niet in het lichaamsvocht aanwezig is. Het is dus van belang om verschillende analytische methoden te combineren om een zo juist mogelijk resultaat te bekomen.
15
3 MATERIAAL EN METHODEN 3.1 MATERIAAL 3.1.1 Gebruikte apparatuur Analytische balans: AB135-S/FACT, Metler Toledo (Metler Toledo, Zaventem, België) Turbo Vap Lv Evaporator (Zymark, Hopkinton, Massachusetts, VS) Eppendorf AG, Centrifuge 5417 C/R (VWR, Haasrode, België) Vortexmixer: Top-mix 11118 (Fisher Bioblock Scientific, Doornik, België) Ultrasoonbad: Bransonic MT 5510, Branson (Branson Ultrasonics BV, Eemnes, Nederland) TQ-detector: (Waters, Milford, Massachusetts, VS) Waters ACQUITY UPLC system (Waters, Milford, Massachusetts, VS) Massaspectrometer Micromass Quattro (Waters, Milford, Massachusetts, VS) Softwarepakket bij UPLC-MS/MS: MassLynx v.4.1 Centrifuge (Jouan type B4i, St-Herblain, Frankrijk) Kolom: ACQUITY UPLC ® HSS C18 (150 mm x 2.1, 1.8 µm) Kolom: ACQUITY UPLC ® BEH C18 (100 mm x 2.1, 1.7 µm) 3.1.2 Gebruikte chemicaliën Acetonitrile p.a. (Fisher Chemical, Geel, België) lotnummer 1409087-T7 Methanol p.a. (Fisher Chemical, Geel, België) lotnummer 1219448-T1 Ultrapuur water (UPW) geproduceerd door Arium® 611 UV (Sartorius, Leuven, België) Mierenzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland) lotnummer K42964063-T1 Ammoniumformiaat (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, VS) lotnummer 052K1270-T1 Ammonium acetaat (VWR, Haasrode, België) lotnummer 10G160004-T1 β-glucuronidase (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, VS) lotnummer BCBL-1355V-T1 3.1.3 Aangemaakte reagentia Acetonitrile/methanol (1:1 v/v) werd aangemaakt door een gelijke hoeveelheid van
acetonitrile en methanol met elkaar te mengen. Acetonitrile/water (1:1 v/v) werd aangemaakt door een gelijke hoeveelheid van
acetonitrile en ultrapuur water met elkaar te mengen. 5 mM ammoniumformiaat buffer pH 3 (mobiele fase A methode cathinonen) werd
aangemaakt door 631 mg ammoniumformiaat af te wegen en dit kwantitatief over te
16
brengen in ongeveer 1,9 mL ultrapuur water. Vervolgens werd er 2,0 mL mierenzuur toegevoegd en werd dit aangelengd met ultrapuur water tot 2,0 L. 0,1 % mierenzuur in acetonitrile (mobiele fase B methode cathinonen) werd aangemaakt
door 1,0 mL mierenzuur over te brengen in 1000 mL acetonitrile. Seal wash (20 % methanol in UPW) werd aangemaakt door 200 mL methanol te mengen
met 800 mL ultrapuur water. De reconstitutie oplossing voor UPLC/MS-screening werd aangemaakt door 435 mL 5mM
ammoniumformiaat buffer pH 3 over te brengen in een fles van 500 mL. Vervolgens werd 65 mL 0,1 % mierenzuur in acetonitrile toegevoegd. 0,05 % mierenzuur in 5 mM ammoniumacetaat (mobiele fase A methode synthetische
cannabinoïden) werd aangemaakt door 771 mg ammoniumacetaat af te wegen en kwantitatief over te brengen in 1,9 L ultrapuur water en te mengen. Vervolgens werd 1,0 mL mierenzuur toegevoegd en aangelengd tot 2,0 L met ultrapuur water. De interne standaardmix voor de screening in bloed werd aangemaakt door 10 µL
cocaïne-d3 (100 µg/mL), codeïne-d3 (100 µg/mL), MDMA-d5 (100 µg/mL) en MBDB-d5 (100 µg/mL) en verschillende andere interne standaarden die in de routine methode gebruikt worden, over te brengen in een maatkolf van 5 mL en deze aan te lengen met acetonitrile tot 5,0 mL. Zo bekomt men een interne standaardmix van 0,2 µg/mL. De interne standaardmix voor de screening in urine werd aangemaakt door 150 µL
cocaïne-d3 (100 µg/mL), 301 µL codeïne-d3 (100 µg/mL) en verschillende andere interne standaarden die in de routine methode gebruikt worden, over te brengen in een maatkolf van 5 mL en aan te lengen tot 5,0 mL met acetonitrile. Zo bekomt men een concentratie van 3 µg/mL voor cocaïne-d3 en een concentratie van 6,02 µg/mL voor codeïne-d3. 3.1.4 Gecertificeerde standaarden en interne standaarden Alle gecertificeerde standaarden en interne standaarden werden bewaard in de diepvries. De gecertificeerde standaarden MDPV (lotnummer FE071612-01), Naphyrone (lotnummer FN02271401), Pentylone (lotnummer FE060712-03), Butylone (lotnummer FN030211-02), Methedrone (lotnummer FEO50412-02), Bufotenine (lotnummer FE011408-01), Cathinone (lotnummer FE020108-01), HU-210 (lotnummer FE113011-02-T1) en JWH-073 (lotnummer FO82712-05) werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (Cerilliant, Saint-Louis, VS).
17
De gecertificeerde standaarden β-ethylmethcathinone (lotnummer 9851), 5-APB (lotnummer 11953) en 3-MeO-PCP (lotnummer 13925), JWH-210 (lotnummer 12-D-12-T1), JWH-018 (lotnummer MO60.910-4-T1) werden aangekocht bij LGC group (Luckenwalde, Germany). De interne standaarden codeïne-d3 (lotnummer 35004-90M), cocaïne-d3 (lotnummer FE 080607-03), MDMA-d5 (lotnummer FE080508-02) en MDBD-d5 (lotnummer 31334-57H-T2) werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (Cerilliant, Saint-Louis, VS).
3.2 METHODEN 3.2.1 UPLC-MS/MS toestel 3.2.1.1
Algemene instellingen methode cathinonen en andere designerdrugs
Het UPLC-toestel dat in dit onderzoek gebruikt wordt is het Waters ACQUITY UPLC ® system (Waters, Milford, Massachusetts, VS). De kolom voor het screenen van de cathinonen en andere designerdrugs is een ACQUITY UPLC ® HSS C18 (150 mm x 2.1, 1.8 µm). De kolomtemperatuur bedraagt 50 °C en de temperatuur van de autosampler bedraagt 10 °C. Er wordt telkens 10 µL van het staal op de UPLC-kolom geïnjecteerd. Nadat de componenten van de kolom geëlueerd zijn worden ze doorgelaten naar de MS, waar de spanning op de tip van de capillair 3,4 kV bedraagt. De temperatuur in de bron wordt ingesteld op 150 °C, de desolvatatietemperatuur op 350 °C. De flow van het gas naar de cone en deze voor de verdamping bedragen respectievelijk 50 en 800 L/hr. De cone voltage en de collisie energie worden per component geoptimaliseerd. 3.2.1.2 Algemene instellingen methode synthetische cannabinoïden Voor het screenen van de synthetische cannabinoïden wordt gebruik gemaakt van een ACQUITY UPLC ® BEH C18 (100 mm x 2.1, 1.7 µm) kolom. De kolomtemperatuur en de temperatuur in de autosampler bedragen respectievelijk 30 °C en 10 °C. Er wordt telkens 30 µL van het staal op de UPLC kolom geïnjecteerd. Nadat de componenten van de kolom geëlueerd zijn worden ze doorgelaten naar de MS, waar de spanning op de tip van de capillair 3,0 kV bedraagt. De temperatuur in de bron bedraagt net zoals bij de cathinonen 150 °C, de desolvatatietemperatuur wordt ingesteld op 400 °C. De flow van het gas naar de cone en deze voor verdamping bedragen respectievelijk 20 en 800 L/hr. De cone voltage en de collisie energie worden ook voor de synthetische cannabinoïden per component geoptimaliseerd door tuning. 18
3.2.1.3 Infusie experiment Het gecertificeerd referentiemateriaal, die allen een concentratie van 1 mg/mL hebben, werd verdund tot een gehalte van 250 ng/mL in een mengsel van acetonitrile/water (1:1 v/v). Vanuit de door politiediensten in beslag genomen producten (kruidenmix en poeders) werd 10 mg van de kruiden en 50 mg van de poeders afgewogen en geëxtraheerd met respectievelijk 10 mL en 5 mL acetonitrile/methanol (1:1 v/v), dit werd 10 minuten in een ultrasoonbad geplaatst en vervolgens gedurende 2 minuten gevortext. (16) De poeders werden beschouwd als 100 % actieve stof, de oplossing in acetontrile/methanol werd verder verdund met acetonitrile/water om een hypothetische concentratie van 250 ng/mL te bekomen. De concentratie van het actieve bestanddeel in de kruiden is niet gekend, hierbij werd er 200 keer verdund. De exacte concentratie is niet van belang bij het infuseren. Wel is het belangrijk dat concentratie niet te laag is omdat de componenten anders niet kunnen gedetecteerd worden. Om de transities te bepalen en om de optimale parameters voor MS (cone voltage en collisie energie) per component vast te leggen werden deze verdunningen rechtstreeks geïnfuseerd in de massaspectrometer. Hiervoor werden de moleculaire gewichten en de transities van alle componenten opgezocht in de literatuur, die als basis gebruikt werden voor het infusie experiment. In eerste instantie wordt enkel gewerkt onder API/ESI+, hierdoor ontstaan er positief geladen precursor ionen (MG + 1). Nu kan de exacte m/z-waarde van het precursor ion bepaald worden. Bovendien worden voor elk component de massaspectrometrische parameters (cone voltage en collisie energie) geoptimaliseerd door tuning, de algemene MS-parameters blijven gedurende de tuning voor alle componenten gelijk. Het is de bedoeling om deze parameters zo te kiezen dat er signalen bekomen worden met de hoogste intensiteit. Voor het precursor ion wordt de cone voltage vastgelegd waarbij de piek het meest gevoelig is. Vervolgens wordt het collision gas aangelegd. Door de energie die op het precursor ion gebracht wordt, zal het precursor ion gefragmenteerd worden in dochterionen, ook wel collision-induced dissociation (CID) genoemd. De twee meest abundante fragment ionen worden geselecteerd en de m/z-waarden worden afgelezen. Voor elke dochterpiek wordt de optimale collisie energie bepaald. Dit is de energie waarbij het meest intense signaal bekomen wordt. Bij een te hoge collisie energie zal het precursor ion volledig gefragmenteerd worden, bij een te lage collisie energie zal de energie te laag zijn om dochterionen te kunnen vormen. Het meest abundante 19
fragment ion zal gebruikt worden voor de kwantificatie, het andere fragment ion wordt gebruikt om de ion ratio te bepalen ter identificatie. Bijlagen 1, 2 en 3 geven een overzicht van de transities, de cone voltage en de collisie energie voor respectievelijk de cathinonen, de andere designerdrugs en de synthetische cannabinoïden. 3.2.1.4 LC-condities cathinonen en andere designerdrugs Er wordt gebruik gemaakt van vloeistof-vaste fase chromatografie (LSC), hierbij is de stationaire fase een adsorbens, de mobiele fase is een vloeistof. Het gaat hier om een reversed phase (RP) chromatografie. Dit wil zeggen dat de kolom bestaat uit een apolair adsorbens, dit wordt gecombineerd met een polaire (minder apolaire) mobiele fase. De kolom die hier gebruikt wordt is een ACQUITY UPLC ® HSS C18 (150 mm x 2.1, 1.8 µm). Deze bestaat uit silica partikels chemisch gemodificeerd met C18 ketens. De flow van de mobiele fase bedraagt 0,4 mL/min. Er wordt gebruik gemaakt van een gradiëntelutie met mobiele fase A en mobiele fase B. De mobiele fase A is 5 mM ammoniumformiaat buffer pH 3, als mobiele fase B wordt 0,1 % mierenzuur in ACN gebruikt. In tabel 3.1 wordt de gradiëntelutie weergegeven. Door het geleidelijk aan overschakelen van een zwakker eluens naar een sterker eluens zal de mobiele fase meer apolair worden. Hierdoor zal de affiniteit van de componenten voor de SF en voor de MF niet meer veel verschillen en zullen ook de meest apolaire componenten van de kolom loskomen, overgaan naar de mobiele fase en van de kolom elueren. De voordelen van het gebruik van een gradiëntelutie zijn een kortere analysetijd, een betere scheiding en een toename van de gevoeligheid. De totale analyse per run duurt 15 minuten. Tabel 3.1 Gebruikte gradiëntelutie methode cathinonen
Tijd (min) initieel 0,50 10,00 10,75 12,25 12,50 15,00
% Mobiele fase A % Mobiele fase B 87,00 13,00 87,00 13,00 50,00 50,00 5,00 95,00 5,00 95,00 87,00 13,00 87,00 13,00
Nu de transities, de cone voltage en de collissie energie voor de cathinonen en andere designerdrugs vastgelegd zijn moeten de retentietijden nog bepaald worden over welke de MS de transities moet zoeken. Hiervoor werden alle cathinonen en andere designerdrugs 20
afzonderlijk geïnjecteerd met de ‘in routine toegepaste’ methode. Het tijdsinterval [RT ± 0,5 min.] waarover de MS de transities moet volgen werd ingegeven in de MS-methode. Bijlage 1 en 2 geven een overzicht van de retentietijden van respectievelijk de cathinonen en de andere designerdrugs. 3.2.1.5 LC-condities synthetische cannabinoïden Ook hier wordt gebruik gemaakt van een reversed phase chromatografie. De kolom die gebruikt wordt is een ACQUITY UPLC ® BEH C18 (100 mm x 2.1, 1,7 µm). De kolommen kunnen een druk aan tot 18000 psi (1241 bar) en zijn dan ook speciaal ontwikkeld voor UPLC. (http://www.waters.com/webassets/cms/support/docs/715001371.pdf) De flow van de mobiele fase bedraagt 0,350 mL/min. Er wordt gebruik gemaakt van een gradiëntelutie met als mobiele fase A, 0,05 % mierenzuur in 5 mM ammoniumformiaat en als mobiele fase B, methanol. In tabel 3.2 is de gradiëntelutie weergegeven. De totale analysetijd per run duurt 10 minuten. Tabel 3.2 Gebruikte gradiëntelutie synthetische cannabinoïden
Tijd (min) % Mobiele fase A % Mobiele fase B 0,00 30,00 70,00 0,50 30,00 70,00 4,00 10,00 90,00 6,00 10,00 90,00 8,00 30,00 70,00 10,00 30,00 70,00
Vervolgens werden de retentietijden van de synthetische cannabinoïden bepaald over welke de MS de transities moet zoeken, deze zijn weergegeven in bijlage 3. De retentietijden werden ingegeven in de MS-methode met een tijdsinterval van RT ± 0,5 min. 3.2.2 Methodevalidatie synthetische cathinonen Nu alle transities, retentietijden en MS-parameters geprogrammeerd zijn in de ‘in routine toegepaste’ UPLC-MS/MS methode voor de screening van drugs, kan de daarbij ‘in routine toegepaste’ alkalische vloeistof-vloeistofextractie (LLE) en chromatografische methode geëvalueerd worden. Deze zal toegepast worden als screeningsmethode ten opzichte van een cut-off waarde.
21
De validatie gebeurt in bloed, waarbij de cut-off waarde 10 ng/mL bedraagt, en in urine met een cut-off waarde van 200 ng/mL (17). Er wordt hierbij gebruik gemaakt van de gecertificeerde referentiestandaarden methedrone, MDPV, naphyrone, pentylone, butylone, 5-APB, 3-MeOPCP, β-ethylmethcathinone, cathinone en bufotenine. Waar mogelijk zal een geschikte gedeutereerde component gebruikt worden als interne standaard (IS). Deze compenseert voor alle oncontroleerbare variabelen gedurende de chromatografie. Om optimaal te corrigeren voor deze oncontroleerbare parameters moet de IS zich zoveel mogelijk gelijk gedragen als de component. Aan de hand van de retentietijden van de gecertificeerde standaarden werd per component een gedeutereerde interne standaard gekozen. Gedeutereerde analogen van de boven vernoemde componenten zijn evenwel niet beschikbaar in het laboratorium. In bloed werd voor de component naphyrone externe standaardisatie toegepast, aangezien geen geschikte interne standaard beschikbaar was. In urine werd voor de componenten methedrone, butylone, 5-APB, naphyrone en bufotenine ook gebruik gemaakt van externe standaardisatie aangezien de ijklijnen zonder toevoegen van interne standaard betere resultaten gaven. 3.2.2.1 Validatie in bloed Er wordt een standaardmix werkoplossing gemaakt van 0,4 µg/mL. De referentiestandaarden hebben allen een concentratie van 1 mg/mL, opgelost in ACN of methanol. Deze moeten dus 2500 keer verdund worden in ACN. Er wordt van elke referentiestandaard 10 µL in een maatkolf van 25 mL overgebracht, daarna wordt er aangelengd met ACN tot 25,0 mL en tenslotte wordt er goed gevortext. Dit wordt twee keer aangemaakt, de ene oplossing dient ter controle, de andere dient voor de kalibratie. Staalvoorbereiding: vloeistof-vloeistofextractie Aangezien de matrix ‘bloed’ te complex is (erytrocyten, leukocyten, trombocyten, plasma en water) voor directe instrumentele analyse moet deze onderworpen worden aan een staalvoorbereiding. De complexe samenstelling van het bloed zou interferenties kunnen veroorzaken, verder kan het ook zorgen voor beschadiging van de apparatuur (vb. verstopping van de kolom) of kan het staal hierdoor te verdund zijn. De staalvoorbereiding in deze masterproef is een alkalische vloeistof-vloeistofextractie die hier in routine toegepast wordt bij het screenen van psychotrope en verdovende stoffen in bloed. De algemene procedure voor de behandeling van de stalen wordt hieronder in detail beschreven. 22
Aan 200 µL bloed wordt 1,0 mL UPW en 10 µL van de gedeutereerde interne standaardmix toegevoegd. Vervolgens wordt hieraan 100 µL verzadigd waterstofcarbonaat en 3,0 mL van het extractiesolvent, chloroform/isopropanol (95:5), toegevoegd. Dit wordt gedurende 30 seconden gevortext. Daaropvolgend worden de stalen gedurende 10 minuten in de centrifuge geplaatst op 3000 g. Daarna wordt de bovenste waterige fase afgezogen met behulp van een pasteurpipet aangesloten op een vacuümpomp. Vervolgens wordt de vaste fase losgemaakt door de proefbuis tegen de tafel te tikken, zo kan de onderste organische fase overgegoten worden in een propere proefbuis. Aan deze proefbuizen wordt 50 µl 10 % HCl in methanol toegevoegd en deze worden drooggedampt in de evaporator. Vervolgens wordt dit opgelost in 150 µL reconstitutie oplossing, er wordt goed gevortext en de proefbuizen worden opnieuw gecentrifugeerd gedurende 5 minuten. Dit wordt overgegoten in een eppendorf cupje en ook deze worden 5 minuten gecentrifugeerd. Als laatste wordt de bovenste vloeistof in het eppendorf cupje overgebracht in een vial met insert. Deze stalen kunnen nu geïnjecteerd worden voor analyse. Kalibratiemodel (lineariteit): Het kalibratiemodel geeft het verband weer tussen de relatieve respons en de concentratie van de kalibratiestandaarden. De relatieve respons is de verhouding van de piekoppervlakte van de component t.o.v. de piekoppervlakte van de IS, vermenigvuldigt met de concentratie van de IS aanwezig in de kalibratiestandaarden (10 ng/mL). Dit verband moet lineair zijn, de lineariteit moet aangetoond worden om betrouwbare kalibratiecurven te garanderen. Bij naphyrone wordt de piekoppervlakte uitgezet ten opzichte van de concentratie aangezien hier externe standaardisatie wordt toegepast. Het kalibratiemodel is opgebouwd uit 5 kalibratiepunten, 0; 5; 10; 25 en 124 ng/mL. Deze kalibratiestandaarden worden bereid door 10 µL gedeutereerde interne standaardmix en respectievelijk 0; 2,5; 5; 12,5 en 62 µL van de werkoplossing (0,4 µg/mL) toe te voegen aan 200 µL blanco bloed met behulp van een Hamilton spuit en vervolgens te extraheren zoals hiervoor beschreven. Er werden telkens 2 controlestalen van 0 en 10 ng/mL meegenomen. In routine zal deze methode gebruikt worden als screeningsmethode, waarbij een rapporteringsgrens van 10 ng/mL gehanteerd wordt. De teruggevonden waarde voor de controle van 10 ng/mL wordt geëvalueerd ten opzichte van de grenzen van een Shewart controlekaart. Door lineaire regressie wordt de best passende rechte door de 5 kalibratiepunten bepaald. De correlatiecoëfficiënt (R2) van deze rechte bepaalt of de kalibratiecurve voldoet aan de eisen. Deze 23
moet groter zijn dan 0,995. Bovendien mogen de berekende waarden van de kalibratiestandaarden bepaald op de kalibratiecurve maximaal 20 % afwijken van de theoretische waarde en moet het residuplot een normale verdeling hebben rond de x-as. Het opstellen van het kalibratiemodel wordt 5 maal uitgevoerd. (18) Detectielimiet (LOD): De detectielimiet is de laagste hoeveelheid die met een bepaalde zekerheid kan gemeten worden en onderscheiden kan worden van de signaal-ruisverhouding. Op basis van de 5 opgestelde kalibratiecurven kan aan de hand van de standaarddeviatie (SD) van het snijpunt met de y-as (het intercept) en de gemiddelde richtingscoëfficiënt van de 5 kalibratievergelijkingen de LOD berekend worden. De LOD moet kleiner of gelijk zijn aan 10 ng/mL. (18) 𝐿𝑂𝐷 =
3,3 𝑥 𝑆𝐷 𝑠𝑛𝑖𝑗𝑝𝑢𝑛𝑡 𝑦−𝑎𝑠
(3.1)
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑟𝑖𝑐𝑜
Accuraatheid (% bias): De accuraatheid wordt bepaald door drie keer 200 µL bloed te beladen met 5 µL van de standaardmix werkoplossing en 10 µL van de interne standaardmix zodat er een concentratie van 10 ng/mL bekomen wordt. Deze stalen worden geanalyseerd in 5 verschillende runs op 5 verschillende dagen. De bias mag niet groter zijn dan ± 20 %. (18) Deze wordt berekend aan de hand van de volgende formule (3.2): 𝐵𝑖𝑎𝑠 (%) =
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒𝑙𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐.−𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐.
𝑥 100
(3.2)
De experimentele concentratie is de concentratie berekend op basis van de ijklijn, de nominale concentratie is de theoretische waarde. Precisie: Ook de precisie kan berekend worden uit de gegevens bekomen bij de bepaling van de accuraatheid en wordt uitgedrukt als variatiecoëfficiënt (CV %). Er wordt een onderscheid gemaakt
tussen
within-run
precisie
(herhaalbaarheid)
en
between-run
precisie
(reproduceerbaarheid), deze worden berekend aan de hand van de formules 3.3 en 3.4. Voor de bepaling
van
de
herhaalbaarheid
worden
de
analyses
uitgevoerd
onder
herhaalbaarheidsvoorwaarden. Dit wil zeggen dat de analyses moeten gebeuren door dezelfde uitvoerder en onder dezelfde omstandigheden. De waarden hiervan mogen beiden niet groter zijn dan 20 %. (18)
24
Within-run precisie:
𝑆𝐷 𝑠𝑖𝑛𝑔𝑙𝑒 𝑟𝑢𝑛
𝐶𝑉 (%) = 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑏𝑒𝑟𝑒𝑘𝑒𝑛𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐.
Between-run precisie: 𝐶𝑉 (%) =
𝑠𝑖𝑛𝑔𝑙𝑒 𝑟𝑢𝑛
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑆𝐷 5 𝑟𝑢𝑛𝑠 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑏𝑒𝑟𝑒𝑘𝑒𝑛𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐. 5 𝑟𝑢𝑛𝑠
𝑥 100
𝑥 100
(3.3)
(3.4)
Overdracht (carry-over): Om na te gaan of de methode vrij is van carry-over wordt na de hoogste kalibrator een blanco geanalyseerd. Dit wordt bevestigd door een drievoudige analyse. Het signaal van de blanco mag niet groter zijn dan 10 % van het signaal van de laagste kalibrator. (18) Het carry-over effect zou vals positieve resultaten kunnen veroorzaken doordat, na het injecteren van een staal met een hoge concentratie, bij het volgende staal nog een bepaalde hoeveelheid van de componenten van het voorgaande staal gemeten wordt. Matrixeffecten: De componenten van de matrix kunnen in competitie treden voor ionisatie met de te bepalen componenten wanneer deze op hetzelfde moment uit de kolom elueren. Het is belangrijk om de matrixeffecten na te gaan aangezien deze aanleiding kunnen geven tot ion suppressie/verhoging. (18) Er worden twee reeksen oplossingen aangemaakt waarbij in vijf vials 10 µL gedeutereerde interne standaardmix toegevoegd wordt. Vervolgens wordt er een bepaalde hoeveelheid van de werkoplossing toegevoegd om een concentratie te bekomen van 0; 5; 10; 25 en 124 ng/mL. Hieraan wordt 50 µl HCl in methanol toegevoegd en drooggedampt in de evaporator. De eerste reeks wordt opgelost in 150 µL mobiele fase. De tweede reeks wordt opgelost in 150 µL homogene pool. Doordat de componenten maar toegevoegd worden na extractie ondervinden deze geen invloed van de extractieprocedure en wordt hier zuiver het effect van de matrix nagegaan. Deze homogene pool wordt bekomen door 14 proefbuizen met 200 µL bloed te extraheren zoals hierboven beschreven. Hieraan wordt 50 µl HCL in methanol toegevoegd en drooggedampt in de evaporator. Dit wordt vervolgens opgelost in 150 µl mobiele fase. Deze 14 geëxtraheerde blanco bloedstalen worden samengevoegd in één proefbuis en gevortext. Vervolgens wordt dit gedurende 5 minuten gecentrifugeerd en daarna overgebracht in een eppendorfcupje om opnieuw 5 minuten te centrifugeren.
25
De piekoppervlakten van de stalen opgelost in de matrix worden vergeleken met de piekoppervlakten van de oplossingen die rechtstreeks geïnjecteerd zijn. Als deze waarde positief is dan is er ion verhoging afkomstig van de matrix. Wanneer de waarde negatief is dan is er ion suppressie. Dit wordt zowel berekend voor de gecertificeerde standaarden als voor de gedeutereerde interne standaarden. De ion suppressie/verhoging wordt berekend aan de hand van formule 3.5, de uitkomst hiervan mag niet groter zijn dan ± 25 % (18) 𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥
% 𝑖𝑜𝑛 𝑠𝑢𝑝𝑝𝑟𝑒𝑠𝑠𝑖𝑒/ 𝑣𝑒𝑟ℎ𝑜𝑔𝑖𝑛𝑔 = ((𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑚𝑜𝑏𝑖𝑒𝑙𝑒 𝑓𝑎𝑠𝑒) − 1) 𝑥 100
(3.5)
Matrixinterferenties: Om de afwezigheid van interferenties afkomstig van de matrix op de componenten aan te tonen worden vijf blanco bloedstalen (200 µL) afkomstig van verschillende bronnen met toevoeging van 10 µl interne standaard geëxtraheerd en geanalyseerd. De interne standaard wordt toegevoegd om er zeker van te zijn dat de injectie gelopen is. Indien er bij de componenten geen pieken worden waargenomen wil dit zeggen dat de methode vrij is van interferentie ten gevolge van de matrix. Om na te gaan of de matrix interfereert met de interne standaarden worden 5 blanco bloedstalen (200 µL) afkomstig van verschillende bronnen met 5 µl werkoplossing geëxtraheerd en geanalyseerd. Hier werden de componenten toegevoegd om te kunnen aantonen dat de injectie wel degelijk is doorgegaan. Indien er geen pieken te zien zijn bij de interne standaarden is de methode vrij van interferentie ten gevolge van de matrix. Interferenties afkomstig van andere analieten: Van de 5 stockoplossingen UPLC mix (92 componenten), standaardmix benzo’s (24 componenten), anti-epileptica (22 componenten); anti-diabetica en paracetamol, gedeutereerde drugs (7 componenten) en standaardmix stockoplossing (119 componenten), werd telkens een hoeveelheid aan de mobiele fase toegevoegd zodat de concentratie van de componenten 500 ng/mL bedraagt. Na het conditioneren van de UPLC-MS/MS werden de stalen geïnjecteerd om na te gaan of deze interfereren met de te bepalen componenten. Indien er geen pieken waargenomen worden bij deze componenten is de methode vrij van interferentie afkomstig van andere analieten. Extractierendement (terugvinding, recovery): Het extractierendement in bloed werd bepaald door 2 reeksen aan te maken. De ene reeks (n = 6) werd aangemaakt door 5 µL standaardmix werkoplossing toe te voegen aan zes verschillende 26
vials, hieraan werd 50 µL HCl in methanol toegevoegd, drooggedampt en vervolgens opgelost in 150 µL reconstitutie oplossing. Zo bekom je een concentratie van 10 ng/mL. De tweede reeks (n = 6) werd aangemaakt door 200 µL UPW water te beladen met een concentratie van 10 ng/mL met de standaardmix werkoplossing, deze werden geëxtraheerd zoals hoger beschreven. Beide reeksen werden geïnjecteerd en geanalyseerd. Het rendement werd berekend door de verhouding te nemen van de piekoppervlakte na extractie ten opzichte van de piekoppervlakte van de niet geëxtraheerde stalen. Deze laatste kan als 100 % beschouwd worden, zonder verlies afkomstig van de extractieprocedure. Door het gebruik van UPW in plaats van blanco bloed worden de matrixeffecten niet meebepaald en wordt enkel het effect van de extractieprocedure geëvalueerd. 𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 (%) =
𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝𝑣𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑛𝑎 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑒 𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝𝑣𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑀𝐹
𝑥 100
(3.6)
3.2.2.2 Validatie in urine Er wordt een standaarmix werkoplossing gemaakt van 4 µg/mL. De referentiestandaarden methedrone,
MDPV,
naphyrone,
pentylone,
butylone,
5-APB,
3-MeO-PCP,
β-
ethylmethcathinone, 5-IT hebben een concentratie van 1 mg/mL, opgelost in ACN of methanol. Deze moeten dus 250 keer verdund worden in ACN. Er wordt van elke referentiestandaard 40 µL overgebracht in een maatkolf van 10 mL, deze wordt daarna aangelengd met ACN tot 10 mL en tenslotte wordt er gevortext. Deze werkoplossing wordt twee keer aangemaakt, de ene dient ter controle, de andere dient voor de kalibratie. Staalvoorbereiding: vloeistof-vloeistofextractie De blanco urinestalen worden na het toevoegen van de componenten en de interne standaarden gedurende 2 uur in een warmwaterbad van 56 °C geplaatst voor enzymatische hydrolyse, aangezien de componenten in de urine kunnen voorkomen in hun geglucuronideerde vorm. Hiervoor wordt er 10 µL Na-acetaat trihydraat 2 M (pH = 4,5) en 10 µL β-glucuronidase (136000 units/mL) toegevoegd. De buffer zorgt voor een pH waarbij het enzym β-glucuronidase optimaal werkt. Vervolgens worden de stalen geëxtraheerd, de alkalische vloeistof-vloeistofextractie verloopt identiek als deze toegepast bij bloed, het enige verschil is dat hier geen 100 µL maar 200 µL verzadigd waterstofcarbonaat aan toegevoegd wordt.
27
Lineariteit : Het kalibratiemodel is opgebouwd uit vier kalibratiepunten 0 %, 75 % (150 ng/mL), 100 % (200 ng/mL) en 125 % (250 ng/mL) van de cut-off waarde. Deze kalibratiestandaarden werden bereid door 10 µL gedeutereerde interne standaardmix en respectievelijk 0; 7,5; 10 en 12;5 µL van de werkoplossing standaardmix (4 µg/mL) toe te voegen aan 200 µL urine met behulp van een Hamilton spuit en vervolgens te extraheren. Er werden telkens twee controles meegenomen van 0 % en 100 %. Dit wordt vijfvoudig uitgevoerd. Aangezien het voor urine slechts een screeningsmethode is, wordt enkel de lineariteit rond de cut-off waarde geëvalueerd en zijn deze 4 kalibratiepunten voldoende. De correlatiecoëfficiënt moet groter zijn dan 0,990; het residuplot moet een normale verdeling hebben rond de x-as en de concentratie van de kalibratoren berekend op de curve mag niet meer dan 20 % afwijken van de werkelijke waarde om te kunnen spreken van lineariteit. (18) Andere validatieparameters: De parameters accuraatheid, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid, extractierendement, matrixeffecten en de matrixinterferenties werden op dezelfde manier bepaald als de validatie in bloed maar dan op de cut-off waarde van 200 ng/mL. Om na te gaan of de methode vrij is aan carry-over werd na de hoogste kalibrator een blanco geanalyseerd. Ook deze validatie gebeurde volgens de richtlijnen van de Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX). 3.2.2.3 Controle van de werking van de autosampler: herhaalbaarheid van de injectie Om de herhaalbaarheid van de injectie na te gaan werd 50 µL van de standaardmix werkoplossing toegevoegd aan een vial. Dit werd, na toevoegen van 50 µL HCl in methanol, droog gedampt in de evaporator, en vervolgens werd 1500 µL reconstitutie oplossing toegevoegd, zo bekomen we een oplossing met een concentratie van 10 ng/mL. Deze vial werd zes maal achtereenvolgens geïnjecteerd, uit de bekomen piekoppervlakten werd de relatieve standaarddeviatie berekend. 3.2.2.4 Stabiliteit in de autosampler Om te controleren of de componenten in een vial stabiel blijven in de autosampler (10 °C ) werd op dezelfde manier te werk gegaan als hierboven beschreven bij de controle van de autosampler. Deze vial werd eerst zes maal geïnjecteerd met een tijdsinterval van 15 minuten om de spreiding op de injectie te controleren, daarna werd er overgeschakeld naar een tijdsinterval van 30 minuten. De stabiliteit wordt nagegaan door de afwijking te bepalen van de absolute respons op
28
ieder tijdstip ten opzichte van de absolute respons op tijdstip 0. De afwijking hierbij mag niet groter zijn dan 20 %. 3.2.2.5 Specificiteit Om na te gaan of de andere componenten uit de MS-methode interfereren met de 10 componenten waarmee we de validatie hebben uitgevoerd, worden alle synthetische cathinonen en andere designerdrugs afzonderlijk opgelost in mobiele fase, geïnjecteerd en geanalyseerd. Vervolgens werd gekeken of er bijvoorbeeld voor methedrone enkel een piek te zien is bij deze component; indien voor methedrone ook bij andere componenten pieken aanwezig waren, werden de identificatiecriteria gecontroleerd. Om geïdentificeerd te worden als een bepaald component mag de retentietijd van deze component niet meer dan 2,5 % afwijken van de gemiddelde retentietijd bekomen uit een standaardcurve van deze component. Bovendien moet ook de afwijking van de ion ratio binnen bepaalde grenzen liggen, de richtlijnen hiervoor zijn Relatieve intensteit Toegestane grenzen voor LC-MS/MS > 50 % ± 20 % > 20 % - 50 % ± 25 % > 10 % - 20 % ± 30 % ≤ 10 % ± 50 %
weergegeven
in
tabel
3.3.
De
identificatiecriteria zijn beschreven in het commissiebesluit 2002/657/EC.
Tabel 3.3 Toegestane grenzen afwijking ion rato ter identificatie
3.2.3 Methodevalidatie synthetische cannabinoïden Nu alle transities, retentietijden en MS-parameters vastgelegd zijn en geprogrammeerd zijn in de ontwikkelde methode, kan de daarbij toegepaste alkalische vloeistof-vloeistofextractie en de chromatografische methode gevalideerd worden. Er wordt hierbij gebruik gemaakt van de gecertificeerde referentiestandaarden JWH-073, HU-210, JWH-210 en JWH-018. 3.2.3.1 Validatie in bloed Er wordt een standaardmix werkoplossing gemaakt van 0,4 µg/mL. De referentiestandaarden JWH-210 en JWH-018 hebben een concentratie van 1 mg/mL. Deze moeten dus 2500 keer verdund worden in ACN. De referentiestandaarden HU-210 en JWH-073 hebben een concentratie van 100 µg/mL en moeten 250 keer verdund worden. Van de referentiestandaarden JWH-210 en JWH-018 wordt 10 µL in een maatkolf van 25 mL overgebracht, van de referentiestandaarden HU-210 en JWH-073 wordt 100 µL in de maatkolf gebracht. Daarna wordt er aangelengd met ACN tot 25 mL en tenslotte wordt er goed gevortext. Dit wordt twee keer aangemaakt, de ene dient ter controle, de andere dient voor de kalibratie. Wegens gebrek aan tijd kon de validatie van deze methode niet meer uitgevoerd worden. 29
4 RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1 METHODEVALIDATIE CATHINONEN EN ANDERE DESIGNERDRUGS IN BLOED 4.1.1 Lineariteit De gegevens van de vijf runs werden gecombineerd in één enkele kalibratiecurve. De figuren 4.1, 4.2 en 4.3 geven de kalibratiecurven en de correlatiecoëfficiënten weer van methedrone (MDMA-d5), butylone (MDMA-d5), pentylone (cocaïne-d3), 3-MeO-PCP (cocaïne-d3), cathinone (codeïne-d3), bufotenine (codeïne-d3), MDPV (cocaïne-d3), β-ethylmethcathinone (cocaïne-d3), 5-APB (MBDB-d5) en bufotenine. Hierbij is de gemiddelde relatieve respons van de vijf runs
Kalibratiecurve 3-MeO-PCP, cathinone en bufotenine
500
3-MeO-PCP
400
cathinone
Bufotenine
y = 3,2597x - 10,604 R² = 0,9979
300
Kalibratiecurve methedrone, butylone en pentylone
50
Gemiddelde relatieve respons
Gemiddelde relatieve respons
uitgezet ten opzichte van de concentratie.
Methedrone
Pentylone
y = 0,3246x - 0,1807 R² = 0,9996
y = 0,3679x - 0,0191 R² = 0,9999
30
y = 1,9174x - 11,114 R² = 0,9899
20
200 y = 0,3504x + 0,4296 R² = 0,9993
100
0
20
40
60
80
concentratie (ng/mL)
100
0
120
Figuur 4.1 Kalibratiecurve 3-MeO-PCP, cathinone en bufotenine
y = 0,1851x - 0,2445 R² = 0,9998
10
0
0
20
B-ethylmethcathinone
5-APB
100 y = 0,8896x + 0,3906 R² = 0,9998
80 60
y = 0,1887x + 0,0957 R² = 0,9997
40 20
y = 0,1709x - 0,3024 R² = 0,9993
0 0
20
40
60
80
100
60
80
100
concentratie (ng/mL)
120
Kalibratiecurve naphyrone Gemiddelde piekoppervlakte
MDPV
120
40
Figuur 4.2 Kalibratiecurve methedrone, butylone en pentylone
Kalibratiecurve MDPV, βethymethcathinone en 5-APB Gemiddelde relatieve respons
Butylone
40
300000
naphyrone
250000 200000 150000 y = 2108,9x + 1196,1 R² = 0,9997
100000 50000 0 0
120
20
40
60
80
100
concentratie (ng/mL)
concentratie (ng/mL) Figuur 4.3 Kalibratiecurve MDPV, β-ethylmethcathinone en 5-APB
Figuur 4.4 Kalibratiecurve Naphyrone
30
120
Figuur 4.4 geeft de kalibratiecurve weer van naphyrone. Doordat er bij naphyrone geen interne standaardisatie wordt toegepast, werd hierbij de gemiddelde piekoppervlakte uitgezet ten opzichte van de concentratie. Methedrone, MDPV, 3-MeO-PCP, cathinone, naphyrone, methedrone, butylone, pentylone en βethylmethcathinone hebben een correlatiecoëfficiënt die groter is dan 0,995. Bovendien kon uit het residu plot voor elke component afgeleid worden dat de residuen een normale verdeling hebben rond de x-as. Hieruit kan besloten worden dat er een lineair verband is tussen de relatieve respons en de concentratie. Naphyrone daarentegen heeft slechts een correlatiecoëfficiënt van 0,9899 (< 0,995) en voldoet hiermee niet aan de vooropgestelde eisen. Ook de vereiste dat de berekende waarde van ieder kalibratiepunt niet meer dan 20 % mag afwijken van de theoretische waarde is bij naphyrone niet voor alle kalibratiecurven voldaan (data niet weergegeven). Hieruit kunnen we besluiten dat de methode voor naphyrone niet lineair is, waardoor deze niet kan gebruikt worden voor een semikwantitatieve bepaling van deze component, een kwalitatieve bepaling daarentegen is wel mogelijk. 4.1.2 Detectielimiet (LOD) Op basis van de vijf kalibratiecurven werd de detectielimiet berekend, deze waarden zijn weergegeven in tabel 4.1. De LOD-waarden van de componenten methedrone, butylone, 5-APB, MDPV, pentylone, β-ethylmethcathinone, 3-MeO-PCP en cathinone zijn lager dan 10 ng/mL. De berekende LOD-waarde van naphyrone en bufotenine voldoet niet aan de vooropgestelde eis en bedraagt respectievelijk 13,72 ng/mL en 12,98 ng/mL. In praktijk werden de kalibratiecurven opgesteld gebruik makende van geaddeerde stalen waarvan de nominale waarde lager is dan de berekende detectielimiet. Hieruit kan besloten worden dat de LOD-waarde in praktijk lager is dan in theorie. Tabel 4.1 Samenvattende tabel detectielimiet bloed Methedrone
Slope
y-intercept
Butylone
Slope
y-intercept
run 1
0,38
-0,60
run 1
0,21
-0,27
run 2
0,27
0,16
run 2
0,16
0,03
run 3
0,33
-0,05
run 3
0,19
-0,58
run 4
0,27
0,16
run 4
0,16
0,03
run 5
0,30
0,31
run 5
0,18
-0,01
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
3,75
0,31
0,36
4,80
0,18
0,26
31
Vervolg tabel 4.1: Samenvattende tabel detectielimiet bloed 5-APB
Slope
y-intercept
MDPV
Slope
y-intercept
run 1
0,19
-0,59
run 1
0,19
-0,03
run 2
0,13
0,07
run 2
0,18
0,17
run 3
0,20
-0,65
run 3
0,21
0,23
run 4
0,13
0,07
run 4
0,18
0,17
run 5
0,19
-0,24
run 5
0,17
0,16
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
6,85
0,17
0,35
1,79
0,19
0,10
Naphyrone
Slope
y-intercept
Pentylone
Slope
y-intercept
run 1
2944,51
-1083,47
run 1
0,36
-0,29
run 2
1586,81
7884,79
run 2
0,38
0,04
run 3
2586,15
-12282,00
run 3
0,36
0,23
run 4
1586,81
7884,79
run 4
0,38
0,04
run 5
1632,76
5650,28
run 5
0,34
0,00
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
13,72
2067,41
8592,33
1,66
0,37
0,18
β-ethylmethcathinone
Slope
y-intercept
3-MeO-PCP
Slope
y-intercept
run 1
0,85
-0,51
run 1
0,37
-0,19
run 2
0,89
0,38
run 2
0,25
0,53
run 3
0,92
1,29
run 3
0,40
1,26
run 4
0,89
0,38
run 4
0,25
0,53
run 5
0,82
0,43
run 5
0,41
0,64
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
2,40
0,88
0,64
5,06
0,34
0,52
Bufotenine
Slope
y-intercept
Cathinone
Slope
y-intercept
run 1
2,52
-16,91
run 1
3,95
-16,26
run 2
1,25
-4,78
run 2
2,34
-2,64
run 3
3,45
-24,22
run 3
4,70
-21,49
run 4
1,25
-4,78
run 4
2,34
-2,64
run 5
2,09
-12,52
run 5
3,23
-7,79
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
LOD
Gemiddelde slope
SD y-intercept
12,98
2,11
8,31
8,40
3,31
8,43
4.1.3 Carry-over In tabel 4.2 zijn de retentietijden, de ion ratio en de piekoppervlakten weergegeven van de blanco bloedstalen die telkens na de hoogste kalibrator werden geanalyseerd. Aangezien de ion ratio voor iedere component een grotere afwijking heeft, ten opzichte van de gemiddelde ion ratio bepaald uit een kalibratie curve, dan de criteria om de identificatie van een component te bevestigen (tabel 3.3) en aangezien de piekoppervlakten kleiner zijn dan 10 % van deze van de laagste kalibrator, kunnen we besluiten dat de methode vrij is van carry-over.
32
Tabel 4.2 Samenvattende tabel carry-over bloed Methedrone
RT
Ion ratio Piekoppervlakte
Butylone
RT
Blanco curve 1
2,52
0,27
Blanco curve 2
2,40
Blanco curve 3
2,56
5-APB
RT
1,14
Blanco curve 1
2,70
2,18
3,25
0,46
0,33
Blanco curve 2
2,82
1,38
0,99
1,51
1,69
Blanco curve 3
2,83
2,86
0,70
Pentylone
RT
Blanco curve 1
3,33
/
23,56
Blanco curve 1
/
/
/
Blanco curve 2
3,49
/
0,21
Blanco curve 2
3,72
0,05
1,15
Blanco curve 3
3,44
/
0,33
Blanco curve 3
3,74
0,05
0,91
β-ethylmethcathinone
RT
MDPV
Rt
Blanco curve 1
3,94
2,79
Blanco curve 2
3,94
44,96
268,58
Blanco curve 1
4,57
0,42
0,63
185,76
Blanco curve 2
4,68
2,53
0,68
Blanco curve 3
3,70
0,98
26,78
Blanco curve 3
4,57
0,76
0,23
3-MeO-PCP
RT
Naphyrone
Rt
Blanco curve 1
6,54
0,24
1,20
Blanco curve 1
7,37
4,11
10,75
Blanco curve 2
6,22
Blanco curve 3
6,38
1,18
2,78
Blanco curve 2
7,38
10,07
337,05
3,12
3,69
Blanco curve 3
7,37
12,22
239,02
Bufotenine
RT
Cathinone
RT
Blanco curve 1
1,12
0,38
1,07
Blanco curve 1
1,75
26,27
11,11
Blanco curve 2
1,22
6,64
1,36
Blanco curve 2
0,77
/
71,04
Blanco curve 3
1,19
0,98
0,25
Blanco curve 3
0,77
/
95,96
Ion ratio Piekoppervlakte
Ion ratio Piekoppervlakte
Ion ratio Piekoppervlakte
Ion ratio Piekoppervlakte
Ion ratio Piekoppervlakte
Ion ratio Piekoppervlakte
Ion ratio Piekoppervlakte
Ion ratio Piekoppervlakte
Ion ratio Piekoppervlakte
4.1.4 Herhaalbaarheid (CV %) Uit de gegevens in tabel 4.3 werd per run de herhaalbaarheid (within-run) berekend, uitgedrukt als variatiecoëfficiënt. Voor de beoordeling van de herhaalbaarheid werd per component gekeken naar de run met de hoogste waarde. Enkel voor MDPV, pentylone en βethylmethcathinone vielen deze waarden binnen de vooropgestelde grenzen (< 20 %). De andere componenten hebben een herhaalbaarheid > 20 %. Tabel 4.3 Samenvattende tabel herhaalbaarheid (within-run) bloed Methedrone
Run 1 10 n ng/mL 1 9,60 2 4,80 3 11,60 Gemiddelde 8,67 SD 3,49 Within-run (CV%) 40,32
Run 2 10 ng/mL 9,90 6,60 9,80 8,77 1,88 21,41
Run 3 Run 4 10 10 ng/mL ng/mL 9,30 9,40 11,20 9,10 10,60 5,70 10,37 8,07 0,97 2,06 9,37 25,48
Run 5 10 ng/mL 7,70 8,30 9,90 8,63 1,14 13,17
Pentylone
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 10 10 10 10 n ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 1 10,10 10,80 9,40 10,10 2 9,00 7,40 10,20 10,40 3 9,50 8,80 10,40 9,80 Gemiddelde 9,53 9,00 10,00 10,10 SD 0,55 1,71 0,53 0,30 Within-run (CV%) 5,78 18,99 5,29 2,97
33
Run 5 10 ng/mL 10,50 10,10 10,70 10,43 0,31 2,93
Vervolg tabel 4.3: Samenvattende tabel herhaalbaarheid (within-run) bloed Butylone n 1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 10 10 10 10 10 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 8,80 9,50 8,40 10,40 9,30
β-ethylmethcathinone
1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 10 10 10 10 10 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 11,50 9,47 10,60 9,30 9,80
n
2
7,80
7,20
10,20
8,80
8,10
2
110,00
6,89
10,30
9,20
9,70
3
12,20
9,50
11,60
6,90
12,50
3
9,90
8,70
9,90
8,50
10,90
Gemiddelde
9,60
8,73
10,07
8,70
9,97
Gemiddelde
10,8
8,35
10,27
9,00
10,13
SD
2,31
1,33
1,60
1,75
2,27
SD
0,82
1,32
0,35
0,44
0,67
Within-run (CV%)
24,03
15,21
15,94
20,14
22,82
Within-run (CV%)
7,58
15,83
3,42
4,84
6,57
5-APB n 1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 10 10 10 10 10 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 11,20 9,50 9,20 9,40 7,60
3-MeO-PCP n 1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 10 10 10 10 10 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 11,70 10,50 8,80 9,20 9,40
2
6,50
8,10
12,00
6,80
9,30
2
6,90
9,90
9,70
9,60
7,60
3
10,30
9,10
13,00
5,20
15,30
3
9,10
9,60
9,50
9,40
10,40
Gemiddelde
9,33
8,90
11,4
7,13
10,73
Gemiddelde
9,23
10,00
9,33
9,40
9,13
SD
2,49
0,72
1,97
2,12
4,05
SD
2,40
0,46
0,47
0,20
1,42
Within-run (CV%)
26,73
8,10
17,28
29,72
37,69
Within-run (CV%)
26,02
4,58
5,06
2,13
15,54
MDPV n 1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 10 10 10 10 10 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 9,00 10,70 8,50 8,80 9,10
2
9,70
10,10
10,10
8,50
8,90
Bufotenine
1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 10 10 10 10 10 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 8,50 7,30 10,40 8,00 12,40
2
11,60
5,80
8,80
6,20
8,80
n
3
9,10
10,00
10,40
9,00
9,60
3
11,50
8,00
9,10
7,40
20,90
Gemiddelde
9,27
10,27
9,67
8,77
9,20
Gemiddelde
10,53
7,03
9,43
7,20
14,03
SD
0,38
0,38
1,02
0,25
0,36
SD
1,76
1,12
0,85
0,92
6,21
Within-run (CV%)
4,09
3,69
10,57
2,87
3,92
Within-run (CV%)
16,72
15,98
9,02
12,73
44,27
Naphyrone n 1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 10 10 10 10 10 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 15,60 10,90 12,20 7,10 4,10
Cathinone n 1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 10 10 10 10 10 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 10,90 6,90 11,60 10,50 11,60
2
8,00
15,30
12,10
7,20
/
2
7,80
5,00
10,00
8,60
9,40
3
8,50
12,00
7,90
10,70
13,60
3
9,40
6,20
12,10
6,70
15,30
Gemiddelde
10,70
12,73
10,73
8,33
8,85
Gemiddelde
9,37
6,03
11,23
8,60
12,10
SD
4,25
2,29
2,45
2,05
6,72
SD
1,55
0,96
1,10
1,90
2,98
Within-run (CV%)
39,73
17,98
22,87
24,60
75,90
Within-run (CV%)
16,55
15,93
9,77
22,09
24,64
4.1.5 Accuraatheid (% bias) en reproduceerbaarheid (CV %) De accuraatheid, weergegeven in tabel 4.4, werd berekend uit de gemiddelde concentratie van de 5 runs uit tabel 4.3. De bekomen resultaten voor de accuraatheid bevinden zich tussen - 11,00 % en + 2,70 %. Alle componenten hebben dus een bias lager dan ± 20 % en voldoen hiermee aan de vooropgestelde eis. 34
Ook de reproduceerbaarheid, of de overeenkomst tussen de resultaten die bekomen werden over de vijf verschillende runs, werd op basis van deze gegevens berekend en is weergegeven in tabel 4.4. De componenten methedrone, 5-APB, naphyrone en bufotenine hebben een variatiecoëfficient > 20 % en voldoen hiermee niet aan de eisen. Vooral bij naphyrone is er een grote spreiding tussen de resultaten bekomen over de vijf runs, de relatieve standaarddeviatie hiervoor is 34,59 %. De andere componenten voldoen wel aan de vooropgestelde eisen. Imprecisie (zowel within-run als between-run) kan te wijten zijn aan het gebrek aan herhaalbaarheid van de matrixeffecten (4.1.6) en van de extractieprocedure (4.1.9) en aan de afname van de stabiliteit in de loop van de tijd (4.4). Aangezien, behalve voor respectievelijk methedrone en cathinone, voldaan is aan de specificaties voor de herhaalbaarheid van de extractieprocedure en voor de stabiliteit, zal het gebrek aan herhaalbaarheid van de matrixeffecten aan de basis liggen voor deze imprecisie. Bovendien kan de imprecisie ook deels te wijten zijn aan de variatie in herhaalbaarheid van injectie (4.3). Tabel 4.4 Samenvattende tabel accuraatheid en reproduceerbaarheid bloed Methedrone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) 5-APB Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) β-ethylmethcathinone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) 3-MeO-PCP Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) Bufotenine Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %)
10 ng/mL 8,90 1,91 -11,00 21,43 10 ng/mL 9,50 2,27 -5,00 23,90 10 ng/mL 9,71 0,72 -2,89 7,40 10 ng/mL 9,42 0,99 -5,80 10,51 10 ng/mL 9,65 2,17 -3,53 22,53
Butylone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) Pentylone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) MDPV Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) Naphyrone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) Cathinone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %)
35
10 ng/mL 9,41 1,85 -5,87 19,69 10 ng/mL 9,81 0,68 -1,87 6,92 10 ng/mL 9,43 0,48 -5,67 5,07 10 ng/mL 10,27 3,55 2,70 34,59 10 ng/mL 9,47 1,70 -5,33 17,94
4.1.6 Matrixeffecten In tabel 4.5 zijn de matrixeffecten weergegeven, deze werden berekend aan de hand van de verhouding van de absolute responsen bepaald in de matrix ten opzichte van de absolute responsen bepaald in de mobiele fase. De matrixeffecten van methedrone, MDPV en pentylone bevinden zich tussen -14,97 % en 12,22 %, waarmee ze in het interval [-25 % ; + 25 %] liggen. Hieruit kunnen we besluiten dat de invloed van de co-eluerende componenten van de matrix op deze componenten aanvaardbaar is. Voor butylone, 5-APB, β-ethylmethcathinone, 3-MeO-PCP, cathinone en naphyrone vallen de waarden voor de matrixeffecten niet binnen het toegelaten interval. Door de gedeutereerde analogen van de componenten te gebruiken als interne standaard zouden deze matrixeffecten gecompenseerd worden. Over het algemeen is er een grote variatie op de matrixeffecten te zien, wat aan de basis kan liggen van de imprecisie. Ook voor de interne standaarden werd de invloed van de matrix nagegaan (tabel 4.6), de waarden bevinden zich voor MBDB-d5 en cocaïne-d3 tussen – 9,70 % en 14,49 %, ook hier kunnen we dus spreken van aanvaardbare matrixeffecten. Voor MDMA-d5 en codeïne-d3 vallen deze waarden buiten het toegelaten interval. Hier is opnieuw een grote variatie op de matrixeffecten te zien. Er kan uit deze resultaten afgeleid worden dat de keuze van de interne standaarden niet ideaal is, aangezien het matrixeffect van de component en de daarbij horende interne standaard niet overeenkomt. De interne standaardaard zal dus niet optimaal compenseren voor het matrixeffect. Tabel 4.5 Samenvattende tabel matrixeffecten standaarden bloed Ion suppressie/verhoging (%) Methedrone Butylone 5-APB MDPV Pentylone β-ethylmethcathinone 3-MeO-PCP Bufotenine Cathinone Naphyrone
5 ng/mL 10 ng/mL 25 ng/mL 50 ng/mL -2,96 -13,22 7,43 -2,34 36,81 36,24 -10,91 -17,21 18,13 -40,95 -7,26 -10,30 -14,97 11,92 -2,78 2,63 -14,61 3,80 -5,84 -4,88 -40,10 -5,55 58,66 -4,77 -27,22 -4,37 -18,27 -14,07 / / / / 37,92 -81,32 32,73 2,61 -73,29 -75,46 -75,92 -73,61
124 ng/mL -1,15 -2,29 -13,83 4,78 -6,41 -4,04 -9,26 / -16,23 -73,62
250 ng/mL 12,22 4,16 -5,06 0,63 5,21 -2,07 -4,14 / 7,36 -69,91
Tabel 4.6 Samenvattende tabel matrixeffecten interne standaarden bloed Ion suppressie/verhoging (%) MDMA-d5 MBDB-d5 Codeïne-d3 Cocaïne-d3
5 ng/mL 65,33 -9,70 25,08 -7,79
10 ng/mL 25 ng/mL 50 ng/mL -12,96 5,60 18,47 11,80 13,63 14,49 2,74 -25,76 10,35 12,07 -1,96 9,85
36
124 ng/mL 5,83 9,52 28,40 -1,64
250 ng/mL -3,67 -1,33 19,14 8,24
4.1.7 Matrixinterferenties Na de analyse van de blanco bloedstalen waaraan IS toegevoegd werd konden er geen pieken waargenomen worden ter hoogte van de meeste van de componenten. Enkel voor 5-APB en naphyrone werden bij enkele curven pieken weergegeven. Aangezien de identificatiecriteria (ion ratio, retentietijd, piekoppervlakte) niet voldeden, konden we besluiten dat de methode voor de componenten vrij is van interferenties afkomstig van de matrix. Bij de stalen waar de componenten werden toegevoegd om zo de interferentie van de matrix met de IS na te gaan konden ook geen pieken waargenomen worden ter hoogte van de IS. Hieruit kunnen we dus besluiten dat de matrix niet interfereert met de IS en de te bepalen componenten. 4.1.8 Interferenties afkomstig van andere analieten Na het injecteren en analyseren van de vijf stockoplossingen, welke veel voorkomende geneesmiddelen (antidepressiva, β-blokkers, benzodiazepinen, pijnstillers,…) bevatten, konden geen pieken waargenomen worden ter hoogte van methedrone, butylone, pentylone, MDPV, βethylmethcathinone, 5-APB, 3-MeO-PCP, naphyrone, bufotenine en cathinone. Hieruit wordt besloten dat de analieten aanwezig in de stockoplossingen geen interferentie veroorzaken en dat de methode dus selectief is voor de te bepalen componenten ten opzichte van de geanalyseerde analieten. 4.1.9 Extractierendement In tabel 4.7 zijn de gemiddelde piekoppervlakten (n = 6) weergegeven van de stalen opgelost in mobiele fase en van de geëxtraheerde stalen, hierbij werd telkens de variatiecoëfficiënt bepaald. Aan de hand van de gemiddelde piekoppervlakten werd het extractierendement berekend. Tabel 4.7 Samenvattende tabel extractierendement bloed Component
Piekopperlakte MF Gem. CV (%) Methedrone 2837,07 42,81 Butylone 34882,45 9,01 5-APB 12387,60 8,54 MDPV 13696,66 8,91 Naphyrone 18234,37 9,86 Pentylone 3787,00 12,30 β-ethylmethcathinone 10746,48 14,14 3-MeO-PCP 5723,96 10,51 Cathinone 892,19 34,50 Bufotenine / /
37
Piekoppervlakte EX Extractierendement (%) Gem. CV (%) 3209,13 34,71 113,11 3222,30 8,18 92,53 11117,75 7,45 89,75 13437,24 8,68 98,11 18923,69 7,47 103,78 3879,88 10,13 102,45 11771,06 2,90 109,53 6368,48 8,31 111,26 1056,89 18,19 118,38 / / /
De waarden voor de extractierendementen bevinden zich voor alle componenten tussen 89,75 % en 118,38 %. Hieruit kan geconcludeerd worden dat de terugvinding na extractie groot genoeg is om deze alkalische vloeistof-vloeistofextractie te kunnen toepassen als staalvoorbereiding. Bovendien zijn de variatiecoëfficiënten voor de piekoppervlakten bekomen na extractie over het algemeen niet hoog, waardoor we kunnen spreken van een goede herhaalbaarheid van de extractieprocedure. Tijdens het experiment voor de bepaling van het extractierendement konden geen pieken waargenomen worden voor bufotenine, waardoor het extractierendement hiervoor niet berekend kon worden.
4.2 METHODEVALIDATIE CATHINONEN EN ANDERE DESIGNERDRUGS IN URINE 4.2.1 Lineariteit Ook hier werden voor iedere component de gegevens van de 5 runs samengevat in één kalibratiecurve. In figuren 4.5, 4.6, 4.7 en 4.8 zijn de kalibratiecurven met de bijhorende correlatiecoëfficiënten weergegeven. Met uitzondering van naphyrone en bufotenine, hebben alle componenten een correlatiecoëfficiënt > 0,995; waarmee ze voldoen aan de vooropgestelde eisen (> 0,990). Naphyrone heeft een R2 -waarde van 0,992 (> 0,990). Bovendien vertonen de residuele waarden voor deze componenten een normale verdeling rond de x-as. Ook de concentraties van de kalibratiepunten berekend op de kalibratiecurven wijken niet meer dan 20 % af ten opzichte van de theoretische waarde (data niet weergegeven).
250000
5-APB
Naphyrone
y = 2253x - 213,71 R² = 0,9921
200000
300
Pentylone
y = 1455,5x + 3105,5 R² = 0,9952
150000 y = 663,89x + 1060,5 R² = 0,9971
100000 50000
y = 650,19x + 1133,4 R² = 0,9968
0 0
20
40
60
80
100
Kalibratiecurve pentylone, βethylmethcathinone en MDPV
Butylone
120
Relatieve respons
Methedrone
Piekoppervlakte
300000
Kalibratiecurve methedrone, 5-APB, naphyrone en butylone
250
MDPV
200 150 y = 0,7987x + 1,1559 R² = 0,9972
100 50
y = 0,4389x + 0,041 R² = 0,9999
0 0
% cut-off waarde
B-ethylmethcathinone y = 1,9685x + 2,7027 R² = 0,9979
20
40
60
80
100
% cut-off waarde
120
Figuur 4.5 Kalibratiecurve methedrone, 5-APB, naphyrone en butylone Figuur 4.6 Kalibratiecurve pentylone, β-ethylmethcathinone en MDPV
38
Kalibratiecurve 3-MeO-PCP en cathinone
3-MeO-PCP
relatieve repons
100
Kalibratiecurve bufotenine 100000
Cathinone
80000
y = 0,7968x - 0,0204 R² = 0,9982
80
Bufotenine
piekoppervlakte
120
60000
60
y = 672,04x + 5437 R² = 0,937
40000
40
y = 0,0193x - 0,0084 R² = 0,9997
20
20000 0
0 0
50
0
100
% cut-off waarde
20
40
60
80
100
120
% cut-off waarde
Figuur 4.7 Kalibratiecurve 3-MeO-PCP en cathinone
Figuur 4.8 Kalibratiecurve bufotenine
Spreiding Bufotenine piekoppervlakte
120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130
% cut-off waarde Figuur 4.9 Weergave spreiding bufotenine
Bufotenine daarentegen heeft een R2 -waarde van 0,937 ( < 0,990). Daarom werd de spreiding over de 5 opgestelde kalibratiecurven bestudeerd, deze is weergegeven in figuur 4.9. Uit deze figuur kan afgeleid worden dat spreiding op 75 % van de cut-off waarde overlapt met de spreiding op 100 % van de cut-off waarde. De spreiding op 100 % is zelfs breder dan de spreiding op 75 %. Ook de concentraties van de kalibratiepunten berekend op de kalibratiecurve hebben een grotere afwijking dan 20 % van de theoretische waarde bij vier van de vijf curven (data niet weergegeven). 4.2.2 Carry-over In tabel 4.8 zijn de retentietijden, de ion ratio en de piekoppervlakte voor iedere component weergegeven van de 3 geanalyseerde blanco stalen die telkens na de hoogste kalibrator geïnjecteerd werden. 39
Tabel 4.8 Samenvattende tabel carry-over urine Methedrone Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3 5-APB Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3 β-ethylmethcathinone Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3 3-MeO-PCP Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3 Bufotenine Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3
RT 2,57 2,57 2,54 RT 3,52 3,89 3,81 RT 3,78 3,88 3,84 RT 6,54 6,49 6,56 RT 1,13 1,16 1,19
Ion ratio 8,21 12,54 0,88 Ion ratio / / / Ion ratio 0,52 8,51 6,32 Ion ratio 0,24 1,96 0,82 Ion ratio 0,74 2,72 0,98
Piekoppervlakte 1,03 20,96 0,32 Piekoppervlakte 16,74 3,06 3,88 Piekoppervlakte 4,11 168,23 113,47 Piekoppervlakte 2,06 4,74 11,23 Piekoppervlakte 0,32 0,63 0,25
Butylone Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3 Pentylone Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3 MDPV Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3 Naphyrone Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3 Cathinone Blanco curve 1 Blanco curve 2 Blanco curve 3
RT 3,18 2,54 2,54 RT 3,76 3,89 3,76 RT 4,6 4,66 4,67 RT 7,49 7,43 7,42 RT 1,68 1,72 1,79
Ion ratio / 3,94 0,23 Ion ratio 0,18 0,05 1,42 Ion ratio 0,11 0,21 2,84 Ion ratio 0,19 0,31 0,24 Ion ratio 6,47 23,96 21,16
Piekoppervlakte 6,33 14,11 2,71 Piekoppervlakte 0,77 1,86 13,46 Piekoppervlakte 0,64 1,73 2,85 Piekoppervlakte 9,05 43,42 14,89 Piekoppervlakte 7,89 22,69 13,04
Aangezien de afwijking van de ion ratio voor de drie blanco’s van alle componenten groter is dan het toegelaten percentage (tabel 3.3) en het signaal van de blanco’s kleiner is dan 10 % van de piekoppervlakte van de laagste kalibrator kunnen we besluiten dat de methode geen invloed ondervindt van carry-over effecten. 4.2.3 Herhaalbaarheid (CV %) In tabel 4.9 worden de concentraties, de gemiddelde concentraties, de SD en de herhaalbaarheid (within-run), uitgedrukt als variatiecoëfficiënten, weergegeven van alle componenten van de 5 verschillende runs. De concentratie wordt uitgedrukt als procent van de cut-off waarde en het concentratieniveau waarop de herhaalbaarheid gecontroleerd wordt is 100 % van de cut-off waarde (= 200 ng/mL).
40
Tabel 4.9 Weergave herhaalbaarheid urine Methedrone
1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % cut-off cut-off cut-off cut-off cut-off 82,40 96,60 95,80 107,30 100,30
2
93,80
100,40
3
87,90
Gemiddelde SD Within-run (CV%)
n
Butylone
1
Run 1 100 % cut-off 89,10
85,90 100,00 88,00
2
92,90 101,60 111,30 101,00 104,60
95,80
96,30
3
91,90 103,90 103,10 94,90 102,40
88,03
97,60
92,67 102,07 97,63
Gemiddelde
95,50
96,27
97,00 102,60 99,50
5,70
2,46
5,87
4,57
8,62
SD
4,84
0,35
3,40
0,36
0,62
6,48
2,52
6,33
4,47
8,82
Within-run (CV%)
5,07
0,36
3,51
0,35
0,63
3-MeO-PCP
1
Run 1 100 % cut-off 89,10
Run 2 100 % cut-off 102,90
Run 3 100 % cut-off 99,10
Run 4 100 % cut-off 93,50
Run 5 100 % cut-off 105,20
98,90 104,60
MDPV n
Run 2 100 % cut-off 102,90
Run 3 100 % cut-off 99,10
Run 4 100 % cut-off 93,50
Run 5 100 % cut-off 105,20
1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % cut-off cut-off cut-off cut-off cut-off 89,10 102,90 99,10 93,50 105,20
2
92,90
101,60 111,30 101,00 104,60
2
92,90 101,60 111,30 101,00 104,60
3
91,90
103,90 103,10 94,90 102,40
3
91,90 103,90 103,10 94,90 102,40
Gemiddelde
91,30
102,80 104,50 96,47 104,07
Gemiddelde
97,10
93,63
95,20 103,20 101,17
SD
1,97
1,15
6,22
3,99
1,47
SD
2,70
3,26
3,66
0,10
2,55
Within-run (CV%)
2,16
1,12
5,95
4,13
1,42
Within-run (CV%)
2,78
3,48
3,84
0,10
2,52
Naphyrone
Run 2 100 % cut-off 102,90
Run 3 100 % cut-off 99,10
Run 4 100 % cut-off 93,50
Run 5 100 % cut-off 105,20
n
5-APB
n
1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % cut-off cut-off cut-off cut-off cut-off 89,10 102,90 99,10 93,50 105,20
1
Run 1 100 % cut-off 89,10
2
92,90
101,60 111,30 101,00 104,60
2
92,90 101,60 111,30 101,00 104,60
3
91,90
103,90 103,10 94,90 102,40
3
91,90 103,90 103,10 94,90 102,40
Gemiddelde
88,83
102,07
98,73
99,90 101,83
SD
-11,17
2,07
-1,27
-0,10
4,78
4,32
1,82
5,77
n
Within-run (CV%) Pentylone
n
Gemiddelde
97,10
97,77 103,70 107,43 101,20
1,83
SD
2,70
0,83
7,69
Within-run (CV%)
2,78
0,85
1,58
4,12
1,71
Bufotenine
1
Run 1 100 % cut-off 89,10
Run 2 100 % cut-off 102,90
Run 3 100 % cut-off 99,10
Run 4 100 % cut-off 93,50
Run 5 100 % cut-off 105,20
1,64
4,42
1,73
1
Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % cut-off cut-off cut-off cut-off cut-off 89,10 102,90 99,10 93,50 105,20
2
92,90
101,60 111,30 101,00 104,60
2
92,90 101,60 111,30 101,00 104,60
3
91,90
103,90 103,10 94,90 102,40
3
91,90 103,90 103,10 94,90 102,40
Gemiddelde
91,67
96,47
94,13 105,13 98,03
SD
5,69
1,56
3,75
1,02
Within-run (CV%) βethylmethcathinone
6,21
1,62
3,99
0,97
Run 1
Run 2
Run 3
Run 4
n
n
Gemiddelde
68,00
89,90 145,63 103,60 92,90
1,50
SD
25,49
27,67
52,24
15,22
26,76
1,53
Within-run (CV%)
37,49
30,78
35,87
14,69
28,80
Run 5
Cathinone
Run 1
Run 2
Run 3
Run 4
Run 5
1
100 % 100 % 100 % 100 % 100 % cut-off cut-off cut-off cut-off cut-off 89,10 102,90 99,10 93,50 105,20
1
100 % 100 % 100 % 100 % 100 % cut-off cut-off cut-off cut-off cut-off 89,10 102,90 99,10 93,50 105,20
2
92,90
101,60 111,30 101,00 104,60
2
92,90 101,60 111,30 101,00 104,60
3
91,90
103,90 103,10 94,90 102,40
3
91,90 103,90 103,10 94,90 102,40
Gemiddelde
92,00
96,17
97,00 100,70 101,17
SD
4,68
0,80
3,40
4,19
1,33
Within-run (CV%)
5,08
0,83
3,51
4,16
1,31
n
41
n
Gemiddelde
102,60 92,30
95,80
95,33 102,37
SD
10,31
4,76
4,10
1,96
2,31
Within-run (CV%)
10,05
5,15
4,28
2,05
2,25
De herhaalbaarheid werd berekend uit de gemiddelde concentratie per run. Voor de beoordeling van de herhaalbaarheid werd per component gekeken naar de run met de hoogste waarde. De waarden voor alle componenten, behalve bufotenine, bevinden zich tussen 3,84 % en 10,05 %, hiermee vallen ze binnen de vooropgestelde eisen van < 20 %. Opnieuw voldoet bufotenine niet aan de vereisten, daar waar de hoogste variatiecoëfficiënt 37,49 % bedraagt. 4.2.4 Accuraatheid ( % bias) en reproduceerbaarheid (CV %) In tabel 4.10 werd de accuraatheid berekend uit de gemiddelde concentratie van de 5 runs weergegeven in tabel 4.9. De accuraatheid van alle componenten bevindt zich tussen de waarden -4,40 % en 1,44 %. Hieruit kunnen we besluiten dat deze waarden binnen de vooropgestelde grenswaarden van -25 % en + 25 % liggen. Ook de reproduceerbaarheid werd berekend op basis van de gemiddelde concentratie van de 5 runs en de gemiddelde SD. De reproduceerbaarheid (between-run) werd uitgedrukt als variatiecoëfficiënt en is weergegeven in tabel 4.10. Tabel 4.10 Weergave accuraatheid en reproduceerbaarheid (between-run) urine Methedrone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) 5-APB Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) β-ethylmethcathinone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) 3-MeO-PCP Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) Bufotenine Gemiddelde conc. Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %)
100 % cut-off 95,6 5,44 -4,40 5,69 100 % cut-off 98,27 4,81 -1,73 4,89 100 % cut-off 97,41 2,88 -2,59 2,96 100 % cut-off 98,06 2,45 -1,94 2,5 100 % cut-off 100,01 29,48 0,01 29,47
42
Butylone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) Pentylone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) MDPV Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) Naphyrone Gemiddelde conc. 5 runs Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %) Cathinone Gemiddelde conc. Gemiddelde SD Accuraatheid (%) Between-run (CV %)
100 % cut-off 99,82 2,96 -0,18 2,97 100 % cut-off 97,09 2,70 -2,91 2,79 100 % cut-off 98,17 1,92 -1,83 1,95 100 % cut-off 101,44 2,26 1,44 2,23 100 % cut-off 97,68 4,69 -2,32 4,80
De waarden van alle componenten, uitgezonderd bufotenine, bevinden zich tussen 1,95 % en 5,69 %. Aangezien deze dus lager zijn dan 20 % kunnen we spreken van een aanvaardbare reproduceerbaarheid. Bufotenine heeft een variatiecoëfficiënt van 29,47 % (> 20 %) en voldoet hiermee opnieuw niet aan de vooropgestelde eisen. Het hoge percentage van de within-run en between-run voor bufotenine kan te wijten zijn aan de slechte herhaalbaarheid van de extractieprocedure (4.2.7) die een CV heeft van 181,55 % en de variatie op ion suppressie afhankelijk van de matrix (4.2.5). 4.2.5 Matrixeffecten In tabel 4.11 zijn de matrixeffecten weergegeven. Aan de hand van de verhouding van de piekoppervlakten bepaald in de matrix ten opzichte van de piekoppervlakten bepaald in de mobiele fase werd het matrixeffect berekend. Tabel 4.11 Samenvattende tabel effect v/d matrix (urine) op de componenten Ion suppressie/verhoging (%) Methedrone Butylone 5-APB Pentylone β-ethylmethcathinone MDPV 3-MeO-PCP Naphyrone Bufotenine Cathinone
100% cut-off -16,51 -18,75 -3,50 -13,68 -16,42 -16,70 -15,16 -20,82 -78,77 -12,41
100% cut-off -10,25 -14,13 17,10 -16,01 -15,47 -10,02 -8,59 -17,75 -52,21 -1,77
100% cut-off -13,16 -12,31 -1,49 -12,85 -13,54 -9,07 -13,34 -20,61 -53,99 -10,67
100% cut-off -11,45 -1,07 -23,22 5,51 -7,10 36,34 10,18 10,80 -87,59 -27,00
100% cut-off -15,36 -2,97 -19,07 1,54 -11,90 26,73 7,68 -0,24 -83,98 -28,23
De berekende matrixeffecten voor methedrone, butylone, pentylone, β-ethylmethcathinone en 3-MeO-PCP bevinden zich tussen -18,75 % en 10,18 %, waarmee ze zich binnen het interval bevinden van [ -25 % ; + 25 %]. Bij de andere componenten veroorzaken de co-eluerende componenten een daling van het signaal groter dan ± 25 %. Een mogelijke oplossing is om gebruik te maken van de gedeutereerde analogen van de componenten als interne standaard. Deze zullen ongeveer dezelfde ion suppressie/verhoging ondervinden als het overeenkomstig component en op die manier hiervoor compenseren. Net zoals in de matrix bloed, is er ook hier een grote variatie in de matrixeffecten. De invloed van de matrix op het signaal van de interne standaarden werd op dezelfde manier berekend en is weergegeven in tabel 4.12.
43
Tabel 4.12 Samenvattende tabel effecten v/d matrix (urine) op de interne standaarden ion suppressie/verhoging (%) codeïne-d3 cocaïne-d3 MDMA-d5
100% cut-off -14,20 -13,03 -12,41
100% cut-off -3,72 -1,09 -1,77
100% cut-off -12,27 -9,77 -10,67
100% cut-off 6,84 47,38 64,01
100% cut-off 12,72 41,36 46,68
De invloed van de matrix op het signaal van codeïne-d3 zorgt voor een suppressie en verhoging van het signaal tussen -14,20 % en 12,72 %. Dit voldoet aan de vooropgestelde eisen, waaruit we kunnen besluiten dat het effect van de co-eluerende componenten van de matrix aanvaardbaar is. Voor cocaïne-d3 en MDMA-D5 veroorzaken de co-eluerende componenten van de matrix een verhoging van meer dan 25 %. Ook hier is een grote variatie in de bekomen matrixeffecten. De ion suppressie/verhoging van de componenten komt niet goed overeen met het matrixeffect van de gekozen interne standaard waardoor de matrixeffecten niet optimaal zullen gecompenseerd worden, het gebruik van gedeutereerde analogen van de componenten als interne stadaard zou een oplossing zijn. 4.2.6 Matrixinterferenties Aangezien we bij de blanco bloedstalen waaraan interne standaard werd toegevoegd geen pieken konden waarnemen ter hoogte van de componenten kunnen wie hieruit concluderen dat de matrix niet interfereert met de te bepalen componenten. Doordat er wel pieken te zien zijn bij de interne standaarden, weten we zeker dat de injectie wel degelijk is doorgegaan. Ditzelfde kunnen we concluderen voor de interferentie afkomstig van de matrix met de interne standaarden, ook hier waren geen pieken te zien ter hoogte van de interne standaarden. De methode is dus vrij van interferentie afkomstig van de matrix voor zowel de te bepalen componenten als de interne standaarden. 4.2.7 Extractierendement In tabel 4.13 worden voor alle componenten de gemiddelde piekoppervlakten ( n = 6 ) weergegeven van de geëxtraheerde stalen en van de stalen in mobiele fase, met het daaruit berekende extractierendement. Bovendien werd telkens de variatiecoëfficiënt bepaald.
44
Tabel 4.13 Samenvattende tabel extractierendement urine Component Methedrone Butylone 5-APB MDPV Naphyrone Pentylone β-ethylmethcathinone 3-MeO-PCP Cathinone Bufotenine
Piekoppverlakte MF Gem. CV (%) 71451,26 10,78 36973,51 10,22 200963,74 11,93 115324,06 11,27 1121943,63 11,35 196689,52 11,53 479753,86 10,78 304364,01 11,85 72806,52 12,38 14846,83 8,94
Piekopperlakte EX Extractierendement (%) Gem. CV (%) 77716,97 5,69 108,77 40210,40 5,02 108,75 188505,68 6,96 93,80 127035,26 5,23 110,16 1210530,33 3,71 107,90 209566,31 5,31 106,55 512412,53 4,05 106,81 336300,75 4,55 110,49 67600,81 7,43 92,85 150656,62 118,55 9,85
Uitgezonderd voor bufotenine, ligt het gemiddelde extractierendement in een range tussen 92, 85 % en 110,49 %. Hieruit kunnen we besluiten dat de extractierendementen voor deze componenten hoog genoeg zijn om ze te kunnen extraheren met de alkalische vloeistof-vloeistof extractie. Bovendien zijn de variatiecoëfficiënten niet groot waardoor we kunnen spreken van een goede herhaalbaarheid van de extractieprocedure. Bij bufotenine daarentegen is de terugvinding na extractie slechts 9,85 %. Dit percentage is veel te laag om deze staalvoorbereiding te hanteren, een wijziging van de extractieprocedure is hier noodzakelijk.
4.3 CONTROLE VAN DE WERKING VAN DE AUTOSAMPLER: HERHAALBAARHEID VAN INJECTIE In tabel 4.14 zijn de piekoppervlakten weergegeven voor alle componenten van de zes achtereenvolgende injecties uit éénzelfde vial. De RSD werd voor elke component bepaald, deze waarden bevinden zich tussen 1,21 % en 3,68 %. Tabel 4.14 Controle autosampler: herhaalbaarheid van injectie Methedrone
Piekopp.
Butylone
Piekopp.
5-APB
Piekopp.
MDPV
Piekopp.
Bufotenine
Piekopp.
1
43602,14
1
41040,29
1
85043,71
1
45144,09
1
100878,63
2
41487,31
2
39591,19
2
81629,13
2
43259,63
2
101470,46
3
42304,86
3
39902,09
3
81772,11
3
42564,48
3
99525,31
4
46013,04
4
37076,16
4
81455,16
4
43201,00
4
98977,73
5
42298,79
5
38398,48
5
85198,44
5
42145,11
5
103291,17
6
43159,63
6
39803,92
6
81727,13
6
43202,57
6
94070,05
SD
1587,74
SD
1377,54
SD
1798,54
SD
1027,91
SD
3151,78
Gemiddelde RSD (%)
43144,30 Gemiddelde 39302,02 Gemiddelde 82804,28 Gemiddelde 43252,81 Gemiddelde 99702,22 3,68
RSD (%)
3,51
RSD (%)
2,17
45
RSD (%)
2,38
RSD (%)
3,16
Vervolg tabel 4.14 Controle autosampler: herhaalbaarheid van injectie β-EMC
Piekopp.
Pentylone
Piekopp. 3-MeO-PCP
Naphyrone
Piekopp.
Cathinone
Piekopp.
1
176743,33
1
68019,22
1
2
173225,59
2
65445,59
2
95832,81
1
100367,79
1
29673,60
94364,30
2
98286,11
2
29886,82
3
170917,30
3
62588,70
3
96059,52
3
103475,40
3
29117,82
4
176094,16
4
66792,20
4
95467,80
4
97189,20
4
29141,56
5
177542,08
6
170026,45
5
64223,81
5
89044,59
5
96629,70
5
29772,94
6
63724,72
6
93214,06
6
99615,05
6
29149,81
SD
3171,73
SD
2023,08
SD
2648,08
SD
2501,12
SD
357,88
Gemiddelde 174091,48 Gemiddelde 65132,37 Gemiddelde 93997,18 Gemiddelde 99260,54 Gemiddelde 29457,09 RSD (%)
1,82
RSD (%)
3,11
RSD (%)
2,82
RSD (%)
2,52
RSD (%)
1,21
4.4 STABILITEIT IN DE AUTOSAMPLER In de onderstaande grafieken (figuur 4.10 – 4.18) wordt de afwijking van de piekoppervlakte op een bepaald tijdstip ten opzichte van de piekoppervlakte op tijdstip 0 weergegeven in functie van de tijd. Uit deze curven kan afgeleid worden dat de componenten ten minste gedurende 14 uur en 30 minuten stabiel blijven in de autosampler, dit wil zeggen dat ze 14 uur en 30 minuten na het plaatsen van de stalen in de autosampler nog op een correcte manier geanalyseerd kunnen worden zonder dat de componenten afgebroken zijn en aanleiding geven tot vals negatieve resultaten.
Stabiliteit 5-APB
120 100 80 60 40 20 0
Stabiliteit (%)
Stabiliteit (%)
Stabiliteit Methedrone
0
5
10
15
120 100 80 60 40 20 0 0
Tijd (uur)
5
10
Tijd (uur)
Figuur 4.10 Stabiliteit methedrone
Figuur 4.11 Stabiliteit 5-APB
46
15
Stabiliteit Naphyrone
120
120
100
100
Stabiliteit (%)
Stabiliteit (%)
Stabiliteit MDPV
80 60 40 20 0
80 60 40 20 0
0
5
10
15
0
5
Tijd (uur)
Figuur 4.13 Stabiliteit naphyrone
Stabiliteit Pentylone
Stabiliteit β-ethylmethcathinone
120
120
100
100
Stabiliteit
Stabiliteit (%)
15
Tijd (uur)
Figuur 4.12 Stabiliteit MDPV
80 60 40 20
80 60 40 20
0
0 0
5
10
15
0
5
Tijd (uur)
10
15
Tijd (uur)
Figuur 4.14 Stabiliteit pentylone
Figuur 4.15 Stabiliteit β-ethylmethcathinone
Stabiliteit Cathinone
Stabliteit 3-MeO-PCP 120
120
100
100
Stabiliteit (%)
Stabilteit (%)
10
80 60 40 20 0
80 60 40 20 0
0
5
10
15
0
Tijd (uur)
5
10
Tijd (uur)
Figuur 4.16 Stabiliteit 3-MeO-PCP
Figuur 4.17 Stabiliteit cathinone
47
15
Stabliteit (%)
Stabiliteit Bufotenine 120 100 80 60 40 20 0 0
5
10
15
Tijd (uur) Figuur 4.18 Stabiliteit bufotenine
Er kan wel telkens een daling gezien worden van gemiddeld 10 % tussen de eerste en de laatste injectie. Bovendien is er na 10 uur en 30 minuten geen normale verdeling meer rond 100 %, dit kan wijzen op instabiliteit van de componenten, maar ook op een vermindering van het gemeten signaal, door eventuele vervuiling van de cone. Bij cathinone (figuur 4.17) daalt de stabiliteit vanaf 12 uur onder de 80 %, na 14 uur en 30 minuten is deze gedaald tot 76 %. Dit kan ook deels te wijten zijn aan de variatie in herhaalbaarheid van injectie. Toch zou de analyse voor de zekerheid beter uitgevoerd worden binnen de 12 uur nadat de stalen in de autosampler geplaatst worden. Bovendien zal voor en na een analysebatch, die meestal uit minder dan 40 injecties bestaat met elk een analyseduur van 15 minuten, een controlestandaard geïnjecteerd worden; het resultaat hiervan wordt geëvalueerd ten opzichte van de grenzen van een Shewart controlekaart.
4.5 SPECIFICITEIT Voor de componenten methedrone, butylone, 5-APB, naphyrone, pentylone, bufotenine, 3MeO-PCP, cathinone en MDPV zijn er geen interfererende componenten. Dit wil zeggen dat de methode specifiek is voor deze componenten ten opzichte van de andere componenten opgenomen in de MS-methode. Voor β-ethylmethcathinone daarentegen zijn er 3 andere componenten, 3,4 dimethylmethcathinone; pentedrone en methylbuphedrone, die een piek geven ter hoogte van β-ethylmethcathinone. Deze 4 componenten hebben allen hetzelfde moleculair gewicht en dezelfde transities. Ook de retentietijden van β-ethylmethcathinone, pentedrone en methylbuphedrone liggen dicht bij elkaar, de componenten elueren van de kolom na respectievelijk 3,71; 3,74 en 3,96 minuten. 3,4 dimethylmethcathinone daarentegen kan onderscheiden worden met een retentietijd van 4,21 minuten.
48
De interfererende componenten pentedrone en methylbuphedrone voldeden aan de identificatiecriteria, waardoor ze dus wel degelijk als methedrone zullen geïdentificeerd worden. De ion ratio’s verschillen niet meer dan 50 % van de ion ratio van β-ethylmethcathinone en de retentietijden verschillen niet meer dan 2,5 % (zie tabel 4.15). Wanneer in een onbekend staal één van deze componenten teruggevonden wordt zal dit bevestigd moeten worden met behulp van een andere methode, zoals full-scan GC-MS, die de componenten wel kan onderscheiden. Bovendien betekent dit wanneer bijvoorbeeld β-ethylmethcathinone en pentylone in éénzelfde onbekend staal aanwezig zijn, dat ook pentylone zal gedetecteerd worden als βethylmethcathinone. Bij een semi-kwantitatieve bepaling zal de piekoppervlakte voor βethylmethcathinone dus de som zijn van beide piekoppervlakten waardoor er een overschatting zal zijn van de concentratie aan β-ethylmethcathinone in het staal. Vandaar dat indien deze component gedetecteerd wordt, dit nagegaan moet worden aan de hand van GC-MS full-scan of een andere methode die deze componenten kan onderscheiden. Tabel 4.15 Ion ratio, RT en piekopp. van interfererende componenten met β-ethylmethcathinone Component
Ion ratio
RT
Pentedrone
3,32
3,77
1200633,80
Methylbuphedrone
3,54
3,98
862073,81
3,4 dimethylmethcathinone
14,37
4,24
853132,38
Β-ethylmethcathinone
3,69
3,77
771905,88
49
Piekoppervlakte
5
CONCLUSIE
Er werden twee UPLC-MS/MS methoden, voorafgaand door een alkalische vloeistofvloeistofextractie, ontwikkeld. Enerzijds voor het screenen van synthetische cathinonen en andere designerdrugs in bloed en urine en anderzijds voor het screenen van synthetische cannabinoïden in bloed. Wegens gebrek aan tijd kon deze laatste methode niet gevalideerd worden. De methode kan wel gebruikt worden voor het identificeren van de, geïnfuseerde en de in MS-methode geprogrammeerde synthetische cannabinoïden, in inbeslaggenomen overtuigingsstukken zoals plantenmateriaal, potpourri en poeders. De methode voor de synthetische cathinonen in bloed kan voor de componenten MDPV, βethylmethcathinone, pentylone, methedrone, butylone, 5-APB, cathinone en 3-MeO-PCP gebruikt worden als screeningsmethode met een cut-off waarde van 10 ng/mL. Voor de componenten methedrone, butylone, 5-APB, cathinone en 3-MeO-PCP zijn er beperkingen in de herhaalbaarheid ( > 20 %) en in de reproduceerbaarheid ( > 20 %). Dit kan te wijten zijn aan een gebrek in herhaalbaarheid van de matrixeffecten. Voor methedrone kan bovendien ook het gebrek aan herhaalbaarheid van het extractierendement ( CV = 34,71 %) aan de basis liggen van de imprecisie. Ook de variatie van de herhaalbaarheid voor injectie is hier deels de oorzaak. Voor de componenten naphyrone en bufotenine voldoet de berekende detectielimiet niet aan de specificaties (< 10 ng/mL) en de kalibratiecurve van bufotenine kan niet als lineair beschouwd worden. Deze methode kan voor bufotenine en naphyrone dus enkel gebruikt worden voor kwalitatieve bepalingen. Daarnaast voldeed de screeningsmethode voor de cathinonen in urine met een cut-off waarde van 200 ng/mL aan de vooropgestelde specificaties voor de componenten methedrone, pentylone, butylone, 5-APB, naphyrone, cathinone, β-ethylmethcathinone, MDPV en 3-MeOPCP. Om deze methode ook te gebruiken voor het screenen van bufotenine is verder onderzoek noodzakelijk. De herhaalbaarheid (37,49 %) en de reproduceerbaarheid (29,47 %) voldeden niet aan de eisen. Dit kan deels te wijten zijn aan de slechte herhaalbaarheid van de matrixeffecten en de extractieprocedure ( CV = 118,55 %). De kalibratiecurve voor bufotenine is niet lineair. Bovendien zijn de matrixeffecten (-87,58 % ; - 52,21 %) veel te hoog, dit kan opgelost worden door gebruik te maken van het gedeutereerd analoog als interne standaard, welke hiervoor zal compenseren. De terugvinding na extractie voor bufotenine is slechts 9,85 %, de staalvoorbereiding zal dus aangepast moeten worden. De transities voor bufotenine werden in 50
de MS-methode behouden, een positief resultaat voor bufotenine in een onbekend staal geeft evenwel geen indicatie over de aanwezige concentratie en dient te worden geconfirmeerd aan de hand van een andere methode. De stabiliteit in de mobiele fase werd getest over 14 uur en 30 min. Hierbij werd voor alle componenten een daling gezien van ongeveer 10 % tussen de eerste en laatste injectie. Voor cathinone daalde de stabiliteit onder de 80 % na 12 uur. Het is dus beter om de analyse uit te voeren binnen de 12 uur nadat de stalen in de autosampler geplaatst worden. Bovendien zullen de componenten uit de MS-methode, 3,4 dimethylmethcathinone; pentedrone en methylbuphedrone
interfereren
met
het
component
β-ethylmethcathinone.
β-
ethylmethcathinone, pentedrone en methylbuphedrone kunnen niet onderscheiden worden van elkaar doordat ze dezelfde moleculaire gewichten, transities, ion ratio’s en retentietijden hebben. Vandaar dat indien één van deze componenten gedetecteerd wordt, een confirmatietest moet uitgevoerd worden met een andere methode die deze componenten wel kan onderscheiden.
51
6
REFERENTIELIJST
1.
H. Peeters (VAD), dossier: nieuwe psychoactieve stoffen. Brussel. F. Matthys, 2013
2.
C. Wyckmans, A. van Nuijs, A. Covaci. Nieuwe pschoactieve stoffen: legale drugs in opmars. Collegazetje 2015, 26-28.
3.
Wong YL. Synthetic cannabinoids in herbal products. Drugs. 2011;
4.
Fattore L, Fratta W. Beyond THC: The New Generation of Cannabinoid Designer Drugs. Front Behav Neurosci. 2011;5(September):1–12.
5.
Vardakou I, Pistos C, Spiliopoulou C. Spice drugs as a new trend: Mode of action, identification and legislation. Toxicol Lett [Internet]. Elsevier Ireland Ltd; 2010;197(3):157–62. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.toxlet.2010.06.002
6.
Research a systematic review. 2008;178(13).
7.
Prosser JM, Nelson LS. The Toxicology of Bath Salts: A Review of Synthetic Cathinones. J Med Toxicol. 2012;8:33–42.
8.
Coppola M, Mondola R. Synthetic cathinones: Chemistry, pharmacology and toxicology of a new class of designer drugs of abuse marketed as “ bath salts” or “ plant food.” Toxicol Lett [Internet]. Elsevier Ireland Ltd; 2012;211(2):144–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.toxlet.2012.03.009
9.
Miotto K, Striebel J, Cho AK, Wang C. Clinical and pharmacological aspects of bath salt use: A review of the literature and case reports. Drug Alcohol Depend [Internet]. Elsevier Ireland Ltd; 2013;132(1-2):1–12. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.drugalcdep.2013.06.016
10.
German CL, Fleckenstein AE, Hanson GR. Bath salts and synthetic cathinones: An emerging designer drug phenomenon. Life Sci [Internet]. Elsevier Inc.; 2014;97(1):2–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lfs.2013.07.023
11.
Baumann MH, Solis E, Watterson LR, Marusich J a., Fantegrossi WE, Wiley JL. Baths Salts, Spice, and Related Designer Drugs: The Science Behind the Headlines. J Neurosci. 2014;34(46):15150–8.
12.
Torres GE, Gainetdinov RR, Caron MG. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nat Rev Neurosci [Internet]. 2003 Jan;4(1):13–25. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrn1008
13.
Swartz ME, Murphy BJ. Ultra performance liquid chromatography : tomorrow ’ s HPLC technology today. Synthesis (Stuttg). 2004;(June).
14.
Böhme D, Boyd B. Editorial: Canadian mass spectrometry: instrumentation development. Mass Spectrom Rev. 2009;28:869. 52
15.
Ni J, Rowe J. Microdosing Assessment to Evaluate Pharmacokinetics and Drug Metabolism Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Technology. 2010;
16.
Simões SS, Silva I, Ajenjo a C, Dias MJ. Validation and application of an UPLC-MS/MS method for the quantification of synthetic cannabinoids in urine samples and analysis of seized materials from the Portuguese market. Forensic Sci Int [Internet]. 2014;243:117– 25. Available from: http://www.fsijournal.org/article/S0379-0738(14)00307-7/abstract
17.
European Laboratory Guidelines for Legally Defensible Workplace Drug Testing 1 . Urine Drug Testing. :1–37.
18.
Development M. Scientific working group for forensic toxicology (SWGTOX) standard practices for method validation in forensic toxicology. J Anal Toxicol. 2013;37:452–74.
http://www.chromedia.org (20/03/2015) http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm (20/03/2015) http://www.waters.com/webassets/cms/support/docs/715001371.pdf (27/03/2015) https://ewsd.wiv-isp.be/default.aspx (16/05/2015)
53
7
BIJLAGEN
BIJLAGE 1: OVERZICHT MG, TRANSITIES, CONE VOLTAGE, COLLISIE ENERGIE EN RETENTIETIJDEN VAN DE SYNTHETSICHE CATHINONEN Component
MG (g/mol)
Precursor ion (m/z)
Cone voltage (V)
Methylbuphedrone
191,10
192,05
20,00
Methylmethcatinone
177,24
178,05
21,00
3,4 dimethylmethcathinone
191,27
192,10
20,00
Pentedrone
191,27
192,05
20,00
Butylone
221,11
222,30
21,00
Pentylone
235,28
236,00
22,00
Methylone
207,22
208,20
28,00
MDPV
275,35
276,10
38,00
Naphyrone
281,39
282,00
30,00
β-ethylmethcathinone
191,27
192,00
20,00
Methedrone
193,24
194,20
28,00
Cathinone
149,19
150,30
19,00
i
Fragment ion (m/z) 192,05 > 174,05 192,05 > 161,05 178,05 > 145,10 178,05 > 160,20 192,10 > 159,10 192,10 >174,10 192,05 > 174,05 192,05 > 161,05 222,30 > 204,10 222,30 > 174,10 236,00 > 218,00 236,00 > 188,10 208,20 > 132,00 208,20 > 160,00 276,10 > 205,00 276,10 > 175,00 282,00 > 141,00 282,00 > 126,10 192,00 > 174,10 192,00 > 161,10 194,20 > 146,00 194,20 > 161,00 150,30 > 132,20 150,30 > 117,20
Collisie energie (ev)
RT (min)
12,00 12,00 20,00 12,00 20,00 12,00 12,00 12,00 17,00 12,00 15,00 17,00 28,00 18,00 20,00 22,00 24,00 28,00 12,00 12,00 30,00 22,00 10,00 18,00
3,96 3,11 4,21 3,74 2,77 3,85 2,00 4,58 7,38 3,72 2,46 1,66
BIJLAGE 2: OVERZICHT MG, TRANSITIES, CONE VOLTAGE, COLLISIE ENERGIE EN RETENTIETIJDEN VAN DE ANDERE DESIGNERDRUGS Component
MG Precursor Cone (g/mol) ion (m/z) voltage (V)
2C-I
307,13
307,95
18,00
Phenibut
179,22
180,05
17,00
4-fluoroamfetamine
153,20
154,05
15,00
Diclazepam
319,19
319,90
40,00
Etizolam
342,07
342,95
40,00
Methoxphinidine
295,42
296,10
22,00
Diphenidine
265,39
266,15
23,00
Methoxetamine
247,33
248,10
20,00
5-IT
174,24
175,05
12,00
3-MeO-PCP
273,41
274,15
19,00
Bufotenine
204,27
205,20
20,00
Psilocybine
284,25
285,51
35,00
5-APB
175,23
176,00
12,00
Ocfentanil
370,46
371,00
32,00
PMMA
179,26
180,10
18,00
Scopolamine
303,35
304,20
30,00
ii
Fragment ion (m/z)
Collisie RT energie (eV) (min)
307,95 > 290,90 307,95 > 275,90 180,05 > 163,05 180,05 > 145,05 154,05 > 137,05 154,05 > 109,05 319,90 > 228,05 319,90 > 154,05 342,95 > 314,00 342,95 > 289,00 296,10 > 211,10 296,10 > 86,10 266,15 > 181,05 266,15 > 86,10 248,10 > 203,05 248,10 >175,10 175,05 > 158,15 175,05 > 130,15 274,15 > 189,15 274,15 > 121,15 205,20 > 58,00 205,20 > 160,00 285,51 > 58,10 285,51 > 205,10 176,00 > 159,00
12,00 23,00 10,00 13,00 9,00 17,00 30,00 30,00 23,00 20,00 12,00 12,00 18,00 15,00 13,00 18,00 10,00 20,00 10,00 18,00 15,00 18,00 22,00 17,00 12,00
371,00 > 188,00 371,00 > 105,10 180,10 > 121,10 180,10 > 149,10 304,20 > 138,20 304,20 > 156,20
22,00 35,00 20,00 9,00 24,00 18,00
5,17 1,25 2,72 10,97 9,37 7,41 6,65 3,95 2,25 6,46 1,16 0,98 3,36 5,40 2,91 2,26
BIJLAGE 3: OVERZICHT MG, TRANSITIES, CONE VOLTAGE, COLLISIE ENERGIE EN RETENTIETIJDEN SYNTHETISCHE CANNABINOÏDEN Component
MG (g/mol)
Precursor Cone ion (m/z) voltage (V)
JWH-210
369,50
370,10
38,00
JWH-018
341,45
342,10
40,00
JWH-122
355,47
356,30
42,00
JWH-307
385,47
386,05
31,00
JWH-081
371,50
372,10
30,00
AM-2201
359,44
360,15
35,00
AM-2233
458,34
458,95
35,00
AM-694
435,27
436,05
33,00
WIN48,098
378,46
379,15
27,00
MAM-2201
373,46
374,10
35,00
UR-144
311,50
312,15
35,00
JWH-073
327,42
328,20
35,00
THJ-018
342,40
343,10
25,00
HU-210
386,56
387,15
26,00
iii
Fragment ion (m/z) 370,10 > 183,10 370,10 > 214,10 342,10 > 155,10 342,10 > 127,10 356,30 > 169,10 356,30 > 214,20 386,05 > 169,10 386,05 > 214,20 372,10 > 185,10 372,10 > 214,15 360,15 > 155,05 360,15 > 127,10 458,95 > 98,10 458,95 > 112,10 436,05 > 309,20 436,05 > 231,00 379,15 > 135,10 379,15 > 114,10 374,10 > 169,10 374,10 > 232,15 312,15 > 125,15 312,15 > 214,15 328,20 > 155,05 328,20 > 127,05 341,10 > 215,10 341,10 > 145,10 387,15 > 243,15 387,15 > 133,15
Collisie energie (eV)
RT (min)
27,00 27,00 25,00 45,00 26,00 26,00 26,00 25,00 30,00 25,00 25,00 53,00 26,00 25,00 20,00 27,00 21,00 30,00 25,00 25,00 22,00 25,00 25,00 40,00 17,00 30,00 18,00 25,00
4,59 3,47 4,27 4,11 3,90 2,65 0,81 2,11 1,34 3,09 4,16 3,23 / 4,84
VERSLAG EVENING LECTURES Dr. I. Huybrechts. Research on the causes of human cancer and scientific strategies for cancer prevention and control Kanker is een wereldwijde epidemie en één van de meest voorkomende doodsoorzaken. Er is een verband tussen het aantal dodelijke aflopen van kanker en de klasse waarin de patiënten zich bevinden. 70 % van de dodelijke kankers vindt plaats in laag- en middeninkomens landen. De meest voorkomende kankers bij mannen zijn longkanker en prostaatkanker, bij vrouwen zijn dit longkanker en borstkanker. Vooral long-, maag-, lever-, colorectale- en borstkanker dragen bij tot het sterftecijfer. Deze zijn verantwoordelijk voor 50 % van alle dodelijke kankers. Naast de invloed van de genetische predispositie, zijn er 8 risicofactoren die betrekking hebben op de levensstijl, waarbij het gebruik van tabak de belangrijkste is, die verantwoordelijk zijn voor 50 % van alle dodelijke kankers. Strategieën om deze risicofactoren te reduceren zullen een grote impact hebben op de vermindering van het aantal gevallen van kanker wereldwijd. International Agency for Research on Cancer (IARC) is een agentschap die deel uitmaakt van de Wereldgezondheidsorganisatie en die onder andere onderzoek doet naar de oorzaken bij het ontstaan van kanker. De IARC monografieën zijn een serie van wetenschappelijke reviews die omgevingsfactoren onderzoeken die mogelijk het risico op kanker kunnen verhogen. De agentia worden onderverdeeld in 5 klassen (groep 1, 2A, 2B, 3 en 4) op basis van de sterkte van wetenschappelijke evidentie dat de blootstelling van deze factor een kanker hazard kan zijn. Deze monografieën worden gebruikt door gezondheidsagentschappen als een bron voor wetenschappelijke informatie over gekende of verwachte carcinogenen.
Prof. R. Schiffelers. RNA Therapeutic: opportunities & challenges Vele ziekten, waaronder kanker en auto-immuunziekten worden veroorzaakt door een overexpressie van specifieke proteïnen, in deze voorbeelden respectievelijk oncogenen en cytokines. Een mogelijke therapie voor deze aandoeningen is interfereren met de verschillende stappen van de proteïnesynthese. Hierbij wordt DNA eerst overgeschreven met behulp van RNA polymerase tot mRNA, dit wordt de transcriptie genoemd. Vervolgens wordt de mRNA-streng vertaald tot proteïnen met behulp van tRNA ter hoogte van de ribosomen, deze stap is de translatie.
iv
In deze lezing wordt de interferentie ter hoogte van de translatiestap besproken, het gaat hierbij om antisense DNA oligonucleotiden. Dit zijn gesynthetiseerde oligonucleotiden die complementair zijn aan de mRNA-streng en bijgevolg hiermee binden, hierdoor zijn de ribosomen niet meer in staat om op deze mRNA-streng te binden, waardoor de translatie en bijgevolg de productie van specifieke proteïnen geblokkeerd wordt. De RNA therapie is momenteel nog zeer uitdagend. De moeilijkheden hierbij zijn de snelle klaring, de afbraak en de intracellulaire activiteit. Vooral het bereiken van de target cel is niet eenvoudig, aangezien de nucleotiden doorheen de celmembraan moeten diffunderen. Hierbij moeten hulpmiddelen gebruikt worden waaronder vb. elektroporatie, waarbij door een korte voltagepuls op de celmembraan, deze permeabel wordt voor de nucleotiden.
Prof John Lipuma. The evolution of microbiology in cystic fibrosis Cystische fibrose (CF), ook wel mucoviscidose genoemd, is de meest voorkomende levensbedreigende erfelijke (autosomaal recessief) aandoening in ons land. Het wordt veroorzaakt door een mutatie in het gen die codeert voor het Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR-eiwit), deze fungeert als een chloorkanaal. De symptomen van de ziekte kunnen plaatsvinden in verschillende organen maar de meest voorkomende symptomen zijn deze ter hoogte van de ademhalingswegen. Aan de basis hiervan ligt de spiraal van obstructie, infectie en inflammatie. De obstructie wordt veroorzaakt door de abnormale vorm van het CFTR-eiwit, waardoor de slijmvliezen niet genoeg bevochtigd worden en er een verminderde mucociliaire klaring is. In 1938 werd cystische fibrose ontdekt, vervolgens werd het belang van infectie als oorzaak van deze ziekte ingezien en heeft men allerlei nieuwe antibiotica ontwikkeld en toegediend aan de patiënten, waarna een grote toename in overleving kon gezien worden. In tussentijd werd Staphylococcus als primair pathogeen vervangen door Pseudomonas. De tegenzijde van het antibioticagebruik was het ontstaan van resistentie. Van 1975 tot 2005 legde men de focus op R. Aeruginosa en werden nieuwe antibiotische behandeling strategieën ontwikkeld gebaseerd op deze bacterie. De bezorgdheid over de resistentie tegen de antibiotica daalde. Vanaf 2005 tot op heden voert men de toepassing van cultuur-onafhankelijke methoden in en probeert men een inzicht te krijgen in het belang van microbiële interacties en in de complexiteit van de microbiologie. v
vi
