UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Farmaceutische Technologie Academiejaar 2009-2010
ZOEKTOCHT NAAR STABILIZERS EN OPTIMALE PRODUCTIEPARAMETERS IN DE ONTWIKKELING VAN EEN DROOG POEDERVACCIN VOOR PLUIMVEE TEGEN DE NEWCASTLE DISEASE
Kaat STRYBOL Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. dr. apr. C. Vervaet
Commissarissen Prof. dr. apr. H. Nelis Dr. apr. K. Raemdonck
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperking van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
31 mei 2010
Promotor
Auteur
Prof. dr. apr. C. Vervaet
Kaat Strybol
DANKWOORD
In de eerste plaats wil ik Prof. dr. apr. C. Vervaet bedanken om mij de kans te geven mijn onderzoeksstage op het labo te mogen uitvoeren en voor de algemene begeleiding.
Eveneens gaat mijn dank uit naar apr. K. Huyge. Bedankt Katrien om mij wegwijs te maken in deze materie en voor de dagelijkse ondersteuning en begeleiding.
De gezellige babbels tussendoor en je enthousiasme tijdens het onderzoek van “onze poedertjes” maakten het voor mij veel aangenamer. Ook bedankt voor de adviezen bij het schrijven en voor het corrigeren van mijn tekst.
Voorts wens ik ook de assistenten en het labopersoneel te bedanken voor het oplossen van allerlei praktische problemen in het labo en voor de leuke sfeer.
Tenslotte bedank ik ook mijn ouders voor hun steun en het nalezen van mijn thesis.
INHOUDSOPGAVE
1. INLEIDING ..................................................................................................................... 1 1.1. NEWCASTLE DISEASE ....................................................................................................... 1 1.1.1. Pathogenese en classificatie .................................................................................... 1 1.1.2. Diagnose ................................................................................................................... 3 1.1.2.1. Klinische symptomen ........................................................................................ 3 1.1.2.2. Serologische diagnose ....................................................................................... 3 1.1.3. Controle en preventie .............................................................................................. 5 1.2. VACCINATIE BIJ PLUIMVEE .............................................................................................. 5 1.2.1. Types vaccins ............................................................................................................ 5 1.2.1.1. Levend geattenueerde vaccins.......................................................................... 5 1.2.1.2. Geïnactiveerde vaccins...................................................................................... 6 1.2.2. Huidige vaccinatietechnieken .................................................................................. 6 1.2.2.1. Individuele vaccinatie ........................................................................................ 6 1.2.2.2. Massavaccinatie ................................................................................................ 7 1.3. DROGE POEDERAEROSOLEN VOOR MASSAVACCINATIE VIA RESPIRATOIRE ROUTE.... 10 2. OBJECTIEVEN .............................................................................................................. 12 3. MATERIALEN ............................................................................................................... 14 3.1. MANNITOL ..................................................................................................................... 14 3.2. TREHALOSE .................................................................................................................... 14 3.3. MYO-INOSITOL .............................................................................................................. 16 3.5. GLYCINE ......................................................................................................................... 16 3.6. BETAÏNE ......................................................................................................................... 17 4. METHODEN ................................................................................................................. 18 4.1. STABILITEITSONDERZOEK VAN B-GALACTOSIDASE IN GESPROEIDROOGDE POEDERS 18 4.1.1. Productie van droge poeders via sproeidrogen ..................................................... 18 4.1.1.1. Principe ............................................................................................................ 18 4.1.1.2. Methode .......................................................................................................... 19 4.1.2. Stabiliteit gesproeidroogde poeders: ß-galactosidasetest .................................... 20 4.1.3. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders ................................................... 21 4.1.3.1. Scanning Elektronenmicroscoop (SEM): bepaling morfologie........................ 21
4.1.3.2. Laserdiffractie: bepaling partikelgrootte ........................................................ 22 4.1.3.3. Karl Fischer titratie: bepaling vochtgehalte .................................................... 24 4.1.3.4. Dynamic Vapour Sorption: bepaling hygroscopiciteit .................................... 25 4.1.3.5. Differential Scanning Calorimetrie: bepaling smelt en glastransitietemperatuur ......................................................................................... 26 4.2. ULTRASOON GESPROEIDROOGDE POEDERS ................................................................. 27 4.3. DESIGN OF EXPERIMENTS: INVLOED VAN DE SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE ENZYMSTABILITEIT ........................................................................................................... 28 4.3.1. Inleidende begrippen ............................................................................................. 28 4.3.2. Design opzet ........................................................................................................... 39 4.3.3. Evaluatie van de poederstalen ............................................................................... 31 4.3.4. Analyse van het experimenteel design .................................................................. 31 4.3.4.1. Evaluatie van de ruwe data ............................................................................. 31 4.3.4.2. Lineaire regressie analyse ............................................................................... 32 4.3.4.3. Gebruik van het model .................................................................................... 33 4.4. VIRUSTITRATIE ............................................................................................................... 33 4.4.1. Principe ................................................................................................................... 33 4.4.2. Methode ................................................................................................................. 34 5. RESULTATEN EN DISCUSSIE.......................................................................................... 36 5.1. STABILITEITSONDERZOEK VAN B-GALACTOSIDASE IN GESPROEIDROOGDE POEDERS 36 5.1.1. Stabiliteit gesproeidroogde poeders: β-galactosidasetest .................................... 36 5.1.2. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders ................................................... 38 5.1.2.2. Morfologie ....................................................................................................... 38 5.1.2.3. Partikelsgroottedistributie .............................................................................. 39 5.1.2.4. Vochtgehalte ................................................................................................... 41 5.1.2.5. Smelt- en glastransitietemperatuur ................................................................ 42 5.1.2.6. Hygroscopiciteit............................................................................................... 43 5.2. ULTRASOON GESPROEIDROOGDE POEDERS................................................................. 44 5.2.1. Morfologie .............................................................................................................. 44 5.2.2. Partikelgroottedistributie ....................................................................................... 45 5.3. EXPERIMENTAL DESIGN/ INVLOED VAN DE SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE ENZYMSTABILITEIT ........................................................................................................... 46
5.3.1. Evaluatie van de poederstalen ............................................................................... 46 5.3.2. Analyse van het experimenteel design .................................................................. 47 5.3.2.1. Evaluatie van de ruwe data ............................................................................. 47 5.3.2.2. Lineaire regressie analyse ............................................................................... 47 5.3.2.3. Gebruik van het model .................................................................................... 48 5.4. Virustitratie.................................................................................................................... 49 6. CONCLUSIE.................................................................................................................. 51 7. LITERATUURSLIJST....................................................................................................... 53
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
Bet
Betaïne
BSA
Bovine Serum albumine
DVS
Dynamic Vapour Sorption
DSC
Differential scanning calorimetry
EID50
Egg infectious dose 50% endpoint
ELISA
Enzyme-inked immunosorbent assay
Glyc
Glycine
H
Hemagglutinine
HA-test
Hemagglutinatie-test
Ino
Myo-inositol
Mann
Mannitol
N
Neuraminidase
NCD
Newcastle Disease
PBS
Phosphate Buffered Saline
PVP
Polyvinylpyrrolidone
RBC
Rode bloedcellen
RH
Relatieve vochtigheid
SEM
Scanning elektronenmicroscoop
Treh
Trehalose
1. INLEIDING
De pluimvee-industrie speelt de dag van vandaag een belangrijke rol in de economie. In pluimveebedrijven kunnen duizenden kippen samen zitten in één ruimte. Hierdoor is het risico op verspreiding van ziektes tussen de dieren zeer groot. Maatregelen zoals vaccinatie en hygiënische maatregelen moeten genomen worden om het uitbreken en verspreiden van deze ziektes te voorkomen (Cargill, 1999; Alexander et al, 2004).
Pluimveehouders moeten zich tegenwoordig aan een strikt vaccinatieschema houden om zo de uitbraak van ziektes te vermijden. Onder andere de Newcastle Disease (NCD), een respiratoire aandoening die ook de pseudovogelpest genoemd wordt (Rauw et al, 2009), is opgenomen in dit vaccinatieschema (tabel 1.1.).
TABEL 1.1.: KLASSIEK VACCINATIESCHEMA VOOR PLUIMVEE (http://www.cbip-vet.be)
1.1.
Leeftijd
Toedieningswijze
Reproductiedieren
Legkippen
1 dag
I. M. Spray
Marek Newcastle
Marek Newcastle
2à4 weken
drinkwater of spray
Bronchitis Newcastle
Bronchitis Newcastle
7 à 12 weken
drinkwater of spray
Gumboro Newcastle
Gumboro Newcastle
14 à 18 weken
drinkwater of spray
Bronchitis Encefalomyelitis
Bronchitis Encefalomyelitis
I.M.
Newcastle Newcastle
Newcastle Newcastle
Mestkippen
Newcastle Bronchitis
Label mestkippen Marek Newcastle Bronchitis
Newcastle
Newcastle
Gumboro
Gumboro
NEWCASTLE DISEASE
1.1.1. Pathogenese en classificatie
De Newcastle Disease werd voor het eerst gesignaleerd bij pluimvee in Java, Indonesië en Newcastle-upon-Tyne in 1926. De dag van vandaag is de ziekte wereldwijd verspreid. Het virus heeft een zeer brede range aan gastheren, 27 van de 50 ordes van 1
vogels werden reeds gerapporteerd besmet te zijn met het Newcastle Disease Virus (NCV) (Seal et al, 1999).
De verspreiding van het virus kan gebeuren via direct contact met besmette vogels, via contact met besmet materiaal (bijvoorbeeld voeder of drinkwater, verontreinigd door uitwerpselen) of via de lucht. Kuikens kunnen besmet worden door viruspartikels die zich op de eierschaal bevinden (http://www.afsca.be/sp/sa-newcastle/newcastle_nl.asp).
Het Newcastle Disease virus maakt deel uit van de familie Paramyxoviridae, meer bepaald van de sub-familie Paramyxoviriniae. Het is een omhuld RNA virus met een negatief enkel-strengig genoom. De belangrijkste antigenen op het oppervlak van het virus die verantwoordelijk zijn voor de protectieve immuunrespons zijn de fusie-glycoproteïnen (Fglycoproteïnen) en de haemaglutinine (H) en neuraminidase (N) oppervlakte glycoproteïnen (Alexander et al, 2004; Seal et al, 1999; Reddy et al, 1996).
FIGUUR 1.1.: PARAMYXOVIRUS MET F EN HN GLYCOPROTEÏNEN (http://pathmicro.med.sc.edu)
Er zijn verschillende Newcastle Disease virusstrengen die in 5 pathotypes onderverdeeld kunnen worden. Viscerotrope en neurotrope velogenische strengen zijn de meest virulente stammen voor kippen en kunnen acute letale infecties met aantasting van de ingewanden veroorzaken. Neurologische en respiratoire symptomen met lage mortaliteit kunnen voorkomen bij infecties met mesogene strengen, terwijl de lentogene strengen mildere infecties ter hoogte van het respiratoire systeem veroorzaken. Ten slotte zijn er ook 2
asymptomatische enterische strengen die enkel verantwoordelijk zijn voor subklinische enterische
infecties
(Alexander
et
al,
2004;
http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/111/newcastle-disease-paramyxovirus-1). 1.1.2. Diagnose 1.1.2.1. Klinische symptomen
De Newcastle Disease tast zowel het respiratoir, nerveus als spijsverteringsstelsel aan. De incubatieperiode van het virus bedraagt 2 tot 15 dagen. Symptomen zijn onder andere plotse dood, zwelling van de weefsels rond de ogen en nek, hoesten, kortademigheid, diarree, verlamming, depressie, draainek, vermindering tot volledig stoppen van de productie van eieren en productie van eieren met een dunnere schaal (Gallili & Ben-Nathan, 1998; http://www.aphis.usda.gov/lpa/pubs/pub_ahend.html).
FIGUUR 1.2.: BROOSHEID VAN DE EIERSCHAAL ALS GEVOLG VAN DE NEWCASTLE DISEASE (http://partnersah.vet.cornell.edu)
1.1.2.2. Serologische diagnose
De aanwezigheid van antilichamen tegen een virus tonen aan dat het dier besmet is met dat virus, maar dat wil niet noodzakelijk zeggen dat het besmette dier aan de ziekte lijdt. Een hoge antilichaam titer wijst wel op een recente infectie. Er zijn twee methoden om de antilichaam titer te meten: de hemagglutinatie test en de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Voor beide methoden zijn bloedstalen van de kippen nodig (Alexander et al, 2004). 3
Hemagglutinatietest De hemagglutinatietest is gebaseerd op het principe dat sommige virussen, die in hun kapsied of envelop de virale hemagglutine glycoproteïnen bevatten, in staat zijn zich aan erytrocyten vast te hechten. Door een brug te vormen tussen 2 of meer bloedcellen kunnen ze een netwerk doen ontstaan.
Influenzavirussen en paramyxovirussen bevatten ook het enzym neuraminidase in hun envelop. Dit enzym zal er voor zorgen dat er elutie ontstaat door gedurende de hemagglutinatie de glycoproteïne receptoren op de wand van de rode bloedcellen af te breken. Elutie is het fenomeen waarbij de virussen terug loskomen van de rode bloedcellen. Zo zal de hemagglutinatie verdwijnen na ongeveer 1 uur bij 37°C.
Of een virus hemagglutinerend is kan visueel makkelijk aangetoond worden. Er worden rode bloedcellen toegevoegd aan een proefbuisje of recipiënt waarin het virus aanwezig is. Als er hemagglutinatie optreedt, zullen de rode bloedcellen niet bezinken naar het diepste punt van het buisje of recipiënt maar bedekken ze de volledige bodem. Indien er geen hemagglutinatie optreedt, zullen de rode bloedcellen wel bezinken en een knop vormen. Dit fenomeen wordt geïllustreerd in onderstaande figuur (cursus Virologie, faculteit diergeneeskunde).
FIGUUR 1.3.: HEMAGGLUTINATIETEST (http://pages.usherbrooke.ca)
4
1.1.3. Controle en preventie
Om de uitbraak van de Newcastle Disease te vermijden moet er veel aandacht besteed worden aan bioveiligheid en hygiëne. Boerderijen en pluimveebedrijven moeten gescheiden worden en verschillende vogelsoorten moeten op verschillende plaatsten gekweekt worden (Alexander et al, 2004). Ook moet er een vlotte toevoer zijn van vers water en moeten geïnfecteerde vogels verwijderd worden (Gallili & Ben-Nathan, 1998; Rauw et al, 2009). Naast het optimaliseren van de levensomstandigheden speelt ook vaccinatie een belangrijke rol in de preventie van NCD (Alexander et al, 2004).
1.2. VACCINATIE BIJ PLUIMVEE 1.2.1. Types vaccins 1.2.1.1. Levend geattenueerde vaccins
Bij vaccinatie van dieren met een levend geattenueerd vaccin wordt het dier geïnfecteerd met een natuurlijk voorkomend virus dat niet virulent genoeg is om een ziekte te veroorzaken of een virus dat afgezwakt is en dus zijn virulentie verloren heeft, maar niet zijn immunogeniciteit.
Levende vaccins kunnen repliceren in hun gastheer. Hierin verschillen ze van geïnactiveerde vaccins. Het nadeel hiervan is dat vaccinatie met levende vaccins kan resulteren in ziekte met klinische symptomen als gevolg aangezien het virusvaccin de gastheer infecteert en op deze manier een immuunreactie uitlokt. Anderzijds is het bij vaccinatie met levende virusvaccins niet noodzakelijk om ieder dier individueel te vaccineren. Het vaccin kan zich namelijk zelf verspreiden van vogel tot vogel.
Dit type vaccin wordt het meest gebruikt omwille van het grote aantal te behandelen dieren en wordt vaak toegediend via massavaccinatietechnieken zoals drinkwater- en sprayvaccinatie. Sommige van deze vaccins vereisen wel individuele applicatie via oogdruppels of injectie (Alexander et al., 2004 ; Cargill, 1999).
5
Voorbeelden van levend geattenueerde Newcastle Disease vaccins zijn de mild virulente B1 en La Sota strengen van het NDV. Deze zijn de meest effectieve levende virusvaccins en worden wereldwijd meest gebruikt (Seal et al, 1999).
1.2.1.2. Geïnactiveerde vaccins
Geïnactiveerde vaccins worden gemaakt door een virus op te kweken in eieren. Daarna wordt de infectieve allantoïsche vloeistof behandeld met een inactiverende stof en met hulpstoffen, zoals minerale olie, om het geïnactiveerde virus immunogener te maken (Gallili & Ben-Nathan, 1998; Alexander et al, 2004).
Een nadeel van dit type vaccins ten opzichte van levende vaccins is dat de virussen dood zijn en zich dus niet langer kunnen repliceren in hun gastheer. Als gevolg hiervan moeten alle vogels individueel gevaccineerd worden wat kan gebeuren via intramusculaire of subcutane injectie.
Geïnactiveerde vaccins zorgen voor een goede protectie tegen het virulent virus doordat ze hoge antilichaam spiegels tegen het virus induceren. In de pluimvee-industrie worden geïnactiveerde vaccins meestal aangewend na een primaire vaccinatie met een levend virus (Alexander et al, 2004).
1.2.2. Huidige vaccinatietechnieken 1.2.2.1. Individuele vaccinatie
FIGUUR 1.4.: VACCINATIE VIA OOGDRUPPELAPPLICATIE (http://www.cdfa.ca.gov)
6
De meest effectieve manier om levende vaccins toe te dienen aan vogels is via oogdruppelapplicatie (zie figuur 1.4). Elke vogel wordt hierbij individueel behandeld en krijgt zo dus een volle dosis vaccin (Cargill, 1999). De meest gebruikte techniek voor het vaccineren met vaccins met olie en aluminiumhydroxide en voor sommige levende vaccins is vaccinatie via intramusculaire injectie. Het vaccin wordt geïnjecteerd ter hoogte van de borst, poot of lagere nek. Het plaatsen van de naald is zeer belangrijk omdat fouten hierbij kunnen leiden tot granulomavorming, verlamming, zwelling en leverpunctie (Cargill, 1999).
In-ovo vaccinatie (zie figuur 1.5.) is een proces waarbij het vaccin toegediend wordt aan bevruchte eieren na 17,5 tot 19 dagen incubatie. Deze techniek behoort tot een snel groeiend terrein van de vaccinatietechnologie (Cargill, 1999; Reddy et al., 1996).
Aangezien de pluimvee-industrie vaak gerelateerd is aan grote aantallen kippen is individuele vaccinatie zeer tijdrovend en hierdoor duur aangezien hiervoor gespecialiseerd personeel nodig is. Daarom is massavaccinatie zowel economisch als praktisch gezien een betere oplossing.
FIGUUR 1.5.: IN-OVO VACCINATIE (http://www.reussir-aviculture.com)
1.2.2.2. Massavaccinatie
Drinkwatervaccinatie (zie figuur 1.6.) is een goede vaccinatiemethode voor levend geattenueerde vaccins, voornamelijk wanneer het gastro-intestinaal stelsel het doelorgaan 7
is, zoals bij de infectieuze bursale ziekte. Het vaccin wordt bij deze methode van massavaccinatie namelijk opgenomen ter hoogte van de gastro-intestinale mucosa. Door de aanwezigheid van de achterste neusopeningen, die de neusholte met de larynx verbinden, kan drinkwatervaccinatie ook gebruikt worden voor de meeste respiratoire virusvaccins. Deze openingen zorgen er immers voor dat het vaccin de neus kan bereiken bij opname via de mond (Cargill, 1999).
FIGUUR 1.6.: MASSAVACCINATIE VIA DRINKWATER (http://www.vactora.com) Alhoewel drinkwatervaccinatie een veel gebruikte methode is, zijn er toch enkele nadelen aan verbonden. Zo blijft het vaccin slechts kort stabiel na oplossing in water. Alle kippen zouden binnen de 2 uur na reconstitutie een voldoende dosis vaccin ingenomen moeten hebben. Ook de kwaliteit van het water moet gegarandeerd zijn. Het mag bijvoorbeeld geen chloor bevatten en desinfectantia die achtergebleven zijn in de drinkbakken moeten vermeden worden (Cargill, 1999).
Een andere zeer effectieve massavaccinatiemethode die gebruikt wordt bij respiratoire virus vaccinatie is toediening via spray en aerosol. Hierbij wordt het gelyofiliseerde vaccin opgelost in niet-gechloreerd water om het daarna met behulp van een sprayapparaat
over
de
kippen
te
(http://www.ema.europa.eu/pdfs/vet/referral/avinew/112901nl4.pdf).
vernevelen Deze
vernevelde
druppels worden door de kippen geïnhaleerd. De druppelgroottedistributie speelt hier een zeer belangrijke rol. Vele sprayapparaten genereren namelijk druppels met een grote druppelgroottedistributie en dus een grote hoeveelheid druppels die niet inhaleerbaar zijn
8
(Corbanie et al, 2006). Deze kunnen oraal of via het oog opgenomen worden of vallen op de grond (Cargill, 1999). Ook de leeftijd van de kip bepaalt de ideale druppelgrootte.
Eendagskuikens worden gevaccineerd via sprayvaccinatie (Gallili & Ben-Nathan, 1998). De druppels zijn vaak te groot om geïnhaleerd te kunnen worden aangezien de kuikens en hun respiratoir systeem vrij klein zijn. De opname van het vaccin gebeurt dus voornamelijk oraal of via het oog aangezien de druppels op de kippen of op de grond vallen en zo opgepikt worden. De druppelgrootte bekomen via de spray is 100-800 µm. Het is belangrijk dat de druppels niet kleiner zijn dan 20 µm want dan kunnen ze via inhalatie de diepere luchtwegen bereiken en zo ernstige post-vaccinale reacties teweeg brengen (Cargill, 1999; Corbanie et al, 2006).
Voor de secundaire vaccinatie van kippen die 2 weken en 4 weken oud zijn wordt aerosolvaccinatie gebruikt (Gallili & Ben-Nathan, 1998). Bij deze kippen zijn in tegenstelling tot de eendagskuikens de diepere luchtwegen de target. Kleinere druppels worden gegenereerd in een range van 10-1000 µm. De ideale druppelgrootte voor 2 weken oude kippen is kleiner dan 5 µm en voor 4 weken oude kippen kleiner dan 10µm (Cargill, 1999; Corbanie et al, 2006).
Ook bij de spray- en aerosolvaccinatie zijn enkele problemen gekend. Zo genereren de meeste vernevelaars een te brede druppelgroottedistributie met als gevolg veel druppels die te groot zijn om geïnhaleerd te kunnen worden tijdens aerosolvaccinatie. Ook kan de efficiëntie van het vaccin verminderen door het gebruik van kraantjeswater, door shear krachten die werkzaam zijn op het vaccin bij de aerosolvorming en door het indrogen van vaccindruppels in de tijdspanne tussen de aerosolgeneratie en opname (Corbanie et al, 2006).
Deze nadelen, zowel van de drinkwater- als van de spray- en aerosolmethoden, dragen bij tot een verminderde efficiëntie van vaccinatie. Daarom moet gezocht worden naar een betere methode die een oplossing kan bieden voor deze problemen.
9
1.3. DROGE POEDERAEROSOLEN VOOR MASSAVACCINATIE VIA RESPIRATOIRE ROUTE
Als
oplossing
voor
de
hierboven
vermelde
problemen
die
huidige
massavaccinatiemethoden met zich meebrengen, kan een droog poederaerosol gebruikt worden als geneesmiddelformulatie. De productie van deze droge poeders kan gebeuren via sproeidrogen. Tijdens het economisch voordelige sproeidroogproces wordt in één stap een poeder verkregen vertrekkende vanuit een vloeistof.
Droge poederaerosolen hebben twee voordelen. Enerzijds is de reconstitutie van het vaccin in water onnodig, waardoor de ongecontroleerde indroging van vloeistofdruppels vermeden wordt. Anderzijds worden via sproeidrogen poeders bekomen met relatief kleine partikelgroottedistributies.
Sproeidrogen is een methode die de laatste jaren veel aandacht gekregen heeft in het onderzoek naar de productie van respiratoire geneesmiddelpartikels. Het is een methode die veel potentieel biedt in de micronisatie van peptiden en proteïnen, zodat deze partikels via de pulmonaire route kunnen afgegeven worden aan de systemische circulatie. Peptiden en proteïnen zijn namelijk te labiel voor mechanische micronisatie door hun complexe tertiaire en quaternaire structuur (Malcolmson et al, 1998).
Om thermolabiele bioactieven zoals proteïnen, bacteriën en virussen tijdens droogprocessen te beschermen moeten thermoprotectoren toegevoegd worden aan de te drogen vloeistof. Veel van deze thermoprotectoren zijn suikers. Zo zijn mannitol, myoinositol en trehalose reeds beschreven als stabilisatoren van vaccins (Amorij et al, 2008; Maa et al, 2004; Burger et al., 2008) en proteïnen (Bakaltcheva et al, 2006) tijdens verscheidene droogprocessen. Ook aminozuren en afgeleiden zoals glycine en betaïne staan beschreven als thermoprotectoren van proteïnen (Caldas et al, 1999).
Het werkingsmechanisme van thermostabiliserende stoffen blijft voorlopig onduidelijk. In verband met de stabilisatie van proteïnen door suikers zijn er twee hypothesen. De eerste hypothese omvat het zogenaamde vitrificatiemodel, waarin beweerd 10
wordt dat de thermoprotectoren de moleculaire bewegingen van het proteïne verminderen door de vorming van een glasachtige matrix rond de proteïne. Anderzijds zegt het watervervangingsmodel dat de suikers bekwaam zijn om te interageren met de proteïne via H-bruggen en hierdoor de waterverwijdering tijdens het droogproces op te vangen. Vaak wordt aangenomen dat er in werkelijkheid een wisselwerking van beide mechanismen plaatsvindt. Algemeen wordt ook gesteld dat om de bioactiviteit te behouden het belangrijk is om de native structuur van de bioactieven zo intact mogelijk te houden (Hill et al, 2005).
Volgens het vitrificatiemodel zouden de beste thermoprotectoren dus amorfe stoffen zijn. Doordat sproeidrogen een snel droogproces is, kunnen amorfe stoffen gevormd worden tijdens het proces. De moleculen krijgen namelijk onvoldoende tijd om zich in een kristalrooster te plaatsen en vormen uiteindelijk een glas. Een nadeel van amorfe stoffen is dat deze vaak onstabiel zijn en zich na verloop van tijd neigen om te zetten naar kristalstructuren met een lagere energie-inhoud. Door deze omzetting kan de native structure van de bioactieve stof verstoord raken, waardoor de bio-activiteit achteruit gaat tijdens de bewaring. Vandaar dat de gesproeidroogde amorfe poeders bewaard moeten worden bij een temperatuur lager dan de glastransitietemperatuur van de amorfe stof (Chang et al, 1996).
Mannitol blijft doorgaans kristallijn, ook na sproeidrogen, waardoor verwacht kan worden dat er tijdens bewaring weinig verlies aan bio-activiteit zal optreden. Trehalose dat beschreven staat als een suiker met een hoge glastransitietemperatuur, kan een molecule zijn die vaccins goed gaat beschermen tijdens droogprocessen én tijdens de bewaring zolang de bewaartemperatuur voldoende onder het glastransitiepunt ligt (Malcolmson et al, 1998).
In voorafvermelde publicaties worden de vernoemde stabilisatoren vaak als enige stabilisator aangewend. In dit werk zullen stabilisatoren vaak in combinatie worden toegepast. Het gebruik van droge poeders voor inhalatie als geneesmiddelvehikel wordt ook onderzocht in de humane geneeskunde (Huang et al, 2007; Amorij et al, 2008).
11
2. OBJECTIEVEN
De Newcastle disease is een besmettelijke respiratoire aandoening bij vogels veroorzaakt door het Newcastle disease virus. Voornamelijk kippen zijn zeer vatbaar voor de ziekte. Aangezien pluimvee een belangrijke schakel is in de huidige economie en een dergelijke uitbraak van de ziekte een groot verlies voor de landbouwer zou betekenen is het uiterst belangrijk dat kippen gevaccineerd worden tegen dit virus. Daar pluimveebedrijven meestal kippen in grote getalen houden, is massavaccinatie, zoals spray- en aerosolvaccinatie, praktisch en economisch de meest geschikte vaccinatiemethode. Aan deze spray- en aerosolvaccinatietechniek zijn echter wel enkele nadelen verbonden zoals de preparatieve reconstitutie van het vaccin in water en de ongecontroleerde indroging van de vaccindruppels. Een mogelijke manier om deze problemen te voorkomen is het gebruik van droge poederaerosolen. Dit onderzoek spitst zich specifiek toe op deze droge poederaerosolen geproduceerd via sproeidrogen.
Een doel van het onderzoek is het vinden van nieuwe stabilisatoren met het oog op de productie van een stabiel vaccin. Een stabilisator moet het vaccin beschermen tijdens het sproeidroogproces en ook tijdens de bewaring. Bij een geschikt gestabiliseerd vaccin in poedervorm is niet enkel de stabilisatie ervan belangrijk, maar zijn ook de fysicochemische karakteristieken
ervan,
zoals
vochtgehalte,
hygroscopiciteit,
morfologie
en
partikelgroottedistributie van groot belang. Een smalle partikelgroottedistributie en partikels groter dan 20 µm zijn gewenst voor een optimale werking van het vaccin. Ook vochtgehalte en hygroscopiciteit van het poeder dienen laag te zijn om de werking van het vaccin te garanderen.
Gedurende het volledige onderzoek wordt gebruik gemaakt van het enzym ßgalactosidase als modelmolecule voor het vaccin.
In het onderzoek worden poeders geproduceerd met verschillende combinaties aan stabilisatoren. Vervolgens worden ze onderzocht op hun stabiliserend vermogen direct na het sproeidroogproces alsook na 1 week en 1 maand bewaring bij 6°C en 25°C. Verder worden ook de poederkarakteristieken bepaald, namelijk de morfologie, deeltjesgrootte, 12
vochtgehalte, smelt- en glastransitietemperatuur, hygroscopiciteit en pH. Dit gebeurt met respectievelijk scanning elektronenmicroscopie, laserdiffractie, Karl Fischer titraties, differential scanning calorimetrie, dynamic vapour sorption en de pH-meter.
Om uit te zoeken of poeders met specifieke partikelgroottes kunnen gesproeidroogd worden, worden waterige oplossingen van stabilisatoren gesproeidroogd met een ultrasone sproeidroger. Deze poeders worden ook onderzocht op hun morfologie en deeltjesgrootte.
Om tot een beter begrip te komen in de effecten van de sproeidroogparameters op het stabiliserend effect van de bekomen poeders wordt een full factorial experimental design opgesteld. De onderzochte procesparameters zijn het vaste stofgehalte van de sproeidroogoplossing (feed), de feedsnelheid door het sproeidroogsysteem, de luchtstroom of airflow verantwoordelijk voor de vorming van de spray en de inlaattemperatuur waarbij de feed verneveld en gedroogd wordt.
13
3. MATERIALEN 3.1. MANNITOL
Mannitol is een polyol of suiker-alcohol, met structuurformule C6H14O6. Het is een wit, geurloos en kristallijn poeder gekarakteriseerd door een zoete smaak. Mannitol, dat geëxtraheerd kan worden uit het gedroogde sap van de manna-es, vertoont polymorfisme. Commercieel wordt het suiker geproduceerd door katalytische of elektrolytische reductie van monosacchariden zoals mannose en glucose. Mannitol is stabiel in droge vorm en in waterige oplossingen. Het is een isomeer van sorbitol, met het belangrijkste verschil tussen de twee dat sorbitol hygroscoop is en mannitol niet (Rowe et al, 2002).
Mannitol werd reeds beschreven als stabilisator van proteïnen bij sproeidrogen (Andya et al, 1999; Costantino et al, 1998).
FIGUUR 3.1.: STRUCTUURFORMULE VAN MANNITOL (http://upload.wikimedia.org)
3.2. TREHALOSE
Trehalose is commercieel beschikbaar als trehalose dihydraat. Trehalose is een natuurlijk voorkomend disaccharide. Het bestaat uit twee glucose moleculen, α,α-1,1 gebonden. Het zijn geurloze, witte kristallen met een zoete smaak. Het disaccharide is chemisch stabiel en een niet-reducerend suiker. Trehalose komt wijd verspreid voor in de natuur, onder andere in dieren, planten en micro-organismen (Rowe et al, 2002).
Trehalose beschermt organismen tegen bevriezing, droogte, hitte, koude en dehydratatie. Trehalose heeft zo een stabiliserende functie. Het is een van de meest stabiele sacchariden. Dit onder meer dankzij zijn zeer hoge glastransitietemperatuur (90°C) en zijn 14
stabiliteit onder lage pH condities waardoor trehalose stabiel blijft onder extreme temperatuursomstandigheden en niet hydrolyseert bij lage pH. Aangezien trehalose een lage
hygroscopiciteit
heeft
is
het
stabiel
bij
hoge
vochtigheidsgraden
(http://www.rspharmchem.com/trehalose.htm).
De combinatie van de hoge glastransitietemperatuur, de hoge stabiliteit onder lage pH en de lage hygroscopiciteit maakt van trehalose een ideale proteïne beschermer bij het sproeidrogen (http://www.hayashibara-intl.com/food/trehalose.html). Na sproeidrogen is trehalose vaak amorf, vandaar dat het wordt gebruikt in combinatie met het kristallijne mannitol teneinde een amorf-kristallijn product te bekomen dat het vaccin kan stabiliseren tijdens zowel het sproeidrogen als de bewaring achteraf.
FIGUUR 3.2.: STRUCTUURFORMULE VAN TREHALOSE (http://en.wikipedia.org)
3.3. MYO-INOSITOL
De best gekende vorm van inositol is myo-inositol, een cyclisch polyol met structuurformule C6H12O6. Myo-inositol is terug te vinden in spierweefsel vandaar de naam.
Een lage hygroscopiciteit en een laag vochtgehalte zijn voordelen van het myoinositol. (http://www.farma.ku.dk/index.php/Kristina-Mosen-F/5045/0/).
In een studie van Burger et al. (2008) worden formulaties gebruikt op basis van myoinositol voor het stabiliseren van virusvaccins tijdens het droogproces en de bewaring
15
achteraf. Aangezien het product moeilijk te sproeidrogen is, worden combinaties met mannitol aangewend.
FIGUUR 3.3.: STRUCTUURFORMULE VAN MYO-INOSITOL (http://upload.wikimedia.org)
3.4. BOVINE SERUM ALBUMINE (BSA)
BSA is serum albumine die verkregen wordt uit runderbloed. BSA, een bruin, amorf en goed wateroplosbaar poeder, wordt vaak gebruikt als stabilisator voor formulaties die proteïnen en enzymen bevatten (Rowe et al, 2002).
3.5. GLYCINE
Glycine is een natuurlijk voorkomend aminozuur met structuurformule C2H5NO2. Het is een niet-essentieel aminozuur en tevens het kleinste. Het wordt gesynthetiseerd uit threonine en serine (http://www.britannica.com/EBchecked/topic/236059/glycine).
Glycine is beschreven als thermoprotectans bij recombinante vaccins (Singh, 2004).
FIGUUR 3.4.: STRUCTUURFORMULE VAN GLYCINE (http://upload.wikimedia.org)
16
3.6. BETAÏNE
Betaïne of trimethylglycine is een derivaat van glycine waarop de waterstofmoleculen gesubstitueerd zijn door drie methylgroepen. Het is dus een methylamine, een alkylamine met drie methyleengroepen (http://www.vannature.nl/monografie/Betaine_TMG_Trimethylglycine.html). Betaïne werd reeds onderzocht als stabilisator van biomoleculen (Knapp et al, 1999).
FIGUUR 3.5.: STRUCTUURFORMULE VAN BETAÏNE (http://upload.wikimedia.org)
17
4. METHODEN 4.1. STABILITEITSONDERZOEK VAN ß-GALACTOSIDASE IN GESPROEIDROOGDE POEDERS 4.1.1. Productie van droge poeders via sproeidrogen
4.1.1.1. Principe Sproeidrogen is een proces waarbij een vloeistof (feed) omgezet wordt naar een droge poedervorm in één stap. Deze omzetting gebeurt doordat de feed in een heet droogmedium gesprayd wordt, wat meestal lucht is. Het proces kan opgesplitst worden in drie stadia. Het eerste daarvan is de atomisatie van de oplossing, emulsie, suspensie of pasta. Onder atomisatie wordt de vorming van miljoenen kleine druppels uit de feed oplossing door toevoeging van kinetische energie verstaan. Zo wordt er een spray gevormd. De tweede stap is het droogproces. De vele kleine druppels komen in contact met een drooggas. De temperatuur van dit gas is doorgaans zeer hoog en kan ingesteld worden als de inlaattemperatuur. Door deze hoge temperatuur zal het solvent van de vloeistofdruppels verdampen en wordt een poeder bekomen. Deze verdamping zal tevens het sproeidroogsysteem afkoelen. De temperatuur die zo wordt bereikt kan gemeten worden en wordt de uitlaattemperatuur genoemd. Als laatste stadium van het proces wordt het poeder gecollecteerd en opgevangen in een reservoir. Het poeder wordt door de circulerende luchtstroom meegetrokken vanuit de droogkamer naar de cycloon. Daar zullen de partikels met hoge snelheid tegen de cycloonwand botsen, waardoor ze hun snelheid verliezen en in het collecterende reservoir onderaan de cycloon vallen (Cal & Sollohub, 2009; Seville et al., 2007).
FIGUUR 4.1.: SYSTEMISCHE VOORSTELLING VAN EEN SPROEIDROOGSYSTEEM (www.buchi.com)
18
4.1.1.2. Methode Voor het stabiliteitsonderzoek werden waterige oplossingen gesproeidroogd. De waterige oplossingen bevatten allen 5% vaste stof: Mannitol (C*Mannidex 16700, Cerestar, Mechelen, België), glycine (Sigma-aldrich), betaïne (Sigma-aldrich), trehalose (C*Ascend 16400, Cerestar, Mechelen, België) en myo-inositol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) werden in variërende hoeveelheden opgelost zoals weergegeven in Tabel 4.1. Per 100 ml oplossing werden ongeveer 100 activiteitsunits van het enzym ß-galactosidase toegevoegd. Deze feedoplossingen werden vervolgens gesproeidroogd met een Büchi Mini Spray Dryer B290 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Zwitserland). De inlaattemperatuur van de sproeidroger werd ingesteld op 150°C, de pomp op 5 mL/min en de airflow op 414 L/h.
De
uitlaattemperatuur resulteerde in 77°C. De bekomen poeders werden bewaard bij 6°C en bij 25°C in aluminium zakjes die werden toegelast.
TABEL 4.1.: VERSCHILLENDE SPROEIDROOGFORMULATIES MET PERCENTAGES VASTE STOF Formulatie
Mannitol
Glycine
Betaïne
Trehalose
Myo-inositol
1
5,00%
-
-
-
-
2
4,50%
0,50%
-
-
-
3
4,50%
-
0,50%
-
-
4
4,50%
-
-
0,50%
-
5
4,50%
-
-
-
0,50%
6
4,00%
1,00%
-
-
-
7
4,00%
-
1,00%
-
-
8
4,00%
0,50%
-
0,50%
-
9
4,00%
0,50%
-
-
0,50%
19
4.1.2. Stabiliteit gesproeidroogde poeders: ß – galactosidasetest Als modelmolecule voor het Newcastle Disease Vaccin werd het enzym ßgalactosidase gebruikt. Dit enzym werd met een activiteit van ongeveer 0,09 units/mL aan de oplossing toegevoegd vooraleer deze gesproeidroogd werd. De mate waarin het enzym het sproeidroogproces overleefde, werd bepaald met een enzymatische test.
FIGUUR 4.2.: PRINCIPE ß-GALACTOSIDASETEST Het principe van de test verloopt volgens bovenstaande reactie (figuur 4.2.). Het ongekleurde substraat ONP ß-D-Galactopyranoside wordt in aanwezigheid van water door het enzym ß-galactosidase omgezet tot het suiker ß-D-Galactose en het geelgekleurd product o-nitrophenol. Door de absorbantie van de gele oplossingen spectrofotometrisch te bepalen, kan de activiteit van het enzyme in de oorspronkelijke oplossing afgeleid worden. Om de enzymactiviteit van een onbekende te bepalen moest de onbekende oplossing verdund worden in gedemineraliseerd water tot een geschatte activiteit binnen een range van 0,2-0,4 units/ml. Gesproeidroogde poeders dienden alvorens de enzymatische test uit te voeren gereconstitueerd te worden in gedemineraliseerd water.
De enzymatische reactie verliep in een reactiemedium met pH 4,5 waarvoor een 20 mM fosfaat-citraat bufferoplossing werd gebruikt. Aan het reactiemedium werd eerst de onbekende met een bepaalde enzymactiviteit toegevoegd. Vervolgens werd het substraat toegevoegd onder de vorm van een 10 mM o-Nitrophenyl ß-D-Galactoside oplossing. Na exact 10 minuten werd de reactie stopgezet door het toevoegen van een hoeveelheid 200 mM boraatbuffer met een pH 9,8. Nadien werden de absorbanties van de stalen in UV cuvetten (weglengte = 1cm) gemeten door een spectrofotometer (Shimadzu Scientific Systems, Japan) bij een golflengte van 410 nm. Telkens werd ook een ijkcurve gemaakt door gekende hoeveelheden enzym (0-0,03 units) toe te voegen aan het reactiemedium, waardoor de activiteit van de onbekenden via lineaire regressie kon worden afgeleid.
Elke onbekende werd in drievoud geanalyseerd.
20
TABEL 4.2.: AANGEWENDE VOLUMINA IN ß-GALACTOSIDASE ACTIVITEITSBEPALING REAGENTIA
VOLUME (ml)
Fosfaat-citraat buffer
0,40
(Verdunde) onbekende
0,10
ONP-Gal oplossing
0,50
Boraatbuffer (na exact 10 min.)
3,00
4.1.3. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders 4.1.3.1. Scanning Elektronenmicroscoop (SEM): bepaling morfologie
4.1.3.1.1. Principe De morfologie van de gesproeidroogde poeders werd bekeken onder de scanning elektronenmicroscoop (SEM).
Bij een SEM onderzoek wordt een straal van elektronen, ook wel primaire elektronen genoemd, gefocusseerd op een bepaalde plaats in het staal. Dit resulteert in een transfer van energie naar deze plaats. Door de energie van deze primaire elektronen worden secundaire elektronen, afkomstig van het staal, uitgestoten. De secundaire elektronen worden aangetrokken en gecollecteerd door een detector en vervolgens vertaald tot een signaal. Om een SEM foto te maken gaat de elektronenbundel over de volledig te bepalen oppervlakte. Zo worden vele van deze signalen geproduceerd die dan allemaal samenkomen en
het
3D-beeld
vormen
(http://science.howstuffworks.com/scanning-electron-
microscope.htm, http://www.siliconfareast.com/SEMTEM.htm).
4.1.3.1.2. Methode Voor het onderzoek werd gebruik gemaakt van de Quanta 200F (FEI Company, Eindhoven, Nederland) scanning electron microscoop. De poeders werden aangebracht op zelfklevende staalhouders. Om het staal geleidbaar te maken voor elektronen werden de poeders op de staalhouders gecoat met ongeveer 40 nm goud.
21
FIGUUR 4.3.: DE SCANNING ELEKTRONENMICROSCOOP (http://www.britannica.com)
4.1.3.2. Laserdiffractie: bepaling partikelgrootte
4.1.3.2.1. Principe De bepaling van de partikelgroottedistributie van de poeders gebeurde met behulp van de laserdiffractor. Het principe van de laserdiffractie is gebaseerd op het feit dat poederpartikels die een laserstraal passeren het licht verstrooien onder een hoek die gerelateerd is aan hun partikelgrootte. Deze hoek zal logaritmisch toenemen als de partikelgrootte afneemt. Ook de intensiteit van het verstrooide licht is afhankelijk van de grootte van de partikels. Zo zullen grotere partikels resulteren in een veel intenser licht dan kleinere partikels. Beide principes werden geïllustreerd in figuur 4.4.
FIGUUR 4.4.: DIFFRACTIEPATROON (www.sympatec.com)
22
De rode lichtbron van een laserdiffractor is een Helium-Neonlaser. Deze laser is een bron van coherent, intens licht met een vaste golflengte (voor Helium-Neonlaser: 632,8 nm). Vooraleer de lichtbundel invalt op het staal gaat hij door verschillende optische lenzen zodat we evenwijdige stralen krijgen. Een staalpresenteersysteem moet ervoor zorgen dat de laserstraal
door een homogene stroom van partikels gaat. Verschillende diode array
detectoren meten tenslotte de hoeken waaronder de partikels de straal van de laserbron verstrooien (www.malvern.com).
FIGUUR 4.5.: DE LASERDIFFRACTOR (www.malvern.com)
De diameters D[v, 0.1], D[v, 0.5] en D[v, 0.9] kunnen bepaald worden uit de partikelgroottedistributiecurve. Deze gemeten diameters zijn de volumediameters die aantonen dat respectievelijk 10%, 50% en 90% van de gemeten partikels een kleinere volumediameter hebben dan de aangegeven waarde.
4.1.3.2.2. Methode De Malvern Mastersizer-S long bench 2000 (Malvern instruments, Worcestershire, Verenigd Koninkrijk) werd gebruikt tijdens het onderzoek. Deze laserdiffractor kan partikelgroottes van 0,5 tot 3500µm meten in geval van staalmetingen in droge toestand en partikels van 0,05 tot 900µm in geval van metingen via de natte dispersiemethode.
De partikelgroottes van de gesproeidroogde poeders werden bepaald via de natte dispersiemethode.
Hiervoor
werd
een
aliquot
poeder
gesuspendeerd
in
een
dispersiemedium van Miglyol 812 (Sasol, Witten, Duitsland) met 0,2% Tween 80 (Polysorbatum 80, SA Fagron, Waregem, België). Deze suspensie werd gevortexed vooraleer 23
toe te voegen aan het natte dispersiepresenteersysteem van de laserdiffractor . Na een eerste bepaling werden de stalen kort in een ultrasoon bad gestoken om de eventuele agglomeraten open te breken. Hierna werden de stalen opnieuw gevortexed en gemeten. Voor de bepalingen via de natte dispersiemethode werd de 300RF lens gebruikt. De stalen werden doorheen de meetcel gestuurd met behulp van een rotordrijfkracht die ingesteld was op 1500 rpm. Tussen de metingen vond telkens een wasstap plaats met zuiver dispersiemedium.
4.1.3.3. Karl Fisher titratie: bepaling vochtgehalte
4.1.3.3.1. Principe De meting van het watergehalte van de poeders gebeurde via de Karl Fischer titratie, een bepaling die gebaseerd is op de oxidatie van zwaveldioxide door jood in de aanwezigheid van water zoals voorgesteld in vergelijking 4.1. I2 + SO2 + 2H2O 2HI + H2SO4
(4.1)
Een oplossing van I2 en SO2 wordt in methanol gebracht, een niet-waterig, watervrij solvent. De gevormde zuren, H2SO4 en HI worden met pyridine geneutraliseerd. De eindpuntbepaling van de titratie is gebaseerd op de detectie van de overmaat I 2. Een overmaat I2 ontstaat wanneer in de titratiecel geen water meer aanwezig is en wordt bivoltametrisch vastgesteld. Tussen 2 identische indicatorelectroden, dubbele platina elektrode, wordt namelijk een constante stroom aangelegd om vervolgens het potentiaalverschil tussen de beide elektroden te kunnen meten. Tijdens de titratie, wanneer er een reactie plaatsvindt tussen het water en I2, is er geen vrije I2 aanwezig en kan dus geen reductie van I2 en stroomdoorgang optreden. Als al het H2O weg getitreerd is zal er wel vrije I2 aanwezig zijn. Hierdoor zal het potentiaalverschil zeer sterk dalen en wordt de stroomdoorgang mogelijk. Deze sterke daling in potentiaal en de bijhorende stijging van de stroom wordt gebruikt als indicatie van het titratie eindpunt (practicumnota’s intrumentele analytische chemie, Prof. L. Thienpont, 3e bachelor farmaceutische wetenschappen).
24
4.1.3.3.2. Methode De metingen werden uitgevoerd met een Mettler Karl Fischer titrator DL35 (N.V. Mettler-Tolede SA, Zaventem, België). Watervrij methanol (Biosolve BV, Valkenswaard, Nederland) en het Karl Fischer reagens Hydranal®-Composite 2 (Sigma-Aldrich, Seelze, Duitsland) werden gebruikt bij de titratie van de poeders. Bij elke meting werd 0,1-0,2 gram poeder afgewogen en in de titratiecel gebracht. Voor elke titratie werd het staal gedurende 5 minuten vermengd met het medium met behulp van een magnetische roerder. Elk staal werd drie keer getitreerd.
4.1.3.4. Dynamic Vapour Sorption: bepaling hygroscopiciteit
4.1.3.4.1. Principe De hygroscopiciteit of de watersorptie van de gesproeidroogde poeders werd bepaald door gebruik te maken van een dynamic vapour sorption toestel (DVS) met microbalans. Tijdens het proces wordt het staal blootgesteld aan een variabele relatieve vochtigheid (RH). Het toestel maakt gebruik van een droog carriergas (bv. stikstofgas) dat vermengd wordt met een verzadigd carrier gas. De ratio van beiden wordt geregeld door elektrische massadebietcontrollers en deze ratio bepaalt de RH. Een daling of stijging van RH kan een verschil in gewicht van het staal teweeg brengen doordat water adsorbeert aan het staal of geabsorbeerd wordt door het staal. Deze veranderingen worden gemeten door een microbalans en vergeleken met een referentiemassa. De mate waarin het gewicht zal stijgen of
dalen
is
dus
afhankelijk
van
de
hygroscopiciteit
van
het
staal
(www.thesorptionsolution.com).
4.1.3.4.2. Methode De DVS Advantage 1 (Surface Measurement Systems, Londen, VK) werd gebruikt bij het onderzoek. Per meting werd er van het staal tussen de 10 en 20 mg poeder afgewogen. Als eerste stap werd dit poeder gedroogd tot constant gewicht. Nadien werd het blootgesteld aan een stijgende RH van 0% tot 90% in stappen van 10% tot evenwicht (i.e. massaverschil kleiner dan 0,002% per minuut gedurende minstens 15 minuten). De bepaling werd uitgevoerd bij een temperatuur van 25°C.
25
FIGUUR 4.6. : DYNAMIC VAPOUR SORPTION (www.thesorptionsolution.com)
4.1.3.5. Differential Scanning Calorimetrie: bepaling smelt- en glastransitietemperatuur
4.1.3.5.1. Principe Differential Scanning Calorimetrie (DSC) is een techniek waarbij de energie gemeten wordt die nodig is om een zo miniem mogelijk temperatuursverschil te verkrijgen tussen een monster en een referentie staal die onderworpen worden aan een identieke temperatuursprogrammatie. Er bestaan twee types DSC systemen: ‘power compensation DSC‘ en ‘heat flux DSC’. Dit laatste meetprincipe wordt hier besproken.
Het meetsysteem van dit type bestaat uit een metalen schijf waarop het monster en een referentiestaal worden geplaatst. Het monster wordt in een DSC pannetje gebracht. Het referentiestaal is meestal een leeg DSC pannetje. Dit geheel wordt vervolgens in een oven gebracht die aan een welbepaalde constante snelheid verwarmd wordt. Het temperatuursverschil tussen referentie en monster wordt gemeten en hierdoor kan de warmtestroom
in
het
monster
bepaald
worden.
Wanneer
een
smelt-
of
glastransitietemperatuur bereikt wordt stijgt het temperatuursverschil en wordt als gevolg een
energiepiek
waargenomen
die
dit
verschil
moet
compenseren
(http://www.msm.cam.ac.uk/phasetrans/2002/Thermal2.pdf; cursus fysicochemie van het geneesmiddel, Prof. S. De Smedt, 2e bachelor farmaceutische wetenschappen).
26
FIGUUR 4.7.: HEAT FLUX DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY (http://materials.npl.co.uk/matsol/thermal.html)
4.1.3.5.2. Methode De DSC (Q-2000,TA Instruments) werd gebruikt. Voor de analyses werd 5 tot 10 mg poederstaal in een hermetisch aluminium DSC pannetje gebracht en vervolgens geplaatst in de autosampler van het DSC toestel.
4.2. ULTRASOON GESPROEIDROOGDE POEDERS
Er werden 4 waterige oplossingen gesproeidroogd: Mann 15,00%, Mann 9,00% - Ino 6,00%, Mann 9,00% - BSA 6,00% en Mann 9,00% - Ino 3,00% - BSA 3,00%. Elk van deze formulaties werd meerdere malen gesproeidroogd met behulp van een lab-scale sproeidroger (ProCept), telkens bij andere sproeidroogparameters zoals weergegeven in tabel 4.3. De gebruikte ultrasone nozzle werd ingesteld op een frequentie van 25 kHz.
TABEL 4.3.: DE 4 SETTINGS MET BIJHORENDE PARAMETERS WAARMEE DE FORMULATIES WERDEN GESPROEIDROOGD SETTING
Inlaattemp (°C)
Feedsnelheid
Airflow (m³/min)
(ml/min)
Druk (mbar)
1
180
2
0,3
20
2
160
2
0,3
20
3
180
4
0,3
20
4
180
4
0,4
20
27
4.4. DESIGN OF EXPERIMENTS: INVLOED VAN DE SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE ENZYMSTABILITEIT 4.4.1. Inleidende begrippen
Om informatie te verkrijgen over welke sproeidroogparameters de enzymstabiliteit beïnvloeden, moeten experimenten uitgevoerd worden.
In een experimenteel design worden vooraf de relevante factoren gekozen die een invloed zouden kunnen hebben op de respons. In dit onderzoek zijn de factoren de sproeidroogprocesparameters en de respons de stabiliteit van de gesproeidroogde poeders. Het basis experimenteel design is het two level full factorial design. Het aantal experimenten die worden uitgevoerd, is afhankelijk van het aantal factoren die onderzocht worden. Zo zal een two level (2x) experimenteel design met drie factoren 23 of 8 experimenten omvatten. Hierbij wordt elke factor op twee niveaus getest, een laag en een hoog niveau, respectievelijk weergegeven als een ‘-‘ en ‘+’ symbool. Om een optimaal design te verkrijgen worden ook centerpoints toegevoegd, weergegeven met het symbool ‘0’. Voor de centerpoint experimenten wordt voor elke factor de middelste waarde toegepast tussen het laag en hoog niveau. Het driemaal uitvoeren van deze centerpoints laat toe de replicaatfout te berekenen. In onderstaande figuur en tabel wordt een 23 full factoral design weergegeven, waarbij x1, x2 en x3 de factoren zijn.
FIGUUR 4.8.: GEOMETRISCHE VOORSTELLING VAN EEN 23 FULL FACTORIAL DESIGN (http://www.itl.nist.gov)
28
TABEL 4.4.: SCHEMATISCH OVERZICHT VAN EEN 23 FULL FACTORIAL DESIGN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
X1 + + + + 0 0 0
X2 + + + + 0 0 0
X3 + + + + 0 0 0
Het randomiseren van de run order is voornamelijk van belang om te voorkomen dat systemische veranderingen in ongecontroleerde variabelen de experimenten zouden kunnen beïnvloeden. Moesten alle experimenten van hoge inlaattemperatuur eerst worden uitgevoerd, dan zou de temperatuur in het lokaal ook toenemen en hoger liggen dan wanneer de experimenten met lage inlaattemperatuur zouden worden uitgevoerd. Dit is van belang wanneer de omgevingstemperatuur een invloed op het resulterende poeder heeft. De invloed hiervan op de stabiliteit van het enzym is vermoedelijk verwaarloosbaar. Voor de zekerheid werden de experimenten toch gerandomiseerd.
4.4.2. Design opzet
De formulatie mannitol 4,50% – trehalose 0,50% beladen met ongeveer 100 units ßgalactosidase werd over de gehele experimental design gebruikt. Deze formulatie werd gekozen op basis van resultaten uit de stabiliteitsstudie.
29
TABEL 4.5.: OPZET VAN HET EXPERIMENTEEL DESIGN
Exp No Exp Name 1 N1 2 N2 3 N3 4 N4 5 N5 6 N6 7 N7 8 N8 9 N9 10 N10 11 N11 12 N12 13 N13 14 N14 15 N15 16 N16 17 N17 18 N18 19 N19
Run Order 16 11 14 6 18 1 3 4 15 17 12 5 13 19 8 9 7 2 10
inlettº (°C) 130 180 130 180 130 180 130 180 130 180 130 180 130 180 130 180 155 155 155
solids (%) 5 5 15 15 5 5 15 15 5 5 15 15 5 5 15 15 10 10 10
airflow (L/h) 355 355 355 355 473 473 473 473 355 355 355 355 473 473 473 473 414 414 414
pump (ml/min) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 7 7 7 7 7 7 7 7 5 5 5
De gekozen factoren waren de inlaattemperatuur, feedsnelhied, airflow en vaste stofgehalte (solids) van de feedoplossing. Aangezien er vier factoren zijn, betekent dit dat het een 24 full factorial design is, wat geometrisch voorgesteld kan worden als een hyperkubus. Er werden dus 19 gerandomiseerde experimenten (24 + 3 centerpoints) uitgevoerd.
Voor de inlaattemperatuur werd 130°C als laag niveau gekozen en 180°C als hoog niveau. Het is belangrijk dat de inlaattemperatuur niet te laag gekozen wordt, zodat het gesproeidroogde product voldoende gedroogd wordt tijdens het proces. Anderzijds mag de inlaattemperatuur niet te hoog zijn om het enzym tegen thermale degradatie te beschermen, wanneer dit in de formulatie zou geïntroduceerd worden.
De feedsnelheid bepaalt mee wat de resulterende uitlaattemperatuur zal zijn. Is deze hoger dan zal er meer water door het sproeidroogsysteem gestuurd worden, wat resulteert in een grotere afkoeling van het systeem en een lagere uitlaattemperatuur. Een lage uitlaattemperatuur is eveneens belangrijk voor de enzymstabiliteit wanneer het enzym in de formulatie geïntroduceerd wordt. Een te lage uitlaattemperatuur zou onvoldoende droging 30
van het product betekenen. De minimumfeedsnelheid werd ingesteld op 3,5 mL/min, de maximale op 7,0 mL/min.
De luchtstroom (airflow) door de sproeikop werd gevarieerd van 355 tot 473 L/h, wat de meest gebruikte waarden zijn voor de Büchi B-290 sproeidroger.
Het solidsgehalte bedroeg minimum 5% en maximum 15%. De bovengrens werd bepaald door de maximale wateroplosbaarheid van mannitol, wat 15% bedraagt bij kamertemperatuur.
4.4.3. Evaluatie van de poederstalen
De respons die gemeten werd, was de stabiliteit van het enzym ß-galactosidase in de gesproeidroogde poeders.
De stabiliteit van het enzym werd bepaald via de ß-galactosidasetest (zie 4.1.2.).
4.4.4. Analyse van het experimenteel design
Het uitvoeren van de data-verwerking van het experimenteel design werd uitgevoerd met behulp van het software programma MODDE 9 (MKS Umetrics AB, Umeå, Zweden).
4.4.4.1. Evaluatie van de ruwe data
Voor de respons werd een replicatieplot opgesteld. Hierbij wordt voor elk experiment de gemeten waarde uitgezet in een grafiek. De 3 centerpoint experimenten zijn 3 identieke experimenten die voor elke factor uitgevoerd werden bij waarden tussen het laagste en hoogste niveau. Daarom horen de responsen van deze experimenten een gelijke waarde te hebben, die ongeveer tussen de hoogste en de laagste responswaarde ligt.
31
4.4.4.2. Lineaire regressie analyse
Via lineaire regressie konden de hoofd- en interactie-effecten berekend worden. Het 24 full factorial design kon via de volgende vergelijking, i.e. model, beschreven worden.
Y = ß0 +
gemiddelde respons
ß1x1 + ß2x2 + ß3x3 + ß4x4 +
hoofdeffecten
ß12x1x2 + ß13x1x3 + ß14x1x4 + ß23x2x3 + ß24x2x3 + ß34x3x4 +
2-factorinteracties
ß123x1x2x3 + ß124x1x2x4 + ß234x2x3x4 + ß134x1x3x4 +
3-factorinteracties
ß1234x1x2x3x4
4-factorinteracties (4.2)
waarin Y:
respons
x1,x2,…:
factoren
ß 0:
gemiddelde respons
ß1,ß2,…:
coëfficiënten van de hoofdeffecten
ß12,... ß123,... ß1234:
coëfficiënten van de interacties
Een hoofdeffect van een factor wordt beschreven als het gemiddelde verschil in respons tussen het lage en hoge factorniveau.
Aangezien de software MODDE de data met behulp van de gecodeerde factorniveaus (-1, 0, +1) hanteert in plaats van de werkelijke waarden (vb. voor temperatuur: 130°C, 150°C, 170°C) wordt niet meer over hoofd- en interactie-effecten gesproken, maar wel over hoofden interactiecoëfficiënten. De coëfficiënten zijn een maat voor de effecten. Deze coëfficiënten werden uitgezet in een plot. Niet-significante coëfficiënten van hoofd- en interactie-effecten werden geëxcludeerd uit de modelopzet. Vervolgens werden de R2, Q2 en reproduceerbaarheid van het experimenteel model berekend door de software via lineaire regressie. Deze waarden werden uitgezet in een ‘summary of fit’ plot.
32
R2 drukt uit in hoeverre het berekende model de gegeven data kan herberekenen volgens het model. Deze waarde ligt tussen ‘0’ en ‘1’, waarbij een waarde van ‘1’ een perfect model weergeeft. Q2 geeft weer hoe goed het model in staat is nieuwe experimenten te voorspellen. Aanvaardbare waarden van Q2 zijn vanaf ‘0,5’. Vanaf ‘0,9’ worden excellente waarden verkregen voor de Q2-waarde. Het is belangrijk in acht te nemen dat R2 de Q2 waarden met niet meer dan 0,2-0,3 mag overschrijden.
De reproduceerbaarheid laat zien hoe groot de pure fout op de experimenten is. Is deze waarde kleiner dan ‘0,5’, dan is er een grote pure fout en zijn de uitgevoerde experimenten onvoldoende gecontroleerd.
4.4.4.3. Gebruik van het model
Voor elke respons werd een contour plot opgemaakt met de belangrijkste coëfficiënten. Uit deze contour plot kunnen voorspellingen gedaan worden in verband met bij welke omstandigheden de experimenten moeten worden uitgevoerd om een bepaalde respons te bekomen.
4.5. VIRUSTITRATIE 4.5.1. principe
De virologie is vaak geïnteresseerd in het aantal infectieuze virussen die aanwezig zijn in een orgaansuspensie of een cultuurvloeistof. Dit kan bepaald worden door een virustitratie uit te voeren. Voor de titratie wordt een serie van 10-voudige verdunningen (log10) gemaakt uit een virussuspensie. Vervolgens worden bebroede eieren geïnoculeerd met deze verdunningen. Indien er virusvermeerdering plaatsvindt door de aanwezigheid van infectieuze virussen kunnen veranderingen van het embryo in het ei waargenomen worden zoals embryonale sterfte, embryonale afwijkingen, membraanletsels etc. De virusdosis die in 50% van de geïnoculeerde eieren een dergelijk respons geeft kan bepaald worden. Dit noemen we de egg infectious doses 50% endpoint (EID50). Het eindpunt zal zelden op het 33
zicht bepaald kunnen worden. Daarom wordt gebruik gemaakt van de formule van Reed en Muench, zie vergelijking (4.3).
(4.3) De uiteindelijke titer van de virusoplossing kan berekend worden met de bekomen index (x): (4.4)
Titer 10 y , x
Waarin
10y: x:
minst verdunde oplossing waartussen het 50% endpoint ligt index
Via de hemagglutinatietest (zie inleiding) kunnen de eieren die geïnfecteerd zijn gezien worden.
4.5.2. Methode
Voor de titratie op eieren werd ongeveer 100 mg van het gesproeidroogde poeder met levend geattenueerd virus opgelost en 10 keer verdund in commerciële PBS (Phosphate Buffered Saline). Een aliquot van de feedoplossing werd als zodanig aangewend voor de verdunningen.
Zowel van de feed- als de poederoplossingen werd een verdunningsreeks gemaakt van 10-1 tot en met 10-8. Deze verdunningen werden vervolgens geïnoculeerd in bebroede eieren van ongeveer 15 dagen oud. Per verdunning werden 4 eieren geïnoculeerd in de allantoïsvloeistof met 100 µl virusverdunningen. Deze geïnoculeerde eieren werden gedurende 3 dagen in een broedstoof geplaatst bij 37°C bij een vochtigheidsgraad van 6065%. Als volgende stap werden de eieren één uur bij –20°C geplaatst zodat de embryo’s afstierven. Hierna konden de eieren geopend worden om een hemagluttinatietest (HA-test) op uit te voeren.
Voor de HA-test werd gebruik gemaakt van microtiterplaten. De welletjes werden allen gevuld met 50 µl PBS. Uit elk ei werd 50 µl allantoïsvloeistof gepipetteerd en in een 34
welletje gebracht. Vanuit deze well werden dan 8 opeenvolgende 1/2 verdunningen gemaakt. Zo werden 1/2, 1/4, 1/8,… tot 1/256 verdunningen gemaakt per ei. Tenslotte werd aan elk welletje 50 µl van een 0,5% rodebloedcellensuspensie van kippen toegevoegd en geschud. Na de microtiterplaten één uur te incuberen bij kamertemperatuur kon het resultaat afgelezen worden. Indien er virus aanwezig was in de allantoïsvloeistof was er hemagluttinatie zichtbaar. Geen hemagluttinatie wees aldus op de afwezigheid van het virus.
Vervolgens werd de virustiter (EID50) berekend aan de hand van de formule van Reed en Muench zoals hierboven beschreven.
35
5. RESULTATEN EN DISCUSSIE 5.1. STABILITEITSONDERZOEK VAN ß-GALACTOSIDASE IN GESPROEIDROOGDE POEDERS 5.1.1. Stabiliteit gesproeidroogde poeders: ß-galactosidasetest
1. Mann 5,00%
Enzymactiviteit (%)
120
104,21
100
2. Mann 4,50% - Bet 0,50% 88,00 74,02
80
73,29
4. Mann 4,50% - Treh 0,50%
54,01
5. Mann 4,50% - Ino 0,50%
60 38,01
6. Mann 4,00% - Glyc 1,00%
40
22,14
20
7. Mann 4,00% - Treh 0,50% -
5,77
Glyc 0,50%
0 1
3. Mann 4,50% - Glyc 0,50%
2
3
4
5
6
7
8
8. Mann 4,00% - Ino 0,50% Glyc 0,50%
FIGUUR 5.1.: ENZYMACTIVITEIT (%) NA PRODUCTIE
Uit figuur 5.1. kan afgeleid worden dat de toevoeging van trehalose en inositol aan mannitol meer bescherming biedt aan het enzym tijdens het sproeidroogproces dan zuiver gesproeidroogde mannitol (respectievelijk 104,2% en 88% vs. 38% aan resterende enzymactiviteit). De toevoeging van glycine aan de mannitol-trehalose en mannitol-inositol formulatie resulteerde in een lagere enzymactiviteit (EA= 74,0%; EA=73,3% respectievelijk) dan wanneer glycine niet toegevoegd werd (EA=104,2%; EA= 88,0% respectievelijk), maar een hogere dan bij de mannitol-glycine (0,5%) formulatie (EA= 54,0%). Werd het percentage aan glycine in de mannitoloplossing opgedreven tot 1%, werd een nog lagere enzymactiviteit vastgesteld (EA= 22,1%). Betaïne in een hoeveelheid van 0,50% bleek met een enzymactiviteit van slechts 5,8% geen positieve invloed te hebben op de enzymstabiliteit tijdens het sproeidroogproces en werd als gevolg hiervan verder niet meer onderzocht. Er werd ook een formulatie met 1% betaïne gesproeidroogd. De resultaten hiervan zijn echter niet terug te vinden in de figuur aangezien de yield 0% was.
36
100
1. Mann 5,00% 2. Mann 4,50% - Glyc 0,50%
Enzymactiviteit (%)
80
3. Mann 4,50% - Treh 0,50% 60
4. Mann 4,50 54,66
58,93
% - Ino 0,50%
40
5. Mann 4,00% - Glyc 1,00%
0,42
6. Mann 4,00% - Treh 0,50% -
20
5,72 15,46
0 1
7,49
10,31
2
3
0 4
6,39 0
16,18
5
6
19,41
Glyc 0,50% 7. Mann 4,00% - Ino 0,50% -
7
Glyc 0,50% 1 week 6°C
1 maand 6°C
100
1. Mann 5,00% Enzymactiviteit (%)
80
2. Mann 4,50% - Glyc 0,50%
4. Mann 4,50% - Ino 0,50%
72,09
5. Mann 4,00% - Glyc 1,00%
40
6. Mann 4,00% - Treh 0,50% 18,27 20
17,65 16,17
0 1
7,91 9,71
12,26
13,98
2
3
4
1 week 25°C
3. Mann 4,50% - Treh 0,50%
83,6 60
0 5
34,19
Glyc 0,50% 7. Mann 4,00% - Ino 0,50%-
17,73
Glyc 0,50% 6
7
1 maand 25°C
*geen data voor verlies na 1 week
FIGUUR 5.2.: VERLIES AAN ENZYMACTIVITEIT BIJ BEWARING TOV POEDER NA PRODUCTIE A. BEWARING BIJ 6°C; B.BEWARING BIJ 25°C
Van een goede stabilisator wordt verwacht dat hij het enzym ook kan blijven stabiliseren na bewaring. Stabiliteitstesten werden gedaan 1 week en 1 maand na het sproeidroogproces. De resultaten staan weergegeven in figuur 5.2. A en B.
De enzymactiviteit van bijna alle formulaties werd vrij goed behouden na 1 week bewaring met een maximum verlies van ongeveer 16% met weinig verschil tussen de twee bewaartemperaturen. De formulaties mannitol-inositol en mannitol-glycine 1% toonden bij de bewaring bij 6ºC geen verlies aan enzymactiviteit. Uit figuur 5.2. blijkt dat na 1 maand 37
bewaring bij 6ºC het enzymactiviteitsverlies kon oplopen tot 59% zoals bij de mannitolinositol formulatie het geval was. De mannitol-trehalose formulatie bleek bij deze bewaaromstandigheden 55% aan enzymactiviteit verloren te hebben, waarmee een totaal van 65% aan enzymactiviteit verloren gegaan is tijdens de bewaring. Werden de stalen bij 25ºC bewaard dan was het enzymactiviteitsverlies na 1 maand iets hoger met een totaal maximum van 83% enzymactiviteitsverlies voor de formulatie mannitol-inositol. De formulatie enkel bestaande uit mannitol vertoonde vrijwel geen verlies aan enzymactiviteit na 1 maand bij 25ºC.
Er kan dus besloten worden dat de formulaties mannitol-trehalose en mannitolinositol het enzym beter beschermen tijdens het sproeidroogproces, maar minder tijdens de bewaring dan de andere formulaties.
5.1.2. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders 5.1.2.2. Morfologie
Onderstaande SEM foto’s in figuur 5.3. tonen de morfologie van de gesproeidroogde poeders.
Uit de beelden blijkt dat bij de formulaties met betaïne en 1% glycine geen sferische partikels gevormd werden, maar grillige clusterspartikels. Deze vaststelling kan ook gelinkt worden aan de stabiliteitstesten. Daaruit bleek namelijk dat de overleving van het enzym bij deze twee formulaties laag lag (5,77% en 22,14% respectievelijk).
Bij de overige formulaties werden sferische partikels gevormd van uiteenlopende groottes.
38
FIGUUR 5.3.: MORFOLOGIE VAN DE GESPROEIDROOGDE POEDERS.
5.1.2.3. Partikelgroottedistributie
De
individuele
partikelgroottes
konden
vastgesteld
worden
uit
de
partikelgroottedistributies gemeten via laserdiffractie volgens de natte dispersiemethode. Uit onderstaande figuur (figuur 5.4.) blijkt dat de formulaties met betaïne en 1% glycine, zowel voor als na sonicatie van de suspensie, grotere partikels hebben dan de overige poeders. Dit resultaat is in overeenstemming met de grillige clusterpartikels te zien op de SEM-foto’s.
Figuur 5.4. A. toont bimodale partikelgroottedistributies, wat verklaart kan worden door de losse partikelaggregaten zichtbaar na dispersie van de poederstalen in miglyol. Sonicatie
van
de
stalen
resulteerde
in
het
verdwijnen
van
deze
bimodale
partikelgrootteverdeling (figuur 5.4. B.), waardoor kon besloten worden dat het inderdaad om losse aggregaatstructuren ging. Dit kan voorts ook beaamd worden door de SEM foto’s 39
die, behalve bij het betaïne- en glycine 1%-poeder, losse sferische partikels toonden. Het kan dus gesteld worden dat de primaire partikelgrootte het best kan worden gemeten na sonicatie van de in miglyol gedispergeerde poederstalen.
FIGUUR 5.4.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIECURVES VAN DE GESPROEIDROOGDE POEDERS BEPAALD VIA LASERDIFFRACTIE A. POEDERS GEDISPERGEERD IN MIGLYOL; B. NA SONICATIE
Exacte waarden van de gemeten volumediameters staan weergegeven in onderstaande tabel 5.1.
De meeste formulaties, behalve de mannitol-betaine en mannitol-glycine 1% formulatie, vertoonden gelijkaardige partikelgroottedistributies met een gemiddelde D(v,0.5) van 9,37 µm voor sonicatie en een gemiddelde van 8,14 µm na sonicatie .
Na sonicatie liggen de D(v,0.5) waarden alsook de spans van de formulaties lager (Tabel 5.1.B.) dan bleek uit de metingen ervoor (Tabel 5.1.A.) wat opnieuw te wijten is aan het opbreken van de losse aggregaten. Aangezien liefst zo weinig mogelijk variatie in partikelgrootte gewenst is, ligt de span bij voorkeur laag. De spans van de gesproeidroogde poeders zijn gelijkaardig en liggen tussen 1,4 – 2,1, wat acceptable waarden zijn.
40
TABEL 5.1.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIE GEKARAKTERISEERD DOOR DE VERSCHILLENDE DIAMETERS. A. OORSPRONKELIJKE POEDERS; B. NA ULTRASOON BAD D(v, 0.1) (µm)
D(v, 0.5) (µm)
D(v, 0.9) (µm)
Span
Mann
2,99
8,96
20,88
1,995
Mann-Bet
15,40
54,46
125,84
2,028
Mann-Glyc 0,5%
2,37
9,04
19,43
1,887
Mann-Treh
4,11
13,65
115,70
8,175
Mann-Ino
2,62
8,06
70,07
8,372
Mann-Glyc 1%
10,70
43,87
113,04
2,333
Mann-Treh-Glyc
1,24
9,29
141,44
1,510
Mann-Ino-Glyc
0,88
7,24
17,13
2,244
D(v, 0.1) (µm)
D(v, 0.5) (µm)
D(v, 0.9) (µm)
Span
Mann
3,00
6,69
13,15
1,517
Mann-Bet
16,34
41,08
74,80
1,423
Mann-Glyc 0,5%
2,93
7,67
15,14
1,593
Mann-Treh
4,04
11,84
23,20
1,618
Mann-Ino
2,68
6,14
11,62
1,456
Mann-Glyc 1%
9,31
40,59
97,17
2,165
Mann-Treh-Glyc
1,10
9,00
20,64
2,172
Mann-Ino-Glyc
1,04
7,52
16,56
2,062
Een van de doelstellingen van het onderzoek was poeders verkrijgen met een partikelgrootte groter dan 20 µm (zie inleiding). Uit de resultaten in bovenstaande tabellen kan echter besloten worden dat al de gesproeidroogde poeders veel partikels bevatten kleiner dan 20 µm.
5.1.2.4. Vochtgehalte
Uit de resultaten van de Karl Fisher titraties, te zien in figuur 5.5., kon afgeleid worden dat de formulaties met trehalose het meeste vocht bevatten, namelijk 0,76% voor de formulatie mann-treh en 0,59% voor mann-treh-glyc. Alle poeders hadden echter een uiterst laag 41
vochtgehalte, lager dan 1,00%. Dit kan gunstig zijn voor de stabiliteit van het virusvaccin tijdens de bewaring en voor de luchtdispergeerbaarheid van het poeder.
FIGUUR 5.5.: VOCHTGEHALTE (%) VAN DE GESPROEIDROOGDE POEDERS MET STANDAARDDEVIATIE BEPAALD DOOR KARL FISHER TITRATIE
5.1.2.5. Smelt- en glastransitietemperatuur
FIGUUR 5.6.: GLASTRANSITIE – EN SMELTTEMPERATUURSBEPALING UITGEVOERD MET DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRIE
Uit de resultaten van de experimenten met de DSC bleek dat enkel bij de trehaloseformulatie na het sproeidroogproces een poeder bekomen werd met een glastransitietemperatuur. Dit wijst op de aanwezigheid van een amorfe stof. Deze temperatuur is, zoals te zien op figuur 5.6., bij de formulatie waar 0,5% trehalose 42
toegevoegd werd aan mannitol 86,54°C. De zuivere stoffen mannitol, trehalose en het fysisch mengsel van beiden vertoonden enkel smeltpieken, wat wijst op de aanwezigheid van kristallijne stoffen. Er kan dus worden gesteld dat het amorfe karakter van het gesproeidroogde mannitol-trehalose poeder te wijten is aan het sproeidroogproces.
Ook het poeder met 0,5% trehalose en 0,5% glycine vertoonde na sproeidrogen een glastransitietemperatuur bij 82,88°C.
Gesproeidroogd mannitol en betaïne vertoonden een smeltpiek bij respectievelijk 168,54 en 94,13°C. Glycine vertoonde geen duidelijke smeltpiek en degradeerde vanaf 250°C. Zuiver inositol vertoonde ook een smeltpiek bij 226,48ºC. Bij het analyseren van de mannitol-inositol formulatie kon de smeltpiek van inositol echter niet duidelijk worden waargenomen te wijten aan het oplossen van de inositol in de reeds vooraf gesmolten mannitol bij 165,05ºC.
5.1.2.6. Hygroscopiciteit
FIGUUR 5.7.: WATERSORPTIECURVEN BEKOMEN DOOR DVS. Figuur 5.6. geeft de resultaten van de hygroscopiciteitsbepalingen weer, uitgevoerd met behulp van DVS. Algemeen kan besloten worden dat alle formulaties een relatief lage hygroscopiciteit bezitten. De maximale wateropname bedroeg 10,39% bij een blootstelling aan 90% RH bij de formulatie waar zowel 0,5% trehalose als 0,5% glycine toegevoegd werden aan mannitol.
43
Opvallend is de stijging gevolgd door een daling in de curve van het poeder met mannitol, trehalose en glycine bij 60% RH. Dit kan wellicht te verklaren zijn door de overgang van een amorfe naar een kristallijne structuur in het poeder. Het is zo dat amorfe stoffen hygroscopischer zijn dan kristallijne stoffen. Beneden de glastransitietemperatuur zal de watersorptie zich beperken tot oppervlakteadsorptie. Wanneer de glastransitie plaatsvindt, zal de moleculaire mobiliteit stijgen en zo bulkwaterabsorptie induceren wat resulteert in een
hogere
wateropname.
Amorfe
materialen
zullen
iets
boven
hun
glastransitietemperatuur overgaan in een meer stabiele kristallijne vorm. Deze overgang doet de hygroscopiciteit van de stof drastisch verlagen (Burnett & Thielmann). Dit fenomeen verklaart de plotse daling in de curve.
5.2. ULTRASOON GESPROEIDROOGDE POEDERS In het kader van dit onderzoek werden enkele formulaties gesproeidroogd met een sproeidroger uitgerust met een ultrasone nozzle om te kijken of deze deeltjes groter dan 20 µm kan produceren dan de two fluid nozzle die voordien gebruikt werd. 5.2.1. Morfologie
FIGUUR 5.8.: MORFOLOGIE VAN DE GESPROEIDROOGDE POEDERS A. MANN 15,00%; B. MANN 9,00% - INO 6,00%; C. MANN 9,00% BSA 6,00%; D. MANN 9,00% - INO 3,00% - BSA 3,00% 44
Figuur 5.8. toont de SEM-foto’s van de 4 formulaties gesproeidroogd met de ultrasone nozzle procept, bij een inlaattemperatuur van 160°C wat resulteerde in een uitlaattemperatuur van ongeveer 60°C, een feed rate van 2 ml/min, een airflow van 0,3 m³/min en een druk van 20 mbar.
Mann 15,00% gaf aanleiding tot eenzijdig ingedeukte partikelsferen. Uit het SEMbeeld van de Mann-Ino formulatie kan afgeleid worden dat er tijdens het sproeidroogproces een onvolledige droging heeft plaatsgevonden aangezien sommige partikels zich tijdens het droogproces aan elkaar vastgehecht hebben. Bij deze formulatie was de yield ook slechts 30% terwijl de yield van de overige formulaties rond de 65% lag. Het poeder bestaande uit mannitol, BSA en inositol lijkt ellipsvormige partikels te bevatten, maar vertoonde op zich slecht vloeiende eigenschappen. Toevoeging van enkel BSA aan mannitol resulteerde in veelzijdig ingedeukte sferen en vertoonde bovendien goede vloeiende eigenschappen.
Opvallend is, vergeleken met de poeders van de two-fluid nozzle, dat alle partikels van gelijkaardige grootte zijn en ook vrij groot zijn.
5.2.2. Partikelgroottedistributie
FIGUUR 5.9.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIECURVES VAN DE POEDER GESPROEIDROOGD MET EEN ULTRASONE NOZZLE BEPAALD VIA LASERDIFFRACTIE
Uit figuur 5.9. blijkt dat de partikelgroottedistributies slechts weinig ten opzichte van elkaar verschillen.
45
TABEL 5.3.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIE GEKARAKTERISEERD DOOR DE VERSCHILLENDE VOLUMEDIAMETERS. D(v, 0.1) (µm)
D(v, 0.5) (µm)
D(v, 0.9) (µm)
Span
Mann
15,76
29,37
42,39
0,9068
Mann - BSA
22,61
46,14
86,30
1,380
Mann - Ino
18,13
37,30
71,50
1,431
Mann - BSA - Ino
16,56
29,69
47,85
1,054
Uit tabel 5.3 kan afgeleid worden dat de partikels van alle formulaties duidelijk groter zijn dan die van de formulaties die met de two fluid nozzle gesproeidroogd werden (gemiddelde D(v,0.5)= 8,14). Het poeder met mannitol en BSA heeft de grootste partikels met slechts 10% van de partikels kleiner dan 22,61 µm. Dit resultaat leunt zeer dicht aan bij de minimale diameter van 20 µm die vooropgesteld was. Deze formulatie toonde in de voorgaande SEM-beelden ook minder kleine partikels dan de andere formulaties.
5.3. EXPERIMENTAL DESIGN: INVLOED VAN DE SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE ENZYMSTABILITEIT 5.3.1. Evaluatie van de poederstalen TABEL 5.4.: OPZET VAN HET EXPERIMENTEEL DESIGN MET FACTOREN EN RESPONSEN Exp No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Exp Name N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N13 N14 N15 N16 N17 N18 N19
Run Order 16 11 14 6 18 1 3 4 15 17 12 5 13 19 8 9 7 2 10
inlettº (ºC) 130 180 130 180 130 180 130 180 130 180 130 180 130 180 130 180 155 155 155
46
Solids (%) 5 5 15 15 5 5 15 15 5 5 15 15 5 5 15 15 10 10 10
Airflow (L/h) 355 355 355 355 473 473 473 473 355 355 355 355 473 473 473 473 414 414 414
Pump Stabiliteit (mL/min) (%) 3,5 114,13 3,5 0,59 3,5 93,32 3,5 50,83 3,5 109,56 3,5 8,72 3,5 68,40 3,5 7,83 7 119,56 7 72,00 7 113,01 7 84,29 7 107,76 7 80,51 7 82,44 7 45,79 5 101,14 5 99,62 5 75,05
5.3.2. Analyse van het experimenteel design 5.3.2.1. Evaluatie van de ruwe data
FIGUUR 5.9.: REPLICATIEPLOT VAN DE STABILITEIT
Van de replicaten wordt verwacht dat hun respons in het midden van de responswaarden ligt. Uit de replicatieplot in figuur 5.9. kan afgeleid worden dat de responsen van de replicaten in dit experiment min of meer in het midden liggen en dat ze vrij dicht bij elkaar liggen, wat een goede reproduceerbaarheid van de experimenten doet vermoeden.
5.3.2.2. Lineaire regressie analyse Scaled & Centered Coefficients for s tabiliteit 30 20 10
%
0 -10 -20 -30
inlet*pum
pum
air
inlet
-40
N=19 R2=0,834 RSD= 17,7 FIGUUR 5.10. : COËFFICIËNTENPLOT VAN DE STABILITEIT DF=14
Q2=0,697
Conf . lev.=0,95
Om een goed model te bekomen werden niet-significante coëfficiënten verwijderd.. Dit resulteerde in de plot te zien in figuur 5.10. Hierbij kan afgeleid worden dat de inlaattemperatuur een significant negatieve invloed heeft op de stabiliteit, net zoals de airflow, hetzij niet significant. Deze negatieve invloed wil zeggen dat naarmate de 47
inlaattemperatuur en enigszins de airflow, hoger wordt ingesteld, de resulterende stabiliteit van het enzym lager zal liggen..Dit valt te verklaren doordat een hogere inlaattemperatuur het thermolabiele enzym meer zal beschadigen. Hoe hoger ook de airflow waarmee de spray gevormd wordt tijdens het sproeidrogen, hoe groter de mechanische stress op het enzym waardoor deze ook hierdoor meer schade kan oplopen. De feedsnelheid daarentegen had een positieve invloed op de stabiliteit. Hier zal dus een betere enzymstabiliteit verkregen worden naarmate de feedsnelheid opgedreven wordt. Doordat het enzym sneller door het sproeidroogsysteem gedreven wordt, wordt de verblijftijd korter en kan die dus minder schade oplopen. Verder was er ook interactie waar te nemen tussen de inlaattemperatuur en de feedsnelheid, hetzij niet significant.
Vervolgens werden de R², Q², de modelvaliditeit en de reproduceerbaarheid van het experimenteel model berekend via lineaire regressie en uitgezet in een ‘summary of fit’ plot (zie figuur 5.11.).
FIGUUR 5.11. ‘SUMMARY OF FIT’ PLOT VOOR DE STABILITEIT Om een goed model te bekomen moeten R² en Q² hoger liggen dan 0,5. De waarden voor de stabiliteit waren 0,834 voor R² en 0,697 voor Q². In figuur 5.11. is ook te zien dat de waarden van de modelvaliditeit en de reproduceerbaarheid hoog waren, wat duidt op de bruikbaarheid van het model en de reproduceerbaarheid van de experimenten. Er kan dus besloten worden dat er een goed en bruikbaar model bekomen werd. 5.3.2.3. Gebruik van het model Een contourplot werd opgemaakt voor de stabiliteit. Uit deze plot kunnen de beïnvloedende factoren voor de stabiliteit makkelijk afgeleid worden en geïnterpreteerd. Aangezien de airflow de minst beïnvloedende factor was, werd deze ingesteld op een centrale waarde van 414 L/H. 48
FIGUUR 5.12.: CONTOUR PLOT VOOR DE STABILITEIT Uit de contour plot (zie figuur 5.12.) kan opgemaakt worden dat de stabiliteit toeneemt naarmate de feedsnelheid verhoogd wordt en de inlaattemperatuur verminderd. Dit kan verklaard worden door het feit dat bij een hoge feedsnelheid het enzym minder lang in het sproeidroogsysteem verblijft en het enzym degradeert bij een hoge inlaattemperatuur zoals reeds eerder vermeld.
Uit deze experimental design kan algemeen besloten worden dat de ideale settings voor een maximale stabiliteit van het enzym een inlaattemperatuur van 130°C, een airflow van 414 L/H (of 35) en een pompsnelheid van 7 ml/min (of 20%) zijn.
5.4. VIRUSTITRATIE
Een formulatie met 4,5% mannitol en 0,5% trehalose, die beladen werd met levend geattenueerd virus, werd gesproeidroogd bij de ideale settings zoals hierboven bepaald via experimental design. Dit resultaat werd vergeleken met het resultaat van een experiment met dezelfde formulatie maar gesproeidroogd bij andere, gemiddelde parameters.
Formulatie 1 in onderstaande tabel (tabel 5.5.) werd gesproeidroogd bij de volgende ideale parameters: inlaattemperatuur 130°C, airflow 414 L/H en pompsnelheid 7 ml/min. Dit resulteerde in een uitlaattemperatuur van 65°C. Formulatie 2 werd gesproeidroogd bij een
49
inlaattemperatuur van 150°C, een airflow van 414 L/H en een pompsnelheid van 5 ml/min. De resulterende uitlaattemperatuur hier was 77°C.
TABEL 5.5.: VIRUSTITER VOOR EN NA SPROEIDROGEN BIJ EEN FORMULATIE GESPROEIDROOGD BIJ IDEALE SETTINGS EN EEN FORMULATIE GESPROEIDROOGD BIJ GEMIDDELDE SETTINGS Formulatie
Feed (10x EID50/100 ml)
Poeder (10x EID50/5g)
1
9,2
8
2
10,3
7,3
In tabel 5.5. worden de virustiters weergegeven van de feedoplossingen voor sproeidrogen en van de poeders na sproeidrogen. Uit de tabel kan afgeleid worden dat het verlies aan virustiter bij de eerste formulatie 1,2 log10 EID50 eenheden is, wat beduidend lager ligt dan het verlies aan virustiter bij de tweede formulatie, namelijk 3 log10 EID50 eenheden.
Algemeen kan dus besloten worden dat betere sproeidroogparameters gevonden zijn met behulp van de experimental design. Wanneer gesproeidroogd wordt bij deze settings zal het virusvaccin minder beschadigd worden dan wanneer gesproeidroogd wordt bij gemiddelde settings.
50
6. CONCLUSIE
De aanwezigheid van stabilisatoren in een droog poeder virusvaccin is onontbeerlijk. Het virus moet namelijk gestabiliseerd worden zowel tijdens het productieproces als tijdens bewaring. Het doel van dit onderzoek was het vinden van nieuwe stabilisatoren met het oog op de productie van een stabiel vaccin. In dit onderzoek werd ß-galactosidase gebruikt als modelmolecule voor het virusvaccin. De onderzochte stabilisatoren waren mannitol als bulkelement gecombineerd met suikers zoals trehalose en myo-inositol en aminozuren zoals glycine en betaine, een glycine-afgeleide. Tijdens het productieproces konden de combinaties mannitol-trehalose en mannitol-myo-inositol de enzymactiviteit vrijwel volledig beschermen, terwijl deze opvallend achteruit ging na 1 maand bewaring ongeacht de bewaartemperatuur (tot 80% enzymactiviteitsverlies na 1 maand bij 25ºC; 60% bij 6ºC). Na 1 maand trad er het minst enzymactiviteitsverlies op bij de formulatie mannitol-glycine 1% met slechts 8,29% bij 25ºC. Uiteindelijk kon besloten worden dat de formulatie mannitoltrehalose-glycine het kleinste enzymactiviteitsverlies vertoonde als gekeken werd naar het totaalverlies van enzymactiviteit na sproeidrogen en 1 maand bewaring bij 25ºC samen, namelijk 44%. . Bij de karakterisatie van de poeders bleek uit de SEM-foto’s dat er bij de meeste formulaties mooie sferische partikels gevormd werden, behalve bij het mannitol-betaïne en mannitol-glycine 1% poeder werden grillige clusterpartikels verkregen. Met behulp van laserdiffractie kon besloten worden dat alle poeders een smalle partikelgroottedistributie hadden (span: 1-2) met een gemiddelde D(v,0.5) van 8-10 µm, behalve opnieuw de betaïne en glycine 1% formulatie die grotere partikels vertoonden (D(v,0.5) van respectievelijk 54 en 43 µm). Uit de Karl Fischer titraties bleek dat alle poeders een laag vochtgehalte hadden (< 1%). DSC-experimenten toonden aan dat enkel de twee formulaties met trehalose na sproeidrogen een glastransitietemperatuur vertoonden wat wijst op de aanwezigheid van een amorficiteit in de poeders. De overige gesproeidroogde poeders waren kristallijn. Dat alle poeders een lage hygroscopiciteit hadden kon besloten worden uit de experimenten met de DVS.
51
Het gebruik van een ultrasone sproeidroger maakte het mogelijk poeders te bekomen met een D(v,0.1) rond 20µm, dit in tegenstelling tot de sproeidroger met een two fluid nozzle. De formulatie mannitol-BSA bleek de minst kleine partikels te bezitten (D(v,0.1)=22,61µm).
Om na te gaan wat de invloed van de sproeidroogparameters op de enzymstabiliteit is werd een full factorial experimental design uitgevoerd. Hieruit kon besloten worden dat de inlaattemperatuur en de feedsnelheid een significante invloed hadden op de stabiliteit. Vermindering van de inlaattemperatuur en verhoging van de feedsnelheid bleken een positieve invloed te hebben op de enzymstabiliteit. Deze uitkomst werd getest door een formulatie met virusvaccin te sproeidrogen bij deze settings (Ti= 130ºC; feedsnelheid: 7mL/min). Het resultaat was dat er inderdaad minder verlies aan virusvaccin (1,2 logeenheden) was in vergelijking met dezelfde formulatie gesproeidroogd bij 150ºC met een feedsnelheid van 5 mL/min.
52
7. LITERATUURSLIJST
Alexander, D.J.; Bell, J.G.; Alders, R.G. (2004). Technology review: Newcastle disease
Amorije, J.P.; Huckriede, A.; Wischut, J.; Frifflink, H.W.; Hinrichs, W.L.J. (2008). Development of stable influenza vaccine powder formulations: Challenges and possibilities. Pharmaceutical resaerch, 25(6), 1256-1273
Andya, J.D.; Maa, Y.F.; Costantino, H.R.; Nguyen, P.A.; Dasovich, N.; Sweeney, T.D.; Hsu, C.C.; Shire, S.J. (1999). The effect of formulation excipients on protein stability and aerosol performance of spray-dried powders of a recombinant humanized anti-IgE monoclonal antibody. Pharmaceutical research, 16(3), 350-358
Bakaltcheva, I.; O’Sullivan, A.M.; Hmel, P.; Ogbu, H. (2007). Freeze-dried whole plasma: Evaluating sucrose, trehalose, sorbitol, mannitol and glycine as stabilizers. Thrombosis research, 120(1), 105-116
Burger, J.L.; Cape, S.P.; Braun, C.S.; Mcadams, D.H.; Best, J.A.; Bhagwat, P.; Pathak, P.; Rebits, L.G.; Sievers, R.E. (2008). Stabilizing formulations for inhalable powders of liveattenuated measles virus vaccine. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery, 21(1), 25-34
Burnett, D.; Thielmann, F. Determining the moisture-induced glass transition in an amorphous pharmaceutical material. Surface measurement systems, Application note, 35
Cal, K.; Sollohub, K. (2009). Spray drying technique. I: Hardware and process parameters. Journal of pharmaceutical sciences, 99(2), 575-586
Caldas, T.; Demont-Caulet, N.; Ghazi, A.; Richarme, G. (1999). Thermoprotection by glycine betaine and choline. Microbiology-UK, 145, 2543-2548 Cargill, P. (1999). Vaccine administration in poultry. In Practice, 21(6), 323-328 53
Chang, B.S.; Beauvais, R.M.; Dong, A.C.; Carpenter, J.F. (1996). Physical factors affecting the storage stability of freeze-dried interleukin-1 receptor antagonist: Glass transition and protein conformation. Archives of biochemistry and biophysics, 331(2), 249-258
Corbanie, E.A.; Matthijs, M.G.R.; van Eck, J.H.H.; Remon, J.P.; Landman, W.J.M.; Vervaet, C. (2006). Deposition of differently sized airborne microspheres in the respiratory tract of chickens. Avian pathology, 35(6), 475-485
Costantino, H.R.; Andya, J.D.; Nguyen, P.A.; Dasovich, N.; Sweeney, T.D; Shire, S.J.; Hsu, C.C.; Maa, Y.F. (1998). Effect of mannitol crystallization on the stability
and
aerosol
performance of a spray-dried pharmaceutical protein, recombinant humanized antiIgE monoclonal antibody. Journal of pharmaceutical science, 87(11), 1406-1411 Cursus “Fysicochemie van het geneesmiddel”, Professor De Smedt, 2 e bachelor farmaceutische wetenschappen Cursus “Practicumnota’s instrumentele analytische chemie”, Professor Thienpont, 3 e bachelor farmaceutische wetenschappen
Cursus “Virologie”, Professor Van Reeth, faculteit diergeneeskunde
Eriksson, L.; Johansson, E.; Kettaneh-Wold, N.; Wikström, C.; Wold, S. (2008). Design of Experiments: Principles and Applications. Umetrics Academy, Umeå, Sweden, Chapter 4.
Gallili, G.E.; Ben-Nathan, D. (1998). Newcastle disease vaccines. Biotechnology Advances, 2, 343-366
Hill, J.J.; Shalaev, E.Y.; Zografi, G. (2005). Thermodynamic and dynamic factors involved in the stability of native protein structure in amorphous solids in relation to levels of hydration. Journal of pharmaceutical sciences, 94(8), 1636-1667 54
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Trehalose.svg
http://materials.npl.co.uk/matsol/thermal.html
http://pages.usherbrooke.ca/biomedias/images/hemagglutination-2.pngµ
http://partnersah.vet.cornell.edu/avian-atlas/search/lesion
http://pathmicro.med.sc.edu/mhunt/RNA10.jpg
http://science.howstuffworks.com/scanning-electron-microscope.htm
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/Inositol_structure.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/bb/DMannitol_structure.png/800px-D-Mannitol_structure.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f1/Glycine-skeletal.png
http://www.afsca.be/sp/sa-newcastle/newcastle_nl.asp
http://www.aphis.usda.gov/lpa/pubs/pub_ahend.html
http://www.britannica.com/EBchecked/topic-art/526571/110970/Scanning-electronmicroscope
http://www.britannica.com/EBchecked/topic/236059/glycine
http://www.buchi.com/uploads/RTEmagicC_Principle_02.jpg.jpg
http://www.cbip-vet.be/nl/texts/NAVOOOL1AL2o.php#LegRepr 55
http://www.cdfa.ca.gov/ahfss/Animal_Health/images/avian_health/by-13.jpg
http://www.ema.europa.eu/pdfs/vet/referral/avinew/112901nl4.pdf
http://www.farma.ku.dk/index.php/Kristina-Mosen-F/5045/0/
http://www.hayashibara-intl.com/food/trehalose.html
http://www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/gifs/cube.gif
http://www.malvern.de/LabGer/technology/laser_diffraction/particle_sizing.htm
http://www.msm.cam.ac.uk/phasetrans/2002/Thermal2.pdf
http://www.reussir-aviculture.com/reussir/photos/100/img/5BVD0OS32_web.jpg
http://www.rspharmchem.com/trehalose.htm
http://www.siliconfareast.com/SEMTEM.htm
http://www.sympatec.com/DE/LaserDiffraction/LaserDiffraction.html
http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/111/newcastle-disease-paramyxovirus-1
http://www.thesorptionsolution.com/Products_DVS_Advantage_Instrument.php
http://www.vactora.com/image/2.jpg
http://www.vannature.nl/monografie/Betaine_TMG_Trimethylglycine.html
56
Huang, J.; Mikszta, J.A.; Ferriteri, M.S.; Jiang, G.; Harvey, N.G.; Dyas, B.; Roy, C.J.; Ullrich, R.G.; Sullivan, V.J. (2007). Intranasal administration of dry powder anthrax vaccine provides protection against lathal aerosol spore challange. Human vaccines, 3(3), 90 -93
Knapp, S.; Ladenstein, R.; Galinski, E.A. (1999). Extrinsic protein stabilization by the naturally occuring osmolytes beta-hydroxyectoine and betaine. Extremophiles, 3(3), 191-198
Maa, Y.F.; Ameri, M.; Shu, C.; Payne, L.G.; Chen, D.X. (2004). Influenza vaccine powder formulation development: Spray-freeze-drying and stability evaluation. Journal
of
pharmaceutical sciences, 93(7), 1912-1923
Malcolmson, R.J.; Embleton, J.K. (1998). Dry powder formulations for pulmonary delivery. PSTT, 1(9), 394-398
Rauw, F.; Gardin, Y.; van den Berg, T.; Lambrecht, B. (2009). Vaccination against Newcastle disease in chickens. Biotechnologie Agronomie Societe et envirronement, 13(4), 587596
Reddy, S.K.; Sharma, J.M.; Ahmad J.; Reddy, D.N.; McMillent, J.K.; Cook, S.M.; Wild, M.A.; Schwartz, R.D. (1996). Protective efficacy of a recombinant herpesvirus of turkeys as an ovo vaccine against Newcastle and Marek’s diseases in specific-pahtogen-free chickens. Vaccine, 14(6), 469-477
Rowe, R.C.; Sheskey, P.J.; Weller, P.J. (2002). Albumin. In: Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical Press, London, Groot-Brittannië, pp. 11-12
Rowe, R.C.; Sheskey, P.J.; Weller, P.J. (2002). Mannitol. In: Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical Press, London, Groot-Brittannië, pp.373-377
57
Rowe, R.C.; Sheskey, P.J.; Weller, P.J. (2002). Trehalose. In: Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical Press, London, Groot-Brittanië, pp. 657-658
Singh, S.; Aziz, M.A.; Khandelwal, P.; Bhat, R.; Bhatnagar, R. (2004). The osmoproctectants glycine and its methyl derivatives prevent the thermal inactivation of protective antigen of Bacillus anthracis. Biochemical and biophysical resaerch communications, 316(2), 559-564
Seal, B.S.; King, D.J.; Sellers, H.S. (1999). The avian response to Newcastle disease virus. Developmental an Camparative Immonology, 24, 257-268
Seville, P.C.; Li, H ; Learoyd, T.P. (2007). Spray-dried powders for pulmonary drug delivery. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 24(4), 307-360
58
