UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium Analytische Chemie Academiejaar 2009-2010
VERESTERDE VETZUREN – FARMACEUTISCHE CONTEXT, ANALYTISCHE METHODES EN VALIDATIE VAN EEN GLC METHODE –
Stefanie DE BUYSER Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling
Promotor
Prof. Dr. L. Thienpont Commissarissen
Prof. Dr. B. De Spiegeleer Prof. Dr. W. Lambert
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
28 mei 2010
Promotor
Prof. Dr. L. Thienpont
Auteur
Stefanie De Buyser
DANKWOORD
Vooreerst wens ik mijn promotor, Prof. Dr. L. Thienpont, te bedanken voor de algemene leiding van de onderzoeksstage en het nalezen van de scriptie.
Daarnaast verdient Dr. D. Stöckl ook een bijzonder dankwoord. Hij heeft met veel geduld mijn gaschromatograaf hersteld. Bovendien heeft hij me ook veel over statistiek bijgebracht en inzicht in het concept “total error” gegeven.
Ook Dr. K. Van Uytfanghe wens ik te bedanken voor het grondig nalezen van mijn thesis.
Aan de doctoraatstudenten Hedwig en Sofie wil ik mijn appreciatie betuigen voor hun bijstand bij het uitvoeren van de experimenten.
Verder wil ik hier ook mijn medestudenten, Renate, Hanne, Sofie, Elise en Lode, vermelden. Zij zorgden voor leuke babbels en een aangename werksfeer in het laboratorium.
Als laatste wil ik nog mijn ouders en vrienden bedanken voor hun aanmoedigingen en in het bijzonder mijn vriend Jeroen, die de voorbije 6 jaar mijn steun en toeverlaat was.
INHOUDSOPGAVE
DANKWOORD INHOUDSOPGAVE DEFINITIES LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 1.
INLEIDING .......................................................................................................... 1 1.1 METHODEVALIDATIE ........................................................................................... 1 1.2 VERESTERDE VETZUREN ...................................................................................... 3
2.
OBJECTIEVEN ................................................................................................... 6
3.
MATERIAAL EN METHODEN ........................................................................ 7 3.1 MATERIALEN ....................................................................................................... 7 3.2 STANDAARDEN EN STALEN .................................................................................. 7 3.3 APPARATUUR ...................................................................................................... 9 3.3.1
Instrument................................................................................................... 9
3.3.2
Randapparatuur ....................................................................................... 10
3.4 METHODE .......................................................................................................... 10 3.4.1
Systeemfunctietest ..................................................................................... 10
3.4.2
Systeemgeschiktheidstest .......................................................................... 10
3.4.3
Analyse ..................................................................................................... 11
3.5 VALIDATIE-EXPERIMENTEN ............................................................................... 12 3.5.1
Kalibratie ................................................................................................. 12
3.5.2
Aantoonbaarheidsgrens ........................................................................... 14
3.5.3
Imprecisie ................................................................................................. 15
3.5.4
Juistheid ................................................................................................... 16
3.5.5
Methodevergelijking ................................................................................. 16
3.5.6
Overzicht validatie-experimenten ............................................................ 18
3.6 SPECIFICATIES ................................................................................................... 18 3.7 DATAVERWERKING EN STATISTIEK ................................................................... 19 3.8 LITERATUURONDERZOEK .................................................................................. 20 3.8.1
Geraadpleegde bronnen ........................................................................... 20
3.8.2
Technieken en reduceermechanisme ........................................................ 20
4.
RESULTATEN EN DISCUSSIE ...................................................................... 21 4.1 METHODE .......................................................................................................... 21 4.1.1
Systeemfunctietest ..................................................................................... 21
4.1.2
Systeemgeschiktheidstest .......................................................................... 21
4.2 VALIDATIE-EXPERIMENTEN .............................................................................. 22 4.2.1
Kalibratie ................................................................................................. 22
4.2.2
Aantoonbaarheidsgrens ........................................................................... 25
4.2.3
Imprecisie ................................................................................................. 26
4.2.4
Juistheid ................................................................................................... 27
4.2.5
Methodevergelijking ................................................................................. 30
4.3 LITERATUURONDERZOEK .................................................................................. 32 4.3.1
Betekenis van veresterde vetzuren in de farmaceutische context ............. 32
4.3.2
Analysemethoden voor veresterde vetzuren ............................................. 37
4.3.3
Total error in methodevalidatie ............................................................... 41
5.
CONCLUSIE ...................................................................................................... 46
6.
LITERATUURLIJST ........................................................................................ 48
DEFINITIES
Volgende
definities
werden
overgenomen
uit
het
“International
vocabulary
of
metrology”(VIM, 2008), tenzij anders vermeld. Accuracy “closeness of agreement between a measured quantity value and a true quantity value of the measurand” Bias “estimate of a systematic measurement error” Calibration “operation that, under specified conditions, in a first step, establishes a relation between the quantity values with measurement uncertainties provided by measurement standards and corresponding indications with associated measurement uncertainties and, in a second step, uses this information to establish a relation for obtaining a measurement result from an indication” Error “measured quantity value minus a reference quantity value” Limit of detection (in analysis) “The limit of detection, expressed as the concentration, cL, or the quantity, qL, is derived from the smallest measure, xL, that can be detected with reasonable certainty for a given analytical procedure. The value of xL is given by the equation xL = xbi + k • sbi, where xbi is the mean of the blank measures, sbi is the standard deviation of the blank measures, and k is a numerical factor chosen according to the confidence level desired.” (http://goldbook.iupac.org).
Limit of detection “measured quantity value, obtained by a given measurement procedure, for which the probability of falsely claiming the absence of a component in a material is β, given a probability α of falsely claiming its presence” Linearity (algemeen) “ability of an analytical procedure to produce test results which are proportional to the concentration (amount) of an analyte, either directly or by means of a well-defined mathematical transformation”(Stöckl, 2007a) Measurement “process of experimentally obtaining one or more quantity values that can reasonably be attributed to a quantity” Precision “closeness of agreement between indications or measured quantity values obtained by replicate measurements on the same or similar objects under specified conditions” Random error “component of measurement error that in replicate measurements varies in an unpredictable manner” Systematic error “component of measurement error that in replicate measurements remains constant or varies in a predictable manner” Trueness “closeness of agreement between the average of an infinite number of replicate measured quantity values and a reference quantity value” Working interval “set of values of the quantities of the same kind that can be measured by a given measuring instrument or measuring system with specified instrumental uncertainty, under defined conditions”
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
°C
Graden Celsius
µg
Microgram
µL
Microliter
µm
Micrometer
µV
Microvolt
BCFI
Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische Informatie
BI
Betrouwbaarheidsinterval
C16
Hexadecaan
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
cm³
Kubieke centimeter
CV
Coefficient of Variation, variatiecoëfficiënt
DDPT
4‟-demethyldeoxypodophyllotoxine
ELSD
Evaporative Light Scattering Detector, evaporatieve lichtverstrooiingsdetector
EP
Evaluation Protocol
FAMEs
Fatty Acid Methyl Esters, vetzuur methylesters
FDA
Food and Drug Administration
FID
Flame Ionisation Detector, vlamionisatiedetector
GC
Gas Chromatography, gaschromatografie
GLC
Gas Liquid Chromatography, gas-vloeistofchromatografie
ICH
International Conference on Harmonisation
ISO
International Organisation for Standardisation
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
LC
Liquid Chromatography, vloeistofchromatografie
LDL
Low Density Lipoproteïnen, lage densiteit lipoproteïnen
mg
Milligram
Mg-St
Magnesiumstearaat
mL
Milliliter
MM
Methylmyristaat
mm
Millimeter
NCCLS
National Committee for Clinical Laboratory Standards
ng
Nanogram
OLR
Ordinary Least Squares Regression
p-waarde
Probabiliteits-waarde
SD
Standaarddeviatie
SEs
Sucrose Esters, vetzuren veresterd met sucrose
SFC
Supercritical Fluid Chromatography, Superkritische vloeistofchromatografie
SFSTP
Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques
S/R
Signaal/ruis-verhouding
TLC
Thin Layer Chromatography, dunne laag chromatografie
USP
United States Pharmacopeia
VIM
International Vocabulary of Metrology
WLR
Weighted Least Squares Regression
1. INLEIDING 1.1
METHODEVALIDATIE De “International Organisation for Standardisation” (ISO) definieert validatie als de
“confirmation, through the provision of objective evidence, that requirements for a specific intended use or application have been fulfilled” (ISO 9001). Volgens het “International Vocabulary of Metrology” (VIM) is validatie de “verification, where the specified requirements are adequate for an intended use”(VIM, 2008). De validatie van een analytische methode
is
dus
het
proces
dat
vaststelt,
door
laboratoriumonderzoek,
dat
de
prestatiekenmerken van de methode voldoen aan de vereisten voor de voorgenomen analytische toepassingen (USP 29). Verschillende stappen dienen hiervoor te worden doorlopen.
Vooreerst moet het bedoeld gebruik van de methode worden gespecificeerd. Vervolgens dienen de relevante prestatiekenmerken te worden vastgesteld en de prestatievereisten gedefinieerd. Typische kenmerken die worden beschouwd, zijn opgesomd in Tabel 1.1. Over het algemeen wordt er bij validatie veel aandacht besteed aan juistheid en precisie en, indien relevant, aan de aantoonbaarheidsgrens.
TABEL 1.1: ANALYTISCHE PRESTATIEKENMERKEN BESCHOUWD IN METHODEVALIDATIE. Imprecisie Aantoonbaarheidsgrens Werkgebied Lineariteit Juistheid Interferentie / Specificiteit
Nadien moeten er via validatie-experimenten objectieve gegevens over de prestatiekenmerken gegenereerd worden. Tenslotte moet door interpretatie van de validatiegegevens worden bevestigd of aan de vooropgestelde vereisten is voldaan. De moderne interpretatie van de analytische data gebeurt met behulp van statistische significantietesten of aan de hand van betrouwbaarheidsintervallen (BI‟s) (http://sttconsulting.com/).
1
Methodevalidatie is een belangrijk onderdeel in elk laboratorium, dat betrokken is in de
ontwikkeling
van
standaardmethoden.
Het
is
namelijk
geïntegreerd
in
het
ontwikkelingsproces van analytische methoden, omdat het toelaat om een methode zijn prestatievermogen vast te stellen en zijn geschiktheid voor het doel (“fitness for purpose”) aan te tonen (Araujo, 2009).
Verschillende gerenommeerde organisaties bieden richtlijnen bij de methodevalidatie. Enkele hiervan zijn: de “United States Food and Drug Administration” (FDA), de “International Conference on Harmonisation” (ICH), de ISO, de “International Union of Pure and Applied Chemistry” (IUPAC) en de “United States Pharmacopeia” (USP) (Araujo, 2009). Zij hebben documenten gepubliceerd, die internationaal aanvaard zijn en een leidraad vormen in geaccrediteerde analytische laboratoria.
Validatie is in principe altijd nodig bij een nieuwe analysemethode, die werd ontwikkeld voor een bepaald doel. Wanneer een reeds eerder gevalideerde methode aangepast wordt of een uitgebreider toepassingsgebied krijgt, kan een hervalidatie evengoed nodig zijn. Prestatiekenmerken zijn namelijk enkel geldig voor het laboratorium dat ze geëvalueerd heeft. Documenten gepubliceerd door de ICH, geven richtlijnen over de noodzaak voor revalidatie in bepaalde omstandigheden, zoals bij veranderingen in de synthese van de substantie, veranderingen in de samenstelling van het product en veranderingen in de analytische procedure (USP 29). Afhankelijk van de mate van verandering varieert de uitgebreidheid van de hervalidatie. In deze meesterproef wordt een gas-vloeistofchromatografische (“Gas Liquid Chromatography”, GLC) methode gevalideerd voor de bepaling van methylmyristaat (MM), een veresterd vetzuur. Als prestatiekenmerken worden de lineariteit, de imprecisie, de juistheid en de aantoonbaarheidsgrens gevalideerd. Tevens wordt een methodevergelijking uitgevoerd. De prestatiekenmerken worden bepaald volgens de “Evaluation Protocols” (EP‟s) van het “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI), tot 2005 bekend als het “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS). De specificaties worden weergegeven onder 3.6. De uitgevoerde validatie-experimenten worden beschreven in het hoofdstuk „Materiaal en methoden‟. In het hoofdstuk „Resultaten en discussie‟ worden de validatiegegevens geïnterpreteerd aan de hand van statistische testen en BI‟s. 2
1.2
VERESTERDE VETZUREN “Vetzuren zijn koolwaterstofketens met aan het uiteinde een zure carboxylgroep.” Ze
worden ingedeeld in 4 grote groepen: verzadigde vetzuren, mono-onverzadigde vetzuren, polyonverzadigde vetzuren en transvetzuren (Christophe, 2007). Bij verzadigde vetzuren heeft de koolstofketen een lineaire configuratie. Er komen geen dubbele bindingen voor tussen de koolstofatomen. Mono- en polyonverzadigde vetzuren hebben respectievelijk 1 en meerdere dubbele bindingen tussen de koolstofatomen. Vetzuren die in de voeding voorkomen, hebben overwegend de cis-configuratie. Hierbij gaat het ketengedeelte volgend op de dubbele binding verder onder een bepaalde hoek. Bij transvetzuren gaat de keten rechtdoor aan de dubbele binding (trans-configuratie). De structuurformule van een vetzuur uit elke groep wordt getoond in Figuur 1.1.
Caprylzuur, onverzadigd
Linolzuur, polyonverzadigd, 2x cis-configuratie
Oliezuur, mono-onverzadigd, cis-configuratie
Elaïdinezuur, mono-onverzadigd, trans-configuratie
FIGUUR 1.1: VOORBEELDEN VAN VETZUREN MET HUN STRUCTUURFORMULE.
Bij de conventionele aanduiding van vetzuren duidt het eerste cijfer na de C het aantal koolstofatomen aan en het tweede cijfer het aantal dubbele bindingen. Het nummer van het koolstofatoom dat met een dubbele binding aan het volgend koolstofatoom gebonden is, wordt geplaatst in de exponent na het tweede cijfer. De telling begint vanaf het carboxylkoolstofatoom. Bij de polyonverzadigde ω-3 vetzuren en ω-6 vetzuren, begint men te tellen vanaf de terminale methylgroep en wijst het cijfer 3 of 6 op de plaats van de eerste dubbele binding die men tegenkomt. De conventionele aanduiding van de meest voorkomende vetzuren in de voeding wordt weergegeven in Tabel 1.2 samen met enkele van hun benamingen.
3
TABEL 1.2: OVERZICHT VAN DE MEEST VOORKOMENDE VETZUREN MET HUN TRIVIALE EN SYSTEMATISCHE BENAMING EN HUN CONVENTIONELE AANDUIDING. Aantal
Triviale benaming
Systematische benaming
koolstofatomen
Conventionele Aanduiding
4
Boterzuur
Butaanzuur
C4:0
6
Capronzuur
Hexaanzuur
C6:0
8
Caprylzuur
Octaanzuur
C8:0
10
Caprinezuur
Decaanzuur
C10:0
12
Laurinezuur
Docedaanzuur
C12:0
14
Myristinezuur
Tetradecaanzuur
C14:0
16
Palmitinezuur
Hexadecaanzuur
C16:0
18
Stearinezuur
Octadecaanzuur
C18:0
20
Arachinezuur
Eicosaanzuur
C20:0
22
Beheenzuur
Docosaanzuur
C22:0
24
Lignocerinezuur
Tetracosaanzuur
C24:0
16
Palmitoleinezuur
9-hexadeceenzuur
C16:19
18
Oliezuur
9-octadeceenzuur
C18:19
22
Erucazuur
13-docoseenzuur
C22:113
18
Linolzuur
9,12-octadecadieenzuur
C18:29,12
18
α-linoleenzuur
9,12,15-octadecatrieenzuur
C18:39,12, 15
18
γ-linoleenzuur
6,9,12-octadecatrieenzuur
C18:36,9,12
20
Arachidonzuur
5,8,11,14-eicosatetraeenzuur
C20:45,8,11,14
20
Timnodonzuur
5,8,11,14,17-eicosapentaeenzuur
C20:55,8,11,14,17
22
Cervonzuur
4,7,10,13,16,19-docosahexaeenzuur
C22:64,7,10,13,16,19
Het belangrijkste voorkomen van vetzuren is in neutrale vetten. Dit zijn esters van glycerol en vetzuren. Bij complete verestering van de glycerolmolecule spreekt men van triglyceriden of triacylglycerolen. Deze vormen kwantitatief de belangrijkste fractie van vetten en oliën in de voeding. Linolzuur en α-linoleenzuur zijn essentiële vetzuren. Voor het organisme zijn ze onontbeerlijk. Aangezien het lichaam ze niet zelf kan synthetiseren, moeten ze via de voeding aangevoerd worden. Arachidonzuur is een precursor in de biosynthese van sommige prostaglandines, waaronder prostaglandine E2. Sommige verzadigde vetzuren hebben een effect op de cholesterolemie. Zo verhogen laurinezuur en vooral myristine- en palmitinezuur
4
het plasmacholesterolgehalte. Stearinezuur en korte ketenvetzuren doen dit echter niet (Christophe, 2007).
Vetzuren en derivaten van vetzuren worden gebruikt in een grote verscheidenheid van toepassingen. Vetzuren zijn gewoonlijk aanwezig in de grondstoffen gebruikt voor de productie van biodiesel. Zeer veel natuurlijke vetzuren worden gebruikt in de bereiding van vetzuuresters. Methyl-, ethyl-, n-propyl-, isopropyl- en butylesters worden gebruikt als zachtmakers in cosmetica en andere verzorgingsproducten en als smeermiddelen. Esters van vetzuren met complexere alcoholen, zoals sorbitol, ethyleenglycol, diethyleenglycol en polyethyleenglycol worden gebruikt in de voeding, persoonlijke verzorging, walsoliën en synthetische
smeermiddelen
(http://www.amberlyst.com/fatty_acids.htm).
Andere
toepassingen voor veresterde vetzuren worden besproken in het literatuuronderzoek bij 4.3.1.
Een GLC methode voor de bepaling van MM wordt gevalideerd tijdens de meesterproef. MM is een methylester van tetradecaanzuur en wordt ook wel methyltetradecanoaat genoemd. De chemische structuur van MM wordt getoond in Figuur 1.2 (www.sigmaaldrich.com). In de cosmetica wordt MM gebruikt als verzachtend middel en voor de huidverzorging. Daarnaast kan het ook dienen als geur- en smaakmiddel (http://www.thegoodscentscompany.com/).
FIGUUR 1.2: STRUCTUUR VAN METHYLMYRISTAAT.
5
2. OBJECTIEVEN De scriptie bestaat enerzijds uit een experimenteel gedeelte en anderzijds uit een literatuuronderzoek.
Tijdens het experimenteel gedeelte zullen we een GLC methode voor de bepaling van MM valideren. Het GLC systeem bestaat uit een kolom met apolaire stationaire fase en een warmtegeleidbaarheidsdetector. We gaan kijken of deze analysemethode geschikt is om MM te bepalen door verschillende prestatiekenmerken te evalueren en te vergelijken met vooropgestelde specificaties. De te beoordelen prestatiekenmerken zijn: de lineariteit, de aantoonbaarheidsgrens, de imprecisie en de juistheid. Deze validatie-experimenten worden zelf gepland en uitgevoerd. Daarnaast is ook een methodevergelijkingsstudie voorzien. Dit gebeurt echter aan de hand van gesimuleerde data. De bekomen gegevens worden statistisch geïnterpreteerd en gerapporteerd.
Alvorens aan de validatie-experimenten te beginnen, zullen we het dynamisch bereik bepalen, waarin we kunnen kwantificeren. Uit het validatie-experiment voor de lineariteit zullen we tevens afleiden welk soort vergelijking de kalibratiecurve het best beschrijft. Verder zal worden nagegaan welk kalibratiemodel aanleiding geeft tot de beste terugvinding en de laagste variatiecoëfficiënt (“Coefficient of Variation”, CV).
Tijdens het literatuuronderzoek willen we eerst en vooral de betekenis van veresterde vetzuren in de farmaceutische context achterhalen. Verder bekijken we de verschillende analysemethodes voor veresterde vetzuren met enkele van hun voor- en nadelen. Tenslotte verduidelijken we het concept “total error” in methodevalidatie.
6
3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1
MATERIALEN MM, gebruikt als standaard, werd aangekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, Verenigde
Staten). Cyclohexaan werd verkregen bij Merck (Darmstadt, Duitsland). Heptadecaan en de interne standaard hexadecaan (C16) waren afkomstig van Sigma-Aldrich. Alle reagentia waren tenminste van analytische zuiverheid. Het Alphagaz 2 stikstof (zuiverheid 99,995%) werd verschaft door Air Liquide (Luik, België). Tabel 3.1 geeft een overzicht van de reagentia met hun leverancier, dichtheid en zuiverheid.
TABEL 3.1: OVERZICHT VAN DE GEBRUIKTE REAGENTIA MET ENKELE VAN HUN EIGENSCHAPPEN EN HUN LEVERANCIER. Reagens
Leverancier
Dichtheid (g/cm³) bij 25°C
Zuiverheid (%)
Methylmyristaat
Sigma-Aldrich
0,855
99
Hexadecaan
Sigma-Aldrich
0,773
99,8
Heptadecaan
Sigma-Aldrich
0,777
99
Cyclohexaan
Merck
0,781
99,5
De bereide oplossingen werden uitverdeeld en bewaard in kleine, doorzichtige, glazen flesjes met een volume-inhoud van 1,5 mL (Filter Service, Eupen, België) en van 4 mL (Alltech, Kentucky, Verenigde Staten).
3.2
STANDAARDEN EN STALEN De testmix, gebruikt in de systeemgeschiktheidstest, bevatte 1051 ng/µL C16 en 1063
ng/µL heptadecaan, opgelost in cyclohexaan.
Voor de bepaling van het dynamisch bereik werden 20 stalen, met een vaste concentratie C16 (1194 ng/µL) en variërende concentratie MM, volumetrisch aangemaakt. Dit gebeurde met behulp van gegeven stockoplossingen van MM en C16. De stalen hadden een concentratie aan MM gaande van 75 ng/µL tot 3000 ng/µL.
Alle stalen dienden een zelfde concentratie interne standaard te hebben; daarom werd er gewerkt met een grote stockoplossing van C16. Deze stockoplossing werd aangemaakt in een maatkolf van 250,0 mL door 122,7 g C16 op te lossen in cyclohexaan. Ook voor MM werd 7
een grote stockoplossing aangemaakt van 6424 µg/g. Dit gebeurde gravimetrisch via inwegen. Als oplosmiddel werd de interne standaardoplossing gebruikt.
Met behulp van de MM-stockoplossing en de interne standaardoplossing werden 2 nieuwe oplossingen van 3354 µg/g MM en 128,5 µg/g MM aangemaakt. Deze werden deels uitverdeeld als standaard 5 en standaard 1 en deels gebruikt voor de aanmaak van de andere standaarden. Standaarden 2, 3 en 4 werden aangemaakt uit standaarden 1 en 5 volgens een mengprotocol (Tabel 3.2). De standaarden werden gebruikt zowel voor de evaluatie van de lineariteit, als voor de opstelling van de dagelijkse kalibratiecurve.
TABEL 3.2: MENGPROTOCOL VOOR DE AANMAAK VAN DE STANDAARDEN. Standaard
Mengprotocol
1
Laag
2
Laag (3) + hoog (1)
3
Laag (2) + hoog (2)
4
Laag (1) + hoog (3)
5
Hoog
Voor de bepaling van de imprecisie werden 2 stalen gravimetrisch aangemaakt uit de MM-stockoplossing en de interne standaardoplossing: een laag IQCstaal waarvan de concentratie die van standaard 2 benaderde en een hoog IQCstaal die een concentratie dicht bij die van standaard 4 had.
Voor de validatie van de aantoonbaarheidsgrens was een staal nodig dat een signaal/ruis-verhouding (S/R) had van ongeveer 6. De aanmaak gebeurde gravimetrisch met behulp van standaard 1 en de interne standaardoplossing (standaard 1 had een S/R van ongeveer 15).
Voor de evaluatie van de juistheid werden 5 onbekende stalen ter beschikking gesteld door het labo Analytische Chemie.
8
TABEL 3.3: OVERZICHT VAN DE AANGEMAAKTE STALEN MET HUN MM-CONCENTRATIE. Prestatiekenmerk
Staal
Lineariteit en kalibratie
Standaard 1
128,5
Standaard 2
915,1
Standaard 3
1874
Standaard 4
2565
Standaard 5
3354
Laag IQC
909,7
Hoog IQC
2502
Aantoonbaarheidsgrens
LoD
51,70
Juistheid
5 onbekende stalen werden gegeven
Methodevergelijking
Gegevens uit een gesimuleerde dataset
Imprecisie
Concentratie MM (µg/g)
Alle stalen werden in de koelkast bij ~ 4°C bewaard.
3.3
APPARATUUR
3.3.1 Instrument De validatie werd uitgevoerd met een gaschromatograaf, model 2014 van Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan). Stalen werden direct door het septum in de liner geïntroduceerd; deze had een temperatuur van 250 °C. GLC scheiding gebeurde bij 152 °C gebruikmakend van een “fused silica” capillaire kolom (15 m x 0,535 mm interne diameter x 1,00 µm filmdikte) gecoat met DB-1 (Agilent Technologies, Santa Clara, Verenigde Staten). Deze apolaire stationaire fase bestaat uit 100% dimethylpolysiloxaan. De kolom werd gekoppeld aan een warmtegeleidbaarheidsdetector met een temperatuur van 270 °C. Stikstof werd gebruikt als dragersgas. Deze mobiele fase had een debiet van 15 mL/min. De GC Solutions® software van Shimadzu Corporation werd gebruikt om de gaschromatograaf te besturen en de gegevens te verwerken (registratie en uitzetting van de chromatogrammen, oppervlakte-integratie, berekening chromatografische parameters).
9
3.3.2 Randapparatuur Voor de gravimetrische aanmaak van de stalen werd een analytische balans van Mettler Toledo, type AT261 DeltaRange® (Greifensee, Zwitserland) gebruikt. Deze balans weegt tot op 10-5 g nauwkeurig. Calibra® micro- en macropipetten (Socorex, Ecublens, Zwitserland) werden gehanteerd bij de volumetrische aanmaak van de stalen voor de bepaling van het dynamisch interval. Voor de injecties gebruikten we een naald met een volume van 10 µL, model 701N (Hamilton, Nevada, USA).
3.4
METHODE
3.4.1 Systeemfunctietest Dagelijks werd, na opstarten en equilibreren van het systeem, een systeemfunctietest uitgevoerd. We controleerden of bepaalde systeemparameters binnen de vastgelegde limieten vielen. Tabel 3.4. geeft hiervan een overzicht.
TABEL 3.4: OVERZICHT VAN DE SYSTEEMPARAMETERS EN HUN SPECIFICATIES GECONTROLEERD MET DE SYSTEEMFUNCTIETEST. Systeemfunctietest Gasdruk
Gasdrukaanvoer
6 ± 0,2 bar
Injector
> 0,4 bar
Systeem controle
Limiet van 100 injecties
Detector
Ruis
Limiet 6 µV
Stabiliteit over 5 min
Limiet 10 µV
3.4.2 Systeemgeschiktheidstest Om verdere systeemprestaties te meten, injecteerden we dagelijks een testmix. We vergeleken enkele chromatografische parameters van de testmix met vooropgestelde aanvaardingscriteria. Alle formules die we hanteerden bij het berekenen van de parameters volgden het USP-model. Tabel 3.5 geeft een overzicht van enkele chromatografische parameters, met hun formule en vastgelegde limieten. Daarnaast werd er ook gekeken naar de retentietijd, de piekoppervlakte en de piekhoogte van MM en C16.
10
TABEL
3.5:
CHROMATOGRAFISCHE
PARAMATERS
GECONTROLEERD
BIJ
DE
SYSTEEMGESCHIKTHEIDSTEST. Chromatografische
USP-formule
Verklaring van de symbolen
parameter Capaciteitsfactor
Opgestelde limieten
k‟= t/t0 – 1
k‟: capaciteitsfactor
k‟ (C16) > 7
t: retentietijd (min)
k‟ (MM) > 11
t0: dode tijd (min) Theoretisch plaatgetal
N = 16 * (tR / W)²
N: theoretisch plaatgetal
N > 1000
tR: retentietijd (min) W: piekbreedte op de basislijn (min) Assymetriefactor
Tf = W0,05 / (2 * a0,05)
Tf: assymetriefactor
Tf < 1,5
W0,05: piekbreedte op 5% piekhoogte (min) a0,05: breedte van de eerste helft van de piek op 5% piekhoogte (min) Resolutie
R = 2 * (tR – tRp) (W + Wp)
R: resolutie
R > 3,7
tR: retentietijd (min) tRp: retentietijd van de vorige piek (min) W: piekbreedte op de basislijn (min) Wp: breedte van de vorige piek op de basislijn (min)
3.4.3 Analyse Onder de chromatografische voorwaarden, zoals reeds beschreven onder 3.3.1, bedroeg de analysetijd 5 min. Het C16 en MM elueerden na respectievelijk 2,3 en 3,7 minuten. Omwille van het moeilijk reproduceerbare injectievolume bij GLC, werd gewerkt met C16 als interne standaard, die voor deze variabele compenseert. We werkten dan ook met de verhouding tussen de piekoppervlakten van MM en C16. Aan de hand van de dagelijkse kalibratiecurve werd afgeleid met welke concentratie MM de verkregen oppervlakteratio overeenkwam. Figuur 3.1. geeft een voorbeeld van een bekomen chromatogram voor standaard 3.
11
Cyclohexaan
C16 MM
FIGUUR 3.1: CHROMATOGRAM VAN STANDAARD 3 DIE EEN MM-CONCENTRATIE VAN 1874 µg/g EN EEN C16 –CONCENTRATIE VAN 1585 µg/g HEEFT.
3.5
VALIDATIE-EXPERIMENTEN
3.5.1 Kalibratie 3.5.1.1.
Dynamisch bereik
De 20 stalen werden éénmaal volgens oplopende concentratie aan MM gemeten en éénmaal in aflopende volgorde. De gemiddelde oppervlakteverhoudingen tussen MM en C 16 werden uitgezet tegenover hun respectievelijke concentratie aan MM. We gebruikten de best passende curve om de punten te beschrijven. Het dynamisch bereik van de detector werd bepaald door de onderste en bovenste kwantificatielimiet. We kozen voor de onderste kwantificatielimiet (“Lower Limit of Quantification”) de concentratie MM die een S/R gaf van 10. De bovenste kwantificatielimiet (“Upper Limit of Quantification”) legden we zelf vast. We wilden dat standaard 3, gebruikt bij de dagelijkse kalibratie en de validatie van lineariteit, een concentratie had, die in het midden van het dynamisch interval lag. De verhouding van de oppervlakte MM t.o.v. de oppervlakte C16 moest, bij deze MMconcentratie, 1 benaderen. Indien dit niet zo was, moest de concentratie aan interne standaard aangepast worden. Deze concentratie C16 diende in alle stalen aanwezig te zijn. 3.5.1.2.
Lineariteit
De validatie van lineariteit gebeurde volgens het CLSI EP6-A protocol. Vijf gerelateerde stalen, waarvan de concentraties op gelijke afstand van elkaar lagen, werden 4 12
maal per dag gemeten, gedurende 3 dagen. We hebben alle stalen binnen 1 analyseserie gemeten, afwisselend volgens oplopende en aflopende concentratie.
Grafisch werd de lineariteit geëvalueerd met een spreidingsdiagram en een residu-plot. Een „U‟- of „omgekeerde U‟-vorm is een teken van niet-lineariteit. De residu-plot gaf ons ook een beeld van eventuele uitschieters, die dan met een Grubbs-test geverifieerd werden. Uitschieters verwijderden we uit de dataset. Het oude EP6 model maakt gebruikt van de “Lack of fit” test om de lineariteit te evalueren. Naargelang er homoscedasticiteit of heteroscedasticiteit was, gebruikten wij respectievelijk de “Ordinary Least Squares Regression” (OLR) of de “Weighted Least Squares Regression” (WLR). Als de F-test een probabiliteits-waarde (p-waarde) groter dan 0,05 geeft, kunnen we de nulhypothese voor lineariteit weerhouden. Dit oude model is echter gevoelig aan uitschieters, daarom voerden we ook een tweede orde polynomiale fit-test uit, die beter aanvaard is. Het nieuwe CLSI EP6-A model vergelijkt het lineair model met 2e of 3e graad modellen, aan de hand van een t-test die nagaat of de laatste coëfficiënt van de tweedegraadsvergelijking significant verschillend is van 0 (y = c + bx + ax²). Wanneer de ttest een p-waarde geeft, die kleiner is dan 0,05, kunnen we besluiten dat de gegevens geen lineair verloop kennen.
Indien er sprake was van niet-lineariteit, gingen we na of het verschil tussen nietlineair en lineair eventueel verwaarloosbaar was omwille van praktische redenen. Wij zetten hierbij de limiet op 10%, vanuit de redenering dat, indien deze niet overschreden werd, er toch zou gewerkt worden met een lineaire kalibratiecurve. Het procentueel verschil tussen de oppervlakteratio, voorspeld via een eerstegraadsvergelijking en de oppervlakteverhouding, voorspeld via een tweedegraadsvergelijking werd berekend voor alle standaarden.
3.5.1.3.
Kalibratiecurve
Afhankelijk van de resultaten voor lineariteit (zie 4.2.1.2), werden de punten op de kalibratiecurve het best beschreven door een eerste- of tweedegraadsvergelijking. Bij lineariteit werden 3 regressiemodellen beoordeeld; de OLR, de OLR geforceerd door 0 en de WLR. In het geval van niet-lineariteit werden volgende regressie-analyses geëvalueerd: één waarbij de trendlijn geforceerd werd door het punt (0,0), één waarbij (0,0) deel uitmaakte van 13
de waarnemingen en één met exclusie van het punt (0,0). De meetresultaten bekomen voor de validatie van de juistheid (5 stalen in duplicaat gemeten gedurende 5 dagen), werden volgens de regressiemodellen verwerkt. Het model dat aanleiding gaf tot de beste juistheid, werd toegepast voor alle experimenten. Daarnaast wilden we ook een lage CV.
3.5.2 Aantoonbaarheidsgrens De validatie van de aantoonbaarheidsgrens gebeurde volgens een algemeen protocol, waarbij een staal met zeer lage concentratie aan MM (LoDstaal), gedurende 20 dagen éénmaal per dag wordt gemeten. In elk bekomen chromatogram werd de S/R van de MM-piek bepaald. Hoe dit gebeurde, wordt aangegeven in Figuur 3.2. De ruis kan bepaald worden uit de standaarddeviatie (SD) van het blanco detectiesignaal (Ruis = 2SDblanco).
Signaal = 12,4 µV
Ruis = 1,6 µV
FIGUUR 3.2: CHROMATOGRAM VAN HET LODSTAAL MET BEREKENING VAN S/R.
Uit de kennis van de geïnjecteerde hoeveelheid LoDstaal, de concentratie MM in het LoDstaal en de bekomen S/R werd telkens de absolute hoeveelheid MM berekend, die een S/R van 3 zou geven (zie Vergelijking 3.1).
14
Absolute hoeveelheid MM (ng)
= V * ρ * 3 * Conc.
(3.1)
S/R Waarbij
V
= het geïnjecteerde volume LoDstaal, 0,5 µL
ρ
= de dichtheid van het LoDstaal, 0,781 g/mL
Conc. = de concentratie aan MM in het LoDstaal, 51,70 µg/g S/R
= de bekomen S/R voor de MM-piek
Deze absolute hoeveelheden werden met behulp van een puntendiagram visueel op uitschieters onderzocht. Potentiële uitschieters werden aan een Grubbs-test onderworpen. Uitschieters werden verwijderd uit de dataset, omdat ze het gemiddelde te sterk zouden beïnvloeden. We berekenden het gemiddelde en zijn éénzijdig BI en vergeleken de bovenste betrouwbaarheidslimiet van het gemiddelde met de specificatie van 15 ng. BBL = X + t(α;n-1) * SD / 𝑛 Waarin
BBL
= bovenste betrouwbaarheidslimiet (ng)
X
= gemiddelde (ng)
α
= significantie; 0,1 als Excelwaarde
n
= aantal metingen, 20
(3.2)
3.5.3 Imprecisie De validatie voor imprecisie gebeurde via het NCCLS EP-5 protocol. Twee verschillende stalen ( laag IQC en hoog IQC), werden elke dag in duplicaat gemeten, gedurende 20 dagen. Volgens het EP-5 protocol wordt een waarde als uitschieter beschouwd, wanneer die meer dan 4 maal de SD afwijkt van de gemiddelde waarde. Wij verwijderden echter alle waarden die door de Grubbs-test als uitschieter geïdentificeerd worden. Het puntendiagram van de daggemiddelden gaf ons inzicht in de spreiding van de resultaten tussen verschillende meetseries. Het puntendiagram van het verschil binnen de duplicaten toonde de spreiding binnen één meetserie. Voor een stabiel proces lag de doelwaarde voor de CVbinnen analyse op 2% en voor de totale CV op 5%. De gekregen MethVal file berekende de totale SD en de SDbinnen analyse. Samen met het gemiddelde kon hieruit de overeenkomstige CV worden berekend. Als deze de specificatie overschreed, dan kon de situatie alsnog worden aanvaard, indien de onderste limiet van het BI niet boven de specificatie viel. Dit werd gecontroleerd aan de hand van een 1-zijdige F-test voor 1 steekproef. 15
3.5.4 Juistheid Voor de evaluatie van de juistheid werden 5 onbekenden gedurende 5 dagen gemeten in duplicaat. We hebben de stalen gemeten in oplopende en aflopende volgorde. De spreiding van de data beoordeelden we met een puntendiagram van het verschil binnen de duplicaten. Een mogelijke uitschieter werd gecontroleerd met de Grubbs-test. Wanneer deze het vermoeden bevestigde, werd de uitschieter verwijderd uit de dataset. We werkten dan verder met de overblijvende waarde van die dag, in plaats van met het gemiddelde op die dag. De aangepaste dataset werd vervolgens verwerkt in een puntendiagram om de verdeling van de daggemiddelden te evalueren. Als de gemiddelde waarde voor een onbekende bij één bepaalde dag er uit schoot, dan werd dit daggemiddelde verwijderd uit de dataset. Na de eventuele aanpassing van de dataset mochten we in een verschildiagram geen uitschieters meer mogen opmerken. Voor de interpretatie van de gegevens keken we naar een procentueel verhoudingsdiagram, waarin de terugvinding van de doelwaarde werd uitgezet in % voor elke onbekende.
Terugvinding (%) = 100 * (gemeten waarde / doelwaarde) ± 95% BI
(3.3)
Voor de validatie van de juistheid mochten de limieten van [95%,105%] niet overschreden worden. De overschrijding van de limieten werd ook met een 1-zijdige t-test voor 1 steekproef onderzocht.
3.5.5 Methodevergelijking Bij een methodevergelijking worden de analyseresultaten van een routinemethode vergeleken met deze van een referentiemethode. Volgens het CLSI EP-9 protocol dienen voor een methodevergelijkingsstudie minstens 40 willekeurige stalen in duplicaat gemeten te worden gespreid over 5 dagen. In deze meesterproef werden de resultaten echter gesimuleerd met behulp van de excelfile „DataGeneration‟, ons ter beschikking gesteld door Dr. Stöckl. Dit gebeurde aan de hand van waarden, gevonden in een relevante publicatie. Brunk & Swanson (1981) vergeleken een colorimetrische methode voor de bepaling van vrije vetzuren in serum met een gaschromatografische (GC) methode. Het referentie-interval voor vrije vetzuren in serum van volwassenen bedraagt 0,199 – 0,801 mmol/L. Bij een gemiddelde concentratie van 0,500 mmol/L had de colorimetrische routinemethode een totale SD van 0,0534 mmol/L (Brunk & Swanson, 1981). 16
De gesimuleerde gegevens konden geïnterpreteerd worden met de Bland & Altman benadering. De berekeningen die hierbij gemaakt moesten worden zijn: het gemiddelde verschil tussen de 2 methodes en de ±1,96 CV van de individuele verschillen, beide met de limieten van hun 95% BI. In een verschildiagram werd het procentueel verschil tussen de meetresultaten van de routine- en de referentiemethode uitgezet in functie van de meetresultaten van de referentiemethode. Deze grafiek kan eventuele uitschieters insluiten. Voor de interpretatie werd enerzijds visueel gecontroleerd of het 95% BI van het gemiddelde niet overlapte met de specificatie van 5% voor de systematische fout. Anderzijds werd gekeken of de limieten van de 95% BI‟s van de ±1,96 CV van de individuele verschillen binnen de specificatie vielen van 15% voor de totale fout1.
Het nadeel van de Bland & Altman benadering was dat ze niet in staat is om concentratiegebonden fouten te detecteren, daarom werden de meetresultaten ook onderzocht via de lineaire regressie analyse. Hierbij werd gekeken naar de richtingscoëfficiënt en het intercept bij de verkregen regressievergelijking. Een richtingscoëfficiënt verschillend van één wijst op een proportionele systematische fout. Indien het intercept afwijkt van nul, bestaat er een constante systematische fout. Daarna werd gekeken of de eventuele afwijkingen binnen de vooropgestelde limieten lagen voor de systematische en de totale fout. Voor de laagste en de hoogste concentratie bij de referentiemethode werden de y-waarden door de routinemethode voorspeld aan de hand van de lineaire regressievergelijking. Vervolgens werd nagegaan of de voorspelde y-waarden met hun 95% BI binnen de specificatie voor de systematische fout lagen. Het 95% predictie-interval rond de voorspelde y-waarden werd ook berekend en moest binnen de limieten voor de totale fout vallen. Met deze benadering kon wel onderscheid gemaakt worden tussen de prestatie van de routinemethode bij hoge en lage concentraties.
1
De totale fout wordt uitvoerig besproken in het literatuuronderzoek (4.3.3). Daar verwijzen we naar dit begrip met de term “total error”.
17
3.5.6 Overzicht validatie-experimenten
TABEL 3.6: OVERZICHT VAN DE VALIDATIE-EXPERIMENTEN MET HUN PROTOCOL EN EXPERIMENTELE OPSTELLING. Validatie-experiment
Protocol
Experimenteel
Lineariteit
CLSI EP6-A
5 standaarden in quadruplicaat, gedurende 3 dagen
Aantoonbaarheidsgrens
Algemeen
LoDstaal in singlicaat, gedurende 20 dagen
Imprecisie
NCCLS EP-5
Lage IQC en hoge IQC in duplicaat, gedurende 20 dagen
Juistheid
Algemeen
5 onbekenden in duplicaat, gedurende 5 dagen
Methodevergelijking
CLSI EP-9
40 stalen in duplicaat, verspreid over 5 dagen
3.6
SPECIFICATIES In Tabel 3.7 wordt een overzicht gegeven van de specificaties, horend bij de
verschillende prestatiekenmerken, die in deze methodevalidatie werden onderzocht.
TABEL
3.7:
OVERZICHT
VAN
DE
SPECIFICATIES
VOOR
DE
VERSCHILLENDE
PRESTATIEKENMERKEN, ONDERZOCHT BIJ DEZE METHODEVALIDATIE. Prestatiekenmerk
Procentuele afwijking
Lineariteit
10% a
Aantoonbaarheidsgrens
-
Imprecisie
CVbinnen analyse: 2% b
15ng a
CVtotaal: 5% Juistheid Methodevergelijking
5% a SE: 5%
Absolute fout
-
b
a
-
TE: 15% a a: Limiet b: Doelwaarde voor een stabiel proces
18
3.7
DATAVERWERKING EN STATISTIEK Zoals reeds eerder vermeld werd de GC solutions® software van Shimadzu
Corporation gebruikt om de data te verwerken. Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corporation, Verenigde Staten) werd aangewend voor de opstelling van de kalibratiecurves en voor de berekening van de concentraties, overeenstemmend met bepaalde oppervlakteratio‟s. Voor de statistische analyse van de resultaten bij lineariteit werd CBstat software, versie 5.1 (K. Linnet, Charlottenlund, Denemarken) ons ter beschikking gesteld. Hiermee werd de polynomiale evaluatie en de “Lack of fit” test uitgevoerd. Dr. Stöckl, STT consulting, gaf ons een MethVal Excel file, geprogrammeerd in Microsoft Office Excel 2003. Deze file werd gehanteerd voor de statistische evaluatie van de meetresultaten. Ook de Grubbs-test, die we gebruikten om uitschieters te detecteren, was geprogrammeerd in Microsoft Office Excel 2003. 2 boeken, „Method validation with confidence‟ (Stöckl, 2007a) en „Laboratory Statistics & Graphics with EXCEL®‟ (Stöckl, 2007b), eveneens door Dr. Stöckl verleend, hielpen bij de statistische interpretatie van de data. Bij de validatie van de juistheid, werd nagegaan hoeveel metingen vereist waren, om een betrouwbaarheidsinterval te verkrijgen, dat binnen de limieten viel. Dit gebeurde met behulp van het programma G*Power, versie 3.1.2 ( Franz Paul, Universiteit Kiel, Duitsland).
19
3.8
LITERATUURONDERZOEK
3.8.1 Geraadpleegde bronnen Voor het verzamelen van informatie werd er voornamelijk beroep gedaan op elektronische informatiebronnen op het internet. Zoekacties met GoogleTM gebeurden om een eerste, algemene kennis te vergaren. Daarna werd er gezocht op wetenschappelijke databanken, zoals PubMed en Web of Science. Tabel 3.8 geeft een overzicht van de geraadpleegde informatiebronnen.
TABEL
3.8:
GERAADPLEEGDE
INFORMATIEBRONNEN
BIJ
HET
ZOEKEN
NAAR
LITERATUUR. Algemene zoekmachine
GoogleTM België
Wetenschappelijk zoeken
GoogleTM wetenschap beta
PubMed
Web of Science
Science Direct
Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische Informatie (BCFI)
Farmacotherapeutisch Kompas
U.S. Food and Drug Administration
3.8.2 Technieken en reduceermechanisme Om te beginnen werden er algemene trefwoorden opgegeven in de databanken. Wanneer zeer veel resultaten werden bekomen, werd de zoekactie verfijnd door een extra zoekterm of een domein op te geven. Indien beschikbaar werd er ook gevraagd om “reviews”. De resultaten werden gerangschikt in volgorde van relevantie en de eerste 50 werden grondig bekeken.
Vervolgens werden de gevonden artikels gebruikt om op andere trefwoorden te komen. Tevens werd de literatuurlijst van de artikels bekeken om andere relevante artikels op te sporen.
20
4.
RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1
METHODE
4.1.1 Systeemfunctietest Bij deze test wordt een stabiele gasdrukaanvoer aangetoond. De gasdruk in de injector overstijgt steeds de 0,4 bar. Wekelijks wordt het septum vervangen, opdat er nooit meer dan 200x zou worden geïnjecteerd met hetzelfde septum. Een aanvaardbare ruis en stabiele basislijn worden bekomen na 1 uur stabiliseren. Het systeem voldoet telkens aan de specificaties.
4.1.2 Systeemgeschiktheidstest Elke dag wordt een testmix geïnjecteerd om de geschiktheid van het totale analytische systeem voor de meting van een bepaald analiet te testen. De aldus verkregen chromatografische parameters liggen steeds binnen de vooropgestelde aanvaardingscriteria (zie Tabel 3.5). Tabel 4.1 toont de gemiddelde waarde van elke chromatografische parameter.
TABEL 4.1: CHROMATOGRAFISCHE PARAMETERS BIJ DE SYSTEEMGESCHIKTHEIDSTEST. Hexadecaan;
Heptadecaan;
Gemiddelde ± 1SD
Gemiddelde ± 1SD
2,434 ± 0,017
3,753 ± 0,021
3870 ± 420
4480 ± 520
Piekhoogte (µV)
360 ± 37
305 ± 46
Theoretisch plaatgetal
1230 ± 61
1543 ± 88
Assymetriefactor
1,17 ± 0,02
1,06 ± 0,02
Capaciteitsfactor
7,3 ± 0,4
11,9 ± 0,7
Retentietijd (min) Piekoppervlakte (µV*min)
Resolutie
4,0 ± 0,1
De robuustheid van het systeem wordt gereflecteerd in de retentietijd van de analieten. De detectorrespons en de kolomkwaliteit beïnvloeden de piekhoogte en de piekoppervlakte. Grote variatie in de piekoppervlakte kan wijzen op instabiliteit van de detectorrespons. In dit geval kan het ook te wijten zijn aan het variabel injectievolume. De kwaliteit van de kolom wordt verder weerspiegeld in het theoretisch plaatgetal, de assymetriefactor, de capaciteitsfactor en de resolutie. Gedurende de gehele meetperiode wordt de kwaliteit van het GLC systeem gewaarborgd. 21
4.2
VALIDATIE-EXPERIMENTEN
4.2.1 Kalibratie 4.2.1.1.
Dynamisch bereik
De gemiddelde oppervlakteverhoudingen van 20 stalen (n = 2) worden uitgezet in functie van hun respectievelijke concentratie MM in een spreidingsdiagram (zie Figuur 4.1.) Een tweede-graadspolynoom beschrijft de punten het best. Via de functie „voorspelling voorwaarts‟ in Excel, zien we dat de curve een horizontale asymptoot benadert bij hogere concentraties MM. Dit komt door verzadiging van de detector.
Opp. MM / opp. C16
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Concentratie MM (ng/µL)
FIGUUR 4.1: SPREIDINGSDIAGRAM OM HET DYNAMISCH INTERVAL TE BEPALEN.
Een MM-concentratie van 100 ng/µL geeft een S/R van 10, dit is onze onderste kwantificatielimiet. Onze bovenste kwantificatielimiet kiezen we ruim onder het verzadigingspunt van de detector. Wanneer we de bovenste kwantificatielimiet vastleggen op 2600 ng/µL, dan bekomen we een dynamisch bereik van 26. Een MM-concentratie van 1350 ng/µL ligt in het midden van het dynamisch interval en is de doelconcentratie voor standaard 3. Een staal met deze concentratie aan MM en een concentratie aan C16 van 1200 ng/µL, geeft een oppervlakteratio die 1 benadert.
4.2.1.2.
Lineariteit
Om de lineariteit van de methode te beoordelen, worden 5 standaarden in quadruplicaat gemeten gedurende 3 dagen. De residu-plot van de resultaten in Figuur 4.2 22
toont geen uitschieters. Toch verifiëren we dit met een Grubbs-test voor alle standaarden. De „omgekeerde U‟ -vorm van de residu-plot wijst op niet-lineariteit.
0,15
Residu (µg/g)
0,10 0,05 0,00 -0,05 -0,10 -0,15 0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Concentratie MM (µg/g)
FIGUUR 4.2: RESIDU-PLOT.
In het spreidingsdiagram in Figuur 4.3 zien we dat de afstand van de gemiddelde oppervlakteverhoudingen tot de lineaire trendlijn groot is in vergelijking met de afstanden tussen de oppervlakteverhoudingen binnen de groepen. Ook dit wijst op een niet-lineair verloop. 1,8 y = 0,0005x + 0,0982 R2 = 0,991
Opp. MM / opp. C16
1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0,0 0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Concentratie MM (µg/g)
FIGUUR 4.3: SPREIDINGSDIAGRAM. RATIO VAN DE OPPERVLAKTE VAN MM EN C16 IN FUNCTIE VAN DE CONCENTRATIE MM (µg/g).
23
Naast een grafische evaluatie, wordt de lineariteit ook statistisch onderzocht. De F-test bij “Lack of fit” en de t-test bij de polynomiale evaluatie leveren beide een p-waarde van 0,0000. Beide statistische testen bevestigen dus de niet-lineariteit.
Wanneer het verband niet-lineair is, kan onderzocht worden of de fout op de resultaten, berekend via een lineair verband, verwaarloosbaar is. Om praktische redenen zou dan toch met een lineair verband kunnen worden gewerkt. Het procentueel verschil tussen de voorspelde y-waarde bekomen via de 1ste graadsvergelijking en deze bekomen via de 2e graadsvergelijking, wordt hiervoor berekend (Tabel 4.2).
TABEL 4.2: GESCHATTE AFWIJKING VAN DE LINEARITEIT VAN ALLE STANDAARDEN. Standaard
Verschil (%)
1
-37
2
5,9
3
6,3
4
2,2
5
-3,8
In Tabel 4.2 zien we dat voor standaard 1 de afwijking van de lineariteit de limiet van 10% overschrijdt en dus niet te verwaarlozen is. Deze resultaten tonen dat een tweedegraadsvergelijking het best de concentratie/oppervlakteratio-relatie beschrijft.
4.2.1.3.
Bepalen kalibratiemodel
Uit de evaluatie van de lineariteit, besluiten we dat de kalibratiecurve het best beschreven wordt door een tweedegraadsvergelijking.
Om het geschikte regressiemodel te bepalen, worden de meetresultaten bekomen voor de evaluatie van de juistheid, gebruikt. De juistheid en de CV bepalen welk model toegepast zal worden. De CV‟s liggen voor de 3 regressiemethodes dicht bij elkaar. Het kalibratiemodel zonder (0,0) als kalibratiepunt geeft de beste terugvinding van de doelwaarde (zie Tabel 4.3) en wordt dan ook bij verdere berekeningen gebruikt. 24
TABEL
4.3:
TERUGVINDING
(%)
EN
CV
(%)
VAN
STANDAARD
1,
VOLGENS
3
KALIBRATIEMODELLEN. Regressiemodel
CV (%)
Terugvinding (%)
Met (0,0) als kalibratiepunt
5,5
94,1
Geforceerd door 0
6,3
93,0
Exclusie van (0,0)
5,3
96,3
4.2.2 Aantoonbaarheidsgrens Voor de validatie van de aantoonbaarheidsgrens wordt een LoDstaal in singlicaat gemeten gedurende 20 dagen. Het puntendiagram van de absolute hoeveelheden MM die een S/R van 3 zouden geven, geeft geen indicatie van een uitschieter (zie Figuur 4.4). De Grubbs-
Absolute hoeveelheid MM die een S/N van 3 geeft (ng)
test confirmeert dit.
20 18 16 14 12 10 8 LoDstaal
FIGUUR 4.4 : PUNTENDIAGRAM VAN DE ABSOLUTE HOEVEELHEDEN MM DIE EEN S/R VAN 3 ZOUDEN GEVEN (ng), BEPAALD MET BEHULP VAN EEN LODSTAAL.
Het gemiddelde van de absolute hoeveelheden is 12,60 ng. De bovenste limiet van het betrouwbaarheidsinterval bedraagt 13,90 ng. Deze ligt dus onder de specificatie van 15 ng. De methode slaagt dus voor de vooropgestelde specificatie van de aantoonbaarheidsgrens.
25
4.2.3 Imprecisie Een laag IQCstaal en een hoog IQCstaal worden elke dag in duplicaat gemeten, gedurende 20 dagen. Wanneer we kijken naar de puntendiagrammen van het hoge IQCstaal in Figuur 4.5 zien we dat de resultaten zowel binnen 1 meetserie (A) als tussen verschillende meetseries (B) gelijkmatig verdeeld zijn. De Grubbs-test bevestigt dat er geen uitschieters zijn. Voor het lage IQCstaal wordt op dag 14 één uitschieter gevonden. Deze wordt verwijderd en er wordt verder gewerkt met de overblijvende waarde van die dag.
Concentratie daggemiddelde (µg/g)
Verschil in concentratie binnen duplicaten (µg/g)
90 60 30 0
2600 2575 2550 2525
-30
2500
-60
2475
-90
2450
Hoog IQC
A
Hoog IQC
B
FIGUUR 4.5: HOOG IQCSTAAL (A) VERSCHIL IN CONCENTRATIE BINNEN DE DUPLICATEN VAN 1 DAG. (B) VERDELING VAN DE DAGGEMIDDELDEN.
Tabel 4.4 geeft de resultaten weer van de berekeningen volgens het EP5 protocol. Enkel de CVbinnen analyse van het laag IQCstaal overschrijdt de specificatie. Er dient opgemerkt te worden dat deze specificatie een doelwaarde voor een stabiel proces karakteriseert en niet een limiet. De imprecisie van het laag IQCstaal kan nog steeds aanvaard worden, wanneer de onderste limiet van het BI van de CVbinnen analyse niet boven de 2% ligt met 95% probabiliteit. Dit wordt gecontroleerd met de 1-zijdige F-test voor 1 steekproef. Wanneer we deze test uitvoeren op de varianties bij het hoge IQCstaal bekomen we zowel voor de precisie binnen analyse als de totale precisie een experimentele Chi² waarde die kleiner is dan de kritische Chi² waarde. Het hoge IQCstaal voldoet dus aan beide specificaties. Bij het lage IQCstaal is de Chi² waarde voor de precisie binnen 1 meetserie groter dan de kritische Chi² waarde, hier wordt dus niet aan de specificaties voor binnen 1 meetserie voldaan, maar wel aan de totale precisie specificaties (zie Tabel 4.5). 26
TABEL 4.4: GEMIDDELDE CONCENTRATIE,T SD EN CV VAN HET HOGE EN LAGE IQCSTAAL. Gemiddelde
SD (µg/g)
CV (%)
Specificatie (%)
SDbinnen analyse: 29,3
CVbinnen analyse: 1,2
CVbinnen analyse: 2
SDtotaal: 38,7
CVtotaal: 1,5
CVtotaal: 5
SDbinnen analyse: 24,1
CVbinnen analyse: 2,6
CVbinnen analyse: 2
SDtotaal: 26,5
CVtotaal: 2,9
CVtotaal: 5
concentratie (µg/g) Hoog IQCstaal
Laag IQCstaal
2502
914,1
TABEL 4.5: OVERZICHT VAN DE EXPERIMENTELE EN KRITISCHE CHI² WAARDEN VOOR IMPRECISIE. Experimentele Chi² waarde Hoog IQCstaal
Laag IQCstaal
Kritische Chi² waarde
Within-run precisie
6,9
31,4
Totale precisie
3,1
46,2
Within-run precisie
35,1
31,4
Totale precisie
12,7
52,2
4.2.4 Juistheid Om de juistheid van de methode te kunnen valideren, worden 5 stalen in duplicaat gemeten gedurende 5 dagen. In het puntendiagram van het verschil binnen de duplicaten zit er bij onbekende 1,2 en 5 een uitschieter (Figuur 4.6 A toont dit voor onbekende 5). De Grubbstest bevestigt dat dit alle drie uitschieters zijn. Na aanpassing van de dataset ziet de verdeling van de daggemiddelden er gelijkmatig uit (Figuur 4.6 B illustreert dit voor onbekende 5), behalve voor onbekende 3. Daarbij is het daggemiddelde op dag 4 een uitschieter. Deze waarde wordt verwijderd uit de dataset.
27
1890 Concentratie daggemiddelde (µg/g)
Verschil in concentratie binnen de duplicaten (µg/g)
75 60 45 30
1880
1870
15 1860 0 -15
1850
Onbekende 5
A
Onbekende 5
B
FIGUUR 4.6: ONBEKENDE 5 (A) UITZETTING VAN HET VERSCHIL IN CONCENTRATIE TUSSEN DE DUPLICATEN VAN 1 DAG, ∆ = UITSCHIETER (B) UITZETTING VAN DE DAGGEMIDDELDEN, NA VERVANGEN VAN DE UITSCHIETER IN DE DATASET DOOR DE RESTERENDE WAARDE OP DIE DAG.
Het verschildiagram in Figuur 4.7 toont dat, na correctie van de dataset, de gegevens voor alle onbekenden gelijkmatig verdeeld liggen rond het gemiddelde.
Verschil van de daggemiddelde concentraties t.o.v. gemiddelde concentratie (µg/g)
45,0 30,0 15,0 0,0 -15,0 -30,0 -45,0 0
500
1000
1500
2000
Gemiddelde concentratie MM (µg/g)
FIGUUR 4.7: VERSCHILDIAGRAM VAN ALLE ONBEKENDEN, NA UITSLUITEN VAN HET DAGGEMIDDELDE OP DAG 4 VOOR ONBEKENDE 3.
28
De concentraties van de onbekende stalen worden ons gegeven voor de berekening van de terugvinding van de doelwaarde (zie Tabel 4.6). Deze wordt voor elke onbekende uitgezet in een procentueel verhoudingsdiagram.
TABEL 4.6: CONCENTRATIE VAN DE ONBEKENDE STALEN. Staal
Concentratie MM (µg/g)
Onbekende 1
197,6
Onbekende 2
568,1
Onbekende 3
925,8
Onbekende 4
1282
Onbekende 5
1869
Het procentueel verhoudingsdiagram (Figuur 4.8) toont dat enkel voor onbekende 1 het BI overlapt met de 5% specificatie, meer bepaald de onderste limiet. Alle gemiddelde waarden liggen wel binnen de specificaties. Opvallend is dat het BI van onbekende 1 groter is dan de andere intervallen. Door meer metingen te verrichten, zou het BI verkleinen, waardoor wel aan de specificaties zou kunnen worden voldaan. Via power-berekeningen werd bepaald dat 133 metingen nodig zouden zijn om een BI te bekomen, dat binnen de specificaties valt. Dit is echter niet realistisch om uit te voeren.
Terugvinding van de doelwaarde (%)
110
105 onbekende 1
onbekende 2
onbekende 4
100 onbekende 5 onbekende 3
95
90 Onbekende
FIGUUR 4.8: % RATIO GRAFIEK: TERUGVINDING VAN DE DOELWAARDE VAN ELKE ONBEKENDE, UITGEZET IN %.
29
De 1-zijdige t-test voor 1 steekproef, die de overlap van het BI van onbekende 1 met de onderste limiet test, geeft een p-waarde van 0,2994. De 1-zijdige t-testen voor 1 steekproef voor alle andere onbekenden, geven een p-waarde kleiner dan 0,05 voor beide limieten. Onbekende 1 slaagt dus niet voor de terugvinding van de doelwaarde. Kalibratiefouten, overdracht of een fout bij het aanmaken kunnen aan de oorsprong hiervan liggen.
4.2.5 Methodevergelijking Voor de methodevergelijking worden de data gesimuleerd aan de hand van een artikel, waarin een colorimetrische methode wordt vergeleken met GC voor de bepaling van vrije vetzuren in serum. In het Bland & Altmandiagram (Figuur 4.9) zien we dat het gemiddelde verschil met zijn 95% BI volledig binnen de limiet van ±5% voor de systematische fout is gelegen. De grenzen van de 95% BI‟s van de ±1,96 CV van de individuele verschillen vallen volledig buiten de 15% specificatie van de totale fout. Via de Bland & Altman benadering besluiten we dus dat de routinemethode voldoet aan de specificaties voor de systematische fout, maar niet aan deze voor de totale fout. Gemiddelde verschil
Routine - Referentiemethode (%)
40 30
±1,96 CV van de individuele verschillen Grenzen van het 95% BI
20 10 0
Limiet voor de systematische fout Limiet voor de totale fout
-10 -20 -30 -40 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Referentiemethode (mmol/L)
FIGUUR
4.9:
BLAND
& ALTMANDIAGRAM
GASCHROMATOGRAFIE
(REFERENTIE)
MET
BIJ
DE METHODEVERGELIJKING VAN
EEN
COLORIMETRISCHE
METHODE
(ROUTINE) VOOR DE BEPALING VAN VRIJE VETZUREN IN SERUM.
30
Bij de lineaire regressie analyse bekomen we een regressievergelijking, waarbij het intercept en de richtingscoëfficiënt statistisch gezien niet significant verschillen van respectievelijk 0 en 1 (zie Tabel 4.7). Er is dus noch een constante, noch een proportionele systematische fout aanwezig op de meetresultaten, bekomen via de colorimetrische routinemethode. Dit sluit aan bij wat we concludeerden uit de Bland & Altman benadering.
TABEL 4.7: LINEAIRE REGRESSIEVERGELIJKING; X = REFERENTIEMETHODE EN Y = ROUTINEMETHODE. Lineaire regressievergelijking
y = 0,9798x + 0,0103
Intercept ± BI
0,0103 ± 0,0192
Helling ± BI
0,9798 ± 0,037
Tabel 4.8 toont ons dat we dit resultaat echter moeten nuanceren. Hierin worden de grenzen van het 95% BI en 95% predictie-interval van de voorspelde y-waarden, horend bij de laagste en hoogste concentratie bekomen met de referentiemethode, weergegeven.
TABEL
4.8:
RESULTATEN
VAN
DE
LINEAIRE
REGRESSIE-ANALYSE
BIJ
DE
METHODEVERGELIJKING. DE SPECIFICATIE VOOR DE SYSTEMATISCHE FOUT IS 5% EN VOOR DE TOTALE FOUT 15%. Minimale y-waarde
Maximale y-waarde
Gemiddelde systematische fout (%)
3,14
-0,73
-BI (%)
-7,37
-3,55
+BI (%)
13,66
2,08
Gemiddelde totale fout (%)
3,14
-0,73
-Predictie-interval (%)
-49,64
-13,97
+predictie-interval (%)
55,93
12,50
Bij hoge concentraties vrije vetzuren in serum worden de limieten voor de systematische en totale fout niet overschreden. Hiervoor is de routinemethode dus niet significant verschillend van de referentiemethode. Bij lage concentraties vrije vetzuren in serum wordt echter zowel de 5% limiet voor de systematische fout als de 15% limiet voor de totale fout overschreden. De routinemethode presteert dus slechter bij lage concentraties.
31
4.3
LITERATUURONDERZOEK
4.3.1 Betekenis van veresterde vetzuren in de farmaceutische context Het zoekproces in de elektronische databanken wordt weergegeven in Tabel 4.9. In Google en Science Direct worden vooral resultaten gevonden over niet veresterde vetzuren, daarom wordt de zoekactie verfijnd door “non-esterified” uit te sluiten als sleutelwoord. Web of Science levert de nuttigste informatie op. Ook het Farmacotherapeutisch Kompas is dienstig.
TABEL 4.9: ZOEKPROCES NAAR DE FARMACEUTISCHE CONTEXT. Informatiebron
Trefwoord als ‘onderwerp’
Verfijning
Aantal resultaten (op 27/04/2010)
GoogleTM
Veresterde vetzuren
-
20
wetenschap beta
“esterified fatty acids”
-
18.500
“esterified fatty acids”
–non-esterified
4.300
“esterified fatty acids”
–non-esterified
566
pharmaceutical
Pubmed
Web of Science
“fatty acid esters”
Pharmaceutical use
22.400
“fatty acid esters”
-
801
“fatty acid esters”
Review
44
“esterified fatty acids”
-
1.488
“esterified fatty acids”
Domein: “Pharmacology &
71
Pharmacy” “fatty acid esters”
-
1.954
“fatty acid esters”
Domein: “Pharmacology &
153
Pharmacy” “fatty acid esters”
Domein: “Pharmacology &
13
Pharmacy” Review
Science Direct
Olestra sucrose ester*
-
23
“esterified fatty acids”
NOT non-esterified
43
-
148
pharmaceutical FDA U.S.
“fatty acid esters”
32
4.3.1.1.
Ethylesters van omega-3-vetzuren in Omacor®
Omacor® is een omega-3-vetzuurpreparaat dat meervoudig onverzadigde omega-3vetzure ethylesters bevat. Deze ethylesters worden bereid met de vetzuren eicosapentaeenzuur en docosahexaeenzuur, die uit visolie gewonnen worden. Omacor® is aangewezen als ondersteunende behandeling bij secundaire preventie na een myocardinfarct, als toevoeging aan de standaardtherapie (deze bestaat gewoonlijk uit een antistollingsmiddel en een angiotensine conversie enzym-remmer, β-blokker of statine). Mogelijks hebben lage doseringen omega-3-vetzuren een positief effect op de endotheelfunctie en het verloop van atherosclerotische processen. Daarnaast leiden ze ook tot een vermindering van het aantal ventriculaire stoornissen en hebben ze dus een direct antiaritmisch effect. Het sarcolemma zou elektrisch stabieler worden door een afname van de activiteit van de aanwezige ionenkanalen. Dit zou het gevolg zijn van een toegenomen aanwezigheid van vooral docosahexaeenzuur in het sarcolemma van de hartspiercellen (Farmacotherapeutisch Kompas). Het is echter niet bewezen dat Omacor® een effect heeft op de mortaliteit (BCFI). Omacor® is ook geïndiceerd bij bepaalde vormen van hypertriglyceridemie; namelijk bij endogene hypertriglyceridemie als aanvulling op dieet, in het geval dat dieetmaatregelen alleen onvoldoende respons opleveren, bij type IV als monotherapie en bij type IIb/III in combinatie met statinen, wanneer de controle van triglyceriden niet voldoende is. Hogere doseringen
omega-3-vetzuren
zorgen
namelijk
voor
een
daling
van
de
triglyceridenconcentratie. De vetzuren binden aan de substraatplaats van leverenzymen, die verantwoordelijk zijn voor de triglyceridesynthese. Hierdoor vermindert de synthese van triglyceriden. Ook de hoeveelheid vrije vetzuren vermindert door een verhoging van de β– oxidatie van vetzuren in de peroxisomen, dit draagt eveneens bij tot de verlaging van de triglyceridenconcentratie (Farmacotherapeutisch Kompas).
4.3.1.2.
Sucrose vetzuuresters als vetvervanger
Zo goed als geen intacte sucrose vetzuuresters (“Sucrose Esters”, SEs) worden als zodanig geabsorbeerd (Noker et al., 1997). Di-, tri- en hogere esters worden enkel geabsorbeerd na hydrolyse tot sucrose en vetzuren. De omvang van de hydrolyse is afhankelijk van de mate van verestering van het SE. Naarmate de veresteringsgraad toeneemt, 33
van mono-ester tot octa-ester, worden de esters minder gemakkelijk gehydrolyseerd en daalt de mate waarin zij geabsorbeerd worden. Het is algemeen aanvaard dat de hogere SEs, de octa-esters en de hepta-esters, niet geabsorbeerd worden door mensen en onveranderd geëxcreteerd worden. De lagere esters worden gedeeltelijk gehydrolyseerd en worden in die mate geabsorbeerd als sucrose en individuele vetzuren (www.fda.gov/). Olestra® is een voedseladditief, dat bestaat uit een mengsel van hexa-, hepta- en octa-esters van sucrose en lange vetzuurketens. Het is een lipide-gebaseerde vetvervanger (Prince & Welschenbach, 1998).
4.3.1.3.
Sucrose vetzuuresters als penetratieverbeteraar
SEs kunnen ook toegepast worden als penetratieverbeteraars. Het zijn niet ionogene surfactantia. Ze bevatten sucrose als polaire hoofdgroep en vetzuren als apolaire groepen. Sucrose heeft 8 vrije hydroxielfuncties, die kunnen worden veresterd (zie Figuur 4.10). De hydrofiele lipofiele balans-waarde kan dus sterk variëren, naargelang de graad van verestering en het type vetzuur (Csóka et al.; 2007).
FIGUUR 4.10: STRUCTUURFORMULE VAN SUCROSE, DE 8 HYDROXIELFUNCTIES KUNNEN WORDEN VERESTERD.
De meeste hydrofiele geneesmiddelen kunnen zonder penetratieverbeteraar niet doordringen in de epidermis vanuit een transdermale formulatie, doordat ze een lage permeabiliteitscoëfficiënt hebben. Met een verbeteraar of cosolvent vertonen ze echter een zeer hoge permeatie. Hoewel ionische surfactantia sterkere penetratieverbeteraars zijn, worden de niet ionogene SEs toch bestudeerd, omdat ionische verbindingen de permeabiliteitsbarrière meer beschadigen. Zowel kationische als anionische surfactantia kunnen de barrière reeds bij relatief lage concentraties schaden. Omwille van hun brede range van hydrofiele lipofiele balans-waarden en omdat ze de barrière minder beschadigen dan ionische verbindingen, zijn SEs interessante mogelijkheden voor penetratieverbetering van hydrofiele geneesmiddelen (Csóka et al., 2007). 34
Csóka et al. (2007) onderzochten het gebruik van SEs in transdermale therapeutische systemen met metoprolol als actief ingrediënt. Dit is een hydrofiele β-blokker met een kort biologisch halfleven. De in vitro studies toonden aan dat alle soorten SEs de vrijgestelde hoeveelheid metoprolol verhogen. Naast de hydrofiele lipofiele balans-waarde beïnvloedde ook de lengte van de vetzuurketens de vrijstelling. SEs van kortere vetzuren deden de vrijstelling meer toenemen dan SEs van langere vetzuren. Er werd geconcludeerd dat verschillende soorten SEs veelbelovende middelen zijn in transdermale therapeutische systemen om de drugvrijstelling en de huidabsorptie te verhogen (Csóka et al., 2007).
4.3.1.4.
Triglycerine beheenzuuresters als smeermiddel
Sommige veresterde vetzuren kunnen ook als smeermiddel gebruikt worden, alhoewel hier doorgaans magnesiumstearaat (Mg-St) voor wordt gebruikt. Mg-St heeft echter enkele nadelen, zo leidt het tot een verlengde desintegratietijd van tabletten en een verminderde tablethardheid. Daarnaast beïnvloedt het de stabiliteit van enkele geneesmiddelen, waaronder acetylsalicylzuur. Aoshima et al. (2004) onderzochten glycerine vetzuuresters alternatieve smeermiddelen voor Mg-St konden zijn. Twee soorten van triglycerine beheenzuur, met verschillende graad van verestering, werden gebruikt. Deze vertoonden gelijkaardige smeereigenschappen als die van Mg-St. Bovendien konden met deze smeermiddelen tabletten bereid worden die superieur waren aan die met Mg-St, op vlak van hardheid, desintegratie en stabiliteit (Aoshima et al., 2004). Ook Uchimoto et al. (2010) concludeerden dat glycerine beheenzuuresters nuttig zijn als alternatieve smeermiddelen voor Mg-St (Uchimoto et al., 2010).
4.3.1.5.
Veresterde vetzuren als solvens in de steriliteitstest van oftalmologische zalven
De steriliteit van oftalmologische zalven wordt getest met de membraanfiltratiemethode. Isopropylmyristaat wordt hierbij gebruikt als solvens. Dit veresterd vetzuur vertoont echter zelf een antimicrobiële activiteit, vnl. tegen gram-negatieve bacteriën. Hierdoor kunnen vals-negatieve resultaten bekomen worden in de steriliteitstest (Cardoso et al., 2006).
Cardoso et al. (2006) onderzochten of andere veresterde vetzuren, zonder antimicrobiële activiteit, kunnen gebruikt worden als solvent in de steriliteitstest voor zalven. Hiervoor werd hun vermogen om oftalmologische zalfbasissen op te lossen en hun antimicrobiële activiteit tegen Pseudomonas aeruginosa geëvalueerd. De resultaten indiceren 35
dat isopropylpalmitaat een belovende vervanger zou kunnen zijn voor isopropylmyristaat als oplossingsmiddel voor oftalmologische zalven in de steriliteitstest met de membraanfiltratiemethode (Cardoso et al., 2006).
4.3.1.6.
Verestering met vetzuren voor solubilisatie
Hydrofiele moleculen kunnen lipofieler gemaakt worden door ze te veresteren met vetzuren. Dit wordt geïllustreerd in een onderzoek van Tikkanen en Adlercreutz (2000). Zij wilden genisteïne en daidzeïne incorporeren in “low density“ lipoproteïnen (LDL) om te onderzoeken of deze isoflavone fyto-oestrogenen de oxidatiegevoeligheid van LDL in vitro reduceren. De vrije vormen van genisteïne en daidzeïne, die relatief hydrofiel zijn, konden echter niet in significante hoeveelheden geïncorporeerd worden in LDL partikels; de lipofiele vetzuuresters van genisteïne en daidzeïne daarentegen wel. De ingesloten fyto-oestrogenen verhoogden ex vivo de oxidatieresistentie en antiproliferatieve werkzaamheid van de LDL (Tikkanen & Adlercreutz, 2000).
4.3.1.7.
Veresterde steroïden
Bijna elke familie van steroïdhormonen komt voor in veresterde vorm. Hochberg et al. (1991)
onderzochten
de
esters
van
oestrogenen
en
glucocorticoïden.
Hun
vetzuursamenstelling blijkt te verschillen. De corticoïd esters zijn grotendeels samengesteld uit één vetzuur, oleaat, terwijl de estradiol esters zeer heterogeen zijn. Uit de studie bleek dat oestrogenen een extreem lange levensduur hebben. Het vetzuur beschermt de oestrogenen namelijk tegen afbraak. Verestering blijkt tevens de enige vorm van metabolisatie te zijn, die de biologische effecten van estradiol niet deactiveert (Hochberg et al., 1991).
4.3.1.8.
Invloed van verestering met vetzuren op de metabolische excretie
You et al. (2003) bereidden esters van 4‟-demethyldeoxypodophyllotoxine (DDPT) met verschillende onverzadigde vetzuren. DDPT is een derivaat van podophyllotoxine, dat een sterke cytotoxische activiteit vertoont in vitro. De esters werden getest op hun antitumorale activiteit. In vivo hadden de esters van DPPT een grotere antitumor activiteit dan DPPT op zich. Dit zou te wijten kunnen zijn aan een vertraagde metabolische excretie of aan een mogelijke selectieve “targetting” van het tumorweefsel (You et al., 2003).
36
4.3.2 Analysemethoden voor veresterde vetzuren Tabel 4.10 geeft het zoekproces naar analysemethoden voor veresterde vetzuren weer. Gezien het grote aantal resultaten wordt er gezocht naar artikels, waarin “determination”, “analysis” of “analytical method” voorkomt in de titel. Om onszelf een beperking op te leggen in het zoekproces, worden enkel de 50 meest relevante artikels gecontroleerd.
TABEL 4.10: ZOEKPROCES NAAR ANALYSEMETHODEN. Informatiebron
Trefwoord als ‘onderwerp’
Verfijning
Aantal resultaten (op 29/04/2010)
GoogleTM
Determination “fatty acid”
Wetenschap beta
ester*
PubMed
Web of Science
-
125.000
Analysis “fatty acid” ester*
-
318.000
Analysis “fatty acid” esters
-
3001
Analysis “fatty acid” esters
review
83
Determination “fatty acid”
-
466
review
25
“fatty acid” AND
354
esters Determination “fatty acid” esters fatty acid ester
determination OR analysis OR method (in „titel‟) Fatty acid ester
“fatty acid” AND
8
determination OR analysis OR method (in „titel‟) Review “fatty acid” ester
Determination OR analysis
80
OR analytical method (in „titel) Subject areas: analytical chemistry OR spectroscopy
4.3.2.1.
Gaschromatografische analyse van vetzuurmethylesters
Bij de analyse van vetzuurmethylesters (“Fatty Acid Methyl Esters”, FAMEs) met GC is de staalintroductie in het systeem de meest kritische stap. Bij de klassieke split injectietechniek kan er discriminatie optreden tussen de hoog- en laagkokende componenten. Dit is een wezenlijk risico, aangezien de natuurlijk voorkomende vetzuren (met een 37
ketenlengte tussen 4 en 24 koolstofatomen) een breed bereik in kookpunt hebben. Daarom zou koude injectie verkozen moeten worden (Eder, 1995).
Capillaire kolommen bieden verschillende voordelen t.o.v. gepakte kolommen, waaronder het vermogen tot zeer hoge resolutie. “Fused-silica” capillaire kolommen geven een uitstekende scheiding van FAMEs in biologische stalen. Sterk polaire stationaire fasen zullen de beste scheiding geven, maar ze hebben een relatief lage thermische stabiliteit. Bij niet polaire kolommen kunnen enkele belangrijke onverzadigde FAMEs gedeeltelijk overlappen. Stationaire fasen met intermediaire polariteit combineren de voordelen van hoge resolutie met die van relatief hoge thermische stabiliteit. Ze zijn dan ook voor vele analyses het meest geschikt (Eder, 1995).
Met GC kunnen FAMEs gescheiden worden volgens zowel de graad als de positie van dubbele bindingen door polaire stationaire fasen te gebruiken (bv. cyanogesubstitueerde stationaire fasen). Met cyanogesubstitueerde polysiloxaan stationaire fasen kunnen FAMEs verder gescheiden worden volgens hun geometrische configuratie rond de dubbele bindingen (cis/trans) (Señoráns & Ibañez, 2002). Voor de kwantificatie van FAMEs is de vlamionisatiedetector (“Flame Ionisation Detector”, FID) het meest aangewezen. De detector is zeer gevoelig en biedt een goede lineariteit over een breed bereik aan concentraties (Eder, 1995). Een universele warmtegeleidsbaarheiddetector kan evengoed worden aangewend. Kwantitatieve bepalingen van vetzuuresters kunnen ook worden uitgevoerd met massaspectroscopie. De kosten van GC gekoppeld aan massaspectroscopie kunnen wel vrij hoog liggen (Vähäjoa et al., 2005).
De verhoogde temperaturen die gebruikt worden bij GC vormen een nadeel voor de scheiding van thermisch labiele componenten. Polyene FAMEs en vrije vetzuren zijn moeilijk te scheiden met GC omwille van hun hoge polariteit en lage vluchtigheid (Señoráns & Ibañez, 2002).
4.3.2.2.
Vloeistofchromatografische analyse
Met vloeistofchromatografie (“Liquid Chromatography”, LC) kunnen thermisch labiele esters wel geanalyseerd worden. De scheidingseffiëntie is echter relatief laag 38
(Señoráns & Ibañez, 2002). Bij LC kan de mobiele fase aangepast worden om zo de retentietijden en resolutie te beïnvloeden. Dit geeft LC meer flexibiliteit dan GC, waarbij het dragersgas inert is en enkel dient om de analieten te transporteren door de kolom tot de detector (Bravi et al., 2006). Met LC is de scheiding van relatief simpele mengsels van FAMEs mogelijk volgens de graad, positie en geometrische configuratie van de dubbele binding (Señoráns & Ibañez, 2002).
De slechte detectielimieten zijn het grootste minpunt van de LC-analyse, doordat de brekingsindexdetector, de UV detector en de fluorescentiedetector niet gevoelig zijn voor verzadigde vetzuren (Señoráns & Ibañez, 2002; Bravi et al., 2006). De detectie van ongederivatiseerde vetzuren met LC-UV is noch sensitief noch selectief, omdat deze componenten over het algemeen geen geschikte chromoforen bevatten. Het is mogelijk om UV-absorberende derivaten te bereiden uit de vetzuren, dit verlengt echter vaak de analysetijd en compliceert de methode (Bravi et al., 2006). De LC kan ook gekoppeld worden aan een “evaporative” lichtverstrooiingsdetector (“Evaporative Light Scattering Detector”, ELSD). Na evaporatie van de mobiele fase meet deze de hoeveelheid licht die verspreid wordt door opgeloste partikels of druppeltjes, die door een lichtbundel passeren. De verstrooiingsintensiteit is proportioneel aan de concentratie van de opgeloste partikels in de lichtbundel. De ELSDrespons is onafhankelijk van de optische kenmerken van het staal en er is geen derivatisatie voor nodig. Bovendien is de ELSD verenigbaar met multi-solvent gradiëntelutie, wat de resolutie en analysesnelheid kan verbeteren. De ELSD is geschikt voor de analyse van C12 tot C22 FAMEs (Bravi et al., 2006). 4.3.2.3.
Analyse met superkritische vloeistofchromatografie
Met superkritische vloeistofchromatografie (“Supercritical Fluid Chromatography”, SFC) kunnen hoog efficiënte scheidingen uitgevoerd worden bij een relatief lage temperatuur. De voornaamste problemen bij de analyse van vetzuren met SFC zijn gerelateerd aan de reproduceerbaarheid van de stationaire fase, die ontwikkeld is voor specifieke toepassingen. Meestal wordt een universeel detectiesysteem gebruikt zoals FID (Señoráns & Ibañez, 2002).
Hirata & Sogabe (2004) scheidden FAMEs door comprehensieve 2-dimensionele SFC met conventioneel gepakte kolommen en FID detectie. De eerste dimensie was een 39
silicagelkolom en de scheidingen erin waren voornamelijk gebaseerd op het aantal dubbele bindingen. Elke fractie van de eerste dimensie kolom werd sequentieel onderworpen aan scheiding op de tweede dimensie kolom. Dit was een ODS kolom waarbij de scheidingen voornamelijk gebaseerd waren op de ketenlengte. De combinatie van de kolommen was grotendeels orthogonaal voor de scheiding van FAMEs. De voordelen van deze aanpak zijn de goed geordende chromatogrammen en de verbeterde resolutie voor de scheiding van FAMEs. Ook 2-dimensionele GC en LC zijn mogelijk (Hirata & Sogabe, 2004).
4.3.2.4.
Analyse met argentatie dunne laag chromatografie
Mono-onverzadigde FAMEs kunnen gescheiden volgens hun ketenlengte worden door argentatie dunne laagchromatografie (“Thin Layer Chromatography”, TLC). Alle monoonverzadigde methylesters worden daarnaast ook gescheiden van de polyonverzadigde en verzadigde FAMEs. Silica TLC platen geïmpregneerd met zilvernitraat worden hiervoor gebruikt. De platen worden ontwikkeld met een tolueen-hexaan mengsel en de gescheiden FAMEs worden gevisualiseerd door verkoling, autoradiografie of onder UVlicht na besproeiing met dichloorfluoresceïne. Dit is een simpele en goedkope techniek (Wilson & Sargent, 2001).
4.3.2.5. Voor
Hydroxaminezuurmethode de
bepaling
van
lange
keten
vetzuuresters
in
serum
kan
de
hydroxaminezuurmethode toegepast worden. Deze simpele methode is gebaseerd op de vorming van hydroxaminezuren, wanneer hogere vetzuuresters met hydroxylamine reageren bij kamertemperatuur in alkalisch milieu in waterige alcohol. De hydroxaminezuren geven een rood/violette kleur met ferrichloride. De kleurdensiteit is proportioneel aan de concentratie van het ester (Stern & Shapiro, 1953).
4.3.2.6.
Infraroodspectroscopie
Infrarood spectroscopie kan gebruikt worden voor de kwantitatieve analyse van de totale concentraties aan vetzuuresters in industriële oliën. Het is een relatief simpele en goedkope methode, die gemakkelijk uitgevoerd wordt in routine analyses. De grootste oorzaken van fouten bij infraroodmetingen van vetzuuresters zijn: de chemische interferentie veroorzaakt door carbonzuren, achtergrondinstabiliteit en instrumentele factoren (Vähäoja et al., 2005). 40
4.3.2.7.
Overzicht
TABEL 4. 11: OVERZICHT VAN DE BESPROKEN ANALYSEMETHODEN VOOR VERESTERDE VETZUREN. Analysemethoden voor veresterde vetzuren Hydroxaminezuurmethode Infraroodspectroscopie Scheiding
Detectie / visualisatie
Gaschromatografie
Vlamionisatiedetector Warmtegeleidbaarheidsdetector Massaspectroscopie
Vloeistofchromatografie
UVspectroscopie na derivatisatie “Evaporatieve” lichtverstrooiingsdetector
Superkritische vloeistofchromatografie
Vlamionisatiedetector
Argentatie dunne laag chromatografie
Verkoling Autoradiografie Onder UV licht na besproeiing met dichloorfluoresceïne
4.3.3 Total error in methodevalidatie Dr. Stöckl heeft mij 2 artikels over total error ter beschikking gesteld. Andere artikels vind ik op Web of Science via trefwoorden zoals “Method validation” en “Total Error” als „onderwerp‟(zie Tabel 4.12). Ook de referenties bij sommige artikels worden opgezocht. Na een eerste kennismaking met het begrip total error, worden enkele aspecten nog verder besproken met Dr. Stöckl.
TABEL 4.12: OVERZICHT VAN DE INGEGEVEN TREFWOORDEN OP WEB OF SCIENCE, MET DE DAARBIJ GEVONDEN HITS, BIJ HET ZOEKEN NAAR ARTIKELS OVER TOTAL ERROR. Databank
Trefwoorden
Aantal resultaten (op 27/04/2010)
Web of Science
Total error AND method validation
581
“Total error” AND “method validation”
15
“Total analytical error”
25
“error” in „titel‟ en “Krouwer” als „auteur‟
12
41
4.3.3.1.
Omschrijving van de total error
De total error van een analytische meting is een maat voor de (on)nauwkeurigheid. Het verwijst naar de afstand tussen een meetresultaat en de ware waarde van dit resultaat (Rozet et al., 2007; Stöckl et al., 2009). De nauwkeurigheid is een combinatie van juistheid (bias) en precisie (SD). Terwijl de juistheid een resultaat is van de systematische fout, is de nauwkeurigheid het gevolg van het samenspel van systematische en random fouten (Hubert et al., 2007; Rozet et al., 2007).
Volgens Krouwer (2002) zijn er 4 mogelijke foutenbronnen die bijdragen tot de total error, namelijk: de imprecisie, de protocol-onafhankelijke bias, de protocol-specifieke bias en de random patiëntinterferenties. De protocol-specifieke bias verwijst naar een verzameling foutenbronnen, die grotendeels afhankelijk is van het gebruikte protocol. Lineaire drift is een voorbeeld van zo‟n foutenbron, aangezien het niet enkel afhangt van de instabiliteit in de assayrespons, maar ook van de staalvolgorde (bv.: de tijd tussen de analyse en de laatste kalibratie). Er is ook een random bias toekenbaar aan interferenties in patiëntstalen. De meeste assays, waaronder immuno-assays, lijden namelijk aan een zekere graad van nietspecificiteit. Elk patiëntstaal zal mogelijk een bias vertonen, die uniek is voor de matrix van het staal van die patïent. Deze matrix vertoont niet-specifieke reacties in de assay (Krouwer, 2002).
4.3.3.2.
Schattingen van de total error
De total error kan uitgedrukt worden volgens het “simple combination” model (Krouwer, 2002). Deze combineert de bias en de imprecisie (zie vergelijking 4.1) (Petersen et al., 2001; Krouwer, 2002; Stöckl et al., 2007). Petersen et al. (2001) verwijzen hier ook naartoe als „het lineaire model om random en systematische fouten samen te voegen‟. Dit model kan de total error onderschatten, doordat de random interferentiebias wordt genegeerd en de lineaire drift niet degelijk behandeld. Tevens is er geen mechanisme om uitschieters een rol te laten spelen in het “simple combination” model. Uitschieters worden verwijderd uit de analyse, hoewel ze nog steeds aanwezig zijn in het echte leven (Krouwer, 2002). Niet iedereen gaat akkoord met deze commentaar van Krouwer, sommige vinden dat de bias te wijten aan interferenties, niet thuishoort in een algemene total error-beschrijving (Dr. Stöckl, persoonlijke communicatie).
42
Total error = bias + k * imprecisie Waarin
bias
(4.1) = de gemiddelde bias bij een bepaalde concentratie, vaak geschat uit een methodevergelijkingsexperiment
k
= meestal 1,96 of 2,58
imprecisie
= de random fout in de methode
De random en systematische fouten kunnen ook samengebracht worden in een „kwadraatmodel‟ (Vergelijking 4.2) (Petersen et al., 2001).
TE = 𝑆𝐸² + 𝑅𝐸² Waarin
(4.2) TE
= de total error
SE
= de systematische fout
RE
= de random fout
Een andere manier om de total error te schatten is via het berekenen van een tolerantieinterval. Er zijn twee types tolerantie-intervallen die gebruikt kunnen worden. Enerzijds is er het tweezijdig “β-expectation” tolerantie-interval. Dit is het interval (L,U) waarvan verwacht wordt dat tenminste een proportie β van de toekomstige resultaten er binnen zullen liggen (Mee, 1984; Govaerts et al., 2008; Denooz et al., 2009). Het is dus eerder een predictieinterval (Dr. Stöckl, persoonlijke communicatie). Anderzijds is er het tweezijdig “β-content” tolerantie interval. Dit is een statistisch interval (L,U) zodat tenminste een proportie β van een populatie binnen het interval (L,U) zullen liggen met γ% zekerheid (Mee, 1984; Hoffman & Kringle, 2007; Govaerts et al., 2008). De total error kan berekend worden met het Enoval® programma (Denooz et al., 2009; https://www.arlenda.com).
4.3.3.3.
Toepassing en voordelen van de total error
Een statistische aanpak, gebaseerd op total error-metingen kan toegepast worden om een methode te valideren (Hoffman & Kringle, 2007; Denooz et al., 2009). De schatting van de total error wordt echter meestal niet behandeld in de validatierichtlijnen, behalve dan bij de laboratoriumgeneeskunde. Daar wordt de total error geschat door middel van toegewijde 43
methodevergelijkingsstudies, waarbij een routinemethode wordt vergeleken met een referentiemethode. De referentiemethode wordt geacht foutenvrij te zijn (Stöckl et al, 2009). EP21-A is een document van het CLSI voor het schatten van de total error in klinische laboratoriummethodes.
Tegenwoordig wordt het belang van de schatting van de total error ook erkend in andere toepassingsvelden buiten de laboratoriumgeneeskunde, maar is het nog niet geïntegreerd in de respectievelijke richtlijnen (Stöckl et al., 2009). De “Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques” (SFSTP) wil de methoden voor validatie van kwantitatieve analytische procedures harmoniseren. De SFSTP raadt het gebruik van tweezijdige β-expectation tolerantie-intervallen voor de total error van validatiestalen aan bij de aanvaarding/verwerping van een analytische methode tijdens de validatie (Hubert et al., 2007). Hoffman & Kringle (2007) gebruiken het tweezijdig β-content tolerantie-interval. Wanneer het tolerantie-interval volledig binnen de aanvaardingslimieten (A,B) valt, wordt de methode aanvaard (Hoffman & Kringle, 2007; Rozet et al., 2007). De huidige pre-analyse (“pre-study”) aanvaardingscriteria voor bioanalytische methoden vereisen dat het geobserveerde gemiddelde binnen ±15% van de nominale waarde ligt en dat de CV kleiner of gelijk is aan 15%. Dit is echter niet compatibel met de “in-study” aanvaardingscriteria. Deze vragen dat minstens 4 van elke 6 stalen binnen de 15% van hun respectievelijke nominale concentratie liggen (4-6-15 regel). Om consistent met de in study vereisten te zijn, zouden de pre-analyse aanvaardingscriteria moeten verzekeren dat tenminste 66,7% van de toekomstige analysewaarden binnen ±15% van hun ware waarde liggen. Implementatie van een tolerantie-interval met een proportie β gelijk aan 66,7% en aanvaardingslimieten van ±15% zou dus in overeenkomst zijn met de in study criteria (Hoffman & Kringle, 2007).
De total error-aanpak gebaseerd op het gebruik van tolerantie-intervallen controleert het risico van het verkeerdelijk aanvaarden van ongeschikte analytische methodes (gebruikersrisico, “consumer risk”). Huidige procedures die puntschattingen van de geobserveerde bias en precisie vergelijken hebben hier geen controle over (Hoffman & Kringle, 2007; Hubert et al., 2007; Rozet et al., 2007). Ander voordelen van de benadering van methodevalidatie met total error zijn dat het kan toegepast worden op elk type van 44
analytische techniek, in elke soort industrie en dat het onafhankelijk is van de matrix waarin het analiet is geanalyseerd (Rozet et al., 2007).
Een nauwkeurigheidsprofiel is een visueel beslissingshulpmiddel om de validiteit van een analytische methode te beoordelen. Nauwkeurigheidsprofielen zijn gebaseerd op de tweezijdige β-expectation tolerantie-intervallen voor de total error van validatiestandaarden (Hubert et al., 2007). Om een nauwkeurigheidsprofiel te verkrijgen wordt de relatieve fout uitgezet
t.o.v.
de
concentratielevels
van
de
validatiestandaarden.
De
bovenste
tolerantielimieten worden samen verbonden. Met de onderste tolerantielimieten gebeurt hetzelfde. Figuur 4.11 stelt schematisch een nauwkeurigheidsprofiel voor. De gestipte lijnen stellen de bovenste en onderste aanvaardingslimieten voor voor de relatieve fout (15% en 15% respectievelijk). De gestreepte lijnen zijn de bovenste en onderste limieten van het βexpectation tolerantie-interval. De relatieve bias wordt voorgesteld door een continue lijn (Rozet et al., 2007).
FIGUUR 4.11: SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN EEN NAUWKEURIGHEIDSPROFIEL.
45
5. CONCLUSIE Voor het experimenteel gedeelte van de onderzoeksstage werd een GLC methode beoordeeld op zijn geschiktheid om MM te bepalen. De methode kende een dynamisch bereik van 26, met 100 ng/µL als onderste kwantificatielimiet en 2600 ng/µL als bovenste kwantificatielimiet. De validatiegegevens toonden aan dat met de methode geen lineaire concentratie/oppervlakteratio-relatie werd bekomen. Een tweede graadsvergelijking werd daarom gebruikt om de kalibratiecurve te beschrijven. De 3 kalibratiemodellen (geforceerd door 0, (0,0) als kalibratiepunt en met exclusie van (0,0)) gaven een gelijkaardige CV. De regressie-analyse zonder (0,0) als kalibratiepunt gaf echter de beste benadering van de werkelijke concentraties, daarom werd dit model toegepast. De methode voldeed aan de specificatie van 15 ng als aantoonbaarheidsgrens. De CVbinnen analyse en de totale CV van het hoge IQCstaal karakteriseerden een stabiel proces. De imprecisie van het lage IQCstaal voldeed niet aan de specificatie van 2% voor de CVbinnen analyse, maar wel aan de doelwaarde van de totale CV. De GLC methode slaagde niet voor terugvinding met vooropgestelde limiet van 5%. Het betrouwbaarheidsinterval van onbekende 1 lag namelijk buiten de specificatie. Een totaal van 133 metingen zou nodig geweest zijn om een BI te krijgen dat volledig binnen de specificaties viel.
Een methodevergelijkingsstudie werd uitgevoerd met gesimuleerde data. Hierbij werd een colorimetrische methode vergeleken met GC voor de bepaling van vrije vetzuren in serum. Met de Bland & Altman benadering viel de systematische fout binnen de specificatie van 5%, maar werd niet voldaan aan de 15% specificatie voor de totale fout. Via de lineaire regressie-analyse vielen de systematische en totale fout binnen de limieten bij hoge serumconcentraties vrije vetzuren, maar niet bij lage concentraties.
Een eerste doel van het literatuuronderzoek was de farmaceutische betekenis van veresterde vetzuren te achterhalen. Een 8-tal situaties waarin veresterde vetzuren een belangrijke rol spelen, werden besproken. Een eerste toepassing vonden we in Omacor ®, hierin zitten ethylesters van omega-3-vetzuren vervat. Als tweede werd de lipide-gebaseerde vetvervanger Olestra® besproken. Deze bestaat uit een mengsel van hexa-, hepta- en octaesters van sucrose en lange vetzuurketens. Ten derde behandelden we de toepassing van SEs als penetratieverbeteraars van hydrofiele geneesmiddelen. Vervolgens stelden we vast dat triglycerine beheenzuuresters nuttig zijn als alternatieve smeermiddelen voor Mg-St. Een 46
andere toepassing vonden we bij isopropylmyristaat, dat wordt gebruikt als oplossingsmiddel voor oftalmologische zalven in de steriliteitstest. Isopropylpalmitaat zou hier echter een betere kandidaat voor kunnen zijn. Verder kan verestering met vetzuren hydrofiele geneesmiddelen lipofieler maken. Als voorlaatste werd het voorkomen van oestrogenen en glucocorticoïden in veresterde vorm aangestipt. Ten slotte bleken esters van DDPT een grotere antitumor activiteit te vertonen dan DDPT op zich. Dit zou mogelijks het gevolg zijn van een vertraagde metabolische excretie.
Het tweede doel van het literatuuronderzoek was te zoeken naar verschillende analysemethoden voor veresterde vetzuren. Eerst en vooral kunnen FAMEs geanalyseerd worden met GC. Dit op voorwaarde dat ze niet thermisch labiel zijn. Voor de kwantificatie is een FID dan het meeste aangewezen. Daarnaast kan ook LC hiervoor aangewend worden. Een koppeling aan een ELSD biedt de meeste voordelen. Een UV-detector is minder bruikbaar, omdat deze niet gevoelig is voor verzadigde vetzuren. De scheidingsefficiëntie bij LC is echter relatief laag. Daarentegen kunnen met SCF hoog efficiënte scheidingen worden uitgevoerd bij een relatief lage temperatuur. Ten vierde kan argentatie TLC aangewend worden om mono-onverzadigde FAMEs te scheiden volgens hun ketenlengte. Ten vijfde kan de hydroxaminezuurmethode toegepast worden voor de bepaling van lange keten vetzuuresters in serum. Tot slot kan infraroodspectroscopie gebruikt worden voor de kwantitatieve analyse van de totale concentraties aan vetzuuresters in industriële oliën.
Een derde doelstelling van het literatuuronderzoek was het begrip total error in methodevalidatie te verduidelijken. Via het “simple combination” model, het kwadraatmodel, β-content en β-expectation tolerantie-intervallen kunnen we de total error berekenen. Voorlopig wordt de schatting van de total error nog niet behandeld in validatierichtlijnen, behalve dan bij de laboratoriumgeneeskunde. Het belang ervan wordt ook wel al erkend in andere toepassingsvelden. Het gebruik van een tolerantie-interval (β-content of β-expectation) als aanvaardingscriterium bij methodevalidatie sluit beter aan bij de in-study criteria dan de huidige pre-study aanvaardingscriteria. Bovendien wordt het gebruikersrisico beter gecontroleerd.
Aan
de
hand
van
de
tolerantie-intervallen
kunnen
ook
nauwkeurigheidsprofielen opgebouwd worden.
47
6. LITERATUURLIJST Aoshima, H.; Miyagisnima, A.; Nozawa, Y.; Sadzuka, Y.; Sonobe, T. (2005). Glycerin fatty acid esters as a new lubricant of tablets. International Journal of Pharmaceutics, 293, 25-34. Araujo, P. (2009). Key aspects of analytical method validation and linearity evaluation. Journal of Chromatography B, 877, 2224-2234. Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische Informatie (BCFI). http://www.bcfi.be/GGR/MPG/MPG_AKF.cfm (13-04-2010). Bravi, E.; Perretti, G.; Montanari, L. (2006). Fatty acids by high-performance liquid chromatography and evaporative light-scattering detector. Journal of Chromatography A, 1134, 210-214. Cardoso, V. M.; Solano, A. G. R.; Prado, M. A. F.; Nunan, E. d. A. (2006). Investigation of fatty acid esters to replace isopropyl myristate in the sterility test for ophthalmic ointments. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 42, 630-634. Christophe, A. (2007). Huidige indeling van vetzuren is te algemeen. Nutrinews, 1, 3-8. Csóka, G.; Marton, S.; Zelko, R.; Otomo, N.; Antal, I. (2007). Application of sucrose fatty acid esters in transdermal therapeutic systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 65, 233-237. Denooz, R.; Douamba, Z.; Charlier, C. (2009). Fatal intoxications bij acenocoumarol, phenprocoumon and warfarin: Method validation in blood using the total error approach. Journal of Chromatography B, 877, 2344-2348. Eder, K. (1995). Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. Journal of Chromatography B, 671, 113-131. Farmacotherapeutisch Kompas. http://www.fk.cvz.nl/ (14-04-2010). Food and Drug Administration U.S. http://www.fda.gov/ (27-4-2010) http://www.accessdata.fda.gov/scripts/fcn/gras_notices/grn_129.pdf (27-04-2010) 48
Govaerts, B.; Dewé, W.; Maumy, M.; Boulanger, B. (2008). Pre-study analytical method validation: comparison of four alternative approaches based on quality level estimation and tolerance intervals. Quality and Reliability Engineering International, 24, 667-680. Hirata, Y.; Sogabe, I. (2004). Separation of fatty acid methyl esters by comprehensive twodimensional supercritical fluid chromatography with packed columns and programming of sampling duration. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378, 1999-2003. Hochberg, R. B.; Pahuja, S. L.; Zielinski, J. E.; Larner, J. M. (1991). Steroidal fatty acid esters. The journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 40(4-6), 577-585. Hoffman, D.; Kringle, R. (2007). A Total Error Approach for the Validation of Quantitative Analytical Methods. Pharmaceutical Research, 24, 1157-1164. Hubert, Ph.; Nguyen-Huu, J.-J.; Boulanger, B.; Chapuzet, E.; Chiap, P.; Cohen, N.; Compagnon, P.-A.; Dewé, W.; Feinberg, M.; Lallier, M.; Laurentie, M.; Mercier, N.; Muzard, G.; Nivet, C.; Valat, L.; Rozet, E. (2007). Harmonization of strategies for the validation of quantitative analytical procedures. A SFSTP proposal – part II. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 70-81. International Vocabulary of Metrology – Basic and general concepts and associated terms (VIM, 2008). http://www.bipm.org/utils/common/documents/jcgm/JCGM_200_2008.pdf (10-5-2010) ISO 9001, Quality Management Systems-Requirements, International Organization for Standards (ISO), Geneva, 2000. Krouwer, J. S. (2002). Setting Performance Goals and Evaluating Total Analytical Error for Diagnostic Assays. Clinical Chemistry, 48, 919-927. Mee, R. W. (1984). β-Expectation and β-Content Tolerance Limits for Balanced One-Way ANOVA Random Model. Technometrics, 26, 251-254. Noker, P. E.; Lin, T.-H.; Hill, D. L.; Shigeoka, T. (1997). Metabolism of 14C-Labelled Sucrose Esters of Stearic Acid in Rats. Food and Chemical Toxicology, 35, 589-595.
49
Petersen, P. H.; Stöckl, D.; Westgard, J. O.; Sandberg, S.; Linnet, K.; Thienpont, L. (2001). Models for Combining Random and Systematic Errors. Assumptions and Consequences for differen Models. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 39(7), 589-595. Prince, D. M.; Welschenbach, M. A. (1998). Olestra: A new food additive. Journal of the American Dietetic Association, 98, 565-569. Rozet, E.; Wascotte, V.; Lecouturier, N.; Préat, V.; Dewé, W.; Boulanger, B.; Hubert, Ph. (2007). Improvement of the decision efficiency of the accuracy profile by means of a desirability function for analytical methods validation. Application to a diacetyl-monoxime colorimetric assay used for the determination of urea in transdermal iontophoretic extracts. Analytica Chimica Acta, 591, 239-247. Señoráns, F. J.; Ibañez, E. (2002). Analysis of fatty acids in foods by supercritical fluid chromatography. Analytica Chimica Acta, 465, 131-144. Stern, I.; Shapiro, B. (1953). A rapid and simple method for the determination of esterified fatty acids and for total fatty acids in blood. Journal of Clinical Pathologie, 6, 158-160. Stöckl, D. (2007a). Method validation with confidence. STT Consulting, Horebeke, België. Stöckl, D. (2007b). Laboratory Statistics & Graphics with Excel®. STT Consulting, Horebeke, België. Stöckl, D.; D‟Hondt, H.; Thienpont, L. M. (2009). Method validation across the disciplines – Critical investigation of major validation criteria and associated experimental protocols. Journal of Chromatography B, 877, 2180-2190. Tikkanen, M. J.; Adlercreutz, H. (2000). Dietary Soy-Derived Isoflavone Phytoestrogens. Could they have e role in coronary heart disease prevention?. Biochemical Pharmacology, 60, 1-5. Uchimoto, T.; Iwao, Y.; Ikegami, Y.; Murata, T.; Sonobe, T.; Miyagishima, A.; Itai, S. (2010). Lubrication properties of potential alternative lubricants, glycerin fatty acid esters, to magnesium stearate. International Journal of Pharmaceutics, 38G, 91-98. United States Pharmacopeia 29 http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c1225.html (15-4-2010) 50
Vähäoja, P.; Närhi, J.; Kuokkanen, T.; Naatus, O.; Jalonen, J.; Lahdelma, S. (2005). An infrared spectroscopic method for quantitative analysis of fatty alcohols and fatty acid esters in machinery oils. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 383, 305-311. Wilson, R.; Sargent, J. R. (2001). Chain separation of monounsaturated fatty acid methyl esters by argentation thin-layer chromatography. Journal of Chromatography A, 905, 251257. You, Y.-J.; Kim, Y.; Nam, N.-H.; Ahn, B.-Z. (2003). Antitumor Activity of Unsaturated Fatty Acid Esters of 4‟-Demethyldeoxypodophyllotoxin. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13, 2629-2632. http://apps.isiknowledge.com/ (27 en 29-4-2010) http://goldbook.iupac.org (9-5-2010) http://stt-consulting.com/ (11-5-2010) http://www.amberlyst.com/fatty_acids.htm (14-4-2010) http://www.sciencedirect.com/ (27-4-2010) http://www.sigmaaldrich.com/ (2-5-2010) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ (27 en 29-4-2010) http://www.thegoodscentscompany.com/ (15-4-2010) https://www.arlenda.com (6-5-2010)
51
