UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar 2008-2009

OPSTELLEN VAN EEN URINAIR EXCRETIEPROFIEL VAN DEHYDROEPIANDROSTERON EN ZIJN PRECURSOREN EN METABOLIETEN NA ORALE EN INTRAMUSCULAIRE TOEDIENING

EXPERIMENTEEL ONDERZOEK Ellen DE PAUW 1ste Master Farmaceutische Zorg

Promotor Prof. Dr. Apr. C. Van Peteghem Commissarissen Dr. Apr. C. Van Poucke Dr. Apr. K. Boussery

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar 2008-2009

OPSTELLEN VAN EEN URINAIR EXCRETIEPROFIEL VAN DEHYDROEPIANDROSTERON EN ZIJN PRECURSOREN EN METABOLIETEN NA ORALE EN INTRAMUSCULAIRE TOEDIENING

EXPERIMENTEEL ONDERZOEK Ellen DE PAUW 1ste Master Farmaceutische Zorg

Promotor Prof. Dr. Apr. C. Van Peteghem Commissarissen Dr. Apr. C. Van Poucke Dr. Apr. K. Boussery

‘De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.’ 2 juni 2009,

De auteur,

Ellen De Pauw

De promotor,

Prof. Dr. Apr. C. Van Peteghem

DANKWOORD In de eerste plaats wil ik Prof. Dr. Apr. Van Peteghem danken voor de algemene leiding bij de masterproef. In het bijzonder zou ik graag Apr. Ilse Becue bedanken voor de goede begeleiding en het nalezen van mijn thesis. Verder wil ik alle mensen van het labo voor Bromatologie bedanken voor de aangename werksfeer en hun behulpzaamheid. Ten slotte bedank ik mijn ouders en vriend voor hun steun.

INHOUDSOPGAVE Dankwoord Inhoudsopgave Lijst met gebruikte afkortingen 1. INLEIDING……………………………………………………………………………………………………………………….1 1.1. DEHYDROEPIANDROSTERON………………………………………………………………………………….1 1.1.1. Situering…………………………………………………………………………………………………………1 1.1.2. Metabolisatiepathway …………………………………………………………………………………..1 1.1.3. Effecten op het lichaam……………………………………………………………………………….…4 1.1.4. DHEA als geneesmiddel………………………………………………………………………………….6 1.1.5. Misbruik in sport…………………………………………………………………………………………….6 1.1.6. Wetgeving toediening hormonen aan dieren………………………………………………….7 2. OBJECTIEVEN…………………………………………………………………………………………………………………..9 3. MATERIAAL EN METHODEN…………………………………………………………………………………………..10 3.1. MATERIAAL……………………………………………………………………………………………………………10 3.1.1. Standaarden…………………………………………………………………………………………………10 3.1.2. Werkoplossingen………………………………………………………………………………………….10 3.1.3. Mix-oplossingen……………………………………………………………………………………………11 3.1.4. Toestellen en hulpmiddelen…………………………………………………………………………12 3.1.4.1. Opzuivering via SPE………………………………………………………………………….12 3.1.4.2. HPLC en MS/MS……………………………………………………………………………….13 3.1.5. Solventen en poeders…………………………………………………………………………………..14 3.1.6. Oplossingen………………………………………………………………………………………………….15 3.2. METHODEN…………………………………………………………………………………………………………..16 3.2.1. Staalvoorbereiding……………………………………………………………………………………….16 3.2.1.1. Opzuiveren via vaste fase extractie………………………………………………….16 3.2.2. Vloeistofchromatografie (LC)……………………………………………………………………….19 3.2.2.1. Principe……………………………………………………………………………………………19 3.2.2.2. HPLC-condities…………………………………………………………………………………20 3.2.3. Massaspectrometrie……………………………………………………………………………………21 3.2.4. Procedure van DHEA-dierproef…….……………………………………………………………..26 3.2.4.1. Opzuivering via SPE…………………………………………………………………………26 3.2.4.1.1. Vrije fractie.………………………………………………………………………….28 3.2.4.1.2. Glucuronide fractie.………………………………………………………………29 3.2.4.1.3. Sulfaat fractie……………………………………………………………………….30 3.2.4.1.4. Voorbereiding LC-MS/MS……………………………………………………..31 3.2.5. Verwerking chromatogrammen…..………………………………………………………………32 3.2.6. Statistiek………………………………………………………………………………………………………33 4. RESULTATEN EN DISCUSSIE……………………………………………………………………………………………36 4.1. ALGEMEEN…………………………………………………………………………………………………………….36 4.1.1. Staalgegevens………………………………………………………………………………………………36 4.1.2. Schommelingen in concentraties………………………………………………………………….36 4.2. VERWERKING…………………………………………………………………………………………………………36 4.2.1. Sulfaat fractie………………………………………………………………………………………………38 4.2.1.1. Proefperiode 1………………………………………………………………………………….40 4.2.1.2. Proefperiode 2.…………………………………………………………………………………41

4.2.2. Vrije fractie…………………………………………………………………………………………………..42 4.2.3. Glucuronide fractie……………………………………………………………………………………….45 5. CONCLUSIES………………………………………………………………………………………………………….………46 6. LITERATUURLIJST…………………………………………………………………………………………………………..47 7. BIJLAGEN……………………………………………………………………………………………………………………….50

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN AED: Δ4-Androsteendion 5-Andro: Δ5-Androsteendiol C18: Octadecyl Conc.: Concentratie DHEA: Dehydroepiandrosteron DHEAS: Gesulfateerd dehydroepiandrosteron ESI: Elektrospray ionisatie eV: Elektronvolt FA: Mierenzuur FAVV: Federaal agentschap voor de veiligheid van de voedselketen FDA: Food and drug administration GABA: Gamma-aminoboterzuur HCl: Zoutzuur HPLC: High performance liquid chromatography 3β-HSD: 3Bèta-hydroxy-steroïddehydrogenase IGF-1: Insulin-like growth factor-1 IM: Intramusculair IOC: Internationaal olympisch comité LC: Vloeistofchromatografie LC-MS/MS: Vloeistofchromatografie - tandem massaspectrometrie

LiCl: Lithiumchloride MeOH: Methanol MF: Mobiele fase MQ: Milli-Q water MRM: Multiple reaction monitoring MT-D3 : 17Alfa-methyltestosteron-trideuterium m/z: Massa-over-ladingverhouding N2: Stikstof NT-D3 : 17Bèta-19-nortestosteron-trideuterium OH-Preg: Hydroxy-pregnenolon pH: Zuurtegraad ppb: Parts per billion Preg: Pregnenolon RF : Radiofrequentie RIVM: Rijksinstituut voor volksgezondheid en milieu RP-HPLC: Reversed phase-high performance liquid chromatography rpm: Rotations per minute SAX: Strong anion exchange SIM: Selected ion monotoring SPE: Solid phase extraction α-T: Alfa-testosteron

β-T: Bèta-testosteron WHO: Wereld gezondheids organisatie

1. INLEIDING 1.1. DEHYDROEPIANDROSTERON 1.1.1. Situering Dehydroepiandrosteron (DHEA) (figuur 1.1) is een natuurlijk steroïd prohormoon dat, uitgaande van cholesterol, geproduceerd wordt in de gonaden, de bijnieren, het vetweefsel, de huid en de hersenen (Lentjes, 2006). Chemisch wordt het geclassificeerd als een androgeen (Corrigan, 2002). De formule van DHEA is C19H28O2 (Merck Index). Het is de precursor van Δ4-androsteendion (AED) en Δ5-androsteendiol (5-andro), die verdere modificaties kunnen ondergaan tot de vorming van het androgeen testosteron en de oestrogenen oestron en oestradiol (Lentjes, 2006).

FIGUUR 1.1: CHEMISCHE STRUCTUUR DHEA (Beaulieu & Robel, 1998)

1.1.2. Metabolisatiepathway De eerste stap in de synthese van androgenen in de bijnier is de omzetting van cholesterol in pregnenolon onder invloed van het enzym CYP 11A1 (figuur 1.2). In de steroïdsynthese in de bijnier is dit de snelheidsbepalende stap, die wordt bepaald door het transport van cholesterol van het buiten- naar het binnenmembraan van het mitochondrion met behulp van het ‘steroidogenic acute regulatory protein’ (Lentjes, 2006).

De volgende stap in de androgeensynthese (figuur 1.3) gebeurt door middel van het microsomale enzym CYP 17 en vindt plaats in de twee binnenste zones van de bijnier, namelijk de zona reticularis en fasciculata. CYP 17 zorgt zowel voor de hydroxylering van C17, als voor de klieving van de 2C-zijketen aan C17 (17,20-lyaseactiviteit). Op deze manier wordt INLEIDING

1

vanuit pregnenolon, 17-hydroxypregnenolon en DHEA gevormd en analoog vanuit progesteron, 17-hydroxyprogesteron en Δ4-androsteendion (Lentjes, 2006).

FIGUUR 1.2: CHEMISCHE OMZETTING VAN CHOLESTEROL NAAR PREGNENOLON (Mathews, 2000)

Δ4 - Androsteendion, een belangrijk bijnierandrogeen, kan ook gevormd worden vanuit

DHEA

door

het

enzym

(3β-HSD-Δ4,5-

3β-hydroxysteroïddehydrogenase

isomerasecomplex). Vanuit Δ4 – androsteendion wordt vervolgens testosteron gevormd met behulp van het enzym 17β-hydroxysteroïddehydrogenase (17β-HSD). Testosteron kan ook gevormd

worden

vanuit

Δ5-androstenediol

door

het

enzym

3β-

hydroxysteroïddehydrogenase (3β-HSD-Δ4,5-isomerasecomplex) (Lentjes, 2006).

INLEIDING

2

FIGUUR 1.3: METABOLISATIEPATHWAY STEROIDEN groen: mineralocorticoïd, blauw: glucocorticoïd, rood: oestrogeen, geel: androgeen (Mathews, 2000)

INLEIDING

3

De grootste productie van zwakke androgenen zoals DHEA, DHEAS en Δ

4

–

androsteendion gebeurt echter niet in de bijnieren, maar door perifere conversie (testis, ovarium, hersenen,… ). De testis bestaat uit twee functionele eenheden, enerzijds een netwerk van tubuli voor synthese en transport van sperma en anderzijds de interstitiële Leydig-cellen voor de synthese van androgenen. Voor de synthese van testosteron wordt in de testis voornamelijk de Δ5 –route gevolgd, dit wil zeggen via 17-hydroxypregnenolon, DHEA en Δ5-androsteendiol (Lentjes, 2006).

Verschillende

C19-steroïden

zoals

DHEA,

androsteendion,

testosteron

en

dihydrotestosteron kunnen geproduceerd worden in het ovarium. In het merg van het ovarium zijn er drie celtypes te onderscheiden: bindweefsel-, contractiele en interstitiële cellen.

Uit

deze

laatste

ontwikkelen

zich

thecacellen,

welke

de

belangrijkste

androgeenproducerende cellen zijn (Lentjes, 2006).

DHEA en zijn precursoren en metabolieten kunnen in het lichaam voorkomen in de vrije, de sulfaat en de glucuronide vorm. Sulfatering is een belangrijke fase llconjugatiereactie voor verbindingen met een hydroxyl- of een aminogroep. Deze reactie wordt in het lichaam gekatalyseerd door enzymen, namelijk de sulfotransferasen. Hierdoor worden de moleculen meer polair en hydrofiel, wat resulteert in een vlottere excretie via de urine (Aldred & Waring, 1999).

De glucuronide fractie van DHEA en zijn precursoren en metabolieten wordt gevormd door een andere fase II-reactie, namelijk de glucuronidatie. Hierbij wordt een molecule, die over een hydroxyl-, carboxyl-, amino- of thiolgroep beschikt, verbonden aan een glucuronisch zuur door middel van een glycoside binding. Glucuronidatie wordt enzymatisch gekatalyseerd door de UDP-glucuronyltransferasen. De resulterende glucuronide is opnieuw meer wateroplosbaar dan de originele substantie (Aldred & Waring, 1999).

1.1.3. Effecten op het lichaam De effecten van DHEA zijn complex, en het is moeilijk vast te stellen of de acties toe te schrijven zijn aan DHEA zelf, zijn metabolieten, of een combinatie van beiden. Ze variëren naargelang het gaat om een man of een vrouw, en bij een vrouw, naargelang ze pre- of INLEIDING

4

postmenopauzaal is. Ook de concentratie zelf speelt een rol, en deze verandert met de leeftijd (Corrigan, 2002).

DHEA kwam in 1993 in de belangstelling toen Franse wetenschappers beweerden dat het een bron van eeuwige jeugd kon zijn. Omdat de DHEA-concentratie daalt met de leeftijd, dachten ze dat door de concentratie te laten stijgen, het verouderingsproces kon tegengehouden worden. Resultaten van klinische studies suggereerden dat zo’n rol mogelijk was. Er moet wel rekening mee gehouden worden dat de resultaten geëxtrapoleerd zijn uit dierenstudies, waarbij er maar een kleine overeenstemming is met mensen. Langere, beter gecontroleerde studies bij een groter aantal mensen zijn daarom nodig (Corrigan, 2002).

Kankers onder hormonale controle zoals borst-, ovarium- en prostaatkankers kunnen beïnvloed worden door DHEA. Bij pre-menopauzale vrouwen is een normale DHEA spiegel beschermend tegen borstkanker, maar een lage spiegel met een gereduceerde androgeenoestrogeen ratio doet het risico toenemen. Bij postmenopauzale vrouwen gedraagt DHEA zich als een oestrogeen, in staat om borstkankercellen te stimuleren (Corrigan, 2002).

DHEA(S) zou een beschermende rol spelen in het immuunsysteem. De weerstand daalt met de leeftijd, wat kan gerelateerd zijn aan gedaalde DHEA- en insulin-like growth factor-1(IGF-1) spiegels. Verschillende immuunziekten, zoals inflammatoire arthritis, systemische lupus erythematosus, multiple sclerose en AIDS zouden ook geassocieerd zijn met lage DHEA-spiegels (Corrigan, 2002).

De DHEA(S) concentratie is hoog in de hersenen, waar het kan gesynthetiseerd worden uit cholesterol. DHEA kan door de bloed-hersenbarrière en gedraagt zich als een inhibitor van de gamma-aminoboterzuur (GABA) receptor. Zoals de meeste steroïden kan DHEA psychologische effecten hebben. Verbetering van het geheugen en cognitieve functies worden vooropgesteld, maar de meeste resultaten zijn ontgoochelend. Ook de toediening van DHEA(S) bij Alzheimerpatiënten, bij wie lage concentraties waargenomen werden, is zonder resultaat (Corrigan, 2002).

Een studie bij ratten toont aan dat DHEA beschermend is tegen de accumulatie van INLEIDING

5

visceraal vet en de ontwikkeling van insulineresistentie. Bij mensen is er echter niet aangetoond dat DHEA enig effect heeft op totaal gewicht, vetmassa, vetverdeling, insulinegevoeligheid of lipiden status (Bahrke & Yesalis, 2004).

1.1.4. DHEA als geneesmiddel DHEA valt in België onder de wetgeving van de hormonen, met strikte eisen voor de apotheker (www.bcfi.be). Om toelating te verkrijgen voor commercialisatie, moet dus aan de regels worden voldaan. In België verkreeg tot nog toe geen enkel medicijn op basis van DHEA deze toelating. Toch mag DHEA door een arts voorgeschreven worden onder de vorm van een magistrale bereiding vertrekkend van DHEA als poeder begeleid door een analysecertificaat van een erkend laboratorium (http://www.vbs-gbs.org). 1.1.5. Misbruik in sport Misbruik van endogene steroïden is een van de grootste zorgen in de sportwereld. Dopingcontroles gaan de uitdaging aan om criteria te vinden die toelaten endogene steroïden te onderscheiden van hun synthetische analogen in de urine van atleten (Cawley et al., 2004).

DHEA is een zwak androgeen, dat door atleten oraal wordt ingenomen met als doel de spiegels van de meer actieve androgenen, zoals testosteron en dihydrotestosteron, te verhogen en op die manier spiermassa en kracht te vergroten (Cawley et al., 2004)

Het Internationaal Olympisch Comité (IOC) verbiedt DHEA-toediening aan atleten, maar de detectie van toegediend DHEA bij dopingcontroles verloopt moeilijk door het niet volledig begrijpen van het DHEA-metabolisme en door de inter-individuele variaties in urinaire steroïd-excretie. DHEA en DHEAS zijn de meest abundante circulerende steroïde hormonen, waarbij de serumspiegels bij mannen twintig keer hoger zijn dan enig ander adrenaal hormoon (Cawley et al., 2004).

In 1985 verbood de Food and Drug Administration (FDA) DHEA in Amerika, maar dat

INLEIDING

6

besluit werd in 1994

opgegeven, wanneer

over-the-counter verkoop als een

voedingssupplement werd toegelaten. Het resultaat was een wereldwijd gestegen gebruik van DHEA in sport, zeker bij bodybuilders. Maar dat enthousiasme nam af en DHEA wordt tegenwoordig vervangen door andere meer potente prohormonen (Corrigan, 2002).

De wetenschap twijfelt aan de spiergroeibevorderende eigenschappen van DHEA; verschillende onderzoeken tonen namelijk tegengestelde resultaten. In een onderzoek van zes maanden waarbij dagelijks 50 mg DHEA oraal bij ouderen (70+) werd toegediend, was er een afname van de vetmassa en een toename van de spiermassa merkbaar (Holloszy et al., 2000). Een andere studie bestudeerde het effect van 50 mg DHEA gecombineerd met 0,625 mg oestrogenen gedurende twaalf weken bij postmenopauzale vrouwen. Hoewel er een significante toename van DHEA, DHEAS, testosteron en AED was, werd er geen verschil waargenomen op gebied van spiermassa, spiersterkte of uithoudingsvermogen (Barnhart et al., 2005). Meer studies over het effect van DHEA op het spiermetabolisme zijn nodig.

1.1.6. Wetgeving toediening hormonen aan dieren De wet van 15 juli 1985 verbiedt het gebruik en toediening van producten met een hormonale of anti-hormonale werking met het oog op vetmesting van dieren in België. De wetgeving omtrent de toediening van hormonen wordt in Europa door twee richtlijnen bepaald (http://www.favv.be).

De eerste richtlijn, 96/22/EG, verbiedt het gebruik van welbepaalde stoffen met hormonale en thyreostatische werking en van β-agonisten bij landbouwhuisdieren. Ook de handel, slacht en verwerking van het vlees van behandelde dieren wordt door deze richtlijn verboden (http://eur-lex.europa.eu).

De tweede richtlijn, 96/23/EG, beschrijft enkele voorschriften voor de opsporing van en de controle op stoffen met hormonale en/of thyreostatische werking. Ook de controlemaatregelen

aangaande

contaminanten,

verboden

stoffen

en

toegelaten

diergeneesmiddelen worden in deze richtlijn verwoord. Stoffen met anabole werking, waaronder steroïden en β -agonisten, behoren tot de verboden stoffen. Daarnaast beschrijft deze richtlijn ook enkele procedures die moeten gevolgd worden bij overtredingen. Zo moet INLEIDING

7

bijvoorbeeld een dier dat positief getest is op een verboden stof gedood worden en het bedrijf verder onderzocht worden (http://eur-lex.europa.eu).

In België controleert het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen (FAVV) of aan deze richtlijnen voldaan wordt. Buiten de Europese Unie mogen zes kunstmatig geproduceerde hormonen worden gebruikt. Deze zijn oestradiol, progesteron, testosteron, zeranol, trenbolone en melengestrol acetaat (http://www.vwa.nl). Omdat er volgens nationale en internationale organisaties zoals de Amerikaanse FDA en de Wereld Gezondheids Organisatie (WHO) bij een normale dagelijkse consumptie van vlees, melk en eieren geen effecten zijn vastgesteld op de gezondheid, wordt het gebruik daar wel toegestaan. De Europese Unie is voorzichtiger en verbiedt deze hormonen uit schrik voor mogelijke gezondheidsrisico’s (http://www.favv.be).

INLEIDING

8

2. OBJECTIEVEN Dehydroepiandrosteron of DHEA is een prohormoon van testosteron dat door atleten, hoewel het verboden is, wordt ingenomen met als doel de spiegels van de meer actieve androgenen, zoals testosteron en dihydrotestosteron, te verhogen en op die manier de spiermassa en krachtprestaties te vergroten. Ook wordt het gebruikt als doping bij vee, om meer spierweefsel te bekomen. Het doel van dit onderzoek is het opstellen van een excretieprofiel van DHEA en zijn precursoren en metabolieten in kalverurine na orale en intramusculaire toediening van 1000 mg DHEA per dag. De concentraties van DHEA, α-T, β-T, AED, 5-andro, OH-preg en preg worden hiervoor geanalyseerd in de vrije, sulfaat en glucuronide fractie via een reeds opgestelde procedure. Deze procedure bestaat uit opzuivering van de urinestalen met behulp van vaste fase extractie, gevolgd door scheiding en detectie van de hormonen met LC-MS/MS. Voor deze studie werden door het Nederlands onderzoeksinstituut RIKILT dagelijks urinestalen van acht kalveren afgenomen. Van deze dieren werden er twee oraal en twee intramusculair behandeld met 1000 mg DHEA per dag gedurende zeven opeenvolgende dagen. Vier dieren werden niet behandeld en fungeerden als controle. Van alle kalveren werd er vooraf urine afgenomen als blanco. Er wordt verwacht dat DHEA zich zal omzetten naar zijn metabolieten volgens de gekende metabolisatiepathways. Hierbij is het interessant na te gaan of de DHEA-toediening de testosteronconcentratie van de kalveren werkelijk verhoogt.

OBJECTIEVEN

9

3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1. MATERIAAL 3.1.1. Standaarden - 17β-19-Nortestosteron-trideuterium (NT-D3), RIVM Bilthoven, Nederland - 17α-Methyltestosteron-trideuterium (MT-D3), RIVM Bilthoven, Nederland - Dehydroepiandrosteron (DHEA), Fluka 30770, Sigma-Aldrich, België - Δ4-Androsteendion (AED), Sigma A9630-16, Sigma-Aldrich, België - α-Testosteron (α-T), Sigma E5878, Sigma-Aldrich, België - β-Testosteron (β-T), Fluka T1500, Sigma-Aldrich, België - Pregnenolon (Preg), Sigma-Aldrich P9129, België - OH-Pregnenolon (OH-Preg), Steraloïds Q4710-000, België - Δ5-Androsteendiol (5-Andro), Steraloïds H534, België 3.1.2. Werkoplossingen - 0,1 mg/mL MTD3 of NTD3 : Er wordt 0,1 mg afgewogen van de standaard en opgelost in 1 mL methanol (MeOH). - 10 ng/µL MTD3 of NTD3 : Er wordt 100 µL van de 0,1 mg/mL oplossing in een proefbuis gebracht en gemengd met 900 µL MeOH. - 1ng/µL MTD3 of NTD3 : Er wordt 100 µL van de 10 ng/µL-oplossing in een proefbuis gebracht en gemengd met 900 µL MeOH. - 1 mg/mL α-T, β-T, AED, DHEA, 5-andro, preg of OH-preg: Er wordt telkens 5 mg afgewogen en opgelost in 5 mL MeOH.

MATERIAAL EN METHODEN

10

- 100 ng/µL α-T, β-T, AED, DHEA, 5-andro, preg of OH-preg: Er wordt 100 µL van de 1 mg/mL-oplossing in een proefbuis gebracht en gemengd met 900 µL MeOH. - 10 ng/µL α-T, β-T, AED, DHEA, 5-andro, preg of OH-preg: Er wordt 100 µL van de 100 ng/µL-oplossing in een proefbuis gebracht en gemengd met 900 µL MeOH. - 1 ng/µL α-T, β-T, AED, DHEA, 5-andro, preg of OH-preg: Er wordt 100 µL van de 10 ng/µL-oplossing in een proefbuis gebracht en gemengd met 900 µL MeOH. 3.1.3. Mix-oplossingen Er worden verschillende mix-oplossingen gemaakt, enerzijds om de urine te belasten om een ijklijn te bekomen, anderzijds om te injecteren ter controle voor elke nieuwe LC-MS/MSanalyse. -Mix 1 (α-T, β-T, AED, OH-preg en preg) om te belasten, 10 ng/µL, 5 mL: Van de α-T-, β-T-, AED-, OH-preg- en preg- stockoplossingen met concentratie 1 mg/mL wordt er telkens 50 µL gepipetteerd en in één proefbuis gebracht. Dit wordt drooggedampt onder N2 bij 40 °C en daarna heropgelost in 5000 µL MeOH. - Mix 2 (α-T, β-T, AED, OH-preg en preg) om te belasten, 1 ng/µL, 5 mL: Er wordt 500 µL van de 10 ng/µL –mix 1 in een proefbuis gebracht en hierbij wordt 4500 µL MeOH toegevoegd. - Mix 3 (α-T, β-T, AED, OH-preg, preg, 5-andro en DHEA) ter controle, 10 ng/µL, 5 mL: Van de α-T-, β-T-, AED-, OH-preg- en preg- stockoplossingen met concentratie 1000 ng/µL wordt er telkens 50 µL gepipetteerd en in één proefbuis gebracht. Dit wordt drooggedampt onder N2 bij 40 °C en daarna heropgelost in 5000 µL MeOH. - Mix 4 (α-T, β-T, AED, OH-preg, preg, 5-andro en DHEA) ter controle, 1 ng/µL, 5 mL:


11

Er wordt 500 µL van de 10 ng/µL -mix in een proefbuis gebracht en hierbij wordt 4500 µL MeOH toegevoegd. 3.1.4. Toestellen en hulpmiddelen 3.1.4.1.

Opzuivering via SPE

- brede grote proefbuizen - lange smalle proefbuizen 20 mL, Duran® - kleine proefbuizen 5 mL - gewone proefbuizen 10 mL, NOVOLAB nv - proefbuisdopjes - pipetpomp, Brand - steriele plastieken pipetten 10 mL, LP Italiana SPA - handschoenen, Kleenguard Kimberly-Clark Professional - proefbuisrekken - centrifuge voor lange smalle proefbuizen, IEC Centra® GP8 - centrifuge voor gewone proefbuizen, IEC Centra® MP4 - pH- strips, Merck pH 4,0-7,0 - pipetten, eppendorf Reference - pipettips, Axygen scientific T-200-C-L en TXL-10-L (Verenigde Staten) - gegradueerde pipet 5 mL - Milli-Q systeem, Millipore (Brussel, België) - Grace Davision Discovery Sciences ™ C18 kolom 500 mg/6 mL (België) - Grace Davision Discovery Sciences ™ aminokolom (België) 500 mg/3 mL


12

- Varian Bond Elut® LRC-SAX kolom, 500 mg (Nederland) - J.T. Baker® vacuümelutiebakje met bijhorende kraantjes en adaptors - spuit voor overdruk, BD Plastipak - warmwaterbad 40 °C, Grant Instruments JB2, VWR International (Zaventem, België) - N2 – toevoer (Air Liquide) - glazen pasteurpipetten - pasteurpipetpompje - oven van 60 °C, Heraeus Instruments - oven van 80 °C, Memmert - vortex, Labinco L46 (Nederland) - weegbalans: bovenweger - diepvriezer, Geeroms (Sint-Denijs-Westrem, België) - koelkast, Geeroms (Sint-Denijs-Westrem, België) - Schott Duran® flessen van 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1 L en 2 L + dop - etiketten - weegbalans, Sartorius - weegbalans, Mettler-Toledo S.A. - maatkolf van 100mL, 200 mL en 500 mL - maatcilinder van 100 mL, 1L en 2 L 3.1.4.2.

HPLC en MS/MS

- HPLC Waters 2695 Separations Module Alliance™ - Waters HPLC-kolom, C18, 5 µm, 2.1x150 mm MATERIAAL EN METHODEN

13

- pré-kolom - Micromass Quattro LC triple quadrupole massaspectrometer - Masslynx 4.0 software voor de data processing, Waters (Milford, Verenigde Staten) - Branson 2210 trilbad - printer, Kipp & zonen - LC-MS-vials, Waters (Zellik, België) - septa, Waters (Zellik, België) - inserts, Grace Alltech 0,1 mL Micro-Insert (Lokeren, België) - klein droogdampbadje voor vials 40 °C, Thermolyne Dri-Bath - LC-MS- caps, Waters (Zellik, België) - parafilm, Alcan Packaging (Menasha, Verenigde Staten) 3.1.5. Solventen en poeders - lithiumchloride (LiCl): Merck (Duitsland) - zoutzuur (HCl) 37%: Merck KGaA (Darmstadt, Duitsland) - natriumacetaat.3 H2O: Merck (Duitsland) Merck AB - methanol (MeOH), BDH HiPerSolvTM voor HPLC: VWR International (Zaventem, België) - MeOH M 51: Merck KGaA - azijnzuur: Merck, Merck KGaA, (Duitsland) - mierenzuur: Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Zwitserland) - diëthylamine: Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH (België) - Helix Pomatia: β-Glucuronidase/Arylsulfatase, Roche diagnostics Gmbh, (Mannheim, Duitsland)


14

- ethylacetaat: Acros Organics (Geel, België) 3.1.6. Oplossingen - 3 M acetaatbuffer pH 4,6 Voor het aanmaken van een 3 M acetaatbuffer worden er eerst twee oplossingen gemaakt. Voor de eerste oplossing wordt er 86,0 mL 100% azijnzuur in een maatkolf van 500,0 mL gebracht en aangelengd met Milli-Q water (MQ). Voor de tweede oplossing wordt 200,5 g natriumacetaat.3H2O opgelost in MQ en in een maatkolf aangelengd tot 500,0 mL met MQ. Hierna wordt er 110,0 mL van de eerste oplossing en 90,0 mL van de tweede oplossing overgebracht en gemengd in een Schott Duran® fles van 250 mL. - 0,2 M acetaatbuffer pH 4,6 20 mL 3 M acetaatbuffer pH 4,6 en 280 mL MQ worden overgebracht in een Schott Duran® fles van 500 mL. - 10 % MeOH in MQ 100,0 mL MeOH en 900,0 mL MQ worden overgebracht in een Schott Duran® fles van 1 L. - 0,5 M azijnzuur in MQ 57,25 mL azijnzuur wordt in een maatcilinder aangelengd tot 2 L met MQ en overgebracht in een Schott Duran® fles van 2 L. - 0,5 M mierenzuur in MeOH 18,86 mL mierenzuur wordt in een maatcilinder aangelengd tot 1 L met MeOH en overgebracht in een Schott Duran® fles van 1 L. - 0,5 M diethylamine in MQ 5,2 mL diethylamine wordt aangelengd met MQ in een maatkolf van 100 mL. - 1/10 Helix Pommatia 25 µL Helix Pommatia wordt in een proefbuis bij 250 µL MQ gebracht en de oplossing wordt omgezwenkt. MATERIAAL EN METHODEN

15

- methanolysis Er wordt 8,5 g LiCl opgelost in 60 mL MeOH. Vervolgens wordt er 16 mL 37 % HCl toegevoegd en dit mengsel wordt in een maatkolf van 200 mL gebracht en aangelengd met MeOH. - Mobiele fase MeOH/MQ (60/40) (MF) 60 mL MeOH en 40 mL MQ worden overgebracht in een Schott Duran® fles van 100 mL. - Oplossing A: H2O/MeOH 90/10 + 0,3 % mierenzuur (FA) 3 mL FA en 100 mL MeOH (BDH) worden in een maatcilinder aangelengd tot 1 L met MQ, dit wordt overgebracht in een Schott Duran® fles van 1 L. - Oplossing C: 100 % MeOH + 0,3 % FA 3 mL FA wordt in een maatcilinder aangelengd tot 1 L met MeOH en overgebracht in een Schott Duran® fles van 1 L. - Sealwash: H2O/MeOH 90/10 100 mL MeOH wordt aangevuld tot 1 L met MQ en dit wordt overgebracht in een Schott Duran® fles van 1 L. 3.2.

METHODEN

3.2.1. Staalvoorbereiding 3.2.1.1. Opzuiveren via vaste fase extractie Voor dit onderdeel wordt gerefereerd naar Lingeman, 2000.

Het doel van vaste fase extractie (SPE) is selectieve aanconcentratie van analyten en verwijderen van storende componenten. Aanrijking is nodig om de detectiegevoeligheid van kwalitatieve of kwantitatieve analyses te verbeteren. Verwijderen van interferende componenten beschermt de chromatografische kolom en levert meer betrouwbare resultaten.


16

Een SPE-cartridge bestaat uit één body, twee frits en een sorbens (figuur 3.1). De body is gemaakt van medisch zuiver polyethyleen of polypropyleen. Meestal zijn een tweetal frits aanwezig. Deze frits hebben poriën van 10 à 20 µm en zijn eveneens vervaardigd uit polyethyleen of polypropyleen. Het sorbens zit ertussen gepakt.

FIGUUR 3.1: OPBOUW SPE-CARTRIDGE (Lingeman, 2000) Onderaan de cartridge bevindt zich een universele luer tip zodat de aansluiting kan worden gemaakt met een vacuümelutiebakje (figuur 3.2).

FIGUUR 3.2: EEN VACUUMELUTIEBAKJE (Lingeman, 2000) Een SPE-procedure is tamelijk eenvoudig en bestaat in principe altijd uit zes stappen. Deze zijn activeren, conditioneren, opbrengen van het monster, wassen, drogen en elueren (figuur 3.3). Activering of wetting van de cartridge gebeurt met een organisch oplosmiddel, meestal is dit methanol. Deze stap heeft als doel de aanwezige lucht te verwijderen en vervolgens de koolstofketens te solvateren. Hierdoor wordt een groot oppervlak gevormd en kan een efficiënte extractie plaatsvinden. Hierbij is het belangrijk dat de cartridge niet droogkomt.


17

Conditionering of equilibrering van de cartridge met water is noodzakelijk omdat tijdens het activeren een oplosmiddel met hoge elutiesterkte (methanol) werd gebruikt. Bij het conditioneren wordt de overmaat organisch oplosmiddel verwijderd en de polariteit van de vloeistof in de poriën wordt zo dicht mogelijk bij deze van de matrix gebracht. Ook hierbij mag de cartridge niet droogkomen. Tijdens het opbrengen van het monster loopt het staal door de cartridge. Hierbij worden de analieten en/of interferende componenten vastgehouden en de overmaat vloeistof loopt door tot in het vacuümelutiebakje . Het wassen van het monster in de cartridge kan gebeuren met water of met een serie oplosmiddelen met toenemende elutiesterkte. Deze stap is belangrijk om verbindingen die de chromatografische analyse kunnen storen te verwijderen. De optimale wasstap verwijdert alle interferende componenten, waarbij de te analyseren stoffen op het sorbens blijven. Waterige buffers of water kunnen gebruikt worden om eiwitten of zouten te verwijderen.

FIGUUR 3.3: DE PROCEDURE VAN EEN VASTE FASE EXTRACTIE (Lingeman, 2000) Drogen van de cartridge is nodig om de resterende vloeistof in de poriën te verwijderen. Dit drogen kan gebeuren door gedurende 10 min. een sterk vacuüm te creëren. De elutie van de analieten gebeurt met een geschikt eluens. Om hydrofobe interacties te


18

verbreken, wordt een organisch oplosmiddel gebruikt. In geval van geladen verbindingen, kan elutie plaatsvinden door aanpassing van de pH. 3.2.2. Vloeistofchromatografie (LC) 3.2.2.1.

Principe

“High Performance Liquid Chromatography” (HPLC) is een dynamisch scheidingsproces dat gebruik maakt van twee niet-mengbare fasen. De mobiele fase wordt onder hoge druk over de stilstaande, stationaire fase gepompt. In dit systeem wordt het mengsel van stoffen gebracht. Wanneer de componenten in het monster zich verschillend over beide fasen verdelen, worden ze gescheiden (Macrae, 1982). In dit onderzoek gebeurt de scheiding van hormonen met behulp van “Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography” (RP-HPLC). De stationaire fase is een apolair adsorbens en bestaat hier uit chemisch gemodificeerde silica met een apolaire C18 alkylketen. De mobiele fase is polair en in dit geval wordt een mengel van water en methanol gebruikt (Simpson, 1982 en Skoog et al., 1992). Het gebruik van RP-fasen biedt een aantal voordelen, zoals onder andere een snelle evenwichtsinstelling, een uitstekende stabiliteit, een goede reproduceerbaarheid, een goede pieksymmetrie en een groot toepassingsgebied (Lingeman et al., 2000). Voor de visualisatie van het scheidingsproces is een detector nodig. In dit onderzoek wordt een massaspectrometer gebruikt. De detector meet een fysische eigenschap van de eluerende componenten en zet dit om in elektrisch signaal. De mobiele fase bezit deze eigenschap niet of slechts in geringe mate (Lingeman et al., 2000). Een chromatogram is de registratie van het signaal in functie van de tijd en kan gebruikt worden voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses. Via de retentietijden kunnen de verbindingen geïdentificeerd worden en met behulp van de piekoppervlaktes kan de concentratie van elke component berekend worden. De retentietijd is de tijd die een component, na injectie van het monster op de kolom, nodig heeft om te elueren en dus de detector te bereiken (Skoog et al., 1992).


19

De elutie kan op 2 manieren gebeuren, namelijk isocratisch of gradueel. Isocratisch betekent dat de samenstelling van de mobiele fase gedurende de hele scheiding constant blijft. In dit onderzoek wordt echter gradiëntelutie aangewend. Hierbij verandert de samenstelling van de mobiele fase gradueel gedurende de scheiding. Er wordt overgegaan van een zwakker naar een sterker eluens (Newton, 1982). Zowel aan de standaard als aan het staal wordt er een interne standaard toegevoegd, deze doorloopt de hele procedure en compenseert voor fouten. Deze fouten kunnen zowel bij de staalvoorbereiding als bij de eigenlijke chromatografie ontstaan, bijvoorbeeld een wisselend extractierendement, injectiefouten,… . Een interne standaard moet aan een aantal voorwaarden voldoen. Allereerst moet er chemische gelijkenis zijn met de te onderzoeken component(en). De elutie moet gebeuren op een vrije plaats in het chromatogram en de concentratie moet overeenstemmen. Tevens moet de interne standaard stabiel en heel zuiver zijn. Tot slot mag de verbinding niet aanwezig zijn in het staal (Krstulovic and Brown, 1982). 3.2.2.2.

HPLC-condities

In dit onderzoek wordt er gebruik gemaakt van twee verschillende types mobiele fasen, namelijk oplossing A en C. Oplossing A bestaat uit 90 % water, 10 % MeOH en 0,3 % FA. Oplossing C bestaat uit 100 % MeOH en 0,3 % FA. De flow bedraagt 0,3 mL/min.

FIGUUR 3.4: VOORSTELLING VAN DE HPLC-GRADIENT


20

De gradiëntelutie (figuur 3.4) begint bij A/C 45/55, bij deze verhouding worden de hormonen gefixeerd op de kolom. Daarna wordt de concentratie aan MeOH langzaam opgedreven, waardoor de hormonen worden gescheiden en beginnen te elueren. Vervolgens wordt de kolom gespoeld met 100 % MeOH, zodat alle componenten en de matrix van de kolom verwijderd worden. Ten slotte wordt de A/C-verhouding teruggebracht tot 45/55 en gedurende 5 min. behouden om de kolom te conditioneren voor de volgende run. 3.2.3. Massaspectrometrie Het principe van massaspectrometrie/massaspectroscopie is gebaseerd op de vorming van ionen tijdens een ionisatieproces. Afhankelijk van de soort ionisatie ontstaan er positieve of negatieve ionen. Ionen verschillen van elkaar in massa-over-ladingverhouding (m/z) en dit verschil wordt door de massaspectrometer gebruikt om ze van elkaar te kunnen scheiden. De typische fragmentatiepatronen leveren structurele informatie op en kunnen gebruikt worden voor structuurbevestiging of structuuropheldering (Monbaliu et al., 2007). In dit onderzoek wordt gewerkt met LC-MS/MS of vloeistofchromatografie - tandem massaspectrometrie. Deze techniek bestaat uit verschillende processen. Eerst worden de moleculen gescheiden in de HPLC om vervolgens in de massaspectrometer geïoniseerd te worden. Er wordt gebruik gemaakt van elektrospray ionisatie (ESI), dit is een ionisatieproces voor niet-vluchtige moleculen. De ionisatie gaat door bij atmosferische druk. Het solvent vloeit door een capillair waarop aan de tip een elektrisch veld aangelegd is. Die spanning, samen met een vernevelingsgas (stikstof), zorgt ervoor dat er een spray van geladen druppels ontstaat. Bij een positieve spanning ontstaan postitief geladen druppels, door protonering van de moedermolecule (Kebarle and Ho, 1997 en Hoffman and Stroobant,2001). Vervolgens wordt met behulp van een drooggas (warme stikstof) het solvent verdampt, waardoor de druppels kleiner worden en de ladingsconcentratie aan hun oppervlak

stijgt.

Door

de

stijgende

Coulombse

repulsiekrachten

wordt

de

oppervlaktespanning overwonnen, wat resulteert in het uiteenvallen van de druppels in MATERIAAL EN METHODEN

21

kleinere druppels. Hierdoor worden de druppels kleiner en verhoogt de ladingsconcentratie aan hun oppervlak, zodat stijgende Coulombse repulsiekrachten ontstaan die de oppervlaktespanning overwinnen en de druppels doen uiteenvallen in kleinere druppels. Door verdere verdamping van het solvent ontstaan heel kleine hoog geladen druppels die ionen in de gasfase vrijgeven. Dit hele proces wordt ionenevaporatie genoemd. ESI (figuur 3.5) is een zachte ionisatietechniek, dit wil zeggen dat er geen verdere fragmentatie van de moleculaire ionen optreedt (Kebarle and Ho, 1997 en Hoffman and Stroobant,2001).

FIGUUR 3.5: SCHEMATISCHE WEERGAVE VAN ESI (http://www.waters.com ) De ionen moeten overgaan van atmosferische druk naar het vacuümmilieu van de massafilter. Om die omschakeling te maken, wordt de Z-baan gebruikt, die uit een “sampling cone” en een “extraction cone” bestaat. Met behulp van een “cone voltage” extraheren deze “cones” de ionen uit de spray. Via de radiofrequentie (RF) -lens (een hexapool) komen de ionen in de analysator terecht. De RF-lens heeft enkel een radiofrequentiespanning, dit betekent dat het ionen van alle massa’s doorlaat. Hier gebeurt dus nog geen massafiltratie; de lens dient enkel ter focussering van de ionen, zodat die in de eerste quadrupool terechtkomen (Quattro LC Operating course, 1998). In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van de “triple quadrupole” en de “multiple reaction monitoring” methode (MRM) (Delmulle et al, 2006). Een quadrupool (figuur 3.6) bestaat uit 4 parallelle, metalen staven, waarbij de overstaande staven met elkaar MATERIAAL EN METHODEN

22

verbonden zijn via een positieve of negatieve gelijkspanning. Daar bovenop wordt een wisselspanning geplaatst, waardoor de potentiaal van teken verandert. Op die manier zal een positief ion, dat aangetrokken wordt door een negatieve staaf, terug naar het centrum worden gestuurd. Dit resulteert in een oscillerende beweging. De aangelegde voltages bepalen welke m/z-waarde door de massafilter kan passeren. De ionen met de juiste m/zwaarde zullen vlot de quadrupool kunnen doorlopen, de andere botsen tegen de staven (Hoffmann and Stroobant, 2001 en Sundström, 2007).

FIGUUR 3.6: SCHEMATISCHE WEERGAVE VAN EEN QUADRUPOOL (http://www.ivv.fraunhofer.de) In de eerste quadrupool (massafilter) wordt het precursorion geselecteerd, daarna komt het in de “collision cell” (een hexapool) terecht, waar het gefragmenteerd wordt tot verschillende productionen. De fragmentatie verloopt in twee stappen. Eerst botst het precursorion met argongas, waardoor de interne energie van het ion stijgt en het in geëxciteerde toestand terechtkomt. In de tweede stap dissocieert het geactiveerde ion. Doordat een voltage wordt aangelegd, krijgen de ionen de energie om te botsen. Deze energie wordt de “collision energie” genoemd. Vervolgens komen de product- of fragmentionen in een tweede quadrupool terecht, waar ze gefilterd worden. Hier gebeurt dus de selectie van de productionen (Hoffmann and Stroobant, 2001). Ten slotte worden de geselecteerde fragmentionen via de fotomultiplier gedetecteerd. De ionen worden eerst geconverteerd in elektronen met behulp van een conversie dynode. Deze elektronen komen vervolgens op een fosforscherm, dat daardoor geëxciteerd wordt en


23

fotonen uitzendt. De fotonen gaan nu verder naar de fotokathode waar terug elektronen vrijgemaakt worden en het signaal versterkt wordt door de fotomultiplier. Het signaal wordt gedigitaliseerd en verwerkt door het datasysteem, met als resultaat een massaspectrum (Quattro LC Operator Training Course, 1998). De verschillende processen worden voorgesteld in onderstaande figuur (figuur 3.7).

FIGUUR 3.7: OVERZICHT VAN DE TANDEMMASSASPECTROMETER (http://images.vertmarkets.com) De tandem massaspectrometer in de MRM-mode beschikt over 2 statische massafilters, waarbij het precursoren fragmention geselecteerd worden door respectievelijk de eerste en tweede quadrupool. Doordat niet gescand wordt, kan een langere tijd gefocust worden op de juiste ionen, waardoor de gevoeligheid stijgt (Hoffmann and Stroobant, 2001). De methode is analoog aan “selected ion monotoring” (SIM) , die gebruik maakt van 1 quadrupool. Bij MRM echter worden de ionen, geselecteerd door de eerste quadrupool, enkel gedetecteerd als ze een bepaald fragmention produceren. Dit leidt tot een verhoogde selectiviteit (Hoffmann and Stroobant, 2001). De instrumentele MS-parameters en de condities voor precursor-en dochterionen worden weergegeven in respectievelijk tabel 3.1 en tabel 3.2.


24

TABEL 3.1: INSTRUMENTELE PARAMETERS MS SCAN Source (ES+)

Settings

Capillary (kV)

4,80

Extractor (V)

3

RF Lens (V)

0,20

Source Temperature (°C)

120

Desolvation Temperature (°C)

350

Analyser

Settings

LM Resolution 1

14,0

HM Resolution 1

14,0

Ione Energy 1

2,0

Entrance

2

Exit

2

LM Resolution 2

14,0

HM Resolution 2

14,0

Ione Energy 2

1,0

Multiplier (V)

650


25

TABEL 3.2: CONDITIES VOOR PRECURSOR- EN DOCHTERIONEN Component

NT-D3

AED

Precursor Ion

Dochterion

Collision Energie

Cone

(m/z)

(m/z)

(eV)

(V)

278,00

109,00

28

45

83,00

28

45

109,30

18

36

97,21

18

36

197,00

17

25

225,00

15

25

201,60

14

27

159,20

12

27

109,10

18

33

97,10

18

33

109,00

30

50

97,00

30

50

133,20

18

22

297,60

10

22

281,40

15

24

255,31

13

24

287 ,20

DHEA

5-Andro

α-T en β-T

MT-D3

OH-Preg

Preg

253,35

273,40

289,40

306,00

333,20

317,30

3.2.4. Procedure van DHEA-dierproef

3.2.4.1.

Opzuivering via SPE

Eerst wordt er 10 mL van de te onderzoeken urinemonsters en van de blanco urine gepipetteerd in proefbuizen. Deze worden gedurende 10 minuten bij 3000 toeren per minuut (rpm) gecentrifugeerd en vervolgens wordt de bovenstaande vloeistof overgebracht in bredere proefbuizen. 3 M acetaatbuffer (pH 4,6) wordt toegevoegd om de stalen tussen pH 4,6 en 5 te brengen.


26

Vervolgens wordt er aan alle proefbuizen (monster en blanco) 20 µL van 1ng/µL MT-D3 als interne standaard toegevoegd. Aan de blanco urine wordt er een gekende hoeveelheid van DHEA en zijn precursoren en metabolieten toegevoegd (zie tabel 3.3), zodat er een calibratielijn verkregen wordt. Een calibratiecurve wordt bij elke run meegenomen om verschillen in resultaten veroorzaakt door omgevingsfactoren weg te werken. TABEL 3.3: SAMENSTELLING VAN DE CALIBRATIECURVE DHEA

Aantal µL

Conc . (ng/µL)

10

5-andro

Aantal µL

Conc . (ng/µL)

1

Totaal aantal ng/ml 1

10

50

10

50

20

100

50 100

α-T, β-T, AED, OH-preg en preg Aantal µL

Conc . (ng/µL)

1


10

1


100

1

10

50

1

5

200

50

10

50

100

1

10

100

500

100

10

100

40

10

40

100

1000

20

100

200

80

10

80

Na activatie en conditionering van de C18–kolommen met tweemaal 5 mL MeOH en tweemaal 5 mL MQ worden de urinestalen op de kolommen gebracht. C18-kolommen hebben een sterk apolair sorbens, opgebouwd uit octadecylketens. De analieten die gedeeltelijk of sterk apolair zijn (hormonen), zullen met het sorbens binden. Wanneer de urinestalen langzaam doorheen de C18–kolommen gelopen zijn, worden deze gewassen met tweemaal 5 mL MQ en met tweemaal 5 mL 10 % MeOH (in MQ). Vervolgens worden de kolommen gedurende een tiental minuten drooggezogen. De C18–kolommen worden verwijderd en vervangen door Bondelut SAX-kolommen. Strong Anion Exchange (SAX) -kolommen zijn sterke anionenwisselaars, bestaande uit quaternaire ammoniumverbindingen. Deze kunnen uit zouten de overeenstemmende basen vrijmaken en hierdoor onder andere de steroïde analieten binden.


27

Deze SAX-kolommen worden eerst bevochtigd met 4 mL MeOH, daarna geconditioneerd met 4 mL MQ, gevolgd door 20 mL 0,5 M azijnzuur (in MQ), 20 mL MQ en 5 mL MeOH. Na het conditioneren worden de droge C18–kolommen op de SAX-kolommen geplaatst en worden er proefbuizen in het vacuümelutiebakje geplaatst. Het elueren van SAX-kolommen gebeurt door de zuurtegraad aan te passen. Voor de elutie van neutrale componenten, waaronder de vrije fractie van DHEA en zijn precursoren en metabolieten, wordt 5 ml MeOH gebruikt. Met de opgevangen oplossingen wordt verder gegaan in 3.2.4.1.1. Vrije fractie. Daarna worden de C18–kolommen verwijderd en worden er nieuwe proefbuizen geplaatst. De SAX-kolommen, die zich nog op het vacuümelutiebakje bevinden, worden geëlueerd met 10 mL 0,5 M mierenzuur (in MeOH). Mierenzuur wordt gebruikt om componenten met een zuur karakter te elueren. Hiermee wordt verder gegaan in 3.2.4.1.2. Glucuronide fractie. Na het verwijderen van de SAX-kolommen worden de C18–kolommen opnieuw geconditioneerd met tweemaal 5 mL MeOH en tweemaal 5 mL MQ. De SAX-kolommen worden vervolgens bovenop de C18–kolommen geplaatst en geëlueerd met 10 mL 0,5 M diethylamine (in MQ). Diethylamine wordt gebruikt om componenten met een basisch karakter te elueren. Hierdoor komt de sulfaat fractie op de C18–kolommen terecht. De SAXkolommen worden verwijderd en de C18–kolommen worden gewassen met 10 mL MQ. Nieuwe proefbuizen worden geplaatst en de C18–kolommen worden geëlueerd met 5 mL MeOH. Hierdoor elueert de sulfaat fractie. Met deze fractie wordt verder gewerkt in 3.2.4.1.3. Sulfaat fractie. 3.2.4.1.1. Vrije fractie De verkregen oplossingen met de vrije fractie worden drooggedampt bij 40 °C onder N2. Vervolgens worden de droge residuen opgelost in 15 mL MQ en op de C18–kolommen gebracht. Deze kolommen worden eerst geconditioneerd met tweemaal 5 mL MeOH en tweemaal 5 mL MQ. Na het doorlopen van de stalen, worden de C18–kolommen gewassen met tweemaal 5 mL MQ en tweemaal 5 mL 10 % MeOH (in MQ). Nadien worden de kolommen gedurende een tiental minuten drooggezogen.


28

De droge C18–kolommen worden verwijderd en vervangen door amino-kolommen. Amino-kolommen hebben een polair sorbens en zijn zwakke ionenwisselaars. DHEA en zijn metabolieten worden direct geëlueerd van de amino-kolommen, terwijl polaire componenten, zoals kleurstoffen, op de kolommen gebonden blijven. Hierdoor worden er minder gekleurde monsters bekomen. Een overzicht van de verschillende kolommen wordt weergegeven in tabel 3.4. TABEL 3.4: EIGENSCHAPPEN VAN ENKELE SPE-KOLOMMEN

De amino-kolommen worden met tweemaal 3 mL ethylacetaat geactiveerd. Vervolgens worden er nieuwe proefbuizen in het vacuümelutiebakje geplaatst en worden de droge C18–kolommen bovenop de amino-kolommen gebracht. De C18–kolommen worden geëlueerd met 5 mL ethylacetaat. Aan het eluaat van de ijklijn wordt 20 µL van 1 ng/µL NTD3 toegevoegd. De oplossingen worden drooggedampt bij 40 °C onder N2 en hiermee wordt verder gewerkt in 3.2.4.1.4. Voorbereiding LC-MS/MS. 3.2.4.1.2. Glucuronide fractie Aan de oplossingen met de glucuronide fractie wordt eerst 20 µL van 1 ng/µL interne standaard MT-D3 toegevoegd. Vervolgens worden deze drooggedampt bij 40 °C onder N2.


29

De stalen worden heropgelost in 5 mL 0,2 M acetaatbuffer pH 4,6 en er wordt telkens 25 µL van een 1/10 verdunning van Helix Pommatia toegevoegd. Om de reactie te laten doorgaan worden de stalen gedurende twee uur in een oven bij 60 °C geplaatst. Helix Pommatia, een slakkenextract, bevat β-glucuronidase en wordt in laboratoria gebruikt voor de deconjugatie van glucuronides (figuur 3.8).

FIGUUR 3.8 : HET EFFECT VAN β-GLUCURONIDASE OP DHEAG Hierna worden de stalen gedurende 10 minuten bij 3600 rpm gecentrifugeerd. Vervolgens worden ze op C18–kolommen gebracht, die geconditioneerd zijn met tweemaal 5 mL MeOH en tweemaal 5 mL MQ. Nadat de stalen doorgelopen zijn, worden de kolommen gewassen met tweemaal 5 mL MQ en tweemaal 5 mL 10 % MeOH. De amino-kolommen worden geconditioneerd met tweemaal 3 mL ethylacetaat en bovenop de C18–kolommen geplaatst. Nieuwe proefbuizen worden voorzien om de doorloop op te vangen. De C18–kolommen worden geëlueerd met 5 mL ethylacetaat en de opgevangen oplossingen worden drooggedampt bij 40 °C onder N2. Met de residuen wordt verder gewerkt in 3.2.4.1.4. Voorbereiding LC-MS/MS. 3.2.4.1.3. Sulfaat fractie Aan de proefbuizen, die de sulfaat fractie bevatten, wordt telkens 40 µL van 1 ng/µL interne standaard MT-D3 toegevoegd. Deze worden drooggedampt en nadien heropgelost in 5 mL methanolysis. De oplossingen worden vervolgens gedurende één uur in een oven bij 80 °C geplaatst. Methanolysis is een chemische oplossing die bindingen tussen sulfaatgroepen en hormonen splitst (figuur 3.9). Op die manier wordt de sulfatering ongedaan gemaakt en worden de vrije vormen van DHEA en zijn precursoren en metabolieten verkregen.


30

FIGUUR 3.9: HET EFFECT VAN METHANOLYSIS OP DHEAS Nadien worden de oplossingen overgebracht in grote proefbuizen en nagespoeld met 15 mL MQ. De verkregen 20 mL–oplossingen worden gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 3000 rpm. Na conditionering van de C18–kolommen met tweemaal 5 mL MeOH en tweemaal 5 mL MQ worden de stalen op de kolommen gebracht. Hierna worden deze gewassen met tweemaal 5 mL MQ en tweemaal 5 mL MeOH (in MQ). Na activatie van de amino-kolommen met tweemaal 3 mL ethylacetaat, worden de C18kolommen er bovenop geplaatst. Proefbuizen worden voorzien in het vacuümelutiebakje. De kolommen worden geëlueerd met 5 mL ethylacetaat en de opgevangen oplossingen worden drooggedampt bij 40 °C onder N2. Met de verkregen residuen wordt verder gewerkt in 3.2.4.1.4. Voorbereiding LC-MS/MS. 3.2.4.1.4. Voorbereiding LC-MS/MS Alle residuen van de vrije, glucuronide en sulfaat fractie worden opgelost in 150 µL MeOH/ MQ (60/40) (mobiele fase). De opgeloste residuen worden overgebracht in LC-MSvials. Voor de sulfaat fractie worden er per staal twee vials gemaakt, een verdund en onverdund extract. Voor het verdund extract wordt er 15 µL uit de 150 µL-oplossing gepipetteerd en hieraan wordt 20 µL van 1 ng/µL NT-D3 toegevoegd. Dit wordt drooggedampt bij 40 °C onder N2 en heropgelost in 150 µL MF. De rest van de oplossing (135 µL) wordt in de andere vial als onverdund extract gebracht. Hieraan wordt geen NT-D3 meer toegevoegd, MT-D3 is aanwezig als interne standaard. Ten slotte wordt een extra vial klaargemaakt, namelijk de mix. De mix-oplossing bevat alle hormonen (DHEA, 5-andro, α-T, β-T, AED, OH-preg en preg) aan een concentratie van 1 ng/µL. 100 µL van de mix-oplossing wordt drooggedampt en heropgelost in 100 µL MATERIAAL EN METHODEN

31

MeOH/MQ (60/40). Hiervan wordt 20 µL geïnjecteerd ter controle van de LC-MS/MS vooraleer de analyse te starten. 3.2.5. Verwerking chromatogrammen De resultaten worden bekomen door de responsen van de componenten in functie van de concentratie uit te zetten. Een respons is de verhouding van het oppervlak van de piek van de component ten opzichte van het oppervlak van de piek van de interne standaard van hetzelfde monster. Een calibratiecurve, bekomen door de blanco urine met vijf gekende concentratieniveaus en de interne interne standaard te belasten, werd telkens meegenomen per zeven stalen en geeft de responsen weer in functie van de concentratie van elke component. Voor de bevestiging van de componenten in de geanalyseerde urinestalen moet er voldaan worden aan drie identificatiepunten, welke beschreven zijn in het Commissiebesluit 2002/657/EG. Ten eerste moet de relatieve retentietijd van de component in het staal binnen het interval van ± 2,5 % van de relatieve retentietijd van de standaard liggen. Hiervoor wordt de standaard uit de calibratiecurve genomen met de concentratie die het dichtst aansluit bij de concentratie van deze component in het onbekende staal. De relatieve retentietijd is de verhouding tussen de retentietijd van de component en de retentietijd van de interne standaard. TABEL 3.5: RELATIEVE INTENSITEIT MET TOEGESTANE GRENZEN Relatieve intensiteit

Toegestane grenzen voor LC-MS/MS

> 50 %

± 20 %

> 20 % - 50 %

± 25 %

> 10 % - 20 %

± 30 %

≤ 10 %

± 50 %


32

Ten tweede moet de verhouding van de piekoppervlaktes van beide dochterionen overeenkomen met die van een calibratiestandaard, die onder dezelfde omstandigheden gemeten is en een vergelijkbare concentratie heeft voor de component. Deze verhouding wordt ook de relatieve intensiteit genoemd en wordt uitgedrukt als percentage van de intensiteit van het meest abundant ion. In tabel 3.5 worden de toegestane grenzen van de relatieve ionenintensiteiten voor LC-MS/MS weergegeven. Ten slotte moeten de pieken van de twee dochterionen aanwezig zijn met een signaalover-ruisverhouding groter dan drie. Indien aan deze drie criteria voldaan is, kan met zekerheid gezegd worden dat de onderzochte component in het staal aanwezig is. 3.2.6. Statistiek Voor dit onderdeel wordt gerefereerd naar De Vocht, 2007. De statistische verwerking van de resultaten gebeurt met het programma SPSS versie 17. Eerst wordt er nagegaan of de gegevens normaal verdeeld zijn. Voor veel statistische toetsen geldt namelijk de voorwaarde dat de variabele normaal verdeeld is, of dat de steekproef afkomstig is uit een normaal verdeelde populatie (figuur 3.10).

FIGUUR 3.10: DE NORMALE VERDELING (M=gemiddelde, s=standaarddeviatie) (http://www.netters.nl) Toetsen op normaliteit kan visueel gebeuren met een Q-Q plot, daarnaast kan het ook door twee toetsen waarmee wordt onderzocht of de verdeling significant verschilt van een normale verdeling. Deze toetsen zijn de Kolmogorov-Smirnov toets en de Shapiro-Wilk toets. Deze laatste heeft de voorkeur bij kleinere steekproeven (N ≤ 50) en wordt daarom MATERIAAL EN METHODEN

33

toegepast. Hierbij wordt de nulhypothese ‘de variabele is normaal verdeeld’ verworpen op het 5 % significantieniveau wanneer de significantie kleiner of gelijk is aan 0.05. Om na te gaan of er een verschil is tussen de concentraties van de verschillende hormonen in de vier groepen, wordt er gebruik gemaakt van de Kruskal-Wallis toets (nietparametrisch alternatief voor one-way ANOVA). Als er een significant verschil wordt waargenomen met deze toets, wordt de t-toets of de Mann-Whitney toets uitgevoerd om na te gaan tussen welke groepen er een significant verschil is. Omdat er twee toetsen na elkaar worden uitgevoerd, vergroot de kans op een type 1 fout, namelijk het valselijk verwerpen van de nulhypothese. Dit wordt in rekening gebracht met de Bonferroni correctie. Om te besluiten dat de ene groep significant verschilt van de andere op het 5% significantieniveau, moet de p-waarde kleiner zijn dan 0.05/6 (=0.0083). De t-toets (Student ’s t-test) is een parametrische toets, die wordt gebruikt om steekproefgemiddelden te vergelijken. Elke t-toets gaat uit van een paar voorwaarden, zo moet het gaan om een aselecte steekproef, een interval/ratio schaal van de te toetsen variabele en een normale steekproevenverdeling. In SPSS zijn er drie versies van t-toetsen, namelijk de One-Sample t-test, de Independent-Samples t-test en de Paired-Samples t-test. Met de One-Sample t-test wordt nagegaan of het (steekproef)gemiddelde gelijk is aan een theoretisch gemiddelde. De Paired-Samples t-test wordt gebruikt om te toetsen of de gemiddelden van twee gepaarde groepen gelijk zijn. In dit onderzoek wordt de Independent-Samples t-test toegepast, hiermee worden de gemiddelden van twee onafhankelijke groepen met elkaar vergeleken. De nulhypothese luidt dat beide populatiegemiddelden aan elkaar gelijk zijn (H0: µ1-µ2 = 0). De Mann-Whitney toets is een niet-parametrische toets die uitgevoerd kan worden wanneer niet aan de voorwaarden van een Independent-Samples t-toets wordt voldaan. Met deze test wordt de nulhypothese, die stelt dat twee steekproeven afkomstig zijn uit identieke populaties, getoetst. De gegevens van beide steekproeven worden gecombineerd en daarna gerangordend. Vervolgens worden de rangscores voor iedere afzonderlijke steekproef opgeteld. Als de steekproeven afkomstig zijn uit dezelfde populatie zullen beide gesommeerde rangscores (ongeveer) even groot zijn. Aan de hand van de tweezijdige


34

overschrijdingskans wordt de nulhypothese al dan niet verworpen op het 5 % significantieniveau.


35

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1. ALGEMEEN 4.1.1. Staalgegevens Er werden urinestalen verzameld van acht kalveren en hierin zijn de vrije, sulfaat en glucuronide fractie van DHEA en zijn precursoren en metabolieten volgens de reeds uitgelegde procedure bepaald. Deze dieren werden ingedeeld in twee oraal en twee intramusculair behandelde en vier niet behandelde (=controle) groepen. Vόόr elke behandeling werd telkens urine afgenomen (= blanco). De behandeling bestond uit een orale of intramusculaire DHEA-toediening van 1000 mg per dag, gedurende zeven opeenvolgende dagen. Het

onderzoek

werd

opgesplitst

in

twee

proefperiodes,

dit

volgens

de

behandelingsperiode. De dieren 635, 649, 664, 1532 en 1578 zijn in juni 2005 behandeld en werden in proefperiode 1 samengebracht. De dieren 705, 718 en 719 zijn behandeld in de periode november en december 2005 en werden samengebracht in proefperiode 2. Alle stalen kregen van het Nederlands onderzoeksinstituut RIKILT een nummer, in bijlage 1 volgt er een overzicht van de nummers die bij welke dieren horen, het gewicht van de dieren, de soort behandeling en het tijdstip van de urine-afname. 4.1.2. Schommelingen in concentraties Schommelingen in concentraties van DHEA en zijn precursoren en metabolieten bij eenzelfde dier komen voor en deze zijn onder andere te wijten aan het drink- en eetgedrag. Wanneer het dier veel drinkt, zal de urine meer verdund zijn en zullen er lagere concentraties van DHEA en zijn precursoren en metabolieten waarneembaar zijn. En omgekeerd, wanneer het weinig drinkt, zal het minder water excreteren via de urine en zullen er iets hogere concentraties waarneembaar zijn. 4.2. VERWERKING Bij de statistische verwerking worden de resultaten per proefperiode en per fractie

RESULTATEN EN DISCUSSIE

36

onderverdeeld in vier groepen naargelang de behandeling van het dier. Deze groepen zijn de blanco stalen, de controle stalen, de stalen na orale DHEA-behandeling en de stalen na intramusculaire DHEA-behandeling.

FIGUUR 4.1: DE GEMIDDELDE CONCENTRATIES VAN DE HORMONEN IN DE DRIE FRACTIES UIT PROEFPERIODE 1


37

In figuur 4.1 worden de hormonen DHEA, 5-andro, α-T, β-T en AED in de drie fracties (vrije, sulfaat en glucuronide) uit proefperiode 1 grafisch weergegeven. Hieruit volgt dat de hormonen voornamelijk in de sulfaat fractie worden uitgescheiden. Op het eerste zicht is er na de behandeling een groot verschil waar te nemen bij DHEA en 5-andro. Preg en OH-preg zijn precursoren van DHEA die in zeer lage concentraties in de urine voorkomen. Het was niet mogelijk om deze hormonen te bevestigen en/of te kwantificeren. Na behandeling was er geen waarneembaar verschil te merken, vermits preg en OH-preg nog steeds niet te bevestigen en/of te kwantificeren waren. 4.2.1. Sulfaat fractie Eerst worden de verschillende groepen getest op normaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk toets. De resultaten worden weergegeven in tabel 4.1. TABEL 4.1 : VERDELING VAN DE GROEPEN IN DE SULFAATFRACTIE Proefperiode (1 of 2) - Behandeling (Blanco,

Normale verdeling?

Controle, IM of Oraal) 1 – Blanco

Niet normaal verdeeld

1 – Controle

Alleen α-T normaal verdeeld

1 – IM

Normaal verdeeld

1 – Oraal

Normaal verdeeld

2 – Blanco

β-T en 5-Andro normaal verdeeld

2 – Controle

DHEA, α-T, β-T en 5-Andro normaal verdeeld

2 – IM


2 – Oraal


1-Behandelde groep

Normaal verdeeld

2-Behandelde groep



38

Vervolgens wordt er met de Independent-Samples t-test nagegaan of de blanco waarden uit proefperiode 1 en 2 uit dezelfde populatie komen. Uit de significantiewaarden, die kleiner zijn dan 0.05, blijkt dat dit niet het geval is op het 5 % significantieniveau en daaruit volgt dat proefperiode 1 en 2 apart moeten beschouwd worden. In tabel 4.2 worden de resultaten weergegeven van de Kruskal-Wallis test in de twee verschillende proefgroepen in de sulfaat fractie. Hieruit volgt dat er een significant verschil is tussen de concentraties in de sulfaat fractie van 5-andro, α-T en DHEA in de 4 verschillende behandelingen in proefperiode 1 en 2. TABEL 4.2: RESULTATEN VAN DE KRUSKAL-WALLIS TEST IN DE SULFAAT FRACTIE Hormoon

Proefperiode 1

Proefperiode 2

Significantiewaarde:

Significantiewaarde:

α-T

0,036

0,037

β-T

0,525

0,498

AED

0,195

0,807

DHEA

0,000

0,000

5-Andro

0,000

0,003

Vervolgens wordt er op het 5 % significantieniveau nagegaan of de verschillende groepen afkomstig zijn uit identieke populaties. Dit gebeurt, zoals voorheen beschreven, met de Independent-Samples t-test wanneer de groepen normaal verdeeld zijn en met de MannWhitney test wanneer dit niet het geval is. Hierbij wordt er rekening gehouden met de Bonferroni correctie (0.05/6 =0.0083).


39

4.2.1.1. Proefperiode 1 De concentraties van de blanco en de controle groep in proefperiode 1 worden met elkaar vergeleken. Het verschil tussen deze twee groepen is significant op het 5 % significantieniveau. Hierdoor kunnen beide groepen niet samen genomen worden. Daarna worden de gemiddelden van de oraal behandelde en de intramusculair behandelde dieren met elkaar vergeleken. Deze significantiewaarden zijn groter dan 0.0083. Dit betekent dat deze gemiddelden gelijk zijn op het 5 % significantieniveau, waardoor beide groepen kunnen samengenomen worden als behandelde groep. Nadien wordt nagegaan of de concentraties van de behandelde groep significant verschillen van de concentraties van de blanco groep. Hierbij kan een significant verschil waargenomen worden tussen de concentraties van α-T, DHEA en 5-andro in de sulfaat fractie. Uit de vergelijking van de concentraties van de behandelde groep met de controle groep kan besloten worden dat de concentraties van α-T, DHEA en 5-andro in de sulfaat fractie significant verschillen (op het 5 % significantieniveau). De gemiddelde concentraties van de hormonen in de sulfaat fractie uit proefperiode 1 worden grafisch weergegeven in figuur 4.2.

FIGUUR 4.2: DE GEMIDDELDE CONCENTRATIES VAN DE HORMONEN IN DE SULFAAT FRACTIE UIT PROEFPERIODE 1


40

Voor proefperiode 1 kan geconcludeerd worden dat de stijging van α-T, DHEA en 5andro in de sulfaat fractie te wijten is aan de behandeling met DHEA, waarbij er geen significant verschil is tussen orale en intramusculaire behandeling. In bijlage 2, 3, 4 en 5 worden de resultaten van respectievelijk de blanco stalen, de controle stalen, de stalen na intramusculaire behandeling en de stalen na orale behandeling van de afzonderlijke dieren uit proefperiode 1 weergegeven. 4.2.1.2. Proefperiode 2 De concentraties van de blanco groep en de controle groep worden met elkaar vergeleken. Hierbij wordt een significant verschil aangetoond op het 5 % significantieniveau waardoor het niet mogelijk is deze groepen samen te nemen. Vervolgens worden de concentraties van de oraal behandelde en de IM behandelde dieren met elkaar vergeleken. Met een significantiewaarde hoger dan 0.0083 kan er besloten worden dat deze concentraties niet verschillen op het 5 % significantieniveau. Deze groepen kunnen samengenomen worden als behandelde groep. Daarna worden de concentraties van de behandelde groep vergeleken met deze van de blanco groep. Hierbij kan een significant verschil aangetoond worden tussen de concentraties in de sulfaat fractie van α-T, DHEA en 5-andro.

FIGUUR 4.3: DE GEMIDDELDE CONCENTRATIES VAN DE HORMONEN IN DE SULFAAT FRACTIE UIT PROEFPERIODE 2


41

Ten slotte worden de concentraties van de behandelde groep vergeleken met deze van de controle groep. Ook hier kan een significant verschil aangetoond worden tussen de concentraties in de sulfaat fractie van α-T, DHEA en 5-andro. De gemiddelde concentraties van de hormonen in de sulfaat fractie uit proefperiode 2 worden weergegeven in figuur 4.3. Voor proefperiode 2 kan geconcludeerd worden dat de stijging van α-T, DHEA en 5andro in de sulfaat fractie te wijten is aan de behandeling met DHEA, waarbij er geen significant verschil is tussen orale en intramusculaire behandeling. In bijlage 6, 7, 8 en 9 worden de individuele resultaten van respectievelijk de blanco stalen, de controle stalen, de stalen na intramusculaire behandeling en de stalen na orale behandeling uit proefperiode 2 weergegeven. 4.2.2. Vrije fractie Voor de statistische testen op de vrije fractie kan enkel met proefperiode 1 gewerkt worden, omdat vele concentraties uit proefperiode 2 te laag zijn om te bevestigen en/of te kwantificeren, waardoor er te weinig data zijn. Eerst worden de groepen getest op normaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk toets. De resultaten worden weergegeven in de tabel 4.3. TABEL 4.3: VERDELING VAN DE VRIJE FRACTIE UIT PROEFPERIODE 1 Behandeling (Blanco, Controle, IM of

Normale verdeling?

Oraal) Blanco

β-T en 5-Andro normaal verdeeld

Controle


IM


Oraal


Onbehandelde groep


Behandelde groep



42

In tabel 4.4 worden de resultaten weergegeven van de Kruskal-Wallis test in proefperiode 1 in de vrije fractie. Hieruit volgt dat er een significant verschil is tussen de concentraties in de vrije fractie van DHEA, AED en α-T in de vier verschillende behandelingen in proefperiode 1. TABEL 4.4: RESULTATEN VAN DE KRUSKAL-WALLIS TEST IN DE VRIJE FRACTIE Proefperiode 1 Significantiewaarde: 0,001 0,879 0,032 0,022 0,834

Daarna worden de verschillende groepen met elkaar vergeleken. Dit gebeurt, zoals voorheen beschreven, met de Independent-Samples t-test wanneer de groepen normaal verdeeld zijn en met de Mann-Whitney test wanneer dit niet het geval is. Met deze testen wordt er op het 5 % significantieniveau nagegaan of bepaalde groepen uit dezelfde populatie afkomstig zijn, rekening houdend met de Bonferroni correctie. De concentraties uit de blanco groep worden vergeleken met deze van de controle groep, hieruit blijkt dat er geen significant verschil is, waardoor deze twee groepen kunnen samengenomen worden als onbehandelde groep. Hetzelfde volgt uit de vergelijking van de oraal behandelde groep met de intramusculair behandelde groep, waarbij een behandelde groep kan gecreëerd worden. Ten slotte worden de concentraties van de onbehandelde groep vergeleken met de concentraties van de behandelde groep. Hierbij zijn de concentraties van DHEA, α-T en AED


43

significant verschillend op het 5 % significantieniveau. De gemiddelde concentraties van de hormonen in de vrije fractie uit proefperiode 1 worden weergegeven in figuur 4.4.

FIGUUR 4.4: DE GEMIDDELDE CONCENTRATIES VAN DE HORMONEN IN DE VRIJE FRACTIE UIT PROEFPERIODE 1 Voor proefperiode 1 kan geconcludeerd worden dat de stijging van DHEA, α-T en AED in de vrije fractie te wijten is aan de behandeling met DHEA, waarbij er geen significant verschil is tussen orale en intramusculaire behandeling. In figuur 4.5 worden de gemiddelde concentraties in de vrije fractie uit proefperiode 2 weergegeven. Voor DHEA, α-T, β-T en 5-andro is grafisch dezelfde trend waar te nemen als in proefperiode 1.

FIGUUR 4.5: DE GEMIDDELDE CONCENTRATIES VAN DE HORMONEN IN DE VRIJE FRACTIE UIT PROEFPERIODE 2 RESULTATEN EN DISCUSSIE

44

Voor AED kan er uit deze figuur geen besluit genomen worden, de daling van de concentratie na behandeling kan te wijten zijn aan de variabiliteit tussen de verschillende dagen. 4.2.3. Glucuronide fractie Voor de glucuronide fractie zijn er geen statistische testen mogelijk, omdat vele concentraties te laag zijn om te bevestigen en/of te kwantificeren, waardoor er te weinig data zijn.

FIGUUR 4.6: DE GEMIDDELDE CONCENTRATIES VAN DE HORMONEN IN DE GLUCURONIDE FRACTIE UIT PROEFPERIODE 1 In figuur 4.6 worden de gemiddelde concentraties van de hormonen in de glucuronide fractie uit proefperiode 1 grafisch weergegeven. Er is echter geen trend waar te nemen, de concentraties zijn te laag om iets te besluiten.


45

5. CONCLUSIES In dit onderzoek wordt een excretieprofiel opgesteld van DHEA en zijn precursoren en metabolieten in kalverurine na orale en intramusculaire toediening van 1000 mg DHEA per dag. Hiervoor werden de urinestalen eerst opgezuiverd met behulp van vaste fase extractie en daarna werden de hormonen gescheiden en gedetecteerd met LC-MS/MS. Statistisch wordt er op het 5 % significantieniveau aangetoond dat er na de behandeling een stijging van DHEA en 5-andro in de sulfaat fractie en een stijging van DHEA, α-T en AED in de vrije fractie plaatsvindt. Hierbij is er geen significant verschil tussen orale en intramusculaire toediening. Uit de grafische verwerking van de resultaten volgt dat de hormonen zich voornamelijk in de sulfaat fractie bevinden. Hiermee kan aangetoond worden dat sulfatering de belangrijkste excretieweg is van androgenen. Dit betekent dat de metabolisatiepathway van DHEA naar DHEAS en gesulfateerd 5-andro, wat in de testis gebeurt, meer doorgaat dan de omzetting van DHEA naar AED, wat in de bijnieren gebeurt. Dit is logisch aangezien de grootste productie van zwakke androgenen niet in de bijnieren gebeurt, maar door perifere conversie. Na toediening van 1000 mg DHEA aan kalveren stijgt dus de concentratie van o.a. testosteron, dit zegt echter niets over het mogelijke spierversterkend effect bij de dieren, om dit te bewijzen zijn er andere studies nodig.

CONCLUSIE

46

6. LITERATUURLIJST Aldred, S.; Waring, R. H. (1999). Localisation of dehydroepiandrosterone sulphotransferase in adult rat brain. Brain Research Bulletin, 3, 291-296. Bahrke, M. S.; Yesalis, C. E. (2004). Abuse of anabolic androgenic steroids and related substances in sport and exercise. Current Opinion in Pharmacology, 4, 614-620. Barnhart K.T.; Dayal M.; Hummel A.C.; Sammel M.D.; Vandenbourne K; Zhao J. (2005). Supplementation with DHEA: Effect on muscle size, strength, quality of life, and lipids. Journal of women’s health, 14, 391-400. Baulieu, E.E.; Robel P. (1998). Dehydroepiandrosterone and dehydroepiandrosterone sulfate as neuroactive neurosteroids. The National Academy of Sciences, 59, 4089-4091. Cawley, A. T.; Hine, E. R.; Trout, G. J.; George, A. V.; Kazlauskas, R. (2004). Searching for new markers of endogenous steroid administration in athletes: ‘looking outside the metabolic box’. Forensic Science International, 143, 103-114. Corrigan, B. (2002). DHEA and Sport. Clinical Journal of Sport Medicine, 12, 236-241. Delmulle, B.; De Saeger, S.; Adams, A.; De Kimpe, N.; Van Peteghem, C. (2006). Development of a liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of 16 mycotoxines on cellulose filters and in fungal cultures. Rapid Commun. In Mass Spectrom., 20, 771-776. De Vocht, A. (2007). Basishandboek SPSS 15 voor windows. Bijleveld press, Utrecht, Nederland. Hoffmann, E.; Stroobant, V. (2001). Mass Spectrometry. Principles and Applications. Wiley, Engeland, pp. 34-36; 65; 70; 71; 133; 137; 139. Holloszy J.O.; Kohrt W.M.; Villareal D.T. (2000). Effects of DHEA replacement on bone mineral density and body composition in elderly women and men. Clinical Endocrinology, 53, 561-568. http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:31996L0022:NL:HTML, geraadpleegd op 20 februari 2009. LITERATUURLIJST

47

http://eur-lex.europa.eu/smartapi/cgi/sga_doc?smartapi!celexapi!prod!CELEXnumdoc& numdoc= 31996L0023&model=guichett&lg=nl, geraadpleegd op 20 februari 2009. http://images.vertmarkets.com/CRLive/files/Images/A5BBBFF5-7525-11D3-9A6400A0C9C83AFB/image3%20copy.jpg, geraadpleegd op 12 april 2009. http://www.favv.be/consum/thema/medvet_nl.asp, geraadpleegd op 8 maart 2009. http://www.favv.be/sp/sous-prod/doc/regl/68942n.pdf, geraadpleegd op 8 maart 2009. http://www.ivv.fraunhofer.de/ms/quad-sch.gif, geraadpleegd op 12 april 2009. http://www.netters.nl, geraadpleegd op 30 april 2009. http://www.vbs-gbs.org/dgs/gs2002/gs0205gs/gs0205-12.asp, geraadpleegd op 2 maart 2009. http://www.vwa.nl/portal/page?_pageid=119,1640036&_dad=portal&_schema=portal, geraadpleegd op 10 maart 2009. http://www.waters.com/webassets/cms/category/media/other_images/primer_ms_Id_AP% 20ESI%20figure.jpg, geraadpleegd op 12 april 2009. Kebarle, P; Ho, Y. (1997). On the mechanism of Electrospray Mass Spectrometry. In: Electrospray ionization mass spectrometry. Fundamentals, instrumentation and applications, Cole, R. B. (Ed.). Wiley-Interscience, Verenigde Staten, pp. 4-63. Krstulovic, A. M.; Brown, P. R. (1982). Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography. Wiley-Interscience, Verenigde Staten, pp. 296. Lentjes, E.G.W.M. (2006). Androgenen. Nederlands Tijdschrift voor Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde, 31, 28-33. Lingeman, H. (2000). Monsterbewerking. Algemene inleiding: methodeontwikkeling: vloeistofchromatografie. Vaste-fase extractie (SPE). In: Chromatografie in de praktijk. Monsterbewerking in de chromatografie, Lipschitz, C. (Ed.). Ten Hagen & Stam uitgevers, Den Haag, Nederland.

LITERATUURLIJST

48

Macrae, R. (1982). Theory of Liquid Column Chromatography. In: HPLC in Food Analysis, Macrae, R. (Ed.). Academic Press, Engeland, pp. 3-26. Mathews, C.K.; van Holde, K.E.; Ahern K.G. (2000). Biochemistry. Addisson-Wesley Company, Harlow, UK, Chapter 19. Merck Index (2001). Merck & Company, New Jersey, USA. Monbalieu, S.; Lobeau, M.; Van Peteghem, C.; De Saeger, S.; Goryacheva, I. Y. (2007). Emerging methods for mycotoxin analysis in food and feed. In: SPSDII. Platform for scientific concertation: food safety. Towards a safer food supply in Europe, Van Peteghem, C.; De Saeger, S.; Daeseleire, E. (Eds.). Belgian Science Policy, Brussel, België, pp. 271-282. Newton, R. (1982). Instrumentation for HPLC. In: HPLC in Food Analysis, Macrae, R. (Ed.). Academic Press, Engeland, pp. 27-77. Simpson, C.F. (1982). Separation modes in HPLC. In: HPLC in Food Analysis, Macrae, R. (Ed.). Academic Press, Engeland, pp. 79-121. Skoog, D.; West, D. M.; Holler, F.J. (1992). Fundamentals of analytical chemistry. Saunders College Publishing, Verenigde Staten, pp. 668-669; 718-719. Sundström, I. (2007). Liquid Chromatography-Mass Spectrometry as a Tool for Drug Metabolite Identification in Biological Fluids With Application to Ketobemidone, Uppsala Universiteit, Doctoraatsthesis. Waters (1998). Quattro LC Operator Training course. Milford, Verenigde Staten.

LITERATUURLIJST

49

7. BIJLAGEN

BIJLAGE 1: STAALGEGEVENS

BIJLAGEN

Diernummer

Gewicht (kg)

635

172

649

174

664

153

705

262

RIKILT Behandeling nr. 152579 Geen 152597 Geen 152588 Geen 152570 Geen 152561 Geen 152610 Controle 152627 Controle 152644 Controle 152662 Controle 152680 Controle 152727 Controle 152715 Controle 152594 Geen 152558 Geen 152567 Geen 152576 Geen 152585 Geen 152621 Controle 152638 Controle 152656 Controle 152674 Controle 152691 Controle 152724 Controle 152600 Geen 152564 Geen 152582 Geen 152591 Geen 152573 Geen 152615 Controle 152633 Controle 152703 Controle 152668 Controle 152686 Controle 152721 Controle 152730 Controle 152650 Controle 152668 Controle 163846 Geen 163857 Geen

Afname uur 10:00 9:15 8:30 10:40 15:30 17:15 15:30 15:40 15:30 15:15 7:40 17:00 9:30 15:30 10:30 10:00 8:30 16:45 15:20 15:00 15:40 15:10 8:30 9:15 15:30 10:45 8:30 11:10 17:00 16:45 15:30 15:35 15:30 17:00 7:30 15:30 15:35 8:20 8:30

50

705

BIJLAGEN

262

718

275

719

216

1532

290

1578

253

163901 163869

IM IM

8:30 7:30

163883 163895 163877 163889 163863 163863 163848 163865 163871 163879 163859 163897 163903 163891 163858 163847 163902 163878 163884 163870 163864 152556 152574 152565 152592 152583 152617 152670 152705 152652 152722 152688 152602 152635 152557 152584 152566 152593 152575 152619 152672 152707 152689

IM IM IM IM IM IM Geen Controle Controle Controle Geen Controle Controle Controle Geen Geen Oraal Oraal Oraal Oraal Oraal Geen Geen Geen Geen Geen IM IM IM IM IM IM IM IM Geen Geen Geen Geen Geen Oraal Oraal Oraal Oraal

7:55 9:00 8:30 8:35 17:25 17:25 8:20 17:30 7:30 7:40 8:30 8:35 8:30 8:05 8:00 8:20 8:20 8:00 8:00 7:30 17:45 15:30 11:15 10:15 9:15 8:30 15:30 15:40 16:40 15:15 8:30 15:20 17:30 15:45 15:30 8:30 11:10 9:30 11:00 15:30 15:45 15:40 16:40

152654

Oraal

17:00

51

1578

253

152637 152723

Oraal Oraal

15:20 8:00

BIJLAGE 2: CONCENTRATIES BLANCO STALEN PROEFPERIODE 1 RIKILT nr.

152556

152557

152579

152584

152594

152597

152558

152566

152574

152588

152593

152600 152600

Fractie

Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide Sulfaat Vrije Glucuronide

BIJLAGEN

α-T 7,60 0,00 0,00 2,40 0,00 0,00 11,60 0,90 0,00 4,20 0,00 0,00 2,60 0,00 0,00 11,80 0,00 0,00 10,40 1,70 0,00 2,80 0,70 0,00 3,60 0,00 0,00 14,40 4,90 0,00 2,30 0,70 0,00 5,80 0,60 0,00

β-T 1,30 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,30 0,00 0,00 0,70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,30 0,00 0,00 2,80 0,40 0,00 2,40 0,10 0,00 2,60 0,00 0,00 2,90 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,80 0,00 0,00

AED 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,80 0,00 0,00 0,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,30 0,00 0,00 0,40 0,00 0,00 0,40 0,00

Concentratie (ng/ml) 5-Andro 29,08 0,00 0,00 20,80 0,00 0,00 33,38 0,00 0,00 18,28 0,00 0,00 14,94 0,00 0,00 12,28 0,00 0,00 53,43 0,00 0,00 53,02 0,00 0,00 41,61 0,00 0,00 42,69 0,00 0,00 21,78 0,00 0,00 32,80 0,00 0,00

OH-Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Preg 11,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

DHEA 21,40 0,00 0,00 7,10 0,00 0,00 11,50 0,00 0,00 6,90 0,00 0,00 8,00 0,00 0,00 8,00 0,00 0,00 16,00 0,00 0,00 4,20 0,00 0,00 12,70 0,00 0,00 9,70 0,00 0,00 4,90 0,00 0,00 6,20 0,00 0,00

52

152564

152565

152570

152582

152591

152592

152561

152567

152573

152575

152576

152585

152583

Sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide

BIJLAGEN

32,10 1,20 0,00

2,10 0,20 0,00

0,00 0,20 0,10

118,87 2,77 0,00

0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00

64,70 0,00 0,00

26,70 0,00 0,00 10,10 0,00 0,00 44,40 1,80 0,00 15,30 0,00 0,00 23,10 0,70 0,00 0,20 0,00 5,00 0,10 1,40 3,70 0,00 0,80 1,40 0,00 0,40 2,70 0,00 0,10 1,80 0,00 0,30 0,00 0,00 0,00 3,80

6,10 0,20 0,00 0,00 0,00 0,10 2,90 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00 7,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,20 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00 0,30 0,00 0,00 0,40 0,00 0,60

0,00 0,30 0,10 0,00 0,10 0,10 0,00 0,30 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,40 0,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 1,22 0,00 0,00 0,93 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5,32 1,46 0,00 3,49 4,32 3,90 10,70 0,00 1,01 4,79 3,89 0,00 4,61 4,28 0,00 0,00 4,14 0,00 1,35

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,90 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 9,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

69,40 0,00 0,00 37,60 0,00 0,00 40,30 0,00 0,00 54,90 0,00 0,00 89,90 0,00 0,00 71,00 0,00 2,10 50,80 0,00 1,50 45,90 0,00 0,00 39,00 0,00 0,00 42,50 0,00 1,40 54,50 0,00 0,00 89,00 0,00 0,80

53

BIJLAGE 3: CONCENTRATIES CONTROLE STALEN PROEFPERIODE 1 RIKILT nr.

152610

152615

152621

152627

152633

152638

152644

152703

152656

152662

152668

152674

152680

Fractie

sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide

BIJLAGEN

α-T 0,00 1,20 8,40 0,00 1,50 6,50 2,10 1,50 12,40 0,00 1,30 5,30 1,70 1,30 9,40 3,10 1,60 14,20 2,20 1,20 14,70 12,49 0,00 3,90 25,30 0,00 15,42 0,00 0,00 0,00 10,17 0,00 2,65 13,37 0,00 7,07 33,70 0,00 8,10

β-T 1,10 0,90 0,90 1,00 1,00 1,00 1,30 0,00 1,30 1,10 0,90 0,90 1,10 0,00 1,10 1,20 0,00 0,00 1,70 0,90 1,40 0,00 0,00 0,00 0,56 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,20 0,00 0,00

AED 0,90 0,80 0,00 0,80 0,90 0,00 0,00 0,90 0,00 1,00 0,90 0,00 0,90 0,80 0,00 0,00 0,80 0,00 1,00 0,90 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Concentratie (ng/ml) 5-Andro 4,43 0,00 3,42 6,56 3,23 4,99 8,32 0,00 0,00 0,00 0,00 3,30 8,42 0,00 4,99 15,20 0,00 0,00 9,69 0,00 2,88 144,19 0,00 0,00 15,76 0,00 0,00 102,78 0,00 0,00 72,08 0,58 0,00 62,61 0,00 0,00 70,28 0,00 0,00

OH-Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

DHEA 23,10 0,40 1,10 29,60 2,40 1,10 61,30 0,70 2,60 26,20 0,50 1,30 43,10 1,00 1,40 58,70 0,80 2,00 38,00 0,30 1,40 33,29 0,00 0,00 80,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 34,83 0,00 0,00 111,46 0,00 0,00 42,10 0,00 0,00

54

152691

152686

152721

152727

152715

152724

152730

152650

152638

152656

152668

sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide

BIJLAGEN

6,83 0,00 0,12 0,00 0,55 0,00 0,00 1,43 0,00 28,90 0,73 0,00 12,98 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 18,47 0,00 0,00 9,04 0,00 0,00 30,49 0,00 0,00 40,30 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,48 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

105,17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 141,3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 175,80 0,00 0,00 101,10 0,00 0,00 107,40 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

34,58 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 11,62 0,00 0,00 13,49 0,00 0,00 7,50 0,00 0,00 21,55 0,00 0,00 16,15 0,00 0,00 7,19 0,00 0,00 152,30 0,00 0,00 54,20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

55

BIJLAGE 4: CONCENTRATIES NA INTRAMUSCULAIRE BEHANDELING PROEFPERIODE 1 RIKILT nr.

Fractie

152617

sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide

152652

152722

152670

152688

152705

152602

152635

BIJLAGEN

α-T 13,20 1,68 0,00 24,44 0,00 1,98 16,48 0,00 0,00 40,30 2,85 0,00 17,10 13,27 0,00 7,20 0,91 0,00 24,66 2,49 0,00 27,20 2,85 0,00

β-T 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,46 0,00 0,00 0,86 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,10 0,00 0,00 0,98 0,00 0,00 2,32 0,00 0,00

AED 0,14 0,17 0,00 1,44 0,00 0,00 2,16 4,74 0,00 0,00 0,49 0,00 0,00 0,93 0,00 0,00 0,15 0,00 0,22 0,08 0,00 0,00 0,37 0,00

Concentratie (ng/ml) 5-Andro 197,20 0,59 0,00 96,90 0,00 0,00 344,80 55,55 0,00 353,10 0,00 0,00 200,60 0,00 0,00 116,60 0,00 0,00 256,00 0,00 0,00 448,90 0,95 0,00

OH-Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

DHEA 442,70 9,83 0,00 175,10 0,00 0,00 1776,80 345,50 0,00 1936,70 32,85 0,00 1118,00 46,98 0,00 646,90 14,03 0,00 1567,80 5,23 0,00 1614,50 17,98 0,00

56

BIJLAGE 5: CONCENTRATIES NA ORALE BEHANDELING PROEFPERIODE 1 RIKILT nr.

Fractie

152619

sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide

152672

152707

152723

152689

152654

152637

BIJLAGEN

α-T 10,36 2,08 0,00 16,40 3,07 0,00 18,00 2,73 0,00 24,88 5,85 0,00 11,20 1,38 0,00 15,60 32,80 0,00 37,80 2,24 0,00

β-T 5,20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,45 0,00 0,00 0,00 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00 1,21 1,00 0,00 2,50 0,00 0,00

AED 0,80 0,54 0,00 0,64 1,31 0,00 0,26 0,49 0,00 0,21 3,53 0,00 0,43 0,23 0,00 0,00 5,14 0,00 0,56 0,28 0,00

Concentratie (ng/ml) 5-Andro 238,20 0,00 0,00 93,70 0,00 0,00 182,00 0,00 0,00 279,20 0,00 0,00 346,90 0,00 0,00 180,50 0,00 0,00 234,60 0,00 0,00

OH-Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

DHEA 2578,00 1,39 0,00 757,90 5,28 0,00 119,10 4,32 0,00 891,30 21,55 0,00 1859,30 18,86 0,00 1456,60 89,14 0,00 2525,00 0,39 0,00

57

BIJLAGE 6: CONCENTRATIES BLANCO STALEN PROEFPERIODE 2 RIKILT nr.

Fractie

163848

sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide

163858

163847

163859

163846

163857

α-T 0,00 0,68 0,00 15,46 0,79 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 38,62 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

β-T 7,43 0,00 0,00 1,54 0,00 0,00 22,21 0,00 0,00 4,23 0,00 0,00 8,67 0,00 0,00 6,39 0,00 0,00

Concentratie (ng/ml) 5AED Andro OH-Preg 6,10 68,79 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,86 158,74 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 122,91 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 70,79 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

DHEA 32,62 0,00 0,00 13,20 0,00 0,00 138,24 0,00 0,00 11,76 0,00 0,00 13,48 0,00 0,00 54,44 0,00 0,00

BIJLAGE 7: CONCENTRATIES CONTROLE STALEN PROEFPERIODE 2 RIKILT nr. 163865

163871

163879

163897

163903

163891

Fractie

Concentratie (ng/ml) α-T β-T AED 5-Andro OH-Preg sulfaat 45,20 5,89 0,00 23,05 0,00 vrije 1,03 0,00 18,35 0,00 0,00 glucuronide 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 sulfaat 59,04 6,06 0,00 46,65 0,00 vrije 0,94 0,02 10,80 0,00 0,00 glucuronide 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 sulfaat 32,69 2,91 0,00 72,73 0,00 vrije 1,02 0,00 0,00 0,00 0,00 glucuronide 0,47 0,00 0,00 0,00 0,00 sulfaat 12,08 0,85 0,00 0,00 0,00 vrije 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 glucuronide 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 sulfaat 0,00 5,28 0,00 73,10 0,00 vrije 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 glucuronide 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 sulfaat 27,98 1,43 0,00 193,78 0,00 vrije 0,67 0,00 0,00 0,00 0,00 glucuronide 0,00 0,32 0,00 0,00 0,00

BIJLAGEN

Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

DHEA 9,66 0,00 0,00 11,79 0,00 0,00 5,14 0,00 0,00 7,21 0,00 0,00 11,07 0,00 0,00 4,57 0,00 0,00

58

BIJLAGE 8: CONCENTRATIES NA INTRAMUSCULAIRE BEHANDELING PROEFPERIODE 2 RIKILT nr.

Fractie

163901

sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide

163869

163883

163889

163895

163863

163877

α-T 220,30 2,32 0,00 90,56 4,19 0,00 120,41 6,15 0,00 60,38 8,13 0,00 8,70 2,97 0,00 18,60 4,84 0,00 94,60 7,40 0,00

β-T 13,66 0,00 0,00 9,12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,27 0,00 0,00 2,25 0,00 0,00 12,60 0,00 0,00

Concentratie (ng/ml) AED 5-Andro OH-Preg 0,00 1043,90 0,00 0,08 8,29 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 306,60 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 642,80 0,00 0,00 9,68 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 575,70 0,00 0,00 12,59 0,00 0,00 6,33 0,00 0,00 355,80 0,00 0,00 5,33 0,00 0,00 5,16 0,00 0,11 125,70 0,00 0,38 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 462,90 0,00 1,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

DHEA 7903,90 35,87 0,00 3279,20 19,68 0,00 5217,50 63,09 0,00 4010,10 103,57 0,00 4100,80 46,05 0,00 1464,30 28,75 0,00 3182,20 57,41 0,00

BIJLAGE 9: CONCENTRATIES ORALE BEHANDELING PROEFPERIODE 2 RIKILT nr.

Fractie

163902

sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide sulfaat vrije glucuronide

163878

163884

163870

163864

BIJLAGEN

α-T 50,19 4,38 0,00 10,75 44,72 0,00 30,00 10,62 0,00 80,00 19,18 0,00 63,30 6,90 0,00

β-T 0,00 0,00 0,00 3,77 0,00 0,00 1,17 0,00 0,00 18,00 0,20 0,00 0,00 0,05 0,00

AED 0,00 0,11 0,00 0,00 7,32 0,00 0,00 0,79 0,00 0,54 1,11 0,00 0,00 1,71 0,00

Concentratie (ng/ml) 5-Andro OH-Preg 510,70 0,00 6,90 0,00 0,00 0,00 501,60 0,00 23,07 0,00 0,00 0,00 428,70 0,00 17,50 0,00 4,46 0,00 422,70 0,00 7,57 0,00 0,00 0,00 302,20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Preg 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

DHEA 2627,90 20,22 0,00 2359,00 117,11 0,00 3023,90 106,69 0,00 4134,90 78,52 0,00 6727,70 16,01 0,00

59

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Recommend Documents