UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

   

   

UNIVERSITEIT GENT  FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN   

Vakgroep Geneesmiddelenleer  Laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie  Academiejaar 2009‐2010   

EXTRACTIE VAN mRNA UIT GLANDULAIRE TRICHOMEN VAN  ARTEMISIA ANNUA VOOR NEXT‐GENERATION SEQUENCING   

Kim DE MARÉ  Eerste Master in de Farmaceutische Zorg    Promotor  Dr. F. Van Nieuwerburgh     Commissarissen  Prof. Dr. D. Deforce  Dr. A. Heyerick 

                                                                   

   

   

UNIVERSITEIT GENT  FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN   

Vakgroep Geneesmiddelenleer  Laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie  Academiejaar 2009‐2010   

EXTRACTIE VAN mRNA UIT GLANDULAIRE TRICHOMEN VAN  ARTEMISIA ANNUA VOOR NEXT‐GENERATION SEQUENCING   

Kim DE MARÉ  Eerste Master in de Farmaceutische Zorg    Promotor  Dr. F. Van Nieuwerburgh     Commissarissen  Prof. Dr. D. Deforce  Dr. A. Heyerick 

    “De  auteur  en  de  promotor  geven  de  toelating  deze  masterproef  voor  consultatie  beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik  valt  onder  de  beperkingen  van  het  auteursrecht,  in  het  bijzonder  met  betrekking  tot  de  verplichting  uitdrukkelijk  de  bron  te  vermelden  bij  het  aanhalen  van  de  resultaten  uit  deze  masterproef.”   

 

 

 

 

          4 mei 2010 

  Promotor, 

 

 

 

 

 

 

  

     Auteur,    

Dr. Apr. F. Van Nieuwerburgh 

 

 

 

 

 

 

Kim De Maré 

 

 

 

 

 

   

   

 

                             

 

   

DANKWOORD

Bij deze wens ik mijn promotor, Dr. F. Van Nieuwerburgh te bedanken voor zijn promotorschap. In het bijzonder dank ik ook mijn begeleidster, Sandra Soetaert voor haar dagelijkse begeleiding, aanmoediging en goede raad bij het verwezenlijken van deze masterproef. Daarnaast dank ik het personeel van het laboratorium dat altijd bereid was hulp te bieden en uitleg te geven. Ook mijn medestudenten Paulien, Nele, Katrien, Astrid en Tom verdienen dank voor de aangename werksfeer en deugddoende babbel tussendoor. Tenslotte wil ik ook mijn ouders, broer, vriend en mijn vriendinnen bedanken voor de goede zorgen, steun en nodige ontspanning.  

 

    INHOUDSOPGAVE    INHOUDSOPGAVE    LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN    1  INLEIDING ....................................................................................................................... 1  1.1  ACHTERGROND .......................................................................................................... 1  1.1.1  Malaria ....................................................................................................................... 1  1.1.1.1  Historiek ........................................................................................................... 1  1.1.1.2  Pathogenese ..................................................................................................... 2  1.1.1.3  Behandeling en resistentie ............................................................................... 4  1.1.2  Artemisinine ............................................................................................................... 5  1.1.2.1  Bron van artemisinine: Artemisia annua L. ...................................................... 5  1.1.2.2  Werkingsmechanisme van artemisinine .......................................................... 6  1.1.2.3  Biosyntheseplaats van artemisinine: glandulaire trichomen ........................... 7  1.1.2.4  Biosynthese pathway ....................................................................................... 8  1.2  PRODUCTIE VAN ARTEMISININE VERHOGEN ............................................................ 11  1.3  OPHELDEREN BIOSYNTHESE ..................................................................................... 12  1.3.1  Vergelijking apicaal‐subapicaal ................................................................................ 12  1.3.2  Isoleren van cellen: Laser Microdissection Pressure Catapulting ........................... 13  1.3.3  Metabolietstudie ..................................................................................................... 14  1.3.4  Transcriptoomstudie ................................................................................................ 14  1.4  ARTEMISININEPREPARATEN ALS KANKERTHERAPIE ................................................. 15  2  OBJECTIEVEN ................................................................................................................ 17   

    3  MATERIALEN EN METHODEN ....................................................................................... 19  3.1  ALGEMEEN ............................................................................................................... 19  3.1.1  Opkweken van A. annua .......................................................................................... 19  3.1.2  Laser Microdissection Pressure Catapulting ............................................................ 19  3.2  METABOLIETSTUDIE ................................................................................................. 20  3.2.1  Doel .......................................................................................................................... 20  3.2.2  Sampling en staalvoorbereiding .............................................................................. 21  3.2.2.1  Verzamelen van incubatiewater van A. annua .............................................. 21  3.2.2.2  Verzamelen van munttrichomen uit incubatiewater van A. annua .............. 21  3.2.2.3  Verzamelen  van  glandulaire  en  filamenteuze  trichomen  van  A.  annua  na  wassen van versneden bloemknoppen ........................................................................ 21  3.2.2.4  Chloroformextractie van fytopreparaten ....................................................... 22  3.2.3  Kwantitatieve analyse van de stalen ....................................................................... 22  3.2.3.1  Principe: HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS .................................................................. 22  3.2.3.2  Ijklijn ............................................................................................................... 24  3.2.3.3  Chromatografische condities ......................................................................... 25  3.2.3.4  Massaspectrometrische condities ................................................................. 25  3.2.4  Dataverwerking ........................................................................................................ 26  3.3  TRANSCRIPTOOMSTUDIE ......................................................................................... 26  3.3.1  Doel .......................................................................................................................... 26  3.3.2  Sterilisatie van het glaswerk .................................................................................... 27  3.3.3  Concentratie‐ en kwaliteitsbepaling van RNA‐stalen .............................................. 27  3.3.3.1  NanoDrop spectrofotometer ......................................................................... 27  3.3.3.2  RiboGreen RNA Quantitation Kit .................................................................... 28  3.3.3.3  Experion RNA Analysis Kit .............................................................................. 29   

    3.3.4  Vergelijking verschillende extractiekits ................................................................... 29  3.3.4.1  Absolutely RNA Nanoprep Kit ........................................................................ 30  3.3.4.2  RNAqueous®‐Micro Kit ................................................................................... 30  3.3.5  Extractie van een referentiestaal ............................................................................ 30  3.3.6  LMPC stalen ............................................................................................................. 31  3.3.6.1  Preliminaire test ............................................................................................. 31  3.3.6.2  Verschillende samplingvolumes ..................................................................... 32  3.3.6.3  Invloed fixatie ................................................................................................. 32  3.3.7  Optimalisatie met meer plantenmateriaal .............................................................. 33  3.3.7.1  RNA‐extractie uit grote hoeveelheden plantenmateriaal ............................. 33  3.3.7.2  Invloed DNase behandeling ........................................................................... 34  3.3.7.3  Invloed fixatie ................................................................................................. 34  3.3.7.4  Verschillende samplingtijden ......................................................................... 35  3.3.8  Nanoprep bij verschillende temperatuur ................................................................ 35  4  RESULTATEN ................................................................................................................. 36  4.1  METABOLIETSTUDIE ................................................................................................. 36  4.1.1  Concentratiebepaling van artemisinine en zijn biosynthetische precursoren ........ 36  4.1.1.1  In incubatiewater van A. annua ..................................................................... 36  4.1.1.2  In munttrichomen geïsoleerd uit incubatiewater van A. annua .................... 36  4.1.1.3  In  filamenteuze  en  glandulaire  trichomen  na  wassen  van  versneden  bloemknoppen van A. annua ....................................................................................... 37  4.1.2  Concentratiebepaling van artemisinine in fytopreparaten ..................................... 38  4.2  TRANSCRIPTOOMSTUDIE ......................................................................................... 38  4.2.1  Concentratie‐ en kwaliteitsbepaling van RNA‐stalen .............................................. 38  4.2.2  Vergelijking verschillende extractiekits ................................................................... 39  4.2.3  Extractie van een referentiestaal ............................................................................ 40 

    4.2.4  LMPC stalen ............................................................................................................. 41  4.2.4.1  Preliminaire test ............................................................................................. 41  4.2.4.2  Verschillende samplingvolumes ..................................................................... 41  4.2.4.3  Invloed fixatie ................................................................................................. 42  4.2.5  Optimalisatie met meer plantenmateriaal .............................................................. 43  4.2.5.1  Invloed DNase behandeling ........................................................................... 43  4.2.5.2  Invloed fixatie ................................................................................................. 43  4.2.5.3  Verschillende samplingtijden ......................................................................... 44  4.2.6  Nanoprep bij verschillende temperatuur ................................................................ 45  5  DISCUSSIE ..................................................................................................................... 46  5.1  Contaminatie bij metabolietanalyse van apicale en subapicale cellen ..................... 46  5.2  Concentratie van artemisinine in fytopreparaten .................................................... 46  5.3  Optimalisatie RNA‐extractie voor next generation sequencing ................................ 47  6  CONCLUSIE ................................................................................................................... 49  7  LITERATUURLIJST .......................................................................................................... 50                       

    LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN    acetylCoA 

 

 

 

 

acetyl‐coenzyme A 

ACT 

 

 

 

 

 

Artemisinin‐based Combination Therapie 

ADS 

 

 

 

 

 

Amorphadieen synthase 

ATP 

 

 

 

 

 

Adenosine Triphosphate 

cDNA   

 

 

 

 

copy DNA 

DEPC   

 

 

 

 

Diethylpyrocarbonaat 

DHA   

 

 

 

 

Dihydro‐artemisinine 

DMAPP 

 

 

 

 

Dimethylallyldiphosphate 

DNA 

Deoxyribonucleic acid 

DXP 

 

 

 

 

 

Deoxyxylulose‐5‐phosphate 

ESI 

 

 

 

 

 

Electrospray Ionization 

FPP 

 

 

 

 

 

Farnesyldifosfaat 

GGPP   

 

 

 

 

Geranylgeranyldifosfaat 

GPP 

 

 

 

 

 

Geranyldifosfaat 

HBRR   

 

 

 

 

Human Brain Reference RNA 

HIF1‐α  

 

 

 

 

Hypoxie Induceerbare Factor 1α 

HPLC   

 

 

 

 

High Performance Liquid Chromatography 

IPP 

 

 

 

 

 

Isopentenyldifosfaat 

IS 

 

 

 

 

 

Interne Standaard 

LMPC   

 

 

 

 

Laser Microdissection Pressure Catapulting 

MEP   

 

 

 

 

2‐C‐methylerythritol‐4‐phosphate 

mRNA  MVA   

messenger RNA   

 

 

 

Mevalonaat 

    m/z 

 

 

 

 

 

massa‐over‐ladingverhouding 

P.A.L.M. 

 

 

 

 

Photoablation And Laser Microdissection 

PBS 

 

 

 

 

 

Phosphate Buffered Saline 

PCR 

 

 

 

 

 

Polymerase Chain Reaction 

Q‐TOF MS/MS   

Quadrupool Time‐Of‐Flight tandem  massaspectrometrie 

RBC 

 

 

 

 

 

Rode bloedcellen / erythrocyten 

rf  

 

 

 

 

 

radiofrequentie 

RNA   

 

 

 

 

Ribonucleic acid 

rpm 

 

 

 

 

 

rotations per minute 

rRNA   

 

 

 

 

ribosomaal RNA 

SERCA   

 

 

 

 

Sarco‐Endoplasmatisch Reticulum Ca2+ ATPase 

SDS 

 

 

 

 

 

Sodiumdodecylsulfaat 

tRNA   

 

 

 

 

transfer RNA  

VEGF   

 

 

 

 

Vasculair Endotheliale Groeifactor 

VIB 

 

 

 

 

 

Vlaams Instituut voor Biotechnologie 

WHO    

 

 

 

 

World Health Organisation 

 

 

I N L E I D I N G  | 1    1 INLEIDING  1.1

ACHTERGROND 

1.1.1

Malaria 

1.1.1.1

Historiek  Sinds  de  Oudheid  worden  vele  populaties  geteisterd  door  malaria.  In  de  17de  eeuw 

dachten  Italiaanse  wetenschappers  dat  de  infectie  veroorzaakt  werd  door  inademing  van  giftige  dampen  afkomstig  van  moerassen.  Malaria  verwijst  dan  ook  naar  ‘mala  aria’,  wat  ‘slechte lucht’ betekent. De ziekte is meer dan alleen een dodelijke infectie maar vormt ook  een  hindernis  voor  de  economische  ontwikkeling  van  de  getroffen  landen.  Om  die  reden  werd het ophelderen van het mysterie rond de oorzaak en transmissie van malaria de focus  van veel wetenschappelijk onderzoek (Capanna, 2006).  In  1880  beschreef  de  Franse  fysicus  Charles  Louis  Alphonse  Laveran  als  eerste  malariaparasieten in het bloed van patiënten en noemde ze Oscillaria malariae. Later werd  het bestaan van deze parasiet bevestigd door andere onderzoekers die de naam Plasmodium  voorstelden.  Eind  19de  eeuw  werd  ook  de  transmissie  van  malaria  opgehelderd.  Zowel  de  Engelse  fysicus  Ronald  Ross  als  de  Italiaan  Battista  Grassi  ontdekten  dat  malaria  overgedragen wordt via de beet van de vrouwelijke Anopheles mug (Capanna, 2006). Deze  muskiet  wordt  enkel  in  tropische  gebieden  met  malaria  besmet,  aangezien  de  parasieten  niet overleven bij middelmatige temperaturen (de Ridder et al., 2008).  Malaria  blijft  daarom  vooral  een  belangrijk  gezondheidsprobleem  in  tropische  gebieden  zoals  delen  van  Azië,  Zuid‐Amerika  en  vooral  het  Sub‐Saharisch  Afrika  waar  90%  van de doden veroorzaakt wordt door malaria (Greenwood & Mutabingwa, 2002). Over de  hele  wereld  worden  jaarlijks  zo’n  515  miljoen  mensen  ziek  en  veroorzaakt  de  ziekte  één à  drie miljoen doden. Aangezien vele landen zich geen dure campagnes kunnen veroorloven, is  een effectieve en betaalbare behandeling vereist (Miller et al., 2002).  Er zijn echter steeds nieuwe medicijnen nodig omdat malariaparasieten in staat zijn  tot snelle ontwikkeling van resistentie. Het eerste antimalariamiddel, quinine, werd gemaakt  uit  de  schors  van  de  Cinchona  boom.  Later  werd  het  van  quinine  afgeleide  synthetisch  middel  chloroquine  ontwikkeld,  wat  veilig  en  goedkoop  was.  Nadeel  is  het  ontstaan  van 

I N L E I D I N G  | 2    chloroquine‐resistente Plasmodium parasieten (Tuteja, 2007). Ook andere malariamiddelen  vertonen  steeds  meer  resistentieproblemen.  In  de  jaren  ’60  werd  artemisinine  ontdekt  als  nieuw  antimalariamiddel  waartegen  tot  nu  toe  geen  zorgwekkende  resistentieproblemen  zijn vastgesteld. Sindsdien raadt de Wereld Gezondheid Organisatie (WHO) het gebruik van  combinatietherapieën  aan  gebaseerd  op  artemisinine  of  semisynthetische  artemisinine‐ derivaten (Olliaro & Taylor, 2004).   In  de  toekomst  kan  malaria  zich  verspreiden  naar  regio’s  die  tot  op  de  dag  van  vandaag als veilig gezien werden. Het voorkomen van de malariaparasiet hangt namelijk af  van  klimatologische  factoren  zoals  temperatuur,  vochtigheid  en  neerslag.  Vooral  de  temperatuur  is  kritisch  aangezien  malariaparasieten  geen  volledige  levenscyclus  kunnen  doormaken  bij  temperaturen  lager  dan  20  °C  en  dus  niet  verder  kunnen  overgedragen  worden.  Als  gevolg  van  de  opwarming  van  de  Aarde  en  de  ontwikkeling  van  resistentie  wordt verwacht dat malaria zich verder zal verspreiden (de Ridder et al., 2008).  1.1.1.2

Pathogenese  Malaria wordt veroorzaakt door parasieten behorend tot het genus Plasmodium dat 

meer  dan  125  species  bevat  die  reptielen,  vogels  en  zoogdieren  infecteren.  Vier  types  infecteren  de  mens:  P.  falciparum,  P.  vivax,  P.  malariae  en  P.  ovale.  Het  is  de  vrouwelijke  Anopheles  mug  die  de  parasieten  draagt  en  verantwoordelijk  is  voor  hun  transmissie.  Plasmodium  falciparum  is  de  meest  kwaadaardige  van  de  vier  species.  Infectie  met  deze  parasiet veroorzaakt de zogenaamde malaria tropica of cerebrale malaria (de Ridder et al.,  2008).  De  symptomen  van  malaria  zijn  niet‐specifiek  zoals  koortsaanvallen,  rillingen,  misselijkheid, hoofdpijn, pijn in rug en ledematen, enz. Cerebrale malaria, veroorzaakt door  Plasmodium faliciparum, wordt naast deze niet‐specifieke symptomen ook gekenmerkt door  verstopping  van  de  nauwe  bloedvaten  van  vitale  organen,  zoals  de  hersenen.  Plasmodium  falciparum  produceert  namelijk  adhesieve  proteïnen  zodat  geïnfecteerde  rode  bloedcellen  aan de wanden van de nauwe bloedvaten kleven. Op die manier wordt passage doorheen de  milt verhinderd en kan het immuunsysteem niet geactiveerd worden. De verstopping van de  nauwe  bloedvaten  verhindert  ook  de  doorbloeding  van  de  vitale  organen.  Indien  onbehandeld, leidt deze vorm van malaria binnen enkele uren of dagen tot de dood. 

I N L E I D I N G  | 3    In  de  ontwikkeling  van  de  malariaparasiet  onderscheiden  we  drie  cycli:  een  exo‐ erythrocytaire, een erythrocytaire en een sporogene cyclus, zoals geïllustreerd in Figuur 1.1.     

FIGUUR  1.1.  :  LEVENSCYCLUS  MALARIAPARASIET:  1.  INJECTIE  VAN  SPOROZOIETEN  IN  DE  HUID  2.  SPOROZOIETEN  VERMENIGVULDIGEN  ZICH  IN  HEPATOCYTEN.  3.  LEVERCELLEN  BARSTEN  OPEN  MET  VRIJSTELLING VAN MEROZOIETEN IN DE BLOEDBAAN. 4. MEROZOIETEN VERMENIGVULDIGEN ZICH IN  RBC  5.  RBC  BARSTEN  OPEN  EN  TROFOZOIETEN  DRINGEN  NIEUWE  ERYTHROCYTEN  BINNEN.  6.  IN  SOMMIGE  RBC  ONTWIKKELEN  MEROZOIETEN  ZICH  TOT  GAMETOCYTEN.  7.  OPNAME  VAN  GAMETOCYTEN  DOOR  NIEUWE  ANOPHELES  MUG.  8.  NA  BEVRUCHTING  IN  DE  ANOPHELES  MUG  VORMEN  GAMETOCYTEN  ZICH  OM  TOT  OÖCYSTEN.  9.  OÖCYSTEN  PRODUCEREN  OPNIEUW  SPOROZOIETEN. 

1. Een malaria‐infectie begint met een beet van een geïnfecteerde muskiet, waarbij  sporozoieten geïntroduceerd worden in de huid. De sporozoieten vinden snel hun  weg  naar  de  lever  waar  ze  hepatocyten  invaderen.  Binnenin  de  hepatocyten  vermenigvuldigen  en  differentiëren ze  waardoor  extra‐erythrocytaire  schizonten  ontstaan die een paar duizenden merozoieten bevatten.  2. Na een bepaalde incubatietijd breken de levercellen open waardoor merozoieten  vrijgesteld worden in de bloedbaan die rode bloedcellen infecteren. Na een fase  van vermenigvuldiging en differentiatie ontstaan erythrocytaire schizonten. Deze  bevatten  een  klein  aantal  trofozoieten,  die  op  hun  beurt  nieuwe  erythrocyten  invaderen. 

I N L E I D I N G  | 4    3. In  sommige  rode  bloedcellen  ontwikkelen  merozoieten  zich  tot  mannelijke  en  vrouwelijke  gametocyten,  die  slapend  in  de  bloedbaan  blijven  tot  ze  opgepikt  worden  in  het  bloedmaal  van  een  nieuwe  bijtende  Anopheles  mug.  Na  bevruchting  in  de  muskiet  verlaten  ze  de  maag  en  vormen  ze  oöcysten,  die  op  hun  beurt  sporozoieten  produceren.  Deze  migreren  naar  de  speekselklieren  en  kunnen zo bij een volgende beet aan de mens overgedragen worden.  1.1.1.3

Behandeling en resistentie  Sinds de ontdekking van het antimalariamiddel quinine werd malaria behandeld met 

op quinoline gebaseerde geneesmiddelen zoals chloroquine, mefloquine, primaquine en met  antifolaten zoals sulfadoxine‐pyrimethamine (Wongsrichanalai et al., 2002). Deze middelen,  die in het verleden de voornaamste aanpak vormden tegen malaria, zijn nu ondoeltreffend  in de meeste malariagebieden wegens het ontstaan van resistentie (de Ridder et al., 2008).  Om die reden was er in de farmaceutische industrie nood aan nieuwe antimalariamiddelen.   Eind  jaren  60  zijn  Chinese  wetenschappers  op  zoek  gegaan  naar  nieuwe  geneesmiddelen  tegen  malaria.  Planten  die  gebruikt  werden  in  de  traditionele  Chinese  geneeskunde  werden  getest.  Artemisia  annua  L.  en  extracten  van  deze  plant  toonden  een  goede  antimalaria‐activiteit.  Over  de  jaren  heen  werd  de  actieve  stof,  artemisinine,  uit  de  plant  geïsoleerd  en  de  structuur  opgehelderd.  Naast  deze  component  werden  ook  semisynthetische derivaten zoals artemether, arteether en artesunaat ontwikkeld (Davis et  al., 2005).   Tot  nu  toe  is  nog  geen  zorgwekkende  resistentie  tegen  artemisinine  gesignaliseerd.  Een  studie  in  2009  rapporteert  echter  wel  een  verminderde  gevoeligheid  aan  artemisinine  bij  bepaalde  personen  in  West‐Cambodja,  waar  artemisinine  meer  dan  30  jaar  als  monotherapie beschikbaar was (Dondorp et al., 2009; Maude et al., 2009). Om resistentie te  vermijden, 

raadt 

De 

Wereld 

Gezondheid 

Organisatie 

artemisinine‐gebaseerde 

combinatietherapieën  (ACT)  aan  als  behandeling  tegen  malaria  (Covello,  2008).  Onder  combinatietherapie verstaat men het simultaan gebruik van twee of meer geneesmiddelen  met  een  verschillend  werkingsmechanisme.  Op  die  manier  kan  resistentie  tegen  de  afzonderlijke  geneesmiddelen  uitgesteld  worden.  Nadelen  van  combinatietherapie  zijn  echter de hogere kosten en het grotere risico op nevenwerkingen. 

I N L E I D I N G  | 5    1.1.2

Artemisinine 

1.1.2.1

Bron van artemisinine: Artemisia annua L.  Artemisia  annua  behoort  tot  de  familie  van  de  Asteraceae,  een  plantenfamilie  die 

deel uitmaakt van de klasse van de Magnoliopsida. Het is een eenjarige struik van 50‐150 cm  hoog. De plant is ook gekend als zomeralsem of zoete alsem en vindt zijn oorsprong in China,  waar het gekend is als qing hao (de Ridder et al., 2008).  Volgens  sommigen  is  de  plant  genoemd  naar  Artemis,  de  Griekse  godin  van  de  vruchtbaarheid,  aangezien  bepaalde  planten  van  dit  genus  gebruikt  werden  om  bevallingspijn  te  controleren.  Belangrijker  is  dat  Artemisia  annua  nu  wereldwijd  gekend  is  voor  zijn  antimalaria‐eigenschappen  (Willcox  et  al.,  2009).  Het  actieve  bestanddeel  is  artemisinine. Aangezien chemische synthese van artemisinine een duur meerstappenproces  is,  rest  de  plant  als  enige  commerciële  bron  van  het  geneesmiddel.  Het  probleem  is  dat  artemisinine slechts in kleine hoeveelheden aanwezig is in de bladeren en bloemen van de  plant,  namelijk  0,01  %  à  0,8  %  van  het  droge  gewicht  (van  Agtmael  et  al.,  1999).  Naast  Artemisia  annua  is  artemisinine  ook  aanwezig  in  Artemisia  apiacea  en  Artemisia  lancea,  echter in nog kleinere hoeveelheden (Hsu, 2006).                    FIGUUR 1.2. : MORFOLOGIE EN CLASSIFICATIE VAN ARTEMISIA ANNUA L. (de Ridder et al., 2008). 

I N L E I D I N G  | 6    1.1.2.2

Werkingsmechanisme van artemisinine  In 1972 werd de structuur van artemisinine gedefinieerd als een sesquiterpeen lacton 

met  een  endoperoxidebrug  (Ferreira  &  Janick,  1996),  geïllustreerd  in  Figuur  1.3.  De  endoperoxidebrug  is  verantwoordelijk  voor  de  antimalaria  activiteit.  De  complexe  ringstructuur is niet noodzakelijk voor de activiteit maar kan essentieel zijn voor de stabiliteit  van de molecule.         FIGUUR  1.3.  :  STRUCTUUR  VAN  ARTEMISININE  (Willcox  et  al.,  2009);  EEN  SESQUITERPEEN  LACTON MET ENDOPEROXIDEBRUG. 

Artemisinineverbindingen  induceren  een  snelle  reductie  van  malariaparasieten  praktisch onmiddellijk na toediening aan de patiënt (Balint, 2001). Artemisinine is niet alleen  actief  tegen  malaria  maar  zou  ook  werkzaam  zijn  tegen  bepaalde  kankers,  virale  infecties,  hepatitis en als pesticide (Romero et al., 2005; Efferth, 2007; Firestone & Sundar, 2009).  Het exacte werkingsmechanisme van artemisinine tegen malaria is nog ongekend. Er  worden twee hypothesen voorgesteld. Beide steunen op de activatie van de endoperoxide  groep waarbij reactieve species gevormd worden (de Ridder et al., 2008). Volgens de eerste  hypothese  interfereert  artemisinine  met  het  SERCA  of  sarco‐endoplasmatisch  reticulum  ATPase van Plasmodium falciparum (Eckstein‐Ludwig et al., 2003; Liu et al., 2006). Het SERCA  is verantwoordelijk voor het behoud van de calciumconcentraties, die belangrijk zijn voor de  correcte  post‐translationale  modificatie  van  proteïnen.  Er  is  aangetoond  dat  artemisinine  hydrofobe  interacties  aangaat  met  het  SERCA  waardoor  de  endoperoxidebrug  gesplitst  wordt  met  vrijstelling  van  koolstofradicalen  tot  gevolg.  Het  tweede  voorgestelde  mechanisme  berust  op  de  vorming  van  reactieve  species  door  interactie  met  de  geïnfecteerde rode bloedcellen. Er werd gevonden dat de heemgroep of Fe2+ het breken van  de endoperoxidebrug in artemisinine katalyseert met vorming van vrije radicalen tot gevolg.  De gevormde koolstofradicalen kunnen essentiële proteïnen en DNA alkyleren wat leidt tot  de dood van de malariaparasieten (de Ridder et al., 2008). 

I N L E I D I N G  | 7    1.1.2.3

Biosyntheseplaats van artemisinine: glandulaire trichomen  Artemisinine  wordt  gesynthetiseerd  in  een  specifiek  soort  cellen  van  Artemisia 

annua, namelijk de glandulaire trichomen (geïllustreerd in Figuur 1.4). In het algemeen zijn  trichomen  de  haren  die  voorkomen  op  het  oppervlak  van  de  meeste  planten.  Ze  worden  beschouwd als uitsteeksels van de epidermis en zijn genoemd naar het Griekse ‘trichos’ wat  ‘haar’  betekent.  De  functie  van  trichomen  bestaat  in  de  verdediging  van  de  plant  tegen  herbivoren en insecten. Dit doen ze door sterische hinder en productie van toxines (Wagner  et  al.,  2004;  Romero  et  al.,  2008).  Daarnaast  vormen  ze  een  belangrijke  biosyntheseplaats  van  secundaire  metabolieten  die  gebruikt  kunnen  worden  voor  farmacologische  en  economische doeleinden.  Bij  Artemisia  annua  onderscheiden  we  twee  types  trichomen:  de  glandulaire  en  de  niet‐glandulaire  of  filamenteuze  trichomen.  Aangezien  enkel  de  glandulaire  trichomen  artemisinine produceren, zal deze scriptie enkel op dit type verdergaan. Vooral de bladeren  en de stengels van deze species zijn bedekt met glandulaire trichomen (Duke & Paul, 1993).  Vanuit  morfologisch  standpunt  zijn  de  glandulaire  trichomen  van  het  Artemisia  genus  10‐ cellig, bestaande uit twee apicale cellen, vier subapicale cellen, twee basale cellen en twee  stalk  cellen  (Duke  &  Paul,  1993).  De  stalk  cellen  staan  in  voor  de  vasthechting  van  de  trichomen  aan  de  epidermis.  De  glandulaire  trichomen  bevatten  ook  een  klierblaas  of  subcuticulaire  ruimte  die  dienst  doet  als  opslagplaats  voor  artemisinine  en  andere  sesquiterpenoïden  (Duke  &  Paul,  1993;  Van  Nieuwerburgh  et  al.,  2006),  alsook  voor  monoterpenoïden (Tellez et al., 1999).             

FIGUUR 1.4. : 10‐CELLIG GLANDULAIR TRICHOOM OP EEN BLOEMKNOP VAN ARTEMISIA ANNUA L.  (Scan gemaakt met het P.A.L.M. Laser Microbeam System 10x40x) 

I N L E I D I N G  | 8    Er  zijn  belangrijke  morfologische  verschillen  gerapporteerd  tussen  de  apicale  en  subapicale  cellen  van  de  glandulaire  trichomen.  Bijvoorbeeld  in  de  aanwezigheid  van  chloroplasten:  enkel  de  vier  subapicale  cellen  bevatten  chloroplasten  (Olsson  et  al.,  2009).  Deze  cellen  met  fotosynthetische  activiteit  doen  waarschijnlijk  dienst  als  energie‐  en  koolstofbron voor het metabolisme in de aangrenzende apicale cellen.    1.1.2.4

Biosynthese pathway  Inzicht  in  de  biosynthese  pathway  van  artemisinine  en  karakterisatie  van  de 

betrokken enzymen is noodzakelijk om de productie van artemisinine te kunnen verhogen.  In de literatuur heerst nog verwarring, maar dankzij recente studies is de pathway voor het  grootste  deel  opgehelderd  (Bertea  et  al.,  2005;  Covello,  2008;  Zhang  et  al.,  2008).  Een  overzicht van de biosynthese pathway van artemisinine wordt gegeven in Figuur 1.5.  Artemisinine  behoort  tot  de  groep  van  de  isoprenoïden.  De  termen  ‘isoprenoïden’,  ‘terpenoïden’  en  ‘terpenen’  duiden  algemeen  de  gehele  klasse  van  verbindingen  aan  afgeleid  van  de  universele  precursoren  isopentenyldifosfaat  (IPP)  en  zijn  isomeer  dimethylallyldifosfaat (DMAPP). Er zijn twee onafhankelijke biosynthetische pathways die tot  de  vorming  van  IPP  en  DMAPP  leiden:  de  mevalonaat  pathway  (MVA)  gelokaliseerd  in  het  cytosol en de mevalonaat‐onafhankelijke pathway (MEP) in de plastiden (Withers & Keasling,  2007).  De  mevalonaat  pathway  start  met  de  samensmelting  van  drie  molecules  acetylCoA  met  vorming  van  mevalonaat  gevolgd  door  fosforylatie  tot  difosfomevalonaat,  wat  gedecarboxyleerd  wordt  tot  IPP  en  zijn  isomeer  DMAPP.  De  mevalonaat‐onafhankelijke  pathway  begint  met  de  condensatie  van  pyruvaat  en  glyceraldehyde‐3‐fosfaat  tot  1‐ deoxyxylulose‐5‐fosfaat (DXP). Via intermoleculaire herschikking ontstaat hieruit 2‐C‐methyl‐ D‐erythritol 4‐fosfaat (MEP). MEP wordt vervolgens via een reeks van reacties omgezet tot  IPP (Withers & Keasling, 2007).  IPP  en  DMAPP  worden  door  terpeen  synthases  omgezet  tot  de  C10,  C15  en  C20  precursoren,  respectievelijk  geranyldifosfaat  (GPP),  farnesyl  difosfaat  (FPP)  en  geranylgeranyldifosfaat (GGPP).   De  cyclisatie  van  farnesyldifosfaat  tot  amorpha‐4,11‐dieen  wordt  beschouwd  als  de  eerste  stap  in  de  biosynthese  van  artemisinine.  Het  enzym  amorpha‐4,11‐dieen  synthase 

I N L E I D I N G  | 9    (ADS)  katalyseert  deze  stap  (Bouwmeester  et  al.,  1999).  Vervolgens  wordt  amorpha‐4,11‐ dieen  via  oxidatie  op  C12  omgezet  tot  artemisinine  alcohol.  Deze  eerste  stappen  in  de  biosynthese  worden  ondersteund  door  verschillende  biochemische  studies,  de  volgende  stappen zijn nog onderwerp van discussie.  Volgens Bertea et al. (2005) wordt artemisinine alcohol geoxideerd tot artemisinine  aldehyde. Vanaf dit punt worden twee routes gesuggereerd. Volgens sommigen volgt er een  oxidatie 

tot 

artemisininezuur, 

dihydroartemisininezuur. 

Het 

is 

anderen  nog 

niet 

suggereren  duidelijk 

een  of 

omzetting 

artemisininezuur 

tot  of 

dihydroartemisininezuur de hoofdprecursor is van artemisinine. Recente bevindingen tonen  echter aan dat zowel artemisininezuur als dihydroartemisininzuur omgezet kunnen worden  tot artemisinine (Brown & Sy, 2004; Brown & Sy, 2007). De omzetting van artemisininezuur  tot zowel arteannuin B als artemisinine werd volgens Liu et al. (2006) ook gerapporteerd in  Sangwan et al. (1993). Er werden echter nog geen enzymen voor deze stap geïdentificeerd.  Hoogst  waarschijnlijk  treden  beide  verbindingen  dus  samen  op  als  de  twee  hoofdprecursoren van artemisinine.  Teoh  et  al.  (2006)  toonden  aan  dat  een  cytochroom  P450,  CYP71AV1,  de  oxidatie  katalyseert  van  de  biosynthetische  intermediairen  amorphadieen,  artemisinine  alcohol,  artemisinine  aldehyde  en  dihydroartemisinine  aldehyde.  Zhang  et  al.  (2008)  karakteriseerden  een  artemisinine  aldehyde  Δ11(13)  reductase,  wat  suggereert  dat  dihydroartemisininezuur  gevormd  wordt  via  reductie  van  artemisinine  aldehyde  tot  dihydroartemisinine  aldehyde  en  vervolgens  oxidatie  tot  dihydroartemisininezuur.  Voor  de  omzetting  van  dihydroartemisininezuur  tot  artemisinine  werden  nog  geen  enzymen  gevonden.  Er  is  een  vermoeden  dat  de  omzetting  via  een  serie  van  niet‐enzymatische  reacties zou plaatsvinden (Brown and Sy, 2004; Teoh et al., 2006; Zhang et al., 2008). 

I N L E I D I N G  | 10   

 

FIGUUR 1.5. : BIOSYNTHESE PATHWAY VAN ARTEMISININE (aangepast van Liu et al., 2006) 

I N L E I D I N G  | 11    1.2

PRODUCTIE VAN ARTEMISININE VERHOGEN  Door  het  wereldwijde  gebruik  van  artemisinine  gebaseerde  combinatietherapieën 

(ACT)  is  de  vraag  naar  artemisinine  groot.  Aangezien  Artemisia  annua  slechts  kleine  hoeveelheden  aanmaakt  (0,01  –  0,8  %)  en  chemische  totaalsynthese  economisch  niet  haalbaar  is,  heerst  er  tegenwoordig  een  tekort  aan  artemisinine.  In  het  verleden  werden  vele pogingen ondernomen om de productie van artemisinine te verhogen, zowel in vivo als  in vitro (Abdin et al., 2003).  In  eerste  instantie  kan  de  productie  in  vivo  verhoogd  worden  door  kruising  van  verschillende  plantentypes.  De  hoeveelheid  aan  artemisinine  en  biosynthetische  precursoren  varieert  in  planten  van  verschillende  origine.  Dit  wijst  op  het  feit  dat  er  verschillende chemotypes van Artemisia annua bestaan. Selectie en kruising van types met  een  hoge  concentratie  aan  artemisinine  gaf  aanleiding  tot  hybride  planten  die  tot  1.4  %  artemisinine  bevatten  (Delabays  et  al.,  2001).  Deze  hoeveelheden  zijn  echter  nog  te  laag  voor  een  efficiënte  commerciële  productie  van  artemisinine.  Daarnaast  blijken  ook  de  resultaten  van  in  vitro  methoden  niet  veelbelovend.  In  vitro  culturen  van  Artemisia  annua  bevatten  tot  nu  toe  lagere  concentraties  artemisinine  dan  de  intacte  plant  (Abdin  et  al.,  2003).  Een  andere  benadering  is  de  aanmaak  van  artemisinine  of  biosynthetische  precursoren  in  gistcellen.  Ro  et  al.  (2006)  rapporteerde  de  genetische  modificatie  van  Saccharomyces  cerevisiae  voor  de  productie  van  grote  hoeveelheden  artemisininezuur.  De  gistcellen werden in drie stappen gemodificeerd. In eerste instantie werd de productie van  farnesyldifosfaat  (FPP)  verhoogd  door  de  upregulatie  van  de  expressie  van  verscheidene  genen  verantwoordelijk  voor  de  FPP  synthese  en  door  downregulatie  van  een  gen  verantwoordelijk voor de omzetting van FPP tot sterolen. Daarna werd het amorphadieen‐ synthase‐gen  afkomstig  van  Artemisia  annua  in  de  gistcellen  geïntroduceerd  zodat  de  omzetting  van  FPP  tot  amorphadieen  kan  plaatsvinden.  Als  laatste  stap  werd  een  nieuw  cytochroom  P450  gekloneerd  dat  instaat  voor  de  oxidatie  van  amorphadieen  tot  artemisininezuur.  Het  gesynthetiseerde  artemisininezuur  wordt  uit  de  gistcel  getransporteerd  zodat  slechts  een  eenvoudige  opzuiveringsstap  nodig  is.  Dit  artemisininezuur  is  dan  geschikt  voor  een  kostenefficiënte  semisynthese  van  artemisinine.  De gistcellen produceren grotere hoeveelheden artemisininezuur dan Artemisia annua. Toch 

I N L E I D I N G  | 12    is  er  verdere  optimalisatie  vereist  om  de  productie  tot  een  niveau  te  brengen  dat  hoog  genoeg  is  om  de  huidige  kosten  van  de  artemisinine  gebaseerde  combinatietherapieën  te  reduceren (Ro et al., 2006).  Zowel  de  klassieke  als  de  biotechnologische  pogingen  hebben  als  doel  artemisinine  beschikbaar  te  maken  aan  aanvaardbare  prijzen.  Tot  nu  toe  is  nog  geen  economisch  haalbare  methode  gevonden  om  artemisinine  op  grote  schaal  te  produceren.  Meer  duidelijkheid  omtrent  de  biosynthese  pathway  van  artemisinine  kan  helpen  om  hierin  vorderingen te maken.   1.3

OPHELDEREN BIOSYNTHESE 

1.3.1

Vergelijking apicaal‐subapicaal  Wat  betreft  de  biosynthese  van  artemisinine  zijn  er  belangrijke  verschillen 

geapporteerd  tussen  apicale  en  subapicale  cellen  van  de  glandulaire  trichomen  van  Artemisia annua. Zo toonden Olsson et al. (2009) aan dat de tot nu toe gekende enzymen  nodig  voor  de  artemisinine  biosynthese  gelokaliseerd  zijn  in  de  apicale  cellen.  Hiervoor  extraheerden  ze  RNA  uit  volledige  glandulaire  trichomen,  apicale  en  subapicale  cellen.  Uit  het  RNA  werd  cDNA  gesynthetiseerd  dat  vervolgens  dienst  deed  als  template  in  een  PCR  amplificatie  van  de  gekende  transcripten  coderend  voor  de  artemisinine  biosynthese‐ enzymen. Hieruit bleek dat de transcripten coderend voor de drie enzymen:  amorphadieen  synthase,  cytochroom  P450  monoöxygenase  CYP71AV1  en  artemisinine  aldehyde  Δ11(13)  reductase  enkel  uit  de  apicale  cellen  geamplificeerd  werden.  Er  werd  geen  amplificatie  gedetecteerd  in  de  subapicale  cellen.  Hoogstwaarschijnlijk  wordt  artemisinine  dus  enkel  gesynthetiseerd in de apicale cellen van de glandulaire trichomen. Aangezien de laatste stap  naar  artemisinine  in  de  biosynthese  nog  opgehelderd  moet  worden,  bestaat  er  geen  zekerheid dat ook deze stap in de apicale celen plaatsvindt.   Om ontbrekende stappen in de biosynthese van artemisinine te ontrafelen, zullen we  apicale  cellen,  die  vermoedelijk  wel  artemisinine  produceren,  vergelijken  met  subapicale  cellen,  die  geen  artemisinine  produceren.  Dit  kan  uiteindelijk  nuttige  informatie  opleveren  om de productie van artemisinine efficiënt te verhogen.    

I N L E I D I N G  | 13    1.3.2

Isoleren van cellen: Laser Microdissection Pressure Catapulting  Wegens technische beperkingen werd men in vroegere studies gedwongen om gebruik 

te  maken  van  volledige  weefsels,  waardoor  celspecifieke  verschillen  gemaskeerd  werden.  Om de functie van apicale en subapicale cellen volledig te begrijpen, is echter een methode  vereist voor de specifieke isolatie van deze cellen uit het plantenweefsel.  De afgelopen jaren werd een techniek ontwikkeld waarvoor geen specifieke merkers  vereist  zijn,  namelijk  Laser  Microdissection  Pressure  Catapulting  (LMPC)  (Day  et  al.,  2005).  LMPC maakt gebruik van een UV‐laser om specifieke targets los te snijden uit weefsels die  gevisualiseerd  worden  met  conventionele  microscopie.  Plantenmateriaal  is  uitermate  geschikt  voor  deze  techniek:  hun  regelmatige  weefselstructuur  en  stabiele  celwanden  vergemakkelijkt  visuele  identificatie  van  de  meeste  celtypes.  De  losgesneden  doelwitcel  wordt bij deze techniek van op het microscoopglaasje in een epje gekatapulteerd (Nelson et  al., 2006). Op die manier kunnen volledige glandulaire trichomen op een efficiënte manier  verzameld  worden.  Een  aangepaste  weefselvoorbereiding,  namelijk  fixatie  met  4%  formaldehyde,  maakt  het  mogelijk  om  ook  apicale  cellen  en  subapicale  cellen  van  de  glandulaire  trichomen  te  isoleren  (Olsson  et  al.,  2009).  Fixatie  is  nodig  voor  de  stabilisatie  van  de  celinhoud  en  het  bewaren  van  de  weefselintegriteit  tijdens  dit  proces.  Dit  staat  in  competitie  met  het  feit  dat  een  groot  deel  van  het  RNA  door  formaldehyde‐fixatie  gecrosslinked wordt en de RNA‐extractie dus negatief beïnvloedt (Kerk et al., 2003).  LMPC  heeft  als  voordeel  dat  het  snel  en  efficiënt  is  en  dat  contaminatie  met  ongewenst  plantenmateriaal  tot  een  minimum  beperkt  is.  Door  manipulatie  op  cellulair  niveau  kan  de  targetcel  namelijk  geïsoleerd  worden  van  naburige  weefsels  (Nelson  et  al.,  2006).   

FIGUUR 1.6. : MICRODISSECTIE VAN GLANDULAIRE TRICHOMEN VAN A. ANNUA (Olsson et al., 2009). (A)  INTACT  GEFIXEERD  GLANDULAIR  TRICHOOM.  (B)  TRICHOOM  NA  DISSECTIE  EN  COLLECTIE  VAN HET  PAAR  APICALE  CELLEN.  (C)  OVERBLIJVENDE  CELLEN  NA  DISSECTIE  EN  COLLECTIE  VAN  DE  VIER SUBAPICALE  CELLEN.  (D)  APICAAL  CELPAAR  NA  DISSECTIE  EN  VÓÓR  COLLECTIE.  (E)  TWEE  PAAR SUBAPICALE CELLEN NA DISSECTIE EN VÓÓR COLLECTIE. 

I N L E I D I N G  | 14    1.3.3

Metabolietstudie   Verdergaand op de vergelijkende studie van apicale en subapicale cellen uitgevoerd 

door  Olsson  et  al.  (2009),  besproken  bij  1.3.1,  werd  vorig  jaar  een  metabolietstudie  uitgevoerd. Deze studie had als doel te testen dat de volledige artemisinine biosynthese in  de apicale cellen plaatsvindt. In de studie van Olsson et al. (2009) werden namelijk enkel de  gekende enzymen bekeken. Er is dus geen zekerheid dat ook de laatste biosynthese‐stappen,  waarvan  het  mechanisme  ongekend  is,  ook  in  de  apicale  cellen  plaatsvindt.  Om  dit  na  te  gaan,  werden  de  concentraties  aan  artemisinine  en  zijn  biosynthetische  precursoren  in  apicale  en  subapicale  cellen  vergeleken  nadat  deze  met  LMPC  verzameld  werden  (Van  Valckenborgh,  2009).  Deze  analyse  werd  verschillende  keren  uitgevoerd.  In  sommige  gevallen werd artemisinine enkel in de apicale cellen gedetecteerd, waardoor de hypothese  ontstond  dat  artemisinine  inderdaad  enkel  in  de  apicale  cellen  geproduceerd  wordt.  Maar  aangezien  de  resultaten  in  deze  studie  veel  variatie  vertoonden,  kon  toch  geen  eenduidig  besluit  gevormd  worden.  Daarom  werden  op  dezelfde  manier  filamenteuze  trichomen  verzameld.  Ook  hier  werd  artemisinine  gedetecteerd,  alhoewel  artemisinineproductie  in  filamenteuze  trichomen  nog  nooit  gerapporteerd  werd.  Om  die  reden  ontstond  er  een  vermoeden  dat  er  sprake  is  van  contaminatie.  Normaal  is  bij  LMPC  contaminatie  tot  een  minimum beperkt maar omdat deze techniek hier in water uitgevoerd wordt, is het mogelijk  dat  metabolieten  in  het  water  migreren  en  zo  contaminatie  veroorzaken.  Om  deze  contaminatie  al  dan  niet  te  bevestigen,  werden  een  aantal  testen  uitgevoerd  die verder  in  deze scriptie besproken worden.  1.3.4

Transcriptoomstudie  Naast  een  metabolietstudie  kan  ook  een  transcriptoomanalyse  uitgevoerd  worden. 

Hierbij wordt het transcriptoom van apicale cellen vergeleken met dat van subapicale cellen.  Het transcriptoom is de verzameling aan RNA van een specifieke cel en geeft informatie over  welke eiwitten tot expressie komen in de cel. Voor de transcriptoomanalyse moet dus eerst  het RNA uit de apicale en subapicale cellen geëxtraheerd worden. Indien het geëxtraheerde  RNA  van  voldoende  hoge  kwaliteit  is,  kan  vervolgens  het  volledige  transcriptoom  gesequeneerd worden.  

I N L E I D I N G  | 15    Gebaseerd  op  het  artikel  van  Olsson  et  al.  (2009)  zal  in  deze  studie  ook  RNA  geëxtraheerd worden uit apicale en subapicale cellen verzameld via LMPC. De bedoeling is  echter  om  RNA  van  hoge  kwaliteit  te  bekomen  zodat  later  de  volledige  lengte  van  het  transcriptoom  gesequeneerd  kan  worden.  Op  die  manier  kan  niet  alleen  de  expressie  van  gekende  enzymen  gedetecteerd  worden,  zoals  bij  Olsson  et  al.  (2009),  maar  is  het  ook  mogelijk om ongekende enzymen te ontdekken. Dit zou bijvoorbeeld inzicht kunnen geven in  het tot nu toe nog ongekende mechanisme van de laatste stap in de biosynthese.  Na de RNA‐extractie zal gebruik gemaakt worden van state of the art next generation  sequencing.  Eind  2009  werd  reeds  de  sequenering  van  het  transcriptoom  van  volledige  glandulaire  trichomen  uit  Artemisia  annua  gerapporteerd  (Wang  et  al.,  2009).  In  deze  scriptie is het echter de bedoeling om het transcriptoom te sequeneren van apicale cellen en  subapicale cellen afzonderlijk, in tegenstelling tot de volledige glandulaire trichomen zoals in  Wang  et  al.  (2009).  Op  die  manier  kan  het  transcriptoom  van  apicale  cellen  vergeleken  worden  met  dat  van  subapicale  cellen  en  kan  meer  inzicht  verkregen  worden  in  de  biosynthese  pathway  van  artemisinine.  In  eerste  instantie  wordt  op  zoek  gegaan  naar  ongekende  enzymen  die  een  rol  spelen  bij  de  biosynthese  van  artemisinine,  vooral  het  mechanisme  van  de  laatste  stap  moet  nog  opgehelderd  worden.  Ten  tweede  kan  ook  gezocht  worden  naar  transcriptiefactoren.  Daarnaast  zijn  er  hoogst  waarschijnlijk  ook  membraantransportproteïnen  aanwezig  die  artemisinine  uit  de  glandulaire  trichomen  pompen, wat ook met deze transcriptoomanalyse nagegaan kan worden.   1.4

ARTEMISININEPREPARATEN ALS KANKERTHERAPIE  Artemisinine  is  vooral  gekend  als  antimalaria‐middel.  De  afgelopen  jaren  blijken 

artemisinine en zijn biosynthetische derivaten echter ook werkzaam te zijn tegen bepaalde  types kanker (Nakase et al., 2008). Interessant is dat het cytotoxisch effect van artemisinine  specifiek is voor kankercellen en dus geen gezonde lichaamscellen aantast. De cellen worden  gedood  door  vrije  radicalen  gevormd  door  openbreken  van  de  endoperoxide  brug  na  interactie met Fe2+. Omdat kankercellen wegens hun snelle proliferatie nood hebben aan de  opname van grote hoeveelheden ijzer brengen ze een grotere concentratie aan transferrine‐ receptoren  tot  expressie  op  hun  celoppervlak.  Transferrine  is  een  bindingsproteïne  dat  instaat voor de opname van serumijzer in cellen via endocytose. Aangezien kankercellen dus 

I N L E I D I N G  | 16    een  hogere  ijzer‐influx  vertonen,  zijn  ze  vatbaarder  voor  het  cytotoxisch  effect  van  artemisinine  dan  normale  cellen.  De  gevormde  vrije  radicalen  zouden  ook  angiogenese  inhiberen  door  een  verminderde  expressie  van  VEGF  (vasulair  endotheliale  groeifactor)  en  zijn activerende factor HIF1‐α (hypoxie‐induceerbare factor 1α) (Firestone & Sundar, 2009).   Een  nog  betere  kankertherapie  wordt  verkregen  door  covalente  binding  van  artemisinine  aan  transferrine  (Nakase  et  al.,  2008).  Op  die  manier  worden  zowel  artemisinine  als  het  activerende  ijzer  selectief  opgenomen  in  de  kankercellen,  die  een  hogere expressie van transferrine‐receptoren vertonen.  Tegenwoordig  zijn  er  verschillende  artemisinine‐preparaten  op  de  markt  maar  de  vraag is echter of de bestaande preparaten echt waardevol zijn. Daarom zal in deze scriptie  de  werkelijke  artemisinineconcentratie  bepaald  worden  van  een  aantal  van  deze  fytopreparaten, geïllustreerd in Figuur 1.7.       

FIGUUR  1.7.  :  DRIE  ARTEMISININE‐PREPARATEN:  EEN  GEDROOGD  THEE‐EXTRACT  (MIN  TONG), CAPSULES (AOV) EN GEDROOGDE A. ANNUA BLAADJES (MINISTERIO DA SAUDE). 

O B J E C T I E V E N  | 17    2 OBJECTIEVEN  Artemisinine  wordt  wereldwijd  gebruikt  als  behandeling  tegen  malaria.  Aangezien  Artemisia  annua  slechts  kleine  hoeveelheden  artemisinine  aanmaakt  en  chemische  totaalsynthese  economisch  niet  haalbaar  is,  heerst  er  tegenwoordig  een  tekort  aan  dit  antimalaria‐middel. Om de productie te kunnen verhogen, is echter meer kennis vereist over  de  biosynthese  pathway  van  deze  verbinding.  Artemisinine  wordt  geproduceerd  in  de  10‐ cellige glandulaire trichomen, opgebouwd uit 2 apicale cellen, 4 subapicale cellen, 2 basale  cellen  en  2  stalk  cellen.  Transcripten  coderend  voor  gekende  artemisinine  biosynthese‐ enzymen werden enkel gedetecteerd in de apicale cellen (Olsson et al., 2009). Dit suggereert  dat artemisinine enkel in dit celtype gesynthetiseerd wordt. Er is echter geen zekerheid dat  nog ongekende biosynthese‐stappen ook enkel in de apicale cellen plaatsvinden.  Om ontbrekende stappen in de biosynthese van artemisinine te ontrafelen, kunnen  apicale  cellen  die  vermoedelijk  wel  artemisinine  produceren,  vergeleken  worden  met  subapicale  cellen  die  geen  artemisinine  produceren.  De  Laser  Microdissection  Pressure  Catapulting techniek (LMPC), besproken in 1.3.2, wordt hierbij gebruikt voor isolatie van de  verschillende  cellen  uit  het  plantenmateriaal.  Vervolgens  kan  op  de  verzamelde  cellen  een  metabolietstudie of een transcriptoomstudie uitgevoerd worden.   Het eerste luik van deze scriptie gaat verder op een vorige metabolietstudie waarbij  artemisinine  in  eerste  instantie  enkel  gedetecteerd  werd  in  apicale  cellen  en  niet  in  subapicale  cellen.  Hierdoor  ontstond  de  veronderstelling  dat  artemisinine  inderdaad  in  de  apicale  cellen  geproduceerd  wordt.  In  een  aantal  hierop  volgende  testen  werd  echter  ook  artemisinine gedetecteerd in filamenteuze trichomen, alhoewel artemisinineproductie hierin  nog nooit gerapporteerd werd. Om die reden ontstond er een vermoeden dat er sprake is  van  contaminatie  bij  LMPC  als  samplingtechniek.  Om  deze  contaminatie  al  dan  niet  te  bevestigen, wordt in deze scriptie de concentratie aan artemisinine en zijn biosynthetische  precursoren  bepaald  in  munttrichomen,  waarvan  bewezen  is  dat  er  geen  artemisininesynthese  plaatsvindt.  Deze  munttrichomen  worden  via  LMPC  geïsoleerd  uit  water  dat  geïncubeerd  werd  met  Artemisia  annua  bloemknoppen.  Vervolgens  worden  ze  geanalyseerd met behulp van HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS zoals besproken in 3.2.3.  

O B J E C T I E V E N  | 18    Het tweede luik van deze scriptie gaat verder in op artemisinine als kankertherapie.  Artemisinine blijkt, naast zijn antimalaria‐werking, namelijk ook actief te zijn tegen bepaalde   kankertypes.  Aangezien  kankerpatiënten  steeds  op  zoek  gaan  naar  nieuwe  genezende  middelen, wordt artemisinine ook meer en meer als therapie aangewend. Tegenwoordig zijn  er  verschillende  fytopreparaten  op  de  markt  die  artemisinine  zouden  bevatten  maar  de  vraag  is  echter  of  deze  echt  waardevol  zijn.  Daarom  zal  in  deze  scriptie  de  werkelijke  artemisinine‐concentratie  nagegaan  worden  in  een  aantal  preparaten.  Hiervoor  worden  chloroformextracten bereid die geanalyseerd worden via HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS.  Als  derde  luik  van  de  scriptie  wordt  gestart  met  een  transcriptoomstudie.  Hierbij  wordt  het  transcriptoom  van  apicale  en  subapicale  cellen  vergeleken  zodat  eventueel  nieuwe  genen  die  betrokken  zijn  in  de  biosynthese  pathway  van  artemisinine  ontdekt  kunnen  worden.  Voor  deze  transcriptoomanalyse  worden  apicale  en  subapicale  cellen  via  LMPC  gescheiden  en  gekatapulteerd  in  lysis  buffer.  Hieruit  wordt  vervolgens  het  RNA  geëxtraheerd.  Daarna  kunnen  de  mRNA‐molecules  gesequeneerd  worden  via  next  generation sequencing. Voor de bepaling van de volledige lengte van de transcripten is de  kwaliteit  van  het  geëxtraheerde  RNA  echter  van  groot  belang.  Kwaliteits‐  en  kwantiteitsanalyses van het RNA worden uitgevoerd met Experion, RiboGreen en NanoDrop.  Om  aan  de  hoge  kwaliteitseisen  te  voldoen,  zullen  we  in  eerste  instantie  zowel  de  RNA‐ extractiemethode  als  de  samplingmethode  optimaliseren  voor  volledige  glandulaire  trichomen.  Wanneer  dit  op  punt  staat,  kan  uiteindelijk  overgeschakeld  worden  op  RNA‐ extracties van apicale en subapicale cellen afzonderlijk.  Als  eerste  optimalisatiestap  wordt  nagegaan  welke  RNA‐extractiekits  de  beste  resultaten  opleveren.  Hierbij  moet  rekening  gehouden  worden  met  eventuele  problemen  met  secundaire  plantenmetabolieten  die  de  RNA‐extractie  en  ‐kwantificatie  kunnen  beïnvloeden.  Naast  de  extractiemethode  wordt  ook  de  samplingmethode  geoptimaliseerd.  Fixatie  van  de  stalen  kan  bijvoorbeeld  de  RNA‐opbrengst  door  cross‐linking  negatief  beïnvloeden,  maar  is  noodzakelijk  om  apicale  en  subapicale  cellen  te  kunnen  verzamelen.  Ook de samplingtijd en het samplingvolume worden geoptimaliseerd. Wanneer uiteindelijk  voldoende  RNA  van  hoge  kwaliteit  bekomen  wordt,  kan  dit  in  de  toekomst  geamplificeerd  worden  met  het  Ovation  RNA‐Seq  System.  Vervolgens  kan  de  next‐generation  sequencing  uitgevoerd worden met de Illumina Genome Analyzer II. 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 19    3 MATERIALEN EN METHODEN  3.1

ALGEMEEN 

3.1.1

Opkweken van A. annua  De  zaden,  geleverd  door  anamed  international  (Winnenden,  Duitsland)  werden 

gesteriliseerd in drie stappen. In eerste instantie werden ze twee minuten ondergedompeld  in een 70% ethanoloplossing (Merck, Darmstadt, Duitsland). Daarna werden ze tien minuten  behandeld  met  een  oplossing  bereid  door  3,84  mL  NaOCl  (Sigma‐Aldrich,  Steinheim,  Duitsland) aan te lengen met 5 µL  Tween 20 (MP Biomedicals, Illkirch, Frankrijk) en 10 mL  steriel water (Sartorius, Goettingen, Duitsland). Na vier à vijf keer wassen, werden de zaden  vervolgens  op  een  filtreerpapiertje  (Whatman,  Kent,  UK)  in  een  petrischaal  gelegd  en  bevochtigd met water. Na één week werden de kiemen overgebracht in potgrond en in een  groeikamer (VIB) geplaatst bij een temperatuur van 21°C en een dagritme van 8 uur licht en  16  uur  donker.  De  eerste  week  werden  de  plantjes  overdekt  met  plastiek  om  een  serre‐ effect  te  creëren.  Vooraleer  de  volgroeide  planten  voor  wetenschappelijk  onderzoek  gebruikt werden, lieten we ze ongeveer een week wennen aan natuurlijk daglicht.  3.1.2

Laser Microdissection Pressure Catapulting  De  Laser  Microdissection  Pressure  Catapulting  (LMPC)  techniek,  ontwikkeld  door 

Zeiss (P.A.L.M.®‐Microlaser Technologies), werd in deze studie toegepast voor de isolatie van  verschillende  celtypes  uit  plantenmateriaal.  Hiervoor  werd  gebruik  gemaakt  van  het  P.A.L.M.®  MicroLaser  systeem  voorzien  van  een  P.A.L.M.®  RoboMover  (PALM,  Wolfratshausen, Duitsland). Dit systeem bevat een snijdende 377‐nm UV stikstofgas laser die  gekoppeld  is  aan  een  lichtmicroscoop  (Axiovert  135;  Carl  Zeiss,  Oberkochen,  Duitsland)  en  gefocuseerd  wordt  door  een  40x  objectief.  De  laser  beam  heeft  een  diameter  kleiner  dan  1µm.  Met  een  gedefocuseerde  laser  worden  de  geselecteerde  cellen  in  een  verzamelepje  (Eppendorf,  Hamburg,  Duitsland)  gekatapulteerd.  De  RoboMover  is  een  computergestuurd  microscoopplatform en micromanipulator. De positionering van het object wordt bekomen  door horizontale beweging van dit platform (Nelson et al., 2006; Olsson et al., 2009).       FIGUUR  3.1.  :  LASER  MICRODISSECTION  PRESSURE  CATAPULTING,  DE  LOSGESNEDEN  TARGETCEL WORDT DOOR DE LASER IN HET DEKSEL VAN HET VERZAMELEPJE GEKATAPULTEERD (Day et al., 2005). 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 20    3.2

METABOLIETSTUDIE  

3.2.1

Doel 

3.2.1.1

Nagaan van contaminatie bij metabolietanalyse van apicale en subapicale cellen  In een vorige metabolietstudie, besproken in 1.3.3, werd artemisinine gedetecteerd 

in  filamenteuze  trichomen  die  via  LMPC  uit  A.  annua  bloemknoppen  geïsoleerd  werden.  Aangezien  hierin  nooit  eerder  artemisinineproductie  gerapporteerd  werd,  ontstond  het  vermoeden  dat  er  sprake  is  van  contaminatie.  Om  dit  al  dan  niet  te  bevestigen,  zal  de  concentratie  nagegaan  worden  van  artemisinine  en  zijn  biosynthetische  precursoren  in  water  geïncubeerd  met  bloemknoppen  van  A.  annua.  Deze  test  zal  een  idee  geven  welke  hoeveelheden artemisinine in het water migreren.   Als volgende stap wordt een muntblad fijngehakt in dit incubatiewater van A. annua,  waaruit  vervolgens  via  LMPC  munttrichomen  geïsoleerd  worden.  Daarna  wordt  de  concentratie  bepaald  van  artemisinine  en  zijn  biosynthetische  precursoren  in  deze  munttrichomen,  waarvan  bewezen  is  dat  er  geen  artemisininesynthese  plaatsvindt.  Zo  kunnen we nagaan of de metabolieten aanwezig in het incubatiewater inderdaad samen met  de  munttrichomen  via  LMPC  in  het  epje  gekatapulteerd  worden  of  migreren  in  de  trichomen.   In  laatste  instantie  worden  glandulaire  en  filamenteuze  trichomen  geïsoleerd  na  versnijden en wassen van de bloemknoppen om te zien hoeveel artemisinine er overblijft na  wassen.  De  stalen  werden  geanalyseerd  met  behulp  van  een  aangepaste  HPLC‐ESI  Q‐TOF  MS/MS methode gepubliceerd in Van Nieuwerburgh et al. (2006), deze techniek zal in detail  besproken worden in 3.2.3.  3.2.1.2

Concentratiebepaling van artemisinine in fytopreparaten  Aansluitend  op  de  metabolietstudie  werd  HPLC‐ESI  Q‐TOF  MS/MS  ook  gebruikt  om 

de  werkelijke  artemisinineconcentratie  te  bepalen  van  drie  artemisinine‐preparaten  die  tegenwoordig  op  de  markt  te  vinden  zijn:  een  poedervormig  thee‐extract  (Min  Tong  Co,  Taichung,  Taiwan)  waarbij  geen  artemisinineconcentratie  wordt  vermeld,  capsules  (aov,  Almere,  Nederland)  die  volgens  hun  verpakking  15  mg  artemisinine  per  capsule  zouden  bevatten en gedroogde Artemisia blaadjes (Ministério da saúde, Esplanada dos Ministérios 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 21    Bloco  G,  Brazilië)  die  0,8%  ‐  1,0%  artemisinine  per  1,25  gram  (1  zakje  blaadjes)  zouden  bevatten.   3.2.2

Sampling en staalvoorbereiding 

3.2.2.1

Verzamelen van incubatiewater van A. annua   Er werden drie pools verzameld van elk 20 gesloten bloemknoppen. Elke pool werd 

genomen  van  dezelfde  zeven‐maand‐oude  Artemisia  annua  anamed  plant  en  werd  gedurende  30  minuten  geïncubeerd  met  400  µL  UltraPure  Water  (Biosolve,  Valkenswaard,  Nederland). Daarna werd de waterfase afgepipetteerd en verzameld in een apart epje. Deze  behandeling  werd  voor  elke  pool  tien  keer  na  elkaar  herhaald.  Na  deze  tien  wasstappen  werden  de  bloemknoppen  versneden  en  vervolgens  nog  driemaal  geïncubeerd  met  water.  Het incubatiewater werd voor elke stap afzonderlijk bij ‐20 °C bewaard om via HPLC‐ESI Q‐ TOF  MS/MS  de  hoeveelheid  vrijgekomen  artemisinine  en  biosynthetische  precursoren  bij  elke incubatiestap te bepalen. Hiervoor werd 50 µL van het incubatiewater aangelengd met  50  µL  Ultra  Pure  Water  (Biosolve,  Valkenswaard,  Nederland)  en  100  µL  mix‐oplossing  samengesteld uit 1 mL IS 1; 1,5 mL ACCN en 4 µL FA.    3.2.2.2

Verzamelen van munttrichomen uit incubatiewater van A. annua  Een  stuk  muntblad  werd  op  een  microscoopglaasje  gelegd  en  met  een  mesje 

fijngehakt in 20 µL water afkomstig van de eerste incubatiestap van Artemisia annua. In het  deksel  van  een  0,2  mL  epje  (Eppendorf,  Hamburg,  Duitsland)  werd  25  µL  UltraPure  Water  (Biosolve, Valkenswaard, Nederland) gepipetteerd. Via LMPC werden munttrichomen in het  deksel van dit epje gekatapulteerd. Op die manier werden 60 munttrichomen verzameld in  66 µL water. Dit werd aangelengd met 66 µL mix‐oplossing samengesteld uit 1 mL IS 1; 1,5  mL ACCN en 4 µL FA. Om de cellen open te breken en hun inhoud vrij te stellen, werd het  staal gedurende tien minuten gesoniceerd en vervolgens geanalyseerd met HPLC‐ESI Q‐TOF  MS/MS.  3.2.2.3

Verzamelen  van  glandulaire  en  filamenteuze  trichomen  van  A.  annua  na  wassen  van versneden bloemknoppen   Na  tien  incubatiestappen  werden  de  volledige  bloemknoppen  versneden.  Na 

driemaal wassen van deze versneden bloemknoppen werden ze op een microscoopglaasje in 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 22    20  µL  UltraPure  Water  (Biosolve,  Valkenswaard,  Nederland)  gelegd.  In  het  deksel  van  een  verzamelepje  werd  25  µL  UltraPure  Water  gepipetteerd.  Via  LMPC  werden  glandulaire  en  filamenteuze trichomen in het deksel van dit epje gekatapulteerd. Op die manier werden in  twee  aparte  stalen  53  glandulaire  trichomen  en  60  filamenteuze  trichomen  verzameld.  Vervolgens  werd  de  inhoud  van  elk  epje  aangelengd  tot  50/50  H2O/MIX.  De  mix‐oplossing  werd bereid door 1 mL IS 1 te mengen met 1,5 mL ACCN en 4 µL FA. Om de cellen open te  breken en hun inhoud vrij te stellen, werden de stalen gedurende tien minuten gesoniceerd.  Via  HPLC‐ESI  Q‐TOF  MS/MS  werd  vervolgens  de  concentratie  aan  artemisinine  en  zijn  biosynthetische precursoren in deze trichomen bepaald.   3.2.2.4

Chloroformextractie van fytopreparaten  Vooraleer  de  concentratie  aan  artemisinine  in  de  fytopreparaten  geanalyseerd  kon 

worden,  werd  van  elk  preparaat  een  chloroformextract  bereid.  Hiervoor  werd  552,50  mg  poedervormig  thee‐extract,  de  inhoud  van  één  aov‐capsule  (588,60  mg)  en  één  zakje  met  1,25  g  gedroogde  blaadjes  gemengd  met  50  mL  chloroform  (Acros,  Geel,  België).  Na  anderhalf  uur  schudden  en  soniceren,  werd  de  chloroform  overgebracht  in  een  aparte  proefbuis. Deze chloroformextracten werden geanalyseerd via HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS. Ter  voorbereiding van de stalen voor injectie werd de chloroform 1000 keer verdund door aan te  lengen met interne standaard 2 (zie 3.2.3.2).  3.2.3

Kwantitatieve analyse van de stalen 

3.2.3.1

Principe: HPLC‐ESI Q‐TOF MS/MS  High  performance  liquid  chromatography  (HPLC)  is  een  analytische  techniek  die 

aangewend  wordt  voor  scheiding  van  mengsels.  De  meeste  stalen,  die  voor  analytisch  onderzoek aangeboden worden, zijn namelijk mengsels van opgeloste substanties. Er wordt  gebruik gemaakt van vloeistofchromatografie gekenmerkt door een vaste stationaire fase en  een vloeibare mobiele fase, hierbij toegepast onder verhoogde druk.       

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 23    Na  chromatografische  scheiding  van  de  stalen  via  HPLC  werden  de  afzonderlijke  componenten  gedetecteerd  en  gekwantificeerd  met  behulp  van  een  massaspectrometer.  Massaspectrometrie  is  een  spectrometrische  techniek  die  gebaseerd  is  op  de  vorming  van  ionen in één of ander ionisatieproces. De ionisatievorm die in dit onderzoek toegepast werd,  is elektrospray ionization (ESI). Het HPLC effluent wordt hierbij door een naald gedwongen,  waarop aan het uiteinde een potentiaal is aangelegd. Deze laatste is voldoende hoog om de  uittredende oplossing in een fijne spray te dispergeren zodat uiteindelijk individueel geladen  ‘naakte’ analytionen in de gasfase gevormd worden. Na dit ionisatieproces worden de ionen  naar  de  massa‐analysator  getransfereerd.  De  elektrospray  vormt  dus  de  koppeling  tussen  het HPLC‐toestel en de Q‐TOF massaspectrometer.  Bij  tandem massaspectrometrie (MS/MS)  worden  meerdere  massaspectrometrische  technieken gecombineerd. Hier wordt gebruik gemaakt van een Q‐TOF massaspectrometer.  Dit  is  een  combinatie  van  een  quadrupool  (Q)  en  een  Time‐Of‐Flight  (TOF)  massaspectrometer, verbonden door een botsingscel (zie Figuur 3.2).                              FIGUUR  3.2.  :  Q‐TOF  MASSSASPECTROMETER;  BIJ  Q‐TOF  MASSASPECTROMETRIE  WORDEN VERSCHILLENDE  MASSASPECTROMETRISCHE  TECHNIEKEN  GECOMBINEERD,  NAMELIJK  EEN QUADRUPOOL (MS1), BOTSINGSCEL (MS2) EN TIME‐OF‐FLIGHT MASSASPECTROMETER (MS3). 

De  quadrupool  bestaat  uit  vier  parallelle  hyperbolische  staven  met  daarop  een  radiofrequentie‐  (rf)  en  een  directe  stroomspanning.  De  combinatie  van  rf‐  en  stroomspanning  bepaald  of  een  gegeven  ion,  afhankelijk  van  de  m/z‐waarde,  al  dan  niet  door  de  quadrupool  doorgelaten  wordt.  De  quadrupool  is  gebonden  aan  de  TOF  massaspectrometer via een botsingscel. Door een potentiaalverschil aan te brengen tussen 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 24    het begin en het einde van deze botsingscel zullen de doorgelaten ionen versneld worden en  botsen  met  de  edelgasatomen  (Ar).  Dit  zorgt  voor  fragmentatie  van  de  ionen.  Deze  specifieke fragmentionen kunnen verder geanalyseerd worden in de TOF analyser.   Een  TOF  (Time‐Of‐Flight)  massaspectrometer  gebruikt  het  verschil  in  transittijd  doorheen  een  buis  (“flight  tube”)  met  een  bepaalde  afstand  om  ionen  van  verschillende  m/z‐verhouding van elkaar te scheiden. De ionen worden vervolgens gedetecteerd via een  elektronmultiplier.  Hierbij  maken  de  ionen  een  groot  aantal  elektronen  vrij  waardoor  een  elektrisch signaal wordt geproduceerd dat evenredig is met het aantal invallende ionen. De  relatieve  hoeveelheid  waarin  elk  soort  ion  voorkomt,  wordt  geregistreerd  in  de  vorm  van  een spectrum. Aangezien de aard en het aantal van de gevormde ionen karakteristiek is voor  de  samenstelling  en  structuur  van  een  molecule,  kan  men  stellen  dat  het  massaspectrum  haar vingerafdruk is.  3.2.3.2

Ijklijn  Voor de aanmaak van de verdunningsreeks werd vertrokken van stockoplossingen in 

methanol  met  gekende  concentraties  aan  artemisinine  (1mg/ml),  artemisininezuur  (1mg/ml),  arteannuin  B  (1mg/ml),  dihydroartemisinine  (1mg/ml),  dihydroartemisininezuur  (5mg/ml),  artemisinine  alcohol  (5mg/ml),  artemisinine  aldehyde  (5mg/ml)  en  dihydroartemisinine  alcohol  (4mg/ml).  De  referentiestandaard  artemisinine  98%  werd  verkregen  door  Sigma‐Aldrich  (Bornem,  België).  Artemisininezuur  en  arteannuin  B  werden  geleverd  door  het  Walter  Reed  Army  Institute  of  Research  (Washington,  USA).  Dihydroartemisinine,  dihydroartemisininezuur,  artemisinine  alcohol,  artemisinine  aldehyde  en  dihydroartemisinine  alcohol  werden  door  Patrick  Covello  van  het  National  Research  Council  Canada  geschonken.  Methanol  werd  verkregen  door  Biosolve  (Valkenswaard,  Nederland). Elke analytische standaard werd bereid als een mengsel van elke stockanalyt en  interne standaard.  Als  interne  standaard  werd  een  santonine  stockoplossing  gebruikt  met  een  concentratie  van  1  mg/mL  in  MeOH.  De  eerste  interne  standaard  (IS  1),  met  een  concentratie van 0.5 ng/µL, werd bereid door 25 µL uit de stock aan te lengen tot 50 mL met  50/50  ACCN/H2O  en  0,1%  FA.  Vervolgens  werd  de  tweede  interne  standaard  (IS  2)  bereid  door  20  mL  uit  IS  1  aan  te  lengen  tot  100  mL  met  50/50  ACCN/H2O  en  0.1  %  FA.  Het 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 25    acetonitril,  water  en  methaanzuur  werden  geleverd  door  Biosolve  (Valkenswaard,  Nederland).   In  eerste  instantie  werden  de  10ng/µL  en  8ng/µL  verdunningen  bereid  door  de  stockoplossingen  en  IS  1  aan  te  lengen  met  50/50  ACCN/H2O  en  0,1%  FA  tot  de  gewenste  concentratie. Bij de volgende verdunningen (6ng/µL t.e.m. 0.001ng/µL) werd uitgegaan van  deze 10ng/µL en 8ng/µL oplossingen en IS 2.   3.2.3.3

Chromatografische condities  Van  elk  staal  werd  100  µL  geïnjecteerd  in  een  Waters  Alliance  2695  HPLC  systeem 

gecombineerd met een capillaire reversed‐phase kolom, namelijk Alltech Ultrasphere C18 IP  5 µm kolom (150 mm x 2,1 mm) beschermd door een Waters XTerra MS C18 5 µm pre‐kolom  (10 mm x 2,1 mm). De stalen werden vervolgens geëlueerd met een typische gradiënt. De  mobiele fase (eluens A: H2O en 0,1% FA; eluens B: 90/10 ACCN/H2O en 0,1% FA) heeft hierbij  een debiet van 0,2 mL/min. De beginsamenstelling, een 40/60 verhouding, werd gedurende  8  minuten  aangehouden.  Daarna  werd  overgeschakeld  op  een  15/85  verhouding,  wat  9  minuten  aangehouden  werd.  Voor  de  volgende  5  minuten  werd  overgeschakeld  op  een  0/100  verhouding.  De  laatste  12  minuten  werd  terug  een  verhouding  van  40/60  aangehouden.  Een  LC  Packings  ACUrate  ICP‐04‐20  post‐kolom  splitter  werd  gebruikt  om  ¼  van het effluens op de elektrospray interface te brengen.  3.2.3.4

Massaspectrometrische condities  Voor  de  massaspectrometrische  detectie  werd  gebruik  gemaakt  van  een  Q‐TOF 

massaspectrometer  (Micromass,  Manchester,  UK)  uitgerust  met  een  electrospray  bron  in  positieve modus (ESP+). Het HPLC effluent wordt hierbij door een elektrospray ionisatie (ESI)  capillair  gedwongen,  waarop  aan  het  uiteinde  een  potentiaal  van  2,8  kV  is  aangelegd.  De  bron en desolvatie temperaturen werden geoptimaliseerd op respectievelijk 130 en 300 °C.  Hierbij  werd  stikstofgas  (N2)  gebruikt  als  desolvatiegas  met  een  debiet  van  400  L/u.  Als  collisiegas  voor  MS/MS  analyse  werd  argon  (0,8  bar)  gebruikt.  Hierbij  werd  de  botsingsenergie  geoptimaliseerd  op  7  eV  voor  artemisinine,  8  eV  voor  dihydroartemisinine  en  artemisinine  alcohol,  9  eV  voor  santonine  en  dihydroartemisinine  alcohol,  10  eV  voor  arteannuin  B,  11  eV  voor  artemisininezuur  en  artemisinine  aldehyde  en  12  eV  voor  dihydroartemisininezuur  en  dihydroartemisinine  aldehyde.  De  MS/MS  methode  werd 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 26    gebruikt  voor  de  kwantificatie  van  artemisinine  (m/z  283    219  +  229  +  247  +  265),  arteannuin  B  (m/z  249    185  +  189),  artemisininezuur  (m/z  235    189  +  199  +  217),  artemisinine alcohol (m/z 221  203), artemisinine aldehyde (m/z 219  145 + 159 + 201),  DHA‐zuur (m/z 237  163 + 191 + 201 + 219), DHA (m/z  221  163) en DHA‐alcohol (m/z  223  149 + 165 + 205).   3.2.4

Dataverwerking  Dataverwerking  en  analyse  werd  verricht  met  behulp  van  de  Masslynx  versie  4.0 

software.  Genormaliseerde  piekoppervlaktes  werden  verkregen  door  berekening  van  de  ratio van de piekoppervlakte van het analyt t.o.v. deze van de interne standaard. De ijklijn  werd in drievoud bepaald en opgesteld door de gekende concentraties van de analyten uit  te  zetten  t.o.v.  hun  genormaliseerde  piekoppervlaktes.  De  concentraties  van  de  respectievelijke analyten in de stalen werden berekend t.o.v deze ijklijnen.  3.3 3.3.1

TRANSCRIPTOOMSTUDIE  Doel  Om ontbrekende stappen in de biosynthese van artemisinine te ontrafelen, kan het 

transcriptoom van apicale cellen vergeleken worden met subapicale cellen. Hiervoor moet in  eerste  instantie  het  RNA  uit  de  cellen  geïsoleerd  worden.  Daarna  kunnen  de  mRNA‐ molecules  gesequeneerd  worden  via  next  generation  sequencing.  Hiervoor  is  echter  zowel  de kwantiteit als de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA van groot belang. Vooraleer next  generation  sequencing  kan  plaatsvinden,  zal  het  RNA  namelijk  geamplificeerd  worden  met  de  Ovation®  RNA‐Seq  System  kit  (NuGen,  Bemmel,  Nederland).  Deze  kit  vereist  RNA  van  hoge  kwaliteit  en  een  minimale  input  van  500  pg  in  een  maximum  volume  van  5  µL.  Een  hoge RNA‐kwaliteit is eveneens belangrijk om de volledige lengte van het transcriptoom te  kunnen  bepalen.  Dit  is  namelijk  niet  haalbaar  indien  het  RNA  in  te  kleine  fragmenten  gedegradeerd  is.  Om  aan  de  hoge  kwaliteitseisen  te  voldoen,  is  dus  een  optimale  RNA‐ extractie  vereist.  In  eerste  instantie  wordt  zowel  de  RNA‐extractiemethode  als  de  samplingmethode  geoptimaliseerd  voor  volledige  glandulaire  trichomen.  Wanneer  dit  op  punt staat, kan overgeschakeld worden op RNA‐extracties van apicale en subapicale cellen  afzonderlijk. 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 27    3.3.2

Sterilisatie van het glaswerk  Vóór  de  start  van  de  transcriptoomstudie  werden  microscoopglaasjes  vrijgemaakt 

van  RNA  en  RNasen  door  behandeling  met  SDS  buffer  en  naspoelen  met  DEPC  water.  SDS  buffer  zorgt  voor  denaturatie  van  proteïnen  en  peptiden  en  werd  bereid  door  5  g  SDS  (sodiumdodecylsulfaat,  MP  Biomedicals,  Illkirch,  Frankrijk)  te  mengen  met  100  mL  DEPC  water,  dit  vormt  de  5%  SDS‐stockoplossing.  Na  10  maal  verdunnen,  werd  de  0,5%  SDS‐ werkoplossing  verkregen.  DEPC  water  is  als  RNase‐vrij  water.  DEPC  vernietigt  alle  enzymatische  activiteit  in  het  water.  Het  werd  bereid  door  1  mL  DEPC  (dieethylpyrocarbonaat,  Sigma‐Aldrich,  Steinheim,  Duitsland)  overnacht  op  te  lossen  in  1  L  Sartorius gezuiverd water (Sartorius, Goettingen, Duitsland) in een schudwarmwaterbad bij  37°C en vervolgens te autoclaveren. Na reiniging van de microscoopglaasjes met 0,5 % SDS‐ buffer  en  afspoelen  met  DEPC  water,  werden  de  glaasjes  verpakt  in  aluminiumfolie  en  9u  gebakken in een oven bij 190°C.  3.3.3

Concentratie‐ en kwaliteitsbepaling van RNA‐stalen  Om na te gaan welke methoden het best geschikt zijn voor de concentratiebepaling 

en/of  kwaliteitsbepaling  van  de  verschillende  RNA‐stalen  werden  zowel  de  NanoDrop  spectrofotometer,  de  RiboGreen  RNA  Quantitation  Kit  als  de  Experion  RNA  Analysis  Kit  uitgetest.  Hiervoor  werd  elke  methode  toegepast  voor  de  analyse  van  RNA  dat  via  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit  (zie  3.3.4.1)  geëxtraheerd  werd  uit  een  referentiestaal,  namelijk Human Brain Reference RNA (HBRR). Ook de concentratie van een 4x‐verdunning  van dit staal werd met de verschillende methoden gemeten. De werkingsprincipes worden  hieronder kort besproken.  3.3.3.1

NanoDrop spectrofotometer  De  NanoDrop  spectrofotometer  (Thermo  Scientific,  Wilmington,  USA)  meet  de 

absorbantie van een staal in het gebied van 200 nm tot 350 nm, wat relevant is om de RNA‐ concentratie  en  ‐zuiverheid  te  kunnen  bepalen.  De  NanoDrop  ND‐1000  maakt  de  analyse  van 1µL staal mogelijk. Hiervoor wordt een druppel (1µL) van het staal op de “measurement  pedestal” gepipetteerd. Bij het sluiten van het apparaat, wordt de druppel samengeperst en  wordt  als  het  ware  een  kolom  gevormd.  Het  staal  wordt  op  zijn  plaats  gehouden  door  de  oppervlaktespanning. Op die manier kan de absorbantie van het licht door het staal gemeten 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 28    worden. Aan de hand van de absorbantie bij 260 nm (A260)  kan vervolgens de concentratie  aan RNA bepaald worden. De ratio A260/A280   geeft een indicatie van de zuiverheid van het  staal.  Een  waarde  tussen  1,8  en  2,0  indiceert  dat  het  RNA‐staal  zuiver  is.  Hiernaast  moet  echter ook gekeken worden naar de ratio A260/A230. Deze waarde moet zo dicht mogelijk bij  2,0  liggen.  Een  afwijking  hiervan  wijst  op  contaminatie  met  proteïnen,  phenolen  of  chaotropische zouten zoals guanidine isothiocyanaat.   3.3.3.2

RiboGreen RNA Quantitation Kit  Het  RiboGreen  Quantitation  Reagens  (Molecular  Probes,  Eugene,  USA)  is  een 

fluorescente kleurstof dat bindt op alle nucleïnezuren aanwezig in het staal. Afhankelijk van  de ‘high‐range methode’ (20 ng/mL tot 1 µg/mL RNA) of de ‘low‐range methode’ (1 ng/mL  tot  50  ng/mL  RNA)  wordt  een  andere  concentratie  aan  kleurstof  gebruikt.  In  deze  studie  werd gebruik gemaakt van de ‘low‐range assay’.   In  eerste  instantie  werden  de  reagentia  bereid.  Een  1x  TE‐buffer  (10mM  Tris‐HCl,  1  mM EDTA, pH 7,5) werd bereid door 500 µL van de 20x TE‐buffer (geleverd bij de kit) aan te  lengen met 9,5 mL DEPC water. Vervolgens werd het RiboGreen Reagens 2000 keer verdund  met  de  1x  TE‐buffer.  Om  een  standaardcurve  te  kunnen  opstellen,  werden  ijklijnpunten  in  drievoud  bereid  volgens  Tabel  3.1.  Aangezien  het  RNA  in  alle  stalen  na  extractie  met  de  Nanoprep  kit  geëlueerd  werd  in  elutiebuffer,  werd  ook  het  controle  RNA  voor  de  ijklijnpunten met dezelfde elutiebuffer verdund. Deze ijklijnpunten en alle stalen werden in  de welletjes van een microplaat gepipetteerd. Vervolgens werd de microplaat gelezen met  behulp  van  de  Safire²  Multiplate  Reader  in  combinatie  met  MagellanTM  Software  (Tecan,  Männedorf,  Zwitserland)  en  werd  de  gemeten  fluorescentie  van  de  ijklijn  uitgezet  ten  opzichte  van  de  gekende  RNA‐concentratie.  Door  omrekening  ten  opzichte  van  deze  standaardcurve kon vervolgens de RNA‐concentratie van de stalen berekend worden.   Tabel  3.1.  :  DE  HOEVEELHEDEN  ELUTIEBUFFER,  CONTROLE  RNA  EN  RIBOGREEN  REAGENS  TER  BEREIDING VAN DE STANDAARDCURVE BIJ DE RIBOGREEN RNA QUANTITATION KIT.  Finale concentratie (ng/mL) 

Elutiebuffer 

50  25  5  1  0 

0 µL  25 µL  45 µL 49 µL  50 µL 

100 ng/mL controle RNA  RiboGreen  2000x verdund  50 µL  25 µL  5 µL 1 µL  0 µL 

50 µL  50 µL  50 µL  50 µL  50 µL 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 29    3.3.3.3

Experion RNA Analysis Kit  Het  Experion  systeem  (Bio‐Rad,  Hercules,  Canada)  is  een  geautomatiseerd 

elektroforese  systeem  dat  gebruik  maakt  van  microfluïde‐chips.  Deze  chips  bevatten  een  serie  van  plastieken  welletjes  gebonden  op  een  dunne  glasplaat,  die  geëtst  is  met  een  netwerk  van  microkanalen.  Eens  de  microkanalen  geprimed  zijn  met  een  gelmatrix  en  de  welletjes  geladen  zijn  met  het  overeenkomstig  staal,  stuurt  het  elektroforese  station  de  stalen door deze microkanalen via controle van de aangelegde spanning en stroom. Om de  concentratie  aan  nucleïnezuren  te  meten,  wordt  gebruik  gemaakt  van  een  intercalerende  dye  en  laser‐geïnduceerde  fluorescentie.  De  snelle  microfluïdische  scheiding,  vergelijkbaar  met gelelektroforese, levert daarbovenop kwalitatieve informatie over de integriteit van het  staal.  Hiervoor  wordt  een  RNA  ladder  gebruikt  die  bestaat  uit  8  zuivere  RNA  fragmenten.  Door de lengte van deze RNA‐fragmenten uit te zetten in functie van hun migratietijden kan  een standaardcurve opgesteld worden. De lengte van de RNA‐fragmenten in de stalen wordt  vervolgens berekend door vergelijking van de migratietijden met deze standaardcurve. Om  te  compenseren  voor  variaties  in  de  verschillende  stalen,  maakt  het  Experion  systeem  gebruik van een lower internal marker om de migratietijden tussen de verschillende stalen  te normaliseren.  Voor de LMPC stalen werd gebruik gemaakt van de ExperionTM RNA HighSens Analysis  Kit  met  een  kwalitatieve  range  van  100  ‐  5000  pg/µL  totaal  RNA.  De  ExperionTM  RNA  StandardSens  Analysis  Kit  werd  toegepast  voor  analyse  van  het  RNA  geëxtraheerd  uit  grotere  hoeveelheden  plantenmateriaal.  Deze  kit  heeft  een kwalitatieve  range  van  5  ‐  500  ng/µL totaal RNA en een kwantitatieve range van 25 ‐ 500 ng/µL totaal RNA.  3.3.4

Vergelijking verschillende extractiekits  Om een optimale RNA‐extractie te verkrijgen, werden twee extractiekits vergeleken, 

namelijk  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit  en  de  RNAqueous®‐Micro  kit.  Hiervoor  werd  plantenmateriaal gebruikt van een zeven‐maand‐oude Artemisia annua anamed plant. Voor  een eerste staal werd met een mesje over een Artemisia blad geschraapt. Een tweede staal  bestond  uit  twee  bloemknoppen,  waarvan  één  fijngehakte  en  één  intacte  bloemknop.  Uiteindelijk werd de RNA‐opbrengst, qua kwaliteit, bij de verschillende kits vergeleken met  behulp van de Experion RNA Analysis Kit, waarvan de werking uitgelegd wordt in 3.3.3.3.  

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 30    3.3.4.1

Absolutely RNA Nanoprep Kit  De Absolutely RNA Nanoprep kit (Stratagene, La Jolla, Canada) is ontworpen voor een 

snelle  opzuivering  van  totaal  RNA  van  hoge  kwaliteit.  De  kit  kan  toegepast  worden  voor  RNA‐isolatie  uit  cellen  verzameld  via  Laser  Microdissection  Pressure  Capture  (LMPC).  Het  design  van  de  RNA‐bindende  spin  cups,  geleverd  bij  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit,  laat  toe  om  het  RNA‐staal  in  een  zeer  klein  volume  (10  µL)  te  verzamelen.  Dit  maakt  verdere  toepassingen  op  het  volledige  staal  mogelijk  zonder  de  nood  aan  verdere  aanconcentreringsstappen, wat tot verlies van RNA zou kunnen leiden.  De Nanoprep procedure start met de lyse van de cellen in een lysis buffer. Deze lysis  buffer  bevat  het  chaotropisch  zout  guanidine  thiocyanaat  dat  instaat  voor  cellyse  en  proteïnedenaturatie  waardoor  degradatie  van  het  RNA  door  ribonucleasen  (RNases)  verhinderd wordt. Na de cellyse wordt het staal overgebracht in een nano‐spin cup waar het  RNA  aan  een  silica‐filter  bindt.  Een  behandeling  met  het  enzym  DNase  elimineert  contaminerend DNA. Vervolgens wordt het DNase en andere proteïnen verwijderd door een  serie  van  wasstappen.  Als  laatste  stap  wordt  het  zuiver  RNA  van  de  silicia‐filter  geëlueerd  met  behulp  van  10‐20  µL  elutiebuffer.  In  deze  testen  werd  telkens  10  µL  elutiebuffer  gebruikt.  3.3.4.2

RNAqueous®‐Micro Kit  De RNAqueous®‐Micro kit (Ambion, Foster City, USA) werd eveneens ontworpen voor 

isolatie  van  totaal  RNA.  De  procedure  begint  met  de  lyse  van  het  staal  in  een  lyserende  oplossing  die,  net  zoals  bij  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  Kit,  guanidine  thiocyanaat  bevat.  Het  lysaat  wordt  vervolgens  gemengd  met  ethanol  en  overgebracht  op  een  silica‐filter  die  selectief RNA bindt. De hoeveelheid ethanol die aan het staal wordt toegevoegd, bepaalt de  grootte van het RNA die op de filter bindt. In deze studie werden zowel de grote als kleine  RNA species geïsoleerd door aan het lysaat 1,25 volumes van 100% ethanol toe te voegen.  Aangezien de silica‐filter uiterst klein is, kan het RNA in kleine volumes (16‐20µL) geëlueerd  worden. Een post‐elutie DNase behandeling elimineert contaminerend DNA.   3.3.5

Extractie van een referentiestaal  Als controle werd de Absolutely RNA Nanoprep Kit toegepast op een referentiestaal, 

namelijk Human Brain Reference RNA (HBRR) met een gekende concentratie van 10 ng/µL. 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 31    Het  referentiestaal  bestaat  uit  zuiver  totaal  RNA  van  humane  oorsprong  waardoor  geen  rechtstreekse  vergelijking  gemaakt  mag  worden  met  RNA‐extracties  uit  het  plantenmateriaal.  Toch  biedt  deze  positieve  controle  de  mogelijkheid  om  een  idee  te  vormen  over  het  eventuele  RNA‐verlies  en  ‐degradatie  tijdens  de  procedure.  Vooral  de  intactheid van 18S en 28S rRNA wordt bekeken.   3.3.6

LMPC stalen  Vooraleer RNA uit de glandulaire trichomen geëxtraheerd kon worden, moesten de 

trichomen in eerste instantie van de Artemisia plant geïsoleerd worden. Voor de isolatie van  de  trichomen  werd  gebruik  gemaakt  van  de  Laser  Microdissection  Pressure  Catapulting  (LMPC) techniek. LMPC is als sampling techniek echter niet 100% sluitend. Er bestaat nooit  zekerheid  dat  alle  geschoten  trichomen  ook  effectief  in  het  deksel  van  het  epje  terechtkomen.  Om  deze  techniek  te  optimaliseren,  werden  verschillende  LMPC‐condities  vergeleken. Het manueel tellen van het aantal volledige trichomen die de vloeistof bereikt  hebben,  bleek  echter  niet  haalbaar.  Omwille  van  degradatie  van  de  meerderheid  van  de  geschoten trichomen werden vooral celmembranen en cuticula teruggevonden. Om toch te  kunnen  nagaan  welke  samplingmethode  het  meest  efficiënt  is,  werd  daarom  de  RNA‐ opbrengst bij de verschillende condities vergeleken.   3.3.6.1

Preliminaire test  In  eerste  instantie  werd  geprobeerd  om  het  totale  RNA  te  extraheren  uit  150 

volledige glandulaire trichomen. Hiervoor werd een bloemknop van een zeven‐maand‐oude  Artemisia  annua  anamed  plant  op  een  microscoopglaasje  fijngehakt  in  20  µL  UltraPure  Water  (Biosolve,  Varkenswaard,  Nederland).  In  het  deksel  van  een  RNase‐vrij  epje  (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) werd 20 µL lysis buffer en 0,14 µL β‐mercaptoethanol van  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit  gepipetteerd.  Vervolgens  werden  via  LMPC  volledige  glandulaire  trichomen  in  het  deksel  van  het  epje  gekatapulteerd.  Indien  het  staal  op  het  microscoopglaasje  aan  het  uitdrogen  was,  werd  een  nieuw  preparaat  gemaakt.  Op  die  manier werden vijf epjes van elk 30 trichomen verzameld. Per epje werd maximaal twee uur  gewerkt. Na het verzamelen van de trichomen werd de vloeistof kort afgecentrifugeerd op  1200 à 1600 rpm (1‐15P Sartorius centrifuge, Sigma, Bornem, België) en bij ‐80 °C bewaard.  De verschillende stalen werden vervolgens in één epje verzameld. Daarna werd het RNA uit 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 32    dit  staal  geëxtraheerd  met  behulp  van  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit.  Zelfs  bij  deze  150  volledige  trichomen  bleek  de  RNA‐opbrengst  echter  te  laag  voor  een  waardevolle  meting  van  de  RNA‐kwaliteit  en  ‐kwantiteit.  In  de  volgende  testen  werd  daarom  meestal  overgeschakeld op grotere hoeveelheden plantenmateriaal voor verdere optimalisatie.   3.3.6.2

Verschillende samplingvolumes  Bij  de  voorgaande  eerste  test  werden  trichomen  via  LMPC  verzameld  in  20  µL  lysis 

buffer.  Om  na  te  gaan  wat  het  optimale  samplingvolume  is,  werden  opnieuw  trichomen  verzameld in zowel 20 µL lysis buffer als in 40 µL, waarbij het vloeistofoppervlak dichter bij  het  preparaat  staat  en  dus  verwacht  zou  worden  dat  meer  geschoten  trichomen  het  vloeistofoppervlak  effectief  bereiken.  Om  na  te  gaan  of  er  effectief  een  verschil  is  tussen  deze  twee  sampling  condities  werd  daarom  de  RNA‐opbrengst  bij  deze  twee  stalen  vergeleken.          FIGUUR 3.3. : ISOLATIE VAN CELLEN VIA LMPC WAARBIJ HET DEKSEL VAN HET EPJE 20µL (LINKS) OF 40µL (RECHTS) LYSIS BUFFER BEVAT. 

3.3.6.3

Invloed fixatie  In  eerste  instantie  werden  de  trichomen  geschoten  vanuit  water.  Aangezien  water 

een hoge oppervlaktespanning heeft, ontstond het vermoeden dat de trichomen moeilijk uit  het  wateroppervlak  geschoten  kunnen  worden.  Daarom  werden  ook  trichomen  verzameld  vanuit  een  gefixeerd  preparaat.  Als  fixatief  werd  PBS  (phosphate  buffered  saline)  4%  formaldehyde gebruikt. Dit werd bereid door 8 mL 37 % formaldehyde (Merck, Hohenbruhn,  Duitsland) toe te voegen aan 66 mL PBS buffer pH 7,4 1x (Gibco, Paisly, UK) en vervolgens te  mengen. In eerste instantie werden enkele takjes met bloemknoppen geplukt van een acht‐ maand‐oude Artemisia annua anamed plant. Vervolgens  werd het plantenmateriaal in een  bekerglas,  gevuld  met  PBS  4%  formaldehyde,  ondergedompeld  en  gedurende  3,5  à  4  uur  vacuüm  getrokken  op  ijs.  Hierdoor  kan  het  fixatief  makkelijker  in  de  cellen  dringen.  Na  de 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 33    fixatie werd een bloemknop op een microscoopglaasje gelegd en fijngehakt in 20 µL PBS 4%  formaldehyde.  Aangezien  deze  fixeervloeistof  een  lagere  oppervlaktespanning  heeft  dan  water wordt verondersteld dat trichomen die hieruit geschoten worden gemakkelijker in het  verzamelepje geraken. Volgens deze denkwijze zou men dus verwachten dat de gefixeerde  stalen een grotere RNA‐opbrengst opleveren dan de stalen verzameld uit water.   Dit  staat  in  competitie  met  het  feit  dat  een  groot  deel  van  het  RNA  door  formaldehyde‐fixatie gecrosslinked wordt en de RNA‐extractie dus negatief beïnvloedt (Kerk  et al., 2003). Om die reden werden ook testen uitgevoerd om de invloed van fixatie op de  RNA‐kwaliteit  na  te  gaan.  De  hoeveelheid  RNA  geëxtraheerd  uit  de  glandulaire  trichomen,  die verzameld werden via LMPC, is echter te laag voor een optimale kwaliteitsbepaling. Om  de invloed van fixatie op de RNA‐kwaliteit toch te kunnen nagaan, werd daarom overgestapt  op grotere hoeveelheden plantenmateriaal (zie 3.3.7.3).  3.3.7

Optimalisatie met meer plantenmateriaal 

3.3.7.1

RNA‐extractie uit grote hoeveelheden plantenmateriaal  De  RNeasy  Plant  Mini  Kit  (Qiagen,  Hilden,  Duitsland)  is  ontwikkeld  voor  de 

opzuivering  van  totaal  RNA  uit  grotere  hoeveelheden  plantencellen  en  ‐weefsels.  Hierbij  wordt tot 100 mg plantenmateriaal verbrijzeld in vloeibaar stikstof en vervolgens gelyseerd  en gehomogeniseerd in een denaturerende lysis buffer. In deze studie werd telkens 73 mg  plantenmateriaal gebruikt om RNA uit te extraheren. De kit biedt de keuze uit twee buffers,  namelijk  RLT  of  RLC,  die  respectievelijk  guanidine  thiocyanaat  en  guanidine  hydrochloride  bevatten. Aangezien RLT een betere cellyse en denaturatie oplevert, gaat de voorkeur naar  deze  buffer.  Beide  buffers  inactiveren  RNases  om  de  opzuivering  van  intact  RNA  te  garanderen.  Na  de  cellyse  worden  de  stalen  gecentrifugeerd  doorheen  een  QIAshredder  homogenizer. Hierdoor wordt onoplosbaar materiaal verwijderd en daalt de viscositeit van  het  lysaat.  Om  optimale  condities  voor  selectieve  binding  van  het  RNA  op  de  RNeasymembraan te verkrijgen, wordt het gezuiverd lysaat gemengd met ½ volume ethanol  en  overgebracht  op  een  RNeasy  Mini  spin  kolom  waarop  het  totale  RNA  zal  binden.  Vervolgens worden contaminanten weggewassen door een serie van wasstappen. Als laatste  stap wordt het RNA geëlueerd in 30 µL RNase‐vrij water. Met de RNeasy procedure worden  alle  RNA  moleculen  langer  dan  200  nucleotiden  opgezuiverd.  Hierdoor  is  er  een  aanrijking 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 34    van  mRNA  aangezien  de  meeste  RNA‐moleculen,  zoals  rRNA  en  tRNA,  minder  dan  200  nucleotiden bevatten. Bij deze testen wordt standaard geen DNase behandeling uitgevoerd  omdat  er  bij  deze  methode  een  aanconcentrering  gebeurt  van  het  RNA.  Daarnaast  wordt  een  DNase  behandeling  ook  vermeden  om  de  kwaliteit  van  het  RNA  zo  intact  mogelijk  te  houden. Om toch een idee te krijgen over de hoeveelheid contaminerend DNA werd bij één  staal achteraf nog een DNase behandeling uitgevoerd.   3.3.7.2

Invloed DNase behandeling  Om  een  idee  te  hebben  over  de  hoeveelheid  contaminerend  DNA  bij  een  RNA‐

extractie  met  de  RNeasy  Plant  Mini  kit  en  het  nut  van  een  DNase‐behandeling  werd  RNA  geëxtraheerd met de RNeasy Plant Mini Kit uit 73 mg plantenmateriaal van een acht‐maand‐ oude  Artemisia  annua  anamed  plant  dat  verbrijzeld  werd  in  vloeibaar  stikstof.  Vervolgens  werd  op  4  µL  van  dit  staal  een  DNase‐behandeling  uitgevoerd  volgens  een  DNase‐ behandelingsprotocol  van  Promega  (Madison,  USA).  Hierbij werd  per  µg  RNA  één  unit  van  RQ1  RNase‐vrij  DNase  toegevoegd.  Per  staal  werd  ook  1  µL  RQ1  RNase‐vrij  DNase  10x  Reaction Buffer toegevoegd en vervolgens aangelengd met nuclease‐vrij water tot een finaal  volume van 10 µL. Dit mengsel werd gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Om de  reactie te stoppen werd 1 µL van RQ1 DNase Stop Solution toegevoegd. Vervolgens werd 10  minuten  geïncubeerd  bij  65°  C  om  het  DNase  te  inactiveren.  Daarna  werd  het  RNA  terug  opgezuiverd met de RNeasy Plant Mini Kit en geëlueerd in 30 µL water. Uiteindelijk werden  beide  stalen,  zowel  vóór  als  ná  de  DNase‐behandeling  geanalyseerd  met  de  NanoDrop  Spectrofotometer  en  het  Experion  systeem.  Op  die  manier  kan  ook  de  invloed  van  contaminerend DNA op deze bepalingsmethoden bekeken worden.   3.3.7.3

Invloed fixatie  Om  de  invloed  van  fixatie  op  de  RNA‐kwaliteit  na  te  gaan,  werd  ongeveer  73  mg 

plantenmateriaal van een acht‐maand‐oude Artemisia annua anamed plant gefixeerd zoals  beschreven  in  3.3.6.3.  Er  werd  evenveel  niet‐gefixeerd  plantenmateriaal  afgewogen.  Vervolgens  werd  het  RNA  uit  deze  stalen  geëxtraheerd  met  de  RNeasy  Plant  Mini  Kit.  Het  plantenmateriaal  werd  hier  voor  extractie  echter  niet  verbrijzeld  in  vloeibaar  stikstof.  De  concentratie  en  kwaliteit  van  het  geëxtraheerde  RNA  werd  nagegaan  met  de  NanoDrop  spectrofotometer en het Experion Systeem. 

M A T E R I A L E N   E N   M E T H O D E N  | 35    3.3.7.4

Verschillende samplingtijden  Aangezien RNA snel degradeert, moet zo snel mogelijk gewerkt worden. Er moet dus 

een  optimale  balans  gevonden  worden  tussen  een  korte  samplingtijd  en  voldoende  aantal  trichomen. Om de invloed van tijd op de RNA‐kwaliteit na te gaan, werden RNA extracties  uitgevoerd na verschillende samplingtijden, namelijk na 0 minuten, 10 minuten en 2 uur. De  hoeveelheid  RNA  geëxtraheerd  uit  LMPC‐stalen  is  echter  te  laag  voor  een  optimale  kwaliteitsbepaling.  Daarom  werd  het  RNA  voor  deze  test  ook  uit  grotere  hoeveelheden  plantenmateriaal  geëxtraheerd.  Voor  elk  staal  werd  ongeveer  73  mg  afgewogen  van  een  acht‐maand‐oude  Artemisia  annua  anamed  plant.  Dit  plantenmateriaal  werd  hier  niet  verbrijzeld  in  vloeibaar  stikstof  maar  onmiddellijk  overgebracht  in  lysis  buffer  met  β‐ mercaptoethanol  voor  lyse  van  de  cellen.  Vervolgens  werden  de  stalen  ofwel  zo  snel  mogelijk, ofwel na tien minuten, ofwel na twee uur ingevroren in vloeibaar stikstof en in de  diepvries bewaard bij ‐80 °C. Daarna werd het RNA uit elk staal geëxtraheerd met behulp van  de  RNeasy  Plant  Mini  Kit.  De  kwantiteits‐  en  kwaliteitbepaling  van  de  RNA‐stalen  werd  uitgevoerd met de NanoDrop spectrofotometer en het Experion Systeem.  3.3.8

Nanoprep bij verschillende temperatuur  Het protocol van de RNeasy Plant Mini Kit dient bij kamertemperatuur uitgevoerd te 

worden, ondanks de labiele eigenschappen van RNA. De Absolutely RNA Nanoprep kit werkt  volgens dezelfde principes als de RNeasy Plant Mini kit. In het protocol van de Nanoprep kit  wordt  echter  geen  informatie  gegeven  over  de  optimale  temperatuur  tijdens  de  extractieprocedure.  Om  die  reden  werd  de  invloed  van  de  omgevingstemperatuur  op  een  RNA‐extractie  nagegaan  door  RNA  bij  verschillende  temperaturen  te  extraheren  uit  twee  intacte bloemknoppen van een acht‐maand‐oude Artemisia annua anamed plant. Hiervoor  werd  het  plantenmateriaal  in  eerste  instantie  verbrijzeld  in  vloeibaar  stikstof  en  overgebracht  in  100  µL  lysis  buffer  met  0,70  µL  β‐mercaptoethanol.  Dit  lysaat  werd  vervolgens  gecentrifugeerd  doorheen  een  Qiashredder  kolom.  Daarna  werd  het  RNA  geëxtraheerd  met  behulp  van  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit.  Een  eerste  extractie  werd  uitgevoerd  op  ijs,  waarbij  ook  de  centrifuge  op  4°  C  werd  ingesteld.  Een  tweede  extractie  werd bij kamertemperatuur toegepast. De concentratie en kwaliteit van de twee stalen werd  gemeten met de NanoDrop spectrofotometer en het Experion analyse systeem. 

R E S U L T A T E N  | 36    4 RESULTATEN  4.1

METABOLIETSTUDIE 

4.1.1

Concentratiebepaling van artemisinine en zijn biosynthetische precursoren 

4.1.1.1 In incubatiewater van A. annua  De  resultaten  van  deze  test  tonen  aan  dat  artemisinine  en  zijn  biosynthetische  precursoren  vanuit  de  glandulaire  trichomen  in  het  omringende  water  migreren  en  dus  mogelijk  contaminatie  kunnen  veroorzaken.  In  Figuur  4.1.  wordt  de  concentratie  van  artemisinine, DHA zuur en artemisininezuur in het water afkomstig van tien opeenvolgende  incubatiestappen met 20 A. annua anamed bloemknoppen weergegeven. Na het versnijden  van de bloemknoppen is een stijging van artemisinine en DHA zuur te zien, artemisininezuur  vertoont daarentegen geen duidelijk merkbare stijging.  

Concentratie (ng/µL)

3,00

Gemiddelde concentratie van 3 pools incubatiewater van A. annua

2,50

artemisinine DHA zuur

2,00

artemisininezuur

1,50 1,00 0,50 0,00

  FIGUUR  4.1. : GEMIDDELDE CONCENTRATIE AAN ARTEMISININE, DHA ZUUR EN ARTEMISININEZUUR  VAN 3 POOLS WATER NA INCUBATIE MET A. ANNUA BLOEMKNOPPEN. 

4.1.1.2 In munttrichomen geïsoleerd uit incubatiewater van A. annua  De  munttrichomen,  geschoten  uit  het  water  afkomstig  van  de  eerste  incubatiestap  van  A.  annua,  bleken  per  trichoom  0,011  ng  artemisinine,  0,038  ng  DHA  zuur  en  0,023  ng  artemisininezuur  te  bevatten.  Aangezien  bewezen  is  dat  er  in  munttrichomen  geen 

R E S U L T A T E N  | 37    artemisininesynthese  plaatsvindt,  kunnen  we  besluiten  dat  er  hier  sprake  is  van  contaminatie. De contaminatie in de munttrichomen blijkt van dezelfde grootte‐orde te zijn  als de concentraties aan artemisinine en zijn biosynthetische precursoren gedetecteerd in de  apicale en  subapicale cellen  van  A.  annua  bij  de  eerder  uitgevoerde  metabolietstudie,  wat 

ng/munttrichoom       of  ng/A.annua‐cel

geïllustreerd wordt in Figuur 4.2.  

0,050

Hoeveelheid artemisinine, DHA zuur en artemisininezuur in munttrichomen  in vergelijking met apicale en subapicale cellen van A. annua  artemisinine

0,040

DHA zuur

0,030

artemisininezuur

0,020 0,010 0,000 munttrichomen

apicale cellen 

subapicale cellen 

 

FIGUUR 4.2. : GEMIDDELDE CONCENTRATIE AAN ARTEMISININE, DHA ZUUR EN ARTEMISININEZUUR  PER MUNTTRICHOOM GESCHOTEN UIT INCUBATIEWATER VAN A. ANNUA IN VERGELIJKING MET   APICALE EN SUBAPICALE CELLEN VAN A. ANNUA. 

4.1.1.3 In filamenteuze en glandulaire trichomen na wassen van versneden bloemknoppen  van A. annua  De glandulaire trichomen, geïsoleerd uit de versneden en gewassen bloemknoppen,  bleken  geen  detecteerbare  hoeveelheid  artemisinine  meer  te  bevatten.  Dit  toont  aan  dat  artemisinine  weggewassen  is.  Ook  in  de  filamenteuze  trichomen  werd  na  wassen  geen  artemisinine gedetecteerd. 

ng/trichoom

0,050

Hoeveelheid artemisinine, DHA zuur en artemisininezuur  in glandulaire en filamenteuze trichomen artemisinine

0,040

DHA zuur

0,030

artemisininezuur

0,020 0,010 0,000 Glandulaire Trichomen

Filamenteuze Trichomen

 

FIGUUR 4.3. : GEMIDDELDE CONCENTRATIE AAN ARTEMISININE, DHA ZUUR EN ARTEMISININEZUUR  PER TRICHOOM GEÏSOLEERD NA WASSEN VAN VERSNEDEN BLOEMKNOPPEN VAN A. ANNUA. 

R E S U L T A T E N  | 38    4.1.2

Concentratiebepaling van artemisinine in fytopreparaten  De  hoeveelheid  aan  artemisinine,  bepaald  via  HPLC‐ESI  Q‐TOF  MS/MS,  in  de 

chloroformextracten van de drie artemisinine‐preparaten wordt weergegeven in Tabel 4.1.  Hieruit  blijkt  dat  in  552,50  mg  gedroogd  thee‐extract  (min  tong)  geen  artemisinine  gedetecteerd werd. Aangezien de detectielimiet 0,9 ng/mg bedraagt, kan besloten worden  dat  dit  preparaat  inderdaad  geen  noemenswaardige  hoeveelheid  artemisinine  bevat.  De  artemisinineconcentratie  van  de  gedroogde  Artemisia  blaadjes  (minésterio  da  saùde)  ligt  rond  de  waarden  die  op  de  verpakking  vermeld  staan.  Het  preparaat  met  de  hoogste  concentratie  aan  artemisinine  zijn  de  capsules  van  aov  die  3,35  %  artemisinine  blijken  te  bevatten, wat zelfs meer is dan de vermelde concentratie op de verpakking van dit product.   TABEL  4.1.  :  HOEVEELHEID  ARTEMISININE,  BEPAALD  VIA  HPLC‐ESI  Q‐TOF  MS/MS,  IN  CHLOROFORMEXTRACTEN VAN DRIE  ARTEMISININE‐PREPARATEN.  mg  mL  mg  preparaat  chloroform  artemisinine  1 capsule  poeder   (min tong)  1 zakje gedroogd  blad  (min. da saude)  1 capsule  (aov) 

4.2 4.2.1

actueel gew%  artemisinine 

theoretisch gew%  artemisinine  (volgens verpakking)

552,50 

50,00 

0,00 

0,00 

niet vermeld 

1250,00 

50,00 

9,17 

0,73 

0,8 tot 1 

588,60 

50,00 

19,74 

3,35 

2,55 

TRANSCRIPTOOMSTUDIE  Concentratie‐ en kwaliteitsbepaling van RNA‐stalen  Zowel  NanoDrop,  RiboGreen  als  Experion  werden  gebruikt  voor  concentratie‐  en 

kwaliteitsbepalingen  van  RNA  dat  geëxtraheerd  werd  uit  een  referentiestaal,  namelijk  Human Brain Reference RNA. Ook een 4x‐verdunning van dit geëxtraheerde RNA werd met  de verschillende methoden gemeten. Experion en NanoDrop detecteerden in dit verdunde  staal echter een hogere concentratie dan in het oorspronkelijke staal, waardoor we kunnen  besluiten  dat  deze  methoden  niet  betrouwbaar  zijn  voor  kwantificatie  van  lage  RNA‐ concentraties.  RiboGreen  kan  dus  beschouwd  worden  als  de  meest  betrouwbare  methode  voor de concentratiebepaling van het RNA. Nadeel is dat deze methode grote hoeveelheden  staal vereist voor de meting van stalen met een lage RNA‐concentratie. Om die reden werd 

R E S U L T A T E N  | 39    een RiboGreen meting in deze studie niet veel uitgevoerd om staal te bewaren voor verdere  analyses.  Bovendien  kan  met  RiboGreen  ook  geen  informatie  verkregen  worden  over  de  RNA‐kwaliteit,  waardoor  voor  kwaliteitsbepalingen  overgeschakeld  werd  op  het  Experion  systeem.  TABEL  4.2.  :  CONCENTRATIE  VAN  RNA  GEËXTRAHEERD  UIT  EEN  REFERENTIESTAAL,  GEMETEN  MET  EXPERION,  RIBOGREEN  EN  NANODROP.  RIBOGREEN  BLIJKT  DE  MEEST  BETROUWBARE  METHODE  VOOR KWANTITEITSBEPALING. 

EXTRACTIE REFERENTIESTAAL  EXTRACTIE REFERENTIESTAAL  4 x VERDUND 

Experion  RNA‐concentratie  ng/µL  0,0780 

RiboGreen  RNA‐concentratie  ng/µL  1,58 

NanoDrop  RNA‐concentratie  ng/µL  3,79 

0,106 

0,440 

5,19 

  4.2.2

Vergelijking verschillende extractiekits 

FIGUUR  4.4.  :  CHROMATOGRAMMEN,  VERKREGEN  MET  HET  EXPERION  SYSTEEM,  VAN  RNA GEËXTRAHEERD  UIT  A.  ANNUA.  MET  VERSCHILLENDE  EXTRACTIEKITS.  DE  ABSOLUTELY  RNA NANOPREP KIT (RECHTS) EXTRAHEERT RNA MET HOGERE KWALITEIT DAN DE RNAQUEOUS®‐MICRO KIT (LINKS). 

De  RNA‐stalen,  verkregen  na  extractie  uit  plantenmateriaal  met  behulp  van  de  RNAqueous®‐Micro  kit  en  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit,  werden  geanalyseerd  met  het  Experion  RNA  Analyse  systeem.  Er  werden  geen  verschillen  in  RNA‐concentratie  waargenomen,  beide  kits  extraheerden  dus  evenveel  RNA.  Uit  de  bekomen  chromatogrammen  (zie  Figuur  4.4)  bleek  het  RNA  geëxtraheerd  via  de  Absolutely  RNA  Nanoprep kit uit langere fragmenten te bestaan en dus van hogere kwaliteit te zijn dan het  RNA  geëxtraheerd  via  de  RNAqueous®‐Micro  kit.  Om  die  reden  werd  voor  de  volgende 

R E S U L T A T E N  | 40    testen  gebruik  gemaakt  van  de  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit.  Er  moet  ook  opgemerkt  worden  dat  in  deze  stalen  geen  rRNA  gedetecteerd  werd.  Om  na  te  gaan  of  het  rRNA  verloren  gegaan  of  gedegradeerd  is  tijdens  de  extractieprocedure,  zal  RNA  uit  een  referentiestaal geëxtraheerd worden met de  Absolutely RNA Nanoprep kit.  4.2.3

Extractie van een referentiestaal 

TABEL  4.3.  :  HOEVEELHEID  TOTAAL  RNA  (ng)  IN  10  µL  REFERENTIESTAAL  (10  ng/µL),  VÓÓR  EN  NA  EXTRACTIE MET DE ABSOLUTELY RNA NANOPREP KIT.  VOOR EXTRACTIE  NA EXTRACTIE  PERCENTAGE GEËXTRAHEERD 

Experion  47,5 ng  4,24 ng  10% 

RiboGreen  73,0 ng  17,6 ng  25% 

De  Abslutely  RNA  Nanoprep  extractiekit  werd  toegepast  voor  de  RNA‐extractie  uit  een  referentiestaal,  namelijk  Human  Brain  Reference  RNA  (HBRR)  met  een  gekende  concentratie  van  10  ng/µL.  Volgens  RiboGreen  bedraagt  de  concentratie  van  het  oorspronkelijke  referentiestaal  7,30  ng/µL.  Aangezien  de  gegeven  concentratie  van  dit  referentiestaal  10  ng/µL  bedroeg,  wijst  dit  erop  dat  de  RNA‐kwaliteit  waarschijnlijk  door  herhaaldelijk ontdooien en terug invriezen verminderd is. Er werd RNA geëxtraheerd uit 10  µL van dit referentiestaal, wat bij 100% extractie een theoretische opbrengst van 73 ng zou  opleveren. De opbrengst na extractie was echter 17,60 ng. Volgens de RiboGreen‐resultaten  is de Nanoprep methode dus in staat om één vierde van het input RNA te elueren. Volgens  de Experion‐resultaten wordt echter slechts 10 % van het input RNA geëlueerd. In volgende  testen moet er dus rekening mee gehouden worden dat slechts een fractie aan RNA in de  stalen effectief geëlueerd wordt. Er moet ook opgemerkt worden dat de ribosomale pieken,  18S  en  28S,  hier  wel  gedetecteerd  worden.  Na  extractie  zien  we  echter  een  duidelijke  vermindering  van  het  ribosomaal  RNA  waardoor  we  kunnen  besluiten  dat  het  ribosomaal  RNA tijdens de extractieprocedure degradeert of gedeeltelijk verloren gaat.  

FIGUUR  4.5.  :  EXPERION‐CHROMATOGRAMMEN  VOOR  EN  NA  EXTRACTIE  VAN  RNA  UIT  10µL REFERENTIESTAAL. NA EXTRACTIE IS ER EEN DUIDELIJKE VERMINDERING VAN RIBOSOMAAL RNA. 

R E S U L T A T E N  | 41    4.2.4

LMPC stalen 

4.2.4.1

Preliminaire test  In een eerste test werd het totale RNA geëxtraheerd uit 150 ongefixeerde volledige 

glandulaire  trichomen  die  in  20  µL  verzameld  werden.  De  RNA‐opbrengst,  bepaald  via  de  Experion  RNA  Analyse  Kit  en  RiboGreen  RNA  Quantition  Kit,  bedroeg  in  dit  staal  respectievelijk 290 pg en 2 170 pg. Dit is echter veel lager dan verwacht aangezien 900 cellen  (150  trichomen  waarvan  minimum  6  cellen  verzameld)  theoretisch  18  000  à  270  000  pg  totaal RNA zouden bevatten. Hierbij gaan we er van uit dat één cel 1 à 3 pg mRNA bevat, wat  1‐5%  van  het  totale  RNA  vormt.  De  lage  opbrengst  kan  te  wijten  zijn  aan  de  samplingmethode. Aangezien LMPC als samplingtechniek niet 100 % betrouwbaar is, bestaat  de mogelijkheid dat niet alle cellen in het epje terechtkomen. Dit kan te wijten zijn aan het  kleine samplingvolume (20 µL) dat in deze test gebruikt werd. Om dit na te gaan werd ook  de RNA‐opbrengst bekeken bij een volgende test met als samplingvolume 40 µL, waarbij het  vloeistofoppervlak dichter bij het preparaat staat en de trichomen dus een kortere afstand  moeten afleggen.   4.2.4.2

Verschillende samplingvolumes  De  RNA‐opbrengst,  verkregen  na  extractie  uit  150  glandulaire  trichomen  die 

verzameld  werden  in  ofwel  20  µL  of  40  µL  lysis  buffer,  werd  gemeten  met  zowel  het  Experion RNA Analyse systeem als de NanoDrop spectrofotometer (zie Tabel 4.4). Zowel bij  Experion als bij NanoDrop vertoonden de twee samplingmethodes geen duidelijk verschil in  RNA‐kwantiteit.  De  RNA‐opbrengst  bleek  echter  te  laag  om  de  RNA‐kwaliteit  via  Experion  optimaal  te  kunnen  meten.  Aangezien  de  260/280  ratio,  berekend  bij  de  NanoDrop  spectrofotometer,  niet  tussen  1,8  en  2,0  ligt,  kunnen  we  wel  besluiten  dat  ons  staal  niet  zuiver  genoeg  is.  Waarschijnlijk  vertonen  nog  aanwezige  plantencontaminanten  te  veel  interferentie met de absorbantie. Ook de 260/230 ratio ligt onder de optimale waarde. Dit  wijst  op  contaminatie  met  proteïnen,  phenolen  of  chaotropische  zouten  zoals  guanidine  thiocyanaat.  Bovendien  bevinden  de  RNA‐concentraties  in  deze  stalen  zich  ook  onder  de  detectielimiet  van  de  NanoDrop  spectrofotometer  waardoor  de  betrouwbaarheid  van  de  resultaten in vraag kan gesteld worden. 

R E S U L T A T E N  | 42    TABEL  4.4.  :  HOEVEELHEID  RNA  GEËXTRAHEERD  MET  DE  ABSOLUTELY  RNA  NANOPREP  KIT  UIT  150  GLANDULAIRE  TRICHOMEN  (VERZAMELD  IN  VERSCHILLENDE  SAMPLINGVOLUMES,  NAMELIJK  20  µL  EN 40 µL) IN EEN TOTAAL VAN 10 µL ELUTIEBUFFER. 

20 µL  40 µL 

Experion  RNA‐kwantiteit  RNA‐kwaliteit  ng/µL  RQI  0,146  RNA‐conc. too low  0,134  RNA‐conc. too low 

NanoDrop  RNA‐kwantiteit  RNA‐kwaliteit  ng/µL  260/280  260/230 6,79  1,60  0,08  5,21  1,62  0,05 

Er  moet  ook  opgemerkt  worden  dat  de  test  waarbij  20µL  gebruikt  werd  als  samplingvolume  in  principe  een  herhaling  is  van  de  eerste  test  besproken  in  4.2.4.1.  De  opbrengst  blijkt  hier  echter  groter te  zijn,  namelijk  1  460  pg  vergeleken  met  290  pg  bij  de  eerste test. Door meerdere testen uit te voeren, zal de reproduceerbaarheid van deze hoge  concentraties nagegaan worden. Dit wordt bij de volgende paragraaf in detail besproken.  4.2.4.3

Invloed fixatie  De gemiddelde RNA‐opbrengst bedraagt voor de gefixeerde en niet‐gefixeerde LMPC 

stalen  respectievelijk  100  pg  en  170  pg  geanalyseerd  met  het  Experion  systeem  (in  een  totaal  van  10  µL  elutiebuffer),  wat  veel  lager  is  dan  de  opbrengst  in  de  stalen  bij  4.2.4.2.  (ongeveer  1  500  pg)  waardoor  we  kunnen  besluiten  dat  de  hoge  waarden  in  voorgaande  testen  niet  reproduceerbaar  zijn  en  er  waarschijnlijk  contaminatie  is  opgetreden.  De  NanoDrop  spectrofotometer  detecteerde  echter  een  veel  hogere  RNA‐opbrengst,  namelijk  75 600 pg en 213 400 pg, voor de gefixeerde en niet‐gefixeerde stalen respectievelijk. Deze  hoge  waarden  zijn  echter  niet  betrouwbaar  aangezien  de  RNA‐concentratie  onder  de  detectielimiet (2 à 5 ng/µL) van de NanoDrop methode ligt. Bovendien kan besloten worden  dat  de  gefixeerde  stalen  geen  grotere  RNA‐opbrengst  opleveren  dan  de  niet‐gefixeerde  stalen, ondanks de lagere oppervlaktespanning van de fixeervloeistof.    TABEL  4.5.  :  HOEVEELHEID  RNA  GEËXTRAHEERD  MET  DE  ABSOLUTELY  RNA  NANOPREP  KIT  UIT  150  GEFIXEERDE  EN  NIET‐GEFIXEERDE  GLANDULAIRE  TRICHOMEN  IN  EEN  TOTAAL  VAN  10  µL  ELUTIEBUFFER.  FIX 1  FIX 2  FIX 3  NIET FIX 1  NIET FIX 2  NIET FIX 3 

Experion (ng/µL)  0,009     0,004  gemiddelde = 0,010  0,015     0,025     0,010  gemiddelde = 0,017  0,015    

NanoDrop (ng/µL)  5,84     6,41  gemiddelde = 7,560  10,43     5,80     8,91  gemiddelde = 21,34  6,63    

R E S U L T A T E N  | 43    4.2.5

Optimalisatie met meer plantenmateriaal 

4.2.5.1

Invloed DNase behandeling  Na  een  DNase  behandeling  blijkt  slechts  een  percentage  van  de  oorspronkelijke 

hoeveelheid  RNA  over  te  blijven.  Dit  wijst  er  op  dat  er  in  eerste  instantie  contaminerend  DNA  aanwezig  was  waardoor  de  RNA‐concentraties  foutief  verhoogd  werden.  Vooral  de  NanoDrop metingen vertonen sterke interferentie met het contaminerend DNA.   TABEL  4.6.  :  OVERBLIJVEND  PERCENTAGE  RNA  NA  DNase  BEHANDELING  VAN  RNA  GEËXTRAHEERD  UIT PLANTENMATERIAAL VAN A. ANNUA.   VOOR DNase BEHANDELING  NA DNase BEHANDELING  OVERBLIJVEND PERCENTAGE  

Experion  2235 ng  1361 ng  61 % 

NanoDrop  3774 ng  1421 ng  38% 

FIGUUR  4.6.  :  EXPERION‐CHROMATOGRAMMEN  VAN  RNA  GEËXTRAHEERD  MET  DE  RNEASY  PLANT MINI KIT UIT PLANTENMATERIAAL VAN A. ANNUA VÓÓR (LINKS) EN NA (RECHTS) DNase BEHANDELING. 

4.2.5.2

Invloed fixatie  Om  de  invloed  van  fixatie  op  de  RNA‐kwaliteit  te  kunnen  bepalen,  moest 

overgeschakeld  worden  op  grotere  hoeveelheden  plantenmateriaal,  namelijk  ongeveer  73  mg  Artemisia  bloemknoppen  en  ‐blaadjes.  De  concentratie  en  kwaliteit  van  hieruit  geëxtraheerd  RNA  werd  nagegaan  met  de  NanoDrop  spectrofotometer  en  het  Experion  Systeem.  Hieruit  blijkt  dat  fixatie  duidelijk  een  negatieve  invloed  heeft  op  zowel  de  RNA‐ kwantiteit  als  –kwaliteit.  Er  wordt  ook  opgemerkt  dat  het  niet‐gefixeerd  staal  een  betere  ratio  A260/A280  (tussen  1,8  en  2,0)  en  ratio  A260/A230  (ongeveer  2,0)  vertoont.  In  het  niet‐ gefixeerd  staal  zijn  dus  minder  contaminanten  aanwezig  die  interfereren  met  de  absorbantie.      

R E S U L T A T E N  | 44    TABEL 4.7. : KWANTITEIT EN KWALITEIT VAN RNA GEËXTRAHEERD MET DE RNEASY PLANT MINI KIT  UIT  GEFIXEERD  EN  NIET‐GEFIXEERD  PLANTENMATERIAAL  VAN  A.  ANNUA  IN  EEN  TOTAAL  VAN  30µl  ELUTIEBUFFER 

FIX  NIET FIX 

Experion  RNA‐kwantiteit  RNA‐kwaliteit  ng/µL  RQI   RNA‐conc.   4,57  too low  552  2,9 

NanoDrop  RNA‐kwantiteit  RNA‐kwaliteit  ng/µL  260/280  260/230  7,15 

1,41 

0,47 

345 

1,84 

1,94 

 

FIGUUR 4.7. : EXPERION‐CHROMATOGRAMMEN VAN RNA GEËXTRAHEERD UIT GEFIXEERD (RECHTS) PLANTENMATERIAAL  VAN  A.  ANNUA  VERTONEN  DUIDELIJK  EEN  MINDERE  RNA‐KWALITEIT  EN  ‐ KWANTITEIT DAN UIT NIET‐GEFIXEERD PLANTENMATERIAAL (LINKS) 

4.2.5.3

Verschillende samplingtijden  Ondanks  het  feit  dat  RNA  labiel  is  en  we  dus  een  daling  in  kwaliteit  en  kwantiteit 

verwachten  in  functie  van  de  tijd,  is  er  toch  geen  duidelijke  dalende  trend  te  zien.  De  chromatogrammen,  verkregen  via  Experion,  vertonen  wel  een  vermindering  van  de  RNA‐ kwaliteit,  maar  deze  afname  is  minder  dan  verwacht.  Volgens  deze  resultaten  zou  een  langere samplingtijd de RNA‐kwantiteit en ‐kwaliteit dus niet noemenswaardig beïnvloeden.    TABEL 4.8. : KWANTITEIT EN KWALITEIT VAN RNA GEËXTRAHEERD MET DE RNEASY PLANT MINI KIT  UIT  PLANTENMATERIAAL  VAN  A.  ANNUA  NA  0,  10  EN  120  MINUTEN  IN  EEN  TOTAAL  VAN  30  µL  ELUTIEBUFFER. 

0 min 

Experion  RNA‐kwantiteit  RNA‐kwaliteit  ng/µL  RQI  353  7,7 

NanoDrop  RNA‐kwantiteit  RNA‐kwaliteit  ng/µL  260/280  260/230  523  1,79  1,91 

10 min 

752 

7,6 

796 

2,03 

2,24 

120 min 

501 

7,8 

370 

2,05 

1,38 

R E S U L T A T E N  | 45   

FIGUUR  4.8.  :  EXPERION‐CHROMATOGRAMMEN  VAN  RNA  GEËXTRAHEERD  UIT  A.  ANNUA  NA  0 MINUTEN (LINKS), 10 MINUTEN (MIDDEN) EN 120 MINUTEN (RECHTS). 

4.2.6

Nanoprep bij verschillende temperatuur  Aan de hand van de chromatogrammen, verkregen via het Experion Analyse Systeem, 

kunnen  we  besluiten  dat  het  RNA  geëxtraheerd  op  ijs  van  betere  kwaliteit  is  dan  het  RNA  geëxtraheerd bij kamertemperatuur. Er moet wel opgemerkt worden dat de ratio 260/280  van  het  RNA  geëxtraheerd  bij  kamertemperatuur  beter  is  dan  bij  ijs,  maar  de  Experion‐ chromatogrammen  en  RQI‐waarde  vertonen  toch  een  betere  kwaliteit  voor  de  RNA‐stalen  geëxtraheerd op ijs. Er zijn echter geen noemenswaardige verschillen in RNA‐kwantiteit.   TABEL  4.9.  :  KWANTITEIT  EN  KWALITEIT  VAN  RNA  GEËXTRAHEERD  MET  DE  ABSOLUTELY  RNA  NANOPREP KIT, OP IJS OF BIJ KAMERTEMPERATUUR, UIT TWEE VOLLEDIGE BLOEMKNOPPEN VAN A.  ANNUA IN EEN TOTAAL VAN 10 µL ELUTIEBUFFER.  Experion  NanoDrop  RNA‐concentratie RNA‐kwaliteit RNA‐concentratie  RNA‐kwaliteit  ng/µL  RQI  ng/µL  260/280  260/230 27,06  9,40  3,81  0,04  8,6 

Ijs  Kamertemperatuur 

22,72 

4,6 

21,34 

1,97 

0,08 

 

FIGUUR 4.9. : HET RNA BEKOMEN NA EXTRACTIE OP IJS (LINKS) IS VAN BETERE KWALITEIT DAN HET RNA GEËXTRAHEERD BIJ KAMERTEMPERATUUR (RECHTS). 

 

D I S C U S S I E | 46    5 DISCUSSIE   5.1

Contaminatie bij metabolietanalyse van apicale en subapicale cellen  Hoewel in een eerder uitgevoerde metabolietstudie artemisinine in eerste instantie 

enkel  gedetecteerd  werd  in  de  apicale  cellen  en  niet  in  de  subapicale  cellen,  kan  hieruit  omwille van contaminatie toch geen besluiten getrokken worden. In het eerste luik van deze  scriptie  werd  artemisinine  namelijk  gedetecteerd  in  munttrichomen  die  geïsoleerd  werden  uit  water  geïncubeerd  met  A.  annua  bloemknoppen,  hoewel  bewezen  is  dat  muntplanten  geen  artemisinine  produceren.  Dit  bewijst  dat  artemisinine  en  zijn  biosynthetische  precursoren  in  het  omringende  water  migreren  en  vervolgens  via  LMPC  samen  met  de  geschoten cellen in het epje gekatapulteerd worden, zelfs al produceren de cellen zelf geen  artemisinine.   Een  aantal  hypothesen  kunnen  deze  resultaten  ondersteunen.  In  een  eerste  hypothese  gaan  we  ervan  uit  dat  artemisinine  vanuit  het  water  via  poriën  in  de  cellen  opgenomen wordt of op de celwand of cuticula van de trichomen adheert. Anderzijds is het  ook mogelijk dat waterdruppels met daarin artemisinine op zichzelf meegeschoten worden,  ondanks  de  grote  oppervlaktespanning  van  water.  Dit  kan  verklaard  worden  doordat  het  wateroppervlak  gebroken  wordt  door  het  aanwezige  plantenmateriaal  waardoor  de  oppervlaktespanning  daalt.  Een  andere  verklaring  is  dat  de  geschoten  cellen  de  vorm  van  een kuipje aannemen en zo de mogelijkheid vormen dat waterdruppels meegekatapulteerd  worden.  5.2

Concentratie van artemisinine in fytopreparaten  In  het  tweede  luik  van  deze  scriptie  werd  de  artemisinineconcentratie  bepaald  van 

drie  artemisinine‐preparaten  die  tegenwoordig  op  de  markt  te  vinden  zijn.  Er  werd  vastgesteld  dat  één  preparaat  geen  detecteerbaar  artemisinine  bevat  en  dus  niet  gebruikt  kan  worden  als  waardevolle  therapie.  De  andere  twee  preparaten  bleken  wel  voldoende  concentraties  artemisinine  te  bevatten,  maar  deze  zijn  tot  nu  toe  nog  niet  verkrijgbaar  in  België. Vooral de aov capsules met een gewichtspercentage 3,35 % aan artemisinine kunnen  beschouwd  worden  als  een  veelbelovende  therapie  bij  bijvoorbeeld  de  behandeling  van  bepaalde types kanker. 

D I S C U S S I E | 47    5.3

Optimalisatie RNA‐extractie voor next generation sequencing  In  het  derde  luik  van  deze  scriptie  werd  getracht  RNA  te  extraheren  uit  volledige 

glandulaire trichomen om in de toekomst het transcriptoom van apicale en subapicale cellen  te kunnen sequeneren. Vooraleer de next generation sequencing kan plaatsvinden, moet het  RNA eerst geamplificeerd worden met behulp van de Ovation® RNA‐Seq System kit. Deze kit  vereist RNA van hoge kwaliteit en een minimale input van 500 pg in een maximum volume  van  5µL.  Een  hoge  RNA‐kwaliteit  is  eveneens  belangrijk  om  de  volledige  lengte  van  het  transcriptoom  te  kunnen  bepalen.  Om  aan  deze  hoge  kwaliteitseisen  te  voldoen,  werd  in  eerste  instantie  de  RNA‐extractiemethode  en  samplingmethode  geoptimaliseerd  voor  volledige glandulaire trichomen.  De  RNA‐opbrengst  uit  150  volledige  glandulaire  trichomen  werd  gemeten  met  Experion, RiboGreen en NanoDrop en bedroeg respectievelijk 290 pg, 2 170 pg en 42,5 ng.  De  resultaten  van  NanoDrop  zijn  hier  niet  betrouwbaar  aangezien  de  RNA‐concentratie  onder de detectielimiet ligt. De opbrengst was echter veel lager dan verwacht aangezien 900  cellen theoretisch 18 000 à 270 000 pg totaal RNA zouden bevatten. Hierbij gaan we er van  uit dat één cel 1 à 3 pg mRNA bevat, wat 1‐5% van het totale RNA vormt. Ter vergelijking  was er bij Olsson et al. (2009) volgens persoonlijke communicatie een RNA‐opbrengst van 30  ng  voor  210  volledige  glandulaire  trichomen  geanalyseerd  met  de  NanoDrop  spectrofotometer. Publicaties van RNA‐extracties uit cellen van verschillende plantensoorten  rapporteren meestal een opbrengst van 1,5 à 3,5 pg per LMPC‐geïsoleerde cel (Nakazono et  al., 2003; Murata & De Luca, 2005; Agusti et al., 2009). Onze opbrengst wijkt hier niet sterk  van af (2,4 pg/cel volgens RiboGreen) maar aangezien het niet haalbaar is om meer dan 150  trichomen  te  verzamelen,  is  de  totale  opbrengst  nog  onvoldoende  voor  efficiënte  kwaliteitsbepaling van het RNA. Daarom werd voor verdere optimalisatie overgeschakeld op  grotere  hoeveelheden  plantenmateriaal.  Op  die  manier  konden  ook  18S  en  28S  rRNA  gedetecteerd worden aangezien dit bij de LMPC‐stalen niet waargenomen werd.  In  eerste  instantie  werd  nagegaan  welke  analysekit  het  meest  betrouwbaar  is  voor  kwaliteit‐  en  kwantiteitsbepaling  van  het  RNA  in  deze  studie.  De  hoge  concentraties  verkregen  met  de  NanoDrop  spectrofotometer  kunnen  verklaard  worden  door  de  invloed  van  contaminanten  op  de  meting  aangezien  DNA,  nucleotiden,  fenolen  en  chaotropische  zouten eveneens absorptie vertonen bij 260 nm waardoor de concentratie valselijk verhoogd 

D I S C U S S I E | 48    wordt. De NanoDrop methode is dus enkel geschikt voor zuivere stalen, in tegenstelling tot  onze  stalen  die  hoogstwaarschijnlijk  nog  resterende  plantenmetabolieten  bevatten.  Ook  Experion bleek niet geschikt voor kwantiteitsbepalingen aangezien deze methode in een 4x  verdund  staal  een  hogere  concentratie  detecteerde  dan  in  het  oorspronkelijk  onverdunde  staal.  De  RiboGreen  resultaten  bleken  tussen  de  hoge  NanoDrop‐concentraties  en  de  lage  Experion‐resultaten  te  vallen.  Nadeel  is  dat  het  RiboGreen  reagens  interageert  met  alle  nucleïnezuren,  waardoor  deze  methode  niet  kan  differentiëren  tussen  DNA,  RNA  en  losse  nucleotiden.  Uiteindelijk  werd  geconcludeerd  dat  Experion  het  meest  betrouwbaar  is  voor  de bepaling van de RNA‐kwaliteit en RiboGreen voor de bepaling van de RNA‐kwantiteit. Een  nadeel  van  de  RiboGreen  kwantificatie  is  dat  relatief  veel  staal  nodig  is  voor  analyse  van  stalen met een lage RNA‐concentratie.   Voor de isolatie van de glandulaire trichomen uit het plantenmateriaal, werd gebruik  gemaakt van LMPC als samplingtechniek. Aangezien er nooit zekerheid is dat de geschoten  trichomen  effectief  in  het  verzamelepje  terechtkomen,  kan  men  besluiten  dat  LMPC  geen  100% betrouwbare techniek is. Dit kan een reden zijn voor de lage RNA‐opbrengst, waardoor  getracht  werd  deze  samplingtechniek  te  optimaliseren.  Er  werden  verschillende  samplingvolumes  en  samplingtijden  vergeleken,  maar  hierbij  werd  geen  merkwaardig  verschil in opbrengst gezien. Fixatie van de stalen bleek echter wel een duidelijke negatieve  invloed  te  hebben  op  de  RNA‐kwantiteit  en  kwaliteit.  Dit  kan  in  de  toekomst  problemen  vormen aangezien fixatie noodzakelijk is om apicale en subapicale cellen te kunnen isoleren.   De  lage  RNA‐opbrengst  kan  ook  te  wijten  zijn  aan  problemen  met  de  extractiemethode.  De  Absolutely  RNA  Nanoprep  kit  leek  hier  het  meest  geschikt.  Het  probleem  is  dat  deze  kit,  zoals  de  meeste  kits  die  tegenwoordig  op  de  markt  zijn,  niet  geoptimaliseerd  is  voor  plantenmateriaal.  Er  wordt  vermoed  dat  fenolische  plantenmetabolieten  kunnen  geoxideerd  worden  tot  quinonen,  die  op  hun  beurt  onoplosbare  complexen  met  nucleïnezuren  vormen.  Het  RNA  zou  dus  verloren  gaan  door  binding aan fenolen of andere plantenmetabolieten (Liu et al., 1998; Ghangal et al., 2009).   Er  is  dus  duidelijk  nog  verdere  optimalisatie  vereist  vooraleer  overgestapt  kan  worden  op  RNA‐extracties  uit  apicale  en  subapicale  cellen.  Aangezien  fixatie  van  het  plantenmateriaal noodzakelijk is voor de isolatie van deze cellen wordt de haalbaarheid om  uiteindelijk RNA, met voldoende kwaliteit en kwantiteit, uit apicale en subapicale cellen te  kunnen extraheren meer en meer in vraag gesteld. 

C O N C L U S I E | 49    6 CONCLUSIE  Een  eerder  uitgevoerde  metabolietstudie  leek  oorspronkelijk  te  bevestigen  dat  artemisinine enkel in de apicale cellen geproduceerd wordt. Hoewel artemisinine in eerste  instantie enkel in de apicale cellen gedetecteerd werd, kon hieruit omwille van contaminatie  toch  geen  besluit  worden  gevormd.  In  het  eerste  luik  van  deze  scriptie  werd  artemisinine  namelijk gedetecteerd in munttrichomen die geïsoleerd werden uit water geïncubeerd met  A.  annua  bloemknoppen.  Aangezien  bewezen  is  dat  er  in  munttrichomen  geen  artemisininesynthese  plaatsvindt,  bewijst  deze  test  dat  artemisinine  in  het  omringende  water migreert en contaminatie veroorzaakt.   Als tweede luik van deze scriptie werd op zoek gegaan naar waardevolle artemisinine  fytopreparaten die reeds op de markt te vinden zijn. Hieruit bleek dat vooral de aov‐capsules  met  een  gewichtspercentage  van  3,35%  aan  artemisinine  kunnen  beschouwd  worden  als  een veelbelovende therapie bij bijvoorbeeld de behandeling van bepaalde types kanker.  Voor de verdere opheldering van de biosynthese pathway van artemisinine werd als  derde luik van deze scriptie gestart met een transcriptoomstudie, waarbij het transcriptoom  van apicale cellen vergeleken wordt met subapicale cellen. Vooraleer RNA geëxtraheerd kan  worden  uit  apicale  en  subapicale  cellen  afzonderlijk,  werd  getracht  de  RNA‐ extractiemethode  en  samplingmethode  te  optimaliseren  voor  volledige  glandulaire  trichomen.  De  opbrengst  bleek  echter  zelfs  bij  150  volledige  trichomen  te  laag,  waardoor  voor 

verdere 

optimalisaties 

overgeschakeld 

werd 

op 

grotere 

hoeveelheden 

plantenmateriaal. De lage opbrengst kan te wijten zijn aan de Laser Microdissection Pressure  Catapulting  techniek,  die  waarschijnlijk  niet  100%  betrouwbaar  is,  alsook  aan  de  RNA‐ extractiemethode.  Ondanks  het  feit  dat  vele  extractiekits  niet  geoptimaliseerd  zijn  voor  plantenmateriaal,  bleek  de  Absolutely  RNA  NanoPrep  het  meest  geschikt  voor  kleinere  hoeveelheden. Bij de optimalisatie van de samplingmethode vertoonden zowel verschillende  samplingvolumes  als  samplingtijden  geen  merkwaardig  verschil  in  RNA‐opbrengst.  Fixatie  van de stalen blijkt wel een duidelijke negatieve invloed te hebben op de RNA‐kwantiteit en  –kwaliteit. Aangezien fixatie noodzakelijk is voor de isolatie van apicale en subapicale cellen  wordt de haalbaarheid om uiteindelijk RNA, met voldoende kwaliteit en kwantiteit, uit deze  afzonderlijke cellen te kunnen extraheren hierdoor meer en meer in vraag gesteld. 

L I T E R A T U U R L I J S T | 50    7 LITERATUURLIJST  Abdin,  M.  Z.;  Israr,  M.;  Rehman,  R.  U.;  Jain,  S.  K.  (2003).  Artemisinin,  a  novel  antimalarial  drug: biochemical and molecular approaches for enhanced production. Planta Med, 69, 289‐ 299.  Agusti, J.; Merelo, P.; Cercos, M.; Tadeo, F. R.; Talon, M. (2009). Comparative transcriptional  survey between laser‐microdissected cells from laminar abscission zone and petiolar cortical  tissue during ethylene‐promoted abscission in citrus leaves. Bmc Plant Biology, 9, 127‐147.  Balint,  G.  A.  (2001).  Artemisinin  and  its  derivatives:  an  important  new  class  of  antimalarial  agents. Pharmacol Ther, 90, 261‐265.  Bertea, C. M.; Freije, J. R.; van der Woude, H.; Verstappen, F. W.; Perk, L.; Marquez, V.; De  Kraker, J. W.; Posthumus, M. A.; Jansen, B. J.; de Groot, A.; Franssen, M. C.; Bouwmeester, H.  J.  (2005).  Identification  of  intermediates  and  enzymes  involved  in  the  early  steps  of  artemisinin biosynthesis in Artemisia annua. Planta Med, 71, 40‐47.  Bouwmeester, H. J.; Wallaart, T. E.; Janssen, M. H.; van Loo, B.; Jansen, B. J.; Posthumus, M.  A.;  Schmidt,  C.  O.;  De  Kraker,  J.  W.;  Konig,  W.  A.;  Franssen,  M.  C.  (1999).  Amorpha‐4,11‐ diene synthase catalyses the first probable step in artemisinin biosynthesis. Phytochemistry,  52, 843‐854.   Brown, G. D.; Sy, L. K. (2004). In vivo transformations of dihydroartemisinic acid in Artemisia  annua plants. Tetrahedron, 60, 1139‐1159.  Brown, G. D.; Sy, L. K. (2007). In vivo transformations of artemisinic acid in Artemisia annua  plants. Tetrahedron, 63, 9548‐9566.  Capanna, E. (2006). Grassi versus Ross: who solved the riddle of malaria? Int Microbiol, 9, 69‐ 74.  Covello, P. S. (2008). Making artemisinin. Phytochemistry, 69, 2881‐2885.  Davis, T. M.; Karunajeewa, H. A.; Ilett, K. F. (2005). Artemisinin‐based combination therapies  for uncomplicated malaria. Med J Aust, 182, 181‐185.  Day,  R.  C.;  Grossniklaus,  U.;  Macknight,  R.  C.  (2005).  Be  more  specific!  Laser‐assisted  microdissection of plant cells. Trends Plant Sci, 10, 397‐406.  de  Ridder,  S.;  van  der  Kooy,  F.;  Verpoorte,  R.  (2008).  Artemisia  annua  as  a  self‐reliant  treatment for malaria in developing countries. Journal of Ethnopharmacology, 120, 302‐314.  Delabays,  N.;  Simonnet,  X.;  Gaudin,  M.  (2001).  The  genetics  of  artemisinin  content  in  Artemisia annua L. and the breeding of high yielding cultivars. Curr Med Chem, 8, 1795‐1801.  Dondorp,  A.  M.;  Nosten,  F.;  Yi,  P.;  Das,  D.;  Phyo,  A.  P.;  Tarning,  J.;  Lwin,  K.  M.;  Ariey,  F.;  Hanpithakpong, W.; Lee, S. J.; Ringwald, P.; Silamut, K.; Imwong, M.; Chotivanich, K.; Lim, P.;  Herdman, T.; An, S. S.; Yeung, S.; Singhasivanon, P.; Day, N. P.; Lindegardh, N.; Socheat, D.;  White, N. J. (2009). Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria. N Engl J Med,  361, 455‐467.  Duke, S. O.; Paul, R. N. (1993). Development and Fine‐Structure of the Glandular Trichomes  of Artemisia‐Annua L. International Journal of Plant Sciences, 154, 107‐118. 

L I T E R A T U U R L I J S T | 51    Eckstein‐Ludwig,  U.;  Webb,  R.  J.;  Van  Goethem,  I.  D.;  East,  J.  M.;  Lee,  A.  G.;  Kimura,  M.;  O'Neill, P. M.; Bray, P. G.; Ward, S. A.; Krishna, S. (2003).  Artemisinins target the SERCA of  Plasmodium falciparum. Nature, 424, 957‐961.  Efferth,  T.  (2007).  Willmar  Schwabe  Award  2006:  antiplasmodial  and  antitumor  activity  of  artemisinin‐‐from bench to bedside. Planta Med, 73, 299‐309.  Ferreira, J. F. S.; Janick, J. (1996). Distribution of Artemisinin in Artemisia annua. ASHSS Press,  579‐584.  Firestone,  G.  L.;  Sundar,  S.  N.  (2009).  Anticancer  activities  of  artemisinin  and  its  bioactive  derivatives. Expert Reviews in Molecular Medicine, 11.  Ghangal, R.; Raghuvanshi, S.; Chand Sharma, P. (2009). Isolation of good quality RNA from a  medicinal  plant  seabuckthorn,  rich  in  secondary  metabolites.  Plant  Physiol  Biochem,  47,  1113‐1115.  Greenwood, B.; Mutabingwa, T. (2002). Malaria in 2002. Nature, 415, 670‐672.  Hsu, E. (2006). The history of qing hao in the Chinese materia medica. Trans R Soc Trop Med  Hyg, 100, 505‐508.  Kerk,  N.  M.;  Ceserani,  T.;  Tausta,  S.  L.;  Sussex,  I.  M.;  Nelson,  T.  M.  (2003).  Laser  capture  microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol, 132, 27‐35.  Liu,  C.;  Zhao,  Y.;  Wang,  Y.  (2006).  Artemisinin:  current  state  and  perspectives  for  biotechnological production of an antimalarial drug. Appl Microbiol Biotechnol, 72, 11‐20.  Liu, J. J.; Goh, C. J.; Loh, C. S.; Liu, P.; Pua, E. C. (1998). A method for isolation of total RNA  from fruit tissues of banana. Plant Molecular Biology Reporter, 16, 1‐6.  Maude, R. J.; Pontavornpinyo, W.; Saralamba, S.; Aguas, R.; Yeung, S.; Dondorp, A. M.; Day,  N. P.; White, N. J.; White, L. J. (2009). The last man standing is the most resistant: eliminating  artemisinin‐resistant malaria in Cambodia. Malar J, 8, 31‐37.  Miller, L. H.; Baruch, D. I.; Marsh, K.; Doumbo, O. K. (2002). The pathogenic basis of malaria.  Nature, 415, 673‐679.  Murata,  J.;  De  Luca,  V.  (2005).  Localization  of  tabersonine  16‐hydroxylase  and  16‐OH  tabersonine‐16‐O‐methyltransferase to leaf epidermal cells defines them as a major site of  precursor  biosynthesis  in  the  vindoline  pathway  in  Catharanthus  roseus.  Plant  Journal,  44,  581‐594.  Nakase,  I.;  Lai,  H.;  Singh,  N.  P.;  Sasaki,  T.  (2008).  Anticancer  properties  of  artemisinin  derivatives and their targeted delivery by transferrin conjugation. Int J Pharm, 354, 28‐33.  Nakazono, M.; Qiu, F.; Borsuk, L. A.; Schnable, P. S. (2003). Laser‐capture microdissection, a  tool  for  the  global  analysis  of  gene  expression  in  specific  plant  cell  types:  Identification  of  genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell, 15,  583‐596.  Nelson,  T.;  Tausta,  S.  L.;  Gandotra,  N.;  Liu,  T.  (2006).  Laser  microdissection  of  plant  tissue:  what you see is what you get. Annu Rev Plant Biol, 57, 181‐201.  Olliaro, P. L.; Taylor, W. R. (2004). Developing artemisinin based drug combinations for the  treatment of drug resistant falciparum malaria: A review. J Postgrad Med, 50, 40‐44. 

L I T E R A T U U R L I J S T | 52    Olsson,  M.  E.;  Olofsson,  L.  M.;  Lindahl,  A.  L.;  Lundgren,  A.;  Brodelius,  M.;  Brodelius,  P.  E.  (2009).  Localization  of  enzymes  of  artemisinin  biosynthesis  to  the  apical  cells  of  glandular  secretory trichomes of Artemisia annua L. Phytochemistry, 70, 1123‐1128.  Ro, D. K.; Paradise, E. M.; Ouellet, M.; Fisher, K. J.; Newman, K. L.; Ndungu, J. M.; Ho, K. A.;  Eachus,  R.  A.;  Ham,  T.  S.;  Kirby,  J.;  Chang,  M.  C.;  Withers,  S.  T.;  Shiba,  Y.;  Sarpong,  R.;  Keasling,  J.  D.  (2006).  Production  of  the  antimalarial  drug  precursor  artemisinic  acid  in  engineered yeast. Nature, 440, 940‐943.  Romero,  G.  Q.;  Souza,  J.  C.;  Vasconcellos‐Neto,  J.  (2008).  Anti‐herbivore  protection  by  mutualistic spiders and the role of plant glandular trichomes. Ecology, 89, 3105‐3115.  Romero,  M.  R.;  Efferth,  T.;  Serrano,  M.  A.;  Castano,  B.;  Macias,  R.  I.;  Briz,  O.;  Marin,  J.  J.  (2005). Effect of artemisinin/artesunate as inhibitors of hepatitis B virus production in an "in  vitro" replicative system. Antiviral Res, 68, 75‐83.  Tellez,  M.  R.;  Canel,  C.;  Rimando,  A.  M.;  Duke,  S.  O.  (1999).  Differential  accumulation  of  isoprenoids in glanded and glandless Artemisia annua L. Phytochemistry, 52, 1035‐1040.  Tuteja, R. (2007). Malaria ‐ an overview. FEBS J, 274, 4670‐4679.  van Agtmael, M. A.; Eggelte, T. A.; van Boxtel, C. J. (1999). Artemisinin drugs in the treatment  of malaria: from medicinal herb to registered medication. Trends Pharmacol Sci, 20, 199‐205.  Van  Nieuwerburgh,  F.  C.;  Vande  Casteele,  S.  R.;  Maes,  L.;  Goossens,  A.;  Inze,  D.;  Van  Bocxlaer, J.; Deforce, D. L. (2006). Quantitation of artemisinin and its biosynthetic precursors  in Artemisia annua L. by high performance liquid chromatography‐electrospray quadrupole  time‐of‐flight tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 1118, 180‐187.  Van  Valckenborgh  A.M.  (2009)  Trichomen,  de  sleutel  tot  een  verhoogde  productie  van  artemisinine in Artemisia annua. Master thesis aan Universiteit Gent, België.  Wagner, G. J.; Wang, E.; Shepherd, R. W. (2004). New approaches for studying and exploiting  an old protuberance, the plant trichome. Ann Bot, 93, 3‐11.  Wang, W.; Wang, Y.; Zhang, Q.; Qi, Y.; Guo, D. (2009). Global characterization of Artemisia  annua glandular trichome transcriptome using 454 pyrosequencing. BMC Genomics, 10, 465‐ 474.  Willcox,  M.;  B.M.;  M.R.C.G.P.;  M.C.P.P.;  D.C.H.;  D.T.M.&H  (2009).  Artemisia  Species:  From  Traditional  Medicines  to  Modern  Antimalarials‐and  Back  Again.  Journal  of  Alternative  and  Complementary Medicine, 15, 101‐109.  Withers,  S.  T.;  Keasling,  J.  D.  (2007).  Biosynthesis  and  engineering  of  isoprenoid  small  molecules. Appl Microbiol Biotechnol, 73, 980‐990.  Wongsrichanalai, C.; Pickard, A. L.; Wernsdorfer, W. H.; Meshnick, S. R. (2002). Epidemiology  of drug‐resistant malaria. Lancet Infect Dis, 2, 209‐218.  Zhang, Y.; Teoh, K. H.; Reed, D. W.; Maes, L.; Goossens, A.; Olson, D. J.; Ross, A. R.; Covello, P.  S. (2008). The molecular cloning of artemisinic aldehyde Delta11(13) reductase and its role in  glandular trichome‐dependent biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua. J Biol Chem,  283, 21501‐21508.