UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN LABORATORY FOR ANIMAL NUTRITION AND ANIMAL PRODUCT QUALITY

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

LABORATORY FOR ANIMAL NUTRITION AND ANIMAL PRODUCT QUALITY

ROL VAN VERTAKTE KETEN VETZUREN IN DE EMBRYONALE EN POSTNATALE ONTWIKKELING VAN BIGGEN

Thomas NEYT Academiejaar 2010-2011 Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor: Prof. dr. ir. V. Fievez Begeleider: dr. ir. B. Vlaeminck

Commissarissen: Prof. dr. Apr. S. De Saeger Prof. dr. Apr. J. Van Bocxlaer

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

LABORATORY FOR ANIMAL NUTRITION AND ANIMAL PRODUCT QUALITY

ROL VAN VERTAKTE KETEN VETZUREN IN DE EMBRYONALE EN POSTNATALE ONTWIKKELING VAN BIGGEN

Thomas NEYT Academiejaar 2010-2011 Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor: Prof. dr. ir. V. Fievez Begeleider: dr. ir. B. Vlaeminck

Commissarissen: Prof. dr. Apr. S. De Saeger Prof. dr. Apr. J. Van Bocxlaer

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

23 mei 2011

Promotor

Auteur

Prof. dr. ir. V. Fievez

Thomas Neyt

DANKWOORD Deze masterproef kon tot stand komen door de steun van velen. Speciale dank gaat uit naar Prof. V. Fievez en B. Vlaeminck voor de mogelijkheid om deel uit te maken van LANUPRO en het beschikbaar stellen van de infrastructuur. B. Vlaeminck wens ik in het bijzonder te bedanken voor de dagelijkse begeleiding. Beiden bedank ik ze graag voor de opvolging en ondersteuning tijdens het onderzoek en het nalezen van mijn thesis. Bijzondere dank gaat uit naar E. Claeys voor de hulp en de informatie die hij mij gaf bij het bekijken van de chromatogrammen en allerlei andere zaken. S. Tanghe bedank ik graag voor het beschikbaar stellen van haar stalen en de nodige informatie die ze mij bezorgde. Ook E. Vossen en E. Colman wens ik graag te bedanken voor het advies. S. Deschildre en C. Melis wens ik graag te bedanken voor de deskundige uitleg tijdens het uitvoeren van het praktische gedeelte in het labo. Uiteraard bedank ik ook graag het volledige LANUPRO team omdat ze steeds paraat stonden voor mij. Last but not least wens ik mijn ouders en vriendin Charlotte te bedanken. Mama en papa, bedankt voor de kans die jullie mij gaven om aan de opleiding Farmaceutische Wetenschappen te kunnen beginnen en mij elk jaar daarin te steunen. Charlotte, bedankt voor alle steun en liefde die je mij tijdens deze periode hebt gegeven.

INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING............................................................................................................................1 1.1. BACTERIEN EN HUN MONOMETHYL VERTAKTE KETEN VETZUREN..............................1 1.1.1. Structuur............................................................................................................1 1.1.2. Biosynthese........................................................................................................2 1.1.2.1.

Biosynthese van verzadigde vetzuren zonder methylgroepen...............2

1.1.2.2.

Biosynthese van de vertakte keten vetzuren..........................................2

1.1.3. Belang van de bacteriële vertakte keten vetzuren...........................................3 1.1.3.1.

Het gebruik van de vertakte keten vetzuren door de bacterie zelf........3

1.1.3.2.

Bacteriële vertakte keten vetzuren bij herkauwers en konijnen............4

1.2. MONOMETHYL VERTAKTE KETEN VETZUREN BIJ EUKARYOTEN...................................6 1.2.1. De aanwezigheid van vertakte keten vetzuren in ratten en muizen...............6 1.2.2. De rol van isoC15:0 en isoC17:0 in de ontwikkeling van C. elegans.................7 1.2.3. De functie van iso type vetzuren bij obese ratten............................................8 1.2.4. De rol van anteisoC21:0 in de structuur van haar bij zoogdieren....................9 1.2.5. De functie van vertakte keten vetzuren in dolfijnen; echolocatie.................10 1.2.6. Vertakte keten vetzuren en hun relatie met droge ogen bij de mens...........11 1.2.7. De rol van vertakte keten vetzuren bij een pasgeborene..............................13 1.2.8. De functie van vertakte keten vetzuren bij de vrouwelijke goudhamster.....15 1.2.9. Vertakte keten vetzuren en hun rol in de behandeling van kanker...............17 1.3. CONCLUSIE..................................................................................................................19 2. OBJECTIEVEN.....................................................................................................................20 3. MATERIAAL EN METHODEN..............................................................................................21 3.1. STAALNAME................................................................................................................21 3.2. STAALVOORBEREIDING..............................................................................................21 3.2.1. Hersenen, hart en milt.....................................................................................21 3.2.1.1.

Lyofilisatie.............................................................................................21

3.2.1.2.

Malen....................................................................................................22

3.2.1.3.

Afwegen................................................................................................22

3.2.2. Plasma en colostrum.......................................................................................22

3.3. EXTRACTIE EN METHYLATIE........................................................................................23 3.3.1. Hersenen, hart en milt.....................................................................................23 3.3.2. Plasma..............................................................................................................23 3.3.3. Colostrum.........................................................................................................24 3.4. GASCHROMATOGRAFIE..............................................................................................24 3.4.1. Algemeen.........................................................................................................24 3.4.2. SLB-5ms / MS...................................................................................................25 3.4.2.1.

Opstelling.............................................................................................25

3.4.2.2.

Interpretatie.........................................................................................27

3.4.3. SP2560 / FID.....................................................................................................27 3.4.3.1.

Opstelling..............................................................................................27

3.4.3.2.

Interpretatie.........................................................................................29

3.4.4. SOLGEL WAX / FID............................................................................................29 3.4.4.1.

Opstelling..............................................................................................29

4. RESULTATEN......................................................................................................................31 4.1. VETZUURPROFIELEN VAN DE HERSENEN, HET HART EN DE MILT..............................31 4.1.1. Hersenen..........................................................................................................31 4.1.2. Hart...................................................................................................................31 4.1.3. Milt...................................................................................................................31 4.2. RESULTATEN VAN HET PLASMA EN HET COLOSTRUM...............................................35 5. DISCUSSIE..........................................................................................................................36 5.1. SCHEIDING EN IDENTIFICATIE.....................................................................................36 5.1.1. Scheiding..........................................................................................................36 5.1.2. Identificatie......................................................................................................39 5.1.2.1.

Identificatie op basis van de retentietijd..............................................39

5.1.2.2.

Massaspectroscopie als belangrijkste identificatiemiddel...................40

5.2. VETZUURPROFIELEN...................................................................................................45 5.2.1. Algemene bespreking......................................................................................45 5.2.1.1.

Hersenen...............................................................................................45

5.2.1.2.

Hart.......................................................................................................45

5.2.1.3.

Milt........................................................................................................46

5.2.1.4.

Plasma en colostrum.............................................................................46

5.2.2. Vergelijking van de vertakte keten vetzuren tussen week 1 en week 4........46 5.2.3. Interpretatie van de aanwezige vertakte keten vetzuren..............................48 6. CONCLUSIES.......................................................................................................................49 7. LITERATUURLIJST...............................................................................................................50

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN CoA: Coenzyme A DHA: Docosahexaeenzuur EI: Electron Impact EPA: Eicosapentaeenzuur FAS: Fatty Acid Synthase FID: Flame Ionisation Detector GC: Gaschromatografie i.e. : id est ID: Interne Diameter IS: Interne Standaard LANUPRO: Laboratory for Animal Nutrition and Animal Product Quality LD50: Lethal Dose 50% MG: Moleculair Gewicht MGD: Meibomian Gland Dysfunction mmVKVZ: monomethyl Vertakte Keten Vetzuren MS: Massaspectroscopie MSUD: Maple Syrup Urine Disease NEC: Necrotizing Enterocolitis OVKVZ: Oneven en Vertakte Keten Vetzuren PEG: PolyEthylene Glycol Stdev: Standaard deviatie TAG: Triacylglycerol VKVZ: Vertakte Keten Vetzuren

INLEIDING |1

1. INLEIDING

1.1.

BACTERIEN EN HUN MONOMETHYL VERTAKTE KETEN VETZUREN Vertakte keten vetzuren (VKVZ) zijn reeds uitvoerig bestudeerd vanuit bacterieel

oogpunt omdat ze een belangrijk onderdeel uitmaken van het celmembraan bij verschillende bacteriën. De eerste keer dat hier melding van werd gemaakt, gaat terug tot 1963 (Kaneda, 1963). Bacillus subtilis was toen de eerste bacterie waarin VKVZ werden gevonden, maar later volgden vele anderen. Vooraleer we ingaan op de rol die deze vetzuren kunnen spelen in bacteriën is het goed eerst meer inzicht te krijgen in hun structuur en biosynthese. 1.1.1. Structuur De naam vertakte keten vetzuren wijst op het feit dat deze vetzuren een extra functie dragen op het basisskelet van een vetzuur. Dit basisskelet bestaat uit een polaire carboxylfunctie (COOH) en een apolaire C-keten die eindigt met een terminale methylfunctie. In ons onderzoek gaan we specifiek op zoek naar vertakte keten vetzuren die één methylgroep dragen als extra functie, zij worden monomethyl vertakte keten vetzuren genoemd (mmVKVZ1). Deze methylgroep kan voorkomen op allerlei koolstofatomen, maar wij gaan op zoek naar 2 specifieke vormen, namelijk de iso en anteiso vormen, waarbij de methylgroep op respectievelijk het voorlaatste en 3de laatste C-atoom staat (Figuur 1.1).

Figuur 1.1: Voorstelling van de iso en anteiso vorm van monomethyl vertakte keten vetzuren. (http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/whatlip/index.htm#fatty)(14-03-2011)

1

In de loop van dit werk worden de termen vertakte keten vetzuren (VKVZ) en monomethyl vertakte keten vetzuren (mmVKVZ) door elkaar gebruikt. In beide gevallen wordt echter de iso of anteiso vorm bedoeld die één methylfunctie draagt.

INLEIDING |2

1.1.2. Biosynthese

1.1.2.1.

Biosynthese van verzadigde vetzuren zonder methylgroepen

Bij de biosynthese van vetzuren moet eerst en vooral een onderscheid gemaakt worden tussen de vetzuren die een even aantal C-atomen hebben en de vetzuren die bestaan uit een oneven aantal C-atomen. Bij de biosynthese van de verzadigde vetzuren zonder methylgroepen wordt in het geval van de even keten vetzuren gestart vanaf acetyl-CoA, in het geval van de oneven keten vetzuren is propionyl-CoA de primer. Acetyl-CoA en propionyl-CoA bestaan uit respectievelijk 2 en 3 C-atomen. Nadien gebeurt de ketenverlenging door malonyl-CoA. Tijdens dit proces wordt de vetzuurketen verder verlengd met 2 C-atomen per malonyl-CoA.

1.1.2.2.

Biosynthese van de vertakte keten vetzuren

De biosynthese van de vertakte keten vetzuren in bacteriën werd beschreven door Kaneda (1991). De biosynthese gebeurt analoog aan die van de verzadigde vetzuren zonder methylgroepen, enkel de primers zijn verschillend. De biosynthese wordt geregeld door het enzym vertakte keten vetzuur synthetase. Zoals blijkt uit Figuur 1.2 zijn de primers voor de verschillende mmVKVZ afkomstig van de vertakte keten aminozuren leucine, isoleucine en valine. Leucine geeft via isovalerylCoA aanleiding tot de oneven keten isoC15:0 en isoC17:0. Isoleucine fungeert via 2methylbutyryl-CoA als primer voor de oneven keten anteisoC15:0 en anteisoC17:0. Valine tenslotte geeft via isobutyryl-CoA aanleiding tot de even keten isoC14:0 en isoC16:0. De ketenverlenging voor de vorming van iso en anteiso vetzuren met een hoger aantal C-atomen gebeurt analoog aan de verzadigde vetzuren zonder methylgroepen via malonyl-CoA.

INLEIDING |3

Figuur 1.2: Biosynthese van de mmVKVZ vanuit de vertakte keten aminozuren leucine, isoleucine en valine. Leucine is de precursor voor de oneven keten isoC15:0 en isoC17:0, isoleucine geeft aanleiding tot de oneven keten anteisoC15:0 en anteisoC17:0, valine fungeert als primer voor de even keten isoC14:0 en isoC16:0. Vlaeminck et al. (2006a)

1.1.3. Belang van de bacteriële vertakte keten vetzuren

1.1.3.1.

Het gebruik van de vertakte keten vetzuren door de bacterie zelf

Niet alle bacteriën produceren vertakte keten vetzuren. Wanneer bacteriën bijvoorbeeld niet beschikken over het enzym vertakte keten vetzuur synthetase is de biosynthese van de vertakte keten vetzuren niet mogelijk. In dat geval wordt het gebrek aan VKVZ gecompenseerd door grotere hoeveelheden onverzadigde vetzuren omdat deze vetzuren vergelijkbare karakteristieken hebben met betrekking tot de smelttemperatuur (Kaneda, 1991). Gezien hun structuur vervullen de vertakte keten vetzuren een specifieke functie in de bacterie. Door de aanwezigheid van de extra methylfunctie ligt hun smeltpunt lager dan de gewone verzadigde vetzuren (Knothe & Dunn, 2009). De reden hiervoor is de minder compacte stapeling die mogelijk is omwille van de extra methyl functie (Annous et al., 1997). Een toepassing van deze eigenschap vindt men terug bij Listeria monocytogenes.

INLEIDING |4

Dit pathogeen is in staat te groeien bij lage temperaturen. Voeding in de koelkast bewaren is geen zekerheid dat het vrij is van dit pathogeen. Om te kunnen overleven bij zo’n lage temperaturen moeten er speciale aanpassingen gebeuren. Zo moet het celmembraan aangepast zijn zodat het nog over de geschikte fluïditeit beschikt opdat de bacterie zou kunnen overleven. Annous et al. (1997) toonden aan dat het vetzuurprofiel van L. monocytogenes gedomineerd werd door anteisoC15:0 bij lagere temperaturen. Hierdoor beschikte L. monocytogenes over de geschikte membraanfluïditeit en kon het gemakkelijk overleven in koude omstandigheden.

1.1.3.2.

Bacteriële vertakte keten vetzuren bij herkauwers en konijnen

Vertakte keten vetzuren die teruggevonden worden in bepaalde diersoorten zijn afkomstig van bacteriën. Zo is er enerzijds de microbiële flora ter hoogte van de pensmaag bij de herkauwers. Anderzijds eten konijnen een deel van hun feces terug op, een proces dat gekend is onder de naam coprofagie. Tijdens dit proces kunnen de bacteriële vertakte keten vetzuren geabsorbeerd worden ter hoogte van de dunne darm. Het is reeds aangetoond dat oneven keten en vertakte keten vetzuren (OVKVZ) die men terugvond in de melk van koeien grotendeels afkomstig waren van de bacteriële flora uit de pens (Keeney et al., 1962; Vlaeminck et al., 2006a). Een overzicht van de verschillende vetzuren met hun hoeveelheden wordt weergegeven in Tabel 1.1. Bij veranderingen in het dieet zagen Vlaeminck et al. (2006b) variatie in het profiel van de OVKVZ in de melk, wellicht ten gevolge van veranderingen in de microbiële flora van de pens. Hierdoor komen deze vetzuren meer en meer in de belangstelling als merker voor onder andere de fermentatie ter hoogte van de pens. Het grote voordeel van deze methode tegenover de huidige methoden is het niet-invasieve karakter.

INLEIDING |5 Tabel 1.1 : Overzicht van de oneven keten en vertakte keten vetzuren (OVKVZ) teruggevonden in de melk van koeien. Hoeveelheden van de individuele vetzuren uitgedrukt als g/100g vetzuren. Vlaeminck et al. (2006a)

Component isoC13:0 isoC14:0 isoC15:0 isoC16:0 isoC17:0 anteisoC13:0 anteisoC15:0 anteisoC17:0 C15:0 C17:0

n 64 82 103 80 93 64 101 73 103 103

Gemiddelde 0.040 0.089 0.224 0.209 0.272 0.083 0.462 0.501 1.104 0.557

Mediaan 0.027 0.083 0.210 0.201 0.214 0.080 0.451 0.489 1.097 0.530

Stdev 0.036 0.031 0.059 0.050 0.164 0.024 0.090 0.125 0.164 0.103

min 0.011 0.038 0.124 0.115 0.124 0.025 0.290 0.150 0.780 0.405

max 0.144 0.179 0.510 0.370 0.910 0.135 0.760 0.790 1.640 0.790

Zoals reeds aangehaald in sectie 1.1.3.1. hebben vertakte keten vetzuren een minder compacte stapeling omwille van hun extra methylfunctie en maken bacteriën zoals L. monocytogenes hier handig gebruik van met betrekking tot de fluïditeit van hun membraan. Bij konijnen werd een analoog verband gevonden tussen de VKVZ en de consistentie van het perirenale vet. López-Bote et al. (1996) vonden een daling van de VKVZ in het perirenale vet van konijnen wanneer die een dieet kregen dat aangerijkt was met onverzadigde vetten (Tabel 1.2). Hun verklaring hiervoor was dat dit een aanpassing was om het smeltpunt van het vet te behouden en zo een daling ervan tegen te gaan. Mocht dit niet gebeuren zou het vet veel te zacht en vloeibaar worden. Dit zou nefaste gevolgen hebben voor het konijn zelf, maar ook uit organoleptisch standpunt zou te zacht vet niet in de smaak vallen. VKVZ bleken dus een belangrijk deel uit te maken van het perirenale vet van konijnen. Tabel 1.2: Veranderingen in de hoeveelheden vertakte keten vetzuren in het perirenale vet bij konijnen indien onverzadigde vetten toegediend worden via het dieet. Bij diëten met olijfolie (O) en zonnebloemolie (Z) dalen de hoeveelheden VKVZ in vergelijking met het controledieet (C) van 5.0 mg/g (C) tot 2.8 mg/g (O) en 3.7 mg/g (Z). Hoeveelheden uitgedrukt als mg/g. López-Bote et al. (1996)

Component isoC15:0 anteisoC15:0 isoC17:0 anteisoC17:0 VKVZ

C 0.7 ± 0.02 1.4 ± 0.07 0.7 ± 0.04 2.1 ± 0.04 5.0 ± 0.14

O 0.4 ± 0.03 0.7 ± 0.12 0.4 ± 0.07 1.2 ± 0.07 2.8 ± 0.24

Z 0.5 ± 0.01 0.9 ± 0.06 0.4 ± 0.03 1.8 ± 0.04 3.7 ± 0.12

INLEIDING |6

1.2.

MONOMETHYL VERTAKTE KETEN VETZUREN BIJ EUKARYOTEN Hoewel er nog vele andere zaken omtrent de bacteriële mmVKVZ te melden zijn,

beperken we ons tot dit kleine deel. In dit werk is het namelijk de bedoeling op zoek te gaan naar nieuwe functies van deze vetzuren. Er zijn er reeds diverse gevonden en hieronder volgt een overzicht van de uiteenlopende functies die de mmVKVZ kunnen spelen. 1.2.1. De aanwezigheid van vertakte keten vetzuren in ratten en muizen Bij ratten vonden Bettger et al. (1998) één van de mmVKVZ terug, met name isoC24:0 (Tabel 1.3). Het was er onderdeel van sfingolipiden / sfingomyeline in verschillende weefsels waaronder de lever, het hart en de milt. Enkel in de hersenen en foetaal serum werd het niet gevonden. Ook bij muizen, honden en katten vonden ze isoC24:0 als onderdeel van de sfingolipiden / sfingomyeline in serum.

Tabel 1.3: Overzicht van de hoeveelheden isoC24:0 teruggevonden in verschillende weefsels van ratten. IsoC24:0 komt vooral voor in de lever, het hart en de milt. De hoeveelheden zijn uitgedrukt als %. ND = Niet Detecteerbaar. Bettger et al. (1998)

Weefsel Lever Hart Long Milt Nier Spier Huid Pancreas Hersenen Darmen Oog Testes Erytrocyt

IsoC24:0 4.1 ± 0.3 1.6 ± 0.2 0.5 ± 0.1 1.2 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.7 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.8 ± 0.1 ND 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.3 ± 0.1

Ook in muizen werden er mmVKVZ teruggevonden, meerbepaald in de lipiden van de huid (Oku et al., 1996). Zowel iso als anteiso mmVKVZ werden er gezien, met de eerste groep in de meerderheid. Ze waren ingebouwd in waxesters en cholesterolesters. In deze studie gingen de onderzoekers nog een stukje verder en keken naar de effecten van leeftijd op de samenstelling van de mmVKVZ. Hierbij vonden ze dat de iso vetzuren daalden van week 6-26

INLEIDING |7

en nadien vrij constant bleven, terwijl de anteiso vetzuren niet onderhevig waren aan de invloed van leeftijd en constant bleven. Ook bij ratten werden analoge trends gezien in de vertakte keten vetzuren van de huid. Oku et al. (1992) vonden dat de iso vetzuren daalden naarmate de leeftijd toenam, terwijl ook hier de anteiso vetzuren constant bleven in functie van de tijd.

1.2.2. De rol van isoC15:0 en isoC17:0 in de ontwikkeling van C. elegans Caenorhabditis elegans is een nematode of ringworm, een groep binnen de wormen. IsoC15:0 en isoC17:0 blijken een essentiële rol te spelen in de ontwikkeling van deze nematode (Kniazeva et al., 2004). Wormen waarvan de biosynthese van deze 2 mmVKVZ werd onderdrukt, zetten hun groei en ontwikkeling stop ter hoogte van de L1 fase, de eerste van 4 fasen die deze worm doorloopt tijdens zijn ontwikkeling. Diezelfde stop in groei en ontwikkeling werd ook gezien bij wormen die geen voeding meer kregen. Het kon niet verholpen worden door andere vetzuren toe te dienen, enkel het exogeen toedienen van isoC15:0 en isoC17:0 bleek effectief. Dit toonde het belang aan van deze mmVKVZ in de groei en ontwikkeling van C. elegans.

Kniazeva et al. (2008) gingen hier nog wat dieper op in en kwamen tot de conclusie dat isoC17:0 een essentiële metaboliet is die belangrijk is in de onderdrukking van een negatieve regulator van de celcyclus. Bovenop een pathway gemedieerd door insuline, is isoC17:0 essentieel voor de groei en ontwikkeling van L1 larven.

Figuur 1.3 toont het effect van isoC17:0 op de groei van C. elegans. Figuur 1.3 A stelt wormen voor die een defect hebben in hun elo-5 enzym en isoC13:0 toegediend kregen. Elo-5 staat voor elongation enzyme, een enzym dat nodig is voor de wormen om zelf te kunnen voorzien in hun isoC15:0 en isoC17:0 via elongatie vanuit precursoren (o.a. isoC13:0). Toevoegen van isoC13:0 had duidelijk geen gunstig effect op de groei omdat er vanuit isoC13:0 geen isoC17:0 kon gevormd worden. Figuur 1.3 B toont het effect van isoC17:0 op de groei van wormen die eveneens een defect hebben in hun elo-5 enzym. Hier is wel isoC17:0 aanwezig aangezien het rechtstreeks wordt toegevoegd aan het groeimedium. De wormen kunnen nu wel groeien. Figuur 1.3 C toont

INLEIDING |8

het effect van verschillende concentraties isoC17:0 op de groei van de wormen. Vanaf concentraties van 0.25 mM neemt de groei sterk toe.

Figuur 1.3: Effect van isoC17:0 op de groei van C.elegans. Figuur 1.3 A toont het effect van isoC13:0 in wormen die een defect hebben in hun elo-5 enzym waardoor ze zelf geen isoC15:0 en isoC17:0 kunnen vormen vanuit isoC13:0. De groei is sterk beperkt. Figuur 1.3 B toont het effect van isoC17:0 bij wormen die eveneens een defect hebben in hun elo-5 enzym. Hier groeien de wormen wel dankzij het toevoegen van isoC17:0 aan het groeimedium. Figuur 1.3 C toont de invloed van stijgende hoeveelheden isoC17:0 op de groei van C. elegans. Concentraties vanaf 0.25 mM blijken een sterke invloed te hebben. Kniazeva et al. (2008)

1.2.3. De functie van iso type vetzuren bij obese ratten Obesitas is een aandoening die naast een groot risico op hart- en vaatziekten ook een socio-economische impact heeft. Shirouchi et al. (2010) bestudeerden het effect van bruinvisolie in obese ratten. Bruinvisolie wordt gekenmerkt door de grote aanwezigheid van isovaleriaanzuur (isoC5:0) en ω3 poly-onverzadigde vetzuren (vb. EPA en DHA). Naast deze vetzuren kwamen ook nog isoC14:0, isoC15:0 en isoC16:0 voor. Men zag een daling van de

INLEIDING |9

hoeveelheid triglyceriden en cholesterol in de lever (Figuur 1.4) en minder kans op steatose of leververvetting ten opzichte van het controledieet.

Hier moet echter wel de kanttekening gemaakt worden welke component verantwoordelijk was voor het geziene effect. Werd dit veroorzaakt door de ω3 vetzuren, door de isoC5:0 of was het door de combinatie ervan? Hierop werd geen antwoord gegeven in het artikel en aangezien het een vrij recent artikel is, zal de toekomst hier een antwoord op moeten bieden. Maar het potentieel gunstig effect van de vertakte keten vetzuren moet een stimulans zijn om hier verder onderzoek naar toe te doen, eventueel ook voor iso en anteiso vetzuren met andere ketenlengtes.

Figuur 1.4: Het effect van bruinvisolie (PO) op de hoeveelheid triglyceriden, cholesterol en fosfolipiden in de lever ten opzichte van het controledieet. Zowel de triglyceriden als de cholesterol dalen. De fosfolipiden blijven gelijk. Shirouchi et al. (2010)

1.2.4. De rol van anteisoC21:0 in de structuur van haar bij zoogdieren AnteisoC21:0 is het belangrijkste vetzuur dat covalent gebonden zit aan de vezels van menselijk haar (Jones & Rivett, 1997). Tabel 1.4 toont aan dat het gehalte aan anteisoC21:0 oploopt tot 31.7% van het totale vetzuurprofiel. Ook anteisoC17:0 en anteisoC19:0 zijn aanwezig, maar in mindere mate. Wat de specifieke rol is die anteisoC21:0 speelt en wat het exacte mechanisme is dat erachter schuilt, is nog niet volledig opgehelderd. Het is wel vrij duidelijk dat het een essentiële rol speelt in de structurele integriteit van het haar.

Dat anteisoC21:0 een cruciale functie vervult in het haar werd duidelijk aangetoond door Smith & Swift (2005) in het haar van patiënten die lijden aan Maple Syrup Urine Disease (MSUD). Deze patiënten hebben mutaties in het Branched Chain α-Ketoacid

I N L E I D I N G | 10

Dehydrogenase enzyme (BCKD) waardoor isoleucine niet kan omgezet worden tot anteisoC21:0 (cf. 1.1.2.2.). Dit bleek reeds uit de hoeveelheden anteisoC21:0 die werden waargenomen door Jones & Rivett (1997) bij MSUD patiënten in Tabel 1.4. “Normaal” haar beschikte over 31.7% anteisoC21:0, terwijl MSUD patiënten slechts 1.6% of 1.8% anteisoC21:0 hadden. Smith & Swift (2005) gingen hier verder op in en konden tijdens microscopische analyses op basis van de structuur van het haar het onderscheid maken tussen normaal haar en het haar van MSUD patiënten zonder dat men op voorhand wist welk haar van wie was. Het haar van MSUD patiënten vertoonde meer “breuken” aan het oppervlak. Ze concludeerden dat anteisoC21:0 essentieel is voor de structurele integriteit van het haar.

Tabel 1.4: Vertakte keten vetzuren bij “normaal” haar en bij haar afkomstig van MSUD patiënten. Bij normaal haar is anteisoC21:0 de belangrijkste constituent met een aandeel van 31.7%. Bij MSUD patiënten daalt dit tot waarden die slechts 1.8% of 1.6% bedragen. Ook anteisoC17:0 en anteisoC19:0 zijn aanwezig. Vetzuren voorgesteld als %. ND = Niet Detecteerbaar. Jones & Rivett (1997)

1.2.5. De functie van vertakte keten vetzuren in dolfijnen; echolocatie Het is algemeen gekend dat dolfijnen een bijzondere vorm van communicatie hebben aangezien dit onder water dient te gebeuren, men noemt dit proces echolocatie. In 2006 vonden Koopman et al. (2006) ongewone vetzuren ter hoogte van het gehoor van dolfijnen en aanverwanten. Zo bevatte de spitssnuitdolfijn (M. europaeus) tot 32.8% isoC12:0 en de bruinvis (Phocoena) tot 34.8% isoC5:0. De vetzuren werden voornamelijk aan de binnenzijde van de onderkaak (mandibula) gevonden (Tabel 1.5).

Duggan & Koopman (2009) ontdekten de aanwezigheid van isoC5:0 in de zogenaamde akoestische weefsels van de tuimelaar. Het werd door het dier zelf aangemaakt en niet doorgegeven van moeder naar kalf via de melk. Verder vonden ze een verband tussen de ketenlengte van een vetzuur en de snelheid waarmee het geluid er passeert.


Hoe korter de ketenlengte, hoe trager het geluid passeert en vice versa. Deze vaststelling gaf een mogelijke verklaring voor het vetzuurprofiel dat men waarnam. Er werden gebieden gezien die gedomineerd werden door lange vetzuren en gebieden met hoofdzakelijk korte en vertakte keten vetzuren (cf. isoC5:0). Deze schikking zorgde er zo voor dat er verschillende geluidssnelheden werden gecreëerd omwille van de verschillende ketenlengtes. Hierdoor ontstond er refractie van de geluidsgolven richting de gebieden die het meest gevoelig waren voor geluid.

Zoals blijkt uit Tabel 1.5 hebben jonge dolfijnen lagere concentraties van de vertakte keten vetzuren. In het geval van de spitssnuitdolfijn (M. europaeus) bevat het kalf slechts maximaal 1.8% isoC12:0 terwijl een volwassen dier tot 32.8% isoC12:0 bevat. Dit lijkt erop te wijzen dat echolocatie een proces is dat zich gaandeweg moet opbouwen.

Tabel 1.5: Voorstelling van isoC5:0, isoC10:0 en isoC12:0 bij M. europaeus en Phocoena ter hoogte van de mandibula. Vetzuren voorgesteld als %. Koopman et al. (2006)

1.2.6. Vertakte keten vetzuren en hun relatie met droge ogen bij de mens Dat de mmVKVZ ook bij de mens een belangrijke rol kunnen spelen, wordt duidelijk bij patiënten die last hebben met hun klieren van Meibom. Deze klieren produceren normaal gezien een olie-achtige substantie waardoor het traanvocht niet te snel verdampt. Het biedt eveneens bescherming tegen bacteriële contaminatie. Bij patiënten die lijden aan Meibomian Gland Dysfunction (MGD) werken deze klieren niet meer naar behoren waardoor het olielaagje ontbreekt en hun traanvocht sneller verdampt, dit resulteert dan in


droge ogen (Driver & Lemp, 1996). Indien ze het traanvocht van MGD patiënten analyseerden, vonden Joffre et al. (2008) hogere hoeveelheden vertakte keten vetzuren en lagere concentraties van de verzadigde vetzuren C16:0 en C18:0 ten opzichte van individuen die geen last hadden van MGD (Tabel 1.6). Dit suggereerde bij hen het mogelijke gebruik van deze vetzuren als diagnostische merkers voor MGD. Souchier et al. (2008) vonden dat isoC20:0 het meest in aanmerking kwam als diagnostische merker en voor de opvolging van de therapie.

Over de precieze functie van deze mmVKVZ tastte men vrij lang in het duister, alsook over de potentieel toxische effecten ervan. Dit laatste was niet volledig onterecht aangezien vroeger reeds in de literatuur toxische effecten van andere VKVZ zoals fytaanzuur (VKVZ met meerdere methylgroepen) werden gezien op bepaalde celtypes. Idel et al. (2002) gaven kennis van apoptose van vasculaire gladde spiercellen door fytaanzuur. Joffre et al. (2009) vonden echter dat dit helemaal niet het geval was voor de mmVKVZ in het oog. Meer nog, ze waren in staat een plausibele verklaring te geven voor de mmVKVZ verhoging. Volgens hen was de stijging van de mmVKVZ een compensatie voor het tekort aan tranen. Op deze manier trachtte het lichaam de fluïditeit van het oogsecreet te waarborgen, aangezien de mmVKVZ een lagere smelttemperatuur hebben.

Tabel 1.6: Vergelijking van C16:0, C18:0 en de VKVZ tussen gezonde personen en personen die last hebben van Meibomian Gland Dysfunction (MGD). De VKVZ stijgen bij de patiënten met MGD van 20.2% naar 29.8%. Er wordt eveneens een daling gezien van C16:0 en C18:0. Vetzuren voorgesteld als %. Joffre et al. (2008)


1.2.7. De rol van vertakte keten vetzuren bij een pasgeborene Oku et al. (2000) vonden vertakte keten vetzuren in de vernix caseosa. De vernix caseosa is een mengsel van lipiden, hoofdzakelijk bestaande uit talg en corneocyten (de cellen van het stratum corneum (hoornlaag)). Het wordt geproduceerd door de huid van de foetus, beginnend vanaf 24 weken en eindigend bij de geboorte. Het is iets dat typisch is voor de mens en wordt niet gezien bij andere zoogdieren die leven op het land. Waarvoor deze mmVKVZ in de vernix caseosa exact dienen is nog niet volledig opgehelderd. Oku et al. (2000) suggereerden hoofdzakelijk een bescherming tegen bacteriële indringers, alsook een bescherming tegen eventuele bacteriële overgroei ter hoogte van de huid. Ook hier kwam de typische eigenschap van een lagere smelttemperatuur naar de voorgrond, de mmVKVZ zouden er namelijk voor zorgen dat het oppervlak van de huid voldoende vochtig blijft, ook bij vrij lage temperaturen. Eveneens zorgde het voor een betere waterhoudende capaciteit.

Ran-Ressler et al. (2008) gingen nog wat dieper in op dit onderwerp en vergeleken de samenstelling van de vernix caseosa met die van meconium. Meconium is de eerste fecale excretie van een pasgeborene. Het is nuttig deze 2 zaken te bestuderen aangezien de vernix caseosa gesuspendeerd wordt met het vruchtwater en op deze manier niet enkel ter hoogte van de huid blijft, maar ook ingenomen wordt door de foetus. De hoeveelheden en samenstelling van VKVZ in de vernix caseosa en meconium verschillenden vrij sterk. Ze bestonden uit respectievelijk 29.1% en 17.5% van het totale vetzuurprofiel (Tabel 1.7). De vernix caseosa en meconium hadden eveneens andere vertakte keten vetzuurprofielen. Voor wat betreft de iso type vetzuren vertoonde meconium ten opzichte van de vernix caseosa een verschuiving naar iso vertakte keten vetzuren met een hoger moleculair gewicht (Figuur 1.5). Voor wat betreft de anteiso reeks vond men bij de vernix caseosa meer anteiso vormen dan bij meconium. AnteisoC17:0 was de enige anteiso vorm die nog teruggevonden werd in meconium (Figuur 1.6).

Hieruit concludeerden ze dat de vernix caseosa een hoge nutritionele waarde heeft voor de pasgeborene. De vertakte keten vetzuren zijn erg belangrijke onderdelen van het gastro-intestinale stelsel van de pasgeborene aangezien een groot deel ervan werd geabsorbeerd en gemetaboliseerd. Hierdoor spelen ze mogelijks een sleutelrol in de


kolonisatie van de darmen. Zo zou de aanwezigheid van de mmVKVZ een shift kunnen veroorzaken in het profiel van de bacteriële flora ter hoogte van de darm. mmVKVZ kunnen er namelijk voor zorgen dat de groei van de meest dominante species wat geremd wordt door voornamelijk bacteriën die mmVKVZ incorporeren in hun membranen, te laten groeien.

Zo suggereerden ze ook een verband tussen mmVKVZ en Necrotizing Enterocolitis (NEC), een aandoening die 1 van de grootste oorzaken is van premature sterfte en waarvan de juiste oorzaak nog niet gekend is. De relatie met bacteriële overgroei is echter wel duidelijk alsook de hogere incidentie bij prematuren. Het feit dat de incidentie daalt naarmate het een oudere prematuur is en de incidentie eveneens daalt indien er probiotica worden toegediend, doet de interesse toenemen in de rol van mmVKVZ in NEC. Daarom worden ze ondermeer beschouwd als belangrijke nutritionele componenten van de foetus of pasgeborene.

Tabel 1.7: Vetzuurprofiel van de vernix caseosa en meconium bij de pasgeborene. De vernix caseosa bevat 29.1% vertakte keten vetzuren. Meconium bevat 17.5% vertakte keten vetzuren. Vetzuren voorgesteld als %. Ran-Ressler et al. (2008)

Component Vertakte keten vetzuren Gewone verzadigde vetzuren Mono-onverzadigde vetzuren Poly-onverzadigde vetzuren

Vernix caseosa 29.1 ± 1.5 34.0 ± 1.9 31.0 ± 1.7 3.9 ± 0.4

Meconium 17.5 ± 1.3 51.3 ± 3.0 22.4 ± 2.1 7.1 ± 1.1

Figuur 1.5: Voorstelling van de iso type vetzuren in de vernix caseosa (witte balkjes) en meconium (zwarte balkjes). In meconium is er een verschuiving naar iso type vetzuren met een hoger moleculair gewicht. Ran-Ressler et al. (2008)


Figuur 1.6: Voorstelling van de anteiso type vetzuren in de vernix caseosa (witte balkjes) en meconium (zwarte balkjes). Meconium bevat slechts 1 anteiso type vetzuur, namelijk anteisoC17:0. In het geval van de vernix caseosa zijn anteisoC13:0, anteisoC15:0, anteisoC17:0, anteisoC21:0 en anteisoC25:0 aanwezig. Ran-Ressler et al. (2008)

1.2.8. De functie van vertakte keten vetzuren bij de vrouwelijke goudhamster Reeds in 1996 werd een dimorf verschil gevonden in de samenstelling van de lipiden in de Harderian gland, een bepaalde klier aanwezig in de vrouwelijke en mannelijke goudhamster (Seyama et al., 1996). Mannetjes bevatten hoofdzakelijk onvertakte keten vetzuren met ketenlengtes die varieerden van C12 tot C22. Zowel even als oneven ketenlengtes werden gezien, hieruit kon men besluiten dat zowel acetyl-CoA als propionylCoA als primers werden gebruikt (zie 1.1.2.1.). De vrouwelijke goudhamsters daarentegen bevatten een grote hoeveelheid iso en anteiso vertakte keten vetzuren. Oneven keten vetzuren (C15, C17, C19, C21) bestonden zowel uit de iso als de anteiso vorm. Even keten vetzuren (C16 en C18) bestonden enkel uit iso vertakkingen.

Seyama & Uchijima (2007) beschreven eveneens de aanwezigheid van iso en anteiso mmVKVZ in de vrouwelijke goudhamster, terwijl die afwezig bleken te zijn in het mannetje. Ze suggereerden daarom dat de mmVKVZ bij de vrouwelijke hamsters de functie van feromoon vervulden om de mannetjes aan te trekken. Hormonale regeling lag aan de basis van het verschil tussen mannetjes en vrouwtjes. Zoals reeds in 1.1.2.2. aangehaald, vervullen de vertakte keten aminozuren leucine, isoleucine en valine een belangrijke rol als precursor voor de vertakte keten vetzuren. Hoe hormonen hier een invloed kunnen op hebben, wordt duidelijk via Figuur 1.7.


TESTOSTERON

Figuur 1.7: Invloed van testosteron op de vetzuursynthese in de goudhamster. Testosteron zorgt voor inductie van de enzymen 2-methyl-branched-chain acyl-CoA dehydrogenase en isovaleryl-CoA dehydrogenase. Hierdoor wordt de productie van de niet-vertakte keten vetzuren (straight chain fatty acids) gepromoot. Bij vrouwtjes waar testosteron afwezig is, wordt er een opstapeling gezien van de precursoren voor de vertakte keten vetzuren (branched chain fatty acids). Hierdoor bezitten de vrouwtjes wel vertakte keten vetzuren in tegenstelling tot de mannetjes. Seyama & Uchijima (2007)

Testosteron is in staat om het metabolisme van de vertakte keten aminozuren te beïnvloeden ter hoogte van 2-methyl-branched-chain acyl-CoA dehydrogenase en isovalerylCoA dehydrogenase. In de afwezigheid van testosteron, zoals dit het geval is voor de vrouwelijke goudhamster, zijn beide enzymen inactief en krijg je op die manier opstapeling van isobutyryl-CoA, 2-methyl-butyryl-CoA en isovaleryl-CoA. Zij doen dienst als precursoren voor de vertakte keten vetzuren. Bij het mannetje daarentegen is er wel testosteron


aanwezig, waardoor de 2 enzymen geïnduceerd worden en de synthese van de gewone verzadigde vetzuren kan doorgaan. Dit werd bevestigd door experimenten waarbij de activiteit van de dehydrogenasen werd bestudeerd. Bij de mannelijke waren die actief, bij de vrouwelijke niet, maar konden die wel geactiveerd worden wanneer ze testosteron toedienden bij de vrouwtjes.

1.2.9. Vertakte keten vetzuren en hun rol in de behandeling van kanker

Een potentieel hoopgevende rol die vertakte keten vetzuren kunnen spelen is die in het kader van kanker. Yang et al. (2000) toonden aan dat isoC15:0 in staat was om apoptose te induceren bij menselijke kankercellen.

Reeds 2 uur na toediening werden de eerste effecten zichtbaar en het aantal cellen dat werd gedood, nam toe naarmate er een langere blootstelling was aan isoC15:0. De behandeling bood eveneens enkele voordelen daar waar de huidige chemotherapie toch nog wat faalt. Zo kon het toegediend worden in vrij hoge dosissen en had het een brede toxisch therapeutische marge, waardoor (toxische) nevenwerkingen tot een minimum werden herleid. De muizen kregen minder dan 75mg/kg/dag toegediend, terwijl de LD50 waarde op 5g/kg/dag ligt. Daarnaast werd het zo goed als niet hepatisch gemetaboliseerd, maar via de lymfekanalen in de circulatie gebracht. Zo kan een hogere concentratie de targetorganen bereiken.

Figuur 1.8 toont de resultaten van de inhibitie van de tumorgroei in vivo bij verschillende doseringen. Figuur 1.8 A toont het inhiberende effect van isoC15:0 op de groei van een prostaatcarcinoom. Een dosering van 70 mg/kg geeft de sterkste gewichtsreductie van de tumor. Figuur 1.8 B toont het effect van isoC15:0 op de groei van een hepatocellulair carcinoom. Ook hier veroorzaakt een dosering van 70 mg/kg een gewichtsreductie van de tumor.


Figuur 1.8: Effect van isoC15:0 op tumorgroei. Figuur 1.8 A toont het effect van isoC15:0 op de groei van een prostaatcarcinoom. Doseringen van 70mg/kg geven de sterkste gewichtsreductie van de tumor. Figuur 1.8 B toont het effect van isoC15:0 op de groei van een hepatocellulair carcinoom. Ook in dit geval blijkt isoC15:0 in een hoeveelheid van 70 mg/kg een inhiberend effect te hebben op de tumorgroei. Yang et al. (2000)

Ook voor isoC16:0 werd een antitumorale activiteit waargenomen, meerbepaald in patiënten met borstkanker (Wongtangtintharn et al., 2004). Antitumorale activiteit werd gezien voor een groot aantal mmVKVZ, zowel iso als anteiso vormen, maar isoC16:0 scoorde het sterkst van allemaal. Het vooropgestelde mechanisme was een inhibitie van de vetzuursynthese van de tumorcellen, dit op 2 manieren. Enerzijds zorgde isoC16:0 voor een vermindering van de precursoren die nodig zijn voor de vetzuursynthese en anderzijds zorgde het voor een rechtstreekse inhibitie van de vetzuursynthese.

Deze hypothese strookt met de observaties die Kuhajda (2000) deed. Hij ging verder in op vroegere bevindingen dat het Westerse dieet - gekenmerkt door grote hoeveelheden vet – mogelijks voor een hoop ziektetoestanden had geleid, zoals colon-, borst- en ovariumcarcinoma (Carroll, 1992; Reddy, 1992; Risch et al., 1994). Kankercellen zijn namelijk in staat te voorzien in hun eigen voorraad aan vetzuren, onafhankelijk van de signalen die de normale vetzuursynthese regelen. Kuhajda (2000) vond dat inhibitie van Fatty Acid Synthase (FAS), het belangrijkste enzym tijdens de vetzuursynthese, leidde tot apoptose van de kankercellen. Dit illustreerde het belang van vetzuren in de overleving van dergelijke maligne


cellen, wat op zijn beurt bevestigde dat isoC16:0 door in te spelen op de vetzuursynthese, een antitumorale werking kon hebben. De inhibitie van FAS bood daarenboven het voordeel om selectief toxisch te zijn voor de tumorcellen, aangezien vooral in deze cellen FAS tot expressie kwam. Verder zag men de grootste activiteit van FAS bij de meest virulente, agressieve tumoren.

Al deze bevindingen leidden er toe dat men op zoek ging naar de rol van melklipiden als potentieel anti-carcinogene verbindingen (Parodi, 2008). Zoals reeds aangehaald in 1.1.3.2. beschikt melk over een hele resem OVKVZ die afkomstig zijn van de bacteriële flora van de koe. Parodi (2008) suggereerde dat de iso en anteiso vertakte keten vetzuren afkomstig uit melk potentieel een anti-carcinogeen effect hebben.

1.3.

CONCLUSIE Zoals blijkt uit voorgaand literatuuroverzicht zijn de vertakte keten vetzuren nog niet

grondig onderzocht bij mensen en monogastrische productiedieren. Onderzoek naar monomethyl vertakte keten vetzuren, de iso en anteiso vormen, is voornamelijk toegespitst op bacteriën, waar ze een groot aandeel hebben in de vetzuren van het celmembraan. Uit de beperkte gegevens die beschikbaar zijn in de literatuur, lijkt het erop dat ze ook een belangrijke rol kunnen spelen bij eukaryoten. Het belang van deze vetzuren wordt onder andere geïllustreerd door hun rol in de reproductie en ontwikkeling van eukaryoten. Voorbeelden hiervan zijn isoC15:0 en isoC17:0 in de ontwikkeling van C. elegans, de rol van de vertakte keten vetzuren in de ontwikkeling van een pasgeborene en de rol die ze hebben als feromoon in de vrouwelijk goudhamster. Bij dolfijnen spelen de vertakte keten vetzuren een rol in de echolocatie. Daarnaast kunnen ze eventueel toegepast worden omwille van hun biologische eigenschappen. Denken we hierbij aan hun potentiële anti-tumorale werking of hun effect op de triglyceriden bij obese ratten. Niet alleen bij dieren, maar ook bij de mens worden de vertakte keten vetzuren teruggevonden. Naast vernix caseosa, vindt men ze terug in het haar van mensen en worden ze in verhoogde hoeveelheden teruggevonden in het traanvocht van MGD patiënten.

O B J E C T I E V E N | 20

2. OBJECTIEVEN Deze masterproef situeert zich binnen het onderzoek van LANUPRO (Laboratory for Animal Nutrition and Animal Product Quality), onderdeel van Universiteit Gent, Melle, België. De doelstelling van dit onderzoek is op zoek te gaan naar vertakte keten vetzuren in verschillende stalen van biggen en zeugen. De interesse in deze vertakte keten vetzuren komt voort uit de grote variëteit aan functies die deze vetzuren hebben in talrijke organismen. Er is al veel geweten over vertakte keten vetzuren die bij bepaalde bacteriën deel uitmaken van het celmembraan (Kaneda, 1963; Kaneda, 1991). Zo produceren de bacteriële flora van herkauwers vertakte keten vetzuren die uitgescheiden worden in de melk (Keeney et al., 1962; Vlaeminck et al., 2006a). Er is echter weinig geweten over de functie van de vertakte keten vetzuren wanneer ze door het dier zelf aangemaakt worden bij bijvoorbeeld de mens of monogastrische productiedieren. Interesse in de embryonale en postnatale ontwikkeling werd opgewekt door onderzoek beschreven door Kniazeva et al. (2008) die de cruciale rol van deze vetzuren beschreven in de ontwikkeling van C. elegans larven. Daarnaast vonden Ran-Ressler et al. (2008) dat de vertakte keten vetzuren een belangrijk deel uitmaken van de vernix caseosa bij de pasgeborene. De eerste fase van ons onderzoek focust zich op de hersenen, het hart en de milt van 2 groepen biggen. De ene zijn 1 week oud, de andere zijn 4 weken oud. Dit moet ons toelaten inzicht te verwerven in de aanwezigheid van vertakte keten vetzuren en ons een beeld te geven over de eventuele invloed van leeftijd op het gehalte van vertakte keten vetzuren. In een tweede fase wordt er gezocht naar vertakte keten vetzuren in de aanvoer van de zeug naar de big, namelijk in het plasma en het colostrum. Onderzoek van het plasma van zeugen geeft ons een beeld over de functie van vertakte keten vetzuren tijdens de embryonale ontwikkeling. Onderzoek in de 3 organen uit de eerste fase en het colostrum geeft een inzicht in de rol van de vertakte keten vetzuren tijdens de postnatale ontwikkeling.

M A T E R I A A L E N M E T H O D E N | 21

3. MATERIAAL EN METHODEN

3.1.

STAALNAME De stalen die in het kader van dit onderzoek werden geanalyseerd, zijn stalen die

gebruikt worden voor het onderzoek van doctoraatsstudente Sofie Tanghe. Dit is echter de eerste maal dat er in deze stalen specifiek op zoek wordt gegaan naar vertakte keten vetzuren. Enerzijds zijn er de stalen afkomstig van het bedrijf Danis nv, Koolskamp. Hier werden stalen genomen van de hersenen, het hart en de milt bij 2 leeftijdsgroepen van biggen. De ene biggen waren 1 week oud, de andere waren 4 weken oud. De staalname gebeurde respectievelijk op 11/02/2008 en op 25/02/2008. De staalname gebeurde via verdoving met isofluraan, gevolgd door uitbloeding. Van de hersenen, het hart en de milt zijn er telkens 12 stalen beschikbaar, dus 3x12= 36 stalen in het totaal. Binnen die 12 stalen per orgaan zijn er 6 afkomstig van de biggen die 1 week oud waren, de overige 6 zijn afkomstig van de biggen die 4 weken oud waren. Anderzijds zijn er stalen die afkomstig zijn van een experiment uitgevoerd aan Het Instituut voor Landbouw en Visserijonderzoek (ILVO) te Melle. Nu werden geen organen van biggen gecollecteerd, maar wel het colostrum (n=20) en het plasma (n=15) van de zeug. Colostrum is de eerste moedermelk die geproduceerd wordt. Deze stalen werden genomen om de invloed van verschillende soorten voeders op de productie van onverzadigde vetzuren bij zeugen te onderzoeken.

3.2.

STAALVOORBEREIDING

3.2.1. Hersenen, hart en milt

3.2.1.1.

Lyofilisatie

De hersen-, hart- en miltstalen werden na staalname bewaard bij -20°C. De eerste behandeling waaraan ze werden onderworpen, was lyofilisatie, dit gebeurde met een Freeze


Dryer Super Modulyo (Edwards, Crawley, UK). Lyofiliseren of vriesdrogen is een proces waarbij -zo goed als- alle water wordt verwijderd uit het staal. Dit zorgde ervoor dat het malen (cf. 3.2.1.2.) vlotter verliep. Ook tijdens de extractie en methylatie (cf. 3.3.) heeft water een ongunstige invloed op de methylatie. 3.2.1.2.

Malen

Nadat het water verwijderd was, moesten de stalen gemalen worden om nadien de vetten er te kunnen uit extraheren. Hiervoor werd een A10 Analytical mill (IKA® Werke, Staufen, Duitsland) gebruikt (Figuur 3.1).

Figuur 3.1: A10 Analytical mill (http://advance-scientific.com/Supp_Details2.asp?CATEGORY_C=IKA%20Yellowline*%20A10%20Analytical%20Grinder)(04-03-2011)

3.2.1.3.

Afwegen

Van elk van de gemalen stalen werd 200 mg afgewogen op een analytische balans AB204 (Metller Toledo, Zaventem, België). De gewichten werden per staal genoteerd. 3.2.2. Plasma en colostrum In het geval van plasma werd er 200 µl genomen en werd het gewicht genoteerd voor ieder staal. Bij colostrum werd er 400 µl afgewogen en werd ook hier bij elk staal het gewicht genoteerd. Beide stalen werden afgewogen op dezelfde AB204 balans zoals hoger beschreven.


3.3.

EXTRACTIE EN METHYLATIE Het spreekt voor zich dat indien er enkel interesse is in de vetzuren, ze voorafgaand

aan de chromatografie moeten geëxtraheerd worden uit het staal. In het geval van gaschromatografie (GC) moet er eveneens gederivatiseerd worden. 3.3.1. Hersenen, hart en milt Voor de hersen-, hart en miltstalen werd er een methylatie uitgevoerd. Voorafgaande extractie van de vetten om de waterfase te scheiden van de organische fase was hier niet nodig aangezien de stalen reeds gevriesdroogd waren. Er werd 2.00 ml tolueen met C13:0 als interne standaard toegevoegd aan het afgewogen staal. Na vortexen werd 2.00 ml methanolisch NaOH toegevoegd. Na vortexen werden de stalen voor een uur in een warmwaterbad van 70°C geplaatst. Na afkoelen werd 3.00 ml methanolisch HCl toegevoegd en, na vortexen, voor 30 min in een oven van 50°C geplaatst. Na afkoelen werden 3 ml hexaan en 4 ml NaHCO3 toegevoegd. Na vortexen, werd er gecentrifugeerd. De bovenste fase werd over een kolom met glaswol, 200 mg silica gel en een kleine hoeveelheid actieve kool gebracht. Het solvent werd terug opgevangen en in een GC-vial overgebracht. 3.3.2. Plasma Bij de plasmastalen moest voorafgaand aan de methylatie een extractie uitgevoerd worden om de waterfase te scheiden van de organische fase. Aan de afgewogen stalen werd 1.5 ml methanol toegevoegd en, na vortexen, werd er 5 ml methyl-tert-butyl-ether toegevoegd en gevortext voor 1 uur. Nadien werd 1.25 ml water toegevoegd en werd er gecentrifugeerd. De bovenste laag werd afgehaald en overgebracht naar een methylatiebuis. Nadien volgde nogmaals hetzelfde proces, nu met 1.29 ml methyl-ter-butyl-ether, 0.39 ml methanol en 0.32 ml water. Na vortexen en centrifugeren werd opnieuw de bovenste laag afgehaald en overgebracht naar de methylatiebuis. Tot slot werd drooggedampt onder N2 tot de vetfractie werd bekomen. Nadien volgde de methylatie analoog aan die beschreven in 3.3.1. 100 µl tolueen met TAG-C13:0 als interne standaard werd toegevoegd aan de vetfractie bekomen tijdens de extractie. Daarna werd 300 µl methanolisch NaOH toegevoegd en, na vortexen, werd er


gedurende 60 min geïncubeerd bij 50°C en nadien afgekoeld. 200 µl methanolisch HCl werd toegevoegd en, na vortexen, volgde incubatie bij 50°C gedurende 10 min. Na afkoeling werd er 200 µl hexaan toegevoegd en 400 µl NaHCO3. Na vortexen en centrifugeren werd de bovenste fase overgebracht naar een GC vial. 3.3.3. Colostrum Net als bij de plasmastalen werd ook bij de colostrumstalen een voorafgaande extractie uitgevoerd om het aanwezige water te kunnen verwijderen. Hiervoor werd een methode gebruikt die gebaseerd is op Rose-Gottlieb. Aan de afgewogen hoeveelheid colostrum werd 0.3 ml ammonium oplossing (25%) en 2.0 ml ethanol (95%) toegevoegd. Na vortexen werd 5 ml diethylether toegevoegd. Nadien werd gevortext en 5 ml petroleum ether toegevoegd. Na vortexen en centrifugeren werd 1.7 ml van de bovenste laag naar een methylatiebuis overgebracht. Op die 1.7 ml werd nadien de methylatie uitgevoerd. Aan de 1.7 ml werd 0.5 ml TAGC13:0 als interne standaard toegevoegd en drooggedampt onder N2. Nadien werd 2 ml hexaan, 40 µl methyl acetaat en 40 µl methylatie reagens (1.75 ml methanol + 0.4 ml natrium methoxide 5.4 M). Na vortexen gedurende 10 min werd 60 µl terminatie reagens toegevoegd ( 1g oxaalzuur opgelost in 30 ml diethyl ether). Na vortexen werd 1 g calciumchloride toegevoegd. Na vortexen en centrifugeren werd de bovenste fase overgebracht naar een GC vial. 3.4.

GASCHROMATOGRAFIE

3.4.1. Algemeen Op basis van retentietijden kunnen componenten worden geïdentificeerd wanneer ze vergeleken worden met standaardmengsels. Dit is echter geen 100% sluitende methode aangezien er soms ook andere componenten eenzelfde retentietijd hebben. Daarom werd er in dit onderzoek ook gebruik gemaakt van massaspectroscopie (MS) wat op basis van typische fragmentionen een perfect identificatiemiddel is. In totaal werd er gewerkt met 3 types kolommen (SLB-5ms, SP2560 en SOLGEL WAX) en 2 types detectoren (MS en FID).


3.4.2. SLB-5ms / MS Deze methode met massaspectroscopie is van de 3 technieken de meest betrouwbare aangezien er hier een identificatie kon gebeuren op 2 manieren: enerzijds kon er gedifferentieerd worden op basis van de retentietijd, maar anderzijds kon er ook op elk tijdstip een massaspectrum opgevraagd en geanalyseerd worden. 3.4.2.1.

Opstelling

A. Gaschromatograaf

De gebruikte gaschromatograaf was een Trace 2D-GC (Thermo Electron Corp., Waltham, MA, USA). Er werd gebruik gemaakt van een split injector. Er werd 2 µl geïnjecteerd en de split ratio was 25:1 met een inlet temperature van 250°C. De scheiding van de componenten werd bekomen met behulp van temperatuurprogrammatie. De initiële temperatuur bedroeg 140°C, nadien verhoogde de temperatuur met 2°C/min tot 200°C. In een volgende fase steeg de temperatuur verder tot 250°C aan een snelheid van 1°C/min. Tenslotte werd er naar een eindtemperatuur van 300°C gestreefd aan een snelheid van 5°C/min. Deze temperatuur werd 20 min aangehouden. Het dragergas was helium en de flow bedroeg 1 ml/min. De gebruikte kolom was een SLB-5ms FUSED SILICA capillaire kolom (Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA) bestaande uit silfenyleen polymeer. Afmetingen: 60 m x 0.25 mm x 0.25 µm filmdikte. Het is een kolom die geschikt is voor mengsels met semi-vluchtige componenten aangezien de scheiding gebeurt op basis van het kookpunt. http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/gas-chromatography/columns/slb-gc-capillary/products.html (24-04-2011)

B. Massaspectrometer De massaspectrometer was een DSQ II (Thermo Electron Corp., Waltham, MA, USA). Figuur 3.2 toont de algemene voorstelling van een massaspectrometer.


Figuur 3.2: Voorstelling van een massaspectrometer. De 3 grote onderdelen zijn: ionizer, ion analyzer en detector (http://www.chem.arizona.edu/massspec/intro_html/intro.html)(04-04-2011)

Een massaspectrometer is opgebouwd uit 3 belangrijke onderdelen: een ionizer, een ion analyzer en een detector. Ionizer De ionizer heeft als doel de componenten die afkomstig zijn van de GC te fragmenteren in verschillende ionen. De fragmentatie tijdens onze analyse gebeurde via Electron Impact (EI). Hierbij worden de vetzuren die zich in de gasfase bevinden, gebombardeerd met elektronen waardoor positief geladen ionen ontstaan. Die ionen zullen op hun beurt fragmenteren in kleinere ionen. De gebruikte ionisatie voltage was 70 eV en het draaggas was helium (Christie, 1989; Thermo Electron Corporation DSQ II Hardware Manual (2006)). Ion analyzer Al deze ionen worden dan doorheen een magnetisch of elektrisch veld gestuurd waarin ze gescheiden worden op basis van hun m/z waarde. Veelal wordt gebruikt gemaakt van een Quadrupole Mass Filter. In het geval van de DSQ II zijn dit 4 staven waarvan 2 met Radio Frequency voltages en 2 met Direct Current voltages. De verschillende groottes van deze voltages veroorzaken stabiele oscillaties van ionen met bepaalde m/z waarden. Zo is de Quadrupole Mass Filter in staat welbepaalde ionen met welbepaalde m/z waarden tot bij de detector te laten komen. Aangezien EI alleen enkelvoudig + geladen moleculen doet ontstaan, gebeurt de scheiding op basis van het moleculair gewicht (Christie, 1989; Thermo Electron Corporation DSQ II Hardware Manual (2006)).


Detector De meeste detectoren produceren een elektrisch signaal wanneer ze geraakt worden door een ion. In het geval van de DSQ II is dit een Ion Detector Assembly. Deze bestaat enerzijds uit een Conversion Dynode die het signaal versterkt en de ruis doet dalen. Anderzijds beschikt het ook over een Electron multiplier die het signaal nog eens versterkt, waardoor een grotere gevoeligheid bekomen wordt (Christie, 1989; Thermo Electron Corporation DSQ II Hardware Manual (2006)). 3.4.2.2.

Interpretatie

De analyse van de massaspectra gebeurde met behulp van de software Xcalibur (Thermo Electron Corp., Waltham, MA, USA) en was gebaseerd op 2 principes. Enerzijds gingen we op zoek naar kenmerkende fragmentionen2 bij bepaalde m/z waarden die typisch zijn voor bepaalde groepen van vetzuren. Anderzijds kon vergelijking van de bekomen spectra met referentiespectra uit een online databank3 verhelderend zijn bij twijfel. Voor een meer gedetailleerde uitleg wordt verwezen naar 5.1.2.2. 3.4.3. SP2560 / FID De tweede methode waarop de stalen werden geanalyseerd was een GC uitgerust met een SP2560 kolom en een Flame Ionization Detector (FID). 3.4.3.1.

Opstelling

A. Gaschromatograaf De gebruikte gaschromatograaf was een 7890A GC System (Agilent Technologies, Diegem, België). Er werd gebruik gemaakt van een split injector. Er werd 1 µl geïnjecteerd en de split ratio was 50:1 met een inlet temperature van 250°C. De scheiding van de componenten werd bekomen met behulp van temperatuurprogrammatie. De initiële temperatuur bedroeg 70°C, daarna werd de temperatuur opgedreven tot 175°C aan een snelheid van 50°C/min en werd deze 13 min aangehouden. Nadien verhoogde de

2 3

http://lipidlibrary.aocs.org/ms/masspec.html (15-04-2011) http://lipidlibrary.aocs.org/ms/arch_me/index.htm (15-04-2011)


temperatuur verder tot 215°C aan een snelheid van 5°C/min, dit werd 21 minuten aangehouden. Het dragergas was H2 en de flow bedroeg 1 ml/min. De gebruikte kolom was een SP2560 capillaire kolom (Supelco / Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA) bestaande uit sterk gesubstitueerd cyanopropyl. Afmetingen: 75 m x 0.18 mm x 0.14 µm. Deze kolom biedt het voordeel dat het componenten met vrij dicht bij elkaar liggende kookpunten kan scheiden. Zo kunnen cis en trans isomeren van elkaar onderscheiden worden. (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?N4=23348U|SUPELCO&N5=SEARCH_CONC AT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&lang=en_US) (18-04-2011)

B. FID detector De Flame Ionization Detector (FID) (Figuur 3.3) aanwezig in de 7890A GC System (Agilent Technologies, Diegem, België) is bijzonder goed geschikt om de hoeveelheden van de verschillende componenten te bepalen.

Figuur 3.3: Voorstelling van een FID detector. Er ontstaan ionen indien de componenten door de vlam gaan. De ionen doen een stroom ontstaan. De hoeveelheid stroom die gecreëerd wordt, is een maat voor de hoeveelheid van de component. (http://www.chem.unl.edu/uic/gc-fid.shtml) (18-04-2011)

Zoals de naam suggereert worden de componenten, die voorafgaandelijk gescheiden zijn via GC, geïoniseerd met behulp van een waterstofvlam. De H2 vlam had een temperatuur van 255°C. Daarnaast zijn er ook nog een positieve elektrode en collectorplaten aanwezig. De ionen die ontstaan zijn door de vlam bewegen zich van de positieve elektrode richting de collectorplaten, waardoor een bepaalde hoeveelheid stroom ontstaat. De hoeveelheid


stroom die ontwikkeld wordt, is een maat voor de hoeveelheid van die component aanwezig in het staal. De hoeveelheid stroom wordt eerst voorbij een versterker gestuurd en dan richting de recorder. 3.4.3.2.

Interpretatie

Interpretatie van de pieken die gevonden werden op de chromatogrammen gebeurde met behulp van de software Agilent ChemStation (Agilent Technologies, Diegem, België) en is gebaseerd op standaardmengsels. Via vergelijking van de retentietijden van de standaardmengsels en de stalen konden de pieken geïdentificeerd worden. Er werden verschillende standaardmengsels gebruikt zodat alle vetzuren vertegenwoordigd waren, zowel de even en oneven keten vetzuren, de enkelvoudig en meervoudig onverzadigde vetzuren als de iso en anteiso vertakte keten vetzuren. De gebruikte standaardmengsels waren: -

37 Component FAME Mix. Catalog No. 47885-U (Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA)

-

Mixture BR2. Order No. 90-1052 (Larodan Fine Chemicals, Malmö, Zweden)

-

Mixture BR3. Order No. 90-1053 (Larodan Fine Chemicals, Malmö, Zweden)

-

PUFA-3. Catalog No. 1177 (Matreya LLC, Pleasant Gap, PA, USA)

-

GLC463 (Nu chek Prep, Elysian, MN, USA)

3.4.4. SOLGEL WAX / FID

De derde methode waarop de stalen werden geanalyseerd was een GC uitgerust met een SOLGEL WAX kolom en een FID detector.

3.4.4.1.

Opstelling

A. Gaschromatograaf De gebruikte gaschromatograaf was een HP 6890 Series GC System (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA). Er werd gebruik gemaakt van een split injector. Er werd 1 µl geïnjecteerd


en de split ratio was 50:1 met een inlet temperature van 250°C. De scheiding van de componenten werd bekomen met behulp van temperatuurprogrammatie. De initiële temperatuur bedroeg 150°C gedurende 2 min en liep op tot 250°C met een snelheid van 3°C per minuut. Het dragergas was H2 en de flow bedroeg 1.5 ml/min. De gebruikte SOLGEL WAX capillaire kolom (SGE Analytical Science, Milton Keynes, UK) bestaat uit poly-ethyleenglycol (PEG). Afmetingen: een lengte van 30 m, ID van 0.25 mm en een filmdikte van 0.25 µm. Deze kolom is goed geschikt om onverzadigde vetzuren te scheiden (http://www.sge.com/products/columns/gc-columns/forte-solgel-wax) (20-042011).

B. FID-detectie en interpretatie De FID-detectie en interpretatie gebeurden zoals hoger beschreven in 3.4.3.

R E S U L T A T E N | 31

4. RESULTATEN

4.1.

VETZUURPROFIELEN VAN DE HERSENEN, HET HART EN DE MILT

4.1.1. Hersenen Het vetzuurprofiel van de hersenen wordt weergegeven in Tabel 4.1. Uit deze tabel blijkt dat er geen vertakte keten vetzuren aanwezig zijn in de hersenen. C16:0, C18:0 en cis9C18:1 zijn de vetzuren die in de grootste hoeveelheden aanwezig zijn. In vergelijking met het hart en de milt komt er een vrij grote hoeveelheid C22:6n-3 (DHA) voor. Ook C20:4n-6 (arachidonzuur) is meer aanwezig in de hersenen in vergelijking met het hart en de milt. 4.1.2. Hart Het vetzuurprofiel van het hart wordt weergegeven in Tabel 4.2. In het hart zijn vertakte keten vetzuren aanwezig, namelijk isoC15:0 en isoC17:0. Ze komen echter in beperkte hoeveelheden voor. De meest dominante vetzuren in dit vetzuurprofiel zijn cis9C18:1, C16:0 en C18:2n-6. In vergelijking met de hersenen en de milt komt er veel C18:2n-6 (linolzuur) voor. 4.1.3. Milt Het vetzuurprofiel van de milt wordt weergegeven in Tabel 4.3. Net als bij het hart zijn bij de milt isoC15:0 en isoC17:0 aanwezig, opnieuw in beperkte hoeveelheden. Bij de milt zijn C16:0, cis9C18:1 en C18:0 de hoofdcomponenten. Met een waarde die bijna oploopt tot 1/3 van het totale vetzuurprofiel is C16:0 sterk vertegenwoordigd in de milt.


Tabel 4.1: Vetzuurprofiel van de hersenen. Het gemiddelde per component en per week wordt weergegeven met bijhorende standaarddeviatie (Stdev). Hoeveelheden uitgedrukt als procentueel aandeel (% w/w).

Week 1 Gemiddelde Stdev C12:0 C14:0 C15:0 C16:0 16:1 trans9C16:1 cis9C16:1 C17:0 C17:1 C18:0 cis9C18:1 cis11C18:1 C18:2n-6 C20:0 C18:3n-6 C18:3n-3 C20:1 C20:2n-6 C20:3n-6 C22:0 C20:3n-3 C20:4n-6 C22:1 C20:5n-3 C24:0 C22:4n-6 C24:1 C22:5n-6 C22:5n-3 C22:6n-3 C24:4n-6

0.01 0.64 0.10 20.47 0.13 0.12 1.01 0.21 0.14 17.77 14.57 4.28 1.25 0.16 0.04 0.02 0.59 0.16 0.52 0.09 0.04 9.36 0.17 0.02 0.06 4.01 0.05 1.65 0.39 7.75 0.32

0.004 0.034 0.011 0.332 0.005 0.007 0.051 0.013 0.012 0.132 0.622 0.122 0.159 0.022 0.005 0.002 0.069 0.020 0.051 0.010 0.019 0.259 0.016 0.004 0.006 0.137 0.005 0.085 0.048 0.267 0.016

Week 4 Gemiddelde Stdev 0.01 0.51 0.06 18.94 0.12 0.08 1.02 0.18 0.12 17.86 16.63 4.43 1.64 0.19 0.03 0.02 0.76 0.22 0.58 0.10 0.02 8.58 0.21 0.02 0.07 3.65 0.07 1.36 0.37 7.44 0.30

0.004 0.087 0.002 0.514 0.005 0.009 0.261 0.009 0.003 0.539 0.751 0.200 0.645 0.014 0.004 0.004 0.063 0.027 0.029 0.011 0.008 0.352 0.013 0.006 0.013 0.161 0.009 0.146 0.035 0.441 0.020


Tabel 4.2: Vetzuurprofiel van het hart. Het gemiddelde per component en per week wordt weergegeven met bijhorende standaarddeviatie (Stdev). Hoeveelheden uitgedrukt als procentueel aandeel (% w/w).

Week 1 Gemiddelde Stdev C10:0 C12:0 C14:0 isoC15:0 C14:1 C15:0 C16:0 16:1 trans9C16:1 isoC17:0 cis9C16:1 C17:0 C17:1 C18:0 cis9C18:1 cis11C18:1 C18:2n-6 C20:0 C18:3n-6 C18:3n-3 C20:1 C20:2n-6 C20:3n-6 C22:0 C20:3n-3 C20:4n-6 C22:1 C20:4n-3 C20:5n-3 C24:0 C22:4n-6 C22:5n-6 C22:5n-3 C22:6n-3

0.02 0.04 0.86 0.03 0.03 0.08 18.50 0.16 0.02 0.02 2.88 0.21 0.17 12.14 22.83 3.73 18.16 0.09 0.13 0.81 0.31 0.54 0.46 0.04 0.14 6.64 0.05 0.03 0.45 0.04 0.58 0.24 0.80 0.76

0.003 0.011 0.250 0.005 0.014 0.008 1.427 0.022 0.005 0.009 0.818 0.021 0.017 1.120 2.866 0.153 1.320 0.015 0.022 0.090 0.070 0.070 0.047 0.005 0.031 1.402 0.017 0.004 0.131 0.015 0.107 0.060 0.191 0.123

Week 4 Gemiddelde Stdev 0.03 0.06 1.33 0.03 0.04 0.07 22.32 0.06 0.02 0.02 4.48 0.17 0.18 9.39 27.13 3.17 16.86 0.09 0.08 1.11 0.40 0.52 0.31 0.03 0.16 4.37 0.03 0.03 0.23 0.03 0.32 0.06 0.59 0.49

0.008 0.007 0.101 0.006 0.012 0.008 0.996 0.006 0.004 0.006 0.884 0.013 0.008 0.626 1.779 0.185 0.720 0.011 0.014 0.101 0.077 0.044 0.035 0.004 0.020 0.699 0.003 0.002 0.028 0.011 0.040 0.010 0.062 0.066


Tabel 4.3: Vetzuurprofiel van de milt. Het gemiddelde per component en per week wordt weergegeven met bijhorende standaarddeviatie (Stdev). Hoeveelheden uitgedrukt als procentueel aandeel (% w/w).

Week 1 Gemiddelde Stdev C10:0 C12:0 C14:0 isoC15:0 C14:1 C15:0 C16:0 16:1 trans9C16:1 isoC17:0 cis9C16:1 C17:0 C17:1 C18:0 cis9C18:1 cis11C18:1 C18:2n-6 C20:0 C18:3n-6 C18:3n-3 C20:1 C20:2n-6 C20:3n-6 C22:0 C20:3n-3 C20:4n-6 C22:1 C20:4n-3 C20:5n-3 C24:0 C22:4n-6 C22:5n-6 C22:5n-3 C22:6n-3

0.05 0.04 0.97 0.03 0.03 0.15 27.82 0.13 0.04 0.04 2.52 0.28 0.13 14.33 22.04 2.84 9.92 0.14 0.09 0.36 0.36 0.58 0.65 0.12 0.10 5.91 0.11 0.02 0.24 0.13 0.90 0.09 0.80 0.65

0.012 0.014 0.260 0.014 0.016 0.016 1.743 0.023 0.005 0.014 0.773 0.023 0.017 1.388 2.804 0.176 1.208 0.024 0.031 0.068 0.042 0.086 0.203 0.011 0.030 2.306 0.015 0.012 0.106 0.029 0.305 0.029 0.341 0.271

Week 4 Gemiddelde Stdev 0.03 0.06 1.37 0.03 0.05 0.14 29.24 0.11 0.02 0.04 3.97 0.25 0.14 13.46 22.36 2.72 9.76 0.12 0.06 0.50 0.35 0.53 0.58 0.10 0.09 5.06 0.07 0.02 0.14 0.09 0.80 0.05 0.64 0.45

0.005 0.014 0.234 0.018 0.014 0.018 1.061 0.013 0.002 0.016 0.824 0.021 0.013 0.960 2.379 0.118 0.491 0.013 0.011 0.055 0.048 0.050 0.152 0.011 0.017 0.951 0.008 0.005 0.047 0.017 0.106 0.012 0.138 0.110


4.2.

RESULTATEN VAN HET PLASMA EN HET COLOSTRUM

De plasma- en colostrumstalen van de zeugen zijn afkomstig van een proef waarbij de invloed van het dieet op de onverzadigde vetzuren wordt onderzocht. De zeugen werden in groepen verdeeld waarbij elke groep een ander dieet kreeg. Van de beschikbare stalen werden er 15 (plasma) en 20 (colostrum) willekeurig gekozen voor gedetailleerde vetzuuranalyse. Vermits de zeugen een rantsoen kregen welke voornamelijk verschilde in vetzuursamenstelling werd besloten om enkel de vertakte keten vetzuren kwantitatief te analyseren. Op basis van de bekomen chromatogrammen kan gesteld worden dat er geen vertakte keten vetzuren aanwezig zijn in de plasma- en colostrumstalen van de zeugen.

D I S C U S S I E | 36

5. DISCUSSIE

5.1.

SCHEIDING EN IDENTIFICATIE

5.1.1. Scheiding Voor de scheiding van de verschillende vetzuren wordt gebruik gemaakt van 3 verschillende kolommen (SLB-5ms kolom, SP2560 kolom en SOLGEL WAX kolom). Deze kolommen hebben alle 3 hun eigen principe van scheiding. De scheiding bij de SLB-5ms kolom gebeurt op basis van het kookpunt van de vetzuren. Aangezien het kookpunt lager ligt naarmate het aantal dubbele bindingen toeneemt, zullen de onverzadigde vetzuren een kleinere retentietijd hebben dan de verzadigde vetzuren met een zelfde aantal C-atomen. Figuur 5.1 toont het chromatogram dat wordt bekomen voor een hartstaal (staal 21) via de SLB-5ms kolom. Figuur 5.1 toont duidelijk aan dat de retentietijd stijgt naarmate de ketenlengte toeneemt. De componenten met het grootste aantal dubbele bindingen hebben de kleinste retentietijd omdat hun kookpunt lager ligt. De volgorde van retentie in het geval van C18 verbindingen is dan ook als volgt: eerst C18:2n-6 , daarna cis9C18:1 en als laatste C18:0. Het scheidingsprincipe van de SP2560 kolom is niet enkel meer gebaseerd op het kookpunt. Door specifieke interacties van de vetzuren met de stationaire fase op de kolom leent deze kolom zich goed om de verschillende cis en trans isomeren van elkaar te scheiden. In tegenstelling tot de SLB-5ms kolom, komen de verzadigde vetzuren nu eerst en dan pas de onverzadigde vetzuren, opnieuw met hetzelfde aantal C-atomen. Figuur 5.2 geeft de volgorde van dezelfde vetzuren die zopas voor de SLB-5ms kolom besproken werden. Uit Figuur 5.2 blijkt dat de retentietijd van de vetzuren nog steeds oploopt volgens stijgende ketenlengte. Echter, de volgorde op basis van de dubbele bindingen is nu omgekeerd. De componenten met het grootste aantal dubbele bindingen hebben bij de SP2560 kolom de grootste retentietijd. Zo is in het geval van de C18 vetzuren de volgorde nu als volgt: eerst C18:0, daarna cis9C18:1 en als laatste C18:2n-6.


cis9C18:1

C16:0

C18:2n-6

C18:0

C13:0 cis9C16:1

C20:4n-6 C14:0

Figuur 5.1 : Chromatogram van een hartstaal (staal 21) via de SLB-5ms kolom.

C16:0

cis9C18:1 C18:2n-6

C13:0 cis9C16:1

C18:0 C20:4n-6

C14:0

Figuur 5.2 : Chromatogram van een hartstaal (staal 21) via de SP2560 kolom.


Bij de SOLGEL WAX kolom wordt een gelijkaardige volgorde van retentietijd gezien als bij de SP2560 kolom (Figuur 5.3). Ook hier loopt de retentietijd van de vetzuren op naarmate het aantal C-atomen stijgt en binnen vetzuren met hetzelfde aantal C-atomen hebben de verzadigde vormen de kleinste retentietijd en de vetzuren met het grootste aantal dubbele bindingen de grootste retentietijd. In het geval van C18 verbindingen is de volgorde van retentie als volgt: eerst C18:0, daarna cis9C18:1 en als laatste C18:2n-6.

cis9C18:1

C16:0

C18:2n-6

C13:0

cis9C16:1

C18:0 C20:4n-6

C14:0

Figuur 5.3 : Chromatogram van een hartstaal (staal 21) via de SOLGEL WAX kolom.


5.1.2. Identificatie

5.1.2.1.

Identificatie op basis van de retentietijd

Figuur 5.4 zet de retentietijden van verschillende groepen vetzuren uit. In de x-as worden de retentietijden op de SLB-5ms kolom van de individuele vetzuren van elke groep uitgezet, in de y-as de retentietijden van dezelfde vetzuren, maar dan op de SP2560 kolom. Enerzijds valt het op dat de verschillende groepen van vetzuren (even keten vetzuren, mono-onverzadigde vetzuren,…) allemaal op een bepaalde lijn liggen. Zo stellen de blauwe ruitvormen de verschillende even onvertakte keten vetzuren voor: C10:0 – C12:0 – C14:0 … Anderzijds is de verschillende volgorde van retentie op beide kolommen zichtbaar. In het geval van de SLB-5ms kolom liggen de vetzuren met 4 dubbele bindingen steeds voor de vetzuren met een zelfde aantal C-atomen, maar met een lager aantal dubbele bindingen. In deze grafiek betekent dit voor de SLB-5ms kolom dat de vetzuren met 4 onverzadigdheden het meest links liggen. In het geval van de SP2560 kolom is de volgorde omgekeerd en hebben de vetzuren die het meest onverzadigdheden bevatten de grootste retentietijd en liggen dus het hoogst op de curve. Als we naar het voorbeeld van de C20 verbindingen kijken, klopt dit. In het geval van de SLB-5ms kolom liggen respectievelijk van links naar rechts op de as: C20:4, C20:3, C20:1 en C20:0. Als we op de SP2560 kolom kijken, vinden we van onder naar boven: C20:0, C20:1, C20:3 en C20:4. Wanneer er verbindingslijnen worden getrokken tussen de verschillende componenten die op eenzelfde lijn liggen, kunnen er voorspellingen gedaan worden over het aantal C-atomen en het aantal dubbele bindingen van een component. Dit kan eveneens een hulpmiddel zijn in de identificatie van vetzuren. Op dezelfde manier als in Figuur 5.4 kunnen de retentietijden van dezelfde groepen vetzuren vergeleken worden tussen de SLB-5ms kolom en de WAX kolom. Aangezien de volgorde van retentie vergelijkbaar is tussen de SP2560 kolom en de WAX kolom (cf. Figuur 5.2 en Figuur 5.3) kan een zelfde patroon als in Figuur 5.4 verwacht worden.


Vergelijking van de retentietijden tussen de SLB-5ms kolom en de SP2560 kolom

Retentietijden SP2560 kolom (min)

35

C20:4

30

even keten VZ oneven keten VZ

25

C20:3

VZ met 1 //

20

VZ met 2//

C20:0

15

VZ met 3//

C20:1 1

10 5

VZ met 4// VZ met 5// VZ met 6//

0 0

20

40

60

80

100

Retentietijden SLB-5ms kolom (min)

Figuur 5.4: Retentietijden van verschillende groepen vetzuren (VZ) uitgezet voor 2 types kolommen (SLB-5ms kolom en SP2560 kolom). Bij de SLB-5ms kolom hebben - voor een zelfde aantal C-atomen - de vetzuren met het grootste aantal dubbele bindingen (//) de kleinste retentietijd gevolgd door de vetzuren met een kleiner aantal dubbele bindingen. De verzadigde vorm is de laatste. Voor vetzuren met 20 C-atomen is de retentievolgorde op de SLB-5ms kolom: C20:4, C20:3, C20:1 en C20:0. Bij de SP2560 kolom is deze volgorde net omgekeerd.

5.1.2.2.

Massaspectroscopie als belangrijkste identificatiemiddel

Retentietijden alleen geven niet altijd een ondubbelzinnige identificatie van de vetzuurcomponenten omdat er soms andere componenten eenzelfde retentietijd hebben. Indien je dan enkel afgaat op de retentietijden, trek je de verkeerde conclusies. Massaspectroscopie kan hierbij een ideaal hulpmiddel zijn. Daarom dienen de gevonden componenten op de SP2560 of SOLGEL WAX kolom steeds bevestigd te worden door de massaspectrometer. Zoals reeds aangehaald in 3.4.2.2. gebeurt de interpretatie van de massaspectra op 2 manieren. Enerzijds wordt er gekeken naar typische fragmentionen, anderzijds wordt er vergeleken met referentiespectra die online kunnen geraadpleegd worden. Typische fragmentionen Ons onderzoek richt zich specifiek naar vertakte keten vetzuren in de verschillende onderzochte stalen. Naast de VKVZ zijn er natuurlijk ook andere vetzuren aanwezig zoals


even en oneven keten vetzuren, mono-onverzadigde vetzuren en meervoudig onverzadigde vetzuren. Elk van deze categorieën hebben typische massaspectra. Figuur 5.5 en Figuur 5.6 tonen de massaspectra van het methylester van respectievelijk isoC15:0 en isoC17:0 die in onze hartstalen werden teruggevonden. In Figuur 5.5 doet de piek bij m/z = 256.23 amu4 vermoeden dat het om het methylester van een vetzuur met 15 C-atomen gaat. In combinatie met de basispiek bij m/z = 74.08 betekent dit een verzadigd vetzuur met 15 C-atomen. Wanneer er ingezoomd wordt, is er een klein piekje bij m/z = MG – 15 = 241 (piek bij m/z = 241.18) te zien hetgeen karakteristiek is voor isoC15:0. In Figuur 5.6 doet de piek bij m/z = 284.24 vermoeden dat het om het methylester van een vetzuur met 17 C-atomen gaat. In combinatie met de basispiek bij m/z = 74.09 betekent dit een verzadigd vetuur met 17 C-atomen. Wanneer er ingezoomd wordt, is er een klein piekje bij m/z = MG – 15 = 269 (piek bij m/z = 269.22) te zien hetgeen karakteristiek is voor isoC17:0. De typische fragmentionen van de vertakte keten vetzuren zijn terug te vinden op http://lipidlibrary.aocs.org/ms/ms03a/index.htm (15-04-2011). Massaspectroscopie biedt het grote voordeel om een bevestiging te kunnen geven van de component op basis van het massaspectrum. In het geval van een FID detector ben je enkel aangewezen op de retentietijd en zou de onderzoeker zich in de eerste plaats al moeten afvragen of een verhoging van de basislijn moet beschouwd worden als ruis of als een piek van een component. MS kan hierover uitsluitsel geven.

4

amu: atomic mass unit. Bij de andere m/z waarden wordt er geen gebruik meer gemaakt van deze eenheid, maar wordt er gewoon gesproken over een m/z waarde.


Figuur 5.5: Massaspectrum van het methylester van isoC15:0 in een hartstaal. Het moleculair gewicht bij m/z = 256.23 en de basispiek bij m/z = 74.08 wijzen erop dat het om het methylester van een verzadigd vetzuur met 15 C-atomen gaat. Indien er verder ingezoomd wordt, vindt men een piekje terug bij m/z = MG – 15 = 256 – 15 = 241 (piek bij 241.18) hetgeen karakteristiek is voor isoC15:0.

Figuur 5.6: Massaspectrum van het methylester van isoC17:0 in een hartstaal. Het moleculair gewicht bij m/z = 284.24 en de basispiek bij m/z = 74.09 wijzen erop dat het om het methylester van een verzadigd vetzuur met 17 C-atomen gaat. Indien er verder ingezoomd wordt, vindt men een piekje terug bij m/z = MG – 15 = 284 – 15 = 269 (piek bij 269.22) hetgeen karakteristiek is voor isoC17:0.


Massaspectroscopie kan natuurlijk ook helpen bij de identificatie van gewone verzadigde en onverzadigde vetzuren zonder methylgroepen. Zij hebben andere typische fragmentionen. Bij wijze van voorbeeld wordt het massaspectrum van het methylester van C18:1 in de hersenen (Figuur 5.7) en C20:4n-6 in de milt (Figuur 5.8) weergegeven. Bij het bekijken van Figuur 5.7 wordt in het geval van het methylester van een vetzuur met 18 C-atomen een MG van 298 verwacht. Echter, wanneer er een dubbele binding aanwezig is, worden 2 H-atomen afgesplitst en wordt het moleculair gewicht 298-2 = 296. Dit wordt bevestigd door de piek bij m/z = 296.29. Bij de aanwezigheid van 1 dubbele binding wordt de piek bij m/z = 55.01 de basispiek in plaats van m/z = 74 bij de verzadigde vormen. Men dient hierbij op te merken dat het op basis van dit massaspectrum niet mogelijk is om de configuratie of de positie van de dubbele binding te achterhalen. Om deze positie te achterhalen, moeten andere derivaten worden gemaakt zoals dimethyldisulfide verbindingen of derivaten met dimethyloxazoline. Deze derivaten zijn in staat de dubbele binding te fixeren indien er fragmentatie optreedt.

Figuur 5.7: Massaspectrum van het methylester van C18:1. Het moleculair gewicht wordt teruggevonden bij m/z = 296.29. De basispiek is m/z = 55.01.


In het geval van het methylester van C20:4(n-6) (Figuur 5.8) daalt het moleculair gewicht van m/z = 326 voor het methylester van C20:0 naar m/z = 326 – (4x2) = 318. De piek bij m/z = 318.26 bevestigt dit. Aangezien het om een verbinding met 4 dubbele bindingen gaat, is m/z = 79.10 de basispiek. Dat het hier om de n-6 vorm gaat, kan afgeleid worden uit de aanwezigheid van de piek bij m/z = 150.16. In het geval van n-3 vetzuren, wordt er een piek gezien bij m/z = 108.

Figuur 5.8: Massaspectrum van het methylester van C20:4(n-6). Het moleculair gewicht wordt teruggevonden bij m/z = 318.26. Door de aanwezigheid van 4 dubbele bindingen is m/z = 79.10 de basispiek. De aanwezigheid van de piek bij m/z = 150.16 toont aan dat het om de n-6 vorm gaat.

Vergelijking met referentiespectra Het is duidelijk uit bovenstaande regeltjes dat het vaak slechts subtiele verschillen zijn die de onvertakte keten vetzuren en de iso en anteiso vormen van elkaar onderscheiden. Vergelijking van het totale spectrum met online referentiespectra kan een goed totaalbeeld geven in plaats van enkel naar de fragmentionen te kijken.


5.2.

VETZUURPROFIELEN

5.2.1. Algemene bespreking

5.2.1.1.

Hersenen

Het vetzuurprofiel van de hersenen zoals weergegeven in Tabel 4.1 wordt gedomineerd door de vetzuren: C16:0, C18:0 en cis9C18:1 (oliezuur).

Bij de hersenen valt het grote aandeel van C22:6n-3 op, beter gekend als docosahexaeenzuur (DHA). Het is een ω3 vetzuur dat heel belangrijk is in de ontwikkeling van de hersenen van de biggen (Leskanich & Noble, 1999). DHA komt in vergelijking met het hart en de milt meer voor in de hersenen. Voor de biggen van 1 week oud bedragen de hoeveelheden DHA in de hersenen, het hart en de milt respectievelijk 7.75%5, 0.76% en 0.65%. Voor de biggen van 4 weken oud worden dit respectievelijk 7.44%, 0.49% en 0.45%. Uit deze resultaten blijkt de dominantie van DHA in de hersenen ten opzichte van de andere 2 organen. Daarnaast valt het hoge gehalte arachidonzuur (C20:4n-6) op wanneer vergeleken wordt met het hart en de milt. In de hersenen bedraagt arachidonzuur 9.36% in de biggen van 1 week oud en 8.58% in die van 4 weken oud.

Zoals blijkt uit Tabel 4.1 worden er geen mmVKVZ gevonden in de hersenen van biggen, niet in die van 1 week oud en niet in die van 4 weken oud.

5.2.1.2.

Hart

De meest dominante vetzuren in het vetzuurprofiel van het hart zijn cis9C18:1 (oliezuur), C16:0 en C18:2n-6 (linolzuur) (Tabel 4.2).

In vergelijking met de hersenen en de milt is er een grote aanwezigheid van linolzuur (C18:2n-6). In de biggen van 1 week oud bedraagt linolzuur 18.16%, in die van 4 weken oud 16.86%. Linolzuur fungeert als precursor voor de n-6 vetzuren. 5

Procentueel aandeel als % (w/w)


In tegenstelling tot de hersenen, worden er in het hart wel mmVKVZ teruggevonden. Enerzijds wordt er isoC15:0 gevonden. In de biggen van 1 week oud bedraagt de hoeveelheid 0.03%, in die van 4 weken oud bedraagt isoC15:0 eveneens 0.03%. Anderzijds is er ook isoC17:0 aanwezig. Voor de biggen van 1 week en 4 weken oud bedraagt de hoeveelheid isoC17:0 0.02%.

5.2.1.3.

Milt

Bij de milt zijn C16:0, cis9C18:1 (oliezuur) en C18:0 de hoofdcomponenten van het vetzuurprofiel (Tabel 4.3). C16:0 is met een waarde die bij de biggen van 4 weken oud oploopt tot bijna 1/3 van het totale vetzuurprofiel (29.24%) sterk vertegenwoordigd in de milt. Net als bij het hart worden in de milt isoC15:0 en isoC17:0 teruggevonden. In de biggen van 1 week oud bedragen isoC15:0 en isoC17:0 respectievelijk 0.03% en 0.04%. In het geval van de biggen van 4 weken oud blijven de waarden dezelfde voor isoC15:0 en isoC17:0.

5.2.1.4.

Plasma en colostrum

Bij de stalen van het plasma en het colostrum zijn geen vetzuurprofielen opgegeven. Deze stalen zijn namelijk afkomstig van het doctoraat van Sofie Tanghe. In dit onderzoek wordt de invloed bekeken van het soort voeder van de zeug op de onverzadigde vetzuren. Bij het bekijken van de chromatogrammen blijkt dat er wel degelijk effect is op de hoeveelheden van deze vetzuren. De hoeveelheden die voor de vetzuren worden teruggevonden wijken sterk van elkaar af, afhankelijk van het voeder dat de zeug heeft gekregen. In deze stalen werd er specifiek op zoek gegaan naar vertakte keten vetzuren. In het plasma, noch in het colostrum zijn vertakte keten vetzuren aanwezig, ongeacht het dieet van de zeug.

5.2.2. Vergelijking van de vertakte keten vetzuren tussen week 1 en week 4

Aangezien in het geval van het hart en de milt de stalen afkomstig zijn van 2 leeftijdsgroepen (week 1 en week 4) bekijken we of er al dan niet een leeftijdseffect is op de aanwezige mmVKVZ. De vergelijking tussen week 1 en week 4 in het hart wordt


weergegeven in Figuur 5.9, de vergelijking in de milt wordt weergegeven in Figuur 5.10. Hieruit blijkt dat zowel bij het hart als bij de milt de hoeveelheden van isoC15:0 en isoC17:0 dezelfde zijn in week 1 en week 4. Ze verschillen enkel in de standaarddeviatie.

Vergelijking van isoC15:0 en isoC17:0 tussen week 1 en week 4 in het hart IsoC17:0 wk 4 IsoC17:0 wk 1 Gemiddelde Stdev

IsoC15:0 wk 4 IsoC15:0 wk 1 0

0.01 0.02 0.03 Procentueel aandeel (% w/w)

Figuur 5.9: Vergelijking van isoC15:0 en isoC17:0 tussen week 1 en week 4 in het hart.

Vergelijking van isoC15:0 en isoC17:0 tussen week 1 en week 4 in de milt IsoC17:0 wk 4 IsoC17:0 wk 1 Gemiddelde Stdev

IsoC15:0 wk 4 IsoC15:0 wk 1 0

0.01 0.02 0.03 0.04 Procentueel aandeel (% w/w)

Figuur 5.10: Vergelijking van isoC15:0 en isoC17:0 tussen week 1 en week 4 in de milt.

Deze resultaten doen vermoeden dat er geen leeftijdseffect is op de mmVKVZ, toch niet voor wat betreft week 1 en week 4 in de door ons geanalyseerde organen.


5.2.3. Interpretatie van de aanwezige vertakte keten vetzuren Uit de vetzuurprofielen van Tabel 4.2 en Tabel 4.3 blijkt dat er in het hart en de milt isoC15:0 en isoC17:0 aanwezig is. De hoeveelheden isoC15:0 en isoC17:0 in het hart bedragen respectievelijk 0.03% en 0.02%. In de milt bedragen isoC15:0 en isoC17:0 respectievelijk 0.03% en 0.04%. In de hersenen komen er geen vertakte keten vetzuren voor. Wanneer we de gevonden hoeveelheden vergelijken met de hoeveelheden die terug te vinden zijn in de literatuur (cf. 1. Inleiding) liggen die lager. Bettger et al. (1998) vonden in het hart en de milt respectievelijk 1.6% en 1.2% isoC24:0 terug. Volgens Jones & Rivett (1997) maakt anteisoC21:0 31.7% uit van het vetzuurprofiel in haar. In de vernix caseosa zit tot 29.1% vertakte keten vetzuren (Ran-Ressler et al., 2008). Met hoeveelheden die in de geanalyseerde organen hersenen, hart en milt een maximum hebben van 0.04% (isoC17:0 in de milt) is het de vraag of ze in deze organen een cruciale rol vervullen. Omdat het niet zeker is of wij met de hersenen, het hart en de milt de juiste organen bekeken hebben, is het niet uitgesloten dat de mmVKVZ in andere organen aanwezig zijn. Verder onderzoek in andere organen en weefsels kan hier een antwoord op bieden. Echter, door het onderzoeken van het plasma en het colostrum van zeugen hebben we ook een zicht op de vetzuren die aangevoerd worden naar de foetus of de pasgeboren big. In het plasma van de zeugen worden geen vertakte keten vetzuren gevonden. Hierdoor lijken deze vetzuren geen rol te spelen in de embryonale ontwikkeling van biggen. Onderzoek van de placenta kan hier eventueel verdere bevestiging over geven. Het onderzoek van het colostrum toont eveneens geen vertakte keten vetzuren aan. Door de geringe aanwezigheid van de vertakte keten vetzuren in 2 van de 3 organen en de afwezigheid ervan in het colostrum lijkt er geen rol voor de vertakte keten vetzuren weggelegd in de postnatale ontwikkeling van biggen. Het is natuurlijk niet uitgesloten dat de big zelf al de vertakte keten vetzuren de novo kan synthetiseren. In dat geval komen we terug tot bovenstaande suggestie ook andere organen te onderzoeken. In het kader van de literatuurstudie lijken ogen (retina), huid, geslachtsorganen, placenta … het meest interessant.

C O N C L U S I E S | 49

6. CONCLUSIES De doelstelling van dit onderzoek was op zoek te gaan naar vertakte keten vetzuren in verschillende stalen van biggen en zeugen en hun eventuele rol in de embryonale en postnatale ontwikkeling na te gaan. Voor het onderzoek naar de embryonale ontwikkeling werd het plasma van zeugen onderzocht. De rol bij de postnatale ontwikkeling werd bestudeerd via analyse van de hersenen, het hart en de milt van biggen samen met het colostrum van zeugen. Bij de 3 organen waren er stalen afkomstig van biggen van 1 week oud en stalen van biggen die 4 weken oud waren. Enkel in het hart en de milt werden vertakte keten vetzuren teruggevonden. In het hart vonden we isoC15:0 en isoC17:0 in hoeveelheden van respectievelijk 0.03% en 0.02%. In het geval van de milt werd er eveneens isoC15:0 en isoC17:0 teruggevonden, nu in hoeveelheden van respectievelijk 0.03% en 0.04%. De hoeveelheden waren dezelfde voor de biggen van week 1 en week 4. De leeftijd lijkt dus geen rol te spelen op de vertakte keten vetzuren voor wat betreft biggen van 1 week oud en 4 weken oud. In de hersenen, het colostrum en het plasma werden geen vertakte keten vetzuren teruggevonden. Wanneer we de gehaltes aan vertakte keten vetzuren vergelijken met de gehaltes die teruggevonden worden in de literatuur is dit heel wat minder. Gezien het beperkte voorkomen van de vertakte keten vetzuren in de 3 organen en hun afwezigheid in het colostrum, lijken deze vetzuren geen rol te spelen in de postnatale ontwikkeling van biggen. Gezien hun afwezigheid in het plasma van de zeug lijkt ook een rol in de embryonale ontwikkeling van biggen niet onmiddellijk weggelegd voor de vertakte keten vetzuren. Dit neemt niet weg dat ze in andere organen geen rol kunnen spelen. Hiervoor kan verder onderzoek gedaan worden. Zo kan de placenta onderzocht worden in het kader van de embryonale ontwikkeling. In het geval van de postnatale ontwikkeling lijken ogen (retina), huid en geslachtsorganen het meest interessant wanneer we de literatuur erop naslaan.

L I T E R A T U U R L I J S T | 50

7. LITERATUURLIJST -

Annous, B.A.; Becker, L.A.; Bayles, D.O.; Labeda, D.P.; Wilkinson, B.J. (1997). Critical Role of Anteiso C15:0 Fatty Acid in the Growth of Listeria monocytogenes at Low Temperatures. American Society for Microbiology, 63, 3887-3894.

-

Bettger, W.J.; Blackadar, C.B.; McCorquodale, M.L.; Ewing, R. (1998). The Occurrence of Iso 24:0 (22-Methyltricosanoic Acid) Fatty Acid in Sphingomyelin of Rat Tissues. Comp. Biochem. Phys. B., 119, 299-304.

-

Carroll, K.K. (1992). Dietary-Fat and Breast-Cancer. Lipids, 27, 793-797.

-

Christie, W.W. (1989). Gas Chromatography and Lipids A Practical Guide. The Oily Press, Scotland.

-

Driver, P.J.; Lemp, M.A. (1996). Meibomian Gland Dysfunction. Survey of Ophthalmology, 40, 343-367.

-

Duggan, Z.P.Z.; Koopman, H.N. Budge, S.M. (2009). Distribution and development of the highly specialized lipids in the sound reception systems of dolphins. J. Comp. Physiol. B., 179, 783-798.

-

http://advancecientific.com/Supp_Details2.asp?CATEGORY_C=IKA%20Yellowline*%20A10%20Analy tical%20Grinder (04-03-2011)

-

http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/whatlip/index.htm#fatty (14-03-2011)

-

http://lipidlibrary.aocs.org/ms/arch_me/index.htm (15-04-2011)

-

http://lipidlibrary.aocs.org/ms/masspec.html (15-04-2011)

-

http://lipidlibrary.aocs.org/ms/ms03a/index.htm (15-04-2011)

-

http://www.chem.agilent.com/en-US/Products/columns-supplies/gc-gcmscolumns/cp-sil88/pages/default.aspx (18-04-2011)

-

http://www.chem.arizona.edu/massspec/intro_html/intro.html(04-04-2011)

-

http://www.chem.unl.edu/uic/gc-fid.shtml (18-04-2011)

-

http://www.freezedryinginfo.com/Process.html (03-03-2011)

-

http://www.matreya.com/ProductInfo.aspx?productid=1605 (26-03-2011)

-

http://www.sge.com/products/columns/gc-columns/forte-solgel-wax (20-04-2011)

-

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/gaschromatography/columns/slb-gc-capillary/products.html (24-04-2011)


-

http://www2.dupont.com/Teflon_Industrial/en_US/products/product_by_name/tefl on_ptfe/index.html (07-03-2011)

-

Idel, S.; Ellinghaus, P.; Wolfrum, C.; Nofer, J.R.; Gloerich, J.; Assmann, G.; Spener, F.; Seedorf, U. (2002). Branched Chain Fatty Acids Induce Nitric Oxide-dependent Apoptosis in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Biol. Chem., 277, 49319-49325.

-

Joffre, C.; Souchier, M.; Grégoire, S.; Viau S.; Bretillon, L.; Acar, N.; Bron, A.M.; Creuzot-Garcher, C. (2008). Differences in meibomian fatty acid composition in patients with meibomian gland dysfunction and aqueous-deficient dry eye. Brit. J. Ophthalmol., 92, 116-119.

-

Joffre, C.; Souchier, M.; Leclere, L.; Buteau, B.; Grégoire, S.; Lizard, G.; Montange, T.; Acar, N.; Bron, A.; Creuzot-Garcher, C.; Diebold, Y.; Bretillon, L. (2009). Branchedchain fatty acids, increased in tears of blepharitis patients, are not toxic for conjunctival cells. Brit. J. Ophthalmol., 93, 1391-1395.

-

Jones, L.N.; Rivett, D.E. (1997). The Role of 18-Methyleicosanoic Acid in the Structure and Formation of Mammalian Hair Fibres. Micron, 28, 469-485.

-

Kaneda, T. (1963). Biosynthesis of Branched Chain Fatty Acids, isolation and identification of fatty acids from Bacillus subtilis. J. Biol. Chem., 238, 1222-1228.

-

Kaneda, T. (1991). Iso and Anteiso-Fatty Acids in bacteria: Biosynthesis, Function and Taxonomic Significance. American Society for Microbiology, 55, 288-302.

-

Keeney, M.; Katz, I.; Allison, M.J. (1962). On the probable origin of some milk fat acids in rumen microbial lipids. J. Am. Oil. Chem. Soc., 39, 198-201.

-

Kniazeva, M.; Crawford, Q.T.; Seiber, M.; Wang C.Y.; Han, M. (2004). Monomethyl Branched Chain Fatty Acids Play an Essential Role in Caenorhabditis elegans Development. Plos Biology, 2, 1446-1459.

-

Kniazeva, M.; Euler, T.; Han, M. (2008). A branched chain fatty acid is involved in post-embryonic growth control in parallel to the insulin receptor pathway and its biosynthesis is feedback-regulated in C. elegans. Genes & Development, 22, 21022110.

-

Knothe, G.; Dunn, R.O. (2009). A Comprehensive Evaluation of the Melting Points of Fatty Acids and Esters Determined by Differential Scanning Calorimetry. J. Am. Oil. Chem. Soc., 86, 843-856.


-

Koopman, H.N.; Budge, S.M.; Ketten, D.R.; Iverson, S.J. (2006). Topographical Distribution of Lipids Inside the Mandibular Fat Bodies of Odontocetes: Remarkable Complexity and Consistency. IEEE. J. Oceanic Eng., 31, 95-106.

-

Kuhajda, F.P. (2000). Fatty-Acid Synthase and Human Cancer: New Perspectives on Its Role in Tumor Biology. Nutrition, 16, 202-208.

-

Leskanich, C.O.; Noble, R.C. (1999). The comparative roles of polyunsaturated fatty acids in pig neonatal development. British Journal of Nutrition, 81, 87-106.

-

López-Bote, C.; Rey, A.; Isabel, B.; Sanz, R. (1996). Dietary Fat reduces Odd-Numbered and Branched-Chain Fatty Acids in Depot Lipids of Rabbits. J. Sci. Food Agr., 73, 517524.

-

Oku, H.; Mimura, K.; Tokitsu, Y., Onaga, K.; Iwasaki, H.; Chinen, I. (2000). Biased Distribution of the Branched-Chain Fatty Acids in Ceramides of Vernix Caseosa. Lipids, 35, 373-381.

-

Oku, H.; Oohama, E.; Yagi, N.; Urahashi, A.; Nagata, J.; Shinjyo, C.; Chinen, I. (1992). Age-Related Changes of the Branched-Chain Fatty Acid Concentration in Rat Skin Surface Lipid. Biochem. Phys. B., 102, 357-362.

-

Oku, H.; Shudo, J.; Mimura, K.; Haratake, A.; Nagata, J.; Chinen, I. (1996). Age-Related Changes in Branched-Chain Fatty Acid Concentration of the Skin Surface Lipid from Hairless Mouse. Comp. Biochem. Phys. B., 114, 103-106.

-

Parodi, P.W. (2008). Milk lipids: their role as potential anti-cancer agents. Sci. Aliment., 28, 44-52.

-

Ran-Ressler, R.R.; Devapatla, S.; Lawrence, P.; Brenna, J.T. (2008). Branched Chain Fatty Acids Are Constituents of the Normal Healthy Newborn Gastrointestinal Tract. Pediatr. Res., 64, 605-609.

-

Reddy, B.S. (1992). Dietary-Fat and Colon Cancer, Animal Model Studies. Lipids, 27, 807-813.

-

Risch, H.A.; Jain, M.; Marrett, L.D.; Howe, G.R. (1994). Dietary-Fat Intake and Risk of Epithelial Ovarian-Cancer. J. Natl. Cancer I., 86, 1409-1415.

-

Seyama, Y.; Otsuka, H.; Ohashi, K.; Vivien-Roels, B.; Pevet, P. (1996). Sexual Diversity of the Lipid Metabolism in the Harderian Gland of the Golden Hamster. Microsc. Res. Techniq., 34, 71-76.


-

Seyama, Y.; Uchijima, Y. (2007). Novel function of lipids as a pheromone from the Haderian gland of golden hamster. P. Jpn. Acad. B-Phys., 83, 77-96.

-

Shirouchi, B.; Nagao, K.; Furuya, K.; Nagai, T.; Ichioka, K.; Tokairin, S.; Lida, Y.; Yanagita, T. (2010). Physiological Functions of iso-type Short-Chain Fatty Acid and Omega 3 Polyunsaturated Fatty Acids Containing Oil in Obese OLETF Rats. J. Oleo Sci., 59, 299-305.

-

Smith, J.R.; Swift, J.A. (2005). Maple syrup urine disease hair reveals the importance of 18-methyleicosanoic acid in cuticular delamination. Micron, 36, 261-266.

-

Souchier, M.; Joffre, C.; Grégoire, S.; Bretillon, L.; Muselier, A.; Acar, N.; Beynat, J.; Bron, A.; D’Athis, P.; Creuzot-Garcher, C. (2008). Changes in meibomian fatty acids and clinical signs in patients with meibomian gland dysfunction after minocycline treatment. Brit. J. Ophthalmol., 92, 819-822.

-

Thermo Electron Corporation (2006). DSQ II Hardware Manual. Editor Technical Publications Thermo Electron Corporation, Austin, USA.

-

Vlaeminck, B.; Fievez, V.; Cabrita A.R.J.; Fonseca A.J.M.; Dewhurst R.J. (2006a). Factors affecting odd- and branched-chain fatty acids in milk: A review. Anim. Feed Sci. Tech., 131, 389-417.

-

Vlaeminck, B.; Fievez, V.; Tamminga, S.; Dewhurst, R.J.; van Vuuren A.; De Brabander D.; Demeyer D. (2006b). Milk Odd- and Branched-Chain Fatty Acids in Relation to the Rumen Fermentation Pattern. J. Dairy. Sci., 89, 3954-3964.

-

Wongtangtintharn, S.; Oku, H.; Iwasaki, H.; Toda, T. (2004). Effect of branched-chain fatty acids on fatty acid biosynthesis of human breast cancer cells. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 50, 137-143.

-

Yang, Z.; Liu, S.; Chen, X.; Chen, H.; Huang, M.; Zhen, J. (2000). Induction of Apoptotic Cell Death and in Vivo Growth Inhibition of Human Cancer Cells by a Saturated Branched-Chain Fatty Acid, 13-Methyltetradecanoic Acid. Cancer Res., 60, 505-509.

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN LABORATORY FOR ANIMAL NUTRITION AND ANIMAL PRODUCT QUALITY

Recommend Documents