UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN. Vergelijking van methoden voor de activiteitsbepaling van asparaginase

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Drug Quality and Registration (DruQuaR) Group Academiejaar 2010 - 2011

Vergelijking van methoden voor de activiteitsbepaling van asparaginase

Jochem VANCOILLIE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer

Commissarissen Prof. Dr. D. Deforce Prof. Dr. apr. H. Robays

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Drug Quality and Registration (DruQuaR) Group Academiejaar 2010 - 2011

Vergelijking van methoden voor de activiteitsbepaling van asparaginase

Jochem VANCOILLIE Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer

Commissarissen Prof. Dr. D. Deforce Prof. Dr. apr. H. Robays

AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

DATUM

Promotor

Auteur

Prof. B. De Spiegeleer

Jochem Vancoillie

DANKWOORD Graag had ik een pagina de tijd genomen om een aantal mensen te bedanken zonder wiens hulp deze thesis nooit tot stand had kunnen komen. Vooreerst wil ik mijn promotor en tevens persoonlijke begeleider, professor Bart De Spiegeleer, bedanken. Niet enkel voor de opportuniteit om aan dit onderzoek deel te nemen, maar ook voor de tijd die hij voor mij vrijmaakte in zijn drukke dagen om mij te begeleiden, mijn kritische geest aan te scherpen en mij talloze nieuwe inzichten te verschaffen. Het vertrouwen, de zelfstandigheid en de verantwoordelijkheid die mij werden toevertrouwd, zullen niet enkel waardevol gebleken zijn voor deze thesis, maar ook voor de verdere stappen in mijn carrière. Daarnaast wil ik ook het voltallige personeel van DruQuaR bedanken, die altijd klaar stonden om naar mijn vragen te luisteren, zijnde praktisch of theoretisch, en deze naar het beste van hun vermogen te beantwoorden. Deze mensen waren echter meer dan een vraagbaken, ze maakten de tijd in het labo aangenaam. De sporadische babbels waren een aangename afwisseling. Verder wil ik ook mijn medestudenten en vrienden in de kijker zetten, daar zonder vriendschap en steun van hen deze afgelopen 4 jaar minder gemakkelijk zouden verlopen zijn. Ook mijn vriendin mag hierin niet ontbreken, zij heeft namelijk een groot deel van mijn frustraties tijdens deze 12 weken getemperd en altijd het volste vertrouwen in mij getoond. Maar mijn grootste dank gaat uit naar mijn ouders die zich gedurende 22 jaar lang reeds belangeloos hebben ingezet voor mij, zowel gedurende goede als slechte periodes. De kans om deze studies aan te vangen is aan hen te danken, het latere succes dat ik hopelijk zal genieten zal een resultaat zijn van hun harde werk, hun opvoeding en steun.

INHOUDSOPGAVE

1.

INTRODUCTIE ............................................................................................................. 1 1.1. LEUKEMIE..................................................................................................................... 1 1.1.1. Algemeen ..................................................................................................... 1 1.1.2. Acute Lymfoblastische Leukemie .................................................................. 1 1.2. ASPARAGINASE ............................................................................................................ 2 1.2.1. Algemeen ..................................................................................................... 2 1.2.2. Karakterisatie ............................................................................................... 4 1.2.2.1. Enzymactiviteit ................................................................................................. 4 1.2.2.2. Structuuranalyse ............................................................................................... 9 1.2.2.3. Zuiverheidsanalyse ......................................................................................... 12 1.2.3. Actief Centrum ........................................................................................... 12 1.2.4. Soorten asparaginase ................................................................................. 16 1.2.5. Stabiliteit ................................................................................................... 16

2.

OBJECTIEF ................................................................................................................ 18

3.

MATERIAAL EN METHODEN ..................................................................................... 19 3.1. TOESTELLEN EN REAGENTIA ...................................................................................... 19 3.1.1. UV/Vis spectrofotometer ........................................................................... 19 3.1.2. Centrifuge .................................................................................................. 19 3.1.3. Thermomixer ............................................................................................. 19 3.1.4. pH meter .................................................................................................... 19 3.1.5. Waterstation .............................................................................................. 19 3.1.6. Balansen .................................................................................................... 20 3.1.7. Producten .................................................................................................. 20 3.2. METHODEN ................................................................................................................ 21 3.2.1. Nessler ....................................................................................................... 22 3.2.2. Berthelot .................................................................................................... 24 3.2.3. Indooxine ................................................................................................... 25 3.2.4. Glutamaat dehydrogenase ......................................................................... 26 3.2.5. Aspartaat Transaminase ............................................................................. 28 3.2.6. Methodenevaluatie .................................................................................... 30

4.

RESULTATEN ............................................................................................................ 31 4.1.

NESSLER ..................................................................................................................... 31

4.2.

BERTHELOT ................................................................................................................ 32

4.3.

INDOOXINE ................................................................................................................ 33

4.4.

GLUTAMAAT DEHYDROGENASE ................................................................................ 34

4.5.

ASPARTAAT TRANSAMINASE ..................................................................................... 35

4.6. GESIMULEERDE ASPARAGINASE METHODENEVALUATIE ......................................... 36 4.6.1. Situering..................................................................................................... 36 4.6.2. Nessler ....................................................................................................... 37 4.6.3. Berthelot .................................................................................................... 39 4.6.4. Indooxine ................................................................................................... 40 4.6.5. Glutamaat Dehydrogenase ......................................................................... 42 4.6.6. Aspartaat Transaminase ............................................................................. 43 5.

DISCUSSIE ................................................................................................................ 45 5.1.

STATISTISCH ............................................................................................................... 45

5.2.

NIET-STATISTISCH ...................................................................................................... 47

6.

ALGEMEEN BESLUIT ................................................................................................. 49

7.

LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 50

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN ADP: Adenosine Difosfaat Ala: Alanine ALL: Acute lymfoblastische anemie ASAT: Aspartaat Transaminase Asn: Asparagine ASNASE: Asparaginase Asp: Asparaginezuur BSA: Bovine Serum Albumine CD: Circulair Dichroïsme DAD: Diode Array Detector DH: Dehydrogenase DRS: Diffuse Reflectieve Spectroscopie DSC: Differential Scanning Calorimetry EFS: Event-Free Survival ELISA: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay ESI: Electrospray Ionisatie GDH: L-glutaminezuurdehydrogenase Glu: Glutaminezuur Gly: Glycine HPLC: High Performance Liquid Chromatography HSD: Honestly Significant Difference Ig: Immunoglobuline Ile: Isoleucine I.m.: intramusculair IU: International Unit, de hoeveelheid enzym dat de omzetting van 1 µmol substraat tot product per minuut onder gedefinieerde condities katalyseert I.v.: intraveneus KGA: Keto-Glutaarzuur LoD: Limit of Detection LoQ: Limit of Quantification

LSD: Least Significant Difference MG: Moleculair Gewicht. MS: Massaspectrometrie/Massaspectrometer NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Ox.: Oxidatie PPM: Parts Per Million Ribo: Ribose RP-HPLC: Reversed-Phase HPLC RSD: Relatieve Standaard Deviatie SDS-PAGE: Sodium Dodecylsulfaat Polyacrylamide Gelelectroforese SEC: Size-Exclusion Chromatografie SPE: Vaste Fase Extractie St. Dev.: Standaard Deviatie Thr: Threonine UV: Ultraviolet licht UV-VIS: Ultraviolet en zichtbaar licht

1. INTRODUCTIE 1.1. LEUKEMIE 1.1.1.

Algemeen Leukemie is een verzamelterm voor verschillende vormen van bloedkanker, meestal

van de witte bloedcellen of leukocyten. Leukemie wordt gekenmerkt door een ontregelde en ongecontroleerde groei van verschillende types van witte bloedcellen in het beenmerg. Vanuit het beenmerg gaan de kankercellen over op het circulerende bloed en zo ook op andere organen, zoals de lymfeklieren, de milt en de lever. Elk orgaan kan worden aangetast, inclusief het centraal zenuwstelsel. (http://www.cancer.org/Cancer/LeukemiainChildren/OverviewGuide/childhood-leukemiaoverview-what-is-childhood-leukemia) De witte bloedcellen maken deel uit van het immuunsysteem en hebben als functie vreemde indringers, zoals bacteriën en virussen, te bestrijden. Bij leukemie is de vorming van deze cellen in het rijpingsproces gestoord. De cellen zijn dus nog niet rijp en bijgevolg niet in staat hun functie uit te oefenen. Het beenmerg is niet meer in staat voldoende normaal functionerende bloedcellen te produceren. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen acute leukemie, dat op korte tijd ontstaat en waarbij de cellen erg onrijp zijn, en chronische leukemie, welke trager verloopt en waarbij de cellen zich verder in het ontwikkelingsproces bevinden. Verder worden ze nog onderverdeeld in lymfatische en myeloïde leukemie, afhankelijk van de cellijn waaruit de cel afkomstig is. (http://www.skion.nl/kbk/leukemieen) 1.1.2.

Acute Lymfoblastische Leukemie Acute lymfoblastische leukemie (ALL) is een vorm van leukemie die gekenmerkt

wordt door een overmaat aan lymfoblasten. Maligne, onrijpe witte bloedcellen worden continu geproduceerd en vermenigvuldigd in het beenmerg. Het gevolg hiervan is dat de gezonde cellen verdreven worden uit het weefsel, maar ook dat het overbevolkte beenmerg lymfoblasten vrij zal stellen in het bloed, met de dood tot gevolg indien onbehandeld. 1

ALL komt het vaakst voor in de kindertijd in de periode van 2 tot 10 jaar. De kans op genezing bij kinderen is ongeveer 80%, bij volwassenen ligt die kans op zo’n 40%. Acuut, zoals reeds vermeld, verwijst naar het relatief korte tijdsverloop van de ziekte, die fataal kan zijn in slechts enkele weken indien men dit onbehandeld laat. Lymfoblastisch slaat op de cellen die betrokken zijn. Hier zijn het lymfocyten, die echter nog onrijp zijn, ze bevinden zich nog in de “blast”-staat. (Randolph, 2004) 1.2. 1.2.1.

ASPARAGINASE Algemeen Asparaginasen zijn natuurlijk voorkomende tetramere enzymen die de hydrolyse

katalyseren van het niet-essentiële aminozuur L-asparagine tot L-asparaginezuur en ammoniak (Figuur 1.1). Dit proces gaat extracellulair door.

Figuur 1.1: Reactiemechanisme van asparaginase gekatalyseerde deaminatie (Verma et al., 2007)

Asparaginasen kunnen voor verscheidene doeleinden worden aangewend. Asparaginasen, afkomstig uit bijvoorbeeld erwten (Tuncel et al., 2010), worden industrieel gebruikt in de voedingsindustrie om de vorming van acrylamide tegen te gaan, een vermoedelijk carcinogeen. Door het omzetten van asparagine tot asparaginezuur kan de Maillard-reactie van asparagine tot acrylamide niet meer doorgaan bij de verwerking van bepaalde types voeding. 2

Asparaginase wordt ook in de medische wereld gebruikt. Deze asparaginasen, afkomstig van bacteriën zoals Escherichia coli en Erwinia chrysanthemi, zijn een belangrijk onderdeel in de behandelingstherapie van ALL. Leukemiecellen zijn namelijk beperkt in de upregulatie van hun asparaginesynthetase en hebben dus nood aan een exogene toevoer van asparagine. Parenteraal toegediende asparaginase zorgt voor een depletie van extracellulair asparagine, en in mindere mate van glutamine, waardoor de proteïnesynthese in de leukemiecel wordt geïnhibeerd. Dit leidt tot selectieve celdood. (Albertsen et al., 2002) Daar asparaginasepreparaten van bacteriële oorsprong zijn, zijn ze immunogeen en geven ze tot in 60% van de gevallen aanleiding tot klinische hypersensitiviteit, waarvan de kans stijgt met het aantal voorafgaande toedieningen. Deze overgevoeligheidsreacties zijn het gevolg van de productie van anti-asparaginase antilichamen, die van het type IgG zijn. Enkele symptomen zijn anafylaxis, pijn, oedeem, urticaria en pruritus. De antilichamen tegen asparaginase leiden niet altijd enkel tot klinische overgevoeligheid, maar veroorzaken ook een snelle inactivatie van het enzym. Dit wordt “silent hypersensitivity” ten gevolge van “silent antibodies” genoemd. Dit komt voor bij ongeveer 30% van de patiënten en kan dus leiden tot resistentie en een gedaalde therapeutische efficaciteit. (Pieters et al., 2010) Een onderverdeling in de bacteriële asparaginasen wordt gemaakt in type I en type II asparaginasen. Type I asparaginasen (Km~ 10-3 M) worden tot expressie gebracht in het cytoplasma en worden gekarakteriseerd door een enzymatische activiteit voor zowel Lasparagine als L-glutamine. Type II asparaginasen (Km~ 10-5 M) daarentegen worden onder anaerobe omstandigheden in de periplasmatische ruimte tot expressie gebracht en hebben een hoge specifieke activiteit ten opzichte van L-asparagine. Het zijn enkel de type II asparaginasen die als chemotherapeutica worden gebruikt bij de behandeling van ALL.

3

1.2.2.

Karakterisatie Met karakterisatie van asparaginase bedoelen we de technieken waarmee we de

volledige “identiteit” ervan kunnen blootleggen. We willen te weten komen hoe snel en efficiënt het enzym werkt en hoe het proteïne is opgebouwd. Onderstaande technieken helpen ons bij deze karakterisatie. 1.2.2.1.

Enzymactiviteit

De enzymactiviteit is de omzetting van substraat (in mol) of de vorming van product (in mol) per tijdseenheid (seconde) door het enzym onder welbepaalde omstandigheden van pH, temperatuur en substraatconcentratie. Om de enzymactiviteit van L-asparaginase te bepalen zijn er verscheidene methoden voor handen. we kunnen deze methoden indelen op basis van het analyt dat kwantitatief bepaald wordt: de daling van het substraat asparagine of de stijging van de producten asparaginezuur of ammoniak. 

Asparaginezuur o Een aminozuuranalyse van asparaginezuur (ook toepasbaar op het substraat asparagine, om depletie te bepalen) kan zelf op verscheidene manieren gebeuren. De meest gebruikte is een RP-HPLC gekoppeld aan een detector. De detector kan een fluorescentiemeter na derivatisatie (met LoQ = 0,1 µM) (Nath et al., 2008), (Boos et al., 1996), UV-detector na derivatisatie (LoQ = 0,01 µM) (Avramis et al., 2007) of ESI-MS (LoQ = 0,35 µM) (Tuncel et al., 2010) zijn. o Een andere techniek om asparaginezuur te gaan kwantificeren is een gekoppelde enzymatische assay. Asparaginezuur, afkomstig van de gekatalyseerde desaminatie van asparagine, reageert met αketoglutaarzuur in de aanwezigheid van aspartaat aminotransferase, waardoor oxaloacetylzuur ontstaat dat op zijn beurt gereduceerd β-NAD+ (=β-NADH) oxideert in aanwezigheid van malaat dehydrogenase(Figuur 1.2). De oxidatie van NADH resultereert in een daling van absorbantie bij

4

340 nm, wat eenvoudig gemeten wordt met een UV-spectrofotometer (LoQ = 4,2 µM). (Vrooman et al., 2010)

Figuur 1.2: Reactiemechanisme bij gekoppelde enzymatische assay o Een aselectieve methode die voorhanden is, is conductometrie. Dit is een methode die gebaseerd is op een stijging van de geleidbaarheid, te wijten aan de productie van ammoniak en asparaginezuur. (Drainas et al., 1985) (Stecher et al., 1999) 

Ammoniak o Nessler-methode. Deze maakt gebruik van het Nessler reagens, wat een mengels is van K2HgI4 en een KOH of NaOH oplossing (Demuthkaya et al., 2006). Het Nessler reagens interageert met ammoniak op volgende manier (Figuur 1.3): (Leonard, 1963)

Figuur 1.3: Reactiemechanisme Nessler De extinctie wordt gemeten met een UV-VIS spectrofotometer bij 485 nm. (Moorthy et al., 2010) (Demuthkaya et al., 2006) De Nessler-methode heeft een werkzaam gebied van 0,5 – 12 µg/ml. o Berthelot-methode. Het gevormde ammonia reageert met hypochloriet waardoor chloramine wordt gevormd. Dat chloramine reageert met Na5

nitroprusside en fenol tot quinone chloramine, dat verder reageert onder alkalische condities om uiteindelijk indofenolblauw te produceren (Figuur 1.4).

Figuur 1.4: Mechanisme van de indofenol-blauwvorming De hoeveelheid indofenol dat geproduceerd wordt is direct proportioneel met de hoeveelheid ammonia dat vrijgesteld werd uit het substraat. De kwantificatie van indofenol gebeurd spectrofotometrisch, waarbij de absorbantie bij 675 nm wordt gemeten. (Moliner-Martinez et al., 2005). Een stijging in blauwe kleur wordt onderscheiden tussen 0 en 20 µg/ml. (Lau et al., 2004) De Berthelot-methode kent ook vele variaties, die vooral een verbeterde serum/plasma-staal behandeling beogen. Een van de recentere variaties voor plasmabepalingen is het gebruik van een SPE (vaste-fase extractie), gekoppeld aan een DRS (diffuse reflectieve spectroscopie). Het detectielimiet bij SPE-DRS is 10 µg/l. (MolinerMartinez et al., 2005) Een andere methode is het gebruik van een nietreversibele solid-phase sensor (sensorstrips). De reactie bij deze wegwerpstrips gaat veel sneller door, namelijk in 3 minuten in plaats van 20 minuten. De range bij deze methode is van 0,5 – 10 µg/ml. (Lau et al., 2004) Nog een andere variant is een micel-gemedieerde extractie. 6

Voordeel bij deze werkwijze is dat ze sneller is. Ook de precisie en accuraatheid ligt hoger. Detectielimiet hier is 1 ng/ml. (Afkhami et al., 2008) Berthelot heeft als voordeel over Nessler dat ze minder gevoelig is aan interferenties. o Verder bestaan er ook enzymatische ammoniakbepalingen. Kits die gebruik maken van het enzym GDH (glutamaat dehydrogenase) laten toe de concentratie van ammoniak te bepalen via een NADPH-afhankelijke reactie (Figuur 1.5). De omzetting van NADPH naar NADP+ wordt kwantitatief gemeten door de daling in absorbantie bij 340 nm. Met deze GDH kits kan men concentraties bepalen in de range van 0,2 – 15 µg/ml. (http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/aa010 0bul.Par.0001.File.tmp/aa0100bul.pdf)

Figuur 1.5: Reactiemechanisme van de Glutamaat Dehydrogenase-kit o Indooxine-methode. De Indooxine-methode is gebaseerd op de reactie van hydroxylamine, afkomstig van het gemodificeerd asparagine AHA (asparaginezuur-β-hydroxamaat), met 8-hydroxyquinoline. (Wehner et al., 1992) De intens groen gekleurde Indooxine-kleurstof die gevormd wordt door de reactie (Figuur 1.6) leent zich uitermate tot een spectroscopische bepaling van de extinctie bij 710 nm. (Lanvers et al., 2002)

7

Figuur 1.6: Reactiemechanisme van de Indooxine-methode 

Eiwitbepalingen o Algemene eiwitbepalingen. Een type proteïne assay dat men reeds toegepast heeft op asparaginase is het Bradford proteïne assay. De absorbantie bij deze colorimetrische assay wordt gemeten bij 595 nm. Als referentie standaard gebruikt men BSA (bovine serum albumine). (Khushoo et al., 2004) Andere colorimetrische proteïneassays die men nog niet heeft toegepast op asparaginase, maar wel mogelijk zijn, zijn de Lowry assay, waarbij met de absorbantie meet bij 750 nm, de modernere variant van de Lowry assay, namelijk de bicinchoninezuur assay waarbij we de extinctie meten bij 562 nm (en waarvoor kits bestaan) en de Biureet test waar we gaan meten bij 540 nm. (Sapan et al., 1999) o Selectieve asparaginase bepalingen. Electrochemiluminescentie immunoassay werd reeds toegepast op asparagine synthethase, maar nog niet op asparaginase. (Lorenzi et al., 2008)

8

o Behalve via deze assays heeft men de concentratie van het enzym ook nog via UV-spectroscopie bepaald, waarbij men de extinctie bij 280 nm gaat meten. Ook een differentiële refractometer werd gebruikt om de concentratie te bepalen, al vereist deze techniek wel een grondige voorafgaande dialyse. (Cammack et al., 1975) 1.2.2.2.

Structuuranalyse

Onder structuuranalyse valt o.a. de primaire, secundaire en tertiaire structuur, maar ook het moleculair gewicht en fragmentatie vallen hieronder. Onder primaire structuur verstaan we de opeenvolging van aminozuren. Dit wordt opgehelderd door middel van diverse technieken. Een klassieke methode is de Edmandegradatie (Edman et al., 1949), waarbij het N-terminale residu wordt gelabeld en afgesplitst, zonder dat de rest van de peptidebindingen wordt gebroken. (Maita et al,. 1979) Een alternatieve, modernere methode is de massaspectrometrie. Eerst wordt via chemische of enzymatische afbraak het eiwit onder gecontroleerde omstandigheden gehydrolyseerd in kleinere stukken. Het gevormde mengsel van peptiden wordt doorheen een HPLC gestuurd om ze te scheiden en detectie gebeurt met MS (voor massabepaling) of MSn (voor aminozuursequentie van elke fractie). (https://www.msu.edu/~gallego7/MassSpect/MSandPMM.htm) (Han et al., 2001) De primaire structuur van enkele asparaginasen zijn reeds volledig opgehelderd (figuur 1.7).

9

Figuur 1.7: Aminozuursequenties van het monomeer van verscheidene asparaginasen. Getallen bovenaan = sequentie van E. coli asparaginase, onderaan = W. succinogenes asparaginase. * = residu cruciaal voor de activiteit. Donkerrood = residu voorkomend in alle enzymen. Licht rood = zeer geconserveerd residu. Paars = vaak voorkomend residu, behalve in W. succinogenes. Groen = vaak voorkomende residu in elke subfamilie (licht groen, asparaginasen; donkergroen, glutaminase/asparaginasen). Roze = residu’s zijn zeer geconserveerd in beide subfamilies. (Lubkowski et al., 1996) De secundaire structuur, de lokale opvouwing in driedimensionele structuurelementen, wordt onder andere bepaald met behulp van circulair dichroisme. CD steunt op het vermogen van de CD-spectrometer om het verschil in absorptie tussen links10

en rechts-circulair gepolariseerd licht te meten. Een afwezigheid van een regelmatige structuur leidt tot een CD-intensiteit van nul. Een geordende structuur, zoals een α-helix of een β-sheet, daarentegen zal resulteren in een spectrum. CD heeft ook inzicht gegeven over het ontvouwen van de secundaire structuren van de proteïne. (Benjwal et al., 2006) (Shifrin et al., 1972) Differential Scanning Calorimetry (DSC) kan worden aangewend om de thermische stabiliteit te bepalen. Hierbij wordt een staal samen met een referentie verwarmd en op dezelfde temperatuur gehouden. Het verschil in toegevoegde warmte is hier dan te wijten aan ontvouwing van de proteïne door breking van de H-bruggen van de αhelix of β-sheet structuren. (Benjwal et al., 2006) (Bruylants et al., 2005) De tertiaire structuur van asparaginase (Figuur 1.8) werd bepaald met behulp van Xstraal kristallografie, een techniek die de relatieve positie van atomen binnen een kristal toont, en NMR (nucleaire magnetische resonantie), een techniek waarmee men de omgeving van een atoom kan onderzoeken. Elk monomeer is identiek en bestaat uit 2 α/β domeinen. (Lubkowski et al., 1996) (Wehner et al., 1992)

Figuur 1.8 : Driedimensionale structuur van Erwinia chrysanthemi asparaginase. Een van de 4 identieke monomeren is aangeduid in felle kleuren. De C-terminale uiteinden zijn rood gekleurd, de N-terminale uiteinden blauw. Een van de actieve centra wordt voorgesteld door het grijze gebied. (Lubkowski, 2003) 11

De quaternaire structuur van het enzym werd ook via X-straal kristallografie bepaald. Zo weten we bijvoorbeeld dat asparaginase voorkomt als een homotetrameer, die te beschouwen valt als een dimeer van dimeren. (Swain et al., 1993) (Lubkowski et al., 1996) 1.2.2.3.

Zuiverheidsanalyse

Zuiverheid van asparaginase werd nagegaan met behulp van gelelektroforese, zowel SDS-PAGE (natrium dodecylsulfaat polyacrylaminde gelelektroforese) als 2-dimensionale elektroforese. Dit werd gekoppeld aan een immunoblotting. Dit laat niet enkel toe met een bepaalde zekerheid te zeggen of het eiwit wel asparaginase is (identificatie), maar ook of er degradatie-fragmenten, andere contaminant-eiwitten of andere onzuiverheden in het staal zitten. (Gupta et al., 2009) 1.2.3.

Actief Centrum Asparaginasen zijn enzymen die actief zijn als homotetrameren met een 222

symmetrie (orthorhombische vorm). Elk monomeer bestaat uit ongeveer 330 aminozuurresidues (in geval van Erwinia chysanthemi zijn het er 327) die 14 β-sheets en 8 αhelixen vormen, gerangschikt in twee te onderscheiden α/β domeinen, namelijk het grotere N-terminale domein en het kleinere C-terminale domein (zie figuur 1.9). Beide domeinen zijn verbonden met een linker die bestaat uit een 20-tal residues. Tussen de 4e en de 5e β-sheet van het N-terminaal domein bevindt er zich een cross-over die linksdraaiend is, wat vrij zelden voorkomt. Dit is een belangrijke determinant van hun activiteit. (Lubkowski et al., 2003) (Papageorgiou et al., 2008) Asparaginase kan beschouwd worden als een dimeer van 2 intieme dimeren en heeft 4 actieve centra. Elk van deze actieve centra bevat voornamelijk aminozuren uit het Nterminale domein van de ene subunit, maar bevat contacten uit het C-terminaal domein van de intiem gebonden subunit (Figuur 1.9). De twee actieve centra van elke dimeer liggen tussen het N-terminale domein van de ene subunit en het C-terminale domein de andere subunit. (Lubkowski et al., 2003) (Swain et al., 1993)

12

Figuur 1.9: Actief centrum van een monomeer van Erwinia chrysanthemi. Het N-terminale domein is in het blauw afgebeeld, het C-terminale domein in het rood, de linker-regio in het grijs. Een fragment van het tweede monomeer dat bijdraagt tot de actieve site is afgebeeld in het licht rood. (Aghaiypour et al., 2001) Twee aminozuurresidu’s die belangrijk zijn in het katalytisch proces en zich in het actieve centrum bevinden zijn Thr-15 (threonine) en Tyr-29 (tyrosine) (Figuur 1.10). Thr-15 (en voor E. coli Thr-12) is geïdentificeerd als het primaire nucleofiel, Tyr-29 houdt de aanvallende nucleofiel in de meest gunstige positie. (Kravchenko et al., 2008) Het eerste tetraëdrische acylenzyme-tussenproduct wordt gevormd na een nucleofiele aanval door Thr15 op het carbonzuur koolstof van het substraat. Die koolstof ondergaat dan een nucleofiele aanval door een watermolecule, en het tweede tetraëdrische intermediair wordt omgezet tot het uiteindelijke product. (Aghaiypour et al., 2001)

13

Figuur 1.10: Close-up van het actief centrum van Erwinia chrysanthemi met aspartaat (achtergrond) en sulfaat (voorgrond) gebonden. W = watermolecule, getallen zijn de bindingslengte (in Angström) van de waterstofbrug met tussen haakjes de standaarddeviatie. Rood= zuurstof. Blauw = stikstof. (Lubkowski et al., 2003) In de omgeving van het actief centrum vindt men een flexibele lus (Figuur 1.11), van residu 14 tot 33, dat de bindingsplaats afdicht bij binding van het substraat aan het enzym. Residu’s Gly-13 (glycine) tot en met Gly-18 vormen de scharnier van de flexibele lus dat zich systematisch aanpast aan 1 van de 2 conformaties, namelijk open of gesloten. In gesloten toestand is de zijketen van Thr15 naar het centrum van het actieve centrum. (Lubkowski et al., 2003)

14

Figuur 1.11 Flexibele lus van Erwinia chryanthemi asparaginase (Lubkowski et al., 2003) Om te kunnen binden op het actieve centrum moet het substraat voorkomen in de zwitterionvorm, m.a.w. moet asparagine elektrisch neutraal zijn. Gebonden asparagine gaat waterstofbindingen vormen met residu’s uit het rigide deel van de pocket en residue’s van de mobiele lus (Thr-15 en Tyr-29) waardoor er een soort “brug” ontstaat tussen beide delen. Moleculen groter dan L-glutamine, een natuurlijk substraat, passen niet in het actieve centrum. (Lubkowski et al., 1996) (Aghaiypour et al., 2001) Glutamine speelt een belangrijke rol in het stikstoftransport in het bloed en langdurige depletie van dit aminozuur gedurende de asparaginasetherapie veroorzaakt ernstige nevenwerkingen. Sommige asparaginasen, zoals E. coli-asparaginase, hebben glutaminase-activiteit. In deze glutaminase-activiteit zou residu Asn-248 (asparagine) een grote rol spelen. Dit residu is in Erwinia chrysanthemi, dat geen glutaminase-activiteit vertoont, vervangen door Ser-248 (serine). Residu 248 neemt deel in waterstofbindingen met Asp-90 (asparaginezuur) (zowel het Ser-248 als Asn-248 residu) en met Glu-283 (enkel het Asn-248 residu). De rol van residu Asp-90 is waarschijnlijk de conformaties van de negatief geladen zijketens die dicht bij elkaar liggen te stabiliseren. (Lubkowski et al., 1996) (Aghaiypour et al., 2001) 15

1.2.4.

Soorten asparaginase Er zijn heel wat species die asparaginase tot expressie brengen, waardoor deze

enzymen andere eigenschappen (zoals KM (Michaëlis constante), specifieke activiteit, moleculair gewicht, optimale temperatuur en pH) kunnen bevatten. Voor een meer gedetailleerde lijst wordt verwezen naar Bijlage 1. 

Bacterieel: Dit koninkrijk bevat de meeste asparaginasen. Hierbij zijn het voornamelijk de proteobacteriën die dit enzym tot expressie brengen, alsook sommige firmicutes, deinococcus-thermus, ciliophora en actinobacteriën.



Schimmel: De ascomycota en basidiomycota zijn hier de divisies die het enzym tot expressie brengt.



Plant: Hierbij is het vooral in de angiospermen dat asparaginase wordt teruggevonden, hoewel er in enkele pinophyta en bryophyta ook asparaginase is aangetroffen.

1.2.5.

Stabiliteit Asparaginase (van E. coli) heeft een vrij breed pH-activiteitsgebied gaande van pH 4,5

tot pH 11,5; hierbuiten verliest het zijn activiteit. Rond pH 4,5 en pH 11,5 zakt de activiteit naar ongeveer 50% van de maximale activiteit. Na tijdelijke blootstelling aan deze pH’s, werd de pH terug naar 8.5 gebracht, waarna het enzym zijn activiteit terugkreeg. Dit wijst erop dat de conformationele veranderingen bij deze pH’s nog reversibel zijn. Er werd een kleine stijging in activiteit opgemerkt als de pH stijgt van ongeveer 4,5 naar 10,5 (Figuur 1.9). De reden dat het activiteitsmaximum in de alkalische regio ligt, is waarschijnlijk een gevolg van het evenwicht tussen asparaginezuur en asparagine. Asparaginezuur in zuur milieu is geprotoneerd en heeft een grotere affiniteit voor het actief centrum. Onder die omstandigheden wordt het een competitieve inhibitor. Bij alkalische pH verschuift de balans richting gedeprotoneerde vorm, namelijk aspartaat. Dit is de vorm met een lagere affiniteit voor het actief centrum. Hierdoor is de binding van het actief centrum met asparagine bij iets hogere pH bevoordeeld. 16

Figuur 1.9 Activiteit/stabiliteits-pH relatie van E. coli asparaginase Asparaginase kan door temperatuursstijging zijn functie volledig verliezen en deze ook weer partieel terugwinnen, afhankelijk van de condities waarin het enzym zich bevindt. Na opwarming (65°C, 20 min) bleek er na afkoeling (37°C) geen herstel van activiteit bij pH 5 en pH 11,5. Bij pH 8,6 werd 50% van de oorspronkelijke activiteit waargenomen. Stecher et al. toonde hiermee aan dat er een irreversibele structurele verandering bij pH 5 en 11,5 plaatsvond, zonder herstel, terwijl er bij pH 8,6 wel partieel herstel optreed. Deze denaturatie kan een gevolg zijn van de dissociatie van asparaginase subunits. (Stecher et al., 1999)

17

2. OBJECTIEF Er is tegenwoordig nog geen consensus over welke toedieningsweg (i.v. of i.m.), snelheid van toediening en concentratie de meest effectieve en veilige is. Gezien de klinische vraag naar infuustoediening, die afwijkt van de beperkte en enige erkende toedieningswijze (i.m. bolus), en het gebrek aan stabiliteitsgegevens, wensen wij in deze initiële onderzoeksfase de verschillende methoden te vergelijken waarmee we de activiteit van het enzym als farmaceutisch preparaat kunnen bepalen. Het hoofdobjectief van deze masterthesis is dus een comparatieve studie maken van de verschillende methoden om de activiteit van asparaginase als farmaceutisch preparaat te bepalen. Deelaspecten daartoe zijn: 1. De ontwikkeling van verschillende methoden, aangepast voor het onderzoek in QC omstandigheden. 2. De evaluatie van de verschillende methoden. 3. Het vergelijken van deze methoden, gebaseerd op statistische en andere descriptoren. Aan de hand de aldus bekomen kengetallen, kan een prioriteitslijst van methoden opgesteld worden. Deze thesis is een pilootwerk, dat kadert binnen een collaboratief onderzoek om uiteindelijk de stabiliteit van asparaginase in een farmaceutisch preparaat te kunnen bepalen. Daarnaast zal men ook andere technieken, zoals MS en CD gebruiken om de stabiliteit te karakteriseren.

18

3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1.

TOESTELLEN EN REAGENTIA

3.1.1.

UV/Vis spectrofotometer Het toestel waarop de metingen zijn uitgevoerd is een UV/Vis spectrofotometer

(interne referentie QR-185) “Ultraspec 4000” van Pharmacia Biotech. Deze is uitgerust met een deuterium lamp van Cathodion. De cuvetten die gebruikt werden zijn quartz-suprasil cuvetten met een weglengte van 1 cm. Een cuvetcorrectie werd doorgevoerd voor iedere proefneming. 3.1.2.

Centrifuge De centrifuge is een gekoelde tafelcentrifuge “Eppendorf Centrifuge 5417” (interne

referentie QR-263), afkomstig van Voor’t Labo, Eeklo. 3.1.3.

Thermomixer Het apparaat om de Eppendorfs te verwarmen is een “Eppendorf Thermomixer

Comfort” (interne referentie QR-412). Deze werd aangekocht bij Fisher Scientific, Aalst. 3.1.4.

pH meter De gebruikte pH meter is een “SevenEasy pH Meter S20” (interne referentie QR-333),

aangeschaft bij Mettler Toledo, Schwerzenbach. 3.1.5.

Waterstation Het waterzuiveringsstation dat werd gebruikt om het water te deïoniseren is een

Arium 611VF Water Purification System (interne referentie QR-233), aangekocht bij Sartorius, Leuven.

19

3.1.6.

Balansen De gebruikte balansen om af te wegen zijn Analytical Balance XS-105 D (interne

referentie QR-277) en Analytical Balance XS-204 (interne referentie QR-196), beide aankomstig van Mettler Toledo, Zaventem. 3.1.7.

Producten In onderstaande Tabel 3.1 staan alle producten die voor deze masterthesis zijn

gebruikt, inclusief lotnummer en productcode. Tabel 3.1: Gebruikte producten Product Kwik(II)-jodide Kaliumjodide Natriumhydroxide DruQuaR water Ammoniumchloride Natriumcarbonaat (watervrij) Natriumwaterstofcarbonaat Natrium nitroprusside Thymol Ethanol Natriumhypochloriet Fenol kristallen Hydroxylamine hydrochloride Zoutzuur 8-hydroxyquinoline Absolute ethanol Citroenzuur monohydraat Dinatriumwatterstoffosfaat dihydraat Trichloorazijnzuur Ammonia Assay Kit Malaat Dehydrogenase Aspartaat transaminase

Leverancier Merck (Whitehouse Station, USA) Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) Fluka Analytical (Buchs, Zwitserland) Jochem UCB (Brussel, België) UCB (Brussel, België)

Productcode 4420 100934463

Lotnummer 4168046 BCBB9119

71694

1421467

14/03/2011 1141

10h21 89079051

1720

99D210054

UCB (Brussel, België) Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) Janssen Chimica (Geel, België) Chem-lab (Zedelgem, België) Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA)

1707 92287083 13451 SZBA0970 15.033.95 2378912 CL00.0112.2500 18.2400710.2400 425044 STBB7477V Conforma S.A. (Destelbergen, België) / 100g 14253 UCB (Brussel, België)

1391

94027196

Sigma-Aldrich St.-Louis, USA) Aldrich (St.-Louis, USA) Riedel-de Haën (Seelze, Duitsland) Merck (Whitehouse Station, USA)

30721 252565-50G

91770 BCBD6040V

nbs

7118A

244.1000

K16008444

Merck (Whitehouse Station, USA)

10.6580.1000

K28624480

Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) Sigma (St.-Louis, USA) Sigma (St.-Louis, USA) Sigma (St.-Louis, USA)

33731 AA0100-1KT 63228-10MG 62751-1KU

90340 100M6204 1441510V 069K7003V 20

β-nicotinamide Adenine Dinucleotide Kaliumwaterstoffosfaat Asparaginezuur Dinatrium α-ketoglutaarzuur dihydraat Kaliumwaterstoffosfaat Albumine Standaard BSA PBS-buffer

Sigma (St.-Louis, USA)

N4505-100MG

010M5153V

Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) ABC Chemicals (Lancashire, Engeland)

00662-1K6

063K0147

260204

04B23M0126

Aldrich (St.-Louis, USA)

101031942

BCBC9151V

1.048.731.000 23209 P-3813

A0188073101 IL116702 060M8222

Merck (Whitehouse Station, USA) Thermo (Scientific Rockford, USA) Sigma (St.-Louis, USA)

3.2. METHODEN In de literatuur worden verscheidene technieken beschreven om de activiteit van asparaginase te bepalen (zie sectie 1.2.2. Karakterisatie). Hieruit werden 5 methoden geselecteerd: Nessler, Berthelot, Indooxine, Glutamaat Dehydrogenase en Aspartaat Transaminase. De keuze werd bepaald door enkele voorafgaande overwegingen: 

De substraat/productbepaling dient selectief, maar instrumenteel en operationeel zo eenvoudig en robuust mogelijk te zijn.



De methode dient kwantificatie toe te laten, waarbij accuraatheid, precisie en lineariteit belangrijke aspecten zijn.



Algemene kosten, inclusief analysetijd, dienen zo minimaal mogelijk gehouden te worden.

Gezien deze “gebruikerswensen”, werden methoden gebaseerd op elektrische geleidbaarheid (selectiviteit?) of HPLC bepalingen (eenvoud? kost?) niet weerhouden. Methoden die finaal gebruik maken van UV-VIS werden dus verkozen. Hierbij werd steeds voor elke methode gestart met een literatuurstudie, waarna er één protocol geselecteerd werd op basis van de gebruiksfrequentie in publicaties en detail van de beschrijvingen (Tabel 3.2).

21

Tabel 3.2: Basisprotocols Methode Nessler

Basisprotocols EPA method 350.2, 1974 Franklin Township Municipal Sanitary Authority, 2006 Searcy et al., 1964

Berthelot

Afkhami et al., 2008 Moliner-Martinez et al., 2005

Indooxine Glutamaat Dehydrogenase Aspartaat Transaminase

Frear et al., 1955 Lanvers et al., 2002 Sigma Aldrich gebruikersprotocol, 2008 Wilkinson et al., 1972 Asselin et al., 1993

In vele gevallen ging het echter om bio-activiteitsbepalingen die asparaginase in serum/plasma bepalen. Dit protocol werd dan door ons aangepast, waarbij eenvoud en lineariteit de belangrijkste ontwikkelingscriteria waren. 3.2.1.

Nessler 

Reagentia o Nessler reagens: 1,4 g kaliumjodide en 2,2 g kwik(II)-jodide oplossen in enkele ml water en aanlengen tot 10 ml. 3,2 g natriumhydroxide oplossen in enkele ml water en aanlengen tot 10 ml. Meng beide oplossingen. Hierbij kan een kleine hoeveelheid rood-bruine neerslag van kalium tetraiodomercuraat ontstaan. Bewaard in een donkere fles, uit het directe zonlicht, blijft dit reagens tot 1 jaar stabiel.

22



Standaardreeks o Ammonium referentie stockoplossing: 315,0 mg ammoniumchloride oplossen in water en aanlengen tot 100,0 ml (1000 ppm). Hiervan 10,0 ml pipetteren in een maatkolf van 100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep (100 ppm). Van deze stockoplossing werd de standaardreeks bereid (Tabel 3.3). Tabel 3.3: Standaardreeks Nessler Concentratie (ppm) blanco 0.5 1 3 5 10 15 20



Volume stockoplossing (ml) 0,0 5,0 5,0 6,0 10,0 5,0 15,0 10,0

Totaal volume (ml) 10,0 1000,0 500,0 200,0 200,0 50,0 100,0 50,0

Werkwijze: Van bovenstaande oplossingen werd 10,0 ml gepipetteerd in een proefbuis en in iedere proefbuis werd 0,2 ml van de heldere fractie van het Nessler reagens gepipetteerd. De oplossingen werden gemengd en de reactie ging door gedurende 10 minuten. Hierna werd de absorbantie van de oplossingen bepaald met behulp van de spectrofotometer bij een golflengte van 425 nm ten opzichte van een blanco.



Berekeningen: Om via deze methode de concentratie van ammonium in een onbekend staal te berekenen, stelt men een ijkcurve op van de standaardreeks. Met de vergelijking van die ijkcurve kan men, met behulp van de absorbantie, de concentratie bepalen.

23

3.2.2.

Berthelot 

Reagentia o Fenol kleurreagens: 5 g fenol en 25 mg natrium-nitroprusside oplossen in water en aan te lengen tot 100 ml. o Alkalisch hypochlorietreagens: 2,5 g natriumhydroxide oplossen in water, 3 ml 10-15% natriumhypochloriet toevoegen en aanlengen tot 100 ml.



Standaardreeks o Ammonium referentie stockoplossing: 315,0 mg ammoniumchloride oplossen in water en aanlengen tot 100,0 ml (1000 ppm). Hiervan 10,0 ml pipetteren in een maatkolf van 100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep (100 ppm). Hiervan nogmaals 10,0 ml pipetteren in een maatkolf van 100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep (10 ppm). De standaardreeks werd vanuit deze stockoplossing bereid (Tabel 3.4). Tabel 3.4: Standaardreeks Berthelot Concentratie (ppm) blanco 0,1 0,2 0,5 1 3 5



Volume stockoplossing (ml) 0,0 1,0 2,0 5,0 10,0 30,0 50,0

Totaal volume (ml) 10,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Werkwijze: 1,0 ml van het fenol kleurreagens werd toegevoegd aan 10,0 ml van de ammonium standaarden, waarna 30 seconden geschud werd. Vervolgens werd 1,0 ml van het alkalisch hypochlorietreagens toegevoegd en opnieuw gedurende 30 seconden geschud. De reactie ging gedurende 15 minuten door bij 37,0°C. Hierna werd de absorbantie van de stalen gemeten bij 633 nm ten opzichte van een blanco. 24



Berekeningen: Aan de hand van de ijkcurve, die kan worden opgesteld met behulp van de standaardreeks, kan men de concentratie van ammonium in een onbekend staal bepalen.

3.2.3.

Indooxine 

Reagentia o 8-hydroxyquinoline reagens: 0,2 g 8-hydroxyquinoline oplossen in 10 ml absolute ethanol (2% (w/v)). 5,3 g natriumcarbonaat oplossen in water en aanlengen tot 50 ml (1M). Meng 10 ml van de 2% (w/v) 8hydroxyquinoline-oplossing met 30 ml van de 1M natriumcarbonaatoplossing. o 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6,8): 7,15 g dinatriumwaterstoffosfaat oplossen in water en aanlengen tot 100 ml. 1,05 g citroenzuur oplossen in water en aanlengen tot 50 ml. Meng 77,3 ml van de dinatriumwaterstoffosfaatoplossing met 22,7 ml van de citroenzuuroplossing. o Trichloorazijnzuur (12% (w/v)): 1,2 g trichloorazijnzuur oplossen in 10 ml water. o 0,01 N HCl oplossing: 100 µl 37 % (m/m) aanlengen tot 100 ml met water.



Standaardreeks o Hydroxylamine referentie stockoplossing: 84,17 mg hydroxylamine.hydrochloride oplossen in water en aanlengen tot 1,0 l (40 ppm). Hiervan 25,0 ml pipetteren in een maatkolf van 100 ml, naar pH 3,0 brengen met behulp van een 0,01 N HCl-oplossing en aanlengen tot aan de ijkstreep (10 ppm). Deze stockoplossing werd gebruikt om de standaardreeks te bereiden (Tabel 3.5)

25

Tabel 3.5: Standaardreeks Indooxine Concentratie (ppm) blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10



Volume stockoplossing (ml) 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

Totaal volume (ml) 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0

Werkwijze: 1,0 ml van de standaarden werd aangelengd met 0,8 ml water. Daarna werd 1,0 ml buffer toegevoegd, alsook 2,0 ml trichloorazijnzuur oplossing. Dit werd gemengd en daarna werd 2,0 ml van het 8-hydroxyquinoline reagens toe gevoegd. De stop werd onmiddellijk op de proefbuis geplaatst en er werd hevig geschud. De oplossingen werden gedurende 1 minuut in een warmwaterbad van 95,0°C verwarmd. De oplossingen lieten we nadien gedurende ongeveer 15 minuten afkoelen in een rek tot kamertemperatuur. Hierna werd de absorbantie bepaald bij 705 nm ten opzichte van een blanco.



Berekeningen: De concentratie van hydroxylamine in een onbekend staal kan berekend worden door van de standaard reeks een ijkcurve op te stellen. Met de vergelijking van die ijkcurve kan men de concentratie van het staal berekenen.

3.2.4.

Glutamaat dehydrogenase 

Reagentia o “Ammonia Assay” reagens: Reconstitueer één vial door 10,0 ml water in de vial te pipetteren, meng door inversie. Gesloten blijft de gereconstitueerde vial stabiel bij 2-8°C gedurende 2 weken.

26



Standaardreeks o

Ammonium referentie stockoplossing: 157,5 mg ammoniumchloride oplossen in water en aanlengen tot 500,0 ml (100 ppm). Vanuit deze stockoplossing werd de standaardreeks bereid, die gelegen is tussen de aanbevolen range van de “Assay Kit”, zijnde 0,2 – 15 ppm. (Tabel 3.6). Tabel 3.6: Standaardreeks Glutamaat Dehydrogenase

Concentratie (ppm) blanco 0,5 1 3 5 10 15 20



Volume stockoplossing (ml) 0,0 5,0 5,0 6,0 10,0 5,0 15,0 10,0

Totaal volume (ml) 1,0 1000,0 500,0 200,0 200,0 50,0 100,0 50,0

Werkwijze: In een cuvet werd 1,0 ml van het reagens gepipetteerd, samen met 100 µl van de oplossing met gewenste ammoniak concentratie of water. De inhoud werd gemengd en geïncubeerd gedurende 5 minuten bij 18-35°C. Water werd als referentie genomen om de absorbantie bij 340 nm op nul te zetten. Daarna werden de absorbanties van de verschillende cuvetten bepaald bij 340 nm. Bij elke oplossing voegden we nadien 10,0 µl glutamaat dehydrogenase toe en lieten opnieuw gedurende 5,0 minuten incuberen bij 18-35°C waarna de absorbantie opnieuw werd gemeten.



Berekeningen: De concentratie van ammonium in een onbekend staal kan bepaald worden door middel van een ijkcurve, opgesteld met behulp van de standaardreeks. De concentratie kan echter ook berekend worden via Vergelijking 3.1: Δ A = Ainitieel – AFinaal. Δ(ΔAStaal) = ΔAstaal - ΔABlanco 27

# mg NH3/ml oorspronkelijk staal =

(3.1)

= = A = Δ(ΔAstaal) TV = Totaal Volume van het assay in ml SV = Staal Volume in ml MW van ammonia = 17 g/mol F= Verdunningsfactor van bij staalvoorbereiding ε = millimolaire extinctiecoëfficiënt voor NADPH bij 340 nm [in mM-1 cm-1 of equivalent ml/µmol)(1/cm)] d = weglengte van het licht (cm) = 1 cm 3.2.5.

Aspartaat Transaminase 

Reagentia o Fosfaatbuffer (1,0 M en 0,1 M): 13,6 g kaliumdiwaterstoffosfaat en 3,3 g natriumhydroxide oplossen in water en aanlengen tot 100 ml (1,0 M, pH 7,5). Pipetteer hiervan 25 ml in een maatkolf van 100 ml en leng aan tot de ijkstreep. o NADH oplossing: 4 mg β-NADH oplossen in 2 ml 0,1 M fosfaatbuffer. Deze oplossing is slechts 1 dag stabiel. o α-ketoglutaarzuur oplossing: 0,73 g α-ketoglutaarzuur oplossen in 35 ml water en 5 ml buffer. De pH werd gemeten en indien nodig gecorrigeerd naar 7,5. Deze oplossing is een maand houdbaar bij 4 °C

28

o Aspartaat transaminase oplossing (9-10 U): 30 µl aspartaat transaminase suspensie (434 U/mg) pipetteren in een maatkolf van 2 ml en aanlengen tot de ijkstreep met 0,1 M fosfaatbuffer. o Malaat dehydrogenase oplossing (9-10 U): 1 mg malaat dehydrogenase (432 U/mg) op lossen in 0,1 M fosfaatbuffer en aanlengen tot 5 ml. 

Standaardreeks o Asparaginezuur referentie stockoplossing: 25,0 mg asparaginezuur op lossen in 350,0 ml water en 50,0 ml 1,0 M fosfaatbuffer, de pH indien nodig corrigeren naar 7,5 en aanlengen tot 500,0 ml met water (50 ppm). Deze stockoplossing werd gebruikt om de standaardreeks te bereiden (Tabel 3.7). Tabel 3.7: Standaardreeks Aspartaat Transaminase Concentratie (ppm) blanco 5 10 15 20 25 30 35 40



Volume stockoplossing (ml) 0,0 5,0 10,0 15,0 10,0 25,0 15,0 35,0 20,0

Totaal volume (ml) 50 50 50 50 25 50 25 50 25

Werkwijze: 1,3 ml van de 0,1 M fosfaatbuffer, 1,0 ml asparaginezuuroplossing, 0,2 ml NADH, 0,1 ml malaat dehydrogenase en 0,2 ml aspartaat transaminase werden in een proefbuis gepipetteerd en geïncubeerd gedurende 15 minuten bij 25,0 °C. De reactie werd gestart door 0.2 ml van de α-ketoglutaarzuur oplossing toe te voegen, waarna voorzichtig werd gemengd. De reactie ging door bij 25,0 °C gedurende 5,0 minuten. De daling in absorbantie werd na deze 5 minuten bepaald bij 340 nm. 29



Berekeningen: Aan de hand van een ijkcurve, die kan worden opgesteld met de standaardreeks, kan men de concentratie van asparaginezuur in een onbekend staal bepalen.

3.2.6.

Methodenevaluatie De stockoplossingen werden als volgt bereid: 

Stockoplossingen Protocol o Ammonium stockoplossing: 20,0 mg ammoniumchloride in water en aanlengen tot 100,0 ml (63,7 ppm). Dit 10 en 100 maal verdunnen om respectievelijk een 6,37 ppm en 0,637 ppm stockoplossing te bekomen. o Hydroxylamine stockoplossing: 26,0 mg hydroxylamine.hydrochloride in water en aan lengen tot 200,0 ml. Dit 10 maal verdunnen teneinde een 6,18 PPM stockoplossing te bekomen. o Asparaginezuur stockoplossing: 20,0 mg asparaginezuur in water en aanlengen tot 100,0 ml. Deze oplossing 10 maal verdunnen, teneinde een 20 ppm stockoplossing te bekomen.



Stockoplossingen andere stalen o Ammonium stockoplossing: 200,0 mg ammoniumchloride in PBS en aanlengen tot 100,0 ml o Hydroxylamine stockoplossing: 130,0 mg hydroxylamine.hydrochloride in PBS en aanlengen tot 100,0 ml. o Asparaginezuur stockoplossing: 250,0 mg asparaginezuur in PBS en aanlengen tot 50,0 ml.

30

4. RESULTATEN 4.1. NESSLER In Bijlage 2 vindt men de absorbantiewaarden terug, gemeten bij 425 nm. Figuur 4.1 geeft deze waarden grafisch weer. Op de bekomen waarden werd een lineaire regressie toegepast: R² was 0,9989, de F-waarde bedroeg 1800,6. De 95% betrouwbaarheidsintervallen voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt zijn respectievelijk [-0,03764;0,04450] en [0,1226;0,1503]. De R² en F-waarde vertellen ons dat er een sterk lineair verband is tussen de concentratie en de absorbantie bij 425 nm. In Bijlage 2 vindt men eveneens de plot van de gestandaardiseerde residuen, waarop men een parabolische vorm kan waarnemen. Deze kan indicatief zijn voor een kwadratisch verloop. Dit is echter niet zo daar de kwadratische coëfficiënt niet significant is. Gezien het betrouwbaarheidsinterval van het snijpunt de nul bevat, kunnen we er ook vanuit gaan dat deze lineaire curve door de oorsprong gaat, zodat in de toekomst een 1-puntscalibratie kan volstaan. Ervan uitgaande dat absorbantiewaarden boven 1 minder gunstig zijn voor kwantitatieve doeleinden, is de bovengrens van het werkzame gebied met onze Nessler methode dus 7,3 ppm.

Nessler: ijkcurve 1,1 1 Absorbantie (425 nm)

0,9 0,8 0,7 y = 0,1365x + 0,0034 R² = 0,9989

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

1

2

3

4

5

6

7

PPM

Figuur 4.1: ijkcurve Nessler 31

4.2. BERTHELOT De absorbantiewaarden, gemeten bij 633 nm, vindt men terug in Bijlage 3. Deze waarden worden grafisch weergegeven in Figuur 4.2. Op de bekomen waarden werd een lineaire regressie toegepast: R² was op 0,9922, de F-waarde bedroeg 380,8. Het 95% betrouwbaarheidsinterval voor het snijpunt is [-0,1180;0,05323] en het 95 % betrouwbaarheidsinterval voor de richtingscoëfficiënt is [0,7892;1,097]. Het betrouwbaarheidsinterval van het snijpunt bevat de nul, waardoor we kunnen aannemen dat deze deze ijkcurve ook door de oorsprong gaat, waardoor in de toekomst een 1puntscalibratie kan volstaan. Uit de R² en F-waarde kunnen we afleiden dat er tussen de concentratie en de absorbantie bij 633 nm een sterk lineair verband is, wat bevestigd wordt door de gestandaardiseerde residuen (Bijlage 3). De helling bij Berthelot is veel groter dan deze bij Nessler, waaruit we kunnen concluderen dat Berthelot een grotere sensitiviteit heeft. Absorbantiewaarden boven de 1 zijn, zoals bij 4.1 reeds aangehaald, minder geschikt voor kwantitatieve doeleinden. Daarom is de bovenlimiet van deze methode 1,1 ppm.

Berthelot: ijkcurve 1,1 1 Absorbantie (633 nm)

0,9 0,8 0,7 y = 0,943x - 0,0324 R² = 0,9922

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

PPM

Figuur 4.2: ijkcurve Berthelot 32

4.3. INDOOXINE Figuur 4.3 geeft de absorbantiewaarden, die we hebben bekomen bij 705 nm, grafisch weer. Deze waarden, samen met de grafiek van de gestandaardiseerde residuen, vindt men terug in Bijlage 4. Op deze waarden werd een lineaire regressie toegepast: de gevonden R² was 0, 9975 terwijl de F-waarde 3153,1 bedroeg. Uit deze gegevens kunnen we afleiden dat er voor deze methode een sterk lineair verband bestaat tussen de concentratie en de absorbantie bij 705 nm Voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt waren de 95% betrouwbaarheidsintervallen respectievelijk [0,005816;0,05192] en [0,08675;0,09416]. Het interval van het snijpunt bevat de waarde nul niet, waardoor we niet met zekerheid kunnen zeggen dat een 1-puntscalibratie met deze methode mogelijk is. De sensitiviteit van deze methode kleiner dan deze van Berthelot en Nessler, daar de richtingscoëfficiënt kleiner is dan die van de twee voorgaande methoden. De bovenlimiet bij onze Indooxine methode is 10,7 ppm (Absorbantie = 1) .

Indooxine: ijkcurve 1,2

Absorbantie (705 nm)

1 0,8 y = 0,0905x + 0,0289 R² = 0,9975

0,6 0,4 0,2 0 0

2

4

6

8

10

12

PPM

Figuur 4.3: ijkcurve Indooxine 33

4.4. GLUTAMAAT DEHYDROGENASE Bijlage 5 bevat de absorbantiewaarden van deze methode, gemeten bij 340 nm en Figuur 4.4 geeft deze waarden grafisch weer. De resultaten van de lineaire regressie, die op deze waarden werden toegepast, zijn de volgende: R² was 0, 9991 en de F-waarde bedroeg 6377,6. Deze resultaten wijzen op een sterk lineair verband tussen de concentratie en absorbantie bij 340 nm. In bijlage 5 vindt men ook de grafische weergave van de gestandaardiseerde residuen terug, die ook een lineair verband bevestigen. Het 95% betrouwbaarheidsinterval van het snijpunt bedroeg [0,9902;1,0091], het 95% betrouwbaarheidsinterval de richtingscoëfficiënt bedroeg [-0,03258;-0,03065]. Dit interval bevat absolute waarden kleiner dan de richtingscoëfficiënten van de voorgaande methoden, waardoor we kunnen besluiten dat deze methode minder sensitief is. Daar het bij deze methode om een daling in absorbantie gaat, hebben we vastgelegd dat een daling van meer dan 0,5 absorbantie-eenheden minder gunstig is voor een kwantitatieve bepaling. De bovenlimiet van de range is bijgevolg 15,8 ppm voor deze methode.

Glutamaat Dehydrogenase: ijkcurve 1,200

Absorbantie (340 nm)

1,000 0,800

y = -0,0316x + 0,9996 R² = 0,9991

0,600 0,400 0,200 0,000 0

5

10

15

20

25

PPM

Figuur 4.4: ijkcurve Glutamaat Dehydrogenase 34

4.5. ASPARTAAT TRANSAMINASE In Bijlage 6 vindt men de absorbantiewaarden, gemeten bij 340 nm, die op Figuur 4.5 grafisch weergegeven worden. Op deze waarden werd een lineaire regressie toegepast: R² was 0, 9963 en de F-waarde bedroeg 1864,9. Hierdoor kunnen we besluiten dat er een sterk lineair verband bestaat tussen de concentratie en de absorbantie bij 340 nm, wat bevestigd wordt door de gestandaardiseerde residuen die terug te vinden zijn in Bijlage 6. De betrouwbaarheidsintervallen voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt zijn respectievelijk [0,8854;0,9135] en [-0,01137;-0,01019]. De richtingscoëfficiënt heeft een absolute waarde kleiner dan de voorgaande methodes, waardoor we kunnen besluiten dat deze methode de minst sensitieve is. Gezien dalingen van meer dan 0,5 absorbantie-eenheden minder gunstig zijn voor kwantitatieve doeleinden, werd de bovengrens het werkzaam gebied voor onze methode bepaald op 46,3 ppm.

Aspartaat Transaminase: ijkcurve 1 0,9

Absorbantie (340 nm)

0,8 y = -0,0108x + 0,8995 R² = 0,9963

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

PPM

Figuur 4.5: ijkcurve Aspartaat Transaminase

35

4.6. GESIMULEERDE ASPARAGINASE METHODENEVALUATIE 4.6.1.

Situering Om na te gaan of de methoden ook toepasbaar zijn wanneer ze gebruikt worden om

de activiteit van asparaginase te bepalen, werd elke methode onderworpen aan een gesimuleerde asparaginase-activiteitsbepaling. Er werd in deze fase van methodeontwikkeling dus nog niet gewerkt met asparaginase zelf, gezien de hoge kostprijs ervan.

Figuur 4.6: schema asparaginase Steeds werden 4 verschillende stalen aangemaakt, ieder in drievoud: staal W (water), staal B (buffer), staal A (acid) en staal BSA. Het staal W volgde de bereiding zoals beschreven wordt in sectie 3.2.1. en in vorige secties geëvalueerd werden. De stalen B, A en BSA volgden het schema afgebeeld in Figuur 4.6 en de samenstelling van de stalen vindt men in Tabel 4.1. Hierdoor kan een eventuele interferentie of interactie opgespoord worden. Tabel 4.1: Staalsamenstelling

Staal W Staal B Staal A Staal BSA

Volume stock (ml) Volume BSA (µl) 0 0 2 0 2 0 2 11

Volume HCl (µl) 0 0 10 10

Volume PBS (µl) Totaal volume (ml) 0 2,21 21 2,21 11 2,21 0 2,21

36

Vooraleer het afgenomen supernatans kan worden gebruikt, moet deze verdund worden in functie van de methode gezien de verschillende werk-concentraties. Tabel 4.2 geeft de verdunningsfactoren en uiteindelijke concentraties weer. Tabel 4.2: Verdunningsreeks Protocol

Verdunningsfactor

Eindconcentratie te meten product (ppm)

Nessler

1/100

6,39

Berthelot

1/1000

0,639

Indooxine

1/100

6,18

Glutamaat Dehydrogenase

1/100

6,39

Aspartaat Transaminase

1/250

19,97

Hieronder vindt men de resultaten van de methodenevaluatie. Ieder staal werd standaard in twee- of drievoud bereid. Gemiddelden, st. dev. (standaard deviatie) en RSD (relatieve standaard deviatie) worden gegeven van de verschillende stalen, alsook de resultaten van de one-way ANOVA en Post-Hoc analyses (Tukey’s HSD (Honestly Significant Difference), Bonferroni en LSD (Least Significant Difference)). 4.6.2.

Nessler Tabel 4.3 toont de gemeten waarden van de stalen onderworpen aan de Nessler

methode. De RSD’s van deze stalen hebben een waarde die lager is dan 2,5: dit is de door ons opgelegde grens waaronder we de herhaalbaarheid als aanvaardbaar definiëren.

37

Tabel 4.3: Nessler Staal

Absorbantie425 nm

Staal W1 Staal W2 Staal W3 Staal B1 Staal B2 Staal B3 Staal A1 Staal A2 Staal A3 Staal BSA1 Staal BSA2 Staal BSA3

0,877 0,872 0,867 0,862 0,862 0,858 0,862 0,847 0,852 0,849 0,866 0,859

Statistiek Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD:

8,72E-01 5,00E-03 5,73E-01 8,61E-01 2,31E-03 2,68E-01 8,54E-01 7,64E-03 8,95E-01 8,58E-01 8,54E-03 9,96E-01

Figuur 4.7: Plot Nessler De Levene homogeniteitstest van de variantie leverde een Levene statistiek waarde op van 1,170 met significantie 0,380. Vervolgens gaf een one-way ANOVA analyse ons een F(3,8) = 4,549 met significantie 0,038. Gezien onze F-waarde statistisch significant is, kunnen we besluiten dat minstens een van de gemiddelden statistisch verschillend is van de andere. Omwille hiervan werden Post-Hoc testen uitgevoerd en deze wezen uit dat er een significant 38

verschil is tussen de staal W- en staal A-populatie (Tukey HSD, Bonferroni en LSD) en tussen de staal W- en staal BSA-populatie ( enkel LSD). Er worden 2 homogene subsets gedefinieerd, namelijk staal W-staal B-staal BSA en staal B-staal A-staal BSA. Figuur 4.7 geeft grafisch de resultaten weer. De resultaten van de Levene-, ANOVA- en Post Hoc-testen vindt men terug in Bijlage 7. 4.6.3.

Berthelot In Tabel 4.4 worden de gemeten waarden getoond van de stalen die werden

onderworpen aan de Berthelot methode. Deze stalen hebben RSD’s met een waarde die lager is dan 2,5, wat een goede herhaalbaarheid aantoont. Tabel 4.4: Berthelot Staal

Absorbantie633

Statistiek

nm

Staal W1 Staal W2 Staal W3 Staal B1 Staal B2 Staal B3 Staal A1 Staal A2 Staal A3 Staal BSA1 Staal BSA2 Staal BSA3

0,612 0,608 0,615 0,624 0,624 0,628 0,632 0,623 0,630 0,625 0,619 0,621

Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD:

6,12E-01 3,51E-03 5,74E-01 6,25E-01 2,31E-03 3,69E-01 6,28E-01 4,73E-03 7,52E-01 6,22E-01 3,06E-03 4,91E-01

39

Figuur 4.8: Plot Berthelot De Levene statistiek gaf ons een waarde 0,741 met significantie 0,557, wat ons toeliet om een ANOVA uit te voeren. Deze ANOVA resulteerde in F(3,8) = 12,800 met significantie 0,002. Met andere woorden, de vier stalen komen niet uit eenzelfde populatie. De Post-Hoc testen toonden aan dat de W-stalen statistisch significant verschillend zijn van de drie andere stalen, zoals Figuur 4.8 visueel weergeeft. De detailresultaten van de statistische testen vindt men terug in bijlage 8. 4.6.4.

Indooxine De gemeten waarden van de stalen van de indooxine methode vindt men terug in

Tabel 4.5. De waarden van de RSD’s zijn kleiner dan 2,5. De Levene statistiek had een waarde 0,075 en significantie 0,972, waardoor we een ANOVA konden uitvoeren. Deze one-way ANOVA gaf een F(3,8) = 36,975 met significantie 4,9 x 10-5. De F waarde was significant, waardoor we Post-Hoc analysesuitvoerden die aantoonden dat er een statistisch significant verschil is tussen de populatie van staal W en de andere stalen. De 2 homogene subsets

40

worden grafisch weergegeven in Figuur 4.9. De resultaten van de statistische testen vindt men terug in bijlage 9. Tabel 4.5: Indooxine Staal

Aborbantie705 nm

Staal W1 Staal W2 Staal W3 Staal B1 Staal B2 Staal B3 Staal A1 Staal A2 Staal A3 Staal BSA1 Staal BSA2 Staal BSA3

0,664 0,637 0,652 0,5701 0,5491 0,5591 0,5781 0,5641 0,5871 0,5881 0,5841 0,5691

Statistiek Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD:

6,51E-01 1,35E-02 2,08E+00 1,12E+00 2,15E-02 1,92E+00 1,15E+00 2,36E-02 2,05E+00 1,16E+00 1,99E-02 1,71E+00

1 ) Deze waarden zijn gecorrigeerde waarden, de concentratie bedroeg 12.34 ppm tov 6.18 ppm voor de waarden van referentie

Figuur 4.9: Plot Indooxine

41

4.6.5.

Glutamaat Dehydrogenase Tabel 4.6 geeft de gemeten waarden weer van de stalen van de Glutamaat

Dehydrogenase methode. Tabel 4.6: Glutamaat Dehydrogenase Staal (PPM)

Absorbantieinitieel,340 nm

Absorbantieeind, 340 nm

ΔA

Δ(ΔA)

BLANCO Staal W1 Staal W2

1,033 1,018 1,023

1,001 0,775 0,781

0,032 0,243 0,242

0,211 0,210

Staal B1 Staal B2

1,029 1,017

0,778 0,765

0,251 0,252

0,219 0,220

Staal A1 Staal A2

1,027 1,037

0,773 0,777

0,254 0,260

0,222 0,228

Staal BSA1 Staal BSA2 Staal BSA3

1,025 1,024 1,026

0,774 0,771 0,768

0,251 0,253 0,258

0,219 0,221 0,226

Statistiek Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD:

2,11E-01 7,07E-04 3,36E-01 2,20E-01 7,07E-04 3,22E-01 2,25E-01 4,24E-03 1,89E+00 2,22E-01 3,61E-03 1,62E+00

Figuur 4.10: Plot Glutamaat Dehydrogenase 42

De RSD’s van deze stalen liggen allen onder de grens van 2,5, waardoor de herhaalbaarheid aanvaardbaar is. De Levene statistiek werd gevonden op 4,246 met significantie 0,077, waardoor we een ANOVA konden uitvoeren. Deze ANOVA gaf als resultaat F(3,5) = 8,934 met significantie 0,019 , waaruit we kunnen besluiten dat niet alle stalen tot dezelfde populatie behoren. De hierop volgende Post-Hoc analyses toonden aan dat staal W hier een afwijkend gedrag vertoont. Op Figuur 4.10 kunnen deze staalresultaten visueel worden gezien. De statistische resultaten vindt men terug in bijlage 10. 4.6.6.

Aspartaat Transaminase De gemeten waarden van de Aspartaat Transaminase methode zijn terug te vinden

in Tabel 4.7. De goede herhaalbaarheid van de methode wordt aangetoond door de RSD’s van de stalen die een waarde hebben die lager ligt dan 2,5.. We voerden een ANOVA uit en deze resulteerde in F(3,4) = 75,526 met significantie 0,001, waaruit we concludeerden dat minstens één van de stalen tot een verschillende populatie behoorde. Met behulp van de daaropvolgende Post-Hoc analyses vonden we de twee variatie-populaties, namelijk staal W enerzijds en staal B-staal A-staal BSA anderzijds, zoals grafisch weergegeven in Figuur 4.11. De statistische resultaten vindt men terug in bijlage 11. Tabel 4.7: Aspartaat Transaminase Staal

Absorbantie340 nm

BLANCO Staal W1 Staal W2

1,004 0,766 0,754

Staal B1 Staal B2

0,828 0,823

Staal A1 Staal A2

0,828 0,822

Staal BSA1 Staal BSA2

0,818 0,821

Statistiek Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD: Gemiddelde: St. Dev.: RSD:

7,60E-01 8,49E-03 1,12E+00 8,26E-01 3,54E-03 4,28E-01 8,25E-01 4,24E-03 5,14E-01 8,20E-01 2,12E-03 2,59E-01

43

Figuur 4.11: Plot Aspartaat Transaminase

44

5. DISCUSSIE Met behulp van alle gegevens uit de sectie Resultaten, kunnen we nu een statistische en niet-statistische vergelijking maken van de 5 methoden, om uiteindelijk de beste methode te selecteren. 5.1. STATISTISCH Onderstaande tabel geeft de belangrijkste eigenschappen weer van de verschillende methodes, bekomen met de statistische gegevens uit de sectie Resultaten. Tabel 5.1: Statistische methodenvergelijking

Bovenlimiet Range (ppm) Herhaalbaarheid (RSD) F Lineariteit R² LoD (ppm) LoQ (ppm) Sensitiviteit

Nessler

Berthelot

Indooxine

Glutamaat Dehydrogenase

Aspartaat Transaminase

7,30

1,10

10,74

15,80

46,33

5,22E-01

3,11E-01

1,39E-00

1,15E-00

5,73E-01

1800,6 0,9989 0,073 0,30 1,37E-01

380,8 0,9922 0,049 0,082 9,43E-01

3153,1 0,9975 0,15 1,24 9,05E-02

6377,6 0,9991 0,24 0,80 -3,16E-02

1864,9 0,9963 1,44 4,80 -1,08E-02

We definieerden de bovenlimiet van het lineaire gebied (range) als de concentratie van het analyt (in ppm) die overeenstemt met 1 absorptie-eenheid, daar we er vanuit gaan dat absorbantiewaarden boven 1 minder geschikt zijn voor robuuste kwantitatieve doeleinden. Bij Glutamaat Dehydrogenase en Aspartaat Transaminase is de bovengrens gedefinieerd als de concentratie die een daling van 0,500 absorptie-eenheden veroorzaakt. De bovengrenzen werden bepaald met behulp van de lineaire vergelijking van de ijkcurve. De herhaalbaarheid werd bepaald aan de hand van de metingen die men terug vindt onder 4.6.1. De RSD’s werden berekend met behulp van de gepoolde standaarddeviatie. De concentraties waarbij dit gebeurde waren 6,37 ppm voor Nessler en Glutamaat Dehydrogenase, 0,637 ppm voor Berthelot, 6,18 ppm voor Indooxine en 20 ppm voor 45

Aspartaat Transaminase. Deze concentraties liggen ongeveer in het midden van de range. De herhaalbaarheid krijgt een waarde < 2,5 wanneer geen enkele RSD deze grens overschrijdt. De lineariteit werd beoordeeld aan de hand van 2 descriptoren, namelijk de F- en de R²-waarde. Samen geven deze waarden aan of er een sterk lineair verband is tussen de concentratie en de absorbantie bij een bepaalde golflengte. Een F-waarde groter dan 20 en een R² groter dan 0,99 zijn de vereisten. LoD (Detectielimiet) en LoQ (Kwantificatielimiet) werden berekend met behulp van de gepoolde standaard deviatie sp, berekend aan de hand van de Vergelijking (5.1): (5.1)

met de waarden die men terug vindt onder 4.6.1.2. resultaten. LoD en LoQ zijn die concentraties die overeenstemmen met 3 x sp voor LoD en 10 x sp voor LoQ en die berekend werden met behulp van de lineaire vergelijking van de ijkcurves. De sensitiviteit wordt weerspiegeld door de richtingscoëfficiënt van de ijkcurve. Hoe steiler deze curve verloopt, hoe gevoeliger de methode is. De waarden in de tabel zijn de richtingscoëfficiënten die men terug vindt op de grafieken in 4.1 tot en met 4.5, en die dus de verandering in absorbantie per ppm analyt weergeven. Zoals blijkt uit Tabel 5.1 is aan de voorwaarde van lineariteit bij iedere methode voldaan, gezien de hoge F- en R²-waarden. Geen enkel staal in geen enkel protocol heeft een RSD die hoger ligt dan 2,5, de arbitraire waarde door ons vastgelegd, waardoor we kunnen besluiten dat ieder protocol een voldoende herhaalbaarheid vertoont. De belangrijkste selectiecriteria zijn de LoQ, die bij voorkeur zo laag mogelijk ligt, en de sensitiviteit, die bij voorkeur zo hoog mogelijk dient te zijn. De selectiviteit met betrekking tot de asparaginas condities tonen aan dat voor alle methoden het waterstaal zich anders gedraagt dan de 3 andere stalen. Echter, dit hoeft geen onoverkomelijk probleem te zijn, gezien de keuze van de referentie standaard. Uit deze statistische methodenvergelijking blijkt Berthelot de laagste detectielimiet te hebben, met 46

de beste gevoeligheid. Nessler was statistisch de tweede meest geschikte methode, met het tweede laagste detectielimiet en de tweede beste gevoeligheid. Indooxine eindigt statistisch op de derde plaats , Glutamaat Dehydrogenase als vierde en Aspartaat Transaminase als vijfde. 5.2. NIET-STATISTISCH In de Tabel 5.2 vindt men een niet-statistische beoordeling van de verschillende methoden terug. Tabel 5.2: Niet-statistische methodenvergelijking Nessler Berthelot Indooxine Glutamaat Dehydrogenase Aspartaat Transaminase Aantal producten1 3 (1) 4 (2) 7 (4) 2 (1) 6 (6) Tijd 13,5 min 20 min 25,5 min 11 min 30 min Prijs 0,4064 € 0,9409 € 0,4430 € 1,8831 € 2,3158 € Moeilijkheidsgraad 1 3 6 3 13 1) De waarde tussen haakjes is het aantal reagentia dat met deze producten wordt bereid.

De parameter “Aantal producten” geeft weer hoeveel verschillende producten er nodig zijn om de nodige reagentia te bereiden, stockoplossingen en water niet inbegrepen. De waarde tussen haakjes is het aantal reagentia dat hiermee wordt bereid. De parameter “Tijd” is de tijd nodig om de proef uit te voeren. Het correct afwegen of pipetteren van 1 product wordt gerekend op een halve minuut, het bereiden van een reagens op 1 minuut. Voor verwarmen, afkoelen, schudden, etc. worden de aangegeven of werkelijke tijden in rekening gebracht. De parameter “Prijs” weerspiegelt de kost om de proef uit te voeren op 1 staal.

47

De parameter “Moeilijkheidsgraad” Vergelijking 5.2 weergegeven: (5.2) #R: het aantal gemaakte reagentia #pH: het aantal opgegeven pH-verificatie/correcties. #T: Het aantal stappen die een specifieke temperatuur vereisen #t: Het aantal stappen met een kritische tijdsduur. Deze worden een gewicht van 2 toegekend. Nessler blijkt de eenvoudige en goedkoopste methode te zijn met een relatief korte tijdsduur, waardoor deze aan de hand van de niet-statistische descriptoren als eerste keuze wordt genomen. Een tweede plaats werd toegekend aan Berthelot, met een lage moelijkheidsgraad en relatief lage kost. Glutamaat Dehydrogenase, met zijn vergelijkbare moeilijkheidsgraad ten opzichte van Berthelot maar een kostprijs die tweemaal zo hoog ligt, is volgens deze niet-statistische methodenvergelijken de derde aangewezen methode. Indooxine volgt als vierde methode en Aspartaat Transaminase maakt het lijstje af met een hoge moelijkheidsgraad en kostprijs. Samenvattend kan men stellen dat Berthelot de eerst aangewezen keuze is, daar de statistische eigenschappen zwaarder doorwegen dan de niet-statistische, gevolgd door Nessler. Indooxine krijgt de derde plaats toebedeeld, daar deze statistisch iets beter is dan Glutamaat Dehydrogenase door de lagere LoD en betere gevoeligheid. De minst aangewezen keuze van deze methodenvergelijking is de Aspartaat Transaminase methode.

48

6. ALGEMEEN BESLUIT Voor ieder van de vijf asparaginase activitetisbepalingsmethoden is een protocol opgesteld en geëvalueerd. In principe zijn alle methoden geschikt om opgenomen te worden in de verdere onderzoeksfase naar de activiteit en stabiliteit van asparaginase. Verscheidene statistische en niet-statistische selectiecriteria werden opgesteld en geëvalueerd, teneinde een finaal protocol te kiezen. Aan de hand van alle beschikbare gegevens, en het orthogonaliteitsprincipe verwaarlozend, hebben we de keuze laten vallen op zowel Nessler als Berthelot. De Berthelot methode vertoont de laagste LoQ en de hoogste sensitiviteit. Dit laat ons toe minieme wijzigingen in concentratie met hoge nauwkeurigheid te detecteren. Daardoor is deze methode uiterst geschikt om op te nemen in de latere stabiliteitsstudies, daar kleine veranderingen in de stabiliteit van het enzym mogelijks kleine verschillen in enzymactiviteit kunnen teweegbrengen. De lineariteit en herhaalbaarheid voldoen aan onze vooropgestelde eisen en de niet statistische kenmerken maken van deze methode een snelle, gemakkelijke en relatief goedkope kwantitatieve test. Deze criteria samen maken van Berthelot de voor ons meest geschikte methode. De Nessler methode wordt als tweede methode gekozen gezien deze methode de tweede laagste LoQ en tweede hoogste sensitiviteit heeft, waardoor we met deze methode reeds lage concentraties kunnen detecteren, alsook kleine stijgingen in concentratie kunnen waarnemen. Deze methode heeft een lagere kostprijs, moeilijkheidsgraad en tijdsduur dan Berthelot. Door deze eigenschappen, samen met het hogere bovenlimiet waardoor concentraties hoger dan 1,1 ppm kunnen worden bepaald, hebben er toe geleid dat ook deze methode in de verdere stabiliteitsstudies kan worden opgenomen.

49

7. LITERATUURLIJST

Afkhami, A.; Norooz-Asl, R. (2008). Micelle-Mediated Extraction and Spectrophotometric Determination of Ammonia in Water Samples utilizing Indophenol Dye Formation. Journal of the Brazilian Chemical Society, 19, 1546-1552. Aghaiypour, K.; Wlodawer, A.; Lubkowski, J. (2001). Do bacterial L-asparaginases utilize a catalytic triad Thr-Tyr-Glu? Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1550, 117-128. Albertsen, B. K.; Schroder, H.; Jakobsen, P.; Avramis, V. I.; Muller, H. J.; Schmiegelow, K.; Carlsen, N. T. (2002). Antibody formation during intravenous and intramuscular therapy with Erwinia asparaginase. Med Pediatr Oncol, 38, 310-316. Avramis, V. I.; Martin-Aragon, S.; Avramis, E. V.; Asselin, B. L. (2007). Pharmacoanalytical assays of Erwinia asparaginase (erwinase) and pharmacokinetic results in high-risk acute lymphoblastic leukemia (HR ALL) patients: simulations of erwinase population PK-PD models. Anticancer Res, 27, 2561-2572. Benjwal, S.; Verma, S.; Rohm, K. H.; Gursky, O. (2006). Monitoring protein aggregation during thermal unfolding in circular dichroism experiments. Protein Sci, 15, 635-639. Boos, J.; Werber, G.; Ahlke, E.; Schulze-Westhoff, P.; Nowak-Gottl, U.; Wurthwein, G.; Verspohl, E. J.; Ritter, J.; Jurgens, H. (1996). Monitoring of asparaginase activity and asparagine levels in children on different asparaginase preparations. Eur J Cancer, 32A, 1544-1550. Bruylants, G.; Wouters, J.; Michaux, C. (2005). Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem, 12, 2011-2020. Cammack, K. A.; Marlborough, D. I.; Miller, D. S. (1972). Physical properties and subunit structure of L-asparaginase isolated from Erwinia carotovora. Biochem J, 126, 361379. Demuthkaya, L. N.; Kalinichenko, I. E. (2006). Interaction of aliphatic polyamines with Nessler reagent. Journal of Analytical Chemistry, 61, 1063-1066. Drainas, D.; Drainas, C. (1985). A conductimetric method for assaying asparaginase activity in Aspergillus nidulans. Eur J Biochem, 151, 591-593.

50

Edman, P. (1949). A method for the determination of amino acid sequence in peptides. Arch Biochem, 22, 475. EPA Method 350.2. (1974). Nitrogen, ammonia (colorimetric, titrimetric, potentiometric, distillation procedure). Franklin Township Municipal Sanitary Authority. (2006). Laboratory standard operating procedures. Frear, D. S.; Burrell, R. C. (1955). Spectrophotometric Method for Determining Hydroxylamine Reductase Activity in Higher Plants. Analytical Chemistry, 27, 16641665. Gupta, M. K.; Subramanian, V.; Yadav, J. S. (2009). Immunoproteomic identification of secretory and subcellular protein antigens and functional evaluation of the secretome fraction of Mycobacterium immunogenum, a newly recognized species of the Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group. J Proteome Res, 8, 2319-2330. Han, J.; Sheng, L. S.; Yang, Z. Y.; Xiang, B. R.; An, D. K. (2001). [High performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric characterization of recombinant L-asparaginase II]. Yao Xue Xue Bao, 36, 46-50. http://www.cancer.org/Cancer/LeukemiainChildren/OverviewGuide/childhood-leukemiaoverview-what-is-childhood-leukemia (14/02/2011) https://www.msu.edu/~gallego7/MassSpect/MSandPMM.htm (23/02/2011) http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/aa0100bul.Par.0001.File.t mp/aa0100bul.pdf (28/03/2011) http://www.skion.nl/kbk/leukemieen (14/02/2011) Khushoo, A.; Pal, Y.; Singh, B. N.; Mukherjee, K. J. (2004). Extracellular expression and single step purification of recombinant Escherichia coli L-asparaginase II. Protein Expr Purif, 38, 29-36. Kravchenko, O. V.; Kislitsin, Y. A.; Popov, A. N.; Nikonov, S. V.; Kuranova, I. P. (2008). Threedimensional structures of L-asparaginase from Erwinia carotovora complexed with aspartate and glutamate. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 64, 248-256.

51

Lanvers, C.; Vieira Pinheiro, J. P.; Hempel, G.; Wuerthwein, G.; Boos, J. (2002). Analytical validation of a microplate reader-based method for the therapeutic drug monitoring of L-asparaginase in human serum. Anal Biochem, 309, 117-126. Lau, K. T.; Edwards, S.; Diamond, D. (2004). Solid-state ammonia sensor based on Berthelot's reaction. Sensors and Actuators B-Chemical, 98, 12-17. Leonard (1963). Quantitative Range of Nessler's Reaction with Ammonia. Clinical Chemistry, 9, 417-422. Lorenzi, P. L.; Llamas, J.; Gunsior, M.; Ozbun, L.; Reinhold, W. C.; Varma, S.; Ji, H.; Kim, H.; Hutchinson, A. A.; Kohn, E. C.; Goldsmith, P. K.; Birrer, M. J.; Weinstein, J. N. (2008). Asparagine synthetase is a predictive biomarker of L-asparaginase activity in ovarian cancer cell lines. Mol Cancer Ther, 7, 3123-3128. Lubkowski, J.; Dauter, M.; Aghaiypour, K.; Wlodawer, A.; Dauter, Z. (2003). Atomic resolution structure of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 59, 84-92. Lubkowski, J.; Palm, G. J.; Gilliland, G. L.; Derst, C.; Rohm, K. H.; Wlodawer, A. (1996). Crystal structure and amino acid sequence of Wolinella succinogenes L-asparaginase. Eur J Biochem, 241, 201-207. Maita, T.; Morokuma, K.; Matsuda, G. (1979). Amino acid sequences of the tryptic peptides from carboxymethylated L-asparaginase from Escherichia coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem, 360, 1483-1495. Moliner-Martinez, Y.; Herraez-Hernandez, R.; Campins-Falco, P. (2005). Improved detection limit for ammonium/ammonia achieved by Berthelot's reaction by use of solid-phase extraction coupled to diffuse reflectance spectroscopy. Analytica Chimica Acta, 534, 327-334. Moorthy, V.; Ramalingam, A.; Sumantha, A.; Shankaranaya, R. T. (2010). Production, purification and characterisation of extracellular L-asparaginase from a soil isolate of Bacillus sp. African Journal of Microbiology Research, 4, 1862-1867. Nath, C. E.; Dallapozza, L.; Eslick, A. E.; Misra, A.; Carr, D.; Earl, J. W. (2009). An isocratic fluorescence HPLC assay for the monitoring of l-asparaginase activity and lasparagine depletion in children receiving E. colil-asparaginase for the treatment of acute lymphoblastic leukaemia. Biomed Chromatogr, 23, 152-159.

52

Papageorgiou, A. C.; Posypanova, G. A.; Andersson, C. S.; Sokolov, N. N.; Krasotkina, J. (2008). Structural and functional insights into Erwinia carotovora L-asparaginase. FEBS J, 275, 4306-4316. Pieters, R.; Hunger, S. P.; Boos, J.; Rizzari, C.; Silverman, L.; Baruchel, A.; Goekbuget, N.; Schrappe, M.; Pui, C. H. (2011). L-asparaginase treatment in acute lymphoblastic leukemia: a focus on Erwinia asparaginase. Cancer, 117, 238-249. Pritsa, A. A.; Kyriakidis, D. A. (2001). L-asparaginase of Thermus thermophilus: purification, properties and identification of essential amino acids for its catalytic activity. Mol Cell Biochem, 216, 93-101. Randolph, T. R. (2004). Advances in acute lymphoblastic leukemia. Clin Lab Sci, 17, 235-245. Sapan, C. V.; Lundblad, R. L.; Price, N. C. (1999). Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appl Biochem, 29 ( Pt 2), 99-108. Scotti, C.; Sommi, P.; Pasquetto, M. V.; Cappelletti, D.; Stivala, S.; Mignosi, P.; Savio, M.; Chiarelli, L. R.; Valentini, G.; Bolanos-Garcia, V. M.; Merrell, D. S.; Franchini, S.; Verona, M. L.; Bolis, C.; Solcia, E.; Manca, R.; Franciotta, D.; Casasco, A.; Filipazzi, P.; Zardini, E.; Vannini, V. (2010). Cell-cycle inhibition by Helicobacter pylori Lasparaginase. PLoS One, 5, e13892. Searcy, R. L.; Simms, N. M.; Foreman, J. A.; Bergquist, L. M. (1965). A study of the specificity of the Berthelot colour reaction. Clin Chim Acta, 12, 170-175. Shifrin, S.; Grochowski, B. J. (1972). L-Asparaginase from escherichia coli B. Succinylation and subunit interactions. J Biol Chem, 247, 1048-1054. Stecher, A. L.; de Deus, P. M.; Polikarpov, I.; Abrahao-Neto, J. (1999). Stability of Lasparaginase: an enzyme used in leukemia treatment. Pharm Acta Helv, 74, 1-9. Swain, A. L.; Jaskolski, M.; Housset, D.; Rao, J. K.; Wlodawer, A. (1993). Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 1474-1478. Tuncel, N. B.; Yilmaz, N.; Sener, E. (2010). The effect of pea (Pisum sativum L.)-originated asparaginase on acrylamide formation in certain bread types. International Journal of Food Science and Technology, 45, 2470-2476. Verma, N.; Kumar, K.; Kaur, G.; Anand, S. (2007). L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent. Crit Rev Biotechnol, 27, 45-62.

53

Vrooman, L. M.; Supko, J. G.; Neuberg, D. S.; Asselin, B. L.; Athale, U. H.; Clavell, L.; Kelly, K. M.; Laverdiere, C.; Michon, B.; Schorin, M.; Cohen, H. J.; Sallan, S. E.; Silverman, L. B. (2010). Erwinia asparaginase after allergy to E. coli asparaginase in children with acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Blood Cancer, 54, 199-205. Wehner, A.; Harms, E.; Jennings, M. P.; Beacham, I. R.; Derst, C.; Bast, P.; Rohm, K. H. (1992). Site-specific mutagenesis of Escherichia coli asparaginase II. None of the three histidine residues is required for catalysis. Eur J Biochem, 208, 475-480. Wilkinson, J. H.; Baron, D. N.; Moss, D. W.; Walker, P. G. (1972). Standardization of clinical enzyme assays: a reference method for aspartate and alanine transaminases. J Clin Pathol, 25, 940-944. Wriston, J. C., Jr. (1985). Asparaginase. Methods Enzymol, 113, 608-618. Yao, M.; Yasutake, Y.; Morita, H.; Tanaka, I. (2005). Structure of the type I L-asparaginase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii at 2.16 angstroms resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 61, 294-301.

54

BIJLAGE 1

Species Δ

Type

KM

Specifieke activiteit

(mM)

(µmol/min/mg)

Optimale temperatuur (°C)

Moleculair gewicht Optimale pH

Referentie (dalton)

BACTERIE Proteobacteriën Enterobacter cloacae

Verma et al., 2007

Erwinia aroidae

II

Lubkowski et al., 1996

Erwinia carotovora

II

Lubkowski et al., 1996

Erwinia chrisanthemi

II

Lanvers et al., 2002

Escherichia coli

II

Lanvers et al., 2002

Helicobacter pylori

0,29

7

140000

Photobacterium leiognathi Photobacterium phosphoreum

Scotti et al., 2010 Verma et al., 2007 Verma et al., 2007

Proteus Vulgaris

0,026

300

57

7

Wriston et al., 1985

Pseudomonas fluorescens

II

Lubkowski et al., 1996

Pseudomonas ovalis

II

Lubkowski et al., 1996

Pseudomonas Stutzeri

II

0,145

132,3

0,1

226

37

9

132000

8,5

147000

Salmonella enterica Serratia marcenscens Vibrio fisheri

Lubkowski et al., 1996 Verma et al., 2007 Verma et al., 2007 Verma et al., 2007

Vibrio harveyi

Verma et al., 2007

Vibrio succinogenes

Moorthy et al., 2010

Wolinella succinogenes

II

0,0478

202

7,3

146000

Lubkowski et al., 1996

Firmicutes Bacillus mesentericus

Verma et al., 2007

Brevibacillus brevis

Verma et al., 2007

Staphylococcus sp.-6A

8,6

Verma et al., 2007

Deinococcus-thermus Thermus aquaticus Thermus thermophilus

Verma et al., 2007 2,8

840

9,2

200000

Pritsa et al., 2001

Ciliophora Tetrahymena pyriformis

Pritsa et al., 2001

Actinobacteriën Mycobacterium phlei Nocardia asterodies Streptomyces karnatakensis Streptomyces longsporusflavus Streptomyces venezualae

0,7

Verma et al., 2007 Verma et al., 2007 Moorthy et al., 2010 Verma et al., 2007 Moorthy et al., 2010

SCHIMMEL Ascomycota Candida utilis

Verma et al., 2007

Aspergillus nidulans

Verma et al., 2007

Aspergillus niger

Tuncel et al., 2010

Aspergillus oryzae

Tuncel et al., 2010

Aspergillus tamari

Moorthy et al., 2010

Aspergillus terreus Saccharomyces cerevisiae

Verma et al., 2007 I

0,74

6,5

Verma et al., 2007

II

0,35

6,8

Verma et al., 2007

Basidiomycota Rhodosporidium toruloides

Verma et al., 2007

Rhodotorula rubra

Verma et al., 2007

PLANT Angiosperm Verma et al., 2007

Arabidopsis thaliana Lupinus angustifolius

8,5

150000

Lupinus angustiplius

Verma et al., 2007 Verma et al., 2007

Lupinus araboreus

6,6

150000

Verma et al., 2007

Lupinus arborens

Verma et al., 2007

Lupinus luteus

Verma et al., 2007

Lupinus polyphylus

12,2

1,65

144000

Phaseolus multiflorus

Verma et al., 2007 Tuncel et al., 2010

Pisum sativum

3,2

136600

Tuncel et al., 2010

Vicia faba

Tuncel et al., 2010

Zea mays

Tuncel et al., 2010

Pinophyta Pinus pinaster

Verma et al., 2007

Pinus radiata

Verma et al., 2007

Bryophyta Sphagnum fallax

I

7,4

Verma et al., 2007

BIJLAGE 2 Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie Absorbantiena cuvetcorrectie 0,5 1 3 5

0,064 0,144 0,474 0,673

0,063 0,144 0,424 0,679

Nessler : gestandaardiseerde residuen plot 1,5

Standard Residuals

1 0,5 0 -0,5 -1 -1,5 0

1

2

3 PPM

4

5

6

BIJLAGE 3 Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie 0,1 0,2 0,5 0,5 1 3 5

Absorbantiena cuvetcorrectie

0,055 0,169 0,526 0,396 0,906 2,779 3,709

0,054 0,169 0,476 0,396 0,912 2,78 3,704

Berthelot: gestandaardiseerde residuen plot 1,5

Standard Residuals

1 0,5 0 -0,5 -1 -1,5 -2 0

0,2

0,4

0,6 PPM

0,8

1

1,2

BIJLAGE 4 Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Absorbantiena cuvetcorrectie

0,093 0,221 0,319 0,452 0,47 0,571 0,675 0,758 0,832 0,927

0,093 0,219 0,316 0,399 0,472 0,571 0,68 0,757 0,832 0,925

Indooxine: gestandaardiseerde residuen plot 1,5 1

Standard Residuals

0,5 0 -0,5 -1 -1,5 -2 -2,5 0

2

4

6 PPM

8

10

12

BIJLAGE 5 Concentratie (ppm) Ainitieel, voor cuvetcorrectie Ainitieel, na cuvetcorrectie 0 0,5 1 3 5 10 15 20

1,027 1,029 1,029 1,085 1,028 1,026 1,028 1,027

1,027 1,028 1,029 1,035 1,036 1,027 1,033 1,032

Aeind, voor cuvetcorrectie

Aeind, na cuvetcorrectie

0,991 0,984 0,966 0,964 0,844 0,682 0,510 0,364

0,991 0,983 0,966 0,914 0,850 0,683 0,515 0,372

Glutamaat Dehydrogenase: gestandaardiseerde residuen plot 1,5

Standard Residuals

1 0,5 0 -0,5 -1 -1,5 -2 0

5

10

15 PPM

20

25

BIJLAGE 6 Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie Absorbantiena cuvetcorrectie 0 5 10 15 20 25 30 35 40

0,915 0,844 0,843 0,726 0,69 0,627 0,615 0,515 0,475

0,913 0,833 0,788 0,729 0,696 0,631 0,577 0,515 0,473

Aspartaattransaminase: gestandaardiseerde residuen plot 2 1,5 Standard Residuals

1 0,5 0 -0,5 -1 -1,5 -2 0

5

10

15

20

25 PPM

30

35

40

45

BIJLAGE 7

BIJLAGE 8

BIJLAGE 9

BIJLAGE 10

BIJLAGE 11