MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Zahradnická fakulta v Lednici
VLIV SACHARIDŮ NA RŮSTOVÉ A BIOSYNTETICKÉ SCHOPNOSTI DIONAEA MUSCIPULA Ell. PŘI KULTIVACI IN VITRO Bakalářská práce
Vedoucí bakalářské práce
Vypracovala
Prof. RNDr. Ladislav Havel, CSc.
Marcela Nejezchlebová roz. Chramostová v 1. manželství Kohoutová
Lednice 2009
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma
Vliv
sacharidů
na
růstové
a biosyntetické schopnosti Dionaea muscipula Ell. při kultivaci in vitro vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Lednici, dne 13. 7. 2009
Podpis:
Poděkování Děkuji prof. RNDr. Ladislavu Havlovi za přečtení práce a za cenné připomínky. Díky patří i PharmDr. Petru Babulovi za poskytnutí literatury a Ing. Emilu Švajdlenkovi za provedení HPLC analýzy. Děkuji také Heleně Navrátilové za neocenitelnou pomoc při provádění experimentu.
OBSAH
1.
ÚVOD…………………………………………………………………………...7
2.
CÍL PRÁCE…………………………………………………………………....8
3.
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY……………………….. 9
3.1
Teoretická část………………………………………………………………….9
3.1.1 Botanická charakteristika Dionaea muscipula Ell. a její kultivary…………9 3.1.2 Obsahové látky Dionaea muscipula Ell……………………………………....14 3.1.3 Terapeutické a insekticidní účinky naftochinonů a jejich využití………….17 3.2
Kultivace in vitro……………………………………………………………....22
3.2.1 Základní pojmy, principy a využití………………………………………….22 3.2.2 Kultivační média……………………………………………………………....26 3.2.3 Sacharidy v médiu…………………………………………………………….27 3.2.3.1 Vliv nutriční a regulační……………………………………………………....27 3.2.3.2 Vliv na sekundární metabolismus……………………………………………..28 3.2.3.3 Hydrolýza sacharidů a pH média……………………………………………...29 3.2.3.4 Vodní a osmotický potenciál…………………………………………………...29 3.3
Analytické metody………………………………………………………….....30
3.3.1
Vysokoúčinná plynová chromatografie – HPLC………………………….. .30
4.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST……………………………………………….. 32
4.1
Použitý materiál…………………………………………………………….....32
4.1.1 Rostlinný materiál…………………………………………………………......32 4.1.2 Chemikálie……………………………………………………………………..32 4.1.3 Použité přístroje a ostatní vybavení……………………………………….....32
4.2
Metodika práce………………………………………………………………..33
4.2.1 Příprava kultivačních médií a uspořádání pokusu…………………………33 4.2.2 Metodika práce se sterilním rostlinným materiálem……………………….35 4.2.3 Podmínky kultivace…………………………………………………………...35 4.2.4 Odběr vzorků a příprava extraktu pro analýzu…………………………….35 4.2.5 Analýza metanolického extraktu……………………………………………..36 4.2.5.1 HPLC analýza plumbaginu…………………………………………………....36 4.3
Statistické metody……………………………………………………………..37
5.
VÝSLEDKY A DISKUSE…………………………………………………..37
5.1
Morfologické a anatomické zhodnocení explantátů po kultivaci…………..37
5.2
Nárůst čerstvé hmotnosti explantátů po kultivaci…………………………..42
5.3
Sušina…………………………………………………………………………..44
5.4
Obsah plumbaginu v extraktu z Dionaea muscipula………………………..45
5.5
Obsah plumbaginu v sušině…………………………………………………..46
6.
ZÁVĚR………………………………………………………………………...47
7.
SOUHRN A RESUME………………………………………………………50
8.
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY……………………………………...51
1.
ÚVOD
Rostliny mají nezastupitelné místo v životě člověka. Člověk je používá jako potravu, koření, pro aroma, pro léčivé účinky i pro jejich krásu. Otázkou, jak léčit pomocí rostlin se člověk zabývá od nepaměti. Nově objevené obsahové látky využitelné ve farmacii mohou být z rostlin buď přímo izolovány a použity, nebo struktura těchto látek slouží jako předloha pro výrobu jejich syntetických analogů. Zkoumání biologicky aktivních látek, vyskytujících se v rostlinách vedlo člověka k nutnosti poznávat, jakými způsoby tyto látky vznikají, tedy k objasňování metabolických cest v rostlinách. Produkty sekundárního metabolismu jsou využitelné nejenom v humánní i veterinární medicíně, ale jsou sledovány i z hlediska jejich allelopatického a insekticidního účinku, který by mohl být využit v zemědělství. Produkce sekundárních metabolitů v rostlině kolísá a je ovlivněna klimatickými a půdními podmínkami, sušením a způsobem skladování. Jednou z možností, jak optimalizovat a unifikovat růstové podmínky a následně i lépe statisticky vyhodnotit je využití kultivace rostlin in vitro. V této práci jsem se pokusila o rozšíření poznatků o pozoruhodné masožravé rostlině Dionaea muscipula Ell., mucholapka podivná, která byla poprvé popsána botanikem Johnem Ellisem roku 1769. Rostlina dostala své jméno podle řecké bohyně lovu Diany. Mezi hlavní obsahové látky této rostliny patří naftochinony. Jsou to sekundární metabolity celé řady rostlinných čeledí, jako jsou Avicenniaceae, Bignoniaceae, Boraginaceae,
Droseraceae,
Ebenaceae,
Juglandaceae,
Nepenthaceae,
Plumbaginaceae. Byly rovněž detekovány u aktinomycet (Streptomyces), některých hub (Fusarium,Verticillium), lišejníků a řas. Naftochinony se vyznačují celým spektrem biologických aktivit, vykazují cytotoxické, antibakteriální, fungicidní, antiparazitální a insekticidní vlastnosti. Některé naftochinony, zejména juglon, nalézající se především v ořešáku (Juglans), jsou studovány z hlediska jejich allelopatického působení. Náplní této práce bylo sledování vlivu primárního metabolismu na obsah sekundárních metabolitů, především plumbaginu. Nedílnou součástí práce byla i optimalizace experimentu
z hlediska
jednotlivých kroků
následného
statistického
při přípravě extraktů.
7
vyhodnocení
a
optimalizace
2.
CÍL PRÁCE
Cílem předložené práce bylo:
• Optimalizace kultivace Dionaea muscipula Ell. in vitro • Sledování vlivu různých sacharidů v kultivačním médiu na růst a morfologii Dionaea muscipula Ell. kultivované in vitro. • Stanovení
obsahu
plumbaginu
v
extraktech
vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). • Statistické vyhodnocení
8
Dionaea
muscipulaEll.
3.
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
3.1
Teoretická část
3.1.1 Botanická charakteristika Dionaea muscipula Ell. a její kultivary
Dionaea muscipula Ellis, (mucholapka podivná) se stala v 19. století první rostlinou, u které byla prokázána „masožravost“. „Masožravost“ se vyvinula nezávisle u několika vzájemně nepříbuzných linií rostlin. Tyto rostliny označujeme také jako rostliny karnivorní, což označuje schopnost lapat živočichy a získávat z jejich těl živiny. Tato schopnost je adaptací na prostředí velmi chudé na živiny, především dusík. S těmito rostlinami se můžeme setkat především na rašeliništích, vřesovištích a v tropických pralesích. Masožravé rostliny jsou typickým reprezentantem organismů s mixotrofním způsobem výživy. Mixotrofie je přechodná forma výživy mezi výživou autotrofní a heterotrofní. Můžeme sem zařadit všechny způsoby, jimiž autotrofní zelené rostliny doplňují svou výživu, a to jak látkami organickými, tak minerálními. Zdroji této výživy jsou nejčastěji hmyz, který rostlina nejprve usmrcuje (masožravé rostliny) a organizmy, se kterými rostlina žije v symbióze (PROCHÁZKA A KOL., 2003). Masožravé rostliny se vyživují autotrofně, ale jejich vegetativní orgány jsou uzpůsobeny k lapání hmyzu. Po „ulovení“ kořisti dochází následně k aktivaci trávících enzymů, které jsou produkovány samotnou rostlinou nebo mikroorganismy žijícími s rostlinou v symbióze. Těla kořistí jsou rozložena na organické a anorganické látky, které již mohou rostliny přijmout a využít. Výživa masožravých rostlin je takto doplňována především o dusík, fosfor a draslík (JEŽEK, 1997). Podle odhadu existuje kolem 600 druhů masožravých rostlin, řazených do 16 rodů a 6 čeledí Nejvýznamnější rody jsou Aldrovanda, Brocchinia, Byblis, Catopsis, Cephalotus, Darlingtonia, Dionaea, Drosera, Drosophyllum, Genlisea, Heliamphora, Nepenthes, Pinguicula, Sarracenia, Utricularia (ŠVARC, 2003). Farmaceuticky nejvíce probádanou čeledí je čeleď Droseraceae. Čeleď Droseraceae, která je řazena mezi rostliny krytosemenné (Magnoliophyta), dvouděložné (Magnoliopsida), zahrnuje v současnosti vytrvalé byliny patřící mezi
9
4 rody. Hlavní oblastí výskytu této čeledi je převážně mírný pás Evropy, Severní Ameriky, subtropické oblasti Austrálie a Afriky a tropický pás Jižní Ameriky. Jedná se především o rostliny rašeliništní a bahenní, vzácně také vodní. Ojediněle se vyskytují na území České republiky, hlavně v oblasti Třeboňské pánve. Nejhojnějším rodem této čeledi je rod Drosera L., s přibližně 130 druhy (KUBÁT, 2002). Dalšími rody jsou Dionaea Ell. a Drosophyllum Lk. Květy rostlin této čeledi jsou oboupohlavné, vesměs pětičetné. Jsou různoobalné, rozlišeny na kalich a korunu. Andreceum je tvořeno pěti tyčinkami, vzácně i 20. Gyneceum je synkarpní, svrchní, tvořeno třemi, vyjímečně až pěti plodolisty. Rostliny jsou zpravidla cizosprašné. Opylovány jsou nejčastěji hmyzem. Plodem je tobolka obsahující několik až mnoho semen (ŠVARC, 2003). Dionaea muscipula Ell., která je jediným zástupcem rodu Dionaea, se v přírodě vyskytuje v Severní Americe (USA), ve státě Jižní Karolína. Osidluje zde krátkostébelná ostřicová a travnatá společenstva na slatiništích a mokřadech (pH 3-5). Rostliny vytváří přízemní růžici o průměru 7 až 14 cm. Listy se skládají z křídlatě rozšířeného řapíku s asimilační funkcí a z lapací čepele. Rostliny jsou v substrátu ukotveny pomocí drátovitých, černých kořenů, které vyrůstají z cibulovitého útvaru zapuštěného až 10 cm pod povrchem. Tento útvar je sestaven ze zduřelých bází listových řapíků a napomáhá rostlinám přezimovat, přestát příležitostné vyschnutí stanoviště, případně požár (obr. 2). Velikost a šířka řapíku se v průběhu roku mění. V době nedostatku světla a kořisti (podzim a zima) je řapík vyvinut tak, aby jeho asimilační plocha byla co největší, čepele jsou v této době malé a nepříliš funkční. Tento typ olistění je označován jako typ zimní. V letním období slouží dlouhý a zúžený řapík především jako nosič čepele - pasti. Jde o letní typ olistění. Maximální rozměr čepele je 3 cm. Je přehnuta kolem hlavní žilky tak, že její poloviny svírají úhel 40° až 50°. Po obvodu čepele jsou dlouhé, špičaté a tuhé výrůstky, které po sklapnutí čepele zabraňují kořisti v úniku. Při okraji čepele se nachází vábící nektarové žlázy, zapuštěné v pokožce. Na každé polovině čepele se nachází zpravidla tři citlivé chlupy, které jsou vlastním signalizačním zařízením pro spuštění pohybu čepele (obr. 3). Samotné sklapnutí „čelistí“ trvá za optimálních podmínek méně než 0,5 sekundy. Po prudkém sevření obou polovin čepele jejich svíravý pohyb pomalu pokračuje a v případě, že byla lapena kořist, začíná proces trávení. Rostlinou jsou vylučovány trávící enzymy, jejímž účinkem je kořist postupně natravována. Následné vstřebávání živin pak probíhá po dobu 7 až 10 dnů pomocí nasávacích žlázek, které jsou rozmístěny 10
na vnitřním povrchu obou částí čepele. Pro sevření čepele je nutné, aby se potenciální kořist dotkla jednoho nebo více chlupů opakovaně v intervalu několika málo sekund. Tímto důmyslným mechanismem se rostliny brání proti zbytečnému uvádění lapacího mechanismu do pohybu. V přírodě rostliny vykvétají koncem května až začátkem června. Květy jsou pětičetné, bílé, asi 1,5 cm velké, uspořádané v hustých květenstvích, rostoucích na stvolech 20 až 30 cm vysokých (obr.1). Černá, hruškovitá semena jsou přibližně 0,5 mm velká, dozrávají v zelených tobolkách v průběhu 6 až 8 týdnů (ŠVARC, 2003).
Obr. 1: Květ
Obr. 2: Podzemní část s kořeny
Obr. 3: Část čepele s chlupy
Do dnešní doby bylo vyšlechtěno již více než 50 atraktivních kultivarů mucholapek, které se liší barvou (celozelené, žlutooranžové, celočervené), tvarem listové růžice (robustní, trpasličí), typem olistění (pouze letní, pouze zimní, letní i zimní) nebo tvarem obvodových výrůstků čepele (krátké, dlouhé apod.). Mezinárodní společnost pro masožravé rostliny ICPS (The International Carnivorous Plant Society) registruje jednotlivé kultivary mucholapky, jejich podrobnější popis poskytuje časopis CPN (Carnivorous Plant Newsletter). V České republice jsou dostupné tyto kultivary : Dionaea muscipula cv. Regular Form čepele se na slunci barví do ruda, aktivní čepele o velikosti 3-5 cm, průměr listových růžic až 20 cm, letní i zimní typ olistění. Přirozený výskyt v Jižní Karolíně (USA). Obr. 4: 11
cv. Regular Form
Dionaea muscipula cv. Akai Ryu celočervený kultivar s průměrem růžic do 20 cm a čepelemi velkými 3-5 cm. Na plném slunci jsou rostliny zcela tmavě rudé.
Obr. 5:
cv. Akai Ryu
Obr. 6:
cv. All Green Form
Obr. 7:
cv. Royal Red
Dionaea muscipula cv. All Green Form Zelený kultivar, na slunci se zbarvuje spíše do žluta. Čepele nikdy nečervenají. Velikost čepele 2-4 cm, průměr listových růžic až 20 cm, letní a zimní typ olistění je výrazně odlišný.
Dionaea muscipula cv. Royal Red Celočervený
kultivar
s tmavě
červenými
řapíky
a čepelemi o velikosti 2-4 cm. Průměr listových růžic je až 20 cm.
Dionaea muscipula cv. Dentate ( známá také jako Shark Teeth, Tiger Sharks Teeth) Kultivar se zkrácenými špičatými trojúhelníkovitými výrůstky (podobné žraločím zubům), čepele jsou 3-5 cm velké, růžice dosahují průměru až 20 cm.
12
Dionaea muscipula cv. Fine Tooth x Red Zajímavý kultivar s oválnějšími a rudými pastmi, které dosahují velikosti 2-4 cm. Typické jsou velmi dlouhé výrůstky.
Obr. 9:
cv. Fine Tooth x red
Dionaea muscipula cv. Red Purple Čepel je velká až 5 cm, na slunci se barví do červena. Průměr růžic listů je do 20 cm.
Obr. 10:
cv. Red Purple
Obr. 11:
cv. Red Jaws
Obr. 12:
cv. Dingley Giant
Dionaea muscipula cv. Red Jaws vyznačuje se krásně rudými čepelemi a výraznými a delšími výrůstky. Velikost čepele je maximálně 4 cm, průměr listových růžic do 20 cm.
Dionaea muscipula cv. Dingley Giant robustní kultivar, čepele jsou 3-5 cm velké, přičemž bývá uváděno, že listové růžice mohou dosahovat průměru až 30 cm.
13
Dionaea muscipula cv. Minutissimum miniaturní forma mucholapky o velikosti růžic pouhé 2-3 cm a s čepelemi velikými kolem 0,5 cm, vytvářejí kompaktní porost.
Obr.13:
cv. Minutissimum
3.1.2 Obsahové látky Dionaea muscipula Ell. Naftochinony tvoří nejvýznamnější skupinu obsahových látek. V methanolickém extraktu Dionaea muscipula Ell. byl prokázán plumbagin (2-methyljuglon), 3-hydroxyplumbagin(droseron),
hydroplumbagin-4-O-β-glukopyranosid,
3-chloroplumbagin (KREHER, NESZMELYI, WAGNER, 1990). Izolací z rostlin pěstovaných
in vitro byl získán 8,8´-biplumbagin (PAKULSKI, BUDZIANOWSKI,
1996). V čerstvých listech a kořenech se v malém množství nachází dvě látky fenolického charakteru, diomuscinon a diomuscipulon, biogeneticky příbuzné naftochinonům (MIYOSHI, SHIZURY, YAMAMURA, 1984), (obr.14).
Obr. 14: Vzorce naftochinonů a příbuzných látek obsažených v Dionaea muscipula
14
Z flavonoidů jsou v Dionaea muscipula obsaženy glykosidicky vázané flavonoly kvercetin a kempferol (PAKULSKI, BUDDZIANOWSKI, 1996), (obr.15).
Obr. 15: Vzorce flavonoidů izolovaných z Dionaea muscipula
V rostlinách se nachází také látky steroidní povahy. V kořenech byla zjištěna přítomnost cholesterolu a β-sitosterolu, v listech se vedle cholesterolu a β-sitosterolu vyskytuje stigmasterol (GERSHBEIN, BROWN, HOPPESCH, YOUNG, 1995), (obr.16).
Obr. 16: Vzorce látek steroidní povahy nacházejících se v Dionaea muscipula
15
Spolu s kyselinou ellagovou byly z extraktu izolovány
i její deriváty:
(PAKULSKI, BUDDZIANOWSKI, 1996), (obr.17).
Obr. 17: Vzorce kyseliny ellagové a jejích derivátů izolovaných z Dionaea muscipula
Z hydrolytických enzymů mají pro trávení kořisti hlavní význam endopeptidázy štěpící bílkoviny, karboxylesterhydrolázy štěpící tuky, glykosidázy potřebné pro štěpení poly- a oligosacharidů a fosfomonoesterázy, které štěpí fosforylované cukry. Pro trávení mastných kyselin je důležitá přítomnost enzymu peroxidázy. K narušení chitinového krunýře hmyzu slouží enzym chitináza (STUDNIČKA, 1998).
16
3.1.3
Terapeutické a insekticidní účinky naftochinonů a jejich využití
Naftochinony jsou většinou barevné pigmenty, které jsou v buňce uloženy ve vakuolách, kde jsou rozpuštěny ve formě glykosidů. Mezi nejčastěji se vyskytující naftochinony patří juglon, lawson a plumbagin (BABULA, ADAM, HAVEL, KIZEK, 2007), (obr.18).
juglon
lawson
plumbagin
Obr. 18: Naftochinony juglon, lawson, plumbagin
Cytotoxické účinky naftochinonů
Beta-lapachon, inhibitor topoizomerázy, vykázal cytotoxický efekt u lidské promyelocytické leukémie a rakoviny předstojné žlázy. Jeho účinek byl zkoušen také na nádorové buňky karcinomu tlustého střeva, které mají tendenci odolávat chemoterapeutické léčbě i radioaktivní terapii. Buněčné nádorové linie SW480, SW620 a DLD1 s mutací p53 byly velmi citlivé k působení β-lapachonu, který pozastavil buněčný cyklus a navodil apoptózu (HUANG, PARDEE, 1999). Cytotoxická aktivita plumbaginu byla prokázána u karcinomu děložního krčku. U lidské buněčné nádorové linie ME-180 způsobuje apoptózu generací reaktivních forem kyslíku (ROS). Dále vyvolává ztrátu potenciálu na mitochondriálních 17
membránách a další morfologické změny vedoucí k apoptóze, jako je translokace fosfatidyl serinu, nukleární kondenzace a štěpení DNA (SRINIVAS, GOPINATH, BANERJI, DINAKAR, SRINIVAS, 2004). Účinek plumbaginu byl zkoumán na nádorových buňkách lidské ledviny HEK293 a tumoru mozku LN229, jejichž vznik je podmíněn aktivitou Nox-4 (gen pro NAD(P)H oxidázu) a renální NAD(P)H oxidázou. Plumbagin v této studii snižoval aktivitu Nox-4 a inhiboval NAD(P)H) oxidázu (DING, CHEN, LIU, CHE, VETTER, CHÁNY, 2005). Výsledky mnoha studií dokazují antikarcinogenní aktivitu naftochinonů včetně jejich mechanismu působení. Naftochinony β-lapachon a plumbagin jsou schopny vyvolat apoptózu (programovanou buněčnou smrt), jiné naftochinony zasahují do metabolismu dusíkatých bází, do procesů replikace DNA, mohou však účinkovat i v ostatních fázích buněčného cyklu.. Značným problémem použití naftochinonů v rámci klinických studií je jejich výrazná toxicita. Byly již však připraveny lékové formy, zejména komplexy s hydroxypropyl-β-cyklodextrinem, které mají cytotoxicitu mnohem nižší. V současné době
mají
význam
hlavně
syntetické
deriváty
naftochinonů.
Jedná
se o komplexy 1,2- naftochinonu s mědí, niklem a mnoha dalšími látkami (BABULA, ADAM, HAVEL, KIZEK, 2007).
Antimikrobní a antifungální účinky naftochinonů
Diskovou difúzní metodou byl testován antimikrobní účinek 1,4-naftochinonů na několika gram-pozitivních a gram-negativních bakterií. Nejvíce účinný byl 5-amino-8-hydroxy-1,4-naftochinon v koncentraci 50 µg.ml-1., jehož inhibiční zóna proti stafylokokům, streptokokům a tyčinkám dosahovala 20 mm. Inhibiční účinek naftochinonů na Staphylococcus aureus byl prokázán v koncentračním rozmezí 30-125 µg.ml-1, baktericidního účinku bylo dosaženo při koncentraci vyšší než 500 µg.ml-1 (BABULA, ADAM, HAVEL, KIZEK, 2007). V dalších testech na antimikrobní účinky naftochinonů na Erwinia carotovora se nejvíce osvědčil naftazarin (NTZ). V koncentraci 3 µg.ml-1 byl po určité době opět pozorován růst E. carotovora, ovšem koncentrace 10 µg.ml-1 již působila baktericidně. 18
Účinek naftazarinu spočívá ve zvýšení reaktivních forem kyslíku, které jsou pro buňky toxické. NTZ v koncentraci 2 mg.ml-1 brání hnilobě bramborových hlíz způsobenou právě E. carotovora (MEDINA, STEFANI, BRANDELLI, 2004). Naftochinon 2-methoxyjuglon, získaný z methanolického extraktu listů Lomatia hirsuta, vykázal antifungální efekt na Candida albicans (MIC 8 µg.ml-1),(SIMONSEN, ADSERSEN, BERTHELSEN, CHRISTENSEN, GUZMAN, MOLGAARD, 2006). . Antivirální, antiparazitální a insekticidní účinky naftochinonů
Studie prokázaly inhibiční účinky naftochinonů na viry chřipky a dětské obrny. U lapacholu izolovaného z Tabebuia avellanedae byl zjištěn také účinek proti herpes viru typu I a II. Antivirální efekt spočívá v inhibici DNA a RNA polymerázy a reverzní transkriptázy. Beta-lapachon zasahuje do replikace HIV-1 inhibicí transkriptázy (CHIANG, 1993). Atovaquon (hydroxyl-1,4-naftochinon), antiprotozoikum s širokým spektrem účinků, má výrazný efekt na Plasmodium sp. a
Pneumocystis carinii. V zahraničí
je používán ve formě žlutých krystalků nebo jako suspenze (přípravek Mepron®). Zabraňuje přenosu elektronů na cytochrom bc1 (komplexIII), což následně vede ke smrti parazita. V kombinaci s proquanilem je uplatňován v prevenci a léčbě malárie (přípravek Malarone®),(BAGGISH, HILL, 2002) Dva naftochinony izolované z Calceolaria andina L. prokázaly insekticidní účinky na molice Trialeurodes vaporariorum (SIMMONDS, MANLOVE, BLANEY, KHAMBAY, 2002). Hledání nových látek s insekticidním a repelentním účinkem a poměrně nízkou toxicitou je cílem mnoha vědeckých pracovišť na celém světě. Vysoký obsah plumbaginu v Dionaea muscipula i ostatních rodech čeledi Droseraceae zřejmě slouží těmto rostlinám jako ochrana proti predátorům. Studie, zabývající se repelentním účinkem různých naftochinonů a jejich analogů zjistila, že nejsilnější repelentní účinek vykazuje plumbagin a juglon. Jako predátor byla použita Spodoptera litura. Prokazatelný repelentní účinek u plumbaginu a juglonu byl již při koncentraci 5 mg.l-1, u 7- methyljuglonu při 10 mg.l-1 a u naftazarinu při 50 mg.l-1. Většina analogů naftochinonů vykazovala účinek až při 100 mg.l-1. Studie se také snažila objasnit 19
princip repelentního účinku a rozdíly v účinku mezi jednotlivými naftochinony. Bylo prokázáno, že rozdíly v účinku jsou způsobeny různou těkavostí naftochinonů a různým redox potenciálem. Čím vyšší těkavost a redox potenciál, tím vyšší repelentní účinek (TOKUNAGA, TAKADA, UEDA, 2004).
Hypolipidemické a antisklerotické účinky naftochinonů
Z Plumbago zeylanica izolovaný plumbagin snížil u hyperlipidemických králíků hladinu sérového cholesterolu o 53-86 %, hladinu LDL cholesterolu o 61-91 %. Hladina HDL cholesterolu se významně zvýšila. Plumbagin zmenšoval aterózní pláty v hrudní a břišní aortě (SHARMA, GUSAIN, DIXIT, 1991).
Antialergické účinky naftochinonů
Antialergické účinky naftochinonů byly zjišťovány u 70 % ethanolického extraktu ze stonků Plumbago zeylanica. Extrakt utlumil navozený systémový anafylaktický šok u 48 myší z 80 a potlačil kožní reakci u krys vyvolanou histaminem a serotoninem. V koncentraci 5, 20 a 50 µg.ml-1 bránil uvolnění histaminu z peritoneálních žírných buněk, v koncentraci 50 µg.ml-1 způsobil výrazné zvýšení obsahu cAMP v žírných buňkách. Právě tyto důkazy přispěly k vysvětlení inhibičního působení extraktu na vznik okamžité alergické reakce (DAI, HOU, CHAN, CHENG, BUT, 2004).
Antiflogistické účinky naftochinonů
Rostliny rodu Plumbago, zejména Plumbago capensis, Plumbago rosea a Plumbago zeylanica, jsou v indické lidové medicíně používány k léčbě zánětlivých onemocnění, jako je revmatoidní artritida, laryngitida, ale také k léčbě bolestivé menstruace, naraženin a otoků. Hydroalkoholický extrakt z kořene Plumbago capensis (HAEPC) zamezil v dávce 250 mg/kg migraci leukocytů v místě zánětu. Protizánětlivý účinek byl
20
srovnatelný s indometacinem (10 mg.kg-1), (DORNI, VIDYALAKSHMI, VASANTHI, RAJAMANICKAM, DUBEY, 2006). . Účinky naftochiononů na reprodukční systém
Plumbagin při studiích na bílých krysách inhiboval v dávce 10 až 20 mg.kg-1 implantaci zárodku na děložní sliznici a vykázal výrazný abortivní efekt. Teratogenní efekt nebyl prokázán. U samic králíků byla plumbaginem potlačena ovulace (WILLIAMSON, 2002).
Účinky naftochinonů na trávicí systém
Výtažek z kořenů Plumbago zeylanica způsobil u myší zmnožení střevních bakterií, což vedlo k normalizaci střevní mikroflóry. Testy dokazují, že plumbagin stimuluje trávení (WILLIAMSON, 2002). Ve Francii se dosud používá Plumbago europaea ke zmírnění bolestí zubů, jiné druhy jsou oblíbené při léčbě průjmových onemocnění, poruch trávení a kožních problémů. V Číně se využívá účinků kořene Lithospermum erythrorhizon k léčbě vředů, spalniček, bolestí v krku a spálenin (BABULA, ADAM, HAVEL, KIZEK, 2007). V České republice se díky vysokému obsahu tříslovin stále používají listy i kůra ořešáku černého Juglans nigra pro adstringentní a detergentní účinky k léčbě kožních chorob, zejména ekzémů, oparů a vředů. Drosera rotundifolia (rosnatka okrouhlolistá), v ČR chráněná rostlina, je známá svými léčivými účinky na dýchací cesty, využívá se proto u nachlazení, bronchitidy, astma a jako expektorans. V České republice je extrakt z rosnatky obsažen v kapkách Tussilen®, které usnadňují vykašlávání (BABULA, ADAM, HAVEL, KIZEK, 2007). Extrakt z rosnatky vykazuje také spasmolytické a protizánětlivé účinky (KRENN, BEYER, PERTZ, KARALL, KREMSER, GALAMBOSI, MELZIG, 2004).
Dále působí proti kornatění tepen,
vysokému krevnímu tlaku a chorobám stáří (SUCHÝ, 1994).
21
Dionaea muscipula nemá v současnosti v ČR terapeutické využití. V Německu je vyráběn (není zde však schválen a registrován) přípravek Carnivora® obsahující extrakt z mucholapky, který zvyšuje imunitu a zlepšuje kardiovaskulární funkce. Ve vyšších dávkách vykazuje účinky antikancerogenní, antibakteriální a působí také proti virům a parazitům. Přípravek je prospěšný u chronických infekcí a dalších nemocí jako lymská nemoc, AIDS, hepatitida-C, Crohnova choroba, sexuálně přenosné nemoci, chronický únavový syndrom, chřipka, ulcerativní kolitida, roztroušená skleróza, lupénka, chronická artritida a další imunodeficientní stavy
a autoimunní
choroby (KELLER, 2001). Extrakt z Dionaea muscipula v množství 10 mg je obsažen také v přípravku MetabolicZyme®, kde spolu s pankreatickými enzymy napomáhá trávení a zlepšuje funkci imunitního systému.
3.2
Kultivace in vitro
3.2.1
Základní pojmy, principy a využití
Explantátové kultury představují kultivaci izolovaných rostlinných částí, orgánů, pletiv, buněk či protoplastů v umělých, víceméně definovaných podmínkách (PROCHÁZKA, ŠEBÁNEK A KOL., 1997). Jednou z možností dělení je dělení explantátových kultur podle kultivovaného explantátu nebo charakteru pletiva : •
Kultury izolovaných semen v různém stádiu vývoje či zralosti
•
Kultury izolovaných embryí v různém stádiu vývoje či zralosti
•
Orgánové kultury : -
kultury vegetativních orgánů či jejich částí (kořeny, stonky, listy, meristémy, pupeny)
-
kultury generativních orgánů (květní pupeny, poupata, květy, pestíky, tyčinky, prašníky pylová zrna, spory, gametofyty)
-
kalusové kultury
-
buněčné kultury
-
protoplastové kultury
Rostlina, ze které byl explantát získán, se nazývá donorovou rostlinou. V explantátové kultuře lze vyvolat růst a další vývoj základů orgánů, které již byly založeny na donorové rostlině. Podmínky kultivace pak stimulují a urychlují průběh 22
morfogeneze. Vznik nových orgánů lze vyvolat také
de novo. V tomto případě
proběhne v diferencované buňce proces dediferenciace. Dediferenciace je definována jako proces obnovení embryonálního stavu
(SLADKÝ, ŠEBÁNEK, 1988). Poté
následuje opět diferenciace, ke které dochází buď přímo z dediferencovaných buňek, anebo při nepřímé diferenciaci se nejdříve vytváří kalus, a na něm probíhá proces diferenciace.
Diferenciací
označujeme
přeměnu
embryonální
buňky v buňku
specializovanou. Kalus představuje amorfní hmotu nediferencovaných buněk a má za úkol zacelit ránu. Jeho tvorbu je možno podnítit auxiny a cytokininy (SLADKÝ, ŠEBÁNEK, 1988). Podle charakteru nově vzniklých struktur se rozlišuje : •
organogeneze, kdy se vytvářejí orgány, jako např. kořeny, prýty, listové útvary či generativní orgány
•
somatická embryogeneze, kdy ze somatických buněk embrya vznikají embrya víceméně podobná embryím zygotickým; zvláštní případ představuje somatická polyembryogeneze, kdy se vzniklá somatická embrya v ranném stádiu sama dále kontinuálně množí
•
pylová embryogeneze (androgeneze), kdy u nezralých pylových zrn vznikají zárodky
Proces dediferenciace a následné diferenciace je indukován a udržován podmínkami kultivace, kde významnou roli hrají rostlinné hormony. Proces diferenciace je založen na diferenční genové aktivitě, kdy se specializované buňky vytvářejí na základě aktivace či inaktivace určitých genů příslušného rostlinného druhu. Teoreticky je tedy k odvození explantátové kultury vhodné jakékoliv pletivo obsahující buňky s funkčním jádrem (KOVÁČ, 1995). Z výše uvedeného
vyplývají i některé možnosti aplikace explantátových kultur
(KOVÁČ, 1995) : 1. kultivace vegetačních vrcholů a pupenů nebo indukce adventivních pupenů na izolovaných orgánech jako metoda vegetativního množení rostlin 2. kultivace izolovaných meristémů jako metoda ozdravování rostlin od virových infekcí 3. překonávání fyziologických bariér při hybridizaci taxonomicky vzdálených druhů pomocí kultivace izolovaných embryí 4. regulace procesu oplození a jeho ovlivnění v podmínkách in vitro 23
5. produkce haploidů při kultivaci prašníků, mikrospor a vajíček 6. spontánní výskyt a indukce genových a genomových mutací v buněčných tkáňových kulturách a jejich selekce na úrovni regenerovaných rostlin 7. řízená fúze protoplastů s cílem vytvoření nových hybridů 8. inkorporace cizího genetického materiálu do buňky s cílem modifikace rostlinného genomu Tkáňové kultury se tedy mohou uplatnit na několika úrovních, z hlediska farmaceutického je však nejdůležitějším aspektem
produkce sekundárních
metabolitů. Pomocí tkáňových kultur je možné vyselektovat kultivary s vysokou schopností produkce sekundárních metabolitů. Současným trendem je tedy snaha využít rostlinných explantátových kultur k produkci sekundárních metabolitů, stejně jako je tomu u mikroorganismů. Důležitým aspektem, který se však do těchto snah promítá, je ekonomické hledisko. Nicméně tkáňové kultury získávají oproti tradičnímu způsobu získávání sekundárních metabolitů některé podstatné výhody (KOVÁČ, 1995): 1. syntéza probíhá řízeně v umělém prostředí nezávisle na klimatu a půdních podmínkách 2. v produčním systému jsou vyloučeny negativní biologické vlivy, jako jsou mikroorganismy nebo hmyz, které v přírodě mění produkci sekundárních metabolitů 3. v tkáňových kulturách je možno vyselektovat kultivary s vyšší produkcí sekundárních metabolitů 4. automatizací řízení buněčného růstu a regulací metabolických procesů může klesat výrobní cena a stoupat produkce Zatím jedinou perspektivní, a přitom rentabilní cestou produkce sekundárních metabolitů představuje kontinuální kultivace buněčných kultur ve fermentorech (KOVÁČ, 1995). Příkladem úspěšného využití této metody může být průmyslová produkce např. digoxinu kulturou Digitalis purpurea (Scrophulariaceae) nebo shikoninu kulturou Lithospermum erythrorhizon (DUŠEK, DUŠKOVÁ, TŮMOVÁ, SPILKOVÁ, 1996). Přes jisté úspěchy však
naráží tato metoda stále na velmi
významné problémy. Po dlouhodobé kultivaci může ustávat produkce sekundárních metabolitů, kdy dochází často ke změnám metabolických drah a k tvorbě modifikovaných metabolitů nebo biosyntéze látek doposud neznámých, rostlinami in vivo nesyntetizovaných (OPATRNÝ, 1999).
24
Jako perspektivní metoda se jeví metoda elicitace. Elicitory jsou sloučeniny biologického původu, které působí jako aktivátory enzymů v pletivech rostlin nebo stimulují syntézu těchto enzymů (KOVÁČ, 1995). Jedním z příkladů je užití inaktivovaných kultur mikroorganismů – bakterií a hub. Elicitory zde působí jako stresový faktor vyvolávající obrannou odpověď buněk založenou na produkci sekundárních metabolitů. V současné době probíhá intenzivní výzkum v zemědělství, kde jako elicitory vystupují běžné patogeny, a zkoumají se vznikající fytoalexiny z hlediska možnosti jejich využití v zemědělství; současně probíhá identifikace genů odpovědných za produkci fytoalexinů
(SOYLU, 2002), (WELLE, SCHRÖDER,
SCHILTZ, GRISEBACH, SCHRÖDER, 1991). Vedle „biotických“ elicitorů existuje skupina elicitorů abiotických, kam patří UV záření, chlad, vysoká teplota, soli těžkých kovů, změny pH, změny osmotického potenciálu a další faktory (KOVÁČ, 1995). Také odlišným složením živného média lze dosáhnou zvýšení tvorby sekundárních metabolitů. V kultuře Drosera communis St.Hil. byly zjištěny kvantitativní rozdíly v produkci naftochinonů v závislosti na typu použitých tekutých médií, která se lišila zejména
zastoupením
naftochinonů
makroelementů,
nejvýrazněji
ovlivňoval
mikroelementů dusík
a
jeho
a
vitamínů;
kvantitativní
produkci zastoupení
v jednotlivých typech použitých médií (SAUERWEIN, SCHMIDT, REICHLING, WINK, 1994). Vliv odlišného zastoupení sacharidů v médiu na produkci sekundárních metabolitů je předmětem této práce a bude detailněji probrán v kapitole „ Sacharidy v médiu“. Další možností, jak cíleně ovlivnit sekundární metabolismus rostlin je použití prekurzorů. Prekurzor můžeme definovat jako látku využitelnou k syntéze námi požadovaného produktu nebo jako meziprodukt při syntéze složitějších sloučenin. Jako prekurzory se tedy využívají látky běžně se v rostlinách vyskytující nebo látky rostlinám cizí; v tomto případě vznikají často metabolity nové, v rostlině nepůvodní, související
zřejmě
s detoxikačními
dráhami
metabolismu
rostlin
(KINDL,
WÖBER,1984). Podmínkou použití látky jako prekurzoru je možnost jejího vstupu do rostlinných buněk a aktivace v rostlinných buňkách. Produční schopnosti rostlin můžeme ovlivnit rovněž zásahy do genetické výbavy rostlin. Uměle připravenou nebo izolovanou molekulu DNA, nesoucí žádaný gen je možné do rostlinných buněk vnášet přímo nebo pomocí vektorů. Přenos DNA pomocí vektorů představuje použití vektoru, který v sobě nese geny zaručující vstup do rostlinných pletiv. Nejčastěji používanými vektory jsou Ti-plasmid bakterie 25
Agrobacterium tumefaciens a různé bakteriofágové vektory (bakteriofág l a M13). Selekce transformovaných buněk je možná různými látkami, např. antibiotiky (KOVÁČ, 1995), používá se i selekce nedostatkem některých živin nebo fytohormonů (SLADKÝ, ŠEBÁNEK ,1988). V současné době jsou transgenní rostliny využívány pro jejich toleranci k novým typům herbicidů nebo patogenů, rovněž chladu nebo vyšším koncentracím solí v půdě. Metodami genového inženýství byly vytvořeny transgenní odrůdy rostlin s vyššími výnosy (ONDŘEJ, 2000). Velmi známá a průmyslově využívaná je produkce sekudárních metabolitů mikroorganismy, čehož se využívá např. v produkci některých antibiotik (Penicillim chrysogenum a Penicillium notatum – různé typy penicilinů v závislosti na použitých prekurzorech), giberelinů (Giberella fujikuroi) nebo kyseliny askorbové (Acetobacter suboxydans), (SLADKÝ, ŠEBÁNEK ,1988).
3.2.2
Kultivační média
Kultivační média jsou pojmenována podle svých tvůrců. Nejvíce se používají Murashige and Skoog (MS), Schenk and Hildebrandt (SH), Gamborg (B5), White, Lloyd a McCown. Média obvykle obsahují makroelementy, mikroelementy, sacharidy,
vitamíny,
aminokyseliny,
zpevňující
látku
a
růstové
regulátory.
Mezi makroelementy přidávané do médií patří dusík, fosfor, draslík, vápník, hořčík a
síra.
Koncentrace
jednotlivých
prvků
je
závislá
na
rostlinném
druhu.
Z mikroelementů jsou nezbytné železo, mangan, zinek, bór, měď a molybden. Často se dodává také kobalt, jód, sodík a chlór. Jako zdroj uhlíku a energie slouží sacharidy (z důvodu převážně heterotrofní výživy explantátů). Nejčastěji používané vitamíny jsou thiamin, kyselina nikotinová, pyridoxin. Zdrojem dusíku v médiích jsou aminokyseliny. Často se používá směs aminokyselin (kasein hydrolyzát). Aktivní uhlí se může přidávat pro svoji schopnost absorbovat látky, které inhibují růst (zejména fenolické látky produkované rostoucím explantátem). Pro zpevnění média se z přírodních látek používá agar, ze syntetických Phytagel a gelrit. Ze stimulačních růstových regulátorů se uplatňují auxiny, cytokininy a gibereliny, jako inhibitor slouží kyselina abscisová (KOVÁČ, 1995).
26
3.2.3
Sacharidy v médiu
3.2.3.1
Vliv nutriční a regulační
Sacharidy hrají významnou roli při kultivaci in vitro, a to především jako zdroj energie, zdroj uhlíku a jako osmotické agens. Je také známo, že ovlivňují genovou expresi. Rostlinné geny odpovídají na změnu stavu sacharidů v buňce velmi nápadně. U některých genů je vyvolána aktivita, u jiných potlačena. Avšak není žádný důkaz, že tato role sacharidů je důležitá i při kultivaci rostlin in vivo (GEORGE, HALL, DE KLERK 2007). Jen vyjímečně jsou rostlinné buňky kultivované in vitro schopny autotrofní výživy. Nejúspěšnější jsou prýtové kultury, úspěch je podmíněn obohacením atmosféry uvnitř kultivačních nádob oxidem uhličitým během fotoperiody. Sacharidy obsažené v médiu jsou v tomto případě nevyužity (KOZAI, 1991). Nicméně u většiny explantátových kultur je nutné do média přidávat zdroj uhlíku. Universálním sacharidem, přidávaným do médií je disacharid sacharóza. Koncentrace sacharózy běžně užívaná pro podporu růstu explantátových kultur však často inhibuje tvorbu chlorofylu a tím ovlivňuje negativně i fotosyntézu ( RIER
J.P., CHEN
P.K.,1964). Stupeň inhibice se liší podle rostlinného druhu, z kterého byla kultura odvozena. Experimenty ukázaly, že napřiklad kalusy Rosa
a Daucus vykazovaly
vysoký obsah chlorofylu i na médiích s obsahem sacharózy 2–8%, narozdíl od kultury Lactuca, Cichorium, které produkovaly chlorofyl pouze na médiu bez sacharózy. ( FUKAMI
T., HILDEBRANDT
A.C.,1967). Buňky kultivované dlouhodobě
na médiu se sacharózou ztrácí schopnost syntetizovat chlorofyl (VAN HUYSTEE R.B., 1977). Dochází k přeměně chloroplastů na amyloplasty, může také dojít ke změně exprese plastidové DNA (GUNNING B.E.S., STEER M. W.,1975). Určitá schopnost fotosyntézy je zachována pouze u prýtů, které nejsou dlouhodobě kultivovány na médiích s vysokým obsahem sacharózy.Není však dostatečná pro další vývoj rostliny in vivo. (LANGFORD
P.J., WAINWRIGHT
H., 1987). Ostatní sacharidy tuto
inhibiční vlastnost nemají (EDELMAN J., HANSON A.D.,1972). Jedna z prvních prací, která sledovala vliv různých sacharidů na růst rostlinných kultur in vitro byla provedena (GAUTHERETEM R.J, 1945). Zjistil, že monosacharid
27
glukóza vykazuje podobné účinky jako sacharóza, ale narozdíl od sacharózy podporuje organogenezi. Protože je však poměrně drahá, užívá se pouze vyjímečně. K zajímavým výsledkům u monosacharidu fruktózy dospěl (POLLARD, 1961). Prokázal toxicitu fruktózy, která byla autoklávovaná společně s médiem. Pokud byla sterilizovaná filtrací, podporovala růst kalusu Daucus. Monosacharid galaktóza je toxický pro většinu rostlinných explantátů. Inhibuje růst orchidejí i jiných rostlin v koncentraci 0,01% (0,9 mM) (ERNST R., ARDITTI J., 1971). Některé druhy rostlin jsou schopny adaptace a jejich buňky vykazují růst na galaktóze, například buňky Saccharum officinarum (MARETZKI A., THOM M., 1978). Galaktóza je také schopna snižovat obsah vody v prýtech (DRUART PH., 1988). Disacharid laktóza může být hydrolyzován na glukózu a galaktózu. Laktóza byla detekována jen u několika málo rostlinných druhů. Je-li laktóza přítomna v médiu, rostlinné buňky jsou schopny adaptace i růstu. Následně mohou růst i na médiích s dalšími oligosacharidy, obsahujícími galaktózu (např.rafinóza a stachyóza) (GROSS K.C., PHARR D. M., LOCY R.D., 1981).
3.2.3.2
Vliv na sekundární metabolismus
Některé studie ukazují, že sacharidy v médiu i jejich koncentrace ovlivňují sekundární metabolismus v rostlinách. Experiment provedený LUX-ENDRICH et al.(2000) prokázal, že obsah fenolických látek v rostlině je poměrně snadno ovlivnitelný například různou koncentrací sacharózy v médiu. Prýty Malus x domestica, kultivované na médiích s obsahem sacharózy 10, 20, 40 a 60 g.l-1 a bez sacharózy ukázaly, že mimo koncentraci 10 g.l-1 došlo ke zvýšení obsahu flavanolů i flavonolů ve srovnání s variantou bez sacharózy. Nabízí se domněnka, že prýty kultivované na 0 g.l-1 , které nevykazovaly téměř žádný růst, zřejmě využily svůj zásobní uhlík pro syntézu fenolických látek a v případě koncentrace 10 g.l-1 prýty použily zásobní i přidaný uhlík pro tvorbu biomasy i syntézu fenolických látek. Také barva prýtů se měnila, od světle zelené při koncentraci 0 a 10 g.l-1 přes tmavě zelenou při 20 g.l-1 až po výrazně červenou u nejvyšší koncentrace. K podobným výsledků dospěli také TREUTTER et al. (1985) u Prunus avium a MORI et al. (1994) u buněčných kultur Fragaria vesca. 28
3.2.3.3
Hydrolýza sacharidů a pH média
K hydrolýze sacharózy na glukózu a fruktózu dochází již při autoklávování média. Pokud jsou v autoklávovaném médiu přítomny i ostatní složky, je hydrolýza větší než je-li sacharóza, rozpuštěná ve vodě autoklávována samostatně (FERGUSON et al., 1958). BRETZLOFF (1954) sledoval závislost hydrolýzy na pH média. Zjistil, že během patnáctiminutového autoklávování při 120oC, je-li pH 6,0 nedojde k žádné hydrolýze. Při pH 5,0 již 10% sacharózy zhydrolyzuje a při pH 3,0 zhydrolyzuje celých 100% sacharózy. Je také známo, že řada kultur roste lépe na autoklávovaném médiu se sacharózou než na médiu filtrovaném (BALL E. 1953). K hydrolýze sacharózy dochází také během in vitro kultivace, a to účinkem invertázy, která je přítomna v rostlinných buněčných stěnách (BURSTROM
H.,1957). I zde
je aktivita invertázy závislá na pH média. Nejvyšší aktivita u kořenové kultury Solanum byla v médiu při pH 3,6-4,7. Aktivita prudce klesala se stoupajícím pH (WESTON et al. 1968). Téměř všechna sacharóza byla hydrolyzována během tří dnů u suspenzní kultury Saccharum, Beta (ZAMSKI E., WYSE R.E.,1985).
3.2.3.4
Vodní a osmotický potenciál
Kromě vlivu nutričního a regulačního mají sacharidy obsažené v kultivačním médiu také vliv osmotický. Plně turgescentní buňka, tedy buňka plně nasycená vodou má vodní potenciál roven nule a je v rovnováze s čistou vodou. Při ztrátě vody se snižuje kladný turgorový potenciál a jak se zvyšuje koncentrace osmoticky aktivních látek, klesá
osmotický
potenciál
do
negativnějších
hodnot
(PROCHÁZKA
S.,
MACHÁČKOVÁ I., KREKULE J., ŠEBÁNEK J. A KOL.,2003). Jak osmotický potenciál ovlivňuje buněčné procesy není stále úplně jasné. Buňky rostoucí v prostředí s nízkým (negativnějším) osmotickým potenciálem ztrácí vodu a v závislosti na tom klesá i vodní potenciál v buňce. To přináší změny v metabolismu a buňky akumulují vysoké hladiny prolinu (RABE E.,1990). Zvýšení koncentrace osmolytika může vést ke zvýšení kyseliny abscisové (RIERA M. et al.,2005). V případě hydrolýzy sacharózy na glukózu a fruktózu bude osmotický potenciál kombinovaných cukrů nižší než by byl u sacharózy samotné (GEORGE E.F., HALL M.A., DE KLERK J.,2007).
29
3.3 3.3.1
Analytické metody Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - HPLC
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je separační metoda, která je založena na rozdílné distribuci dělených látek mezi dvě nemísitelné fáze - stacionární (nepohyblivá) a mobilní (pohyblivá). Separace probíhá v separační koloně, která obsahuje stacionární fázi (pevný sorbent). Pohybem mobilní fáze (eluentu) je vzorek unášen a ty složky, které mají vyšší afinitu ke stacionární fázi, jsou více zadržovány než složky ostatní a tím dochází k jejich postupnému rozdělení ( PERTILE, E., KABLÍK, V.,2006). Při nástřiku dvojice látek do chromatografické kolony se nejprve vytvoří eluční pás obsahující směs obou látek. Ty jsou pak pod vysokým tlakem unášeny mobilní fází a na náplni kolony dochází k jejich separaci. Jakmile vyjde první látka z kolony, detektor indikuje její přítomnost v eluátu a zaznamená eluční pík (křivku). Po výstupu obou rozdělených látek jsou zapisovačem zaznamenány dva eluční píky (obr.19).
Obr. 19: Průchod separovaných látek kolonou a jejich záznam
K – chromatografická kolona, V – vstup mobilní fáze, D – detektor, Z – zapisovač, P – pisátko zapisovače, E – eluční křivka, A,B – analyzované složky. 30
Zařízení pro chromatografii obsahuje (obr.20):
rezervoár mobilní fáze
odplyňovač (degasér)
čerpadlo, pumpu (tvoří konstantní tlak proudem plynu)
dávkovač vzorku
kolonu s chromatografickým materiálem (čím jemnější je sorbent, tím je vyšší tlak v koloně a roste její dělící schopnost)
detektor (UV/Vis detekce, DAD detektor)
jímač frakcí
Obr. 20: Schéma chromatografického zařízení
Předností HPLC je rychlost analýzy, vysoká dělící schopnost, možnost automatické detekce, identifikace a kvantitativní vyhodnocení chromatogramu. Touto technikou je možno oddělit i termolabilní a polární látky ( PERTILE, E., KABLÍK, V.,2006).
31
4.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Celý experiment včetně přípravy médií, kultivace i následné analýzy proběhl v laboratoři explantátových kultur Ústavu přírodních léčiv Farmaceutické fakulty VFU Brno. 4.1
Použitý materiál
4.1.1
Rostlinný materiál
Rostliny Dionaea muscipula pocházely z laboratoře explantátových kultur MZLU Brno. Před experimentem byly kultivovány na médiu Murashige and Skoog (MS) v poloviční koncentraci , s přídavkem 30 g.l-1 sacharózy, 5 g.l-1 aktivního uhlí a 2,7 g.l-1 gelritu. Pro kultivaci byly použity erlenmayerovy baňky 100 ml s 30 ml média, uzavřené alobalem. Kultivace probíhala po dobu tří měsíců v kultivačním světelném boxu při intenzitě osvětlení 4000 luxů a fotoperiodě 16 hodin. Teplota se pohybovala v rozmezí 23oC – 28oC. 4.1.2
Chemikálie
•
Demineralizovaná voda
•
Fruktóza – RNDr. Jan KULICH, s.r.o.
•
Glukóza - RNDr. Jan KULICH, s.r.o.
•
Kapalný dusík
•
Laktóza - RNDr. Jan KULICH, s.r.o.
•
Methanol - Sigma Aldrich Chemical Corp., USA
•
Plumbagin - Sigma Aldrich Chemical Corp., USA
•
Sacharóza - RNDr. Jan KULICH, s.r.o.
4.1.3
Použité přístroje a ostatní vybavení
•
Autokláv (Chirana, typ AUT 26/2, Česká republika)
•
Automatické pipety
•
Centrifuga (Universal 32 R, Hettich-Zentrifugen GmbH, Německo)
•
Demineralizační přístroj (Aqua Dem typ 02, ČR) 32
•
Digitální fotoaparát (Olympus 4040)
•
Germicidní zářivka (OSRAM 15 W)
•
Homogenizátor skleněný
•
Kapalinový chromatografický systém s detektorem diodového pole (HP 1100, Hewlett Packard, Německo)
•
Kultivační světelný box (Česká republika) se zářivkami Lumilux plus, cool white, OSRAM L 36 W
•
Laboratorní váhy (A&D, typ HL-200, Japonsko)
•
Laboratorní váhy analytické (A&D, typ FX-40, Japonsko)
•
Laminární box (Aura Mini, Biotech Instruments)
•
Membránové filtry (Millipore, USA)
•
Míchačka se zahříváním (IKA, RTC basic, Německo)
•
PH metr ( Jenway 3510 )
•
Plastové zkumavky (15 ml) (TPP, Švýcarsko)
•
Plastové zkumavky (50 ml) s mikrofiltrem (TPP, Švýcarsko)
•
Plynový kahan pedálový (Gasprofi 1, Německo)
•
Sonikátor (K5, Česká republika)
•
Sušárna
•
Třepačka (Vortex-2 Genie, Scientific Industries, USA)
•
Vialky (1,5 ml)
4.2
Metodika práce
4.2.1
Příprava kultivačních médií a uspořádání pokusu
Na přípravu kultivačních médií byla použita destilovaná voda, do které bylo kvantitativně převedeno práškované MS médium s obsahem makroelementů, mikroelementů a vitamínů (obr.21) v poloviční koncentraci, dále MS vitamíny (obr.21) v poloviční koncentraci. Do jednotlivých variant byla přidána glukóza, fruktóza, sacharóza a laktóza. Všechny tyto sacharidy byly ve dvou koncentracích, a to 30 g.l-1 a 60 g.l-1. Poslední varianta byla bez sacharidů. Celkem bylo tedy 9 variant. Média neobsahovala agar ani jiný zpevňující materiál. PH médií bylo
33
upraveno na 5,8. Každá z variant byla rozlita do 15 autoklávovatelných plastových zkumavek (50 ml). Jednotlivá zkumavka obsahovala 3 ml média. Po uzavření zkumavek uzávěrem s mikrofiltrem, byly zkumavky autoklávované pří 121oC po dobu 20 minut. MAKROELEMENTY
mg.l-1
CaCl2
332,00
KNO3
1900,00
KH2PO4
170,00
MgSO4
180,40
NH4NO3
1650,00
MIKROELEMENTY
mg.l-1
CoCl2 .6H2O
0,025
CuSO4.H2O
0,025
FeNaEDTA
36,70
H3BO4
6,20
KI
0,83
MnSO4 .H2O
16,90
Na2MoO4 .2H2O
0,25
ZnSO4.7H2O
8,60
VITAMÍNY
mg.l-1
myo-inositol
100,00
glycin
2,00
kys. nikotinová
0,50
pyridoxin HCl
0,50
thiamin HCl
0,10
Obr.21: Složení kultivačního média Murashige and Skoog
34
4.2.2
Metodika práce se sterilním rostlinným materiálem
Před manipulací se sterilním rostlinným materiálem je nutná sterilizace pinzet a dalších pomůcek používaných při práci s explantáty. Veškeré kovové nástroje i sklo musí být zabalené do hliníkové fólie. Sterilizace se provádí v autoklávu horkou parou o teplotě 121 ºC, při přetlaku 110 kPa, po dobu 20 minut. Manipulace se sterilním materiálem probíhá v laminárním boxu. Před zahájením práce je nutné vytřít jeho vnitřní stěny etanolem (70 %) a zapnout germicidní zářivku na 20 minut. Laminární box musí být uveden do provozu alespoň 15 minut před začátkem činnosti, aby došlo k ustálení proudu. Ruce se po umytí desinfikují ethanolem (70%) a nástroje používané při práci s explantáty se průběžně žíhají nad kahanem umístěným v laminárním boxu. Jednotlivé rostliny Dionaea muscipula byly před vložením do experimentálních médií opláchnuté ve sterilní vodě a posléze osušeny ve sterilní buničité vatě. Vše probíhalo v laminárním boxu. Po osazení a uzavření všech zkumavek proběhlo zvážení zkumavek s médiem a rostlinou již mimo laminární box. Samotné zkumavky s médiem byly zváženy před osazením. Vážení probíhalo na analytických váhách, s přesností na tři desetinná místa. Byla tak zjištěna počáteční čerstvá hmotnost jednotlivých rostlin před kultivací.
4.2.3
Podmínky kultivace
Zkumavky byly uzavřené uzávěrem s mikrofiltrem, který zabezpečoval výměnu plynů ve zkumavce v průběhu kultivace, a zároveň zabezpečoval sterilitu uvnitř zkumavky. Kultivace probíhala po dobu jednoho měsíce v kultivačním světelném boxu při intenzitě osvětlení 4000 luxů a fotoperiodě 16 hodin. Teplota se pohybovala v rozmezí 23oC – 28oC. Experimentálně bylo ověřeno, že plastové zkumavky propouští elektromagnetické vlnění o vlnové délce nad 300 nm.
4.2.4
Odběr vzorků a příprava extraktů pro analýzu
Pro zajištění dostatečného množství materiálu bylo v každé variantě 15 zkumavek, v každé zkumavce jedna rostlina.
35
Od každé varianty bylo odebráno a následně zpracováno 7 rostlin ze 7 zkumavek. Každá rostlina byla zpracována samostatně a z každé byl připraven methanolický extrakt pro analýzu plumbaginu. Rostliny byly vyjmuty ze zkumavky, opláchnuty destilovanou vodou a poté metanolem. Pak byly osušeny v buničité vatě, zváženy a rozděleny na dvě části. Jedna část byla okamžitě uzavřena do předem zvážené plastové zkumavky (15 ml) a druhá část byla zvážena přímo a následně vysušena při 105oC do konstantní hmotnosti. Po vysušení byly rostliny opět zváženy a hodnoty sloužily pro vyjádření sušiny.
Plastové zkumavky (15 ml) s druhou částí rostliny, které byly určeny pro přípravu extraktu pro analýzu plumbaginu, byly zváženy a byla tak získána čerstvá hmotnost vzorku. Do každé zkumavky byl přidán kapalný dusík a po dokonalém zmražení vzorku byla provedena homogenizace materiálu pomocí skleněného homogenizátoru přímo ve zkumavce. Pak podle čerstvé hmotnosti bylo přidáno přesně dané množství rozpouštědla (metanol:voda, 2:1) tak, aby výsledný poměr rostlinného materiálu v čerstvém stavu a rozpouštědla byl 1g rostlinného materiálu : 10 ml rozpouštědla. Po uzavření zkumavek dokonale těsnícími uzávěry byly zkumavky třepány 5 minut na třepačce tak, aby byly všechny látky extrahovány do rozpouštědla. Následovala centrifugace a filtrace přes membránový filtr.
4.2.5
Analýza metanolického extraktu
4.2.5.1
HPLC analýza plumbaginu
Pro analýzu sekundárních metabolitů – obsahu plumbaginu v odebraných vzorcích Dionaea muscipula – byl použit kapalinový chromatograf HP 1100 firmy Hewlett Packard se spektrofotometrickým detektorem DAD, který snímá vlnové délky 190 nm až 950 nm. Dělení probíhalo na koloně Supercosil ABZ+Plus (150 mm x 4,6 mm, velikost částic 3 mm) s 2 cm předkolonou ze stejného materiálu. Byla použita gradientová eluce při 30°C s gradientem v nulté minutě 30 % acetonitril a 70 % 40 mM kyselina mravenčí, do desáté minuty 80 % acetonitril a 20 % 40 mM kyselina mravenčí. Rychlost průtoku byla 2 ml/min. Objem nástřiku analyzovaných extraktů byl 10 mikrolitrů.
36
4.3
Statistické metody
Všechna získaná data byla zpracována pomocí statistického programu Statistica verze8, Stat Soft. V tomto programu byla provedena vícefaktorová analýza variance. Testy homogenity rozptylu byly provedeny pomocí testů Cochran, Hartley, Bartlett. Výsledky těchto testů byly zpracovány metodou následného testování -Tukeyův test a bylo získáno výsledné grafické zobrazení dat i vyjádření statistické průkaznosti.
5.
VÝSLEDKY A DISKUSE
5.1
Morfologické a anatomické zhodnocení explantátů po kultivaci
Glukóza 30 g.l-1 – listová růžice řídká, řapíky velmi dlouhé a široké, čepele středně velké, barva čepelí načervenalá, obvodové zuby čepele krátké (obr.22).
Obr. 22: Glukóza 30 g.l-1 37
Glukóza 60 g.l-1 -
listová růžice řídká, řapíky krátké, čepele velké, barva čepelí
zelenohnědá, obvodové zuby čepele krátké (obr.23).
Obr. 23: Glukóza 60 g.l-1
Fruktóza 30 g.l-1 - listová růžice hustá, řapíky krátké a široké, čepele velké, barva čepelí načervenalá, obvodové zuby čepele dlouhé (obr.24).
Obr.24: Fruktóza 30 g.l-1 38
Fruktóza 60 g.l-1 – listová růžice velmi hustá, řapíky dlouhé a úzké, čepele malé, barva čepelí červená, obvodové zuby čepele zakrnělé (obr.25).
Obr. 25: Fruktóza 60 g.l-1
Sacharóza 30 g.l-1 – listová růžice hustá, řapíky velmi široké, čepele velké, barva čepelí načervenalá, obvodové zuby čepele dlouhé, tenké (obr.26).
Obr. 26: Sacharóza 30 g.l-1 39
Sacharóza 60 g.l-1 – listová růžice hustá, řapíky krátké, čepele velké, barva čepelí načervenalá, obvodové zuby čepele dlouhé, tenké (obr.27).
Obr. 27: Sacharóza 60 g.l-1
Laktóza 30 g.l-1 – listová růžice hustá, řapíky velmi dlouhé, široké, čepele velké, barva čepelí načervenalá, obvodové zuby čepele dlouhé (obr.28).
Obr. 28: Laktóza 30 g.l-1
40
Laktóza 60 g.l-1 – listová růžice hustá, řapíky velmi dlouhé, čepele malé, barva čepelí červená, obvodové zuby čepele velmi krátké (obr.29)
Obr. 29: Laktóza 60 g.l-1
Bez sacharidů – listová růžice hustá, řapíky krátké, čepele velké, barva čepelí zelená, obvodové zuby čepele krátké (obr.30).
Obr. 30: Bez sacharidů 41
Vzhled rostlin, a to především barva a velikost čepelí byla po měsíční kultivaci odlišná. Rostliny u varianty bez cukru byly zelené, narozdíl od rostlin variant se sacharidy, které byly více či méně červené. Varianty s koncentrací 60 g.l-1 byly výrazně červené. Může se jednat o inhibici tvorby chlorofylu ( RIER J.P., CHEN P.K.,1964), a to u všech použitých sacharidů, nejenom v případě sacharózy jak uvádí EDELMAN J., HANSON A.D.,1972. Velikost čepelí byla výrazně odlišná u varianty fruktóza 60 g.l-1 a laktóza 60 g.l-1. Čepele byly drobné, se zakrnělými obvodovými zuby. Mohlo by se jednat o projev toxicity autoklávované fruktózy a galaktózy, jež je součástí disacharidu laktózy (POLLARD, J.K., 1961),( ERNST R., ARDITTI J., 1971). Srovnáme-li jednotlivé koncentrace u stejného sacharidu, pouze rostliny variant sacharóza 30 g.l-1 a sacharóza 60 g.l-1 se mezi sebou téměř nelišily, od ostatních variant se lišily dlouhými a velmi tenkými obvodovými zuby čepele. Rostliny ostatních variant se sacharidy byly v různých koncentracích odlišné. Mikroskopické preparáty připravené z jednotlivých variant neukázaly žádné významné anatomické změny. Ve všech případech bylo přítomno velké množství žlázek na povrchu čepelí a velké množství škrobových zrn (obr.31).
Obr. 31: Žlázka a škrobová zrna
5.2
Nárůst čerstvé hmotnosti explantátů po kultivaci
Statisticky průkazné byly rozdíly mezi čerstvou hmotností rostlin kultivovaných na médiích se sacharidy v koncentraci 60 g.l-1 a čerstvou hmotností rostlin kultivovaných na médiích se sacharidy v koncentraci 30 g.l-1(výjimkou byla jen sacharóza 60 g.l-1 ). U všech variant sacharidů v koncentraci 60 g.l-1 došlo k poklesu čerstvé hmotnosti rostlin (výjimkou byla jen sacharóza 60 g.l-1 ). Rostliny varianty bez sacharidů vykazovaly také pokles čerstvé hmotnosti. U všech variant sacharidů v koncentraci 30 g.l-1 vzrostla u rostlin čerstvá hmotnost, nejvyšší nárůst byl u laktózy. Pokles nebo nárůst byl vztažen k počáteční čerstvé hmotnosti rostliny při založení pokusu (obr.32). 42
Obr. 32: Nárůst čerstvé hmotnosti (v g)
Z výsledků prvního grafu vidíme, že fotosyntéza u varianty bez cukru postačovala na prostou existenci rostliny nikoliv však již na tvorbu biomasy. Koncentrace sacharidů 30 g.l-1 prokazatelně zvýšila čerstvou hmotnost rostlin ve srovnání s počáteční hmotností při založení pokusu. Je tedy zřejmé, že rostliny jsou schopny sacharidy z média využít pro svoji stavbu. Pokles čerstvé hmotnosti u
koncentrací 60 g.l-1
je zřejmě způsoben osmotickým vlivem. Hladina osmoticky aktivních látek v médiu je tak vysoká, že odčerpává z buněk rostlin vodu, a tím snižuje jejich hmotnost. (PROCHÁZKA S., MACHÁČKOVÁ I., KREKULE J., ŠEBÁNEK J. A KOL.,2003). Neprůkazný rozdíl mezi sacharózou 60 g.l-1 a 30 g.l-1 bychom snad mohli vysvětlit hydrolýzou sacharózy účinkem invertázy během kultivace (ZAMSKI R.E.,1985).
43
E., WYSE
5.3
Sušina
Statisticky průkazný byl nárůst sušiny u rostlin kultivovaných na médiích se sacharidy v koncentraci 60 g.l-1 a také u variant glukóza a sacharóza 30 g.l-1 ve srovnání s rostlinami kultivovanými bez sacharidů. Statisticky průkazné rozdíly v sušině rostlin u variant jednotlivých sacharidů a jejich koncentrací byly v případě rostlin kultivovaných na médiu s fruktózou 30 g.l-1 a 60 g.l-1 a také v případě rostlin kultivovaných na laktóze 30 g.l-1 a 60 g.l-1. (obr.33).
Obr. 33: Sušina (v %)
Z výsledků můžeme usuzovat, že rostliny varianty bez cukru byly sice schopny fotosyntézy, ta ale nepostačovala ani na tvorbu biomasy ani na tvorbu sušiny. Srovnáme-li grafy na obr. 32 a obr. 33 vidíme, že došlo k nárůstu sušiny u variant fruktóza a laktóza 60 g.l-1 ve srovnání s variantami fruktóza a laktóza 30 g.l-1 i variantou bez sacharidů. Mohlo by se snad také jednat o kumulaci sacharidu v buňkách a v důsledku toho navýšení sušiny. Hodnoty u variant glukóza 30 g.l-1 a 60 g.l-1 i sacharóza 30 g.l-1 a 60 g.l-1 jsou téměř shodné. Došlo tedy k nárůstu sušiny ve srovnání s variantou bez sacharidů, a to bez ohledu na koncentraci sacharidu.
44
5.4
Obsah plumbaginu v extraktu z Dionaea muscipula
Statisticky vysoce průkazné byly rozdíly v obsahu plumbaginu v extraktu u variant glukóza 30 g.l-1 a 60 g.l-1 a fruktóza 30 g.l-1 a 60 g.l-1
a také rozdíly v obsahu
plumbaginu u variant glukóza 30 g.l-1 a laktóza v obou koncentracích ve srovnání s variantou bez cukru.(obr.34).
Obr. 34: Obsah plumbaginu v extraktu (mg/g)
Z grafu vidíme, že fruktóza a sacharóza v médiu ani jejich koncentrace nemají vliv na obsah plumbaginu v extraktu ve srovnání s variantou bez sacharidu. Glukóza a laktóza i jejich koncentrace mají vliv na obsah plumbaginu v extraktu, a to rozdílným způsobem. Laktóza v médiu zvyšuje obsah plumbaginu v obou koncentracích ve srovnání s variantou bez cukru. Glukóza 30 g.l-1 také zvyšuje obsah plumbaginu, narozdíl od glukózy 60 g.l-1 , která jej výrazně snižuje.
45
5.5
Obsah plumbaginu v sušině
Statisticky vysoce průkazné rozdíly v obsahu plumbaginu v sušině byly u variant glukóza 30 g.l-1 a 60 g.l-1 a laktóza 30 g.l-1 a 60 g.l-1 . Ve srovnání s variantou bez sacharidu byl prokazatelný nárůst u variant glukóza 30 g.l-1, fruktóza 60 g.l-1 , sacharóza 30 g.l-1 , laktóza 30 g.l-1 a 60 g.l-1 . (obr.35).
Obr. 35: Obsah plumbaginu v sušině (mg/g)
Zhodnotíme-li grafy na obr.34 a 35, můžeme prohlásit, že laktóza v obou koncentracích zvyšuje obsah plumbaginu, a to jak v rostlině v čerstvém stavu, tak v rostlině vysušené. Domněnkou zůstává, zda laktóza jako sacharid živočišný a pro rostlinu tedy nepřirozený působí v médiu jako elicitor (KOVÁČ, 1995) anebo jako prekurzor (KINDL, WÖBER,1984).
46
6.
ZÁVĚR
Produkty sekundárního metabolismu jsou využitelné nejenom v humánní i veterinární medicíně, ale jsou sledovány i z hlediska jejich allelopatického a insekticidního účinku, který by mohl být využit v zemědělství. Produkce sekundárních metabolitů v rostlině kolísá a je ovlivněna klimatickými a půdními podmínkami, sušením a způsobem skladování. Jednou z možností, jak optimalizovat a unifikovat růstové podmínky a následně i lépe statisticky vyhodnotit je využití kultivace rostlin in vitro. Nedílnou součástí médií, užívaných v in vitro kultivaci jsou sacharidy jako zdroj uhlíku, neboť rostlinné explantáty jsou jen zřídka schopny autotrofní výživy. Sacharidy hrají významnou roli při kultivaci in vitro, a to především jako zdroj energie, zdroj uhlíku a jako osmotické agens. V této práci jsem se pokusila o rozšíření poznatků o rostlině Dionaea muscipula Ell., mucholapka podivná. Mezi hlavní obsahové látky této rostliny patří naftochinony. Jsou to sekundární metabolity celé řady rostlinných čeledí a vyznačují se celým spektrem biologických aktivit, vykazují cytotoxické, antibakteriální, fungicidní, antiparazitální a insekticidní vlastnosti. Náplní této práce bylo sledování vlivu primárního metabolismu na obsah sekundárních metabolitů, především plumbaginu, vlivu na růstové a morfologické parametry uvedeného druhu v kulturách in vitro. V provedeném experimentu byla Dionaea muscipula kultivována na médiích, kde byly použity čtyři druhy sacharidů, ve dvou koncentracích (30 g.l-1 a 60 g.l-1) a varianta bez sacharidu. Byly sledovány morfologické parametry( délka řapíku, velikost čepelí a jejich barva, velikost a délka obvodových zubů čepele), nárůst čerstvé hmotnosti, sušina, obsah plumbaginu v extraktu a sušině). Z následujících výsledků vyplývá, že sacharidy v médiu ve srovnání s variantou bez sacharidů mají vliv na všechny sledované parametry. Nárůst nebo pokles čerstvé hmotnosti je vždy vztažen k počáteční čerstvé hmotnosti rostlin při založení pokusu.
47
GLUKÓZA 30 g.l-1
GLUKÓZA 60 g.l-1
Morfologické parametry jsou ovlivněny
Morfologické parametry jsou ovlivněny
Nárůst čerstvé hmotnosti rostlin
Pokles čerstvé hmotnosti
Nárůst sušiny
Nárůst sušiny
Zvýšení obsahu plumbaginu v extraktu Snížení obsahu plumbaginu v extraktu Zvýšení obsahu plumbaginu v sušině
Statisticky neprůkazný rozdíl
FRUKTÓZA 30 g.l-1
FRUKTÓZA 60 g.l-1
Morfologické parametry jsou ovlivněny
Čepele velmi drobné se zakrnělými zuby
Nárůst čerstvé hmotnosti rostlin
Pokles čerstvé hmotnosti
Statisticky neprůkazný rozdíl
Nárůst sušiny
Statisticky neprůkazný rozdíl
Statisticky neprůkazný rozdíl
Statisticky neprůkazný rozdíl
Zvýšení obsahu plumbaginu v sušině
SACHARÓZA 30 g.l-1
SACHARÓZA 60 g.l-1
Morfologické parametry jsou ovlivněny, ale koncentrace je neovlivňuje Nárůst čerstvé hmotnosti rostlin
Nárůst čerstvé hmotnosti rostlin
Nárůst sušiny
Nárůst sušiny
Statisticky neprůkazný rozdíl
Statisticky neprůkazný rozdíl
Zvýšení obsahu plumbaginu v sušině
Statisticky neprůkazný rozdíl
LAKTÓZA 30 g.l-1
LAKTÓZA 60 g.l-1
Morfologické parametry jsou ovlivněny
Čepele velmi drobné se zakrnělými zuby
Nárůst čerstvé hmotnosti rostlin
Pokles čerstvé hmotnosti
Statisticky neprůkazný rozdíl
Nárůst sušiny
Zvýšení obsahu plumbaginu v extraktu Zvýšení obsahu plumbaginu v extraktu Zvýšení obsahu plumbaginu v sušině
Zvýšení obsahu plumbaginu v sušině 48
Z uvedených výsledků můžeme udělat krátké shrnutí. Pouze glukóza 30 g.l-1obsažená v médiu ovlivnila pozitivně všechny parametry, tj. došlo k nárůstu čerstvé hmotnosti, nárůstu sušiny a zvýšení obsahu plumbaginu v extraktu i sušině. Sacharóza v obou koncentracích podporovala nárůst čerstvé hmotnosti i sušiny a laktóza v obou koncentracích zvyšovala obsah plumbaginu jak v čerstvé rostlině, tak v sušině. Vzhledem k tomu, že byl prokázán vliv sacharidů v médiu na morfologii, růst i sekundární metabolismus rostlin, bylo by vhodné experiment rozšířit. Především by bylo nezbytné provést identifikaci použitých sacharidů v médiu ihned po autoklávování, vzhledem k případné hydrolýze a sledovat pH média po celou dobu kultivace. Následně by bylo vhodné sledovat využití sacharidů z média a také stanovit obsah jednotlivých sacharidů v rostlině po kultivaci. Především u laktózy, která se v rostlinách nevyskytuje, by bylo důležité zjistit, zda je po kultivaci obsažena v rostlině. Teprve na základě dalších poznatků se můžeme pokusit osvětlit, jakým způsobem sacharidy, použité při kultivaci, ovlivňují morfologické parametry, růst i sekundární metabolismus.
49
7.
SOUHRN A RESUME
Nedílnou součástí médií, užívaných v in vitro kultivaci jsou sacharidy jako zdroj uhlíku, neboť rostlinné explantáty jsou jen zřídka schopny autotrofní výživy. Sacharidy hrají významnou roli při kultivaci in vitro, a to především jako zdroj energie, zdroj uhlíku a jako osmotické agens. V provedeném experimentu byla Dionaea muscipula kultivována in vitro na médiích, kde byly použity čtyři druhy sacharidů (glukóza, fruktóza,sacharóza,laktóza) ve dvou koncentracích (30 g.l-1 a 60 g.l-1)a varianta bez sacharidu. Byly sledovány morfologické parametry( délka řapíku, velikost čepelí a jejich barva, velikost a délka obvodových zubů čepele), nárůst čerstvé hmotnosti, sušina, obsah plumbaginu v extraktu a sušině). Z uvedených výsledků můžeme udělat krátké shrnutí. Pouze glukóza 30 g.l-1obsažená v médiu ovlivnila pozitivně všechny parametry, tj. došlo k nárůstu čerstvé hmotnosti, nárůstu sušiny a zvýšení obsahu plumbaginu v extraktu i sušině. Sacharóza (30 g.l-1 a 60 g.l-1) podporovala nárůst čerstvé hmotnosti i sušiny a laktóza (30 g.l-1 a 60 g.l-1)
zvyšovala obsah
plumbaginu jak v čerstvé rostlině, tak v sušině.
Sugars as a carbon source are inseparable components of media, which are used in in vitro cultivation. Plant cultures cultivated in vitro are hardly ever capable of autotrophic nutrition. Sugars play an important role in in vitro cultures as an energy and carbon source, as well as an osmotic agent. Dionaea muscipula was cultivated in vitro in media with various sugars in this experiment. Four sugars (glucose, fructose, sucrose, lactose) in two concentrations (30 g.l-1 a 60 g.l-1) and a variant without sugar were used. Morphologic parameters, increase of fresh weight, dry mass, contents of plumbagin in extracts and dry mass were observed. We can make a short resume from the said results. Only glucose 30 g.l-1 in a medium influenced positively all parameters – the increase of the fresh weight, the increase of the dry mass and increases of contents of plumbagin in the extract and in the dry mass. Sucrose (30 g.l-1 a 60 g.l-1) supported the fresh weight increase and the dry mass increase. Lactose (30 g.l-1 a 60 g.l-1) increased contents of plumbagin in the extracts and in the dry mass.
50
8.
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
BABULA, P., ADAM, V., HAVEL L., KIZEK R. (2007): Naftochinony a jejich farmakologické vlastnosti, Česká a slovenská farmacie 56 (3): 114-120. BAGGISH, A. L., HILL, D. R. (2002): Antiparasitic agent Atovaquone, Antimicrob Agents Chemother. 46(5): 1163–1173. BALL, E. (1953): Hydrolysis of sucrose by autoclaving media, a neclected aspect in the culture of plant tissues. B.Torrey Bot. Club 80, 409-411. BRETZLOFF, C.W.Jr. (1954): The growth and fruiting of Sordaria fimicola.Am. J. Bot. 41, 58-67. BURSTROM, H. (1957): Root surface development, sucrose inversion and free space. Physiol. Plant.10, 741-751. DAI, Y., HOU, L. F., CHAN, Y. P., CHENG, L., BUT, P. P. (2004): Inhibition of immediate allergic reactions by ethanol extract from Plumbago zeylanica stems, Biol. Pharm. Bull. 27 (3): 429-432. DING, Y. X., CHEN, Z. J., LIU, S. G., CHE, D. N., VETTER, M.., CHÁNY, C. H. (2005): Inhibition of Nox-4 activity by plumbagin, a plant-derived bioactive naphthoquinone, Journal of Pharmacology 57 (1): 111-116. DORNI, CH. A. I., VIDYALAKSHMI, K. S., VASANTHI, H. R., RAJAMANICKAM, G. V. AND DUBEY, G. P. (2006): Anti-inflammatory activity of Plumbago capensis, Pharmacognosy Magazíne 2 (8): 239-243. DRUART PH. (1988):Regulation of axillary branching in micropropagation of woody fruit species. Acta Hortic. 227, 369-380. DUŠEK,
J., DUŠKOVÁ , J., TŮMOVÁ , L., SPILKOVÁ , J. (1996) :
Biotechnologické využití kultur vyšších rostlin in vitro, Česká a Slovenská Farmacie 45, č.4, 204-212.
51
EDELMAN, J., HANSON, A.D. (1972):Sucrose suppression of chlorophyll synthesis in carrot-tissue cultures. J. Exp. Bot. 23, 469-478. ERNST, R., ARDITTI, J. (1971):Carbohydrate fysiology of orchid seedlings. Am. J. Bot. 58, 827-835. FERGUSON et al. (1958): The carbohydrate nutrition of tomato roots. The promotion and inhibition of excised root growth by various sugars and sugar alcohols. Ann.Bot. 22, 513-524. FUKAMI, T., HILDEBRANDT, A.C. ( 1967): Growth and chlorophyll formation in edible green plant callus tissues in vitro on media with limited sugar supplements. Bot. Mag. Tokyo 80, 199-212. GAUTHERET, R.J. (1945):Une voie nouvelle en biologie végétale: la culture des tissus. Gallimard, Paris. GEORGE, E.F., HALL , M.A., DE KLERK, J.(2007): The Components of Plant Tissue Culture Media II: Organic Additions, Osmotic and pH Effects, and Support Systems., Plant Propagation by Tissue Culture., 3rd Edition, Springer Netherlands, 124. GERSHBEIN, L. L., BROWN, M. E., HOPPESCH, J. P.,YOUNG, D. C. (1995): Sterol composition and distribution in carnivorous plants, Sarracenia flava, Sarracenia purpurea, and Dionaea muscipula, Transactions of the Illinois State Academy of Science 88 (5):13-20. GROSS, K.C., PHARR, D. M., LOCY, R.D. (1981):Growth of callus initiated from cucumber hypocotyls on galactose and galactose-containing oligosaccharides. Plant Sci. Lett. 20, 333-341. GUNNING B.E.S., STEER M. W. (1975):Ultrastructure and the Biology of Plant Cells. Arnold, London. HUANG, L., PARDEE, A. B.(1999): Beta-lapachone induces cell cycle arrest and apoptosis in human colon cancer cells, Mol Med 5: 711-720.
52
CHIANG, J. ET AL. (1993): Three inhibitors of type 1 human immunodeficiency virus analog terminal repeat-directed gene expression and virus replication, Proc. Natl. Acad. Sci 90 (5): 1839-1842. JEŽEK, Z. (1997): Masožravé rostliny, Květ, Praha: 15. KELLER, H. (2001): Carnivora: Pharmacology and Clinical Efficacy of a Most Diverse Natural Plant Extract. Townsend Letter for Doctors and Patients. KINDL, H., WÖBER, G. (1984): Biochemie rostlin, Academia, Praha. KOVÁČ,
J.
(1995):
Explantátové
kultury
rostlin,
Univerzita
Palackého,
Přírodovědecká fakulta, Olomouc, 140 stran. KOZAI, T.(1991): Photoautotrophic micropropagation. In vitro Cell. Dev.-Pl.27, 47-51 KREHER, B., NESZMELYI, A., WAGNER, H. (1990) : Naphtoquinones from Dionaea muscipula, Phytochemistry 29 (2): 605-606. KRENN, L., BEYER, G., PERTZ, H. H., KARALL, E., KREMSER, M., GALAMBOSI, B., MELZIG, M. (2004): In vitro antispasmodic and anti-inflammatory effects of Drosera rotundifolia, Arzneimittelforschung 54 (7): 402-405. KUBÁT, K. (2002): Klíč ke květeně České republiky, Academia, Praha LANGFORD, P.J., WAINWRIGHT, H. (1987):Effects of sucrose concentration on the photosynthetic ability of rose shoots in vitro. Ann. Bot. 60, 633-640. LUX-ENDRICH, A.,TREUTTER, D., FEUCHT, W. (2000): Influence of nutrients and carbohydrate supply on the phenol composition of apple shoot cultures.Plant Cell, Tissue and Organ Culture 60, 15-21. MARETZKI, A., THOM, M. (1978):Characteristics of a galactose adapted sugarcane cell line grown in suspension culture. Plant Physiol. 48, 521-525. MEDINA ,L. F., STEFANI, V., BRANDELLI, A. (2004): Use of 1,4-naphthoquinones for control of Erwinia carotovora, Can J Microbiol 50 (11): 951-956.
53
MIYOSHI, E., SHIZURY, Y., YAMAMURA, S. (1984): Isolation and structures of diomuscinone and diomuscipulone from Dionaea muscipula, Phytochemistry 23 (10): 2385-2387. MORI et al. (1994): Production of anthocyanin from strawberry cell suspension cultures, effects of sugar and nitrogen. J. Food Sci. 59 (3): 588-593. ONDŘEJ, M. (2000): Přítomnost a budoucnost transgenních odrůd rostlin, Živa 48, č.6, str. 243-245, Praha. OPATRNÝ, Z. (1999): Buněčné kultury a jejich využití v experimentální fyziologii rostlin, Habilitační práce, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Praha. PAKULSKI, G., BUDDZIANOWSKI, J. (1996) : Quercetin and kempferol glycosides of Dionaea muscipula from in vitro cultures, Planta Med., 62 (1): 95-96. PAKULSKI, G., BUDZIANOWSKI, J. (1996): Ellagic acid derivates and naphthoquinones
of Dionaea muscipula from in vitro cultures, Phytochemistry 41
(3): 775-778. PERTILE, E., KABLÍK, V. (2006): Instrumentální metody analýzy, VŠB- Tech. Univ. Ostrava, Ostrava. POLLARD, J.K., SHANTZ, E.M. & STEWARD, F.C. (1961): Hexitols in coconut milk: their role in the nurture of dividing cells, Plant Physiol. 36, 492-501. PROCHÁZKA, S., MACHÁČKOVÁ, I., KREKULE, J., ŠEBÁNEK, J. A KOL. (2003): Fyziologie rostlin, Academia, Praha: 217. PROCHÁZKA, S., ŠEBÁNEK ,J. A KOLEKTIV (1997): Regulátory rostlinného růstu, 395 str. Academia Praha. RABE, E. (1990): Stress fysiology: the functional significance of the accumulation of nitrogen-containing compounds. J.Hortic.Sci. 65, 231-243. RIER,
J.P., CHEN , P.K.(1964):Pigment induction in plant tissue cultures, Plant
Physiol.39, Suppl.
54
RIERA, M. et al.(2005): The genetics of adaptive responses to drought stress: abscisic acid-dependent
and
abscisic
acid-independent
signalling
components.
Physiol.Plant.123, 111-119. SAUERWEIN,
M.,
SCHMIDT,
S.,
REICHLING,
J.,
WINK,
M.
(1994):
Naphthoquinone production in vitro cultures of Drosera communis St.Hil., Bioforum Extra, Praha. SHARMA,
I.,
GUSAIN,
D.,
DIXIT,
V.
P.
(1991):
Hypolipidaemic
and
antiatherosclerotic effects of plumbagin in rabbits, Indian J. Physiol. Pharmacol. 35 (1): 10-14. SIMMONDS, M. S. J., MANLOVE, J. D., BLANEY, W. M., KHAMBAY, B. P. S. (2002): Effects of selected botanical insecticides on the behaviour and mortality of the glasshouse whitefly Trialeurodes vaporariorum and the parasitoid Encarsia formosa, Entomologia Experimentalis et Applicata 102 (1): 39-47. SIMONSEN, H. T., ADSERSEN, A., BERTHELSEN, L., CHRISTENSEN, B. S., GUZMAN, A., MOLGAARD, P. (2006): Ethnopharmacological evaluation of radal (leaves of Lomatia hirsuta) and isolation of 2-methoxyjuglone, BMC Complementary and Alternative Medicine 29(6). SLADKÝ, Z., ŠEBÁNEK,J. (1988): Biotechnologie rostlinných explantátů, skriptum Vysoké školy zemědělské v Brně, 100 stran. SOYLU, S. (2002): Induction of Phytoalexin Accumulation in Broad Bean (Vicia faba L.) Cotyledons Following Treatments with Biotc and Abiotic Elicitors, Turk. J. Agric. For. 26, 343 – 348. SRINIVAS, P., GOPINATH, G., BANERJI, A., DINAKAR, A., SRINIVAS, G. (2004): Plumbagin induces reactive oxygen species, which mediate apoptosis in human cervical cancer cells, Molecular Carcinogenesis 40 (4): 201-211. STUDNIČKA, M.(1998): Masožravé rostliny, Academia, Praha. SUCHÝ, V. (1994): Farmakognosie, část speciální, Universita Komenského, Bratislava, 178 stran.
55
ŠVARC, D. (2003): Masožravé rostliny, Sursum, Tišnov. TOKUNAGA, T., TAKADA, N., UEDA, M. (2004): Mechanism of antifeedant aktivity of plumbagin, a compound concerning the chemical defense in carnivorous plant, Tetrahedron Letters 45: 7115-7119. TREUTTER, D. et al. (1985): Flavanone glucosides in callus and phloem of Prunus avium : Identification and stimulation of their synthesis. Physiol.Plant. 65, 95-101. VAN
HUYSTEE,
R.B. (1977):Porphyrin metabolism in peanut cells cultured in
sucrose containing medium. Acta Hortic. 78, 83-87. WELLE, R., SCHRÖDER, G., SCHILTZ, E., GRISEBACH, H., SCHRÖDER, J. (1991): Induced plant responses to pathogen attack : analysis and heterologous expression. WESTON et al. (1968): Sugar absorption and sucrose inversion by excised tomato roots. Ann. Bot. 32, 521-529. WILLIAMSON, E. M. (2002): Major Herbs of Ayurveda, Elsevier Health Science, 361 stran, London. ZAMSKI, E., WYSE, R.E.(1985): Stereospecificity of glukose carrier in sugar beet suspension cells. Plant Physiol.78, 291-295.
56
