ROLE ETYLENU PŘI KULTIVACI ČESNEKU V PODMÍNKÁCH IN VITRO VITRO

ROLE ETYLENU PŘI KULTIVACI ČESNEKU V PODMÍNKÁCH IN VITRO ROLE ETYLENU PŘI KULTIVACI ČESNEKU V PODMÍNKÁCH IN VITRO Fišerová, H., 1 Spálovský, M., 1 Staňková, Z., 1 Kozák, V., 1 Křižan, B., 2 Havel, L. 1 1

Department of Plant Biology, Faculty of Agronomy, Mendel University, Zemědělská 1, 613 00 Brno 2 Department of genetiky - Mendeleum, Faculty of Horticulture, Mendel University, Valtická 337, 691 44 Lednice na Moravě Abstrakt – Česnek kuchyňský nedosahuje při množení v podmínkách in vitro z pletiv či meristémů stroužků uspokojivých koeficientů množení. Po mikroskopickém potvrzení založených meristémů v podpučí stroužku byly testovány 4 varianty kultivačních podmínek – kombinace světla, tmy, tepla a chladu v interakci se změnami obsahu růstových regulátorů v mediu na produkci etylenu a oxidu uhličitého explanátem do prostředí kultivační nádobky. Cílem bylo zjištění, že explantátem zvýšená koncentrace plynů by neměla působit zpětně inhibičně na multiplikaci rostlin. V dalším kroku byly naopak rostliny česneku kultivovány ve zvýšeném prostředí etylenu vytvořeném různými způsoby aplikace 2-chloretylfosfonovou kyselinou. Stonásobné zvýšení koncentrace etylenu v kultivační nádobce vedlo ke zlepšení multiplikace rostlin česneku. Klíčová slova: CEPA – 2 chlorethylfosfonová kyselina, CO2, kultivační podmínky Abstract Česnek kuchyňský nedosahuje při množení v podmínkách in vitro z pletiv či meristémů stroužků uspokojivých koeficientů množení. Po mikroskopickém potvrzení založených meristémů v podpučí stroužku byly testovány 4 varianty kultivačních podmínek – kombinace světla, tmy, tepla a chladu v interakci se změnami obsahu růstových regulátorů v mediu na produkci etylenu a oxidu uhlíku explanátem do prostředí kultivační nádobky. Cílem bylo zjištění, že explantátem zvýšená koncentrace plynů by neměla působit zpětně inhibičně na multiplikaci rostlin. V dalším kroku byly naopak rostliny česneku kultivovány ve zvýšeném prostředí etylenu vytvořeném různými způsoby aplikace 2-chloretylfosfonovou kyselinou. Ani dvojnásobné zvýšení koncentrace etylenu v kultivační nádobce nevedlo k výraznému zlepšení multiplikace rostlin česneku. Key words:CEPA – 2 chlorethylfosfonová kyselina, CO2, kultivační podmínky Úvod Etylen se jako jediný rostlinný hormon vyskytuje v plynném stavu. Zasahuje do růstu a vývoje rostlin. Jeho hydrofobní molekula snadno proniká membránami, zvyšuje jejich propustnost pro průchod látek, příjem iontů a je v interakci s ostatními fytohormony. Fišerová a kol. (2010), Hartman a kol. (2011) potvrzují, že etylen zvyšuje aktivaci a tvorbu α-amylázy v obilkách ječmene, urychluje výstup obilek z dormance a zvyšuje kvalitu vyrobeného sladu. Množením česneku v podmínkách in vitro se zabývala řada autorů (Havel, 1982, Lepitan a Patena, 1992, Roksana a kol. 2002, Křižan a kol. 2010). Snahou naší práce bylo zvýšení koeficientu množení u česneku kuchyňského změnou růstových regulátorů v médích a kultivačními podmínkami. Současně jsme sledovali produkci etylenu a kysličníku uhličitého

explantátem do prostředí kultivační nádobky. Po vyloučení inhibičních účinků nativních plynů byla naopak aplikovaná zvýšená hladina etylenu v kultivační nádobě s cílem přerušení eventuelní dormance explantátu ze stroužku a současného využití antagonistického účinku etylenu a auxinu, který může držet „axilární“ pupeny v inhibici. Materiál a metody K pokusům byly použity in vitro materiály z projektu Ing. B. Křižana, Ph.D. – NAZV QH 71228 a stroužky kultivaru Lukan dodané pěstitelem česneku Ing. Kozákem. Sterilní materiály byly rozpasážovány na poloviční MS (Murashige, Skoog, 1962) medium s pěti variantami obsahu α-naftyloctové kyseliny a benzyladeninu (tab. I) a uloženy v kultivační místnosti (světlo, teplo – 23°C –ST), termostatu (tma, teplo – 23°C – TT), chladničce se světlem (světlo, chlad – 11°C – SCH) a v chladničce ve tmě (tma, chlad – 11°C – TCH). Varianty rostoucí na médiích značení H1 a H10/1 byly uzavřeny víčkem se septem uzpůsobeným k odběru plynů z kultivačních nádob. Plyny byly analyzovány na plynových chromatografech a získané výsledky obsahu etylenu a CO2 byly zpracovány do grafu obr. 1, 2, procentický růst explantátů na médiích H1 a H10/1 do grafu obr. 3 a růst na všech médiích do grafu obr.4. Fotografie explantátů jsou na obr. 5 a, b. Vliv aktivního uhlí na růst explantátu a vliv přídavku CEPA (2-chlorethylphosphonová kyselina) do media před sterilizací (0,01%) a po sterilizaci do nádobky s naklíčenými sterilními obilkami ječmene (1 ml 1% CEPA) – viz obr. 5 c - na multiplikaci a výsledky stanovení obsahu etylenu a CO2 v kultivačních nádobách jsou uvedeny v grafu obr. 6 a 7 a růst rostlin je na obr. 8. Tab. 1: Obsah růstových regulátorů ve sledovaných médiích Značení H1 H2 H5 H10/1 H11

kyselina α-naftyl-octová – NAA (mg.l-1) 1 2 5 1 1

benzyladenin – BA(mg.l-1) 0,1 0,2 5 10 1

Fotografie anatomické stavby stroužku u kultivaru česneku Lukan jsou uvedeny na obr. 9 a-d. Primární kultura in vitro byla založena z podélných a příčných segmentů stroužků kultivaru Lukan po 13 min. sterilizaci v 0,2% HgCl2, a trojím oplachu ve sterilní destilované vodě na mediu H11- obr. 10 a,b. Výsledky a diskuze V prvních dnech založení pokusu se sledováním vlivu kultivačních podmínek na multiplikaci byla nejvyšší produkce etylenu u variant uložených na světle a v chladu (obr. 1). Po druhém týdnu kultivace pak produkce etylenu rostlinami v chladu klesá a zvyšuje se v kultivačních podmínkách tepla a světla – kde byla také vyhodnocena nejvyšší aktivita růstu (obr. 3). Nejnižší aktivita růstu a nejnižší produkce plynů byla ve variantě kultivace v chladu a tmě. Nejvyšší produkce CO2 byla zaznamenána ve variantě tepla a tmy na mediu se zvýšeným obsahem BA (obr. 2), nízká teplota produkci CO2 snižovala. Rostliny nejlépe rostly na médiu s 1 mg.l-1 NAA a s přídavkem 1 a 10 mg.l-1 BA (obr. 5a, b) obdobně jak uvádí Havel (1982). Obr. 1: Produkce etylenu v kultivačních podmínkách kombinace světla a tepla. Obr. 2: Produkce CO2 v kultivačních podmínkách kombinace světla a tepla. Obr. 3: Relativní % růstu rostlin česneku ve variantách kultivačních podmínek. Obr. 4: Relativní % růstu rostlin česneku na médiích s různými variantami obsahu růstových regulátorů. Obr. 5a: Rostlina multiplikující na médiu s obsahem 1 mg.l-1 NAA a 1 mg.l-1 BA . Obr. 5b: Rostlina multiplikující na médiu s obsahem 1 mg.l-1 NAA a 10 mg.l-1 BA .

Obr. 5c: Rostlina rostoucí na médiu s obsahem 1 mg.l-1 NAA a 10 mg.l-1 BA s vloženou skleněnou tabletovkou, kam byla při zakládání pokusu dávkována 1% CEPA (1 ml) se 2 naklíčenými obilkami ječmene, které biologicky uvolňovaly z CEPA plynný etylen do prostředí kultivační nádobky.

Obr. 6: Hodnoty obsahu etylenu v kultivační nádobě z pokusu vlivu etylenu na multiplikaci rostlin česneku – etyl w – H11 medium, etyl A – medium H 11 s přídavkem aktivního uhlí, etyl CEPA – přídavek 0,01% CEPA do media H11, etyl O – uspořádání pokusné varianty viz obr. 5c – 1% CEPA se 2 naklíčenými obilkami ječmene v tabletovce v kultivační nádobce s H11 mediem.

Obr. 7: Hodnoty obsahu CO2 v kultivační nádobě z pokusu vlivu etylenu na multiplikaci rostlin česneku – CO2 w – H11 medium, CO2 A – medium H 11 s přídavkem aktivního uhlí, CO2 CEPA – přídavek 0,01% CEPA do media H11 CO2 O – uspořádání pokusné varianty viz obr. 5c – 1% CEPA se 2 naklíčenými obilkami ječmene v tabletovce v kultivační nádobce s H11 mediem. Obr.8: relativní procento růstu a multiplikace rostlin česneku. Na obr. 6 je potvrzena až 100 x vyšší koncentrace etylenu v kultivační nádobce proti kontrolní variantě (50 nl.l-1) a na obr. 5c je patrné zbytnění rostliny a kořenového systému vliven exogenního etylenu. Varianty s CEPA a obilkou produkovaly více CO2 než varianty kontrolní a v závěru pokusu i u varianty s přídavkem aktivního uhlí dochází ke zvýšení produkce etylenu a obsahu CO2 (obr. 7). Přídavek CEPA do media působil inhibičně oproti kontrole – patrně částečným rozkladem a změnou pH media po sterilizaci – ale multiplikaci zvyšoval, stejně jako přídavek aktivního uhlí – graf 8. Na mikroskopických řezech obr. 9a, b a c rozlišujeme svazky cévní v zásobním listenu (parenchymatických pletivech) stroužku, ve střední části příčný řez prvním listem se základem kořenů a ve středu pletiva podpučí. Na podélném řezu obr. 9d – na bázi preparátu základy kořenů, podpučí se základy listů.

Obr. 9a: příčný řez bází stroužku, síla 30 um, lupa - zvětšení Obr. 9b: příčný řez bází stroužku, síla 30 um, mikroskop - zvětšení Obr. 9c: příčný řez bází stroužku, síla 30 um, lupa - zvětšení Obr. 9d: podélný řez bází stroužku, síla 30 um, lupa - zvětšení

Obr. 10a: týdenní primární kultura založená z bazálních příčných řezů stroužku-kultivar Lukan Obr. 10b: týdenní primární kultura založená z bazálních podélných řezů stroužku-kultivar Lukan

Závěr Pro růst a multiplikaci rostlin česneku je nejvhodnější obsah růstových 1 mg.l-1 NAA a 10 mg.l-1 BA a kultivace na světle a teple. Zvýšení hladiny etylenu v kultivační nádobce ….. …….. Poděkování: Pokusný materiál byl poskytnut Ing. B. Křižanem, Ph.D. z projektu NAZV QH 71228 – Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace. Použitá literatura Fišerová, H., Prokeš, J., Helánová, A., Hartmann, J.: Změny kvality sladu v průběhu posklizňového dozrávání ječmene. Kvasný průmysl. 2010. sv. 58, č. 2, s. 93--99. ISSN 00235830. Hartman, I., Fišerová, H., Helánová, A., Prokeš, J., Hartmann, J.: Ovlivnění kvality sladu exogenní aplikací etylenu v průběhu posklizňového dozrávání ječmene. Kvasný průmysl. 2011. sv. 57, č. 7-8, s. 246--252. ISSN 0023-5830. Havel, L.: Diferenciace rostlin v explantátových kulturách druhů rodu Allium L. Kandidátská disertační práce, ČSAV –Ústav experimentální botaniky, Praha 1982, 1-221. Křižan, B., .. Metodika kultivace a multiplikace česneku v podmínkách in vitro, ….2010 Lapitan, V.P.C., Patena, F.L.: Bublet formation in vitro, a new approach to garlic (Alium sativum L) „basic seed“ production. Philipp. J. Crop Sci. Vol. 17 No. 2 1992. 89-94. Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497 Roksana R., Alam, M.F., Islam, R., Hossain, M.M.: In vitro bublet formation from shoot apex in garlic (Allium sativum L.). Plant Tissue Cult. 12 (1): 11-17, 2002. Kontaktní adresa 1. autora: Dr. Ing. Helena Fišerová, Mendelova univerzita v Brně, Fakulta agronomická, Ústav biologie rostlin, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected]