ANALIS SIS in vitroo TOLERA ANSI ISO OLAT BAK KTERI ASAM LA AKTAT AS SAL DAG GING SAP PI TERHA ADAP pH LA AMBUNG G, pH USU US DAN GARAM G EMPEDU SEBAG GAI KAN NDIDAT PROBIOT P TIK
S SKRIPSI UMAR WIJAYAN NTO
PROGRAM P M STUDI TE EKNOLOGI HASIL TE ERNAK FAKULTA AS PETERN NAKAN INSTITUT PE ERTANIAN N BOGOR 2009
RINGKASAN UMAR WIJAYANTO. D14204030. Analisis in vitro Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging Sapi terhadap pH Lambung, pH Usus dan Garam Empedu sebagai Kandidat Probiotik. Skripsi. Program Studi Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Irma Isnafia Arief, S.Pt, MSi Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Rarah Ratih Adjie Maheswari, DEA Bakteri asam laktat merupakan mikroflora normal daging sehingga lebih sesuai bila dijadikan kultur starter untuk pengolahan produk fermentasi yang berasal dari daging. Syarat utama suatu isolat berpotensi sebagai probiotik adalah memiliki toleransi yang tinggi terhadap asam lambung dan garam empedu dalam saluran pencernaan. Kondisi kritikal yang harus dihadapi bakteri probiotik dalam saluran pencernaan manusia dimulai dari lambung, yaitu bakteri harus mampu bertahan terhadap pH yang sangat rendah (pH 2,0) selama minimal 90 menit. Bakteri probiotik selanjutnya memasuki saluran usus bagian atas (pH 7,2) yang merupakan tempat disekresikan garam empedu. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan seleksi bakteri asam laktat hasil isolasi dari daging sapi dari pasar tradisional di kabupaten Bogor (Arief et al., 2006) untuk mendapatkan kandidat isolat probiotik yang mempunyai karakteristik pertumbuhan terbaik dalam kondisi lingkungan asam kuat HCl sesuai dalam lambung dan adanya garam empedu (0,3%) sesuai usus halus. Penelitian menggunakan dua puluh delapan isolat bakteri asam laktat yang telah diisolasi dari daging sapi. Masing-masing dari isolat bakteri asam laktat diuji kemampuan pertumbuhannya dalam media pH 2,0 sesuai dengan kondisi keasaman pada lambung dan pada pH 7,2 yang sesuai dengan kondisi pH usus halus. Isolat bakteri asam laktat yang mampu tumbuh baik pada perlakuan pH berbeda dengan viabilitas mencapai minimal 5 log10 diuji lebih lanjut pertumbuhannya pada kondisi sesuai dengan usus (pH 7,2) dengan kadar garam empedu 0,3%. Penelitian dilakukan dengan tiga kali ulangan dan pengambilan data secara duplo. Peubah yang diamati adalah jumlah kematian populasi isolat bakteri asam laktat yang diujikan. Populasi yang tinggi menunjukkan toleransi yang baik pada kondisi tersebut. Populasi bakteri asam laktat dihitung dengan metode pour plate pada media MRS-agar. Analisis data menggunakan rancangan acak lengkap pola searah dengan uji lanjut Duncan. Kondisi pH lambung (pH 2,0) maupun pH usus (pH 7,2) nyata (P<0,05) mempengaruhi pertumbuhan isolat bakteri asam laktat asal daging sapi. Sebanyak sepuluh isolat bakteri asam laktat memiliki toleransi yang baik pada kondisi pH lambung (pH 2,0) dengan urutan sebagai berikut 2C12a, 1A5a, 2B2b, 2B4b, 1B1b, 1C4c, 1A2c, 1A32d, 2B1de, dan 2D1ef. Bakteri asam laktat yang mampu bertahan pada pH 2,0 dan pH 7,2 dengan kadar garam empedu 0,3% didapatkan sebanyak tiga isolat dengan urutan toleransi yang terbaik 1A5a, 2B4ab, dan 1B1abc. Ketiga isolat bakteri asam laktat asal daging sapi yaitu 1A5, 2B4, dan 1B1 yang memiliki toleransi paling baik pada kondisi lingkungan pH lambung dan pH usus halus dengan kandungan garam empedu 0,3 % berpotensi digunakan sebagai bakteri kandidat probiotik. Kata-kata kunci : bakteri asam laktat, toleransi asam dan toleransi garam empedu.
ABSTRACT Lactic Acid Bacteria Isolated from Meat with Acid and Bile Salt Tolerance as Probiotics Candidate by in vitro Technique Wijayanto, U., I. I. Arief, and R. R. A. Maheswari Lactic acid bacteria have been reported to be useful as a health adjunct and are commonly added to food as delivery mechanism. As candidate for probiotic, lactic acid bacteria should have the ability to survive in the digestion process such as resistance towards gastrointestinal tract pH and bile salt concentrations. Lactic acid bacteria utilised in this research were isolated from meat. Twenty eight isolates of lactic acid bacteria selected for their resistancy towards gastric juice pH (pH 2,0) and small intestines pH (pH 7,2) with 0,3% bile salt under in vitro conditions. The result showed that all strains well grown in small intestines pH (pH 7,2), but only 10 isolates had good resistance to gastric juice pH. There were significant difference among theme (P<0,05). Bile salt 0,3% with pH 7,2 influenced significantly the growth of lactic acid bacteria selected at gastric juice condition showed that only three strains (1A5, 2B4, and 1B1) showed tolerance (P<0,05) could be used as probiotics candidate in further applications. Key words : lactic acid bacteria, acid tolerant, bile tolerant
ANALISIS in vitro TOLERANSI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL DAGING SAPI TERHADAP pH LAMBUNG, pH USUS DAN GARAM EMPEDU SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK
UMAR WIJAYANTO D14204030
Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
ANALISIS in vitro TOLERANSI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL DAGING SAPI TERHADAP pH LAMBUNG, pH USUS DAN GARAM EMPEDU SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK
Oleh UMAR WIJAYANTO D14204030
Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 25 Agustus 2009
Pembimbing Utama
Pembimbing Anggota
Irma Isnafia Arief, S.Pt, MSi NIP. 19750304 199902 2 001
Dr. Ir. Rarah R. A. Maheswari, DEA NIP. 19620504 198703 2 002
Dekan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Luki Abdullah, M.Sc. Agr. NIP. 19670107 199103 1 003
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 19 Mei 1986 di Bogor Jawa Barat. Penulis adalah anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Subagio dan Ibu Lasiyem. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1998 di SDN Mekarwangi, pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun 2001 di SMPN 6 Bogor dan pendidikan lanjutan menengah atas diselesaikan pada tahun 2004 di SMUN 5 Bogor. Penulis diterima sebagai mahasiswa pada Program Studi Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun 2004. Selama mengikuti pendidikan, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa Produksi Peternakan Institut Pertanian Bogor dan FAMM Al An’aam Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor serta kepanitiaan kegiatan kampus lainnya. Penulis pernah menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah Ilmu dan Teknik Pengolahan Daging ajaran 2007/2008. Salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, penulis melakukan penelitian selama empat bulan dengan judul “Analisis in vitro Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging Sapi terhadap pH Lambung, pH Usus dan Garam Empedu sebagai Kandidat Probiotik“, dibawah bimbingan Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si dan Dr. Ir. Rarah Ratih Adjie Maheswari, DEA.
KATA PENGANTAR Assalamua’alaikum wr.wb. Puji syukur kami panjatkan Kehadirat Allah SWT, karena berkat rahmat dan hidayah-Nya penulis diberikan kesempatan untuk menyelesaikan skripsi dengan judul Analisis in vitro Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging Sapi terhadap pH Lambung, pH Usus dan Garam Empedu sebagai Kandidat Probiotik. Tidak lupa shalawat dan salam bagi junjungan kami Nabi besar Muhammad SAW yang selalu kita nantikan syafaatnya di hari akhir kelak. Penelitian dalam skripsi ini bertujuan untuk mendapatkan kandidat probiotik hasil isolat daging. Ada beberapa syarat bagi suatu isolat dapat dikatakan sebagai probiotik, yaitu mampu tahan terhadap asam dan garam empedu. Mikroba-mikroba yang umum digunakan dalam pembuatan makanan dan minuman probiotik terutama berasal dari kelompok bakteri asam laktat (BAL). Bakteri asam laktat merupakan mikroflora normal yang terdapat di dalam daging. Kondisi lingkungan terutama sangat mempengaruhi kemampuan, ketahanan dan kinerja dari masing-masing isolat. Oleh karena itu diperlukan seleksi pada bakteri asam laktat yang terdapat di daging sehingga didapatkan isolat yang potensial sebagai probiotik. Demikian skripsi ini disusun, penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini. Kritik dan saran selalu kami harapkan dan semoga bermanfaat bagi para pembaca. Wassalamu’alaikum wr.wb.
Bogor, September 2009 Penulis
DAFTAR ISI Halaman RINGKASAN............................................................................................
i
ABSTRACT ..............................................................................................
ii
LEMBAR PERNYATAAN ......................................................................
iii
LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................
iv
RIWAYAT HIDUP ...................................................................................
v
KATA PENGANTAR ...............................................................................
vi
DAFTAR ISI .............................................................................................
vii
DAFTAR TABEL .....................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR.................................................................................
x
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................
xi
PENDAHULUAN .....................................................................................
1
Latar Belakang ............................................................................... Tujuan ............................................................................................
1 2
TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................
3
Probiotik ......................................................................................... Bakteri Asam Laktat ...................................................................... Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik ......................................... Lambung, Hati dan Kandung Empedu Manusia ........................... Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap Asam Lambung ... Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap Garam Empedu ...
3 4 7 10 12 13
METODE...................................................................................................
15
Lokasi dan Waktu .......................................................................... Materi ............................................................................................. Rancangan Percobaan .................................................................... Prosedur ......................................................................................... Penyegaran dan Penghitungan Populasi Awal ................... Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap pH Lambung (2,0) dan pH Usus (7,2) ..................................... Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap Garam Empedu................................................................... Peubah ............................................................................................
15 15 15 16 17
HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................
21
Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap pH lambung (2,0) dan pH Usus (7,2) ......................................................................... Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap Garam Empedu 0,3% ....................................................................
17 18 20
21 26
KESIMPULAN .........................................................................................
31
Kesimpulan .................................................................................... Saran...............................................................................................
31 31
UCAPAN TERIMA KASIH .....................................................................
32
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
33
LAMPIRAN... ...........................................................................................
38
viii
DAFTAR TABEL
Nomor
Halaman
1. Mikroorganisme yang Digunakan dalam Produk Probiotik ...........
10
2. Rataan Populasi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging Sapi pada pH 2,0 dan 7,2 ...............................................................
22
3. Rataan Populasi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging Sapi pada Garam Empedu 0,3% .....................................................
27
DAFTAR GAMBAR
Nomor
Halaman
1.
Skema Jalur Fermentasi Heksosa oleh Bakteri Asam Laktat .......
7
2.
Bagian-bagian Lambung Manusia ................................................
11
3.
Lokasi Hati, Lambung, dan Kandung Empedu dalam Saluran Pencernaan Manusia ........................................................
12
Tahapan Seleksi Bakteri Asam Laktat sebagai Kandidat Probiotik ........................................................................
16
Diagram Alir Pengujian Toleransi Bakteri Asam Laktat terhadap pH 2,0 dan 7,2 ...............................................................
18
Diagram Alir Pengujian Toleransi Bakteri Asam Laktat terhadap Garam Empedu 0,3% ....................................................
19
Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik .........
29
4. 5. 6. 7.
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor
Halaman
1. Hasil Sidik Ragam Jumlah Kematian Populasi 28 Isolat Bakteri Asam Laktat pada pH Lambung (2,0)...........................................
39
2. Hasil Sidik Ragam Jumlah Kematian Populasi 28 Isolat Bakteri Asam Laktat pada pH Usus (7,2) ..................................................
39
3. Hasil Sidik Ragam Jumlah Kematian Populasi 10 Isolat Bakteri Asam Laktat pada Garam Empedu 0,3% ......................................
39
PENDAHULUAN Latar Belakang Ilmu pengetahuan dan teknologi saat ini berkembang dengan pesat dan telah membawa perubahan pada pola pikir masyarakat tentang diet dan kesehatan. Pengetahuan gizi yang meningkat, mengakibatkan masyarakat semakin selektif dalam menentukan bahan pangan yang akan dikonsumsinya. Salah satu makanan kesehatan yang berkembang saat ini adalah pangan probiotik. Istilah probiotik didefinisikan oleh Naidu dan Clemens (2000) sebagai makanan atau minuman yang mengandung mikroba hidup yang memiliki pengaruh menguntungkan
bagi
yang
mengkonsumsinya
dengan
cara
meningkatkan
keseimbangan mukosa usus. Salah satu prasyarat mikroorganisme probiotik agar dapat memberikan dampak positif terhadap kesehatan adalah mempunyai viabilitas yang tinggi atau ketahanan hidup mikroba probiotik setelah melalui saluran pencernaan. Beberapa karakteristik yang diperlukan bagi suatu isolat berpotensi sebagai probiotik adalah mampu melewati stress di lambung karena asam lambung yang tinggi dan dapat bertahan terhadap garam empedu pada usus halus sehingga mampu bertahan hidup dalam usus besar. Viabilitas sel bakteri yang menjadi kandidat probiotik harus berkisar antara 107-109 agar mampu bertahan di saluran pencernaan dan tentu saja kemampuan dari probiotik tersebut harus telah terbukti. Menurut Fardiaz (1992) bakteri asam laktat merupakan mikroflora normal yang terdapat di dalam daging atau dapat ditambahkan sebagai kultur starter untuk memfermentasi produk-produk dengan karakteristik yang dikehendaki. Bakteri asam laktat merupakan salah satu jenis bakteri yang dapat berfungsi sebagai bakteri probiotik. Bakteri asam laktat sebagai probiotik memiliki mekanisme untuk mempertahankan mikroflora saluran pencernaan sehingga dapat memperbaiki gangguan saluran pencernaan pada inangnya. Mikroflora usus adalah ekosistem yang kompleks, terdiri atas berbagai jenis bakteri dalam jumlah yang besar. Penelitian terdahulu (Arief et al., 2006) telah berhasil melakukan isolasi terhadap bakteri asam laktat yang berasal dari daging sapi dari pasar tradisional di kabupaten Bogor telah diaplikasikan sebagai kultur starter untuk pembuatan produk daging fermentasi (salami). Karakterisasi bakteri asam laktat sebagai bakteri
probiotik menarik untuk dilakukan, sehingga akan diperoleh bakteri asam laktat yang memiliki fungsi ganda. Tujuan Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan seleksi bakteri asam laktat hasil isolasi dari daging sapi untuk mendapatkan kandidat isolat probiotik dengan karakteristik pertumbuhan terbaik dalam kondisi lingkungan pH lambung (pH 2), pH usus (pH 7,2) dan adanya garam empedu 0,3%. Toleransi bakteri asam laktat kandidat probiotik akan menunjukkan pertumbuhan yang tinggi walaupun ditumbuhkan pada kondisi yang kritis yaitu pH 2,0 dan pH 7,2 dengan kandungan garam empedu 0,3%.
2
TINJAUAN PUSTAKA Probiotik Istilah probiotik pertama kali dicetuskan untuk mendeskripsikan senyawa yang
dihasilkan
mikroorganisme
yang
dapat
menstimulir
pertumbuhan
mikroorganisme lain. Definisi probiotik digunakan pada pemberian pakan ternak yang disuplementasi dengan mikroba pada tahun 1960 untuk membantu hewan ternak khususnya dalam saluran pencernaannya. Fuller (1999) menyatakan bahwa probiotik
adalah mikroorganisme yang bila dikonsumsi, baik dalam bentuk sel
kering maupun produk fermentasi memberikan efek menguntungkan dengan memperbaiki sifat mikroflora indigenous. Selanjutnya definisi probiotik berkembang menjadi makanan suplemen berupa mikroba hidup yang memiliki keuntungan kepada manusia khususnya dalam keseimbangan mikroflora usus (Shortt, 1999). Definisi tersebut diperluas oleh para ahli dari Eropa dengan mempertimbangkan mekanisme probiotik selain yang diperantarai mikroflora usus. Probiotik adalah bahan
pangan
berupa
mikroorganisme
hidup
yang
mempunyai
pengaruh
menguntungkan terhadap kesehatan manusia. Definisi lain tentang probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup atau komponen dari sel mikroba yang memiliki pengaruh menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya (Salminen et al., 1999). Definisi tersebut memiliki implikasi bahwa probiotik tidak selalu harus berupa sel hidup karena telah terbukti bahwa probiotik dalam bentuk sel yang tidak hidup juga menunjukkan pengaruh positif terhadap kesehatan inang (Ouwehand dan Salminen, 1998). Probiotik sangat penting bagi tubuh karena menunjukkan peranan fisiologis yang penting dalam menjaga keseimbangan mikroflora saluran pencernaan sehingga terbentuk suatu ekosistem yang unik, yaitu terjadi interaksi yang kompleks yang bekerja secara sinergis dan antagonistis tergantung dari strain yang terlibat, jumlah dan aktivitas metaboliknya (Mattila-Sandholm et al., 1999) Sejumlah peneliti juga mengungkapkan beberapa pengaruh positif bagi kesehatan dari probiotik yaitu (a) meningkatkan ketahanan terhadap penyakit infeksi terutama infeksi usus dan diare, (b) menurunkan tekanan darah/ antihipertensi, (c) menurunkan konsentrasi kolesterol serum darah, (d) mengurangi resiko lactose intolerance, (e) mempengaruhi respon imun, (f) memudahkan pencernaan, (g)
menurunkan resiko terjadinya tumor dan kanker kolon dan (h) bersifat antimutagenik serta bersifat anti karsinogenik (Kusumawati, 2002). Menurut Shortt (1999), ada beberapa kriteria yang perlu dipertimbangkan untuk mendapatkan produk probiotik dengan pengaruh positif optimal bagi inangnya, diantaranya adalah : (a) spesies bakteri probiotik sebaiknya tidak bersifat patogen, (b) toleran terhadap asam dan garam empedu, (c) memiliki kemampuan menempel dan mengkolonisasi usus, (d) memiliki kemampuan untuk bertahan selama proses pengolahan dan selama waktu penyimpanan, (e) memiliki karakteristik sensor yang baik, (f) memiliki sifat antagonistik terhadap mikroba patogen enterik, (g) terbukti memiliki pengaruh menguntungkan bagi kesehatan inang, (h) produk probiotik diharapkan memiliki jumlah sel hidup yang besar (107-109 cfu/ml) dan (i) total konsumsi produk probiotik sekitar 300-400 gram per minggu. Dua alasan terakhir diperlukan untuk memperkirakan bahwa tersedia cukup bakteri probiotik dalam tubuh untuk memberi pengaruh positif (Tannock, 1999). Efek probiotik dapat dipertahankan jika makanan pembawa mengandung minimal organisme probiotik 106-108 cfu/ml (Svensson, 1999), atau 108-1010 cfu/gr (preparat kering) (Vinderola et al., 2000). Konsumsi minimal per hari dianjurkan oleh Gilliland (1989) adalah 106-109 sel. Konsumsi probiotik sebaiknya teratur karena waktu kolonisasi dari mikroorganisme probiotik bersifat terbatas, ditambah lagi adanya kompetisi dengan mikroorganisme intestinal patogen. Bakteri Asam Laktat Salah satu jenis bakteri yang umum terdapat di daging adalah bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat dicirikan sebagai bakteri Gram positif, tidak membentuk spora, katalase negatif tetapi kadang-kadang terdeteksi katalase semu pada kultur yang ditumbuhkan pada konsentrasi gula rendah, anaerob aerotoleran, tahan asam, fermentatif, berbentuk batang dan bulat, habitatnya harus kaya nutrisi, dengan komposisi basa DNA kurang dari 50% mol G+C (Axelsson, 1998; Adam dan Moss, 1995; Pot et al., 1994). Fardiaz (1992) mengatakan bahwa bakteri asam laktat merupakan mikroflora normal yang terdapat di dalam daging. Kultur starter untuk produk daging yang pertama kali diproduksi secara komersial adalah Pediococcus cereviseae. Pengujian laktobasili pernah dilakukan sebelumnya tetapi mengalami kesulitan dalam 4
komersialisasi karena bakteri ini tidak tahan lyofilisasi. Gilliland (1986) mengatakan bahwa untuk kultur starter yang umum untuk produk-produk daging, isolat terbanyak yang ditemukan dalam produk-produk fermentasi daging adalah berbagai varian dari Lactobacillaceae. Menurut Hayakawa (1992), bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang menguntungkan, mampu memfermentasi gula sebagai sumber energi untuk memproduksi asam laktat dalam jumlah besar dan jika memecah protein, tidak membentuk senyawa putrefaktif (senyawa yang berbau busuk). Bakteri asam laktat sering digunakan dalam proses pengolahan pangan, misalnya pada pengolahan susu seperti yogurt, kefir, keju; dalam fermentasi sayuran seperti sauerkraut, pikel, kecap kedelai, miso; dalam fermentasi ikan seperti kecap ikan dan pasta ikan; dalam pembuatan silase seperti bakteri E. faecium dan E. faecalis; serta dalam pengolahan daging seperti sosis fermentasi, salami probiotik dan daging fermentasi. Klasifikasi bakteri asam laktat berdasarkan beberapa hal yaitu: morfologinya, kemampuan memfermentasi glukosa, perbedaan tumbuh pada suhu-suhu tertentu, konfigurasi produksi asam laktat, kemampuan untuk tumbuh pada konsentrasi garam tinggi dan kemampuan toleransinya terhadap asam dan basa. Jay (1996) mengatakan bahwa bakteri asam laktat bersifat mesofilik dan termofilik, beberapa dapat tumbuh pada suhu 5oC dan tertinggi 45oC, dapat bertahan pada pH 3,2 dan pada pH yang lebih tinggi (9,6), beberapa hanya bisa tumbuh pada kisaran pH yang sempit (4,0-4,5). Pot et al. (1994) menyatakan bahwa semula bakteri asam laktat diklasifikasikan menjadi 4 genus yaitu Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, yang didasarkan pada ciri morfologi, tipe fermentasi, kemampuan tumbuh pada suhu yang berbeda, sifat stereospesifik (D atau L laktik), serta toleransi terhadap asam dan basa. Klasifikasi bakteri asam laktat terus berkembang,
sehingga
genus
Lactobacillus
menjadi
Lactobacillus
dan
Carnobacterium. Genus Streptococcus menjadi 4 yaitu Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus
dan
Enterococcus.
Genus
Pediococcus
menjadi
Pediococcus,
Tetratogenococcus dan Aerococcus. Sementara tidak ada perubahan pada genus Leuconostoc. Klasifikasi yang baru tersebut dihasilkan dengan mempertimbangkan komposisi asam lemak pada membran sel, motilitas dan urutan rRNA, serta persen guanin dan sitosin pada DNA. Klasifikasi spesies sering juga dicantumkan toleransinya terhadap garam dan pH, pertumbuhan pada suhu yang berbeda dan
5
konfigurasi produksi asam laktat. Berdasarkan pada perbedaan fenotip atau sifat biokimia, bakteri asam laktat dibedakan dalam kemampuan memfermentasi karbohidrat, menghidrolisis arginin, pembentukan asetoin, toleransi pada garam empedu, kemampuan menghemolisis, produksi polisakarida ekstraseluler, keperluan faktor pertumbuhannya, dihasilkannya beberapa enzim seperti β-galaktosidase dan βglukuronidase, karakteristik pertumbuhan dalam susu dan pembedaan dalam serologinya (Axelsson, 1998; Pot et al., 1994). Karakterisasi lebih lanjut meliputi pendekatan molekuler. Pendekatan ini meliputi perbedaan asam diamin dalam peptidoglikan, adanya dan perbedaan asam teikoat, adanya dan perbedaan menaquinon, rasio guanin + cytosin (G+C) dalam DNA, komposisi asam lemak dan keaktifan elektroporesis dari laktat dehidrogenase (LDH). Pengklasifikasian yang tidak kalah penting adalah perbedaannya dalam memfermentasi glukosa yang dibagi dalam heterofermentatif dan homofermentatif (Fardiaz, 1989). Bakteri asam laktat heterofermentatif yaitu memfermentasi glukosa menjadi asam laktat melalui jalur fosfoketolase, etanol atau asam asetat dan CO2, sedangkan homofermentatif mengubah keseluruhan glukosa menjadi asam laktat melalui jalur glikolisis. Bakteri asam laktat yang bersifat homofermentatif misalnya: Lactobacillus sp. dan Bacillus dextrolacticus. spesies Lactobacillus antara lain Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Pediococcus cerevisae dan Streptococcus paecalis. Bakteri asam laktat yang bersifat heterofermentatif yaitu Leuconostoc mesentroides dan Lactobacillus brevis (Fardiaz, 1992). Jalur glikolisis (Embden-Meyerhof-Parnas) merupakan jalur yang digunakan oleh seluruh bakteri asam laktat kecuali Leuconostoc, grup lactobacillus dengan heterofermentasi obligat, oenococcus dan wissellas. Selain glukosa, bakteri asam laktat juga mampu memfermentasi heksosa seperti manosa, galaktosa dan fruktosa. (Salminen et al., 2004). Jalur fermentasi heksosa oleh bakteri asam laktat dapat dilihat pada Gambar 1.
6
Glukosa Fru-1,6P
Fru-6P
Glu-6P
Asetil-P + Eritrosa-4P Triose-3P
6P-Glukonat
Fru-6P
Heptosa-P + Pentosa-P Selulosa-5P + CO2 Fosfoketolase Piruvat Asetil-P + Triosa-3P
Asetil-P + Triosa-3P
ADP ATP
Laktat Acetate
ADP ATP
Laktat
Asetat (Etanol)
Laktat Laktat
Glikolisis Homofermentasi
Jalur Bifidus
Jalur 6P-Glukonat (Heterofermentasi) (Jalur Fosfoketolase)
Gambar 1. Skema Jalur Fermentasi Heksosa oleh Bakteri Asam Laktat (Kandler, 1983) Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik Bakteri asam laktat yang bersifat sebagai probiotik pada pencernaan manusia merupakan mikroflora normal usus, terdiri atas Bifidobacteria dan Lactobacillus acidophilus (Gomes dan Malcata, 1999). Selanjutnya Fuller (1992) mengatakan bahwa bakteri asam laktat digunakan sebagai probiotik karena mampu : (1) menghasilkan asam laktat yang dapat menurunkan pH, (2) dalam kondisi aerob memproduksi hidrogen peroksida, (3) memproduksi komponen penghambat yang spesifik misalnya bakteriosin. Bakteri asam laktat memiliki peranan yang penting pada kehidupan manusia, karena kemampuannya untuk menghasilkan makanan fermentasi maupun kemampuannya untuk hidup di dalam saluran pencernaan. Penelitian bakteri asam laktat yang berpotensi probiotik untuk kesehatan telah banyak dilakukan contohnya adalah manfaat probiotik pada penyakit gangguan saluran pencernaan. Menurut Mitsuoka (1990), bakteri asam laktat dapat dibagi atas 4 grup, berdasarkan keberhasilan hidupnya di dalam saluran pencernaan manusia, yaitu (1) grup yang berhasil hidup di dalam lumen usus dan merupakan organisme yang paling banyak ditemukan dalam spesimen usus manusia, contohnya galur-galur dari 7
Bifidobacterium, (2) grup yang berhasil hidup di dalam lumen usus dan sering ditemukan dalam spesimen usus manusia, contohnya Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri), (3) grup yang berhasil hidup di dalam lumen usus dan kadang-kadang ditemukan dalam spesimen usus manusia, contohnya Lactobacillus (Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis) dan (4) grup yang sering digunakan dalam pembuatan produk susu dan tidak dapat dijumpai dalam spesimen usus manusia, contohnya Lactobacillus (Lactobacillus bulgaricus) dan Laktokoki (Streptococcus thermophilus, Streptococcus cremoris). Naidu dan Clemens (2000) menyatakan bahwa bakteri asam laktat dengan aktivitas probiotiknya berperan penting dalam mengatur ekosistem saluran pencernaan. Aktivitas probiotik terbagi atas 3 spektrum, yaitu nutrisi, fisiologi dan efek antimikroba. Aspek nutrisi berupa penyediaan enzim untuk membantu metabolisme komponen makanan (laktase), sintesis beberapa vitamin (K, folat, piridoksin, pantotenat, biotin dan riboflavin) dan menghilangkan racun metabolit komponen makanan di dalam usus. Aspek fisiologi meliputi kemampuan menjaga keseimbangan komposisi mikroflora usus dan menstimulasi sistem kekebalan usus. Efek antimikroba yang dimiliki oleh probiotik yaitu kemampuannya untuk memperbaiki ketahanan terhadap bakteri patogen. Pertumbuhan dan metabolisme dari spesies bakteri pada usus tergantung dari substrat yang tersedia, yang umumnya berasal dari makanan yang dikonsumsinya. Wright dan Salminen (1999) menyatakan kelebihan bakteri asam laktat adalah kemampuannya untuk bertahan hidup mengkolonisasi usus, memproduksi asam laktat, bakteriosin dan merangsang pembentukkan antibodi tubuh. Menurut Evanikastri (2003), untuk bersifat sebagai probiotik maka bakteri asam laktat harus memiliki beberapa syarat sebagai berikut : (1) tahan terhadap asam, terutama asam lambung yang memiliki pH antar 1,5-2,0 sewaktu tidak makan dan pH 4,0-5,0 sehabis makan, sehingga mampu bertahan dan hidup lama ketika melalui lambung dan usus, (2) stabil terhadap garam empedu dan mampu bertahan hidup selama berada pada bagian usus kecil. Empedu disekresikan ke dalam usus untuk membantu absorbsi lemak dan asam empedu yang terkonjugasi dan diserap dari usus kecil, (3) memproduksi senyawa antimikroba seperti asam laktat, hidrogen peroksida dan bakteriosin, (4) mampu menempel pada sel usus manusia, faktor penempelan oleh
8
probiotik merupakan syarat untuk pengkolonisasian, aktivitas antagonis terhadap patogen, pengaturan sistem daya tahan tubuh dan mempercepat penyembuhan infeksi, (5) tumbuh baik dan berkembang dalam saluran pencernaan, sebagai probiotik tentu saja kemampuan untuk tumbuh harus diperhatikan. Pada beberapa genus bifidobakteria dan laktobasili dapat tumbuh baik pada saluran pencernaan tanpa adanya oksigen, (6) koagregasi membentuk lingkungan mikroflora normal dan seimbang, koagregasi juga mencerminkan kemampuan interaksi antar kultur untuk saling menempel dan (7) aman digunakan oleh manusia. Uji secara in vivo merupakan salah satu indikator bahwa probiotik tersebut dapat dikonsumsi oleh manusia. Fermented Milks and Lactic Acid Bacteria Association yang berkedudukan di Jepang mensyaratkan jumlah minimal 1 x 107 bifidobacteria setiap g atau ml produk makanan probiotik. Jumlah sel mikroba hidup yang harus terdapat pada produk probiotik masih menjadi perdebatan, akan tetapi umumnya adalah sebesar 106-108 cfu/ml (Tannock, 1999). Ditambahkan pula oleh Charteris et al. (1998) yang menyatakan bahwa jumlah minimal mikroorganisme probiotik dalam bioproduk untuk dapat memberikan manfaat kesehatan adalah 109-1010 cfu/100g produk. Penelitian mengenai bakteri asam laktat sebagai kandidat probiotik telah banyak dilakukan pada bidang kesehatan, probiotik banyak diteliti berkaitan dengan kemampuannya mengatasi gangguan pencernaan. Gill dan Guarner (2004) mengatakan beberapa gangguan pencernaan dapat berupa inflamasi pada saluran pencernaan. Selain itu juga sebagai penghasil antimikroba, bakteri asam laktat dapat menghambat bakteri patogen sehingga dapat mencegah terjadinya diare dan infeksi usus. Menurut Bernet et al. (1993) bakteri asam laktat dari genus Bifidobacteria dan Lactobacillus telah terbukti memilki efek probiotik pada manusia. Keberadaan Lactobacillus dalam saluran pencernaan dapat menjaga keseimbangan ekosistem mikroba dalam usus. Bakteri asam laktat juga dapat bersifat sebagai imunomodulator untuk meningkatkan daya tahan tubuh (Erickson, 2000). Keuntungan lain dari mengkonsumsi bakteri asam laktat adalah menstimulir pergerakan usus. Stimulasi pergerakan usus ini terkait dengan waktu transit di dalam usus (lamanya transit). Jika bakteri asam laktat mampu bertahan lama dalam usus maka akan menstimulir pergerakan peristaltik di usus, sehingga waktu transit feses akan lebih singkat.
9
Tabel 1. Mikroorganisme yang Digunakan dalam Produk Probiotik Bakteri Asam Laktat lainnya E. faecium
Bukan Bakteri Asam Laktat B. cereus
Lactobacilli
Bifidobacteria
L. acidophilus
B. animali
L. casei
B. breve
E. coli
L. johnsonii
B. infantis
S. boulardi
L. reuteri
B. longum
Cl. butyricum
L. salivarus
B. adolescentis
L. plantarum
B. lactis
L. crispatus
B. bifidum
L. rhamnosus Sumber : Shortt 1999.
Lambung, Hati dan Kandung Empedu Manusia Lambung berbentuk seperti huruf J dan merupakan pembesaran dari saluran pencernaan. Lambung dibagi oleh ahli anatomi menjadi empat bagian, yaitu bagian fundus, kardiak, “body” atau badan dan pilorus. Bagian kardiak mengelilingi lower esophageal sphincter. Bagian bulat yang terletak diatas dan disebelah kiri bagian kardiak adalah fundus. Di bawah fundus adalah bagian pusat yang terbesar dari lambung, yang disebut dengan “body” atau badan lambung. Bagian yang menyempit, pada daerah inferior adalah pilorus. Sekresi dari getah lambung diatur oleh mekanisme syaraf dan hormonal. Impuls parasimpatis yang terdapat pada medulla dihantarkan melalui syaraf vagus dan merangsang gastric glands untuk mensekresikan pepsinogen, asam klorida, mukus dan hormon gastrin. Asam klorida (HCl) terlibat dalam perubahan pepsinogen menjadi enzim aktif yaitu pepsin dan faktor intrinsik, terlibat dalam penyerapan vitamin B12 untuk produksi sel darah merah, yang diproduksi oleh sel parietal. HCl juga memiliki fungsi mengasamkan makanan, sebagai antiseptik dan desinfektan dan membuat suasana asam pada pepsinogen sehingga menjadi pepsin. Larutan ini adalah asam kuat dan merupakan komponen utama dalam asam lambung.
10
Gambar 2. Bagian-Bagian Lambung Manusia Hati dan kandung empedu terletak di perut kanan bagian atas dan keduanya dihubungkan oleh suatu saluran yang dikenal sebagai duktus biliaris (saluran empedu). Meskipun memiliki saluran penghubung dan keduanya berperan dalam fungsi yang sama, tetapi hati dan kandung empedu sangat berbeda satu sama lain. Hati berbentuk seperti baji dan merupakan pabrik kimia pada tubuh manusia. Hati merupakan suatu organ kompleks yang melaksanakan berbagai fungsi vital, mulai dari mengatur kadar bahan kimia dalam tubuh sampai menghasilkan zat-zat pembekuan darah. Salah satu fungsi utamanya adalah menghancurkan zat-zat yang berbahaya yang diserap dari usus atau dibuat di bagian tubuh lainnya, kemudian membuangnya sebagai zat yang tidak berbahaya ke dalam empedu atau darah. Kandung empedu berbentuk seperti buah pir dan merupakan tempat penyimpanan empedu. Empedu mengalir dari hati melalui duktus hepatikus kiri dan kanan, lalu keduanya bergabung membentuk duktus hepatikus utama. Duktus hepatikus utama bergabung dengan saluran yang berasal dari kandung empedu (duktus sistikus) membentuk saluran empedu utama. Saluran empedu utama masuk ke usus bagian atas pada sfingter Oddi, yang terletak beberapa sentimeter di bawah lambung. Unsur utama empedu adalah air (97%), elektrolit, garam empedu fosfolipid, kolesterol dan 11
pigmen empedu (terutama bilirubin terkonjugasi). Garam empedu penting untuk pencernaan dan absorpsi lemak dalam usus halus. Oleh bakteri usus halus sebagian besar garam empedu direabsorpsi dalam ileum, mengalami resirkulasi ke hati, kemudian mengalami rekonjugasi dan resekresi. Garam empedu menyebabkan meningkatnya kelarutan kolesterol, lemak dan vitamin yang larut dalam lemak, sehingga membantu penyerapannya dari usus.
Gambar 3. Lokasi Hati, Lambung dan Kandung Empedu dalam Saluran Pencernaan Manusia Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap Asam Lambung Toleransi terhadap asam lambung merupakan syarat penting suatu isolat untuk dapat menjadi probiotik. Hal ini disebabkan bila isolat tersebut masuk ke dalam saluran pencernaan manusia, salah satu kondisi yang menekan adalah pada saat di lambung, yang memiliki pH sekitar 2,5 sehingga bakteri asam laktat harus mampu bertahan hidup (Jacobsen et al., 1999). Hasil sekresi dari lambung dikenal dengan istilah getah lambung berupa cairan jernih berwarna kuning pucat yang mengandung HCl 0,2-0,5% dengan pH sekitar 1,5 (bila lambung dalam kondisi benar-benar kosong). Getah lambung terdiri atas air (97-99%), musin (lendir) serta garam anorganik, enzim pencernaan (pepsin serta renin) dan lipase. Berrada et al. (1991) menyatakan bahwa waktu yang diperlukan mulai saat bakteri masuk sampai keluar dari lambung sekitar 90 menit. Isolat yang diseleksi untuk digunakan sebagai
12
probiotik harus mampu bertahan dalam keadaan asam lambung selama sedikitnya 90 menit. Booth dan Kroll (1989) menyatakan bahwa asam kuat seperti HCl menyebabkan penurunan pH eksternal. Asam kuat menyebabkan enzim-enzim yang terdapat pada permukaan sel terdenaturasi oleh pH rendah sehingga menurunkan pH sitoplasma akibat peningkatan permeabilitas proton pada gradien pH yang besar. Bakteri asam laktat adalah mikroorganisme fermentatif yang mampu tumbuh pada kisaran pH yang luas. Diantara genus bakteri asam laktat, spesies-spesies dalam laktobasili dikenal memiliki ketahanan yang baik dalam kondisi asam. Pertahanan utama sel bakteri dari lingkungannya adalah membran seluler yang terdiri atas struktur lemak dua lapis. Paparan sel bakteri dalam lingkungan yang sangat asam dapat menyebabkan kerusakan pada membran sel tersebut dan keluarnya komponenkomponen intraseluler yang mengakibatkan kematian sel. Bakteri yang toleran terhadap asam, membran selnya lebih tahan terhadap kebocoran akibat pH rendah dibandingkan dengan yang tidak tahan asam (Bender et al., 1986). Tidak seperti bakteri netrofilik (hanya tumbuh pada kondisi pH mendekati netral) yang menjaga pH intraselulernya mendekati netral, pada bakteri asam laktat terjadi perubahan dinamis pH intraseluler seiring dengan terjadinya penurunan pH ekstraseluler (Nannen dan Hutkins 1991; Siegumfeldt et al., 2000) sehingga tidak terjadi gradien proton yang besar. Bakteri asam laktat tidak hanya tumbuh dengan lambat pada pH rendah, tapi kerusakan akibat asam dan hilangnya viabilitas juga dapat terjadi pada sel bakteri yang terpapar pada pH rendah. Tiap galur memiliki ketahanan berbeda terhadap asam atau pH rendah. Ada beberapa kemungkinan mekanisme bagaimana bakteri mengatur pH internal tetapi yang paling penting adalah translokasi proton oleh enzim ATP-ase (Hutkins dan Nannen, 1993). Parameter lain yang terlibat dalam pengaturan pH internal adalah permeabilitas membran plasma terhadap proton. Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat terhadap Garam Empedu Toleransi isolat bakteri asam laktat terhadap garam empedu juga merupakan syarat penting untuk probiotik. Bakteri asam laktat untuk dapat bertahan dan tumbuh pada saluran pencernaan harus mampu melewati bagian atas saluran usus yang berisi cairan garam empedu yang disekresikan ke dalam usus. 13
Asam empedu disintesa dalam hati dari kolesterol, menghasilkan senyawa yang disebut asam empedu primer. Asam empedu utama ini berkonjugasi dengan glisin atau taurin dan disekresikan ke dalam kantung empedu sebagai asam empedu terkonjugasi. Asam empedu di dalam kantung empedu dilepaskan ke dalam lumen duodenum dalam bentuk misel dengan asam lemak dan gliserol yang dihasilkan oleh pencernaan lipase pankreatik. Sebanyak antara 5,500 sampai 35,500 mg asam empedu terkonjugasi desekresikan ke dalam usus kecil manusia setiap, untuk membantu absorpsi lemak makan, kolesterol, vitamin hidrofobik dan senyawa larut lemak yang lain. Asam empedu terkonjugasi diserap dari usus kecil (sekitar 97%) dan dikembalikan ke dalam hati melalui sirkulasi hati. Sebagian kecil dari asam empedu (250-400 mg) yang tidak diserap hilang dari tubuh manusia sebagai asam empedu bebas di feses. Mekanisme saat asam empedu diserap dalam usus kecil dan kolon, disintesa kembali dan disekresikan lagi dikenal sebagai sirkulasi hati harinya (Corzo dan Gilliland, 1999). Seperti halnya ketahanan terhadap asam, menurut Zavaglia et al. (1998) dan Jacobsen et al. (1999), semua mikroba yang berhasil hidup setelah ditumbuhkan dalam MRSA yang ditambah 0,3% ox gall, dinyatakan bersifat tahan terhadap garam empedu. Konsentrasi garam empedu sebesar 0,3% merupakan konsentrasi yang kritikal, nilai yang cukup tinggi untuk menyeleksi isolat yang resisten terhadap garam empedu. Laktobasili yang paling bersifat resisten terhadap garam empedu terdapat pada bagian atas usus halus (jejunum). Hal ini juga dilaporkan oleh Ray (1996) dan Drouault et al. (1999), bahwa jumlah bakteri asam laktat yang terdapat di yeyunum lebih rendah dibanding ileum, sekum dan kolon. Hal ini disebabkan konsentrasi garam empedu pada bagian yeyunum paling tinggi daripada ileum, karena lokasinya paling dekat bila garam empedu masuk ke dalam saluran usus.
14
METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Ilmu Produksi Ternak Ruminansia Besar, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilakukan selama lima bulan dari bulan Juli sampai Nopember 2008. Materi Bahan-bahan yang diperlukan untuk penelitian ini meliputi 28 isolat bakteri asam laktat asal daging sapi (1A1, 1A2, 1A32, 1A4, 1A5, 1A6, 1B1, 1B2, 1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 1D1, 1D2, 1D3, 2A1, 2A2, 2A3, 2B1, 2B2, 2B3, 2B4, 2C2, 2C12, 2D1, 2D2, 2D41, 2D42) yang diperoleh dari penelitian sebelumnya oleh Arief et al. (2006). Kode ke-28 isolat ini diperoleh dari daging dengan masa penyimpanan berbeda yaitu 12 jam (1) dan 34 jam (2), pasar berbeda yaitu pasar Anyar 1 (A), pasar Cibeureum (B), pasar Ciampea (C), pasar Gunung Batu (D), pasar Anyar 2 (E) dan bakteri ke-1 (1), ke-2 (2), ke-3 (3), dst. Isolat 1A1, 1A4, 2B1, 2B3, 1D2, 2D1 dan 2D2 memiliki morfologi bentuk bulat sedangkan ke-21 isolat lainnya memiliki morfologi bentuk batang (Firmansyah, unpublished). Media yang digunakan adalah Buffer Pepton Water (BPW), Posphat Buffer Salin (PBS), de Man Rogosa Sharp Broth (MRSB), Bacteriological Agar (BA), Yeast Extract (YE), dan Ox gall. Bahanbahan kimia yang digunakan adalah aquadestilata, buffer pH 4 dan 7, HCl 0,1N, NaOH 0,1N, alkohol 70%, dan teepol. Peralatan yang diperlukan untuk penelitian ini adalah cawan Petri, pemanas Bunsen, pipet volumetrik (1 ml, 5 ml, dan 10 ml), mikropipet (0,1 ml, 1 ml dan 5 ml), tabung reaksi, vorteks, autoklaf, mikroskop, stopwatch, botol Schott, inkubator, alumunium foil, kompor, panci, gelas ukur, alat gelas lainnya dan alat-alat tulis. Rancangan Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap pola searah sebanyak 28 isolat diuji pada pH dan garam empedu dengan tiga kali ulangan. Perlakuan yang diberikan meliputi kemampuan hidup isolat pada media berbeda yaitu dengan pH 2 dan pH 7,2 dengan kadar garam empedu 0,3%. Sidik ragam dilakukan untuk setiap parameter pengujian. Apabila hasil sidik ragam menunjukkan respon yang berbeda nyata, maka diuji lanjut dengan uji Jarak Berganda Duncan. Model matematika
rancangan percobaan yang digunakan mengacu pada Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: Yij = μ + τi + εij Keterangan: Yijk. = Respon yang didapat (jumlah bakteri) dari pengaruh perlakuan. µ
= Nilai rataan umum
τi
= Pengaruh perlakuan pH (2,0 dan 7,2) dan garam empedu 0,3%
Εij
= Galat percobaan untuk taraf ke-i dan ulangan ke-j
Peubah yang diamati selama penelitian ini ialah jumlah populasi bakteri asam laktat yang mati dari masing-masing isolat kultur bakteri asam laktat untuk menentukan isolat yang mempunyai toleransi tertinggi terhadap kondisi lambung (pH 2,0) dan kondisi usus (pH 7,2) dengan kadar garam empedu 0,3% . Jumlah populasi bakteri asam laktat yang mati digunakan sebagai dasar penentu bakteri asam laktat sebagai kandidat probiotik. Prosedur Penelitian ini dilakukan melalui dua tahap yaitu (1) seleksi isolat bakteri asam laktat asal daging sapi terhadap lingkungan dengan kondisi yang berbeda yaitu pH 2 dan pH 7,2. Pada tahap 2 isolat bakteri asam laktat yang tahan terhadap pH 2 diseleksi kembali dalam media dengan garam empedu 0,3 % ox gall. Tahapan prosedur dapat dilihat pada Gambar 4.
Isolat bakteri asam laktat murni (hasil isolasi dari daging sapi)
16
Penyegaran dalam media MRS-broth + yeast ekstrak
Uji ketahanan pada pH lambung (pH 2,0) selama 3 jam (Uji 1)
Uji ketahanan pada pH Usus (pH 7,2) selama 3 jam (Uji 1)
Bakteri Asam Laktat yang mampu tumbuh pada pH 2,0 dan pH 7,2 Uji ketahanan pada garam empedu (bile salt 0,3% dengan pH 7,2) selama 24 jam (UJI 2) Seleksi isolat bakteri asam laktat yang mampu hidup pada uji 1 dan 2 (Jika didapatkan lebih dari 3 isolat, maka dipilih hanya 3 isolat dengan toleransi pertumbuhan tertinggi, jika didapatkan ≤ 3 isolat, maka dipilih isolat tersebut)
Gambar 4. Tahapan Seleksi Bakteri Asam Laktat sebagai Kandidat Probiotik Penyegaran dan Penghitungan Populasi Awal (Lin et al., 2006) Penyegaran dilakukan setiap kali sebelum pengujian ketahanan bakteri terhadap asam maupun terhadap garam empedu. Penyegaran dilakukan dengan cara isolat induk bakteri asam laktat sebanyak 1% dari masing-masing 28 isolat bakteri asam laktat murni diinokulasikan ke dalam media MRS-broth 9 ml untuk kemudian di inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam untuk mendapatkan kultur kerja. Setelah diinkubasi dilakukan penghitungan populasi awal dengan cara sebelumnya diencerkan pada media BPW (10-7, 10-8, 10-9), selanjutnya dipupukkan dalam media MRS-agar dengan metode pour plate. Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging pada pH Lambung dan pH Usus (Lin et al., 2006) Uji toleransi terhadap pH lambung dan pH usus dilakukan dengan cara 28 isolat kerja bakteri asam laktat diinokulasikan masing-masing sebanyak 1% dengan jumlah populasi awal minimal 108cfu/ml ke dalam media PBS untuk diatur pada pH 2,0 dan 7,2 menggunakan HCl 0,1N untuk menurunkan pH atau NaOH 0,1N untuk menaikkan pH. Selanjutnya isolat diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 jam. Setelah 17
itu dilakukan pemupukan untuk pnentuan jumlah populasi akhir dengan metode pour plate sesuai Fardiaz (1992). Pengenceran dilakukan pada media BPW (10-3, 10-4, 10-5 untuk pH 2,0 dan 10-7, 10-8, 10-9 untuk pH 7,2). Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 37oC. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dengan setiap ulangan duplo. Penghitungan dilakukan terhadap koloni bakteri asam laktat yang terlihat berwana putih atau kekuningan dihitung sebagai populasi akhir. Toleransi bakteri asam laktat ditentukan berdasarkan jumlah kematian bakteri asam laktat tersebut. Kematian bakteri asam laktat ditentukan dengan cara menghitung selisih antara populasi awal dikurangi populasi akhir. Diagram alir pengujian toleransi bakteri asam laktat terhadap pH lambung dan pH usus dapat dilihat pada Gambar 5. Kultur Kerja Populasi awal ≥ 108 cfu/ml
pH 2,0
PBS 9 ml pH PBS 9 ml pH PBS 9 ml pH 2,0 2,0 2,0 HCl 0,1 N
pH 7,2
PBS 9 ml pH PBS 9 ml pH PBS 9 ml pH 7,2 7,2 7,2 NaOH 0,1 N
Inkubasi selama 3 jam pada suhu 37 oC
Pengenceran tiga ulangan BPW 10-3
BPW 10-4
Pengenceran tiga ulangan BPW 10-5
Pemupukan duplo
BPW 10-7
BPW 10-8
BPW 10-9
Pemupukan duplo
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
Inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam Penghitungan Populasi Akhir
Gambar 5. Diagram Alir Pengujian Toleransi Bakteri Asam Laktat terhadap pH 2,0 dan 7,2 Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging terhadap Garam Empedu (Lin et al., 2006) 18
Uji toleransi terhadap garam empedu dilakukan setelah didapat isolat bakteri asam laktat dari daging yang dapat tumbuh pada pH 2,0. Pengujian disesuaikan dengan kadar garam empedu pada saluran pencernaan yaitu dengan menggunakan ox gall sebanyak 0,3% b/v dalam media MRSB dengan pH 7,2. Pengujian dilakukan pada konsentrasi garam empedu 0,3% mengacu pada Marteu et al. (1997). MRSbroth basal ditambahkan garam empedu dengan konsentrasi 0,3% dengan pH 7,2, kemudian disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Sebanyak 1% kultur kerja isolat bakteri asam laktat dengan jumlah populasi awal minimal 108 cfu/ml diinokulasikan pada media MRSB yang telah ditambahkan garam empedu 0,3% steril lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Diagram alir pengujian toleransi isolat bakteri asam laktat asal daging sapi terhadap garam empedu 0,3% dapat dilihat pada Gambar 6. Kultur Kerja Populasi awal ≥ 108 cfu/ml
MRSB 9 ml
MRSB 9 ml
MRSB 9 ml
Ox gall 0,3%
Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC
Pengenceran tiga kali ulangan
BPW 10-7
BPW 10-8
BPW 10-9
Pemupukan duplo MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
MRSA
Inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam Penghitungan populasi
Gambar 6. Diagram Alir Pengujian Toleransi Bakteri Asam Laktat terhadap Garam Empedu 0,3%
19
Setelah diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, isolat diencerkan dengan media BPW untuk selanjutnya dipupukkan dalam media MRSA pada cawan petri dengan metode pour plate. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 48 jam, pengujian dilakukan sebanyak 3 kali. Populasi bakteri asam laktat yang dapat bertahan hidup diamati dengan cara menghitung jumlah koloni yang berwarna putih atau kekuningan sebagai populasi akhir. Toleransi bakteri asam laktat ditentukan berdasarkan jumlah kematian bakteri asam laktat tersebut. Kematian bakteri asam laktat ditentukan dengan cara menghitung selisih antara populasi awal dikurangi populasi akhir.
20
HASIL DAN PEMBAHASAN Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging pada pH Lambung dan pH Usus Menurut Havenaar et al. (1992), dalam pengembangan galur probiotik baru, perlu dilakukan seleksi secara in vitro yang meliputi sensitivitas terhadap pH rendah, cairan lambung, asam empedu, pankreas dan kemampuannya menekan pertumbuhan mikroba patogen lain. Pada penelitian ini, 28 galur isolat bakteri asam laktat (1A1, 1A2, 1A32, 1A4, 1A5, 1A6, 1B1, 1B2, 1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 1D1, 1D2, 1D3, 2A1, 2A2, 2A3, 2B1, 2B2, 2B3, 2B4, 2C2, 2C12, 2D1, 2D2, 2D41, 2D42) diuji secara in vitro kemampuan tumbuh pada pH lambung dan pH usus untuk mengetahui karakteristik probiotiknya, meliputi uji ketahanan terhadap pH rendah dan bile salt (garam empedu). Kondisi yang kritikal bagi bakteri asam laktat pertama kali terjadi pada saat sel bakteri memasuki saluran pencernaan, yaitu
terpapar pada asam
lambung. Asam lambung memiliki pH yang sangat rendah, yaitu sekitar 2. Uji ketahanan bakteri asam laktat pada pH rendah merupakan salah satu sifat yang paling penting dalam menentukan karakteristik dari mikroorganisme probiotik. Hasil pengujian ketahanan isolat daging bakteri asam laktat terhadap pH 2 dan 7,2 dapat dilihat pada Tabel 2. Uji ketahanan isolat bakteri asam laktat asal daging sapi terhadap pH rendah (pH 2) selama 3 jam ditetapkan berdasarkan rataan ketahanan pertumbuhan dari masing-masing isolat. Uji ketahanan isolat bakteri asam laktat terhadap pH 7,2 juga dilakukan karena di dalam usus yang terdapat garam empedu memiliki pH yang hampir mendekati netral, yaitu 7,2. HCl 0,1N pada PBS (media pertumbuhan) ditambahkan untuk mendapatkan kondisi yang mendekati lambung. HCl adalah asam kuat yang mudah terdisosiasi menghasilkan proton, menyebabkan penurunan pH medium di luar sel atau pH ekstraseluler. Asam ini menghambat pertumbuhan sel melalui efek denaturasi enzim-enzim yang ada di permukaan sel, kerusakan lipopolisakarida, dan membran luar serta penurunan pH sitoplasma melalui peningkatan permeabilitas membran terhadap proton pada gradien pH yang sangat besar. HCl digunakan karena memiliki karakteristik yang mirip dengan asam lambung (Yang et al., 2001).
Tabel 2. Rataan Populasi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging Sapi pada pH 2 dan pH 7,2 Isolat Jumlah Sel Mati di pH 2 Jumlah Sel Mati di pH 7,2 -----------------------------(Log10 cfu/ml)------------------2C12 1,53±0,16 a -1,1±0,08 k 1A5
1,99±0,56 a
1,4±0,53 cde
2B2
2,74±011 b
0,5±0,17 jk
2B4
2,78±0,12 b
0,5±0,18 k
1B1
3,21±0,02 b
1,8±0,13 cdef
1C4
3,94±0,04 c
0,2±0,06 defgh
1A2
4,39±0,15 c
0,0±0,06 ab
1A32
4,89±0,10 d
2B1
4,95±0,08 de
0,0±0,22 jk
2D1
5,41±0,11 ef
1,5±0,21 k
1A4
5,48±0,17 fg
0,0±0,11 cd
1B2
5,58±0,51 fgh
0,1±0,03 cdef
2D42
5,58±0,13 fgh
1,2±0,10 m
1D1
5,62±0,14 fgh
0,8±0,20 efgh
1C3
5,64±0,35 fgh
0,0±0,44 defgh
1A6
5,71±0,04 fghi
1,4±0,21 cdef
2C2
5,85±0,17 fghij
2,0±0,75 k
1C1
5,86±0,48 ghij
0,5±0,44 defg
1C6
5,94±0,44 ghij
-0,6±0,55 efgh
2A2
6,01±0,35 ghij
-0,2±0,27 ijk
2D41
6,01±0,62 ghij
0,2±0,48 m
2A3
6,03±0,25 hij
1,3±0,29 ijk
2A1
6,07±0,31 hij
1,5±0,27 hij
2D2
6,07±0,26 ij
2,7±0,31 l
2B3
6,24±0,42 ij
1,3±0,26 k
1D3
6,29±0,17 j
0,7±0,40 ghi
1D2
7,23±0,30 k
1,5±0,14 fgh
1A1
7,61±0,21 k
2,1±0,27 a
-1,2±0,3 bc
Keterangan : Tanda superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukan perbedaan yang nyata ( P < 0,05 ) Tanda superskrip yang berbeda pada baris yang sama tidak berhubungan Tanda – (negatif) menunjukkan populasi bertambah
22
Media PBS digunakan sesuai dengan penelitian Conway et al. (1987) yaitu sebagai larutan penyangga yang mampu mempertahankan pH lingkungan bakteri asam laktat untuk seleksi sebagai probiotik pada kondisi asam. Waktu inkubasi selama 3 jam disesuaikan dengan waktu transit makanan dalam lambung manusia berkisar antara 2-6 jam. Beberapa bakteri probiotik tumbuh hingga mencapai populasi maksimum setelah 3 jam mengkonsumsi pangan probiotik (Oozer et al., 2006). Hasil analisis ragam pada Tabel 2, menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nyata (P<0,05) pada ketahanan isolat-isolat yang diuji untuk tumbuh pada pH 2. Bakteri asam laktat asal daging sapi yang mampu bertahan hidup dengan baik pada pH 2 didapatkan sebanyak sepuluh isolat yaitu 2C12a, 1A5a, 2B2b, 2B4b, 1B1b, 1C4c, 1A2c, 1A32d, 2B1de, dan 2D1ef. Pemilihan isolat bakteri asam laktat berdasarkan pada kemampuan tumbuhnya pada pH 2 dan mempertahankan populasinya minimal 5 log10 cfu/ml selama 3 jam sesuai Mitsuoka (1990) Pengujian pada pH 7,2 selama 3 jam juga dilakukan untuk melihat ketahanan isolat bakteri asam laktat asal daging sapi dalam usus halus yang memiliki pH hampir mendekati netral. Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa terdapat perbedaan toleransi yang nyata (P<0,05) dari ke 28 isolat yang diuji pada pH 7,2 selama 3 jam. Keseluruhan isolat dapat tumbuh dengan tingkat kematian kurang dari 3 log sehingga dapat dikatakan bahwa seluruh isolat merupakan isolat yang tahan pada kondisi usus (pH 7,2). Hal ini terjadi karena sifat bakteri asam laktat yang cenderung tumbuh pada kisaran pH mendekati netral. Jay (1996) mengatakan bahwa bakteri asam laktat bersifat mesofilik dan termofilik, beberapa dapat tumbuh pada suhu 5oC dan tertinggi 45oC, dapat bertahan pada pH 3,2 dan pada pH yang lebih tinggi yaitu pH 9,6, beberapa hanya bisa tumbuh pada kisaran pH yang sempit 4,04,5, Isolat bakteri asam laktat mampu beradaptasi pada pH 2 karena memiliki sistem regulasi pada pH internal sel (pHi). Hal ini dapat dicapai dengan sintesis enzim-enzim baru dan mengeluarkan proton (H+) dari dalam sel yang pengeluarannya terjadi melalui proses hidrolisis ATP (H+-ATPase). Casiano-Colon dan Marquis (1998) berpendapat bahwa bakteri asam laktat bertahan dari kerusakan asam karena adanya enzim histidin dekarboksilase dan enzim arginin deiminasi. Hasil ini menunjukkan bahwa hanya beberapa isolat bakteri asam laktat yang diuji
23
dapat melewati saluran lambung yang bersifat asam. Toleransi bakteri asam laktat terhadap asam cukup tinggi disebabkan kemampuannya mempertahankan pH sitoplasma lebih basa daripada pH ekstraseluler (Hutkins dan Nannen, 1993). Pertahanan utama sel bakteri dari lingkungannya adalah membran seluler yang terdiri atas struktur lemak dua lapis. Bila sel bakteri terpapar dalam kondisi asam, maka membran sel dapat mengalami kerusakan dan berakibat hilangnya komponenkomponen intraseluler, seperti Mg, K, dan lemak dari sel, biasanya kerusakan ini menyebabkan kematian sel. Mekanisme bakteri untuk mengatur pH internalnya adalah melalui translokasi proton oleh enzim ATP-ase, Enzim yang terikat pada membran sel bertindak sebagai pompa yang akan memindahkan ion dan reaksinya bersifat reversible. Enzim tersebut juga akan mengkatalisis gerakan proton menyeberangi membran sel sebagai akibat dari hidrolisis dan sintesis ATP. Berbeda dengan bakteri yang tidak tahan asam, bakteri yang tahan asam memiliki pH optimal enzim yang lebih rendah dibandingkan dengan bakteri yang kurang tahan asam. Bakteri asam laktat untuk mempertahankan pH sitoplasma supaya lebih basa sel harus memiliki barrier terhadap aliran proton, barrier ini umumnya adalah membran sitoplasma. Membran sitoplasma bakteri terdiri atas 2 lapis fosfolipid (lipid bilayer) yang pada masing-masing permukaan lapisan tersebut melekat pada protein dan glikoprotein. Lipid bilayer bersifat semipermeabel yang akan membatasi gerakan senyawa yang keluar masuk antara sitoplasma dengan lingkungan luar. Sebanyak 18 isolat bakteri asam laktat asal daging sapi lainnya didapatkan tidak tahan terhadap asam lambung. Hal ini ditunjukkan dengan pertumbuhannya yang tidak mampu mencapai hingga 5 log10. Kematian sel pada pH rendah diakibatkan terjadinya pengasaman dinding sel. Paparan pada kondisi yang sangat asam juga dapat mengakibatkan kerusakan membran dan lepasnya komponen intraseluler yang mampu menyebabkan kematian. Kebanyakan bakteri asam laktat tidak hanya tumbuh lebih lambat pada pH rendah, tetapi mungkin juga mengalami kerusakan, terjadi penurunan viabilitas jika selnya berada pada kondisi pH rendah. Toleransi relatif dari mikroorganisme terhadap lingkungan asam bergantung dari jenis isolat tersebut. Perbedaan kerentanan membran sitoplasma inilah yang menentukan toleransi bakteri tersebut pada pH rendah. Gradien proton yang besar Bagi bakteri asam laktat tidak menguntungkan sebab translokasi proton
24
menggunakan banyak energi (Kobayashi, 1985) dan bakteri anaerobik mendapatkan energi dari metabolisme gula yang jauh lebih kecil dibandingkan dengan bakteri aerobik. Gradien proton yang besar juga mengakibatkan akumulasi anion asam organik dalam sitosol yang bersifat racun bagi sel tersebut (Russel, 1992). Komposisi asam lemak penyusun membran sitoplasma beragam diantara spesies bakteri yang keragamannya tersebut mempengaruhi karakteristik dan permeabilitasnya.
Beberapa
protein
dalam membran
secara
spesifik
juga
memfasilitasi pergerakan senyawa melewati membran. Komposisi dan struktur protein yang berbeda pada membran sitoplasma juga menentukan karakteristik dan permeabilitas membran tersebut. Keragaman asam lemak dan protein pada membran sitoplasma diduga juga mempengaruhi keragaman ketahanan bakteri terhadap pH rendah. Pada beberapa bakteri Gram positif terjadi peningkatan sintesis asam amino fosfolipid (Booth et al., 1989) yang bermuatan positif jika ditumbuhkan pada media yang ber-pH rendah. Perubahan ini diduga karena ionisasi asam amino pada pH rendah menyebabkan permukaan membran bermuatan positif sehingga dapat bertindak sebagai barrier proton. Selain itu, bakteri yang tahan asam memiliki enzim yang lebih tahan terhadap pH rendah (asam), faktor lain seperti kapasitas buffering sitoplasma kurang berpengaruh bagi pengaturan pH intraseluler (Bender et al., 1986). Cotter dan Hill (2003) menambahkan bahwa pertahanan bakteri Gram positif terhadap asam juga terjadi karena adanya pompa proton oleh ATP-ase, adanya mekanisme perubahan membran sel bakteri dan dekarboksilasi asam amino. Chou dan Weimer (1999) menyatakan bahwa enzim dapat mempengaruhi pertumbuhan dari bakteri asam laktat pada pH rendah. Enzim-enzim yang mempengaruhi ketahanan bakteri asam laktat pada pH rendah adalah enzim protease. Diungkapkan bahwa semakin tinggi enzim protease yang dimiliki oleh suatu isolat dapat meningkatkan ketahanannya pada kondisi asam. Salah satu enzim protease yaitu aminopeptidase dapat mempengaruhi adaptasi dan pertumbuhan dari isolat bakteri asam laktat pada kondisi asam (De Angelis et al., 2001). Enzim protease dibutuhkan oleh bakteri asam laktat untuk pertumbuhan dan menghasilkan asam dalam proses pembuatan produk fermentasi. Berdasarkan hasil pengujian pertumbuhan bakteri asam laktat dalam media dengan pH 2,0 dan 7,2 selama 3 jam, terseleksi sebanyak 10 isolat bakteri asam
25
laktat asal daging sapi dengan toleransi dan viabilitas tinggi. Selanjutnya 10 isolat bakteri asam laktat asal daging sapi diuji toleransinya terhadap kondisi usus halus dengan pH 7,2 dengan kandungan garam empedu 0,3%. Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging terhadap Garam Empedu Bakteri asam laktat sebagai isolat probiotik untuk dapat bertahan dan tumbuh pada saluran pencernaan harus mampu melewati berbagai kondisi lingkungan yang menekan, salah satunya adalah pada saat bakteri memasuki bagian atas saluran usus yang merupakan tempat empedu disekresikan ke dalam usus. Cairan empedu merupakan campuran dari asam empedu, kolesterol, asam lemak, fosfolipid, pigmen empedu, dan sejumlah xenobiotik terdetoksifikasi. Sekresi pankreas juga mengandung serangkaian enzim pencernaan, yaitu tempat enzim yang bersifat lipolitik diaktifkan oleh karakteristik aktif dari empedu. Kombinasi tersebut bersifat bakterisidal bagi mikroorganisme komensal dalam tubuh manusia kecuali bagi beberapa genus penghuni usus yang tahan garam empedu (Hill, 1995). Hasil pengujian ketahanan isolat daging bakteri asam laktat terhadap garam empedu 0,3% dapat dilihat pada Tabel 3. Uji ketahanan isolat bakteri asam laktat asal daging sapi terhadap garam empedu (bile salt) merupakan pengujian tahap lanjutan terhadap isolat yang telah terlebih dahulu diseleksi pada pH 2 dan 7,2 sebagai kandidat probiotik. Sebanyak 10 isolat bakteri asam laktat asal daging sapi terpilih diuji pada garam empedu 0,3%. Konsentrasi garam empedu sebesar 0,3% merupakan konsentrasi yang kritikal dan merupakan nilai yang cukup tinggi untuk melakukan seleksi isolat yang resisten terhadap garam empedu (Gilliland et al., 1984). Pengujian dilakukan dengan cara penumbuhan isolat dalam media MRS-broth dengan pH 7,2 yang telah ditambahkan garam empedu sebesar 0,3% selama 24 jam. Hasil analisis ragam dan uji lanjut menunjukkan bahwa isolat yang berasal dari sumber sejenis yaitu daging sapi tidak memberikan karakteristik ketahanan terhadap garam empedu yang sama. Sebanyak tiga isolat bakteri asam laktat asal daging sapi didapatkan memiliki toleransi yang tinggi terhadap garam empedu yaitu 1A5a, 2B4ab, dan 1B1abc dan secara statistik tidak berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa ketiga isolat bakteri asam laktat ini berpotensi sebagai kandidat probiotik. Toleransi paling baik dimiliki oleh isolat 1A5
26
yang ditunjukkan dengan jumlah kematian paling sedikit dan secara statistik menunjukkan hasil yang sama dengan 2B4 dan 1B1. Tabel 3. Rataan Populasi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging Sapi pada Garam Empedu 0,3% Isolat
Jumlah Sel Mati -------(Log10 cfu/ml)-------
1A5
0,9±0,08 a
2B4
1,1±0,06 ab
1B1
1,5±0,35 abc
2C12
1,7±0,22 bcd
2B2
1,7±0,20 cde
1A32
1,9±0,60 def
1C4
2,0±0,45 def
2B1
2,5±0,36 ef
1A2
2,5±0,41 fg
2D1
3,3±0,04 g
Keterangan : Tanda superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P < 0,05)
Isolat bakteri asam laktat 2D1 memiliki ketahanan yang paling rendah dibandingkan dengan isolat-isolat lainnya pada garam empedu 0,3% ditunjukkan dengan jumlah kematian yang paling tinggi diantara kesembilan isolat bakteri asam laktat terpilih lainnya. Toleransi yang baik terhadap garam empedu ini diduga karena peranan polisakarida sebagai salah satu komponen penyusun dinding sel bakteri Gram positif, tetapi mekanisme yang terlibat di dalamnya belum diketahui dengan jelas. Bakteri asam laktat yang tidak mampu bertahan dan tumbuh dengan baik dalam kondisi usus halus dapat disebabkan oleh perubahan permeabilitas seluler dan kebocoran materi intraseluler yang dialami lebih besar sehingga menyebabkan lisisnya sel dan menyebabkan kematian. Hasil ini sesuai dengan penelitian-penelitan lain (Kusumawati, 2002; Kimoto et al., 1999; Ngatirah et al., 2000) yang juga menunjukkan bahwa bakteri asam laktat memiliki ketahanan terhadap garam empedu yang beragam. Chou dan Weimer (1999) juga mendapatkan bahwa diantara galurgalur bakteri asam laktat dari spesies yang sama serta diisolasi dari sumber yang sama, memiliki keragaman pada toleransinya terhadap garam empedu.
27
Cairan garam empedu bersifat sebagai senyawa aktif permukaan sehingga dapat menembus dan bereaksi dengan sisi membran sitoplasma yang bersifat lipofilik, menyebabkan perubahan dan kerusakan struktur membran. Sifat aktif permukaan dari cairan garam empedu juga mengakibatkan aktifnya enzim lipolitik yang disekresikan pankreas (Hill, 1995). Enzim tersebut juga mungkin bereaksi dengan asam lemak pada membran sitoplasma bakteri menyebabkan perbedaan permeabilitas dan karakteristiknya sehingga dapat mempengaruhi ketahanannya terhadap garam empedu. Menurut Smet et al. (1995) beberapa Lactobacillus memiliki enzim bile salt hydrolase dengan aktivitas untuk menghidrolisis garam empedu. Enzim ini mampu mengubah kemampuan fisik dan kimia yang dimiliki oleh garam empedu, sehingga tidak bersifat racun bagi bakteri asam laktat. Hal inilah yang memungkinkan menjadi penyebab beberapa isolat bakteri asam laktat tahan terhadap keadaan garam empedu. Semakin tinggi konsentrasi garam empedu, maka jumlah sel Lactobacillus yang mati juga akan meningkat. Hal ini disebabkan peningkatan aktivitas enzim βgalaktosidase terhadap garam empedu, sehingga meningkatkan permeabilitas membran sel. Bila permeabilitas sel meningkat maka banyak materi intraseluler yang keluar dari dalam sel. Bila hal ini berlangsung terus menerus akan menyebabkan lisis bakteri. Enzim β-galaktosidase merupakan enzim intraseluler dari bakteri. Kusumawati (2002) melaporkan bahwa isolat bakteri asam laktat yang diisolasi dari makanan fermentasi asal Indonesia menunjukkan perbedaan ketahanan untuk tumbuh pada lingkungan yang mengandung garam empedu 1% dan 5%, perbedaan tersebut bersifat beragam untuk masing-masing galur. Ngatirah et al. (2000) menguji ketahanan isolat bakteri asam laktat yang diisolasi dari makanan fermentasi dan feses bayi terhadap garam empedu. Pengujian dilakukan pada MRSB yang mengandung garam empedu 10% selama 24 jam. Ketahanan terhadap garam empedu dihitung berdasarkan selisih unit OD (Optical Density) pada panjang gelombang 660 nm yang dicapai setelah inkubasi 24 jam dengan OD pada awal inkubasi yang hasilnya berkisar antara 1,16-2,34. Penelitian tersebut mampu mengungkap bahwa isolat yang diisolasi dari sumber yang sama memiliki ketahanan terhadap garam empedu yang beragam atau ketahanan terhadap garam empedu bersifat strain dependent. Wirawati (2002) menyatakan ketahanan isolat bakteri asam laktat asal tempoyak terhadap
28
garam empedu 0,3% berkisar antara 34,8%-100%. Berdasarkan kisaran tersebut terlihat bahwa isolat bakteri asam laktat asal tempoyak relatif tahan terhadap garam empedu, bahkan isolat To 8 tidak menunjukkan penurunan selama inkubasi 24 jam. Hasil penelitian ini mendapatkan sebanyak 3 dari 28 (10,7%) isolat bakteri asam laktat asal daging sapi yang diseleksi mampu bertahan terhadap kondisi yang menekan yaitu 1A5, 2B4 dan 1B1. Ketiga kandidat probiotik ini memiliki morfologi berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek dan Firmansyah (unpublished) menambahkan bahwa isolat 1A5, 2B4 dan 1B1 merupakan bakteri mesofil (Buckle, 1987) yaitu bakteri yang memiliki pertumbuhan 15 oC – 45 oC dengan suhu optimum pertumbuhan 37 oC.
1A5 2B4 1B1 Gambar 7. Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik Selanjutnya ketiga isolat ini juga memiliki karakteristik katalase negatif dan merupakan bakteri Gram positif. Sesuai dengan Axellson (1998) yang menyatakan bahwa bakteri asam laktat dicirikan sebagai bakteri Gram positif dan katalase negatif tetapi kadang-kadang terdeteksi katalase semu pada kultur yang ditumbuhkan pada konsentrasi gula rendah. Identifikasi yang diteliti secara terpisah (Arief, unpublished) berhasil mengidentifikasi 1B1 dan 1A5 adalah Lactobacillus plantarum sedangkan 2B4 merupakan Lactobacillus fermentum. L. plantarum secara taksonomi berasal dari famili Lactobacillaceae dan genus Lactobacillus. Ciri lain dari bakteri asam laktat ini adalah bakteri homofermentatif yang tumbuh pada suhu optimal 37oC. Kemampuan bertahan yang baik dimiliki oleh Lactobacillus plantarum dalam kondisi menekan seperti di lambung dengan pH 2 dan usus yang memiliki pH 7,2 dengan kadar garam empedu 0,3% seperti dinyatakan oleh Anukam dan Koyama (2007) bahwa Lactobacillus plantarum pada pH 2-3 yang diuji ketahanan selama 24 jam berkurang sebanyak 2 log10, sedangkan pada pH antara 4-6,5 terjadi peningkatan populasi. Selanjutnya juga dikatakan bahwa bakteri ini mampu tumbuh baik dengan 29
25% penghambat pertumbuhan pada kadar garam empedu 2% dan 68% penghambat pertumbuhan saat kadar garam empedu 4%. L. plantarum mampu merombak senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana dengan hasil akhirnya yaitu asam laktat. Menurut Buckle et al. (1987) asam laktat dapat menghasilkan pH yang rendah pada substrat sehingga menimbulkan suasana asam. L. plantarum dapat meningkatkan keasaman sebesar 1,5 sampai 2,0% pada substrat. Isolat 2B4 merupakan bakteri Lactobacillus fermentum yang memiliki ketahanan yang cukup baik dalam pH lambung dan garam empedu seperti dikatakan oleh Klayraung et al. (2008) bahwa Lactobacillus fermentum mampu tumbuh baik pada kisaran pH 2-3 dan garam empedu 0,3-1%.
30
KESIMPULAN Kesimpulan Isolat bakteri asam laktat asal daging sapi yang berbeda mempunyai toleransi yang berbeda pula terhadap kondisi keasaman lambung dengan pH 2,0 dan kondisi usus dengan pH 7,2 serta kandungan garam empedu 0,3%. Sebanyak sepuluh dari dua puluh delapan isolat (35,71%) mampu bertahan tumbuh pada kondisi keasaman lambung dengan pH 2,0 dan hanya didapatkan tiga dari sepuluh (30%) isolat bakteri asam laktat tersebut mampu tumbuh dan berkembang di dalam kondisis usus halus. Ketiga kandidat probiotik yang didapat adalah 1A5, 2B4 dan 1B1. Saran Terbatasnya bakteri asam laktat asal daging sapi yang diperoleh sebagai kandidat probiotik (10,71%), memungkinkan untuk memanfaatkan sumber-sumber bakteri asam laktat asal daging jenis lainnya. Pengujian lebih lanjut terkait dengan karakteristik probiotik dalam saluran pencernaan manusisa dapat dilakukan meliputi uji kemampuan penempelan bakteri asam laktat terpilih pada sel epitel usus. Pengujian keamanan dan sifat toksikologi dari bakteri asam laktat asal terpilih perlu dilakukan untuk membuktikan bahwa bakteri asam laktat asal daging sapi yang telah diperoleh aman dikonsumsi oleh manusia.
UCAPAN TERIMAKASIH Puji dan syukur penulis panjatkan Kehadirat Allah SWT dengan segala rahmat dan karuniaNya yang telah melimpahkan nikmat dan kemudahan sehingga skripsi ini dapat terselesaikan. Shalawat serta salam tak lupa penulis sampaikan kepada Nabi SAW beserta keluarga dan para sahabatnya. Penulis mengucapkan terimakasih kepada kedua orang tua Subagio dan Lasiyem yang telah memberi kasih sayang, materi, motivasi, bimbingan dan doa-doa yang tiada henti baik secara langsung maupun tidak langsung. Terima kasih untuk adik tersayang Dewi Yuliarti yang selalu memberikan dukungan dan motivasi yang sangat berarti bagi penulis. Terima kasih juga untuk seluruh anggota keluarga yang selalu memberikan dukungan kepada penulis. Penulis mengucapkan terimakasih kepada dosen Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si dan Dr. Ir. Rarah R. A. Maheswari, DEA.
yang telah membimbing,
mengarahkan, memotivasi, dan membantu mendampingi penyusunan proposal hingga tahap akhir penulisan skripsi. Terimakasih kepada Ir. B.N. Polii, SU selaku pembimbing akademik, yang telah membimbing penulis selama masa perkuliahan. Penulis juga ingin mengucapkan terimakasih kepada Ir. Hj. Komariah M.Si dan Ir. Abdul Djamil H. M.Si yang telah memberikan banyak masukan dan sumbangan pemikiran dalam penulisan ini. Ucapan terima kasih juga kepada tim satu penelitian Dudi Firmansyah, M. Tito Grandisa, Helmi Nursirwan, Cahyanto dan Rahmadani Puspitasari yang telah berjuang bersama selama penelitian menyelesaikan tugas akhir dengan baik. Terima kasih juga disampaikan kepada Edit Lessa Aditya, S.Pt, Bramada W.P. S.Pt, Cucu Diana A.Md dan Eko Prasetyo A.Md yang telah membantu serta memberikan nasihat dan bimbingan selama penelitian. Terima kasih kepada Novara Rahmat, Rindu Dara dan rekan-rekan THT 41 lainnya atas doa, dukungan dan kerjasamanya. Terima kasih kepada M. Arif Setiawan, Satriyo, dan Edi Setiawan yang telah memberikan kontribusi selama penulisan skripsi. Terima kasih juga kepada adik kelas Gina Citra Dewi Gozali yang telah memberikan motivasinya dan bantuannya selama penyusunan penulisan skripsi. Terakhir, penulis ucapkan terima kasih kepada seluruh civitas akademika Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat. Bogor, September 2009
Penulis
DAFTAR PUSTAKA Adam, M.R., and Moss M.O. 1995. Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, London. Anukam K.C. and Tara E. Koyama. 2007. Bile and acid tolerance of Lactobacillus plantarum KCA-1: a potential probiotic agent. Int. J. Dairy Sci. 2. 275-280. Arief, I.I., R.R.A. Maheswari, dan N. Hidayati. 2006. Karakteristik Lactobacillus sp. yang diisolasi dari daging sapi. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Pertanian. Axelsson, L. 1998. Lactid Acid Bacteria : Classification and physiology. Dalam: Lactid Acid Bacteria : Microbiology and Functional Aspects. 2nd ed. Editor : S. Salminen dan A. Von Wright. Marcel Dekker, Inc, New York. Bender, G.R and R.E. Marquis. 1987. Membran ATP-ase and acid tolereance of Actinomyces vixcosus and Lactobacillus casei. Appl. Environ. Microbiol. 59(12) : 2124-2128. Bernet M-F, Brassart D, Neeser J-R, and Servin AL. 1993. Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interactions. Appl. Environ. Microbiol. 59:4121–8. Berrada, N., Lemeland J.F., Laroch G, Thouvenot P., and Piala M. 1991. Bifidobacterium from fermented milks: Survival during gastric transit. J. Dairy Sci. 74: 409-413. Booth, I.R. and E.G. Kroll. 1989. The Preservation of food by low pH. Dalam: Gould, G.W. (ed.). Mechanism of Action of Food Preservation Procedures. Elsevier Applied Science, London. Buckle, K.A., R.A. Edwards, G.H. Fleet, dan M. Wooton. 1987. Ilmu Pangan. Universitas Indonesia Press. Jakarta. 365 hlm. Charteris, W.P., P.M. Kelly, L. Morelli and J.K. Collins. 1998. Ingredient selection criteria for probiotic microorganisms in functional dairy foods. Int. J. Dairy Tech. 51(4): 123-135 Chou, L.S. and B. Weimer. 1999. Isolation and characterization of acid and bile tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus. J. Dairy Sci. 62 : 23-31. Conway, P.L., Gorbach, S.L., and Goldin, B.R. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci 70:1. Corzo, G. and Gilliland S.E. 1999. Measurement of bile salt hydrolase activity from Lactobacillus acidophilus based on dissapearance of conjugated bile salts. J. Dairy Sci. 82 : 466-471. Cotter, P. D., and C. Hill. 2003. Surviving the acid test: responses of gram-positive bacteria10 to low pH. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:429-453.
De Angelis, M., A. Corsetti, N. Tosti, J. Rossi, M. R. Corbo, and M. Gobbetti. 2001. Characterization of non-starter lactic acid bacteria from Italian ewe cheeses based on phenotypic, genotypic, and cell wall protein analyses. Appl. Environ. Microbiol. 67:2011–2020. Drouault, S., G. Corthier, S.D. Erlich and P. Renault. 1999. Survival physiology and lysis of Lactococcus lactis in the digestive tract. Appl. Environ. Microbiol. 65 : 4881-4886. Ericksson K.L., Hubbard N.E. 2000. Probiotic immunomodulation in health and disease. J. Nutr. (Suppl.) 130:403S-409S. Evanikastri. 2003. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari sampel klinis yang berpotensi sebagai probiotik. Tesis. Institut Pertanian Bogor : Program Studi Ilmu Pangan. Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Depdikbud, Pusat Antar Universitas-Institut Pertanian Bogor, Bogor. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Fuller, R .1992 . Probiotics The Scientific Basis. Chapman & Hall. London. Fuller, R. 1999. Probioticts from animals. Dalam: Probiotics : A Critical Review. Editor : G.W. Tannock. Horizon Scientific Press. Gill H. S. and F. Guarner. 2003. Probiotics and human health: a clinical perspective. J. Postgrad. Med. 80:516-526. Gilliland, S. E., T. E. Stanley, and L. J. Bush. 1984. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a dietary adjunct. J. Dairy Sci. 67:3045– 3051. Gilliland, S. E. 1986. Bacterial Starter Cultures for Food. CRC Press, Inc. Boca Parton, Florida. Gilliland, S. E. 1989. Acidophilus milk products: a review of potential benefits to consumers. J. Dairy Sci. 72:2483–2494. Gomes, A.M.P. and Malcata F.X. 1999. Bifidobacterium spp. and L. acidophilus : biological, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics. Gohran, M. 1994. Lactobacillus with the ability of colonization and establishing in the intestinal tracts. Japan Patent. 6−501624. Havenaar, R., and J.H.J. Huis in’t Veld. 1992. Selection of strains for probiotic use. Dalam: Fuller, R. (ed.). Probiotics : The Scientific Basic, p.209-224. London: Chapman & Hall. Hayakawa, K. 1992. Classification and action of food microorganisms. Dalam: Nakazawa, Y. dan A. Hosono (eds.). Function of Fermented Milk : Challenges for the Health Sciences, p.127. Elsevier Science Publisher Ltd., University Press, Cambridge. Hill, M.J. 1995. Role of Gut Bacteria in Human Toxicology and Pharmacology. Taylor, New York. 34
Hutkins, R.W. and Nannen N.L. 1993. pH homeostatis in lactic acid bacteria. J. Dairy Sci. 76 : 2354-2365. Jacobsen, C.N., V.R. Nielsen, A.E. Hayford, P.L. Moller, K.F. Michaelsen, A.P. Erregard, B. Sandstrom, M. Tvede. dan M. Jakobsen. 1999. Screening of probiotic activities of forty seven strains of Lactobacillus spp. by in vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in human. Appl. Environ. Microbiol. 65 : 4949-4956. Jay, J.M. 1996. Modern Food Microbiology. Cambridge: The Royal Society of Chemistry. Kandler, O. 1983. Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. 49:209-224. Kobayashi, H. 1985. A proton-translocating ATP-ase regulate pH of bacterial. J. Bio. Chem. 260 : 72-76. Kimoto, H., J. Kurisaki, N.M. Tsuji, S. Ohmomo and T. Okamoto. 1999. Lactococci as probiotic strains: adhesion to human enterocyte-like Caco-2 cells and tolerance to low pH and bile. Lett. Appl. Microbiol. 29:313-316. Klayraung S., Siripon O., Jakkapan S., and Helmut V. 2008. Comparative probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from Thai traditional fermented foods: miang and nham. Res. J. Biol. Sci. 1119-1124. Kusumawati, N. 2002. Seleksi bakteri asam laktat indigenus sebagai galur probiotik dengan kemampuan mempertahankan keseimbangan mikroflora usus feses dan mereduksi kolesterol serum darah tikus. Tesis. Institut Pertanian Bogor : Program Studi Ilmu Pangan. Lin W. H., C. F. Hwang, L. W. Chen, and H. Y. Tsen. 2006. Viable counts, characteristic evaluation for commercial lactic acid bacteria products. J. Food Microbiol. 23: 74-81. Marteu et al. 1990. Effect of chronic ingestion of a fermented dairy product containing L. acidophilus and B. bifidum on metabolic activities of the colonic flora in humans. Am. J. Nutr. 52:685-688. Marteu, P., M. Minekus, R. Havenaar and J.H.J. Huis In’t Veld. 1997. Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation and the effects of bile. J. Dairy Sci. 80:1031–1037 Mattila-Sandholm T., S. Blum, J. K. Collins, R. Crittenden, W. de Vos, C. Dunne, R. Fondén, G. Grenov, E. Isolauri, B. Kiely, P. Marteau, L. Morelli, A. Ouwehand, R. Reniero, M. Saarela, S. Salminen, M. Saxelin, E. Schiffrin, F. Shanahan, E. Vaughan and A. von Wright. 1999. Probiotic:towards demonstrating efficacy. Trends in Food Sci. and Tech. 10:393-399. McDonald, L.C., Fleming H.P. dan Hassan H.M. 1990. Acid tolerance of Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus plantarum. Appl. Environ. Microbiol. 56: 2120-2124. Mitsuoka, T. 1990. Profile of intestinal bacteria : our lifelong partners. Yakult Honsa Co. Ltd. 35
Naidu, A.S. and R.A. Clemens. 2000. Probiotics. Dalam: Natural Food Antimicrobial Systems. Naidu A.S. (Ed). CRC Press, LLC. Nannen, N.L. and Hutkins R.W. 1991. (a) Intracellular pH effect in lactic acid bacteria. J. Dairy Sci. 74 : 741-746. Ngatirah, A., Harmayanti E.S. dan T. Utami. 2000. Seleksi bakteri asam laktat sebagai agensia probiotik yang berpotensi menurunkan kolesterol. Prosiding Seminar Nasional Industri Pangan. PATPI (II) : 63-70. Noh, D.O. and S.E. Gilliland. 1993. Influence of bile on cellular integrity and βgalactosidase activity of Lactobacillus acidophilus. J. Dairy Sci. 76:12531259. Oozeer, R., A. Leplingard, D. D. G. Mater, A. Mogenet, R. Michelin, I. Seksek, P. Marteau, J. Dore´, J. L. Bresson, and G. Corthier. 2006. Survival of Lactobacillus casei in the human digestive tract after consumption of Fermented Milk. Appl. Environ. Microbiol. 5615–5617 Ouwehand, A.C. and Salminen, S. 1998. The health effect of culture milk product with viabel and non-viabel bacteria. Int. Dairy J. 8:749-76. Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Terjemahan: Universitas Indonesia Press, Jakarta. Pot, B., Ludwig W., Kersers, Schiefer K. 1994. Taxonomy of lactic acid bacteria. Dalam: L. De Vuyst dan E.J. Vandamme. Bacteriocins of lactic acid bacteria : Microbiology, genetic dan application. Blackie Academic, London. Ray, B. 1996. Probiotic of lactic acid bacteria. Science or myth. Dalam: NATO ASI Series, editor. Lactic acid bacteria. Current advances in metabolism, genetic and application. Volume V(98). Springer-Verlag. Germany. Russel, J.B. 1992. Another explanation for the toxicity of fermentation acids at low pH: anion accumulation versus uncoupling. J. Appl. Bacteriol. 73 : 363-370. Salminen, S., A. Von-Wright, and A. Owehand. 2004. Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects. Marcel Dekker Inc. New York. Salminen, S., A. Ouwehand, Y. Beno and Y.K. Lee. 1999. Probiotic : how should they be defined?. Trends in Food Science and Technology. Shortt C. 1999. The probiotic century: historical and current perspectives. Trends Food Sci. Tech. 10:411-417. Siegumfeldt, H., Rechninger B.K., and Jacobsen M. 2000. Dynamic changes of intracellular pH in individual lactic acid bacterium cells in response to a rapid drop in extracellular pH. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2330-2335. Smet, I.D., L. van Hoorde, M.V. Woestyne, H. Christiaens and W. Verstraete. 1995. Significance of bile salt hydrolytic activities of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 79 : 292-301. Svensson, U. 1999. Industrial perspective. Probiotics: A Critical Review, 15-8: 5764. ISBN: 1898486. 36
Steel, R. G. D. dan J. H. Torrie. 1991. Prinsip dan Prosedur Statistika. Terjemahan B. Sumantri. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Tannock, G. W. 1999. Probiotics : A critical review. Horizon Scientific Prod, England Vinderola, C. G., N. Bailo and J.A. Reinheimer, 2000. Survival of probiotic microflora in Argentinian yoghurts during refrigerated storage. Food. Res. Intl.,33: 97-102. Wright, A. and Salminen, S., 1999. Probiotics: established effects and open questions. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 11, pp. 1195–1198. Wirawati, C. U. 2002. Potensi bakteri asam laktat yang diisolasi dari tempoyak sebagai probiotik. Tesis. Institut Pertanian Bogor: Program Studi Ilmu Pangan. Yang, Y. S., M. C. Chen, and C. C. Liao. 2001. Mutant bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance. U.S. Patent Appl. 6306638. Zavaglia, A. G., G. Kociubinski, P. Perez and G. De Antoni. 1998. Isolation and characterization of Bifidobacterium strains for probiotic formulation. J. Food Protect. 61(7) : 865-873.
37
LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil Sidik Ragam Jumlah Kematian Populasi 28 Isolat Bakteri Asam Laktat pada pH Lambung (2) Informasi Kelas pH Kultur
Jumlah Nilai 1 2 28 1A1 1A2 1A32 1A4 1A5 1A6 1B1 1B2 1C1 1C3 1C4 1C6 1D1 1D2 1D3 2A1 2A2 2A3 2B1 2B2 2B3 2B4 2C12 2C2 2D1 2D2 2D41 2D42 Simbol 28 a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u v w x y z aa bb
Jumlah data = 84 Variable yang diamati : TTLB (total bakteri) SK Bakteri Galat Total
db JK 27 185.37767024 56 4.78013333 83 190.15780357
KT 6.86583964 0.08535952
F Hitung 80.43
Pr > F 0.0001
Lampiran 2. Hasil Sidik Ragam Jumlah Kematian Populasi 28 Isolat Bakteri Asam Laktat pada pH Usus (7,2) Informasi Kelas pH Kultur
Jumlah Nilai 1 7,2 28 1A1 1A2 1A32 1A4 1A5 1A6 1B1 1B2 1C1 1C3 1C4 1C6 1D1 1D2 1D3 2A1 2A2 2A3 2B1 2B2 2B3 2B4 2C12 2C2 2D1 2D2 2D41 2D42 Simbol 28 a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u v w x y z aa bb
Jumlah data = 84 Variable yang diamati : TTLB (total bakteri) SK Bakteri Galat Total
db 27 56 83
JK 77.25782381 5.59673333 82.85455714
KT 2.86140088 0.09994167
F Hitung 28.63
Pr > F 0.0001
Lampiran 3. Hasil Sidik Ragam Jumlah Kematian Populasi 10 Isolat Bakteri Asam Laktat pada Garam Empedu 0,3% Informasi Kelas pH Kultur Simbol
Jumlah 1 10 10
Nilai 0,3% 1A2 1A32 1A5 1B1 1C4 2B1 2B2 2B4 2C12 2D1 bcegkstvwy
39
Jumlah data = 30 Variable yang diamati : TTLB (total bakteri) SK Bakteri Galat Total
db 9 20 29
JK 15.08533667 2.16240000 17.24773667
KT 1.67614852 0.10812000
F Hitung 15.50
Pr > F 0.0001
40
