MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE
Studium distribuce prvků ve vzorcích zubů pomocí LA-ICP-MS Bakalářská práce
Vedoucí bakalářské práce Mgr. Michaela Galiová, Ph.D.
Lenka Tenorová
Brno 2011
Prohlašuji, ţe jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně s vyuţitím uvedené literatury. ……………………… Lenka Tenorová
…………………….. Brno, 2011
1
Poděkování: Z celého srdce bych ráda poděkovala vedoucí mé bakalářské práce Mgr. Michaele Galiové, Ph.D. za cenné rady při měření, vyhodnocování a interpretaci výsledků, za obrovskou trpělivost a za čas, který mi věnovala. Dále bych ráda poděkovala RNDr. Miriam Nývltové Fišákové, Ph.D. za poskytnutí vzorků zubů k analýze a v neposlední řadě bych také ráda poděkovala Mgr. Radku Škodovi, Ph.D. za poskytnutí výsledků analýzy jednotlivých zubů z elektronové mikrosondy.
2
OBSAH 1 2
3
4
5 6
ÚVOD............................................................................................................................ 4 TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................... 5 2.1 Obecná charakteristika zubů .................................................................................. 5 2.1.1 Stavba zubů ................................................................................................... 5 2.1.2 Chemické sloţení zubů .................................................................................. 6 2.2 Vztah k archeologii ................................................................................................ 7 2.2.1 Určení skladby potravy.................................................................................. 7 2.2.2 Cyklus izotopů v přírodě a určení mobility ................................................... 8 2.3 Diageneze ............................................................................................................ 10 2.4 Způsob obţivy zvířat ........................................................................................... 11 2.5 Naleziště .............................................................................................................. 12 2.6 Metody analýzy zubů........................................................................................... 14 2.6.1 Laserová ablace ve spojení s hmotnostní spektrometrií indukčně vázaným plazmatem.................................................................................................................... 14 2.7 Další metody analýzy povrchů pevných látek ..................................................... 18 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ....................................................................................... 22 3.1 Popis zařízení....................................................................................................... 22 3.1.1 LA-ICP-MS ................................................................................................. 22 3.1.2 EMPA .......................................................................................................... 23 3.2 Vzorky ................................................................................................................. 24 3.3 Experimentální podmínky LA-ICP-MS .............................................................. 25 3.4 Vyhodnocení signálu ........................................................................................... 25 3.5 Kalibrace.............................................................................................................. 26 VÝSLEDKY A DISKUZE .......................................................................................... 28 4.1 Vzorek číslo 1 ...................................................................................................... 28 4.2 Vzorek číslo 2 ...................................................................................................... 31 4.3 Vzorek číslo 3 ...................................................................................................... 34 4.4 Vzorek číslo 4 ...................................................................................................... 37 4.5 Vzorek číslo 5 ...................................................................................................... 41 4.6 Vzorek číslo 6 ...................................................................................................... 43 4.7 Vzorek číslo 7 ...................................................................................................... 49 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 54 LITERATURA ............................................................................................................ 55
3
1 ÚVOD Prvky obsaţené v kostech a zubech ţivočichů včetně člověka často ve stopových a ultrastopových mnoţstvích hrají ţivotně důleţitou roli v biologických systémech. Biominerály jsou vynikající archivy ţivota jedinců a z toho důvodu jsou stále častěji zkoumány. Například kosti i zuby, které se pravidelně kaţdý rok zvětšují, mohou uchovávat změny okolního prostředí prostřednictvím koncentrací kovů a nekovů a izotopového sloţení prvků. Díky těmto vlastnostem mohou být vyuţívány při určování mobility a stravy různých druhů zvířat. Díky své schopnosti poskytovat velmi citlivé, přesné a správné multiprvkové analýzy stopových a ultrastopových prvků a izotopových poměrů, je právě LA-ICP-MS jednou z nejdůleţitějších spektrometrických technik pouţívaných pro popis biologických materiálů [1]. Cílem této bakalářské práce je uvedení do problematiky laserové ablace ve spojení s hmotnostní spektrometrií indukčně vázaným plazmatem a zejména vyuţití této metody při sledování rozloţení vybraných prvků ve vzorcích fosilních zvířecích zubů. Hlavním cílem práce je sledování fluktuace poměrů Zn/Ca a Ba/Ca, Sr/Zn a Sr/Ba, které mohou být vyuţity při určování migrace a výţivy daných jedinců.
4
2 TEORETICKÁ ČÁST
2.1 Obecná charakteristika zubů Zuby (dentes) jsou tvrdé, bílé orgány připomínající kosti. Vznikají jako specializovaný produkt ústní sliznice. Část zubu je původu ektodermového (sklovina) a část je původu mesodermového (zubovina, cement, zubní dřeň). Slouţí hlavně k mechanickému zpracování potravy. Během ţivota se vytváří: -
zuby dočasné (dentes decidui)
-
zuby stálé (dentes permanentes) [2].
Kaţdý zub se skládá z: -
korunky (corona dentis),
-
zubního krčku (collum dentis),
-
zubního kořenu případně kořenů (radix (radices) dentis).
Dále se zuby dělí podle tvaru a počtu kořenů na řezáky, špičáky, třenové zuby a stoličky. Vícehrbolkové zuby mají na korunce nestejně silnou sklovinu, která je nejsilnější na vrcholu hrbolků a naopak nejtenčí je v zářezech mezi hrbolky [3].
2.1.1 Stavba zubů Zub se skládá z několika vrstev: -
sklovina (enamelum) – je na povrchu volné části zubu a jedná se o nejtvrdší tkáň v těle. Je tvořena sklovinnými prizmaty (hranoly sloţené z jehlancovitých krystalů hydroxyapatitu). Jedná se o tvrdou, ale zároveň poměrně křehkou tkáň, která můţe být poškozena například prudkými změnami teploty.
-
zubovina (dentinum) – tvoří většinu hmoty zubu a je měkčí neţ sklovina. Obsahuje asi 80 % anorganických látek typu hydroxyapatitu, u něhoţ jsou destičkovité krystaly menší neţ krystaly skloviny. Dále zubovinou prochází mnoţství
5
mikroskopických kanálků, ve kterých jsou uloţeny výběţky odontoblastů tvořících vrstvičku na rozhraní zuboviny a zubní dřeně. -
dutina uvnitř zuboviny je vyplněná zubní dření (pulpa dentis) – obsahuje cévy a nervy zubu. Tvoří ji vazivo, které kromě vláken, buněk a základní amorfní hmoty nese také cévní a nervové pleteně.,
-
cement (cementum) – obaluje povrch kořene zubu. Jedná se o hutnou vláknitou kost, jeţ chrání kořen a kotvící fixační aparát zubu [3].
2.1.2 Chemické složení zubů Organickou sloţkou zubů a kostí je kolagen. Naproti tomu minerální frakci tvoří hydroxyapatit (Ca10(PO4)6(OH)2) [4]. Obsah vápníku v zubech je v rozmezí od 34 – 39 %, obsah fosforu je 16 – 18 % [5]. Ca2+ – zajišťuje pevnost zubu, slouţí k remodelaci kostí a zubů a společně s fosforem jde o hlavní stavební prvky zubů. Zn2+ – v dentinu a ve sklovině se nachází přibliţně ve stejném mnoţství, ve větší míře se nachází v povrchových vrstvách. Mg2+ – druhý nejrozšířenější kation po vápníku, větší obsah hořčíku je v dentinu. CO32- – větší mnoţství uhličitanových iontů v hydroxyapatitu způsobuje jeho větší rozpustnost v kyselém prostředí a tím vzniká zubní kaz. F- – sniţuje rozpustnost hydroxyapatitu v kyselém prostředí [6]. Sr2+, Ba2+ – silná afinita k PO43-, proto jsou v kostech vázány silněji neţ vápník [7]. Ve stopovém mnoţství jsou přítomny ionty prvků sodíku, ţeleza, olova, cínu, mědi, rtuti a manganu [6]. Sklovina zubu se vyvíjí a vápenatí kontrolovaným, pravidelným a prstencovitým způsobem. Jednou takto vytvořená sklovina uţ není dále podrobována minerální resorpci [5]. V případě dentinu však dochází k remodelaci kaţdých 10 let.
6
2.2 Vztah k archeologii Archeologové spolu s antropology často uvaţují o tom, jak se lidé v minulosti stravovali. Dále se zabývají také otázkami týkajícími se migrace lidí a zvířat. Zde je důleţitý výsledek rozdílu izotopového profilu kostí a zubů jedince a daného místa, kde se v různých dobách svého ţivota nacházel. Tyto obory se zabývají studiem různých kulturních předmětů, keramiky a v nejlepším případě kostí a zubů, aby dosáhly zodpovězení alespoň některých svých otázek [4].
2.2.1 Určení skladby potravy Díky zdokonalení analytických metod v posledních dvou desetiletích je moţné vyuţít stopové prvky vyskytující se v kostech pro rekonstrukci potravy daného jedince. Určující nejsou jednotlivé součásti stravy, ale zdroje prvků. Určením prvků, jejichţ výskyt v potravním řetězci je znám, je moţné určit, zda stravování několik let před smrtí bylo zaloţeno na přijímání rostlinné potravy či spíše ţivočišné. Prvky stroncium, baryum, zinek, olovo, sodík, měď, hořčík a vanad se ukázaly být jako nejvhodnější pro rekonstrukci potravy. Nejdůleţitější z těchto prvků je stroncium. Stroncium se nachází v přírodě prakticky všude. Ve velkých mnoţstvích se vyskytuje v magmatických skalách, alkalických zeminách, pegmatitech, atd [7]. Význam stroncia Stroncium se dostává do potravního řetězce z rostlin, které přijímají stroncium z půdy společně s nezbytným vápníkem. Z lodyhy rostlin se stroncium dostává do listů. Stroncium a vápník se dostávají do krevního toku, kde se dále ukládají do minerální sloţky kostí. Mnoţství stroncia se sniţuje v potravním řetězci v pořadí býloţravci (400 – 500 mg.kg-1), všeţravci (150 – 400 mg.kg-1) a masoţravci (100 – 300 mg.kg-1). Tyto hodnoty jsou pouze orientační, protoţe byly určeny analýzou kostí, kde se stroncium přednostně ukládá. Obsah stroncia také závisí na druhu kosti a na daném zvířeti. Vyšší hodnoty stroncia tedy ukazují na větší podíl rostlinné stravy. Naopak niţší hodnoty stroncia představují přijímání ţivočišné potravy. 7
Problém by mohl nastat, pokud by se v potravě daného ţivočicha vyskytovali měkkýši, kteří shromaţďují stroncium z vody ve svých tkáních, tím se hodnoty stroncia zvyšují, coţ by mělo být bráno v úvahu při interpretaci výsledků [7].
Baryum a zinek Baryum je více citlivé na odchylky ve stravě neţ stroncium a je tedy vynikající pro určení druhu potravy. Zatímco koncentrace stroncia klesá v pořadí od býloţravců přes všeţravce aţ k masoţravcům, koncentrace zinku se ve stejném pořadí zvyšuje – býloţravci (90 – 150 mg.kg-1), všeţravci (120 – 220 mg.kg-1) a masoţravci (175 – 250 mg.kg-1). Tyto hodnoty jsou opět závislé na typu kosti a druhu daného zvířete. Relativně vysoké hodnoty zinku se vyskytují v mase, dále jsou vysoké koncentrace v ořechách a měkkýších nebo mohou být vysoké hodnoty detekovány při zánětu okolní tkáně [7].
2.2.2 Cyklus izotopů v přírodě a určení mobility Všechny organismy jsou součástí komplexu globálních geochemických cyklů. O klimatu i o postavení organismů v potravních řetězcích nás informuje mnoţství izotopů ukládaných během ţivota v kostech a zubech lidí či zvířat. Obsah izotopů se zvyšuje na kaţdé trofické úrovni o 2 aţ 3 ‰. Kaţdá geografická oblast má vlastní určitou geochemickou charakteristiku odpovídající obsahu stabilních izotopů různých prvků, které jsou obsaţeny v horninách. Z těchto hornin se zvětráváním dostávají do půdy a do vody a následně do rostlinné potravy v poměru, který je typický pro dané území. Obsah stabilních izotopů zůstává zachován v zubních tkáních. Je-li rozdíl v poměru stabilních izotopů území, kde jedinec zemřel, a území, kde se narodil, dá se uvaţovat o jeho migraci. Ovšem určit místo, odkud přišel, je velmi obtíţné, ne-li nemoţné [4].
8
Poměr 87Sr/86Sr Nejvhodnějším prvkem pro sledování migrací a pohybu lidí a zvířat se jeví stroncium. Stroncium se vyskytuje ve čtyřech stabilních izotopech – 86Sr, 87Sr, 88Sr a 84Sr. V průběhu času se nuklid stroncia 87Sr vytváří rozpadem radioaktivního rubidia 87Rb. Podle toho, jak je hornina stará a kolik v ní původně bylo
87
Rb, je v hornině obsaţen nuklid
Přibliţnému geologickému stáří substrátu odpovídá poměr
87
87
Sr.
Sr/86Sr. Geologicky mladé
horniny mají hodnotu poměru 87Sr/86Sr niţší neţ horniny geologicky staré [4]. Poměr Sr/Ca, Ba/Sr Na základě poměru Sr/Ca můţeme například určit přibliţnou dobu kojení a dobu odstavení dítěte. Dále tento poměr můţe slouţit k určení mobility. Baryum a stroncium vstupuje do kosterních tkání v poměru k jejich mnoţství v potravě. Jejich mnoţství se v prostředí značně mění podle různých regionů. Zubní sklovina se během dětství vyvíjí, přitom si ale uchovává původní mnoţství těchto prvků. Díky tomu nám můţe poskytnout informace o geografickém původu daného jedince [7]. Využití C a N Hodnoty δ15N se zvyšují v potravním řetězci o 2 – 3 ‰. Býloţravci mají hodnoty δ15N kolem 6 ‰ a masoţravci se dostávají na hodnoty v rozpětí 9 – 10 ‰. Vyuţitím hodnot δ15N můţeme také určit, jestli zdroj potravy byl spíše mořského nebo sladkovodního původu. Na základě poklesu δ15N je moţné také určit věk odstavení dítěte. Rozšiřující informaci o postavení jedince v trofickém řetězci udává poměr δ13C/ δ15N [4]. Vyuţitím izotopu
13
C můţeme určit, zda se jedná o C3 (obilí, rýţe, ovocné stromy, atd.)
nebo C4 rostliny (tropické trávy, kukuřice, proso, atd.) [7].
9
2.3 Diageneze Diageneze je proces fyzikálních a chemických změn v kostech a zubech po jejich sedimentaci. Diageneze můţe ovlivnit informace získané ze vzorků [7]. V hydroxyapatitu mohou být anionty a kationty substituovány. Na pozici vápenatých iontů ve struktuře hydroxyapatitu mohou vstupovat další kationty jako Ca2+, Na+ a Mg2+. Na pozici fosforečnanových iontů mohou vstupovat CO32-, HPO42a na pozici hydroxylu se mohou navázat CO32-, F-, Cl- a H2O. Do kostí a zubů se mohou zabudovávat i další prvky jako Fe, Mn, Si, Al, Ba a Cu. Uhličitanový anion (CO32-) můţe tedy nahradit jak skupinu OH-, tak i skupinu PO43-. Nahrazení fosforečnanové skupiny uhličitanem můţe zdeformovat krystalovou mříţku a sníţit tak stabilitu apatitu. Během fosilizace se hydroxyapatit mění na více stabilní formu, protoţe získává fluoritové ionty. Koncentrace stopových prvků se během procesu diagenese můţe zvyšovat nebo sniţovat. Konečné sloţení biogenního apatitu je závislé na koncentraci stopových prvků v okolí, mikrostruktuře zubu, chemickém sloţení mikroprostředí v místě pohřbení, délce expozice, pH, teplotě, atd. [8 - 12].
V následující kapitole bych chtěla přiblíţit způsob obţivy zvířat, jejichţ vzorky zubů byly analyzovány. Dále budou také zmíněna jednotlivá naleziště, ze kterých jednotlivé vzorky zubů pochází.
10
2.4 Způsob obživy zvířat Vlk obecný (Canis lupus) Původně se vlk vyskytoval ve všech biotopech (arktická tundra, lesní a lesostepní oblasti jiţní a jihovýchodní Evropy). Člověk ovšem vlka vytlačil do horských oblastí v severní Skandinávii, na Balkánský poloostrov, do Apenin, Pyrenejí a Karpat. Na východě je vlk rozšířen v rozlehlém území střední Asie a Sibiře aţ na druhou stranu v Severní Americe. Na našem území se vlci trvale nevyskytují, ale občas se sem zatoulá několik jedinců z Karpat. Vlci nejčastěji loví ve smečkách velkou jelení či srnčí zvěř, někdy dokonce i losy. Ţiví se také nejrůznějšími malými zvířaty, mršinami a dokonce i rostlinnou stravou. Nejsou vůbec vybíraví a nejčastěji ţerou to, co mohou nejsnadněji ukořistit. Proto velmi často způsobují škody na stavech domácích zvířat, nejčastěji ovcí či hovězího dobytka, která se vyskytují ve stádech, kde se dají mnohem snadněji ulovit neţ plachá lesní zvěř [13]. Liška obecná (Vulpes vulpes) Jedná se o divoce ţijící psovitou šelmu s velikou schopností přizpůsobit se podmínkám okolí. Je rozšířena téměř v celé Evropě a také ve velké části severní a střední Asie a Severní Ameriky. Husté lesy, ale i parky, zahrádkářské kolonie u velkých měst jí poskytují vhodné ţivotní podmínky. Co se potravy týče, nejsou lišky moc vybíravé. Většinou jsou hlavním zdrojem potravy myši. Dále liška loví téměř všechna zvířata přiměřené velikosti (kolouchy, zajíce, koroptve, ale také domácí slepice). Na březích vodních toků vyhledává hnízda divokých kachen, vodních slípek a potápek. Také ţere leklé ryby a ţáby. Dále poţírá zvířata přejetá od aut, která vyhledává podél silnic. Dále se ţiví larvami různého hmyzu, lučními kobylkami, chrousty a dokonce i ţíţalami. Nevyhýbá se ani rostlinné stravě, například v létě neodolá borůvkám, které jí velmi chutnají [13].
11
Liška polární (Vulpes lagopus) Ţije v arktických oblastech severní Skandinávie, Aljašky, severní Sibiře, severní Kanady, v Grónsku a na Islandu a také na některých ostrovech v Severním moři. Vyhledává i lidská sídla, kde se přiţivuje na odpadcích. Někdy ji lze spatřit i na ledových krách. Hlavní součástí potravy lišky polární jsou malí savci (lumíci, zajíci běláci), dále se ţiví zdechlinami, vajíčky a mláďaty ptáků. Lišky polární ţijící poblíţ moře ţerou i různé druhy mořských ţivočichů [13]. Sob polární (Rangifer tarandus) Sob polární ţije na severní polokouli v Severní Americe, Kanadě, v Rusku, ve Skandinávii a v severním Mongolsku. Sob polární je býloţravec a ţiví se tedy veškerou dostupnou rostlinnou potravou (mechy, lišejníky, traviny, výhonky keřů, listí, atd.). Někdy dokonce seţere i lumíky [14].
2.5 Naleziště Dolní Věstonice a Pavlov Mezi hlavní naleziště patří Dolní Věstonice I a II, které v pásu dlouhém asi 2,5 km lemují severní úpatí Pavlovských vrchů nad řekou Dyjí (Obr. č. 1). Stáří lokalit je nyní datováno na 29 000 – 24 000 let, některé k 21 000 let. V případě Dolních Věstonic a Pavlova se jedná o nejúplněji dochované civilizační centrum v daném časovém období. Na počátku mladého paleolitu (mezi 40 000 – 30 000 lety) se utváří na Moravě síť rozptýlených sídlišť, které lemují zejména okraje vrchovin. Mezi 30 000 – 20 000 lety (osídleny Dolní Věstonice a Pavlov) se mění strategie volby sídliště. Utvářejí se soustředěná sídliště ve východních polohách podél geografické osy směřující z Podunají (Willendorf) do Moravské brány (Předmostí) a dále do jiţního Polska (okolí Krakova). Kamenné surovina na výrobu nástrojů se transportovala podél geografické osy, která prochází Moravskou bránou do Podunají. Na Moravě přitom existují zdroje kamenných surovin, ale v Dolních Věstonicích a v Pavlově se téměř nevyskytují. Z toho vyplývá, ţe se 12
masa kamenné suroviny musela na jiţní Moravu donášet, nejspíše v sezónním rytmu. Podél stejné geografické osy migrovala sezónně i stáda lovné zvěře (sob, liška, vlk a zajíc). Na úpatí Pavlovských vrchů byla všechna sídliště zásobena týmiţ horninami, masem a dalšími surovinami [15].
Willendorf II Willendorf II je venkovní stanoviště nacházející se v rakouském Dunajském údolí přibliţně 80 km západně od Vídně (Obr. č. 1). Jedná se o jedno stanoviště ze seskupení osmi nalezišť Willendorf I, Willendorf I – North, Willendorf II aţ VII podél Dunaje. Toto místo je známé hlavně díky objevu figurky Venuše, ale také pro své dlouhé sekvence (devět archeologických horizontů), které jsou od sebe odděleny neúrodnými nánosy [16].
Obr. č. 1: Znázornění nalezišť Dolní Věstonice a Pavlov (B) a Willendorf (A) [17] Boršice Geograficky spadá katastr Boršic u Buchlovic do Buchlovické pahorkatiny tvořící východní předhůří Chřibů (Obr. č. 2). Území má podobnou stavbu nejmladších geologických vrstev. Paleogenní prachovité jílovce tvoří terciérní podloţí. Kvartérní sérii tvoří sedimenty s mnoţstvím vápnitých záteků z nadloţních spraší. Z této vrstvy pochází většina nálezů [18].
13
Obr. č. 2: Lokalizace naleziště Boršice u Buchlovic (A) [17]
2.6 Metody analýzy zubů 2.6.1 Laserová ablace ve spojení s hmotnostní spektrometrií indukčně vázaným plazmatem Laserová ablace ve spojení s hmotnostní spektrometrií indukčně vázaným plazmatem (LAICP-MS – Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) je vyuţívána k analýze pevných materiálů. Jedná se o velmi citlivou analytickou metodu. Díky spojení laserové ablace s hmotnostním spektrometrem poskytuje rychlou prvkovou i izotopovou analýzu. Detekční limity v LA-ICP-MS jsou závislé zejména na citlivosti ICP-MS. Tato metoda vyţaduje jen minimální přípravu vzorku [19]. Pro přímé stanovení izotopového podílu v pevných vzorcích je LA-ICP-MS aplikována ve vzrůstající míře v geologii [20], medicíně [21], biologii [22, 23] a v chemii ţivotního prostředí [1]. Laserová ablace V analytické chemii zaznamenala laserová ablace v posledních letech velký rozvoj [24]. Při chemické analýze laserovou ablací je potřeba jen malé mnoţství vzorku < μg a někdy můţe být dostatečné mnoţství v řádech pikogramů a femtogramů [25]. Ve spojení s hmotnostní spektrometrií se laserová ablace stala metodou vhodnou pro stanovení velkého mnoţství prvků s velmi nízkými limity detekce [24]. 14
Princip laserové ablace Laserová ablace je zaloţena na interakci zaostřeného laserového paprsku s povrchem vzorku. Materiál vzorku se prudce ohřeje do určité hloubky pod povrch a vzroste tlak, který vyvolá explozi a tříštění povrchové vrstvy. Dojde k odpaření materiálu, odštěpení atomů, iontů, molekul a fragmentů molekul z povrchu vzorku [24]. Velikost ablačního kráteru, vzniklého po interakci laserového paprsku s povrchem vzorku, je závislá na energii pulzu, operačním modu laseru, schopnosti zaostřit laserový paprsek a vlastnostech interagující hmoty [19]. Ablatovaný materiál je následně transportován proudem nosného plynu do dalšího ionizačního a excitačního zdroje [1]. Lasery využívané pro ablaci Pro ablaci bylo vyuţíváno mnoho typů pulzních laserů. Mezi první lasery vyuţívané pro chemickou analýzu pevných látek patří lasery rubínové. V této době jsou při měření experimentů nejvíce pouţívány pevnolátkové nebo excimerové lasery. K širokému vyuţití pevnolátkových Nd:YAG laserů přispěla jejich relativně nízká cena, nenáročnost na údrţbu a moţnost jednoduchého zabudování do malého ablačního systému. Ablace je ovlivněna vlnovou délkou laseru. Základní vlnová délka pro Nd:YAG lasery je v IČ oblasti při 1064 nm. Vyzařovaná vlnová délka u excimerových laserů závisí na pouţitém plynu. Obecně lze říci, ţe kratší vlnové délky poskytují vyšší energie fotonů pro účinné rušení vazeb a ionizaci pevných vzorků [25]. Ablační systém Ablační systém se skládá z čočky, která můţe být součástí optického mikroskopu, ablační komory a pohyblivého systému. Povrch vzorku můţeme sledovat také pomocí CCD kamery. Vzorek je umístěn v ablační komoře, která má křemenné okénko, přes které vstupuje do komory laserový paprsek. Vliv na účinnost transportu vzorku má objem komory a transportní hadičky spojující ablační systém s ICP [24].
15
ICP V plazmatu, coţ je ionizovaný, makroskopický neutrální plyn, vykazují elektrony a ionty tzv. kolektivní chování. Vysokofrekvenční elektromagnetické pole indukční cívky dodává do ICP výboje energii volným elektronům. Ionizací jiskrovým výbojem z Teslova transformátoru je iniciován samotný výboj ICP. Další ionizaci pracovního plynu způsobují vytvořené elektrony a dochází ke vzniku nepřetrţitého výboje [26]. Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem Jedná se o víceprvkovou analytickou metodu mající pro většinu prvků nejniţší meze detekce ze všech běţných analytických metod vyuţívaných v současnosti. Navíc má tato metoda velký koncentrační rozsah stanovení. ICP-MS je jednou z nejefektivnějších metod v prvkové analýze pevných látek. Svým charakterem a vysokou univerzálností, citlivostí a rychlostí předčí klasické metody atomové absorpční i emisní spektrometrie. Nevýhodou jsou ovšem vyšší provozní a investiční náklady [27].
Princip ICP-MS Aerosol vzorku je proudem nosného plynu veden do plazmatu, kde je vysušen a suchý aerosol vzorku je účinně atomizován a ionizován. Ionty následně vstupují malým otvorem v kuţelovitém „sampleru“ do předvakua. Dále prochází část otvorem v kuţelovitém „skimeru“ do vakua hmotnostního spektrometru. Z iontové optiky vstupuje fokusovaný svazek iontů do analyzátoru, kde je rozdělen podle poměru m/z. Ionty prošlé analyzátorem dopadají na detektor, který převádí proud iontů na elektrický signál [27]. Způsoby separace iontů v hmotnostní spektrometrii Separace iontů magnetickým a elektrickým polem Přístroje s jednoduchou fokusací – ionty jsou urychleny v iontovém zdroji elektrickým polem s určitým napětím, které udělí iontům kinetickou energii. Ionty se stejným nábojem, ale s různou hmotností, se pohybují po kruhových drahách s různým poloměrem zakřivení. Jednotlivé druhy iontů je moţno registrovat v určitých bodech, do kterých se fokusují po průletu magnetickým polem. 16
Přístroje s dvojí fokusací – ionty vstupují do separačního magnetického pole rozdělené a fokusované podle energie. Magnetický sektor fokusuje ionty se stejnou hmotností i přesto, ţe mají do jisté míry různou energii [28]. Dynamická separace iontů Kvadrupólový analyzátor – nevyţaduje přítomnost magnetického pole. Vyuţívá kombinaci stejnosměrného a radiofrekvenčního elektrického pole vytvářející hmotnostní filtr pro ionty, které do tohoto kombinovaného pole vstupují [28]. Separace podle doby letu Princip je zaloţen na měření času, který iont potřebuje k prolétnutí vzdálenosti mezi iontovým zdrojem a detektorem. Na vstupu do separátoru je potřeba vytvořit svazek iontů se stejnou kinetickou energií. Za letu oblastí bez pole se ionty rozdělí do skupin podle rychlosti a tedy i hmotnosti [28]. Detektory iontů Faradayův kelímek – tvoří jej konverzní elektroda miskovitého tvaru. Po dopadu iontu je z povrchu vyraţen elektron, který dopadá na anodu. Elektronové násobiče – většinou tvaru zuţující se trubice. Ionty dopadají do širší části trubice a vyráţí elektrony. Proud elektronů je veden do zesilovače, kde je vyhodnocován. Detektor s konverzní dynodou a fotonásobičem – vyraţený elektron dopadá na fosforescenční stínítko, kde dojde k vyraţení fotonu, který je poté zachycen fotonásobičem [29].
Interference V ICP-MS se setkáváme s interferencemi spektrálními a nespektrálními. Spektrální interference – jsou závislé na rozlišovací schopnosti spektrometru a jejich hlavní příčinou je výskyt částic o stejném m/z (izobarický překryv). Dále se jedná o interference dvojnásobně nabitých iontů a polyatomické ionty, které vznikají z iontů produkovaných v ICP. Nespektrální interference – nejčastěji se jedná o vliv matrice a snadno ionizovatelných prvků.
17
Interference molekulových iontů se dají řešit vyuţitím matematických korekcí, čímţ se ovšem negativně ovlivní mez detekce. Časté je pouţití tzv. „studeného plazmatu“. Jedná se o plazma generované s pouţitím nízkého výkonu a zvýšeného průtoku nosného plynu, coţ vede ke sníţení tvorby polyatomických iontů [30].
Kalibrace LA-ICP-MS je limitována procesem kvantifikace. Získání nebo příprava standardů s vhodnou matricí jsou obtíţné. Ablace pevných vzorků s přizpůsobenou matricí (matrix-matched solid calibration) – nejběţnější metodou kalibrace pro LA-ICP-MS je externí kalibrace vyuţívající „matrix matching“ – kalibrace s přizpůsobenou matricí. Certifikované referenční materiály jsou dostupné pro některé druhy pevných matric. Většina laboratoří si ovšem připravuje vlastní „matrix-matched“ standardy skládající se z vhodné matrice a obsahující stanovovaný prvek analytu [24]. Přepočet na sumu – tato metoda vyuţívá celkového signálu izotopů všech prvků ve vzorku. Nejprve se vypočítají hodnoty obsahů těchto prvků ve vzorku pomocí SRM, dále se tyto hodnoty přepočítají na oxidy prvků, tak aby součet odpovídal 100 % hm. Přepočet na porovnávací prvek – vyuţívá se k eliminaci rozdílů v celkovém mnoţství ablatovaného materiálu během kaţdé ablace. Nezávislou metodou se určí obsah alespoň jednoho prvku, na který se poté přepočítají obsahy ostatních prvků ve vzorku [20].
2.7 Další metody analýzy povrchů pevných látek K analýze zubů mohou být pouţity také následující metody hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů (SIMS – Secondary Ion Mass Spectrometry), elektronová mikrosonda (EMPA – Electron Probe Micro – Analyzer), infračervená spektroskopie, Ramanova spektrometrie, spektrometrie rentgenového záření buzeného ionty (PIXE – Particle Induced X-ray Emission), spektrometrie laserem buzeného plazmatu – LIBS (Laser Induced Breakdown Spectrometry) a rastrovací tunelová mikroskopie (STM – Scanning Tunneling Microscopy).
18
SIMS Jedná se o hmotnostní spektrometrii atomárních a molekulárních iontů emitovaných při bombardování povrchu pevné látky ionty nebo atomy. V důsledku bombardování povrchu vzorku ionty dochází k emisi atomárních a molekulárních částic. Tento proces se nazývá odprašování. Jen asi 1 % odprašovaných částic je emitováno jako ionty. Základem metody SIMS je analýza těchto sekundárních iontů hmotnostním spektrometrem. Nevýhodou této metody je její destruktivnost a obtíţnost kvantifikace dat v některých případech. Avšak výhod má tato metoda mnohem více, například jsou to vysoká citlivost, schopnost detekce všech prvků, moţnost provádět izotopickou analýzu, moţnost zjišťovat koncentrační hloubkové profily prvků a velké plošné rozlišení [31, 32]. Elektronová mikrosonda V této metodě se vyuţívá spojení elektronového mikroskopu s lokální rentgenovou analýzou. Elektrony jsou urychlovány v elektronovém mikroskopu a dále jsou fokusovány na definovanou plochu vzorku. Dále vzniká charakteristické rentgenovo záření, dochází k pruţným elektronovým sráţkám, vznikají sekundární elektrony, absorbují se elektrony, vzniká viditelné světlo a dochází k difrakci elektronů a rentgenového záření. Spektrum rentgenových paprsků můţe být detekováno na základě vlnové délky nebo energie [33, 34]. Infračervená spektroskopie Infračervená spektroskopie vyuţívá absorpce infračerveného záření molekulami látek, coţ způsobuje změny vibračních a rotačních stavů molekul. Záření můţe být absorbováno, jen pokud jeho energie odpovídá daným rotačním a vibračním přechodům. Pro kvalitativní analýzu lze získat informace z vlnové délky absorbovaného záření [29, 10].
Ramanova spektrometrie Ramanova spektrometrie je zaloţena na měření rozptýleného záření. Toto záření vzniká interakcí monochromatického záření s molekulami vzorku, současně se mění rotační a vibrační stav těchto molekul [29, 35]. 19
PIXE Tato metoda vyuţívá charakteristické rentgenovo záření, které vzniká při bombardování vzorku urychlenými nabitými částicemi. Protony, částice α anebo dvojnásobně ionizované ionty helia bývají vyuţívány jako budící částice. Nejčastěji jsou vyuţívány protony. Při vyhodnocování spektra jsou přepočítány naměřené intenzity na koncentrace [33, 36].
LIBS Jedná se o formu atomové emisní spektroskopie, která vyuţívá jako budicí zdroj vysoce energetický laserový pulz. Principem metody je sledování emise mikroplazmatu vznikajícího při laserové ablaci na povrchu vzorku. Analýza můţe být provedena bez přímého kontaktu se vzorkem, coţ je asi největší výhoda této metody. LIBS má stejný princip vzorkování jako LA-ICP-MS, ale vyuţívá jiné procesy, ke kterým při laserové ablaci dochází. Předmětem zájmu je v této metodě záření emitované laserem buzeným mikroplazmatem. Absorpce fotonů atomy vzorku je způsobená laserovým pulzem zaostřeným na malou plochu vzorku. Analyzovaný vzorek je prudce ohříván, aţ dojde k ablaci tenké vrstvy analyzovaného materiálu. Vzniklé páry pohlcují další energii, expandují a vzniká mikroplazma. Mikroplazma poté expanduje, dojde k ochlazení a emisi záření. Excitované atomy a ionty emitují záření s charakteristickou vlnovou délkou. Prvkové sloţení ablatovaného materiálů se určí pomocí spektrální analýzy emise. LIBS metoda neposkytuje o zkoumaném materiálu tolik informací jako LA-ICP-MS. Nejsou stanovitelné ani prvky obsaţené ve stopovém mnoţství a nedostupné je izotopové sloţení. LIBS je ovšem metoda rychlá, snadno automatizovatelná, je zde moţnost konstrukce přenosných zařízení a měření na dálku v nepřístupných místech [37, 38].
20
Rastrovací tunelová mikroskopie Vyuţitím této metody můţeme získat zobrazení povrchu pevné látky s atomárním rozlišením. Povrch vzorku musí mít dostatečnou vodivost, aby rastrovací tunelová mikroskopie mohla vyuţít elektronů procházejících potenciálovou bariérou mezi ostrým kovovým hrotem a povrchem vzorku. Je tedy nutné přiblíţit hrot k povrchu vzorku na vzdálenost několika desetin nanometru. Tvarem elektrod, vzdáleností a výškou potenciálové bariéry je dána velikost tunelového proudu mezi dvěma elektrodami [31].
21
3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
3.1 Popis zařízení
3.1.1 LA-ICP-MS K analýze vzorků byl pouţit laserový ablační systém UP 213 (New Wave, USA) emitující laserové záření o vlnové délce 213 nm s délkou laserového pulzu 4,2 ns (Obr. č. 3). Mezi parametry, které lze na tomto laserovém ablačním systému měnit, patří frekvence (1 – 20 Hz), průměr laserového paprsku (4 - 400 µm) a hustota zářivé energie (maximální hodnota kolem 25 J.cm-2).
Obr. č. 3: Laserový ablační systém UP 213 Vzorek se umísťuje do ablační komory SuperCell (New Wave, USA) o objemu 33 cm3. K pohybu vzorku během ablace dochází díky posuvnému systému, na kterém je ablační komora umístěna. Zařízení je také vybaveno CCD kamerou slouţící k monitorování vzorku během ablace. Systém umoţňuje mapování povrchu vzorku prostřednictvím liniového skenu nebo linie bodů. V případě liniového skenu dochází současně k ablaci a posunu vzorku. U linie bodů je nejprve ablatován bod, poté je posunuto se vzorkem a následuje ablace dalšího bodu. Laserový paprsek se v obou případech pohybuje po přesně definované trajektorii. 22
Ablatovaný materiál byl transportován do ICP-MS polyuretanovou hadičkou (firma Lergis) vnitřním průměrem 4 mm a délkou asi 1 m. Jako nosný plyn slouţí helium s průtokem 1 l.min-1. Detekčním systémem je ICP-MS spektrometr Agilent 7500ce (Agilent, Japonsko) s kvadrupólovým analyzátorem a elektronovým násobičem (Obr. č. 4). Hmotnostní spektrometr je vybaven kolizní reakční celou pro minimalizaci interferencí. Jako reakční plyn je pouţíván H2 (průtok 1 ml.min-1) a kolizní plyn He (průtok 2 ml.min-1).
Obr. č. 4: ICP-MS spektrometr Agilent 7500ce
3.1.2 EMPA Chemické sloţení vzorků bylo určeno pomocí elektronové mikrosondy Cameca SX 100 na Ústavu geologických věd Masarykovy univerzity. Nevýhodou EMPA jsou vysoké detekční limity. Metoda je tedy pouţitelná pouze pro prvky přítomné ve vyšším obsahu.
23
3.2 Vzorky Všechny vzorky zubů k analýze byly poskytnuty RNDr. Miriam Nývltovou Fišákovou, Ph.D. z Ústavu archeologie Akademie věd. Bylo analyzováno celkově sedm vzorků zubů s označením „vzorek č. 1 aţ 7“. Vzorky byly pro účely analýzy zality do tablety z epoxidové pryskyřice. Vzorky kořenů zubů pocházejí ze tří českých lokalit (Dolní Věstonice, Pavlov, Boršice) a jedné rakouské (Willendorf). Jedná se o zuby vlka obecného, lišky obecné, lišky polární a soba polárního. Stáří zvířat je odhadováno od 1,5 – 3,5 let. U všech vzorků byla určena sezonalita (doba úmrtí) podle přírůstků v cementu (Tab. č. 1).
vzorek č. 1 2 3 4 5 6 7
druh věk zvířete druh zubu zvířete vlk obecný třetí třenový 2 spodní Willendorf vlk obecný špičák 3,5 liška spodní Willendorf obecná stolička 1,5 Boršice sob polární třetí třenový 3 liška Boršice polární třetí třenový 1,5 Pavlov vlk obecný horní řezák 2,5 Dolní spodní Věstonice vlk obecný špičák 3,5 Tab. č. 1: Seznam vzorků pouţitých k analýze lokalita Willendorf
sezóna úmrtí IV-VI VIII-X VIII-X IV-VI IV-VI VIII-X XI-XII
Spolu se vzorky byly poskytnuty výsledky geochemické analýzy (izotopová analýza uhlíku a dusíku) některých vzorků (Tab. č. 2). Hodnoty δ15N pro býloţravce se pohybují v rozmezí asi 3,3 – 8,4 ‰, masoţravci mají hodnoty δ15N vyšší 8 – 13 ‰. V rozmezí negativních čísel od -30 do -10 se pohybují hodnoty δ13C, které ukazují, jaký typ rostlin byl konzumován [4]. Ve většině případů se jedná o masoţravce podle hodnot δ15N. U vzorku č. 7 je hodnota δ15N niţší a poukazuje spíše na býloţravost. Rozdílné hodnoty δ15N však mohou ukazovat také na prostředí (sucho/voda), ve kterém se zvířata pohybovala. Podle δ13C je však patrná smíšená strava a hodnoty δ15N mohou být ovlivněny prostředím, ve kterém zvířata ţila.
24
vzorek
elementární
δ13C org.
δ15N org.
číslo
analýza
uhlík
dusík
C%
N%
δ13C (‰)
δ15N (‰)
4
5,32
1,52
-19,53
4,57325
5
10,42
3,04
-19,18
10,1355
6
6,58
1,87
-19,725
9,4515
7
13,6
4,01
-21,025
4,977
Tab. č. 2: Výsledky geochemické analýzy jednotlivých vzorků zubů
3.3 Experimentální podmínky LA-ICP-MS Při analýze vzorků zubů byly měřeny následující izotopy 42,43,44
23
Na,
24,26
27
Mg,
Al,
31
P,
39
K,
Ca, 55Mn, 56Fe, 63Cu, 66Zn, 75As, 85Rb, 86,87,88Sr, 107Ag, 135,137Ba, 208Pb, 232Th a 238U.
Z hlediska výţivy a migrace byly vyhodnocovány izotopy 31P, 44Ca, 66Zn, 86Sr a 135Ba. Analýza u všech vzorků byla provedena formou linie bodů (rastr bodů), mezi nimiţ byla konstantní vzdálenost. Průměr kráteru a vzdálenost mezi jednotlivými krátery byla volena s ohledem na velikost vzorku, aby byla zachycena struktura dentinu. Prodleva mezi jednotlivými body byla u všech vzorků 8 s. Pozadí bylo měřeno po dobu 20 s. Frekvence byla zvolena pro všechny vzorky na hodnotu 10 Hz. Hustota zářivé energie byla nastavena na 5 J.cm-2. Za stejných podmínek byl měřen také signál izotopů u standardu NIST 1486 (kostní moučka).
3.4 Vyhodnocení signálu K vyhodnocování dat získaných analýzou vzorků zubů pomocí LA-ICP-MS byl pouţit program Microsoft Excel. Výsledky byly získány jako závislost intenzity jednotlivých izotopů na čase (Obr č. 5). Jak je patrné z obrázku, vyskytuje se zde mnoho maxim, která odpovídají jednotlivým ablatovaným bodům. Jednotlivá maxima byla od sebe oddělena a odečtena průměrná hodnota pozadí. V některých místech, kde se vyskytovala pryskyřice, bylo potřeba 25
dopočítat chybějící počet kráterů, protoţe stanovovaný prvek zde nebyl obsaţen a nebyla tedy naměřena ţádná intenzita. Dále se podle počtu kráterů v ose x a y uspořádají získané hodnoty do jednotlivých sloupců a řádků, tak aby byly přesně v tom pořadí, v jakém byly ablatovány. Z takto uspořádaných hodnot se vytvoří v programu Grams mapy zobrazující distribuci jednotlivých prvků a jejich poměrů ve vzorku.
Intenzita 66Zn (cps)
40000 32000 24000 16000 8000 0 40
140
240
340
Čas (s)
Obr. č. 5: Závislost intenzity signálu izotopu 66Zn na čase
3.5 Kalibrace Obsahy prvků v jednotlivých vzorcích zubů byly stanoveny pomocí SRM NIST 1486. Jedná se o kostní moučku s matriční sloţkou hydroxyapatitu slisovanou pomocí lisu do tablety průměru 1 cm. Deklarované obsahy jednotlivých prvků v NIST 1486 jsou uvedeny v tabulce č. 3. prvek
Obsah (mg·kg-1)
Ba
189
Zn
147
Sr
264
Ca
265800
P
123000
Tab. č. 3: Obsah vybraných prvků v SRM NIST 1486 Na základě přímé úměry mezi intenzitou daného prvku a jeho obsahem ve vzorku, byly vypočítány obsahy vybraných prvků (Sr, Ba, Zn a P) ve vzorku pomocí SRM NIST 1486. 26
Rozdílná ablační rychlost a tím rozdílné mnoţství materiálu uvolněné z povrchu vzorku a tablety bylo minimalizováno přepočtem na obsah vápníku zjištěný pomocí elektronové mikrosondy. V případě vzorků 6 a 7 byl přepočet Ca proveden s průměrnou hodnotou získanou měřením elektronovou mikrosondou přes celý vzorek (linie bodů procházející středem vzorku). Přepočet spočíval v navýšení průměrné hodnoty obsahu vypočtené pomocí LA-ICP-MS na průměrnou hodnotu Ca zjištěnou z elektronové mikrosondy. V případě vzorků 1, 2 a 3 byl přepočet proveden také na průměrnou hodnotu Ca ve vzorku, ale jeho obsah byl měřen pouze na 3 místech, kde se nacházely ablační krátery. U vzorků 4 a 5 byl průměrný obsah Ca získaný pomocí LA-ICP-MS navýšen na hodnotu 39,8 % odpovídající obsahu vápníku podle stechiometrie v hydroxyapatitu. Hodnoty obsahů ostatních prvků vypočtené pomocí kostní moučky byly navýšeny o stejnou hodnotu jako obsah vápníku. Hodnoty obsahů uvedené v tabulkách v kapitolách zaměřených na analýzu vzorků byly vypočteny pouze zprůměrováním hodnot z části dentinu, která podle distribuce 44Ca nebyla ovlivněna diagenezí. Metodu kalibrace, kdy je proveden přepočet na porovnávací prvek po celé ploše vzorku, nebylo moţné pouţít, protoţe distribuce
44
Ca nebyla homogenní a musely být zachovány
rozdíly v jeho obsahu. Vzhledem k tomu, ţe průměrné hodnoty byly brány pouze z části ablatovaného povrchu, je metoda spíše semikvantitativní.
27
4 VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1 Vzorek číslo 1 Při analýze vzorku č. 1 (třenový zub vlka obecného) byl průměr kráteru 100 µm a vzdálenost mezi jednotlivými krátery v osách x a y byla 200 µm. Rastr byl tvořen 36 body ve směru osy x a 16 body ve směru osy y a procházel všemi částmi kořene zubu – cementem, dentinem i kořenovým kanálkem (Obr. č. 6). Stanovený obsah jednotlivých prvků po přepočtu na průměrnou hodnotu vápníku (Ca = 33, 9 %) ve vzorku zjištěnou pomocí elektronové mikrosondy je znázorněn v tabulce č. 4. Obsah (mg·kg-1) prvek
Ca
RSD
Ba
284
13
Sr
1186
15
Zn
95
22
Tab. č. 4 – Obsahy prvků ve vzorku č. 1 po přepočtu na obsah Ca zjištěný pomocí EMPA Ze stanovených obsahů jednotlivých prvků je patrný zvýšený obsah stroncia, coţ naznačuje, ţe by vzorek mohl být ovlivněn diagenezí. Vysoké hodnoty RSD mohou ukazovat na pórovitost vzorku a také mohou být zapříčiněny fluktuací obsahů prvků ve vzorku. Diagenezi potvrzuje i distribuce vápníku, která by měla být homogenní (Obr. č. 7), ale vyšší intenzity 44Ca byly naměřeny převáţně ve spodní části ablatovaného rastru. Na obrázku č. 8, který zobrazuje poměr prvků 135Ba/44Ca ve vzorku č. 1 je patrná struktura dentinu (jemné vrstvy dentinu kopírující cement), která se utváří během ţivota jedince. Je zde také zřejmý úbytek obsahu barya od kořenového kanálku směrem k cementu. Jak je vidět z obrázku č. 9 znázorňující poměr 66Zn/44Ca, nejvyšší intenzita zinku byla naměřena v okolí kořenového kanálku. Vzhledem k diagenetickému ovlivnění Zn v jedné části kalcifikované mohlo dojít i k nárůstu RSD při výpočtu obsahu. Kanálek není chráněný ţádnou další vrstvou a výměna jednotlivých iontů můţe probíhat. Navíc okolí kanálku se můţe vyznačovat niţší tvrdostí neţ zbytek dentinu [38]. 28
Zinek se tedy vyskytuje ve velkém mnoţství v okolí kořenového kanálku, kam byl nejspíše zabudován z vnějšího prostředí. Na obrázku č. 10 je také patrný vyšší obsah stroncia kolem kořenového kanálku oproti ostatním částem zubu.
Obr. č. 6: Fotografie třenového zubu vlka obecného s rastrem ablačních kráterů
Obr. č. 7: Distribuce 44Ca
0,5 mm 0
6000000
29
Obr. č. 8: Poměr 135Ba/44Ca
0
0,03
Obr. č. 9: poměr prvků 66Zn/44Ca
0
0,04
Obr. č. 10: poměr prvků 86Sr/44Ca
0
0,05 30
4.2 Vzorek číslo 2 U vzorku č. 2 (špičák vlka obecného) byla velikost jednotlivých kráterů 40 µm a vzdálenost mezi nimi byla 50 µm v obou osách. Rastr obsahoval 55 bodů ve směru osy x a 22 bodů ve směru osy y a zasahoval jak do cementu zubu, tak i do dentinu a kořenového kanálku, jak je patrné z obrázků č. 11 a 12. Obsah (mg·kg-1) prvek
Ca
RSD
Ba
465
10
Sr
1744
8
Zn
48
6
Tab. č. 5: Obsahy prvků ve vzorku č. 2 po přepočtu na obsah Ca zjištěný pomocí EMPA Přepočtem na průměrný obsah vápníku ve vzorku (Ca = 32,5 %) z výsledků elektronové mikrosondy byly stanoveny obsahy jednotlivých prvků (Tab. č. 5). Ze stanovených obsahů je opět patrný vliv diageneze. Hodnoty obsahu stroncia bývají běţně do 1000 mg·kg-1 [7]. Ve srovnání s předchozím vzorkem došlo k navýšení i obsahu barya. Naopak niţší obsah byl zjištěn u zinku, coţ můţe ukazovat na jeho vymývání. Obsah Sr je také vyšší i přes to, ţe původ vzorků je stejný. Zde by bylo moţné uvaţovat o migraci nebo větším diagenetickém ovlivnění v závislosti na stavu vzorku. Na obrázcích č. 14 – 16 jsou zachyceny vrstvy dentinu, které kopírují cement zubu. Také je z nich patrné sniţování obsahů jednotlivých prvků od kořenového kanálku směrem k cementu.
. Obr. č. 11: Fotografie vzorku špičáku vlka obecného s rastrem ablačních kráterů 31
Obr. č. 12: Detail ablačního rastru Obr. č. 13: Distribuce 44Ca
0,5 mm 0
1150000
Obr. č. 14: Poměr prvků 135Ba/44Ca
0
0,04
32
Obr. č. 15: Poměr prvků 66Zn/44Ca
0
0,001
Obr. č. 16: Poměr prvků 86Sr/44Ca
0
0,08
33
4.3 Vzorek číslo 3 Při analýze vzorku č. 3 (stolička lišky obecné) měly jednotlivé krátery průměr 100 µm a byly vzdáleny v obou osách 200 µm. Rastr byl veden od horního okraje vzorku směrem ke kořenovému kanálku. Zasahoval tedy do cementu i dentinu vzorku, jak je patrné z obrázku č. 17. Počet bodů rastru v ose x byl 41 a v ose y 10 (Obr. č. 18). V tabulce č. 6 jsou uvedeny vypočítané obsahy prvků ve vzorku po přepočítání na průměrný obsah vápníku ve vzorku (Ca = 32,7 %) zjištěný z elektronové mikrosondy. Obsah (mg·kg-1) prvek
Ca*
RSD
Ba
496
5
Sr
1215
5
Zn
110
27
Tab. č. 6: Obsahy prvků ve vzorku č. 3 po přepočtu na obsah Ca zjištěný pomocí EMPA Z obsahu stroncia ve vzorku je opět patrný vliv diageneze analyzovaného vzorku. Porovnáním s předchozími vzorky ze stejné lokality, je v případě Sr patrná podobnost obsahů. Z 2D mapy 66Zn/44Ca (Obr. č. 21) je patrná nejvyšší intenzita v okolí kořenového kanálku a směrem k cementu zubu výrazně klesá a opět je ovlivněna i průměrná hodnota obsahu prvku a jeho vysoká relativní směrodatná odchylka. Koncentrické přírůstky nejsou patrné na ţádném obrázku, coţ můţe být dáno diagenezí nebo neměnnou stravou a migrací (Obr. č. 20 – 22). Obsah barya a zinku je vyšší oproti prvním dvěma vzorkům ze stejné lokality. Zinek se ale mohl dostat do vzorku z vnějšího prostředí, coţ naznačuje jeho výskyt hlavně v okolí nechráněného kořenového kanálku.
34
Obr. č. 17: Fotografie stoličky lišky obecné s rastrem ablačních kráterů
Obr. č. 18: Detail ablačního rastru Obr. č. 19: Distribuce 44Ca
0,5 mm 0
10500000
35
Obr. č. 20: Poměr prvků 135Ba/44Ca
0
0,03
Obr. č. 21: poměr prvků 66Zn/44Ca
0
0,002
Obr. č. 22: Poměr prvků 86Sr/44Ca
0
0,05
36
4.4
Vzorek číslo 4
Při analýze vzorku č. 4 (třenový zub soba polárního) byla velikost jednotlivých kráterů 40 µm a vzdálenost mezi nimi v jednotlivých osách x a y byla 50 µm. V ose x obsahoval rastr 26 bodů a v ose y bodů 48. Část rastru zasahovala do kořenového kanálku, zbytek procházel hlavně dentinem, ale procházel i cementem vzorku (Obr. č. 23, 24). Stanovené obsahy pro jednotlivé prvky jsou zapsány v tabulce č. 7 a přepočet byl proveden na obsah Ca 39,8 % zjištěný ze stechiometrie hydroxyapatitu.
prvek
Obsah (mg·kg-1)
RSD
Ba
604
14
Sr
1774
13
Zn
103
19
Tab. č. 7: Obsahy jednotlivých prvků ve vzorku po přepočítání na hodnotu Ca zjištěnou ze stechiometrie hydroxyapatitu I tento vzorek byl nejspíše ovlivněn diagenezí, jak naznačuje vysoký obsah stroncia ve vzorku. Hodnoty RSD jsou poměrně vysoké, coţ by mohla způsobit pórovitost vzorku nebo různá fluktuace prvku v dentinu. Obsah jednotlivých prvků klesá od kořenového kanálku směrem k cementu zubu. Na jednotlivých obrázcích č. 26 – 28 se dají určit moţné koncentrické kruhy. Koncentrace barya a hlavně zinku v okolí kořenového kanálku je vysoká, coţ potvrzuje ovlivnění diagenezí. Hodnota obsahu barya je vyšší neţ v případě vzorků č. 1 – 3, zatímco obsah zinku je srovnatelný se vzorky č. 1 a 3. Vzorek č. 4 pochází z lokality Boršice a jeho obsah Sr se můţe také lišit podle geografického umístění. Je zde patrná podobnost mezi obsahy Sr se vzorkem č. 2, který se svým obsahem vyčleňuje z lokality Willendorf.
37
Obr. č. 23: Fotografie třenového zubu soba polárního s ablačním rastrem
Obr. č. 24: Detail rastru kráterů
38
Obr. č. 25: Distribuce 44Ca
0,5 mm 0
Obr. č. 26: Poměr 135Ba/44Ca
0 750000
0,1
Obr. č. 27: Poměr 66Zn/44Ca
0
Obr. č. 28: Poměr 86Sr/44Ca
0,002
0
0,1
40
4.5 Vzorek číslo 5 Na vzorku č. 5 (třenový zub lišky polární) měly jednotlivé krátery průměr 40 µm a byly od sebe ve vzdálenosti 50 µm. Rastr procházel dentinem těsně pod kořenovým kanálkem od středu vzorku směrem k cementu (Obr. č 29) a obsahoval ve směru osy x 85 bodů a ve směru osy y bodů 7. V tabulce č. 8 jsou uvedeny obsahy jednotlivých prvků ve vzorku zjištěné přepočtem na stechiometrický obsah vápníku (39,8 %) v hydroxyapatitu.
prvek
Obsah (mg·kg-1)
RSD
Ba
557
3
Sr
1943
4
Zn
70
4
Tab. č. 8: Obsahy jednotlivých prvků ve vzorku po přepočítání na hodnotu Ca zjištěnou ze stechiometrie hydroxyapatitu Vysoký obsah stroncia ve vzorku ukazuje na ovlivnění diagenezí, při kterém mohlo dojít k vytěsnění zinku ze zubu, čemuţ by napovídala jeho nízká hodnota. Na obrázcích 32 – 34 jsou viditelné vrstvy dentinu kopírující cement. V případě zinku a stroncia (Obr. č. 33 – 34) nejsou v celém dentinu, ale zasahují asi jen do poloviny. Hodnoty obsahu Sr jsou si velmi blízké s hodnotami Sr ve vzorku č. 4, tyto vzorky pochází ze stejné lokality (Boršice).
Obr. č. 29: Fotografie třenového zubu lišky polární s rastrem kráterů 41
Obr. č. 30: Detail rastru kráterů Obr. č. 31: Distribuce 44Ca
0,5 mm 0
1500000
Obr. č. 32: Poměr 135Ba/44Ca
0
0,075
Obr. č. 33: Poměr 66Zn/44Ca
0
0,002
Obr. č. 34: Poměr 86Sr/44Ca
0
0,1
42
4.6 Vzorek číslo 6 Vzdálenost v osách x a y kráterů o průměru 40 μm byla při analýze vzorku č. 6 (horní řezák vlka obecného) 50 μm. Velikost rastru byla 22 x 30 bodů. Rastr procházel přes cement zubu směrem ke kořenovému kanálku zubu (obr. č. 35).
Obr. č. 35: Fotografie řezáku vlka obecného s rastrem kráterů Obr. č. 36: Distribuce 44Ca
0,5 mm 0
650000 43
Obr. č. 37: Poměr 135Ba/44Ca
0 0,04 Obr. č. 38: poměr 66Zn/44Ca
0
0,002
Obr. č. 39: poměr 86Sr/44Ca
0 0,1 Z nehomogenní distribuce vápníku ve vzorku (obr. č. 36) se dá usuzovat na ovlivnění diagenezí. Rozloţení barya a částečně zinku od kořenového kanálku směrem k cementu (obr. č. 37 – 39). Koncentrické kruhy jsou pouze částečně patrné na jednotlivých mapách, coţ by mohlo být způsobeno neměnnou stravou během ţivota daného jedince a minimální migrací. Průměrný obsah vápníku ve vzorku zjištěný pomocí elektronové mikrosondy byl 38,99 %. Na tuto hodnotu byly přepočítány obsahy Ba, Sr a Zn ve vzorku (tabulka č. 9).
prvek
Obsah (mg·kg-1)
RSD
Ba
607
11
Sr
2298
11
Zn
103
11
Tab. č. 9: Obsahy prvků ve vzorku č. 6 po přepočtu na obsah Ca zjištěný pomocí EMPA V porovnání s ostatními vzorky se tato lokalita (Pavlov) vyznačuje vysokým obsahem stroncia. Aby bylo moţné hodnoty povaţovat za správné, byla provedena podrobná analýza pomocí elektronové mikrosondy.
45
Elektronová mikrosonda: Vzorek byl analyzován po celé délce a část se překrývala s oblačním rastrem. Analýza byla rozdělena do dvou částí odpovídající distribuci v levé a v pravé části vzorku. Průměrné obsahy prvků zjištěné z poloviny vzorku jsou uvedeny v tabulce č. 10 a průměrné obsahy prvků z druhé poloviny jsou uvedeny v tabulce č. 11. Vysoké hodnoty RSD jsou způsobeny velkou fluktuací jednotlivých prvků a také poškozením vzorku.
Obr. č. 40: Část liniového skenu řezáku vlka obecného z elektronové mikrosondy prvek
obsah (mg·kg-1) RSD
P
13,4*
6
Ca
40,1*
5
O
37,7*
3
Fe
7299
43
Mg
7634
13
Na
4142
15
Zn
493
59
Mn
1262
64
Al
683
57
Cl
1021
23
F
8867
20
C
29963
19
Sr
1774
55
*Hodnoty obsahů uvedené v %. Tab. č. 10: Obsahy prvků z poloviny vzorku zjištěné elektronovou mikrosondou 46
prvek
Obsah (mg·kg-1) RSD
P
12,4*
8
Ca
37,8*
8
O
37,5*
3
Fe
5317
40
Mg
7795
9
Na
3690
24
Zn
496
59
Mn
1657
63
Al
797
30
Cl
1049
28
F
8772
19
C
38125
22
Sr
1737
64
S
1664
18
*Hodnoty obsahů uvedené v %. Tab. č. 11: Obsahy prvků z poloviny vzorku zjištěné elektronovou mikrosondou Hodnota obsahu stroncia ve vzorku je velmi vysoká (1700 mg.kg-1), coţ ukazuje na ovlivnění vzorku diagenezí, čímţ by mohly být ovlivněny i obsahy ostatních prvků ve vzorku. Neshoduje se s obsahem zjištěným pomocí LA-ICP-MS, ale rozdíl je způsoben velkou fluktuací jeho obsahu, coţ ukazuje i vysoká hodnota RSD. Jaká je fluktuace Sr je znázorněno na obr. č. 41. Pro srovnání je uvedena i distribuce fluoru ve vzorku (Obr. č. 41), jehoţ obsah nabývá průměrné hodnoty 8800 mg.kg-1.
0.45
1.6 Sr
0.4
1.4 F
1.2
0.3
1
0.25 0.8 0.2
0.6
0.15
0.1
0.4
0.05
0.2
0
Obsah F (%)
Obsah Sr (%)
0.35
0 0
500
1000
1500
Pozice (μm)
Obr. č. 41: Obsahy stroncia a fluoru ve vzorku zubu Z obr. č. 42 je patrná i záměna uhličitanové skupiny za fosforečnanovou a to především v cementu zubu. V této části dosahuje obsah uhlíku aţ 16 %. V dentinu se jeho obsah sniţuje a zvyšuje se podíl PO43-, coţ potvrzuje přítomnost karbonizovaného hydroxyapatitu.
18
14 P
16
C
12 10
12 10
8
8
6
6
Obsah C (%)
Obsah P (%)
14
4
4 2
2 0
0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Pozice (μm)
Obr. č. 42: Obsahy vápníku a fosforu ve vzorku zubu
48
4.7 Vzorek číslo 7 Rastr vzorku č. 7 (špičák vlka obecného) byl tvořen krátery o průměru 100 µm ve vzdálenosti 200 µm a procházel přes střed vzorku kořenovým kanálkem. Zasahoval tedy do všech částí zubu – do cementu, dentinu i kořenového kanálku (Obr. č. 43). V ose x se skládá rastr z 57 bodů a v ose y z 12 bodů.
Obr. č. 43: Fotografie spodního špičáku vlka obecného s rastrem ablačních kráterů Obr. č. 44: Distribuce 44Ca
0,5 mm 0
15000000
Obr. č. 45: Poměr 135Ba/44Ca
0
0,02 49
Obr. č. 46: poměr 66Zn/44Ca
0
0,004
Obr. 47: Poměr 86Sr/44Ca
0
0,06
Nehomogenní distribuce vápníku ve vzorku (Obr. č. 44) by mohla ukazovat na ovlivnění diagenezí, coţ potvrzuje i klesající obsah jednotlivých prvků ve vzorku od kořenového kanálku směrem k cementu vzorku (Obr. č. 45 – 47). Na mapách znázorňujících poměr 135
Ba/44Ca a
86
Sr/44Ca (Obr. č. 45 a 47) by mohly být patrné koncentrické kruhy, skladba
potravy proto mohla být neměnná a vlk nejspíš minimálně migroval. Průměrný obsah vápníku zjištěný pomocí elektronové mikrosondy je ve vzorku zubu vlka obecného 38,87 %. Na tuto hodnotu byly přepočítány obsahy Ba, Sr a Zn ve vzorku (Tab. č. 12). prvek
Obsah (mg·kg-1)
RSD
Ba
468
28
Sr
2168
7
Zn
135
22
Tab. č. 12: Obsahy prvků ve vzorku č. 7 po přepočtu na obsah Ca zjištěný pomocí EMPA Hodnoty obsahů jednotlivých prvků jsou srovnatelné s hodnotami ve vzorku č. 6 (řezák vlka obecného), coţ by mohlo být způsobeno blízkostí nalezišť obou vzorků (Pavlov a Dolní Věstonice). V této lokalitě je tudíţ také vysoký obsah stroncia, proto byla i v tomto případě provedena podrobná analýza pomocí elektronové mikrosondy.
50
Elektronová mikrosonda: Analýza vzorku č. 7 byla provedena na celém vzorku a byla rozdělena do dvou částí, které odpovídaly distribuci v levé a v pravé části vzorku. Průměrné hodnoty obsahů jednotlivých prvků naměřené v kaţdé polovině vzorku zubu jsou znázorněny v tabulkách č. 13 a 14. Vysoké hodnoty RSD mohou být způsobeny poškozením vzorku a velkou fluktuací obsahů jednotlivých prvků ve vzorku.
Obr. č. 48: Část liniového skenu špičáku vlka obecného z elektronové mikrosondy prvek
Obsah (mg·kg-1)
RSD
P
13,3*
6
Ca
38,8*
6
O
37,3*
3
Fe
2574
44
Mg
6852
14
Na
3659
29
Zn
220
131
Mn
543
93
Al
642
51
Cl
785
48
F
6438
43
C
36928
11
Sr
3606
63
S
2094
21
*Hodnoty obsahů uvedené v %. Tab. č. 13: Obsahy prvků z poloviny vzorku zjištěné elektronovou mikrosondou 51
prvek
Obsah (mg·kg-1)
RSD
P
12,9*
10
Ca
38,9*
6
O
36,5*
4
Fe
3078
36
Mg
6212
16
Na
3745
43
Zn
390
119
Mn
1131
89
Al
760
69
Cl
908
95
F
5258
54
C
38059
19
Sr
5051
68
S
2098
34
*Hodnoty obsahů uvedené v %. Tab. č. 14: Obsahy prvků z poloviny vzorku zjištěné elektronovou mikrosondou Vzorek byl nejspíše ovlivněn diagenezí, coţ dokazuje vysoká hodnota obsahu stroncia ve vzorku ( 4000 mg.kg-1), z toho vyplývá, ţe i ostatní prvky ve vzorku mohly být ovlivněny diagenezí. Výrazně se liší od hodnoty naměřené pomocí LA-ICP-MS, ale jak ukazuje vysoká hodnota RSD, můţe to být způsobeno fluktuací jeho obsahu ve vzorku (Obr. č. 49). Pro srovnání je uvedena i distribuce F ve vzorku (Obr. č. 49). Obsah fluoru ve vzorku nabývá hodnot kolem 5500 mg.kg-1.
52
1,6
1,6
Sr
1,4
1,4
F
1,2
1
Obsah F (%)
Obsah Sr (%)
1,2
1
0,8
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0 0
2000
4000
6000
8000
0 10000
Pozice (µm)
Obr. č. 49: Obsahy Sr a F ve špičáku vlka obecného Z obrázku č. 50 je patrná substituce fosforečnanových skupin za uhličitanové v dentinu vzorku. 18
6
16
Obsah P (%)
12
4
10
3
8 6
2
P
4
C
1
2 0 0
2000
4000
6000
8000
Obsah C (%)
5
14
0 10000
Pozice (µm)
Obr. č. 50: Obsahy C a P ve špičáku vlka obecného
53
5 ZÁVĚR Z naměřených intenzit jednotlivých prvků v dentinu zubu byly přepočtem na stechiometrický obsah vápníku v hydroxyapatitu (39,8 %) stanoveny obsahy Sr, Ba a Zn v jednotlivých vzorcích. Vzhledem k vysokým hodnotám obsahu Sr ve vzorcích byly tyto hodnoty v případě vzorků č. 1, 2, 3, 6 a 7 přepočítány na obsah vápníku ve vzorku zjištěný pomocí elektronové mikrosondy. Analýza elektronovou mikrosondou tyto vysoké hodnoty stroncia potvrdila. Hodnoty stroncia ve vzorcích pocházejících ze stejných nalezišť (Willendorf, Boršice) nebo nalezišť hodně blízkých (Dolní Věstonice a Pavlov) byly srovnatelné (Tab. č. 15). Výjimku tvoří vzorek č. 2, který má v porovnání s ostatními vzorky ze stejné lokality vyšší obsah stroncia. S takto vysokým obsahem stroncia by spíše zapadal do lokality Boršice. To můţe znamenat, ţe tento vlk byl do Willendorfu přiveden lidmi nebo mohl migrovat.
vzorek č. 1 2 3 4 5 6 7
naleziště zvíře druh zubu Willendorf vlk obecný třenový zub Willendorf vlk obecný špičák Willendorf liška obecná stolička Boršice sob polární třenový zub Boršice liška polární třenový zub Pavlov vlk obecný řezák Dolní Věstonice vlk obecný špičák Tab. č. 15: Popis vzorků zubů a zjištěný obsah Sr
obsah Sr (mg.kg-1) 1186 1744 1215 1774 1943 2298 2168
U jednotlivých vzorků zubů lze z uvedených 2D map, vysokého obsahu stroncia ve vzorku a moţného vytěsnění ostatních prvků ze vzorku usuzovat na ovlivnění diagenezí, proto nelze z naměřených hodnot stanovit, zda dané zvíře bylo spíše masoţravé nebo býloţravé. Metoda LA-ICP-MS se jeví jako vhodná pro mapování distribuce jednotlivých prvků ve vzorcích zubů a k vykreslení jemné struktury dentinu.
54
6 LITERATURA [1]
J.S. Becker: Inorganic Mass Spektrometry: Principles and Applications, John Wiley and Sons, Chichester, 2007
[2]
L. Páč: Anatomie člověka II – Splanchnologie, kardiovaskulární systém, ţlázy s vnitřní sekrecí, MU, Brno 2007
[3]
I. Dylevský, R. Druga, O. Mrázková: Funkční anatomie člověka, Grada Publishing, Praha, 2000
[4]
L. Kovaříková, J. Brůţek: Stabilní izotopy a bioarcheologie – výţiva a sledování migrací v populacích minulosti, Ţiva 1 (2008) 42 - 45
[5]
D. Kang, D. Amarasiriwardena, A. H. Goodman: Application of laser ablationinductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) to investigate trace metal spatial distributions in human tooth enamel and dentine growth layers and pulp, Anal Bioanal Chem 378 (2004) 1608 – 1615
[6]
http://liborlouda.ic.cz/P%F8edn%E1%9Aky/Chemick%E9%20slozeni%20zubu %20I pdf (12. 5. 2011)
[7]
V. Smrčka, Trace elements in the bone tissue, The Karolinum press, Czech Republic, 2005
[8]
J. Labs-Hochstein, B.J. MacFadden: Quantification of diagenesis in Cenozoic sharks: Elemental and mineralogical changes, Geochimica 70 (2006) 4921 - 4932
[9]
M.J. Kohn, M.J. Schoeninger, W.W. Barker: Altered states: Effects of diagenesi on fossil tooth chemistry, Geochim Cosmochim 63 (1999) 2737 – 2747
[10]
V. Michel, P. Ildefonse, G. Morin: Chemical and structural changes in Cervus elaphus tooth enamels during fossilization (Lazaret cave): a combined IR and XRD Rietveld analysis, Appl Geochem 10 (1995) 145 – 159
[11]
P. Budd, J. Montgomery, B. Barreiro, R. G. Thomas: Differential diagenesis of strontium in archaeological human dental tissues, Appl Geochem 15 (2000) 687 – 694
55
[12]
T. Tutken, T. W. Vennemann, H. U. Pfretschner: Early diagenesis of bone and tooth apatite in fluvial and marine settings: Constraints from combined oxygen isotope, nitrogen and REE analysis, Palaeogr Palaeocl 266 (2008) 254 – 268
[13]
J. Reichholf: Savci, Kniţní klub ve spolupráci s Ikarem, Praha, 1996
[14]
http://web.quick.cz/mkorinek/savci/zvirata/sob_polarni.html (23. 5. 2011)
[15]
http://www.vesmir.cz/clanek/dolni-vestonice-a-pavlov (21. 3. 2011)
[16]
http://www.eva.mpg.de/evolution/files/willendorf.htm (8. 4. 2011)
[17]
google maps
[18]
http://www.geology.cz/zpravy/obsah/2005/zpravy-o-vyzkumech-2005-str-08284.pdf (15. 5. 2011)
[19]
V. Otruba: Spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem, MU, Brno, 2001
[20]
Y. Liu, Z. Hu, S. Gao, D. Gunther, J. Xu, Ch. Gao, H. Chen: In situ analysis of major and trace element sof anhydrous minerals by LA-ICP-MS without applying an internal standard, Chem Geol 257 (2008) 34 – 43
[21]
J. Dobrowolska, M. Dehnhardt, A. Matusch, M. Zoriy, N. Palomero-Gallagher, P. Koscielniak, K. Zilles, J.S. Becker: Quantitative imaging of zinc, copper and lead in three distinct regions of the human brain by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry, Talanta 74 (2008) 717 – 723
[22]
J. H. Burton, T. D. Price: The ratio of barium to strontium as a paleodietary indicator of consumption of marine resources, J Archaeol Sci 17 (1990) 547 – 557
[23]
W. Bei, M. Zoriy, Ch. Yingxu, J.S. Becker: Imaging of nutrient elements in the leaves of Elsholtzia splendens by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS), Talanta 78 (2009), 132 – 137
[24]
M. Holá: 5. kurz ICP spektrometrie, Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, Brno, 2009
[25]
R.E. Russo, X. Mao, H. Liu, J. Gonzales, S.S. Mao: Laser ablation in analytical chemistry – a review, Talanta 57 (2002) 425 – 451
[26]
V. Kanický: 5. kurz ICP spektrometrie, Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, Brno, 1995
[27]
V. Otruba: 5. kurz ICP spektrometrie, Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, Brno, 2009
[28]
J. Vřešťál: Hmotnostní spektrometrie, MU, Brno, 2000
[29]
P. Klouda: Moderní analytické metody, Pavel Klouda, Ostrava, 2003
56
[30]
J. Machát: 5. kurz ICP spektrometrie, Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, Brno, 2009
[31]
L. Frank, J. Král: Metody analýzy povrchů – iontové, sondové a speciální metody, Academia, Praha, 2002
[32]
B. Jalevik, H. Odelius, W. Dietz, J.G. Noren: Secondary ion mass spectrometry and X-ray microanalysis of hypomineralized enamel in human permanent first molars, Elsevier Science 46 (2001) 239 - 247
[33]
T. Černohorský, P. Jandera: Atomová spektroskopie, Pardubice, 1997
[34]
K. Shimada, I. Sato, H. Moriyama: Morphology of the tooth of the american alligator (Alligator – Mississippiensis) – the fine – structure and elemental analysis of the cementum, Wiley – Liss 3 (1992) 319 – 329
[35]
K.A. Schulze, M. Balooch, G. Balooch, G.W. Marshall, S.J. Marshall: MicroRaman spectroscopic investigation of dental calcified tissues, Wiley InterScience
[36]
T.R. Rautray, S. Das, A.C. Rautray: In situ analysis of human teeth by external PIXE, Elsevier Science 14 (2010) 2371 – 2374
[37]
T. Vaculovič, K. Novotný: 5. kurz ICP spektrometrie, Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, Brno, 2009
[38]
M. Galiová, J. Kaiser, F.J. Fortes, K. Novotný, R. Malina, L. Prokeš, A. Hrdlička, T. Vaculovič, M. Nývltová Fišáková, J. Svoboda, V. Kanický, J.J. Laserna: Multielemental analysis of prehistoric animal teeth by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, Applied Optics 49 (2010) 191-199.
57
