MASARYKOVA UNIVERZITA. Antibiotická rezistence a distribuce genů rezistence

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Antibiotická rezistence a distribuce genů rezistence u izolátů Escherichia coli a koliformních bakterií z potravního řetězce člověka

(Diplomová práce magisterského studijního programu Biologie oboru Obecná biologie – směr Mikrobiologie)

Monika Dolejská Brno 2006

OBSAH

1. Úvod………………………………………………………………………... 4 1.1 Escherichia coli………………………………………………………………………… 5 1.1.1 Charakteristika a význam…….……….………………………………………………. 5 1.1.2 Patogenita…………………………………………………………………………… 5 1.1.3 Shiga toxin produkující E. coli……………………………………………………... 6 1.1.3.1 Faktory virulence……………………………………………………………….. 6 1.1.3.2 Hemolyticko-uremický syndrom……………………………………………….. 7 1.1.3.3 Zdroj nákazy……………………………………………………………………. 7 1.1.3.4 Epidemiologie……...…………………………………………………………… 8 1.1.3.5 Diagnostika a léčba……………………………………………………………... 8 1.2 Antimikrobiální látky u potravinových zvířat………..…………………………….. 9

1.2.1 Antimikrobiální látky jako prevence a kontrola infekce……………………………. 9 1.2.2 Antimikrobiální látky jako růstové stimulátory……...……………………………. 10 1.2.2.1 Historie a současnost. Povolené a zakázané růstové stimulátory……………… 10 1.2.3 Antimikrobiální látky ve veterinární medicíně v ČR…………………………….... 11 1.3 Rezistence bakterií k antimikrobiálním látkám…………..………….……………….12 1.3.1

1.3.2

Výskyt antibiotické rezistence u izolátů E. coli…………………………………... 12 Mechanizmy a genetické determinanty rezistence E. coli a koliformních bakterií

k vybraným antimikrobiálním látkám……………………………………………. 13 1.3.2.1 Rezistence k β-laktamovým antibiotikům……………………………………... 14 1.3.2.2 Rezistence k aminoglykosidům………………………………………………... 16 1.3.2.3 Rezistence k sulfonamidům a trimetoprimu…………………………………… 17 1.3.2.4 Rezistence k tetracyklinům……………………………………………………. 19 1.3.2.5 Rezistence k chloramfenikolu…………………………………………………. 20

1.3.3

Integrony…………………………………………………………………………... 21

1.4 Metody průkazu antibiotické rezistence……………………………………………..22 1.4.1 Fenotypové metody……………………………………………………………….. 23 1.4.1.1 Speciální metody pro detekci rezistence k β-laktamovým antibiotikům……… 23 1.4.2 Genotypové metody……………………………………………………………….. 24

2.

Cíl práce…....…………………….……………………………………….26

1

3.

Materiál a metody………………………………………………….……..27

3.1 Použité mikroorganizmy……………………………………………………………… 27

3.2 Chemikálie……………………………………………………………………………... 28

3.3 Kultivační média a roztoky…………………………………………………………… 29 3.4 Identifikační soupravy a antiséra……………………………………………………. 30 3.5 Antibiotické disky……………………………………….………………….…………. 30

3.6 Přístroje……………………………….………………………………………………. 30 3.7 Pomůcky…………………………………………….…………………………………. 31

3.8 Metody…………………………………….…………………………………………… 31

3.8.1 Uchovávání bakteriálních kultur………………………………………………….… 31 3.8.2 Očkování bakteriálních kultur ze zamražení……………………………………...…31 3.8.3 Průkaz rezistence bakteriálních izolátů diskovou difuzní metodou…………………32 3.8.4 Identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S…………………….. .35 3.8.5 Typizace O-antigenů E. coli……………………………………………………….. .36 3.8.5.2 Typizace antigenu O157 u E. coli latexovou aglutinací………………………. .36 3.8.5.2 Typizace O-antigenů E. coli typově specifickými O-antiséry………………….37 3.8.6 Průkaz širokospektré β-laktamázy…………………………………………………..38 3.8.6.1 Vyhledávací („screeningový“) test……………………………………………. .38 3.8.6.2 „Double-disk synergy test“……………………………………………………. .39 3.8.7 Průkaz inducibilní β-laktamázy……………………………………………………. .40 3.8.8 Izolace bakteriální DNA rezistentních izolátů…………………………………….. .41 3.8.9 Polymerázová řetězová reakce se specifickými primery…………………………....41 3.8.9.1 Příprava PCR reakční směsi…………………………………………………... .41 3.8.9.2 Provedení PCR………………………………………………………………... .44 3.8.10 Detekce PCR produktu agarózovou gelovou elektroforézou………………….…….44

4. Výsledky…………………………………….……………………………...46 4.1 Vyhodnocení antibiotické rezistence 4 skupin izolátů ………………………………46 4.2 Výběr rezistentních izolátů pro další testování……………………………………....48 4.3 Identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S……………………...49

4.4 Typizace O-antigenů E. coli humánního původu……………………………………. 49 4.4.1 4.4.2

Typizace antigenu O157 latexovou aglutinací……………………………………… 49 Typizace O-antigenů E. coli typově specifickými O-antiséry……………………… 50

4.5.1 4.5.2

Vyhledávací („screeningový“) test………………………………………………… 51 Výsledky „double-disk synergy testu“…………………………………………….. 51

4.5 Průkaz širokospektré β-laktamázy…………………………………………………... 50

4.6 Průkaz inducibilní β-laktamázy……………………………………………………... 53

2

4.7 Průkaz genů antibiotické rezistence metodou PCR………………………………... 55

4.7.1 4.7.2 4.7.3 4.7.4 4.7.5 4.7.6 4.7.7

Průkaz genů rezistence k β-laktamovým antibiotikům…………………………… 55 Průkaz genů rezistence k tetracyklinu…………………………………….………. 57 Průkaz genů rezistence ke streptomycinu…………………………………………. 59 Průkaz genů rezistence k sulfonamidům………………………………………….. 61 Průkaz genů rezistence k chloramfenikolu………………………………………... 63 Průkaz genu int1 a integronu třídy 1……………..……………………………..…. 65 Průkaz genových kazet integronu…………………………………………………. 65

4.8 Průkaz genů antibiotické rezistence a integronu u multirezistentních izolátů

E. coli O157:H7 izolovaných v Jordánsku…………………………………………. 68

5. Diskuze……………………………………………………………………. 69 5.1 Antibiotická rezistence vyšetřovaných izolátů a její vztak ke spotřebě antimikrobiálních látek v ČR………………………...……………………………… 69

5.2 Vyhodnocení antibiotické rezistence jednotlivých skupin izolátů a její srovnání s jinými studiemi……………………………………………………………………… 71

5.3 Průkaz determinant antibiotické rezistence………………………….…………….. 72 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6 5.3.7 5.3.8

Průkaz širokospektré β-laktamázy………………………………………………… 72 Průkaz inducibilní β-laktamázy…………………………………………………… 73 Výskyt genů rezistence k β-laktamovým antibiotikům…………………………… 74 Výskyt genů rezistence k tetracyklinu…………………………………………….. 75 Výskyt genů rezistence ke streptomycinu………………………………………… 76 Výskyt genů rezistence k sulfonamidům………………………………………….. 76 Výskyt genů rezistence k chloramfenikolu……………………………………….. 77 Průkaz genu int1, genových kazet a integronu…………………………………... 78

5.4 Multirezistentní izoláty E. coli O157:H7 z Jordánska…………………………….. 80

6. Závěr………………………………...……………………………………. 81 7. Literatura………………………………………………………………… 83 Přílohy………………………………………………………………………...94

3

1. ÚVOD Antibiotika, přirozené látky produkované převážně mikroorganizmy potlačující růst

jiných organizmů, se v určité formě užívaly již ve starém Egyptě, ale jejich skutečný rozvoj nastal až s Flemingovým objevem penicilinu v roce 1929. V souvislosti s jejich používáním

se dokonce uvažovalo o vymizení bakteriálních onemocnění jako zdravotnického problému. Tomu odpovídalo i jejich použití, téměř neomezované a určitě nadbytečné. V roce 1940 byl popsán první enzym schopný destrukce penicilinu u izolátu Escherichia coli. Tento objev byl

prvním svědectvím o existenci bakteriální rezistence k účinku antibiotika. V následujících

desetiletích problematika antibiotické rezistence nabyla celosvětového významu a přístup k antibiotikům musel být přehodnocen. Byly vypracovány zásady racionální antimikrobiální

terapie, omezeno profylaktické užívání antibiotik a používání těchto látek jako růstových stimulátorů. Přesto je v současné době celosvětově pozorován zvyšující se výskyt

rezistentních bakterií k antimikrobiálním přípravkům, který následně představuje vážný problém při terapii infekčních onemocnění i v epidemiologické praxi.

Kromě racionální aplikace antimikrobiálních látek je možné problém stále rostoucí

antibiotické rezistence řešit především sledováním výskytu a rozšíření rezistentních bakterií v různých ekologických nikách, studiem mechanizmů rezistence a rovněž genetických determinant podmiňujících tuto rezistenci včetně možnosti jejich přenosu na dosud citlivé

bakterie. Nejprve se hlavní zájem soustředil na patogenní mikroorganizmy. V současnosti se

výzkum zaměřuje především na studium přenosu a šíření genů antibiotické rezistence mezi nepatogenními bakteriemi běžné střevní flóry zvířat a člověka hlavně prostřednictvím přímého kontaktu nebo nepřímo potravou a

vylučovanými

odpadními

produkty

kontaminujícími prostředí, s nimiž se člověk i zvířata dostávají do styku. Právě střevní trakt je

považován za jeden z nejdůležitějších rezervoárů rezistentních bakterií a genetických

determinant rezistence. Prevalence a hladina antibiotické rezistence u indikátorových bakterií ve střevním traktu člověka i zvířat, jakou je i Escherichia coli a jiné koliformní bakterie,

mohou sloužit jako vhodné ukazatele selekčního tlaku vzniklého v důsledku používání antimikrobiálních látek.

4

1.1

Escherichia coli

1.1.1 Charakteristika a význam Escherichia coli je fakultativně anaerobní gramnegativní nesporulující tyčka náležící

do čeledi Enterobacteriaceae. Je běžnou součástí střevní flóry zdravých lidí i zvířat. E. coli je komenzálem, saprofytem a také symbiontem, neboť svým působením znemožňuje průnik patogenů produkcí kolicinů, které jsou pro některé jiné bakterie toxické. Zároveň je

pro makroorganizmus prospěšná i přímo – podílí se na tvorbě některých vitaminů, především

vitaminu K (Tancrede, 1992; Votava a kol., 2003). Komenzální E. coli jsou indikátory fekálního znečištění vody a potravin (Bednář a kol., 1999).

1.1.2 Patogenita E. coli patří mezi podmíněně patogenní mikroorganizmy. Ve střevě se patogenní

účinek uplatňuje jen tehdy, když je tato bakterie vybavena specifickými faktory virulence. Mimo střevo je E. coli téměř vždy patogenní. E. coli patogenní pro člověka zahrnují kromě

dalších čtyři hlavní skupiny (Bednář a kol., 1999; Lhotová, 2001; Votava a kol., 2003):


Enteropatogenní E. coli (EPEC) jsou spojovány s onemocněním novorozenců

získané především v nemocničním prostředí. Nejběžnější jsou antigenní typy O55,

O126 a O86.







Enteroinvazivní E. coli (EIEC) disponují faktory invazivity a vyvolávají onemocnění

připomínající bacilární dyzenterii.

Enterotoxigenní E. coli (ETEC) vyvolávají průjmy v oblasti tropů a subtropů

s nízkým hygienickým standardem. Onemocnění vyvolaná tímto typem se označují jako tzv. cestovatelské průjmy.




Shiga toxin produkující E. coli (STEC, také VTEC, EHEC) způsobují

nejzávažnější

onemocnění. Vyvolávají

hemoragickou

kolitidu a

hemolyticko-

-uremický syndrom (HUS). Nejčastější jsou antigenní typy O157 a mezi EPEC dříve řazený antigenní typ O26 (Kaper a O´Brien, 1998).

5

1.1.3 Shiga toxin produkující E. coli Dříve byly tyto vysoce patogenní typy E. coli označovány jako verotoxigenní

(VTEC) (Votava a kol., 2003). Název verotoxigenní pochází z jejich schopnosti produkovat jeden nebo oba ze dvou exotoxinů (verotoxiny VT1 a VT2), které vyvolávají cytopatický

efekt na buňkách Vero (Konowalchuk a kol., 1977). Dnes je však propagován název Shiga toxin produkující E. coli (STEC), neboť struktura toxinu je velmi podobná Shiga toxinu

Shigella dysenteriae (Kaper a O´Brien, 1998). Pojem enterohemoragické E. coli (EHEC)

souvisí s jejich schopností vyvolávat hemoragický zánět střeva v důsledku produkce hemolyzinu (Votava a kol., 2003).

Shiga toxin produkující E. coli byly poprvé identifikovány jako lidské patogeny

schopné vyvolávat onemocnění potravinového původu v roce 1982; onemocnění bylo

způsobeno konzumací nedostatečně tepelně upraveného hovězího masa (Kaper a O´Brien,

1998). Infekce potravinového původu vyvolané STEC O157 jsou závažným zdravotnickým problémem v Severní Americe a Velké Británii (Griffin a Tauxe, 1991). Naproti tomu infekce

tohoto typu se ve střední Evropě vyskytují velmi řídce, kde první případ HUS vyvolaného STEC byl poprvé zaznamenán až v roce 1988 v Německu (Stewart a kol., 1997).

1.1.3.1 Faktory virulence Hlavním faktorem virulence STEC je produkce Shiga toxinů, které zahrnují dva

toxiny – Stx1 a Stx2. Toxin Stx1 je vysoce homologický (99 %) s Shiga toxinem, který

produkuje Shigella dysenteriae typu 1. Naproti tomu Stx2 se od Shiga toxinu Shigella

dysenteriae typu 1 výrazně liší. Geny pro

produkci obou toxinů

jsou lokalizovány

na chromozomu (Leung a kol., 2003; Mainil, 1999). Patogenní účinek Shiga toxinů spočívá v jejich schopnosti spojovat se specifickým receptorem glykolipidové povahy (Gb3), který se nachází na povrchu endotelových buněk krevních kapilár, endotelových buněk ledvin

a červených krvinek. Toxin následně inhibuje proteosyntézu, což má za následek buněčnou smrt (Lingwood a kol., 1987).

V genomu STEC se nachází také specifický chromozomální gen eae. Tento

gen je lokalizován uvnitř tzv. patogenního ostrůvku LEE („locus of enterocyte effacement“). Gen eae řídí činnost intiminu, což je bílkovina s funkcí adhezinu a napomáhá tak připojení patogenních STEC a EPEC k buňkám střevního epitelu (Mainil, 1999). 6

Geny kódující další faktory virulence jsou lokalizovány na plazmidech; jedná se

o geny pro produkci enterohemolyzinu (gen ehx), bifunkční katalázy-peroxidázy (gen katP),

serin proteázy (geny espP a pssA) a gen etp podílející se na řízení sekrečního systému typu 2 (Mainil, 1999).

1.1.3.2 Hemolyticko-uremický syndrom Hemolyticko-uremický syndrom (HUS) byl poprvé popsán ve Švýcarsku v roce

1955 (Gasser a kol., 1955); jedná se o závažné onemocnění, při kterém dochází k akutnímu

renálnímu selhání, ke vzniku trombocytopénie a mikroangiopatické hemolytické anémie

(Lhotová a Sevčíková, 2000). Bylo prokázáno, že HUS může být vyvolán různými faktory jako například léky, chemikáliemi a toxiny některých mikroorganizmů (S. dysenteriae typu 1, Salmonella typhi, Campylobacter jejuni, STEC) (Kaper a O´Brien, 1998). HUS jako následek

infekce STEC je častou příčinou akutního selhání ledvin u dětí nejmladší věkové kategorie (do 5 let), ale setkáváme se s ním i u dětí starších, kde může vyústit v chronické postižení

ledvin. Tento fakt je dán vyšší vnímavostí dětí k Shiga toxinu, neboť buňky ledvin mají vysoký obsah receptoru pro Shiga toxin (Lhotová a Sevčíková, 2000).

1.1.3.3 Zdroj nákazy Shiga toxin produkující E. coli vstupují do potravinového řetězce člověka

nejrůznějšími způsoby. Nejčastějším zdrojem nákazy je nedostatečně tepelně upravené hovězí maso, ale také nepasterizované mléko, jogurt, brambory, čerstvý jablečný džus a jiné

potraviny. Byla prokázána možnost přenosu z člověka na člověka a rovněž infekce kontaminovanou vodou (Kaper a O´Brien, 1998). Ve srovnání s infekcemi vyvolanými

salmonelami, kde je nutná infekční dávka 105 až 108 bakterií (Votava a kol., 2003), je riziko

infekce STEC podobně jako u shigelózy vysoké i v důsledku velmi nízké infekční dávky, která je menší než 100 bakterií (Kaper a O´Brien, 1998).

Střevní trakt přežvýkavců je považován za hlavní rezervoár STEC patogenních

pro člověka. Ke kontaminaci potravin dochází nejčastěji během porážky dobytka, kdy střevní

bakterie mohou kontaminovat maso, které je následně určené ke konzumaci člověkem. Pokud

7

při kuchyňské úpravě takto kontaminované potravy není dodržen dostatečný čas a teplota, může se stát zdrojem nákazy konzumenta (Borczyk a kol., 1987).

1.1.3.4 Epidemiologie Shiga toxin produkující E. coli jsou vážným problémem Severní Ameriky, Japonska,

jižní Afriky, Austrálie a některých oblastí v Evropě (především Německa a skandinávských

zemí) (Kaper a O´Brien, 1998). Z epidemiologického hlediska je zajímavá skutečnost, že konzumace nedostatečně tepelně upravených hamburgerů a jiných hovězích produktů je

hlavním zdrojem nákazy STEC především v Severní Americe a Velké Británii. Navíc v těchto

zemích je naprostá většina infekcí vyvolána sérotypem O157:H7 (Griffin a Tauxe, 1991). V Evropě jsou zdrojem nákazy výhradně mléčné výrobky a kontaminované prostředí

a sérotyp O157:H7 reprezentuje pouze malé procento STEC izolovaných ze střevního traktu dobytka. Naopak infekce vyvolané sérotypy O26, O103, O111, O113 a O128 jsou zde mnohem častější (Kaper a O´Brien, 1998). 1.1.3.5 Diagnostika a léčba Mezi důležité vlastnosti STEC O157, které se využívají při diagnostice, patří jejich

neschopnost fermentovat sorbitol a produkovat

β-D-glukuronidázu. K záchytu STEC se

využívá MacConkeyho agar, ve kterém je laktóza nahrazena sorbitolem (Votava a kol., 2003). Tato metoda záchytu však může selhat, neboť byly v Evropě izolovány i sérotypy O157:H7, které sorbitol fermentují (Bitzan a kol., 1991; Gunzer a kol., 1992).

Problémem zůstává záchyt jiných sérotypů, kde se vlastnost neokyselování sorbitolu

nedá využít. V diagnostice se používá sérotypizace pomocí sklíčkové či latexové aglutinace. K podrobnějšímu studiu se využívá molekulárně-biologických metod – DNA sondy, PCR

se specifickými primery, stanovení plazmidového profilu; dále je možné použít metody imunologické – detekci monoklonálních protilátek a ELISA testy (Kaper a O´Brien, 1998).

U nejmladších dětí, kde je průběh onemocnění prudký, se perorálně podávají

aminoglykosidy. Role antibiotik při léčbě onemocnění vyvolané STEC není jasná. In vitro

bylo prokázáno, že po aplikaci antibiotik je produkce toxinu zvýšená. Při léčbě se proto

8

pozornost zaměřuje především na rehydrataci organizmu (Cimolai a kol., 1990; Walterspiel a kol., 1992).

1.2 Antimikrobiální látky u potravinových zvířat Na rozdíl od humánní medicíny jsou antibiotika u potravinových zvířat používána

ze dvou různých důvodů – k prevenci a kontrole bakteriálních infekcí a dále jako růstové stimulátory (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Aplikace antibiotik u potravinových zvířat se

v posledních letech stala předmětem mnoha diskuzí. Obavy ze stále rostoucí rezistence bakteriálních patogenů k antibiotikům běžně užívaným k terapeutickým účelům v humánní

medicíně a možnost přenosu rezistentních bakterií z potravinových produktů ke člověku vedly

k celosvětové změně v oblasti užití antibiotik v chovech potravinových zvířat (Aerestrup a Wegner, 1999; Englen a kol., 2005; McEwen a Fedorka-Cray, 2002).

Důležitým aspektem, který je specifický pro veterinární medicínu je problém

zbytkového množství antibiotika. Evropská legislativa stanovuje tzv. maximální hladiny

reziduí (MRL - „maximum residue level“), což je maximální přijatelné množství antibiotika

v živočišném produktu určenému ke konzumaci člověkem, které nemá vliv na lidské zdraví (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001).

1.2.1 Antimikrobiální látky jako prevence a kontrola infekce Počátky antibiotické terapie u zvířat se datují do 40. letech minulého století, kdy se

penicilinové preparáty začaly používat ve formě intramamárních infuzí k léčbě mastitid

u skotu (Prescott a kol., 2000). Obecně mohou být antimikrobiální látky u potravinových zvířat používány k terapeutickým, metafylaktickým a profylaktickým účelům. Účelem

terapie je léčit zjevnou infekci. Naproti tomu metafylaxí se rozumí podávání antibiotika velké

skupině zvířat nejčastěji prostřednictvím pitné vody nebo krmiva. Infekce je v tomto případě

prokázána pouze u omezeného počtu zvířat, ale antibiotika jsou podávána všem zvířatům

v chovu z důvodu zabránění přenosu infekce na zdravé jedince (Schwarz a kol., 2001). Profylaktická aplikace antibiotik znamená podávání antimikrobiální látky určitým jedincům

popřípadě skupině zvířat za zvláštních okolností (při chirurgickém zákroku, vakcinaci) nebo v určitém stádiu jejich života, ve kterém jsou náchylnější k různým infekcím (při odstavování

9

selat, na konci laktace u skotu určeného k produkci mléka – léčba mastitid v zaprahlosti) (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001).

1.2.2 Antimikrobiální látky jako růstové stimulátory Jako růstové stimulátory mohou být použity pouze zákonem schválené látky. Přesné

podmínky jejich použití zahrnující cílovou skupinu zvířat, dobu užití a dávkování jsou jasně

definovány zákonem. Hlavní podmínkou je, aby žádný z povolených antimikrobiálních růstových stimulátorů nezpůsoboval zkříženou rezistenci s molekulami antibiotik podávanými

v humánním lékařství (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Přesný mechanizmus účinku

růstových stimulátorů není znám, ale pravděpodobně se na něm podílí nárůst vitaminové

produkce intestinálních mikroorganizmů, eliminace subpopulací patogenních bakterií a nárůst střevní absorpce živin (Butaye a kol., 2003).

1.2.2.1 Historie a současnost. Povolené a zakázané růstové stimulátory Antibiotika jako přípravky podporující růst zdravého dobytka a drůbeže jsou

používány již 60 let (Prescott a kol., 2000). Prvními popsanými antibiotiky s tímto účinkem byly streptomycin a chlortetracyklin (Moore a kol., 1946; Stokstad a kol., 1949).

První diskuze ohledně užití antibiotických růstových stimulátorů z důvodů

zaznamenání nárůstu antibiotické rezistence bakteriálních patogenů začaly v 60. letech.

Od roku 1975 je v Evropě zakázána aplikace β-laktamových antibiotik a tetracyklinů jako stimulátorů růstu (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). V letech 1998 až 1999 bylo v Evropě k těmto účelům rovněž zakázáno použití glykopeptidu avoparcinu, u kterého byla prokázána zkřížená rezistence s vankomycinem používaným v humánní medicíně, dále tylosinu, spiramicinu, virginiamycinu a Zn-bacitracinu (Teale, 2002). Mezi růstové stimulátory, jejichž

použití bylo do konce minulého roku v zemích EU povoleno, patřily flavofosfolipid,

monensin, salinomycin a avilamycin (Butaye a kol., 2003; Prescott a kol., 2000). Nové nařízení Rady EU 1831/2003 zakazuje v zemích EU od 1. 1. 2006 použití antibiotických růstových stimulátorů u potravinových zvířat.

10

1.2.3 Antimikrobiální látky ve veterinární medicíně v ČR Použití antibiotik ve veterinární medicíně v České republice upravuje Vyhláška

325/2003 Sb., která je v souladu se směrnicemi Evropského parlamentu a Rady. Stanovuje pravidla pro použití veterinárních přípravků při poskytování veterinární péče a nařizuje veterinárním lékařům i chovatelům vést záznamy o použití léčivých přípravků.

Na základě informací zpracovaných Ústavem pro státní kontrolu veterinárních

biopreparátů a léčiv v Brně (Hera a kol., 2005) jsou v České republice tetracykliny nejčastěji aplikovanými antibiotiky při terapii zvířat. Další významný podíl z celkové spotřeby antimikrobiálních látek tvoří β-laktamová a diterpenová antibiotika a dále sulfonamidy včetně sulfonamidů

potencovaných.

Souborný

přehled

spotřeby

jednotlivých

antimikrobiálních látek v České republice za rok 2004 uvádí Tabulka 1.

skupin

Tabulka 1: Spotřeba antimikrobiálních látek ve veterinární medicíně v ČR v roce 2004

antimikrobiální látka tetracyklinová antibiotika

spotřeba antimikrobiální látky (v kg)a 31039

% spotřeby antimikrobiální látky z celku 41,9

β-laktamová antibiotika

20634

27,9

sulfonamidy

5267

7,1

makrolidová antibiotika

1853

2,5

chinolony

1145

1,5

74024

100

diterpenová antibiotika

potencované sulfonamidy aminoglykosidy

ostatní (amfenikoly, linkosamidy, polypeptidová a jiná antibiotika) Celkem a

8542

3377

1463 704

zaokrouhleno na celá čísla

11

11,5 4,6 2

1

1.3 Rezistence bakterií k antimikrobiálním látkám Zavedení antibiotik k léčbě bakteriálních infekcí v humánní a veterinární medicíně

bylo brzy následováno popsáním bakterií rezistentních k příslušné antimikrobiální substanci.

Relativně krátké časové rozpětí mezi zavedením antibiotika a popsáním prvních rezistentních bakterií k dané látce je důkazem rychlé a efektivní schopnosti bakterií přizpůsobit se

změněným podmínkám vnějšího prostředí v důsledku nadměrného užívání antibiotik (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Kromě selekce rezistentních bakterií v přítomnosti

antibiotika hraje nezanedbatelnou roli v rychlém šíření antibiotické rezistence i horizontální přenos genů podmiňujících rezistenci k dané substanci mezi bakteriemi stejného i různého

druhu nebo rodu. Tyto geny antibiotické rezistence jsou obvykle součástí mobilních genetických elementů – plazmidů, transpozonů a integronů, které umožňují jejich efektivní šíření (Carattoli, 2001).

Antibiotická rezistence se stala jedním z hlavních problémů v terapii člověka.

Snížení spotřeby antibiotik v humánní a veterinární medicíně, omezení aplikace růstových

stimulátorů u potravinových zvířat a zavádění nových antimikrobiálních látek schopných

odolat nejrůznějším mechanizmům bakteriální rezistence jsou jedny z možností řešení tohoto problému (Livermore, 2005; Teale, 2002).

1.3.1

Výskyt antibiotické rezistence u izolátů E. coli V posledních letech je zaznamenán vysoký nárůst rezistence bakteriálních

komensálů i patogenů člověka a zvířat (White a kol., 2002). Frekvence výskytu rezistentních izolátů se v jednotlivých zemích liší. Výskyt rezistentních bakterií souvisí s použitím

antimikrobiálních látek u člověka nebo zvířete, ze kterého byl rezistentní izolát získán, neboť

bylo prokázáno, že aplikace určitého antibiotika vede k selekci bakterií rezistentních k této antimikrobiální látce (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Bylo prokázáno, že antibiotická

rezistence izolátů E. coli získaných z prasat a drůbeže je mnohem vyšší než rezistence izolátů

ze skotu a souvisí s nadměrnou aplikací antibiotik v chovech prasat a drůbeže (Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Sáenz a kol., 2001). Podle mnoha studií jsou sulfonamidy,

streptomycin, tetracyklin a ampicilin antimikrobiální látky, ke kterým je vysoké procento patogenních i nepatogenních izolátů E. coli získaných ze zvířat, potravin a člověka rezistentní

(Aerestrup a kol., 1999; Gassama a kol., 2004; Guerra a kol., 2003; Kijima-Tanaka a kol., 12

2003; Lanz a kol., 2003; Meng a kol., 1998; Mora a kol., 2005; Nijsten a kol., 1996; Schroeder a kol., 2002; Zhao a kol., 2001).

Vysoký výskyt rezistentních nepatogenních bakterií je dokumentován u mléčného

a masného skotu. DeFrancesco a kol. (2004) prokázali rezistenci k tetracyklinu u 33 %, k sulfonamidům u 20 %, ampicilinu a streptomycinu u 16 %

izolátů E. coli získaných

z dojnic. Obdobné výsledky publikovali i Lanz a kol. (2003), podle kterých je rezistence k ampicilinu, streptomycinu, sulfonamidům a tetracyklinu nejčastější a vyskytuje se u 20 – – 22 % izolátů E. coli pocházejících ze skotu.

Sáenz a kol. (2001) zaznamenali vysoký výskyt nepatogenních izolátů E. coli

rezistentních k ampicilinu, kyselině nalidixové a tetracyklinu získaných z potravin (přibližně

u 50 % izolátů). U nepatogenních izolátů E. coli z vepřového masa byla zaznamenána i

poměrně vysoká rezistence k sulfonamidům (Hammerum a kol., 2006).

Patogenní bakterie E. coli O157 byla dlouho považována za citlivou k mnoha

antimikrobiálním látkám. Na počátku 80. let se rezistence vyskytovala pouze u 1 – 3 % izolátů těchto bakterií (Bopp a kol., 1987; Ratman a kol., 1988), ale od konce 80. let je dokumentován nárůst antibiotické rezistence (Kim a kol., 1994). Současné studie dokazují

vysokou prevalenci rezistence a výskyt multirezistence u E. coli O157 izolovaných ze zvířat, potravin i lidí (Mora a kol., 2005; Sáenz a kol., 2001; Schroeder a kol., 2002; You a kol., 2006; Zhao a kol., 2001), které jsou způsobené častou aplikací antibiotik u potravinových

zvířat, především skotu (Tollefson a kol. 1999), který je hlavním rezervoárem E. coli O157

(Kaper a O´Brien, 1998). Antibiotická rezistence se vyskytuje u 7 – 70 % izolátů E. coli O157

získaných ze skotu (Wilkerson a kol., 2004; You a kol., 2006).

U izolátů STEC O157 byl oproti jiným sérotypům STEC prokázán nižší výskyt

antibiotické rezistence (Mora a kol., 2005; Zhao a kol., 2001). Zajímavým je rovněž nižší

výskyt rezistence u izolátů STEC ve srovnání s patogenními E. coli bez produkce Shiga

toxinu (Bettelheim a kol., 2003; Schroeder a kol., 2002).

1.3.2 Mechanizmy a genetické determinanty rezistence E. coli a koliformních bakterií k vybraným antimikrobiálním látkám

Rezistence E. coli a koliformních bakterií může být způsobena nejrůznějšími

mechanizmy, které přehledně shrnuje Tabulka 2. 13

Tabulka 2: Mechanizmy rezistence E. coli a koliformních bakterií k vybraným

antimikrobiálním látkám

rezistence k antimikrobiální látce β-laktamová antibiotika

tetracykliny sulfonamidy trimetoprim

aminoglykosidy

chloramfenikol a

mechanizmus rezistencea nadprodukce PBP snížená propustnost antibiotika (nízká exprese porinu OmpF) „multidrug transportéry“ produkce β-laktamáz „eflux proteiny” „multidrug transportéry“ snížená propustnost antibiotika mutace genů kódujících DPHS produkce DPHS s nízkou afinitou nadprodukce DHFR produkce DHFR s nízkou afinitou snížená vazba antibiotika na podjednotku 30 S ribozomu snížený průnik antibiotika bakteriální stěnou snížená permeabilita cytoplazmatické membrány „eflux proteiny” AcrD produkce enzymů modifikujících aminoglykosidy enzymatická inaktivace acetyltransferázami „eflux proteiny“

PBP = proteiny vázající penicilin, DPHS = dihydrofolátsyntetáza, DHFR = dihydrofolátreduktáza

1.3.2.1 Rezistence k β-laktamovým antibiotikům β-laktamová antibiotika patří mezi nejpoužívanější antimikrobiální látky. Obsahují

β-laktamový kruh, čtyřčlennou strukturu skládající se ze tří atomů uhlíku a jednoho atomu

dusíku. Mají schopnost usmrtit mikroorganizmy blokováním syntézy buněčné stěny vazbou na transpeptidázy a karboxypeptidázy, které se účastní tvorby peptidoglykanu (Walsh, 2003).

Rezistence E. coli a koliformních bakterií k β-laktamovým antibiotikům může být

způsobena následujícími mechanizmy:

14

1. nadprodukcí proteinů vázajících penicilin (PBP) (Ferrari a Turnidge, 2003)

2. sníženou propustností antibiotika v důsledku nedostatečné exprese porinu OmpF (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001)

3. aktivním vypuzováním antibiotika prostřednictvím „multidrug transportérů“ (Putman a kol., 2000)

4. produkcí β-laktamáz – nejčastější mechanizmus rezistence gramnegativních bakterií (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001)

Rezistence zprostředkovaná β-laktamázami β-laktamázy jsou skupina enzymů s určitými podobnostmi ve struktuře. Jejich

účinek spočívá v interakci s β-laktamovým antibiotikem a jeho následné hydrolýze (Ferrari a Turnidge, 2003). První β-laktamáza TEM-1 byla popsána v roce 1965 u izolátu E. coli, brzy po zahájení užívání penicilinu v klinické praxi (Datta a Kontomichalou, 1965). V současné

době rozlišujeme více než 340 typů různých β-laktamáz produkovaných gramnegativními a grampozitivními bakteriemi (Finch a kol., 2003).

Geny kódující β-laktamázy se nachází na chromozomu bakterií nebo na přenosných

genetických elementech (Mascaretti, 2003). β-laktamázy mohou být produkovány konstitutivně či induktivně. Při konstitutivní produkci vytváří bakterie tyto enzymy nezávisle na přítomnosti či nepřítomnosti antibiotika uvnitř nebo vně buňky. Inducibilní β-laktamázy

AmpC jsou produkovány pouze v případě, že se v okolí nebo uvnitř bakteriální buňky nachází β-laktamové antibiotikum. Produkce inducibilních β-laktamáz je častým mechanizmem

rezistence k cefalosporinům vyšších generací u rodů Enterobacter, Citrobacter, Serratia

a Proteus (Livermore, 1995; Qin a kol., 2004). β-laktamázy typu TEM

Nejrozšířenějšími β-laktamázami E. coli rezistentních

k ampicilinu jsou β-

-laktamázy typu TEM (Guerra a kol., 2003; Sáenz a kol., 2004). Jeho nejfrekventovanější

varianta TEM-1 je kódována genem blaTEM-1 lokalizovaným na transpozonu Tn3 (Briñas

a kol., 2002). Umístění genu blaTEM-1 na mobilních genetických elementech umožňuje jeho snadné šíření mezi bakteriemi (Bradford, 2001; Briñas a kol., 2002; Livermore, 1995). 15

Širokospektré β-laktamázy Širokospektré β-laktamázy jsou schopné rozkládat cefalosporiny 3. generace,

aztreonam a další β-laktamová antibiotika (kromě karbapenemů) s různou intenzitou, která

závisí na typu produkovaného enzymu. Zkráceně se označují ESBL („extended-spectrum

betalactamase“) a v současné době je jim věnována velká pozornost, neboť komplikují léčbu

bakteriálních infekcí. Rozlišujeme více než 150 druhů ESBL, což není číslo rozhodně konečné, neboť selekční tlak a nadměrné užívání nových β-laktamových antibiotik má za následek vznik nových variant (Bradford, 2001). 1.3.2.2 Rezistence k aminoglykosidům Aminoglykosidy jsou baktericidní antibiotika inhibující syntézu proteinů na úrovni

bakteriálních ribozomů. Chemicky se jedná o cyklický aminoalkohol spojený glykosidickou vazbou se dvěma aminocukry (Ferrari a Turnidge, 2003).

Rezistence E. coli a koliformních bakterií k aminoglykosidům může být způsobena

následujícími mechanizmy (Kolář a kol., 2002; Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001):

1. změnou ribozomové bílkoviny, kterou se snižuje vazba aminoglykosidu na 30S podjednotku ribozomu

2. sníženým průnikem antibiotika bakteriální stěnou nebo sníženou permeabilitou metabolicky aktivní cytoplazmatické membrány

3. „eflux proteiny“ AcrD popsanými u E. coli (Rosenberg a kol., 2000) 4. produkcí enzymů modifikujících aminoglykosidy

Enzymy modifukující aminoglykosidy Produkce enzymů modifikujících aminoglykosidy je nejdůležitějším mechanizmem

rezistence gramnegativních bakterií k těmto antibiotikům. Geny kódující tyto enzymy mohou být mezi bakteriemi přenášeny transpozony a plazmidy (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001) a mohou tvořit součást

integronů (Recchia a Hall, 1995). Enzymy modifikující

aminoglykosidy se dělí do tří skupin podle typu reakce, kterou katalyzují, na fosfotransferázy (APH), adenyltrasferázy (ANT) a acetyltransferázy (AAC) (Mascaretti, 2003).

16

Acetyltransferázy acylují aminoskupiny antibiotika pomocí kofaktoru acetyl-CoA

jako donoru acetátové skupiny a jsou kódovány geny aac lokalizovanými na plazmidech,

transpozonech nebo uvnitř integronu. V současnosti rozlišujeme přinejmenším 16 různých variant acetyltransferáz, které se liší spektrem účinku (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001).

Fosfotransferázy využívají ATP jako donor fosfátové skupiny, fosforylují

hydroxylové skupiny aminoglykosidů a jsou kódovány geny aph; dosud bylo popsáno 11

odlišných variant tohoto genu (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001). Fosfotransferázy kódované geny aph(3”)-Ib (rovněž s označením strA) a aph(6)-Id (strB) jsou frekventovanými enzymy

u E. coli rezistentních ke streptomycinu. Geny strA a strB tvoří genový pár (strA-strB), jsou

součástí malých plazmidů skupiny RSF1010 a vyskytují se nezávisle na integronu (Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Madsen a kol., 2000; Sørum a Sunde, 2001).

Adenyltransferázy adenylují hydroxylovou skupinu aminoglykosidů, využívají

ATP jako donor adenylové skupiny a jsou kódovány geny ant (Schwarz a Chaslus-Dancla,

2001). Rozšířenou genovou kazetou integronu odpovědnou za rezistenci ke streptomycinu a spektinomycinu je kazeta ant(3”)-I (rovněž s označením aadA) (Guerra a kol., 2003). 1.3.2.3 Rezistence k sulfonamidům a trimetoprimu Sulfonamidy a trimetoprim blokují různé enzymatické kroky syntézy kyseliny

tetrahydrolistové.

Sulfonamidy

jsou

strukturní

analogy kyseliny p-aminobenzoové

a způsobují kompetitivní inhibici dihydrofolátsyntetázy (DPHS), zatímco trimetoprim

inhibuje dihydrofolátreduktázu (DHFR). Sulfonamidy byly do klinické praxe zavedeny v roce 1932 (Schwarz a kol., 2001). Tyto levné antimikrobiální látky byly široce užívány v humánní

i veterinární medicíně, což v posledních desetiletích vedlo k rapidnímu nárůstu rezistence mezi nejrůznějšími druhy bakterií. Použití sulfonamidů

je dnes omezeno a jsou často

používány v kombinaci, převážně s trimetoprimem (Infante a kol., 2005).

Rezistence E. coli a koliformních bakterií k sulfonamidům může být způsobena

strukturními změnami enzymů DPHS v důsledku mutace genu dphs (folP) lokalizovaného

na chromozomu nebo produkcí DPHS rezistentních k sulfonamidům, které jsou kódovány geny sul lokalizovanými na plazmidech (Mascaretti, 2003).

Rezistence E. coli a koliformních bakterií k trimetoprimu je podmíněna produkcí

DHFR kódovaných geny, které se nachází na plazmidech. Doprovodným mechanizmem 17

rezistence je rovněž nadprodukce běžně se v buňce vyskytujících chromozomálně kódovaných DHFR v důsledku změny v oblasti promotoru (Mascaretti, 2003). Rezistence podmíněná přítomností genů sul Geny sul, determinanty rezistence k sulfonamidům, byly popsány v 60. letech

minulého století jako geny kódující enzymy DPHS se sníženou afinitou k sulfonamidům

(Nakaya a kol., 1960). Rozlišujeme 3 typy těchto genů; nejfrekventovanějšími jsou geny sul1 a sul2 a nově popsaný gen sul3 se vyskytuje pouze ojediněle (Grape a kol., 2003; Infante

a kol., 2005; Perreten a Berlin, 2003). Hlavním důvodem šíření determinant rezistence k těmto antimikrobiálním látkám je jejich přitomnost na R plazmidech. Intenzivní užívání

sulfonamidů po jejich uvedení do veterinární a humánní medicíny pravděpodobně stimulovalo rozvoj R plazmidů obsahujících tyto geny rezistence (Rådström a kol., 1991).

Gen sul1 je lokalizován v 3’-konzervativní oblasti integronů třídy 1, které jsou

součástí velkých konjugativních plazmidů a transpozonů skupiny Tn21. S šířením integronů třídy 1 v bakteriální populaci se tedy automaticky šíří i gen sul1 (Infante a kol., 2005).

Gen sul2 byl popsán u gramnegativních bakterií z velmi odlišných ekologických nik

(Enne a kol., 2001; Guerra a kol., 2003; Hochhut a kol., 2001). Nachází se na malém

konjugativním plazmidu pGC05 a nekonjugativních plazmidech pBP1 a RSF1010. Právě poslední dva zmíněné plazmidy pBP1 a RSF1010 nesou také geny odpovědné za rezistenci

ke streptomycinu. Z tohoto důvodu bývá rezistence k těmto dvěma typům antimikrobiálních látek úzce spjata (Huovinen a kol., 1995; Rådström a kol., 1991).

Gen sul3 byl poprvé popsán u E. coli izolovaných na farmách s chovem prasat

ve Švýcarsku v roce 2003 (Perreten a Berlin, 2003).

Rezistence zprostředkovaná plazmidovými geny dhfr Nejčastější příčinou rezistence E. coli a koliformních bakterií k trimetoprimu je

produkce DHFR kódovaných plazmidovými geny dhfr se sníženou afinitu k trimetoprimu.

Bylo popsáno přes 20 různých variant genů dhfr (Mascaretti, 2003), přičemž u izolátů E. coli

se v nejvyšší frekvenci vyskytuje gen dhfr1, a to ve formě genové kazety integronu (Sáenz

a kol., 2004; Skurnik a kol., 2005).

18

1.3.2.4

Rezistence k tetracyklinům Tetracykliny

jsou širokospektrá antibiotika s bakteriostatickým účinkem, která

inhibují proteosyntézu bakteriální buňky tím, že brání vazbě aminoacyl-tRNA na ribozom. Jsou to relativně levná a bezpečná antibiotika se širokým spektrem účinku. Díky svým

výhodným vlastnostem byly tetracykliny široce využívané po celém světě k profylaxi a terapii

bakteriálních infekcí v humánní i veterinární medicíně a dále jako růstové stimulátory zvířat. V posledních dvaceti letech se z důvodu nárůstu rezistentních bakterií použití těchto antibiotik

výrazně omezilo (Roberts, 1996). I přesto patří tetracykliny mezi nejčastěji používaná antibiotika (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001).

Rezistence E. coli a koliformních bakterií k těmto antibiotikům může být způsobena

přítomností „eflux proteinů“, sníženou propustností antibiotika nebo „multidrug transportéry“ (Roberts, 1996).

„Eflux proteiny“ „Eflux

proteiny“

odpovědné

za

rezistenci

k tetracyklinům

se

nachází

v cytoplazmatické membráně a vylučují tetracykliny do vnějšího prostředí buňky, čímž je

snižována intracelulární koncentrace antibiotika a chráněny ribozomy. Exprese genů tet pro „eflux proteiny“ probíhá induktivně v přítomnosti tetracyklinu. Geny tet jsou

lokalizovány na konjugativních plazmidech nebo jiných přenosných genetických elementech, což je vysvětlením jejich širokého rozšíření mezi bakteriemi. „Eflux proteiny“

gramnegativních bakterií zahrnují TetA, TetB, TetC, TetD, TetE, TetG, TetH a TetI (Roberts, 1996). U izolátů E. coli se je rezistence k tetracyklinu způsobena především přítomností

proteinů TetA a TetB (Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Sáenz a kol., 2004; Wilkerson a kol., 2004).

Snížená propustnost cytoplazmatické membrány a „multidrug transportéry“ Rezistence k tetracyklinu jako důsledek snížené propustnosti antibiotika byla

popsána u E. coli a je způsobena nízkou produkcí porinu OmpF, který přenáší tetracykliny

skrze cytoplazmatickou membránu do buňky. Dalším příkladem je mutace v oblasti operonu mar, který se podílí na expresi genů pro porin OmpF (Schwarz and Chaslus-Dancla, 2001). 19

„Multidrug transportéry“ podmiňují rezistenci různých gramnegativních bakterií

k tetracyklinům i k řadě strukturně vzdálených sloučenin (například k β-laktamovým antibiotikům). U E. coli byl popsán transportér EmrE (Putman a kol., 2000).

1.3.2.5 Rezistence k chloramfenikolu Chloramfenikol je širokospektré antibiotikum inhibující proteosyntézu vazbou

na podjednotku 50S bakteriálního ribozomu, jejíž aplikace kvůli vedlejším hematotoxickým účinkům v posledních letech upadá (Ferrari a Turnidge, 2003). Použití chloramfenikolu u potravinových zvířat bylo v roce 1994 v Evropě zakázáno (Arcangioli a kol., 1999).

Rezistence E. coli a koliformních bakterií k chloramfenikolu může být způsobena

enzymatickou inaktivací antibiotika účinkem acetyltransferáz nebo aktivním vypuzováním antibiotika prostřednictvím „eflux proteinů“ (Ferrari a Turnidge, 2003; Mascaretti, 2003). Enzymatická inaktivace chloramfenikolu Nejběžnějším mechanizmem rezistence k chloramfenikolu u gramnegativních

i grampozitivních bakterií je produkce enzymů acetylfransferáz (Cat), které jsou kódovány

geny cat lokalizovanými na plazmidech (Arcangioli a kol., 1999; Schwarz a kol., 2001).

Acetyltransferázy využívají acetyl-CoA jako donor acetylové skupiny a jsou schopné acetylovat hydroxylové skupiny vázané na uhlíku molekuly chloramfenikolu v pozici 1 a 3.

Acetylovaný derivát chloramfenikolu není schopný se navázat na 50S podjednotku ribozomu a inhibovat tak syntézu bakteriálních proteinů (Ferrari a Turnidge, 2003; Mascaretti, 2003). „Eflux proteiny“ První gen s označením cmlA odpovědný za aktivní vypuzování chloramfenikolu

popsali Bissonnette a kol. (1991). Dalším genem kódujícím „eflux protein“ je gen floR, který

byl detekován u izolátů E. coli a Salmonella spp. Na rozdíl od „eflux systému“ kódovaného genem cmlA je tento systém specifický pro chloramfenikol i florfenikol (Ferrari a Turnidge,

2003). Oba zmíněné geny mohou být součástí genových kazet integronu (Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001).

20

1.3.3

Integrony

Charakteristika integronů a jejich význam v šíření antibiotické rezistence Geny podmiňující rezistenci k antibiotikům mohou být součástí genetických

elementů – plazmidů, transpozonů nebo integronů, které umožňují rozšiřování těchto genů mezi nejrůznější druhy bakterií (Ferrari a Turnidge, 2003). Collins a Hall (1995) definovali

integrony jako genetické elementy složené z místně specifického rekombinačního systému, který rozpoznává a zachycuje mobilní genové kazety. Tyto DNA elementy nejsou schopné

vlastního přemisťování mezi různými bakteriálními buňkami, jsou však součástí transpozonů nebo plazmidů s širokým hostitelským spektrem, které umožňují jejich efektivní šíření

(Carattoli, 2001). Integrony se vyskytují ve vysoké frekvenci u multirezistentních gramnegativních bakterií izolovaných z veterinárního a humánního klinického materiálu

i z prostředí (Sáenz a kol., 2004) a jsou jednou z nejdůležitějších příčin šíření antibiotické rezistence (Fluit a Schmitz, 1999).

Struktura integronů Rozlišujeme integrony tříd 1 až 4. Integrony každé třídy jsou charakteristické svou

strukturou, existuje však i variabilita v rámci jedné třídy (Carattoli, 2001). Integrony třídy 1 jsou nejrozšířenějšími integrony mezi bakteriemi izolovanými z klinického materiálu (Guerra

a kol., 2003) a skládají ze dvou konzervativních oblastí oddělených variabilní oblastí, která obsahuje začleněné geny antibiotické rezistence nebo genové kazety dosud neznámé funkce (Carattoli, 2001). Zjednodušenou strukturu integronu třídy 1 popisuje Obrázek 1.

5’-konzervativní oblast (5’-CS) obsahuje gen int1, oblast att1 a promotor. Gen

int1 kóduje místně specifickou rekombinázu, která hraje hlavní úlohu při přemisťování

genových kazet (při jejich excizi a inzerci). Genové kazety jsou začleňovány do rekombinační oblasti att1 lokalizované za genem int1. Jednotlivé inkorporované genové kazety postrádají

vlastní promotor. Jejich exprese je řízena z jednoho společného promotoru PANT, který se

ve skutečnosti skládá ze dvou promotorů P1 a P2 (Carattoli, 2001; Fluit a Schmitz, 1999).

3’-konzervativní oblast (3’-CS) je tvořena geny sul1, qacE1 a otevřeným čtecím

rámcem ORF5 kódujícím protein neznámé funkce. Gen sul1 kóduje protein odpovědný

21

za rezistenci k sulfonamidům a gen qacE1 podmiňuje rezistenci ke kvartérním amoniovým sloučeninám a k ethidium bromidu (Carattoli, 2001).

Variabilní oblast tvoří genové kazety lokalizované mezi 5’- a 3’-CS. Tato oblast se

skládá z kódující sekvence a rekombinačního místa attC pro připojení další genové kazety.

Počet genových kazet začleněných do integronu je různý, byly popsány integrony, které postrádají genové kazety, ale i integrony s pěti kazetami (Fluit a Schmitz, 1999). V současné

době je známo přes 70 různých genových kazet (Mazel, 2004) odpovědných za rezistenci k aminoglykosidům,

β-laktamovým

antibiotikům,

chloramfenikolu,

erytromycinu a dezinfekčním látkám (Martinez-Freijo a kol., 1998).

sulfonamidům,

Obrázek 1: Obecná struktura integronu třídy 1 a proces začleňování nové genové kazety (upraveno podle Carattoli, 2001)

1.4 Metody průkazu antibiotické rezistence Stanovení citlivosti (rezistence) klinických bakteriálních izolátů k antibiotikům

je často rozhodující pro optimální antibiotickou léčbu infikovaných pacientů. Testování

antibiotické rezistence mikroorganizmů nehraje klíčovou roli pouze v oblasti terapie, ale rovněž v oblasti epidemiologie, monitorování šíření rezistentních mikroorganizmů a studia 22

přenosu genů antibiotické rezistence mezi mikroorganizmy žijícími v nejrůznějších typech prostředí (Fluit a kol., 2001). Z obecného hlediska můžeme metody průkazu antibiotické

rezistence rozdělit na metody prokazující fenotyp rezistence a metody založené na průkazu genotypu (Ferrari a Turnidge, 2003). 1.4.1 Fenotypové metody Na rozdíl od metod genotypových, které nachází své uplatnění především v oblasti

výzkumu, metody založené na průkazu fenotypu rezistence jsou využívány i v oblasti klinické mikrobiologie. Fenotypové metody je možné rozdělit na metody diluční, které se používají

k určení minimální koncentrace antibiotika potřebného k inhibici růstu vyšetřovaného mikroorganizmu a zahrnují agarovou a bujónovou diluční metodu. Další kategorii tvoří metody difuzní zahrnující diskovou difuzní metodu, kde citlivost nebo rezistenci stanovíme

podle toho, zda vyšetřovaná bakteriální kultura na agarové půdě vytvoří či nevytvoří

příslušnou zónu inhibice růstu kolem disků s určitou koncentrací antibiotika. Metodou kombinující principy diskové difuzní metody a metod dilučních je Etest (Ferrari a Turnidge, 2003).

Metodika, interpretace získaných výsledků citlivosti bakterií k antimikrobiálním

látkám a v neposlední řadě standardizace interpretačních kritérií se řídí určitými pravidly.

Jednou z předních mezinárodně uznávaných organizací, která stanovuje tato pravidla, je NCCLS (National Committee for Clinical and Laboratory Standards).

1.4.1.1 Speciální metody pro detekci rezistence k β-laktamovým antibiotikům Průkaz inducibilní β-laktamázy Standardní diskovou difuzní metodou a bujonovou mikrodiluční metodou

používanou v klinických laboratořích nemohou být inducibilní β-laktamázy typu AmpC

detekovány a dávají tak nesprávné výsledky o citlivosti testovaného infekčního agens. Obtížnost při detekci těchto β-laktamáz způsobují genetické rozdíly determinant antibiotické

rezistence, rozdíly v hladině genové exprese a odlišnosti v substrátové specifitě jednotlivých enzymů k testovaným antibiotikům (Ferrari a Turnidge, 2003; Qin a kol., 2004).

23

K jejich průkazu je tedy nutné použít specifické testy; první z nich popsali Sanders

a Sanders (1979). Do současné doby byly vyvinuty různé varianty testů (Huber a Thomas, 1994; Qin a kol., 2004), všechny jsou ale založeny na tom, že určitá antibiotika jako cefoxitin, ampicilin a karbapenemy indukují produkci těchto enzymů, které jsou pak vylučovány ve vysoké koncentraci a způsobují rezistenci k širokospektrým β-laktamovým antibiotikům. Průkaz širokospektré β-laktamázy Stále rostoucí frekvence výskytu enterobakterií produkujících širokospektré β-

-laktamázy nutí odborníky vyvíjet metody pro jejich rutinní průkaz u klinických izolátů (Bradford, 2001). Velký problém při průkazu ESBL nastává v případě, že bakterie produkuje

inducibilní β-laktamázu AmpC nebo dokonce oba typy enzymů (AmpC a ESBL současně).

Tyto specifické testy využívají toho, že na rozdíl od AmpC je většina ESBL inhibována kyselinou klavulanovou a jinými inhibitory (Pitout a kol., 2003). Testy mají několik

variant, mohou

být

založeny

na

bujónové diluční

mikrometodě a Etestu (Leverstein-van Hall a kol., 2002), dále na diskovém difuzním testu (Jarlier a kol., 1988) a trojrozměrném testu (Thomson a Sanders, 1992). Všechny však prokazují synergický účinek mezi inhibitorem β-laktamázy a cefalosporiny 3. generace. Při

hodnocení se srovnává zvýšená aktivita v přítomnosti β-laktamového antibiotika spolu

s inhibitorem β-laktamázy (kyselinou klavulanovou) a aktivita v případě, je-li β-laktamové

antibiotikum testováno samotné. Podstatou testu je inhibice širokospektré β-laktamázy

kyselinou klavulanovou, což má za následek snížení hladiny rezistence k cefalosporinu (Bradford, 2001).

1.4.2 Genotypové metody Systémy založené na detekci nukleových kyselin jsou rychlými a citlivými

metodami pro průkaz genů rezistence k danému antibiotiku a hrají důležitou roli v objasnění mechanizmů rezistence (Fluit a kol., 2001).

Jednou z nejstarších molekulárních technik rovněž využívaných k detekci genů

antibiotické rezistence je hybridizace, která je založena na párování jednořetězcových

24

fragmenů DNA ve vzorku s jednořetězcovou DNA sondou značenou radioaktivním nebo neradioaktivním markerem (Fluit a kol., 2001; Levy a kol., 1989; Oullette a kol., 1988).

Nejspolehlivější metodou je přímé sekvencování DNA, které se stalo tzv. „zlatým

standardem“ pro analýzu genů kódujících nové typy β-laktamáz. Nevýhodou této metody jsou

vysoké náklady a časová náročnost (Fluit a kol., 2001; M’Zali a kol., 1998).

V oblasti průkazu genů antibiotické rezistence je polymerázová řetězová reakce

(PCR) nejvíce využívanou metodou (Cockerill, 1999; Fluit a kol., 2001). Hlavní kroky PCR

zahrnují denaturaci DNA, připojení primerů a jejich elongaci termostabilní DNA

polymerázou. PCR slouží k amplifikaci mnoha kopií vybrané sekvence. Výběr se provádí pomocí oligonukleotidových primerů, komplementárních k 3’- a 5’-koncovým sekvencím

úseku, jenž má být pomnožen (Rumlová a kol., 2003). Tyto primery je možné vybrat podle specifických sekvencí genů antibiotické rezistence v internetových databázících (Genbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) (Bradford, 2001).

25

2. CÍL PRÁCE Escherichia coli a koliformní bakterie jsou často využívanými reprezentativními

zástupci čeledi Enterobacteriaceae pro studium mechanizmů a genetických determinant

rezistence k antibiotikům a slouží rovněž jako indikátory fekálního znečištění vody a potravin. Komenzální E. coli jsou běžnou součástí střevní mikroflóry člověka a zvířat, kde jsou

vystaveny účinku antimikrobiálních látek a výměně genetického materiálu s ostatními bakteriemi a významnou měrou tak přispívají k šíření determinant rezistence. Cíl této diplomové práce je možné shrnout do následujících bodů:




vypracovat přehled mechanizmů rezistence E. coli a koliformních bakterií




zjistit frekvenci rezistence k vybraným antimikrobiálním látkám u souboru izolátů




u vybraných izolátů prokázat širokospektré a inducibilní β-laktamázy




u souboru izolátů E. coli a koliformních bakterií ze zvířat, potravin a lidí prokázat

k vybraným antimikrobiálním látkám

E. coli a koliformních bakterií ze zvířat, potravin a lidí

genetické determinanty antibiotické rezistence metodou PCR

26

3. MATERIÁL A METODY 3.1 Použité mikroorganizmy


201 izolátů E. coli a koliformních bakterií získaných z mléčných filtrů odebraných na




283 izolátů E. coli O157 ze sbírky kultur Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU




68 izolátů E. coli a koliformních bakterií získaných z potravin

farmách mléčného skotu

Brno; většina izolátů pocházela ze skotu

61 izolátů bylo získáno z různých potravinových výrobků (především masné produkty) od MVDr. Brychty (Státní veterinární ústav Jihlava)

7 izolátů bylo získáno ze sýrů od MVDr. Žabské (Státní zemědělská a potravinová inspekce, Brno)


27 izolátů E. coli humánního původu izolovaných ze stolice průjmujících lidí; získány od RNDr. Lhotové (Národní referenční laboratoř pro E. coli a shigely, Státní zdravotní ústav, Praha)







8 multirezistentních izolátů E. coli 0157:H7 izolovaných z rektálních výtěrů koz a ovcí,

které byly odebrány v Jordánsku (izoláty EC312 až EC319) Jako kontrolní kmeny byly použity: Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 produkující širokospektrou β-laktamázu SHV-18

získaný od MUDr. Urbáškové (Národní referenční laboratoř pro antibiotika, Státní zdravotní ústav, Praha)

Multirezistentní kmeny Salmonella enterica serovar Typhimurium (dále jen Salmonella Typhimurium) získané od Mgr. Hradecké (Výzkumný ústavu veterinárního lékařství, Brno):

27



kmen

110/2

s typickou pentarezistencí

(ampicilin,

chloramfenikol,

streptomycin, sulfonamidy, tetracyklin), specifickými geny antibiotické rezistence - blaPSE-1, floR, aadA, sul1, tetG, int1 a integrony o velikosti 1

a 1,2 kb 

kmen F8352 s rezistencí k ampicilinu, streptomycinu, sulfonamidům,

tetracyklinu a trimetoprimu, geny blaTEM, strA, aadA, sul1, sul2, tetB, dfr1,

int1 a integronem o velikosti 1,6 kb 

kmen 110/9 s rezistencí k ampicilinu, chloramfenikolu, streptomycinu, sulfonamidům, tetracyklinu a geny blaTEM, cat, strA, sul2 a tetA

3.2 Chemikálie Fenol (Lachema, ČR)

Parafinový olej (Lachema, ČR)

2, 3, 5-trifenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC) (Sigma-Aldrich, ČR) 1N NaOH (Lachema, ČR)

Komponenty pro PCR a gelovou elektroforézu: DNA markery (Bio-Rad, USA):

EZ Load 100 bp DNA Molecular Ruler separující se do 10 fragmentů (1000 – 100 bp)

EZ Load 100 bp DNA Molecular Ruler separující se do 30 fragmentů (3000 – 100 bp)

PCR voda (Top Bio, ČR)

PPP Master Mix (Taq- Purple DNA polymeráza PCR Master Mix s MgCl2) (Top Bio, ČR)

Složení: 150 mM Tris-Cl; 40 mM (NH4)2SO4; 0,02% Tween 20; 5 mM MgCl2; 400 µM

dATP, 400 µM dCTP, 400 µM dGTP a 400 µM dTTP; 100U/ml Taq-Purple DNA polymeráza; stabilizátory a aditiva; pH 8,8

PCR primery nasyntetizovány firmou InvitrogenTM Life Technology (USA) (seznam primerů viz. Tabulka 7 v kapitole 3.8.9.1)

Agaróza pro elektroforézu (Lachema, ČR) Ethidium bromid (Sigma-Aldrich, ČR)

28

3.3 Kultivační média a roztoky Živný bujón č. 2 (Imuna, Šarišské Michalany, SR) Kryoprotektivní médium

Složení: glycerol 43,5 ml (Lachema, ČR); destilovaná voda 6,5 ml; 1,5 % BactoPepton 50 ml (Difco, USA); destilovaná voda 6,5 ml

MacConkeyho agar (CM115, Oxoid, Velká Británie)

Složení: pepton 20 g/l; laktóza 10 g/l; žlučové soli 1,5 g/l; NaCl 5 g/l; neutrální červeň 0,03 g/l; krystalová violeť 0,001 g/l; agar 15 g/l

Živný agar

Pro jeho přípravu byl použit Nutrient agar (CM3, Oxoid, Velká Británie) Složení: pepton 23 g/l; škrob 1 g/l; NaCl 5 g/l; agar 10 g/l Mueller-Hintonův agar (CM337, Oxoid, Velká Británie)

Složení: hovězí extrakt 300 g/l; kaseinový hydrolyzát 17,5 g/l; škrob 1,5 g/l; agar 17 g/l Média byla připravena podle instrukcí výrobce (The Oxoid Manual, 1998).

TBE–pufr

Složení: 0,089M Tris-base 53,90 g (Sigma-Aldrich, USA); kyseliny borsírové 27,514 g (Sigma-Aldrich, USA); 0,002M EDTA Na2·2H2O 3,722 g (Sigma-Aldrich, USA); navážka

byla doplněna destilovanou H2O do objemu 1000 ml a bylo přidáno 11 ml 5N HCl (Lachema,

ČR), aby pH vzniklého pufru bylo 8,0.

Pufr se před použitím ředí destilovanou vodou v poměru 1:9. Pufrovaný fyziologický roztok

Složení: NaCl 0,85 g (Lachema, ČR); KH2PO4 0,07 g (Lachema, ČR); NaOH 0,015 g (Lachema, ČR); navážka byla doplněna destilovanou H2O do objemu 100 ml.

pH připraveného roztoku musí být 7,2 – 7,3.

29

3.4 Identifikační soupravy a antiséra E. coli O157 Latex Test (BR620, Oxoid, Velká Británie) Typově specifická O-antiséra pro detekci O-antigenů E. coli (připravená na Výzkumném

ústavu veterinárního lékařství, Brno)

Komponenty pro identifikační test API 10S:

Identifikační souprava API 10S (bioMérieux, Francie) API suspenzní médium – 5 ml (bioMérieux, Francie)

reagencie – THAMES, TDA a činidla NIT1 a NIT2 (bioMérieux, Francie) 3.5 Antibiotické disky (Oxoid, Velká Británie)

amoxicillin-clavulanic acid (AMC, 30/20+10 µg), ampicillin (AMP, 10 µg), apramycin (APR,

15 µg), cefotaxime (CTX, 30 µg), cefoxitin (FOX, 30 µg), ceftazidime (CAZ, 30 µg), cephalotin (KF, 30 µg), colistin sulphate (CT, 10 µg), enrolfoxacin (ENR, 5 µg), gentamycin

(GN, 10 µg), chloramphenicol (C, 30 µg), nalidixic acid (NA, 30 µg), oxolinic acid (OA, 2

µg), streptomycin (S, 30 µg), sulfonamides cp. (S3, 300 µg), tetracycline (TE, 30 µg), trimethoprim-sulfmethoxazole (SXT, 1,25/23,7 µg) 3.6 Přístroje Laminární box II. bezpečnostní třídy (Steril Antares, Itálie) Stolní autokláv IP 44 (CertoClav, Rakousko) Vodní lázeň (GFL, Německo)

Fotometr (Densi-La-Meter, LIAP, Litva)

Chlazená odstředivka Micro 22 R (Hettich, Německo) Thermocycler PTC 200 (MJ Research, USA) Zařízení pro elektroforézu (Bio-Rad, USA)

Zdroj elektrického napětí Power Pac 3000 (Bio-Rad, USA)

Transiluminátor s fotodokumentačním zařízením Ultra Lum (Claremont, USA) Nastavitelné mikropipety (Gilson, Francie)

30

Vortex MS 2 Minishaker (IKA-WORKS, USA). Předvážky Kern 440 (Ecotech, ČR)

Digitální fotoaparát Sony DSC-W30 (Sony, Japonsko) Termostat Sanyo MIR-153 (Sanyo, Japonsko)

Dispenzor antibiotických disků (Oxoid, Velká Británie) Mikrovlnná trouba (Bosch, Německo)

3.7 Pomůcky Sterilní vatové tampóny Mikrotitrační destičky Očkovací kličky

Běžné laboratorní sklo

Jednorázové plastové Pasteurovy pipety Špičky pro mikropipety

Plastové zkumavky se šroubovým uzávěrem o objemu 1,5 ml Zkumavky typu Eppendorf o objemu 200 µl a 1ml Sterilní plastové zkumavky o objemu 10 ml 3.8 Metody 3.8.1 Uchovávání bakteriálních kultur Bakteriální kultury byly uchovávány ve sterilních plastových zkumavkách se

šroubovým uzávěrem o objemu 1,5 ml v 1 ml kryoprotektivního média v mrazícím boxu při teplotě -80 oC.

3.8.2 Očkování bakteriálních kultur ze zamražení Malé množství bakteriální kultury bylo sterilním vatovým tampónem natřeno

na danou kultivační půdu a zkumavka s kulturou byla ihned umístěna zpět do mrazícího boxu. Při očkovávání takto uchovaných vzorků bylo striktně zamezováno jejich rozmrznutí.

31

3.8.3 Průkaz rezistence bakteriálních izolátů diskovou difuzní metodou (podle metodiky NCCLS M31-A2, 2002)

Za použití diskové difuzní metody byla testována rezistence 68 izolátů E. coli

a koliformních bakterií z potravin a 27 izolátů E. coli humánního původu získaných ze stolice

průjmujících lidí.

Výsledky citlivosti 201 izolátů E. coli a koliformních bakterií z mléčných filtrů

odebraných na farmách mléčného skotu, 283 izolátů E. coli O157:H7 ze sbírky kultur Ústavu

mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno a 8 multirezistentních izolátů E. coli 0157

(EC312 až EC319) izolovaných v Jordánsku byly k dispozici z dřívějšího testování.

Byla použita sestava 12 antibiotických disků. Pro izoláty E. coli a koliformních

bakterií z mléčných filtrů, potravin a E. coli humánního původu byla použita sestava 1.

Izoláty E. coli O157 ze sbírky kultur Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno

a multirezistentní izoláty E. coli O157:H7 z Jordánska byly testovány sestavou 2. Názvy použitých antibiotických disků v jednotlivých sestavách jsou uvedeny v Tabulkách 3 a 4.

Jako kontrola kvality provedení diskové difuzní metody byl použit kmen

Escherichia coli ATCC 25922.

Příprava inokula a očkování ploten 1. Bakteriální kultury uchovávané v kryoprotektivním médiu byly vyočkovány křížovým

roztěrem na živný agar a kultivovány v termostatu 24 hodin při 37 oC. Druhý den byla zkontrolována čistota kultury.

2. Potřebné množství ploten s Mueller-Hintonovým agarem o průměru 90 mm (2 plotny pro jeden testovaný izolát), které byly skladovány při 4 oC, byly vyjmuty z chladničky

a ponechány při pokojové teplotě až do vyrovnání teploty. Plotny, které obsahovaly kapky kondenzované vody, byly krátce vysušeny v termostatu při 37 oC.

3. Několik kolonií (přibližně 3 – 4 kolonie) bylo resuspendováno v 5 ml sterilního

fyziologického roztoku. Zkumavka s bakteriální suspenzí byla homogenizována

promícháním na vortexu. Zákal suspenze bakterií byl nastaven fotometrem na hodnotu 0,5 McFarlandovy stupnice.

32

4. Výchozí inokulum bylo ředěno ve fyziologickém roztoku v poměru 1:100 tak, že 50 µl

homogenizované suspenze bylo mikropipetou přeneseno do 5 ml fyziologického roztoku. Počet buněk ve výsledné suspenzi určené pro očkování ploten tedy odpovídal přibližně 106 CFU/ml.

5. Po 2 ml suspenze bylo ihned (nejdéle však do 15 minut od přípravy) sterilně napipetováno na celý povrch plotny s Mueller-Hintonovým agarem. Přelití celého

povrchu plotny bylo docíleno jejím nakláněním na všechny strany. Přebytek inokula byl odpipetován.

Kladení antibiotických disků a inkubace ploten 1. Inokulum naočkované na povrchu Mueller-Hintonova agaru se před aplikací disků nechalo dobře zaschnout. Zaschnutí bylo urychleno odložením víčka Petriho misky na 5 – 15 minut. Na vlhkých plotnách se vytváří nehodnotitelné zóny inhibice.

2. Po naočkování půdy inokulem bylo na povrch ploten otiskem dispenzoru umístěno 6 antibiotických disků.

3. Po nakladení disků byly plotny otočeny víčkem dolů a umístěny do termostatu. Plotny byly inkubovány při 37 oC po dobu 24 hodin.

Vyhodnocení výsledků a výběr rezistentních bakteriálních izolátů Po inkubaci byly změřeny zóny inhbice vytvořené v okolí antibiotických disků.

Výsledky byly vyhodnoceny porovnáním s průměry

inhibičních zón pro enterobakterie

uvedené v metodických listech NCCLS (M31-A2, 2002) a shrnuté v Tabulkách 3 a 4. Izoláty s průměrem zóny daného antibiotika shodnou nebo vyšší než je hraniční průměr pro citlivé a intermediální kmeny byly označeny jako citlivé k tomuto antibiotiku a obdobně izoláty s průměrem zóny daného antibiotika

shodnou nebo nižší než je hraniční průměr

pro rezistentní kmeny byly označeny jako rezistentní k tomuto antibiotiku.

Pro další práci byly vybrány pouze izoláty vyhodnocené diskovým difuzním testem

na základě kritérií NCCLS (M31-A2, 2002) jako rezistentní k jednomu nebo více testovaným

antibiotikům.

33

Tabulka 3: Sestava antibiotických disků (sestava 1) a průměry inhibičních zón pro hodnocení citlivých a rezistentních izolátů

disk číslo zkratka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

AMP AMC KF CAZ S S3 TE C GN NA ENR SXT

antibiotický disk název

množství antibiotika v disku (µg)

ampicillin 10 amoxicillin-clavulanic acid 30 (20+10) cephalothin 30 ceftazidime 30 streptomycin 30 sulphonamides cp. 300 tetracycline 30 chloramphenicol 30 gentamycin 10 nalidixic acid 30 enrolfloxacin 5 trimethoprim-sulfamethoxazole 1,25/23,7

průměr inhibiční zóny R

I

rezistentní intermediální

≤ 13 ≤ 13 ≤ 14 ≤ 14 ≤ 11 ≤ 12 ≤ 14 ≤ 12 ≤ 12 ≤ 13 ≤ 16 ≤ 10

14 14 15 15 12 13 15 13 13 14 17 11

-

16 17 17 17 14 16 18 17 14 18 22 15

S

citlivý

≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥

17 18 18 18 15 17 19 18 15 19 23 16

Tabulka 4: Sestava antibiotických disků (sestava 2) a průměry inhibičních zón pro hodnocení citlivých a rezistentních izolátů

disk číslo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

antibiotický disk zkratka

název

množství antibiotika v disku (µg)

AMP AMC S S3 TE C GN SXT APR N CT OA

ampicillin amoxicillin-clavulanic acid streptomycin sulphonamides cp. tetracycline chloramphenicol gentamycin trimethoprim-sulfamethoxazole apramycin neomycin colistin sulphate oxolinic acid

10 30 (20+10) 30 300 30 30 10 1,25/23,7 15 30 10 2

34

průměr inhibiční zóny R

I

rezistentní intermediální

≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤

13 13 11 14 13 16 14 12 11 12 8 13

14 14 12 15 14 17 15 13 12 13 9

- 16 - 17 - 14 - 17 - 18 - 22 - 17 - 14 - 14 - 16 - 10 14

S

citlivý

≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥ ≥

17 18 15 18 19 23 18 15 15 17 11 15

3.8.4 Identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S API 10S je standardizovaný systém pro identifikaci enterobakterií a jiných

nenáročných gramnegativních bakterií, který využívá 11 miniaturních biochemických testů. Tento test byl použit k identifikaci vybraných izolátů z mléčných filtrů a potravin, u kterých byla diskovou difuzní metodou prokázána rezistence k jednomu nebo více typům antibiotik. Příprava inokula 1. Bakteriální kultury uchovávané v kryoprotektivním médiu byly vyočkovány křížovým roztěrem na MacConkeyho agar a kultivovány v termostatu při 37 oC 24 hodin.

2. Druhý den byla zkontrolována čistota kultury. Z misky byla přeočkována jedna

kolonie na živný agar a kultura byla umístěna do termostatu nastaveného na teplotu 37 oC po dobu 24 hodin.

3. Kultura vyrostlá na živném agaru byla použita pro přípravu inokula. Jedna kolonie

byla přeočkována do 5 ml API suspenzního média a dobře homogenizovaná suspenze byla ihned použita pro inokulaci.

Inokulace a hodnocení testu 1. Stripy byly vloženy do inkubačních komůrek, do kterých byly předem napipetovány

3 ml destilované vody pro zajištění vlhké atmosféry. Do jednotlivých jamek stripu

bylo pipetováno 150 ml bakteriální suspenze. Pro zajištění anaerobního prostředí byly testy LDC, ODC, H2S a URE zakápnuty 3 kapkami parafinového oleje. Inkubační

komůrka se stripem byla uzavřena a inkubována v termostatu při 37 oC po dobu 24 hodin.

2. Po příslušné době inkubace byla k testu TDA přidána kapka reagencie TDA, k testu IND kapka reagencie JAMES a

redukce nitrátů byla, po odečtení testu GLU,

prokázána přidáním po jedné kapce činidel NIT1 a NIT2 k testu GLU.

3. Při odečítání výsledků byly použity Obrázek 2 a Tabulka 5. Výsledky všech 11 testů byly zaznamenány na identifikační kartičky a vyhodnoceny softwarovým programem (http://www.apiweb.com).

35

Obrázek 2: Pozitivní a negativní reakce testu API 10S

pozitivní

negativní

Tabulka 5: Tabulka pro odečítání testu API 10S test

substrát

reakce/enzym

ONPG

2-nitrofenyl-β-galaktopyranosid

β-galaktosidáza

GLU

D-glukóza

ARA

L-arabinóza

LDC

L-lyzin

ODC

fermentace/oxidace glukózy fermentace/oxidace arabinózy dekarboxylace lyzinu

L-ornitin

dekarboxylace ornitinu

H2S

sodium thiosulfonát

produkce H2S

TDA

L-tryptofan

deaminace tryptofanu

IND

L-tryptofan

produkce indolu

NO2

(GLU test)

produkce NO2

CIT

URE

trisodium citrát urea

negativní

výsledek

pozitivní

bezbarvá

žlutá

modrozelená / modrá

žlutá / žlutozelená

modrozelená / modrá

žlutá

žlutá

červená / oranžová

žlutá

utilizace citrátu

světle zelená / žlutá

ureáza

žlutá

červená / oranžová

modrozelená / modrá

bezbarvá / našedlá

černý střed / tenká linie

žlutá bezbarvá / světle zelená, žlutá žlutá

červenohnědá

červená / oranžová růžová červená

3.8.5 Typizace O-antigenů E. coli

3.8.5.1 Typizace antigenu O157 u E. coli latexovou aglutinací Přítomnost antigenu O157 u izolátů E. coli izolovaných z průjmujících lidí byla

prokazována komerčně dodávanou soupravou E. coli O157 Latex Test podle následujících

kroků:

36

1. Bakteriální kultury uchovávané v kryoprotektivním médiu byly vyočkovány křížovým roztěrem na živný agar a kultivovány v termostatu 24 hodin při 37 oC.

2. Souprava byla přemístitěna do pokojové teploty a reagencie byly protřepány.

3. Latexové částice byly nakapány na testovací kartičku a vedle ní byla přidána kapka fyziologického roztoku, tak aby se latexové částice a roztok nesmíchaly.

4. Jedna kolonie vykultivovaná na živném agaru byla resuspendována v kapce fyziologického roztoku na testovací kartičce, poté byla tato suspenze smíchána

s latexovými částicemi. Pro zajištění promíchání všech komponent a správného výsledku bylo nutné po dobu jedné minuty kartičkou otáčet.

5. Po jedné minutě byly odečteny výsledky. Pozitivní výsledek a tudíž přítomnost

antigenu O157 se projevil aglutinací. Pozitivní kolonie bylo však nutné aglutinovat i s kontrolními latexovými částicemi pro odhalení spontánně aglutinujících izolátů a zamezení vzniku falešně pozitivních výsledků.

3.8.5.2 Typizace O-antigenů E. coli typově specifickými O-antiséry O-antigeny izolátů E. coli z průjmujících lidí byly typizovány na Výzkumném

ústavu veterinárního lékařství v Laboratoři koliinfekcí MVDr. Alexi. Kultivace izolátů

1. Bakteriální izoláty uchovávané v zamražovacím médiu byly vyočkovány křížovým roztěrem na živný agar a kultivovány v termostatu při 37 oC 24 hodin.

2. Kultura byla druhý den přeočkována do 5 ml živného bujónu. Následovala kultivace při 37 oC po dobu 16 hodin.

3. Do živného bujónu s narostlými kulturami byla přidána 1 kapka 4 % vodného roztoku TTC, který se vyznačuje barvícími schopnostmi. Zkumavky byly mírně protřepány a ponechány v termostatu přibližně 1 hodinu.

4. Bylo přidáno 50 µl 1N NaOH, bujón byl poté důkladně promíchán.

5. Kultury byly autoklávovány při 120 oC 1 hodinu. Poté se zkumavky nechaly vychladnout a ustát.

37

Provedení aglutinace 1. Aglutinace typově specifickými O-antiséry byla prováděna na mikrotitračních

destičkách s jamkami tvaru U. Do jamek mikrotitrační destičky bylo napipetováno 30 µl příslušného O-antiséra. Pro kontrolu bylo do poslední jamky místo antiséra nepipetováno 30 µl fyziologického roztoku s přídavkem 0,5 % fenolu. Kontrola byla použita pro odlišení falešně pozitivních izolátů, které mají sklon k R formě.

2. K antisérům a kontrole bylo přidáno stejné množství živného bujónu s testovanou kulturou (30 µl). Nestejný poměr množství séra a antigenu může mít za následek nepřesné výsledky.

3. Po napipetování antigenů k sérům byl obsah jamek promíchán mírným poklepem z boku destičky. Mikrotitrační destičky byly překryty fólií, aby nedošlo k vysychání obsahu a umístěny do termostatu nastaveného na 37 oC do druhého dne. Odečtení a vyhodnocení výsledků Po příslušné době inkubace byly mikrotitrační destičky umístěny na bílý podklad

a byly posuzovány výsledky aglutinace. V negativním případě byl všechen antigen shromážděn v jednom místě na dně jamky a vytvářel tmavou skvrnu. Pozitivní výsledek byl charakteristický

v jednom místě.

difuzním pokryvem antigenu v celé jamce bez náznaku tmavé skvrny

3.8.6 Průkaz širokospektré β-laktamázy 3.8.6.1 Vyhledávací („screeningový“) test

( podle metodických listů NCCLS, M31-A2, 2002) K vyhledávání produkce širokospektré β-laktamázy byly použity výsledky

diskového difuzního testu. Velikosti inhibičních zón v okolí disku s ceftazidimem byly

porovnány se speciálně vyvinutými „break-pointy“ pro cefalosporiny vyšších generací publikované v metodických listech NCCLS (M31-A2, 2002). Bakteriální izoláty s velikostí

38

zóny inhibice v okolí disku s ceftazidimem ≤ 22 mm byly považovány za potenciální producenty širokospektré β-laktamázy a podrobeny „double-disk synergy testu“.

3.8.6.2 „Double-disk synergy test“

(metoda podle Jarliera a kol., 1988; Thomsona a Sanderse, 1992) „Double-disk synergy testu“ byly podrobeny izoláty, u kterých byla diskovou difuzní

metodou získána zóna v okolí disku s ceftazidimem ≤ 22 mm, podle níže popsaných kroků. Jako pozitivní kontrola byl použit kmen Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 a jako negativní kontrola kmen Escherichia coli ATCC 25922. 1. Bakteriální kultury byly vyočkovány z

kryoprotektivního média na živný bujón

a kultivovány v termostatu při 37 oC 24 hodin.

2. Další postup práce byl totožný s postupem při diskové difuzní metodě popsané v kapitole 3.8.3 bodech 2. – 5.

3. Do středu naočkované plotny byl sterilní injekční jehlou položen disk s amoxicilinem-kyselinou klavulanovou (AMC, 30 µg) a ve vzdálenosti 30 mm od něj byly položeny

2 cefalosporinové disky. Nalevo od disku s amoxicilinem-kyselinou klavulanovou byl položen disk s ceftazidimem (CAZ, 30 µg) a napravo byl položen disk s cefotaximem (CTX, 30 µg). Schéma rozmístění disků je znázorněno na Obrázku 3.

4. Po rozmístění disků byly plotny otočeny víčkem dolů, umístěny do termostatu a inkubovány při 37 oC po dobu 24 hodin.

5. Při pozitivním výsledku testu bylo sledováno zvětšení inhibiční zóny v okolí cefotaximu a ceftazidimu u strany přilehlé k disku obsahujícího amoxicilin-kyselinu

klavulanovou v důsledku inhibice produkce širokospektré β-laktamázy inhibitorem (kyselinou klavulanovou).

6. Podle doporučení Thomsona a Sanderse (1992) u izolátů označených jako negativní tímto testem byl postup zopakován, přičemž vzdálenosti mezi středy jednotlivých disků byly zkráceny na 20 mm.

39

Obrázek 3: Schéma umístění disků při „double-disk synergy testu“

1….disk s ceftazidimem (CAZ, 30 µg)

2….disk s amoxicilinem-kyselinou klavulanovou (AMC, 30 µg)

3….disk s cefotaximem (CTX, 30 µg)

3.8.7 Průkaz inducibilní β-laktamázy (metoda podle Qina a kol., 2004)

Inducibilní β-laktamázy byly prokazovány u bakteriálních izolátů rezistentních

k jednomu nebo více testovaným β-laktamovým antibiotikům izolovaných z mléčných filtrů

a potravin identifikovaných testem API 10S jako rody Citrobacter, Enterobacter a Serratia podle následujícího postupu:

1. Bakteriální izoláty uchovávané v kryoprotektivním médiu byly vyočkovány křížovým roztěrem na živný agar a kultivovány v termostatu při 37 oC 24 hodin. Druhý den byla

zkontrolována čistota kultury.

2. Další postup práce byl totožný s postupem při diskové difuzní metodě popsané v kapitole 3.8.3 v bodech 2. – 5.

3. Po zaschnutí inokula byly sterilní injekční jehlou na plotny umístěny 3 antibiotické disky podle schématu znázorněného na Obrázku 4. Do středu plotny byl umístěn disk s cefoxitinem (FOX, 30 µg), vlevo ve vzdálenosti 15 mm od okraje tohoto disku byl položen disk s ceftazidimem (CAZ, 30 µg) a disk s cefotaximem (CTX, 30 µg) byl umístil 15 mm vpravo od okraje disku s cefoxitinem.

4. Plotny byly inkubovány při 37 oC po dobu 24 hodin.

5. Byla sledována deformace (zmenšení) inhibiční zóny v okolí indikátorových antibiotik (cefotaximu a ceftazidimu) u strany přilehlé k disku s antibiotikem indukujícím produkci β-laktamázy (cefoxitinu).

40

Obrázek 4 : Schéma rozmístění disků pro průkaz inducibilní β-laktamázy

1.....disk s ceftazidimem (CAZ, 30 µg) 2.....disk s cefoxitinem (FOX, 30 µg)

3….disk s cefotaximem (CTX, 30 µg)

3.8.8 Izolace bakteriální DNA rezistentních izolátů

(podle pracovního protokolu Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno) 1. Bakteriální izoláty uchovávané v kryoprotektivním médiu byly vyočkovány křížovým roztěrem na živný agar a kultivovány v termostatu při 37 oC 24 hodin. Několik koloníí bylo resuspendováno ve zkumavce typu Eppendorf v 300 µl sterilní destilované vody.

2. Buňky byly zlyzovány povařením ve vodní lázni po dobu 10 minut.

3. Směs byla poté zcentrifugována při 16 000 ot./min po dobu 2 minut.

4. Supernatant s DNA byl odebrán do sterilní zkumuvky typu Eppendorf a uchován zamražením pro následné použití.

3.8.9 Polymerázová řetězová reakce se specifickými primery 3.8.9.1 Příprava PCR reakční směsi

(podle upraveného pracovního protokolu Laboratoře salmonelových infekcí Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, Brno) PCR reakční směs byla připravena podle následujících kroků: 1. Všechny

komponenty PCR reakce byly uchovávány v mrazničce. Po rozmražení

byly krátce centrifugovány a těsně před použitím byl obsah promíchán špičkou. 41

Při přípravě PCR směsi byly přísně dodržovány zásady sterilní práce, aby bylo

zamezeno kontaminaci vzorku a případnému vzniku nespecifických produktů PCR reakce.

2. Pro přípravu PCR směsi byl zvolen postup namíchání „master-mixu” tak, že objemy

jednotlivých kompoment byly vynásobeny počtem analyzovaných vzorků. Jednotlivé

složky směsi byly napipetovány a smíchány v jedné zkumavce typu Eppendorf (kromě

DNA). Přesné objemy jednotlivých komponent PCR směsi obsažené v jednom vzorku jsou rozepsány v Tabulce 6.

3. Směs byla krátce homogenizována pomocí vortexu a rozpipetována po 24 µl do zkumavek typu Eppendorf o objemu 200 µl.

4. Nakonec byl do každé zkumavky přidán 1 µl bakteriální DNA připravené teplotní lyzí a uchované zamražením. Celkový objem reakční směsi byl 25 µl.

Seznam použitých primerů včetně jejich annelingové teploty (Ta), délky

amplifikovaného úseku a literárního zdroje, ve kterém byly příslušné primery vyhledány, jsou přehledně shrnuty v Tabulce 7.

Jako kontroly byly použity Salmonella Typhimurium kmen 110/2 pro detekci genů

aadA, sul1, tetG, int1 a průkaz integronu, S. Typhimurium kmen 110/9 pro průkaz genů

blaTEM, cat, strA, sul2 a tetA, S. Typhimurium F8352 pro gen tetB, dfr1 a pro detekci integronu. Kmen Klebsiella pneumonie ATCC 700603 byl použit jako pozitivní kontrola

pro průkaz genu blaSHV. Jako negativní kontrola pro všechny PCR reakce byl použit kmen

Escherichia coli ATCC 25922.

Tabulka 6: Komponenty PCR směsi na jeden vzorek reakční komponenty PPP Master Mix PCR voda primer P1 primer P2 DNA matrice

objem 12,5 11,3 0,1 0,1 1

42

Tabulka 7: Seznam použitých primerů, jejich sekvence, annelingová teplota, délka amplifikovaného úseku a literární zdroj sekvence (5'-3')

cílový gen

TEMF

ATT CTT GAA GAC GAA AGG GC

TEMR

ACG CTC AGT GGA ACG AAA AC

blaTEM

OXAF

TTC AAG CCA AAG GCA CGA TAG

OXAR

TCC GAG TTG ACT GCC GGG TTG

SHVF

CAC TCA AGG ATG TAT TGT G

SHVR

TTA GCG TTG CCA GTG CTC G

TetAF

GCT ACA TCC TGC TTG CCT TC

TetAR

CAT AGA TCG CCG TGA AGA GG

TetBF

TTG GTT AGG GGC AAG TTT TG

TetBR

GTA ATG GGC CAA TAA CAC CG

TetCF

CTT GAG AGC CTT CAA CCC AG

TetCR

ATG GTC GTC ATC TAC CTG CC

TetDF

AAA CCA TTA CGG CAT TCT GC

TetDR

GAC CGG ATA CAC CAT CCA TC

TetEF

AAA CCA CAT CCT CCA TAC GC

TetER

AAA TAG GCC ACA ACC GTC AG

TetGF

CAG CTT TCG GAT TCT TAC GG

TetGR

GAT TGG TGA GGC TCG TTA GC

AadAF

TGA TTT GCT GGT TAC GGT GAC

AadAR

CGC TAT GTT CTC TTG CTT TTG

StrAF

CCT ATC GGT TGA TCA ATG TC

StrAR

GAA GAG TTT TAG GGT CCA CC

CatF

CCT GCC ACT CAT CGC AGT

CatR

CCA CCG TTG ATA TAT CCC

ClmAF

TGT CAT TTA CGG CAT ACT CG

CmlAR

ATC AGG CAT CCC ATT CCC AT

sul1F

CTT CGA TGA GAG CCG GCG GC

sul1R

GCA AGG CGG AAA CCC GCG CC

sul2F

AGG GGG CAG ATG TGA TCG AC

sul2R

GCA GAT GAT TTC GCC AAT TG

dfr1F

ACG GAT CCT GGC TGT TGG TTG GAC GC

dfr1R

CGG AAT TCA CCT TCC GGC TCG ATG TC

int1F

CCT CCC GCA CGA TGA TC

int1R

TCC ACG CAT CGT CAG GC

5CS

GGC ATC CAA GCA GCA AG

3CS

AAG CAG ACT TGA CCT GA

Primer

blaOXA

rezistence

Taa (oC)

Db (bp) 1150

β-laktamová antibiotika

60

702

blaSHV

885

tetA

210

tetB

659

tetC

418

tetD

tetracyklin

55

787

tetE

278

tetG

468

aadA strA cat cmlA sul1 sul2 dfr1 int1 5´-3´CS

streptomycin

chloramfenikol

sulfonamidy

trimetoprim

43

Briñas a kol., 2002

Ng a kol., 1999

68

284

Clark a kol., 1999

58

250

Faldynová a kol., 2003

55

623

Faldynová a kol., 2003

55

455

Sáenz a kol., 2004

68

417

Zhao a kol., 2001

58

249

Faldynová a kol., 2003

55

254

Gibreel a Sköld, 1998

280

Zhao a kol., 2001

55

Ta…teplota použitá pro připojení primerů v PCR (annelingová teplota) D…délka amplifikovaného úseku DNA

a

b

literární zdroj

variabilní Faldynová a kol., 2003

3.8.9.2 Provedení PCR Zkumavky typu Eppendorf se vzorky obsahujícími všechny reakční složky byly

umístěny do termocykléru a byl spuštěn příslušný program (podle upraveného pracovního protokolu Laboratoře salmonelových infekcí Výzkumného ústavu veterinárního lékařství, Brno). Jednotlivé kroky PCR reakce jsou rozepsány v Tabulce 8. Tabulka 8: Kroky PCR reakce Krok

funkce

1 2 3 4 5 6 7

úvodní denaturace DNA denaturace DNA připojení primerů syntéza DNA řetězce opakování kroků 2 - 4 závěrečná syntéza DNA řetězce chlazení

teplota ( oC ) 94 94 Ta 72

72 4

parametry

35 krát

čas

3 min 45 s 45 s 1, 5 min 10 min minimálně 5 min

3.8.10 Detekce PCR produktu agarózovou gelovou elektroforézou (podle pracovního protokolu Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno) Příprava agarózového gelu 1. Pro detekci PCR produktu byl použit 1,5 % agarózový gel. Pro přípravu malého gelu

(s 12 jamkami) bylo naváženo 0,525 g agarózy do 35 ml TBE pufru a poté byly přidány 2 µl ethidium bromidu. Pro přípravu velkého gelu (s 20 jamkami) bylo naváženo 0,975 g agarózy do 65 ml TBE pufru a byly přidány 4 µl ethidium bromidu.

2. Agaróza byla rozvařena v mikrovlnné troubě při 180 V po dobu 7 min pro přípravu malého gelu a 12 min pro přípravu velkého gelu.

3. Po vychladnutí přibližně na 60 oC byla agaróza nalita do předem připravené elektroforetické vaničky s hřebínkem. Případné bublinky byly odstraněny špičkou.

44

4. Gel byl ponechán ve vaničce ve vodorovné poloze při pokojové teplotě až do ztuhnutí po dobu 30 minut.

5. Gel umístěný v elektroforetické vaničce byl přelit TBE pufrem tak, aby hladina pufru byla

přibližně 0,5 cm nad gelem. Z gelu byl opatrně vysunut hřebínek tak, aby

komůrky zůstaly nepoškozeny. Nanášení vzorku DNA na gel

Vzorky DNA v množství 8 – 12 µl byly opatrně naneseny mikropipetou do komůrek

v gelu v elektroforetické vaničce. Nakonec byly do jedné komůrky gelu napipetovány 4 µl 100 bp DNA markeru.

Spuštění elektroforézy a prohlížení gelu v transluminátoru 1. Elektroforetická vanička s gelem byla umístěna v takové orientaci, aby záporně nabitá DNA mohla migrovat gelem směrem k anodě. Komůrky s DNA byly umístěny u anody. Byly zapojeny příslušné elektrody.

2. Elektroforéza byla spuštěna při napětí 110 V. Separace probíhala po dobu 50 minut až

do oddělení jednotlivých fragmentů standardu. Nakonec byl vypnut elektrický proud a elektrody odpojeny.

3. V ochranných rukavicích byl gel opatrně vyjmut s elektroforetické vaničky a přenesen

na transluminátor a po zapnutí UV světla prohlížen přes sklo. Gel byl vyfotografován digitálním fotoaparátem napojeným na počítač.

Stanovení velikosti amplifikovaného PCR produktu Jako standard o definovaném počtu bazí byl při elektroforéze multiplikovaného

úseku DNA fragmentu použit komerčně dostupný 100 bp

DNA marker, který se

na agarózovém gelu separuje do 10 fragmentů různých velikostí (1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp) a 100 bp DNA marker separující se do 30 fragmentů (3000 až 100 bp). Z fotografie byla porovnána vzdálenost jednotlivých fragmentů vzorku s fragmenty DNA markeru a rovněž s pozitivní a negativní kontrolou. 45

4. VÝSLEDKY 4.1 Vyhodnocení antibiotické rezistence 4 skupin izolátů Diskovou difuzní metodou byla testována rezistence 4 skupin bakteriálních izolátů

rozdělených podle původu k 12 vybraným antimikrobiálním látkám. Výsledky vyhodnocené podle kritérií NCCLS (M31-A2, 2002) jsou přehledně shrnuty v Tabulce 9 a 10.

Tabulka 9: Přehled rezistence 4 skupin bakteriálních izolátů na základě počtu antimikrobiálních látek, ke kterým byla prokázána rezistence

skupina izolátů (počet izolátů ve skupině)a

mléčné filtry (201)

počet izolátů rezistentních k (n) antimikrobiálním látkámb

n=0

n=1

n≥1

n=2

n=3

n=4

104 17 31 27 5 97 (51,7 %) (8,5 %) (48,3 %) (15,4 %) (13,4 %) (2,5 %)

248 18 12 E. coli O157 35 veterinárního původu (283) (87,6 %) (6,4 %) (12,4 %) (4,2 %)

2 (0,7 %)

potraviny (68)

40 5 28 (58,8 %) ( 7,4 %) (41,2 %)

E. coli humánního původu (27)

1 2 4 20 7 (74,1 %) (3,7 %) (25,9 %) (7,4 %) (14,8 %)

0

1 (0,4 %)

n≥5 17 (8,5 %) 2 (0,7 %)

9 4 10 (13,2 %) (5,9 %) (14,7 %) 0

0

charakteristika skupin (totéž platí i pro ostatní níže uvedené tabulky): mléčné filtry … E. coli a koliformní bakterie izolované z mléčných filtrů na farmách mléčného skotu E. coli O157 veterinárního původu … E. coli O157 ze sbírky kultur Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno potraviny … E. coli a koliformní bakterie izolované z různých potravinových produktů E. coli humánního původu … E. coli izolované ze stolice průjmujících lidí b n … počet testovaných antimikrobiálních látek, ke kterým je daná skupina izolátů rezistentní a




Vysoký výskyt rezistence k testovaným antimikrobiálním látkám byl zjištěn u E.

coli a koliformních bakterií izolovaných z mléčných filtrů, kde více než 48 % izolátů bylo 46

rezistentních. U E. coli a koliformních bakterií z potravin bylo rovněž prokázáno vysoké

procento rezistentních izolátů (41 %) a byl zde zaznamenán vysoký výskyt rezistence k 5

a více antimikrobiálním látkám. Mezi izoláty E. coli získané ze stolice průjmujících lidí bylo

nalezeno 26 % rezistentních izolátů. U těchto izolátů byla dále zjištěna rezistence maximálně

ke 3 testovaným antimikrobiálním látkám. Pouze 12 % izolátů E. coli O157 veterinárního

původu bylo rezistentních a většina z nich pouze k jedné z testovaných antimikrobiálních látek.

Tabulka 10: Výsledky rezistence 4 skupin izolátů podle původu k 12 testovaným antimikrobiálním látkám

počet (%) rezistentních izolátů k testovaným antimikrobiálním látkám ve 4 skupinách izolátů podle původua, b

název antimikrobiální látky

mléčné filtry (201)

E. coli O157 veterinárního původu (283)

ampicilin

47 (23,5 %)

21 (7,4 %)

22 (32,4 %)

5 (18,5 %)

cefalotin

61 (30,5 %)

NT

17 (25 %)

1 (3,7 %)

streptomycin

39 (19,5 %)

6 (2,1 %)

14 (20,6 %)

7 (25,9 %)

tetracyklin

32 (15,9 %)

4 (1,4 %)

14 (20,6 %)

1 (3,7 %)

gentamycin

0

0

amoxicilin-kyselina klavulanová ceftazidim

sulfonamidy

chloramfenikol kyselina nalidixová enrolfloxacin

trimetoprim-sulfametoxazol apramycin neomycin

kyselina oxolinová kolistin sulfát

52 (26 %)

10 (3,5 %)

0

NT

19 (9,5 %)

17 (6 %)

15 (7,5%)

0

potraviny (68) 5 (7,4 %)

1 (1,5 %)

14 (20,6 %) 4 (5,9 %) 0

E. coli humánního původu (27) 0

0

4 (14,8 %) 0

0

0

NT

7 (10,3 %)

0

6 (3 %)

1 (0,4 %)

5 (7,3 %)

0

NT

0

0

NT

NT

0

NT

0

NT

0

6 (8,8 %)

0

NT

NT

NT

NT

NT NT

NT NT

0 … nebyl prokázán žádný rezistentní izolát k dané antimikrobiální látce NT … citlivost k antimikrobiální látce nebyla diskovou difuzní metodou testována b pět nejvyšších hodnot (vyjádřených počty a procenty rezistentních izolátů k jednotlivým antimikrobiálním látkám) je v každé ze 4 skupin izolátů zvýrazněno

a

47




Výsledky testování citlivosti k jednotlivým antimikrobiálním látkám u 4 skupin izolátů

rozdělených podle původu je možné shrnout do následujících bodů:


U všech 4 skupin izolátů rozdělných podle původu byl zaznamenán vysoký výskyt rezistence k ampicilinu, streptomycinu, sulfonamidům a tetracyklinu.


Více než 30 % izolátů E. coli a koliformních bakterií z mléčných filtrů bylo

rezistentních k cefalotinu. Vysoké procento izolátů bylo rezistentních také k amoxicilinu-kyselině klavulanové, ampicilinu, streptomycinu a tetracyklinu.


U izolátů E. coli O157 veterinárního původu byl zaznamenán

nízký výskyt

rezistentních izolátů k testovaným antimikrobiálním látkám (0 – 7 %). Nejvíce izolátů

bylo rezistentních k ampicilinu a sulfonamidům.


U více než 32 % izolátů E. coli a koliformních bakterií z potravin byla prokázána

rezistence k ampicilinu. Dalšími antimikrobiálními látkami, ke kterým bylo přibližně

21 – 25 % izolátů rezistentních, byly cefalotin, streptomycin, sulfonamidy a tetracyklin.


U izolátů E. coli humánního původu byl zaznamenán vysoký výskyt izolátů

rezistentních ke streptomycinu (26 %). Vysoké procento izolátů bylo rezistentních také k ampicilinu a sulfonamidům.

4.2 Výběr rezistentních izolátů pro další testování Pro následný průkaz determinant antibiotické rezistence byly vybrány bakteriální

izoláty vyhodnocené diskovou difuzní metodou na základě kritérií NCCLS (M31-A2, 2002) jako rezistentní k jednomu nebo více z následujících antimikrobiálních látek – β-laktamová

antibiotika (zahrnující ampicilin, amoxicilin-kyselinu klavulanovou, cefalotin a ceftazidim), streptomycin, sulfonamidy, tetracyklin a chloramfenikol. Byly vybrány antimikrobiální látky, ke kterým bylo vysoké procento E. coli a koliformních bakterií ze 4 skupin izolátů rezistentní,

a u kterých byly popsány vhodné metody detekce determinant této rezistence (Faldynová a kol., 2003; Qin a kol., 2004; Ng a kol., 1999; Sáenz a kol., 2004). V jednotlivých skupinách bakteriálních izolátů rozdělených podle jejich původu bylo vybráno:

48


97 izolátů E. coli a koliformních bakterií izolovaných z mléčných filtrů


35 izolátů E. coli O157 veterinárního původu ze sbírky kultur Ústavu mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno


28 izolátů E. coli a koliformních bakterií izolovaných z potravin


7 izolátů E. coli humánního původu izolovaných ze stolice průjmujících lidí Kromě těchto izolátů byly determinanty rezistence testovány u 8 multirezistentních

izolátů E. coli 0157:H7 izolovaných z rektálních výtěrů koz a ovcí odebraných v Jordánsku.

4.3 Identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S Izoláty získané z mléčných filtrů a potravin, u kterých byla diskovou difuzní

metodou prokázána rezistence k jednomu nebo více typům antimikrobiálních látek, byly

identifikovány testem API 10S. K identifikaci byly přednostně vybrány izoláty určené k průkazu genů antibiotické rezistence. Z ekonomických důvodů nebyla provedena

identifikace u části izolátů (13) koliformních bakterií z mléčných filtrů, které byly rezistentní pouze k některému z β-laktamových antibiotik, a u kterých se předpokládala produkce inducibilní

β-laktamázy. Na základě těchto námi stanovených kritérií byla provedena

identifikace 77 izolátů z mléčných filtrů a 28 izolátů z potravin. Izoláty získané z mléčných

filtrů byly identifikovány jako následující druhy: Citrobacter braakii (17 izolátů), Citrobacter

farmeri (2), Citrobacter freundii (24), Enterobacter aerogenes (2), Enterobacter cloacae (15),

Escherichia coli (11), Escherichia vulneris (1), Klebsiella oxytoca (1), Klebsiella pneumoniae

(1) a Serratia odorifera (3). Kultury izolované z potravin byly identifikovány jako

Enterobacter aerogenes (1), Enterobacter cloacae (1), Escherichia coli (25) a Serratia

mascescens (1).

4.4 Typizace O-antigenů E. coli humánního původu 4.4.1 Typizace antigenu O157 latexovou aglutinací Sedm vybraných rezistentních izolátů E. coli získaných z průjmujících lidí bylo

podrobeno typizaci O-antigenu komerčně dodávaným setem specifickým pro průkaz antigenu 49

O157 (E. coli O157 Latex Test). Pouze u jednoho izolátu E. coli (19/ECS) byl prokázán

antigenu O157. Všechny negativní

izoláty byly podrobeny dalšímu testování O-antigenů

za použití typově specifických O-antisér. Typizaci O-antigenů

touto metodou byl

podroben i izolát 19/ECS pro ověření specifity komerčně dodávaného setu pro průkaz antigenu O157.

4.4.2 Typizace O-antigenů E. coli typově specifickými O-antiséry Výsledky typizace O-antigenů izolátů E. coli humánního původu za použití typově

specifických O-antisér jsou shrnuty v Tabulce 11. U izolátu E. coli 19/ECS byla potvrzena přítomnost antigenu O157. U 4 izolátů se nepodařilo použitými antiséry určit typ O-antigenu.

Tabulka 11: Výsledky typizace O-antigenů humánních izolátů E. coli typově specifickými O-antiséry izolát číslo

O-antigen

19/ECS 305 767 21161 21161N 21164 2628

O157 O7 neprokázán neprokázán neprokázán neprokázán O55

4.5 Průkaz širokospektré β-laktamázy Izoláty určené k průkazu širokospektré β-laktamázy „double-disk synergy testem“

byly nejdříve vybrány pomocí vyhledávacího („screeningového“) testu. K tomuto účelu musela být diskovou difuzní metodou dotestována citlivost k ceftazidimu a to u veterinárních

izolátů E. coli O157 s prokázanou rezistencí k ampicilinu; vycházelo se ze skutečnosti, že

bakterie produkující širokospektrou β-laktamázu jsou rezistentní ke všem β-laktamovým antibiotikům, tedy i k ampicilinu (Bradford, 2001). 50

4.5.1 Vyhledávací („screeningový“) test Celkem 8 bakteriálních izolátů, u kterých byla diskovým difuzním testem získána

zóna v okolí disku s ceftazidimem ≤ 22 mm, bylo považováno za potenciální producenty širokospektré β-laktamázy a na základě doporučení uvedeném v metodických listech NCCLS (M31-A2, 2002) podrobeno „double-disk synergy testu”.

4.5.2 Výsledky „double-disk synergy testu“ Produkce

širokospektré

β-laktamázy

byla

„double

disk-synergy

testem“

prokazována u multirezistentního izolátu E. coli O157 získaného v Jordánsku (EC317) a u 7

izolátů E. coli z potravin. Seznam testovaných izolátů a výsledky testu dokumentují Obrázek

5 a Tabulka 12.

Obrázek 5: Příklady pozitivních a negativních výsledků „double-disk synergy testu“ A. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (vzdálenost středů disků 20 mm)

B. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (vzdálenost středů disků 30 mm)

disk 1…ceftazidim, disk 2…amoxicilin-kyselina klavulanová, disk 3…cefotaxim

51

C. E. coli O157 (EC317) (vzdálenost středů disků 20 mm)




D. E. coli ATTC 25922 (vzdálenost středů disků 30 mm)

Obrázky 5A. – C. dokumentují pozitivní výsledky testu a 5D. výsledek negativní.

Lepší výsledky byly získány při vzdálenosti 20 mm mezi středy disků. Při použití vzdálenosti

30 mm nebyl test jak u pozitivní kontroly (Obrázek 5B.), tak u izolátu EC 317 zcela průkazný.

Tabulka 12: Výsledky „double-disk synergy testu“ číslo izolátu EC317 4/p 6/p1 10/p 12/p 13/p 14/p 15/p1

a

původ izolátu multirezistentní E. coli O157 z Jordánska potraviny potraviny potraviny potraviny potraviny potraviny potraviny

velikost inhibiční zóny v okolí disku CAZ (mm)a

produkce širokospektré β-laktamázyb

13

+

17 19 22 14 22 22 22

-

inhibiční zóny získané diskovým difuzním testem + … produkce širokospektré β-laktamázy byla „double-disk synergy testem“ prokázána - … produkce širokospektré β-laktamázy nebyla „double-disk synergy testem“ prokázána

b

52

4.6 Průkaz inducibilní β-laktamázy Produkce inducibilní β-laktamázy byla testována u 56 izolátů z mléčných filtrů

a 3 izolátů z potravin, které byly rezistentní k jednomu nebo více z testovaných β-

-laktamových antibiotik a identifikovány testem API 10S jako rody Citrobacter, Enterobacter a Serratia. Produkce tohoto enzymu byla rovněž testována u dalších 13 izolátů koliformních

bakterií rezistentních pouze k β-laktamovým antibiotikům, které nebyly z ekonomických důvodu blíže dourčeny.

Příklady získaných pozitivních i negativních výsledků ukazuje Obrázek 6.

Výsledky testu na produkci inducibilní β-laktamázy jsou souborně shrnuty v Tabulce 13.

Obrázek 6: Příklady pozitivních a negativních výsledků testu na produkci inducibilní β-laktamázy

A. Enterobacter cloacae F66

B. Citrobacter freundii F12

disk 1….ceftazidim, disk 2….cefoxitin, disk 3….cefotaxim

53

C. Enterobacter cloacae F113




D. Citrobacter braakii F57

Obrázky 6A. – C. jsou příklady pozitivních výsledků testu pro průkaz inducibilní β-

-laktamázy. Obrázek 6D. dokumentuje negativní výsledek. Data srovnávající schopnost jednotlivých indikátorových antibiotik ceftazidimu a cefotaximu zachytit produkci inducibilní

β-laktamázy nejsou ve výsledcích zahrnuta. V průběhu testování se však ukázalo, že v mnoha

případech je lepším indikátorovým antibiotikem ceftazidim, což je možné vidět na Obrázku

6D., kde ke zřetelné zmenšení a zcela jasné deformaci inhibiční zóny v důsledku produkce inducibilní β-laktamázy došlo pouze v okolí disku s ceftazidimem.

Tabulka 13: Výsledky průkazu inducibilní β-laktamázy u vybraných izolátů z mléčných filtrů a potravin

testovaný izolát (počet) C. braakii (15) C. farmeri (1) C. freundii (21) E. aerogenes (2) E. cloacae (16) S. marcescens (1) S. odorifera (3) neidentifikované koliformní bakterie (13)

počet izolátů s prokázanou produkcí inducibilní β-laktamázy (%) 9 (60 %) 1 (100 %) 17 (81 %) 2 (100 %) 12 (75 %) 1 (100 %) 1 (33,3 %) 13 (100 %) 56 (77,8 %)

celkem (72)

54

4.7 Průkaz genů antibiotické rezistence metodou PCR Metodou PCR byly prokazovány geny odpovědné za rezistenci k β-laktamovým

antibiotikům, tetracyklinu, streptomycinu, sulfonamidům a chloramfenikolu u 4 skupin

izolátů. Přehled vyšetřovaných izolátů včetně jejich charakteristiky a prokázaných genů antibiotické rezistence je uveden v Přílohách 1 – 4.

4.7.1 Průkaz genů rezistence k β-laktamovým antibiotikům Genetické determinanty rezistence k β-laktamovým antibiotikům byly testovány u

izolátů E. coli a koliformních bakterií rezistentních k jednomu nebo více testovaným β-

-laktamovým antibiotikům s výjimkou izolátů rodů Citrobacter, Enterobacter, Serratia a jiných blíže neurčených koliformních bakterií s prokázanou produkcí inducibilní β-

-laktamázy (viz. Tabulka 13). Byly použity primery specifické pro geny blaTEM, blaOXA

a blaSHV. Výsledky PCR dokumentují Obrázky 7 a 8 a dále Tabulka 14.

Obrázek 7: Gelová elektroforéza PCR produktů získaných amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro gen blaTEM

běh číslo

vzorek

1

pozitivní kontrola (S. Typhimurium 110/9)

3

F2

2 4 5 6 7 8 9

negativní kontrola (E. coli ATTC 25922) F21

F103 5/p1 7/p

+ -

(E. coli / mléčné filtry)

+

(E. cloacae / mléčné filtry)

+

(C. freundii / mléčné filtry)

(E. coli / potraviny) (E. coli / potraviny)

100 bp DNA marker

EC78 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

10

EC202 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

12

19/ECS (E. coli / humánní izoláty)

11

přítomnost PCR produktu

EC250 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

-

+ + -

+

+

+

55




Obrázek 8: Gelová elektroforéza PCR produktů získaných amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro gen blaOXA

běh číslo 1

přítomnost PCR produktu

vzorek 100 bp DNA marker

2

negativní kontrola (E. coli ATTC 25922)

-

4

F118

+

3 5 6 7 8

EC78 (E. coli O157 / veterinární izoláty) F134

-

(E. coli / mléčné filtry) (E. coli / mléčné filtry)

+

EC186 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

-

EC187 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

-

EC266 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

-

Tabulka 14: Zastoupení genů rezistence k β-laktamovým antibiotikům u 4 skupin izolátů

skupina izolátů (počet) mléčné filtry (29)

E. coli O157 veterinárního původu (21) potraviny (21)

E. coli humánního původu (5) celkem (76)

gen blaTEM

blaOXA

blaSHV

neprokázán

8 (27,6 %)

2 (6,9 %)

0

19 (65,5 %)

6 (28,6 %)

0

0

15 (71,4 %)

21 (100 %)

0

0

0

5 (100 %)

0

0

0

40 (52,7 %)

2 (2,6 %)

0

34 (44,7 %)

56




Nejčastěji detekovaným genem u všech 4 skupin izolátů byl gen blaTEM, který byl

prokázan u téměř 53 % izolátů rezistentních k některému z β-laktamových antibiotik.

Determinantu rezistence k β-laktamovým antibiotikům se u všech izolátů z potravin a izolátů E. coli humánního původu podařilo prokázat, ve všech případech byl detekován gen blaTEM. U 2 izolátů z mléčných filtrů se podařilo prokázat gen blaOXA; gen blaSHV nebyl detekován

u žádného z testovaných izolátů. U velkého počtu izolátů E. coli O157 veterinárního

původu a E. coli a koliformních bakterií z mléčných filtrů se nepodařilo detekovat žádný

ze 3 testovaných genů.

4.7.2 Průkaz genů rezistence k tetracyklinu Geny tet byly prokazovány u všech izolátů označených diskovou difuzní metodou

jako rezistentní k tetracyklinu. Byly použity primery specifické pro následující geny: tetA, tetB, tetC, tetD, tetE a tetG. Výsledky PCR reakce dokumentují Obrázek 9 a Tabulka 15.

Obrázek 9: Gelová elektroforéza PCR produktů získaných amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro geny tetA a tetB

57

běh číslo 1 2

pozitivní kontrola (S. Typhimurium 109/2) negativní kontrola (E. coli ATTC 25922)

4

1/p1

(E. coli / potraviny)

C3604

(E. coli / potraviny)

3 5 6 7 8 9

10 11

přítomnost PCR produktu + -

vzorek

F68

5/p1 9/p2

EC78

(C. freundii / mléčné filtry

+ -

(E. coli / potraviny)

+

(E. coli / potraviny)

+

(E. coli 0157 / veterinární izoláty)

-

EC250 (E. coli 0157 / veterinární izoláty)

+

EC116 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

100 bp DNA marker

+

pozitivní kontrola (S. Typhimurium F8352)

+

14

F118

(E. coli / mléčné filtry)

+

F174

(E. cloacae / mléčné filtry)

-

15 16 17 18 19 20

negativní kontrola (E. coli ATTC 25922) F164 F186

+

(C. freundii / mléčné filtry)

+

(E. coli / potraviny)

-

(E. coli / potraviny)

7/p

(E. coli / potraviny)

5/p1

-

(E. aerogenes / mléčné filtry)

13/p

tetA

+

12 13

prokazovaný gen

tetB

+ +

Tabulka 15: Zastoupení genů tet u 4 skupin izolátů rezistentních k tetracyklinu

skupina izolátů (počet) mléčné filtry (32)

E. coli O157 veterinárního původu (4) potraviny (14)

E. coli humánního původu (1) celkem (51)

gen tetA

tetB

tetD

neprokázán

9 (28,1 %)

19 (59,4 %)

0

4 (12,5 %)

2 (50 %)

0

1 (25 %)

1 (25 %)

10 (71,4 %)

4 (28,6 %)

0

0

0

1 (100 %)

0

0

21 (41,2 %)

24 (47 %)

1 (2 %)

5 (9,8 %)

58




U 90 % izolátů rezistentních k tetracyklinu se některý z testovaných genů tet

podařilo prokázat. Nejfrekventovanějšími geny rezistence k tetracyklinu byly tetA a tetB. U

více než poloviny izolátů z mléčných filtrů byl detekován gen

tetB. U E. coli

a koliformních bakterií izolovaných z potravin byl ve vysoké frekvenci prokázán gen tetA.

Gen tetD byl detekován u jednoho izolátu, tedy pouze u 2 % ze všech testovaných izolátů

rezistentních k tetracyklinu. Geny tetC, tetE a tetG nebyly prokázány. U žádného izolátů nebyla zjištěna přítomnost dvou a více genů tet.

4.7.3 Průkaz genů rezistence ke streptomycinu U izolátů označených diskovou difuzní metodou jako rezistentní ke streptomycinu

byly prokazovány geny strA a aadA. Výsledky gelové elektroforézy PCR produktů získaných

amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro geny strA a aadA

dokumentují Obrázky 10 a 11. Zastoupení genů strA a aadA u testovaných izolátů rezistentních ke streptomycinu přehledně shrnuje Tabulka 16.

Obrázek 10: Gelová elektroforéza PCR produktů získaných amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro gen strA

běh číslo

vzorek

1

pozitivní kontrola (S. Typhimurium 110/9)

3

F8

2 4 5 6 7 8 9

negativní kontrola (E. coli ATTC 25922) F10

(E. coli / mléčné filtry)

(E. cloceae / mléčné filtry)

F110 (E. coli / mléčné filtry)

přítomnost PCR produktu

+ -

+

+ -

F116 (S. odorifera / mléčné filtry)

+

F134 (E. coli / mléčné filtry)

-

100 bp DNA marker

1/p1

(E. coli / potraviny)

+

(E. coli 0157 / veterinární izoláty)

+

10 C9271 (E. coli / potraviny) 11 EC6 12 EC9

(E. coli 0157 / veterinární izoláty)

-

+

59

Obrázek 11: Gelová elektroforéza PCR produktů získaných amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro gen aadA

běh číslo

vzorek

1

pozitivní kontrola (S. Typhimurium 110/2)

3

F2

2

přítomnost PCR produktu

+

negativní kontrola (E. coli ATTC 25922)

-

(E. coli / mléčné filtry)

+

F66

(E. cloacae / mléčné filtry)

+

F88

(E. coli / mléčné filtry)

-

8

10/p

(E. coli / potraviny)

+

10

15/p1 (E. coli / potraviny)

+

12

EC116 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

+

4 5 6 7 9

11

F118 (E. coli / mléčné filtry)

4/p

EC6

+

100 bp DNA marker

(E. coli / potraviny)

-

(E. coli O157 / veterinární izoláty)

Tabulka 16: Zastoupení

ke streptomycinu

skupina izolátů (počet)

-

genů strA a aadA u 4 skupin izolátů rezistentních

gen strA

aadA

strA+aadA

neprokázán

32 (82,1 %)

3 (7,7 %)

2 (5,1 %)

2 (5,1 %)

6 (100 %)

0

0

0

potraviny (14)

8 (57,2 %)

3 (21,4 %)

3 (21,4 %)

0

E. coli humánního původu (7)

7 (100 %)

0

0

0

53 (80,3 %)

6 (9,1 %)

5 (7,6 %)

2 (3 %)

mléčné filtry (39) E. coli 0157 veterinárního původu (6)

celkem (66)

60




Pouze u 2 izolátů E. coli a koliformních bakterií z mléčných filtrů, tedy u 3 %

izolátů rezistentních ke streptomycinu, se nepodařila prokázat přítomnost žádného z genů

strA a aadA. Gen strA byl prokázán u většiny izolátů rezistentních ke streptomycinu, naproti

tomu gen aadA se vyskytoval v nižší frekvenci a nebyl prokázán u žádného z izolátů E. coli

O157 veterinárního původu a E. coli humánního původu rezistentních ke streptomycinu.

Vysoký výskyt genu aadA a kombinace genů strA + aadA byl zaznamenán u izolátů E. coli z potravin.

4.7.4 Průkaz genů rezistence k sulfonamidům Izoláty rezistentní k sulfonamidům byly podrobeny PCR reakci pro průkaz genů sul1

a sul2. Výsledky gelové elektroforézy specifických PCR produktů dokumentují Obrázky 12

a 13. Zastoupení genů sul1 a sul2 u 4 skupin izolátů shrnuje Tabulka 17.

Obrázek 12: Gelová elektroforéza PCR produktů získaných amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro gen sul1

běh číslo

Vzorek

přítomnost PCR produktu

1

pozitivní kontrola (S. Typhimurium 110/2)

+

3

F66

(E. cloacae / mléčné filtry)

+

(E. coli / mléčné filtry)

-

2 4 5 6 7 8 9

negativní kontrola (E. coli ATTC 25922) F110 F195

(E. coli / mléčné filtry)

-

+

EC116 (E. coli O157 / veterinární izoláty)

+

EC6

-

C3604

10 C9277 11 8/p

12 10/p

100 bp DNA marker (E. coli O157 / veterinární izoláty) (E. coli / potraviny)

+

(E. coli / potraviny)

-

(E. coli / potraviny)

(E. coli / potraviny)

+ -

61

Obrázek 13: Gelová elektroforéza PCR produktů získaných amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro gen sul2

běh číslo

přítomnost PCR produktu

vzorek

1

pozitivní kontrola (S. Typhimurium 110/9)

+

3

F2

+

2 4 5 6 7 8 9

negativní kontrola (E. coli ATTC 25922) (E. coli / mléčné filtry)

F10

(E. cloacae / mléčné filtry)

+

F68

(C. freundii / mléčné filtry)

+

F20 F110 F105

(E. cloacae / mléčné filtry)

+ -

100 bp DNA marker

(E. coli / mléčné filtry)

12

EC6

(E. coli O157 / veterinární izoláty)

5/p1

(E. coli / potraviny)

13 14 15 16 17 18 19

EC9

6/p2 8/p

13/p

-

(E. coli / mléčné filtry)

F134 F184

+

(E. coli / mléčné filtry)

10 11

-

(C. freundii / mléčné filtry)

+

(E. coli O157 / veterinární izoláty)

-

+

+

(E. coli / potraviny)

+

(E. coli / potraviny)

-

(E. coli / potraviny)

+

C3604 (E. coli / potraviny)

+

C9277 (E. coli / potraviny)

-

62

Tabulka 17: Zastoupení genů sul1 a sul2 u 4 skupin izolátů rezistentních

k sulfonamidům

skupina izolátů (počet) mléčné filtry (19)

E. coli O157 veterinárního původu (17) potraviny (14)

E. coli humánního původu (4) celkem (54)




gen sul1

sul2

sul1+sul2

neprokázán

4 (21,1 %)

14 (73,7 %)

0

1 (5,2 %)

1 (5,9 %)

16 (94,1 %)

0

0

4 (28,6 %)

7 (50 %)

2 (14,3 %)

1 (7,1 %)

0

4 (100 %)

0

0

9 (16,7 %)

41 (75,9 %)

2 (3,7 %)

2 (3,7 %)

Kromě 2 izolátů E. coli a koliformních bakterií z mléčných filtrů a potravin se

podařilo prokázat jeden nebo oba z genů sul1 a sul2. Rezistence k sulfonamidům u většiny

izolátů byla způsobena přítomností genu sul2, gen sul1 se vyskytoval v nižší frekvenci.

U izolátů z mléčných filtrů a potravin byl v porovnání s ostatními skupinami izolátů zaznamenán vyšší výskyt genu sul1. Přítomnost obou genů byla prokázána pouze u 2 (3,7 %)

izolátů.

4.7.5 Průkaz genů rezistence k chloramfenikolu Pro průkaz determinant rezistence k chloramfenikolu metodou PCR byly použity

primery specifické pro geny cat a cmlA. Tyto geny byly prokazovány pouze u izolátů

z mléčných filtrů a potravin, neboť u zbylých 2 skupin izolátů nebyla rezistence k chloramfenikolu zaznamenána. Výsledky gelové elektroforézy PCR produktů vzniklé

amplifikací DNA sekvence primery specifickými pro gen cat dokumentuje Obrázek 14. Výsledky detekce genů rezistence k chloramfenikolu přehledně shrnuje Tabulka 18.

63

Obrázek 14: Gelová elektroforéza PCR produktů získaných amplifikací DNA sekvence za použití primerů specifických pro gen cat

běh číslo

Vzorek

přítomnost PCR produktu

1

pozitivní kontrola (S. Typhimurium 109/2)

+

3

F2

+

2 4 5 6 7 8 9

10

negativní kontrola (E. coli ATTC 25922)

-

(E. coli / mléčné filtry)

F20 (E. cloacae / mléčné filtry)

+

F68 (C. freundii / mléčné filtry)

+

F66 (E. cloacae / mléčné filtry)

+

2/p1 (E. coli / potraviny)

+

14/p (E. coli / potraviny)

+

13/p (E. coli / potraviny)

+

100 bp DNA marker

Tabulka 18: Zastoupení genu cat u izolátů z mléčných filtrů a potravin rezistentních k chloramfenikolu

skupina izolátů (počet)

gen cat

cmlA

neprokázán

mléčné filtry (15)

13 (86,7 %)

0

2 (13,3 %)

celkem (19)

17 (89,5 %)

0

2 (10,5 %)

potraviny (4)




4 (100 %)

0

0

Rezistence k chloramfenikolu byla u 89,5 % testovaných izolátů podmíněna

přítomností genu cat. Gen cmlA nebyl detekován. Ve dvou případech se nepodařilo použitými

primery determinantu rezistence k chloramfenikolu určit. 64

4.7.6 Průkaz genu int1 a integronu třídy 1 Gen int1 kódující integrázu 1 a integron třídy 1 (oblast 5’-3’CS) byly prokazovány

pouze u vybraných rezistentních izolátů. Za kritérium výběru byla zvolena přítomnost genu

aadA nebo genu sul1 popřípadě přítomnost obou genů prokázaná metodou PCR (viz. výše), neboť tyto geny jsou specifickou součástí integronu třídy 1 (Carattoli, 2001; Fluit a Schmitz, 1999; Guerra a kol., 2003).

Tabulka 19 shrnuje výsledky detekce genu int1 a integronů u testovaných izolátů

včetně podrobné charakteristiky těchto izolátů.

4.7.7 Průkaz genových kazet integronu U izolátů s prokázaným genem sul1 citlivých ke streptomycinu byla z důvodu

kompletní charakteristiky struktury integronu dotestována přítomnost genové kazety aadA,

neboť bylo prokázáno, že exprese této genové kazety uvnitř integronu může být nízká

a nezpůsobí tak rezistenci ke streptomycinu (Lanz a kol., 2003). Gen aadA byl tak prokázán

u 3 z 5 izolátů obsahujících integron a citlivých ke streptomycinu.

U 7 izolátů s prokázaným integronem o velikosti větší než 1 kb, v jejichž struktuře

integronu se předpokládala přítomnost dalších genů kromě kazety aadA, byla za použití

specifických primerů testována přítomnost jedné z nejobvyklejších genových kazet integronů

třídy 1 – kazety dfr1, jejíž produkt podmiňuje rezistenci k trimetoprimu (Guerra a kol., 2003).

Přítomnost této genové kazety byla prokázána u 3 izolátů z potravin obsahujících integron o velikosti 1,6 kb. Výsledky detekce této kazety jsou součástí Tabulky 19.

65

Tabulka 19: Seznam izolátů použitých pro průkaz genu int1 a integronu včetně jejich

podrobné charakteristiky a prokázaných genů antibiotické rezistencea

Izolát číslo F2

identifikace původb

fenotyp integron antibiotické int1 (velikost sul1 aadA PCR rezistence c produktu)

jiné detekované geny antibiotické rezistence

MF

ACSSuSxtT

-

-

-

+

blaTEM, cat, sul2, tetB

MF

KfS

-

-

-

+

-

P

S

-

-

-

+

-

MF AAcCKfSSuT +

1 kb

+

+

cat, strA, tetB

MF

ACSSuT

+

1 kb

+

+

cat, tetB

EC116 E. coli O157

VI

SuT

+

1 kb

+

+

tetA

C9277

E. coli

P

SSu

+

1 kb

+

+

-

C10032

E. coli

P

ASSu

+

1 kb

+

+

blaTEM

F103

E. cloacae

MF

ACKfST

+

1 kb

-

+

blaTEM, cat, strA, tetA

15/p1

E. coli

P

ASSuT

+

1,6 kb

+

+

blaTEM, strA, sul2, tetA, dfr1

C3604

E. coli

P

ASSuT

+

1,6 kb

+

+

blaTEM, strA, sul2, tetA, dfr1

10/p

E. coli

P

ASSuT

+

1,6 kb

-

+

blaTEM, strA, sul2, tetA, dfr1

F118

E. coli

MF

ACSuT

+

2 kb

+

+

blaOXA, cat, tetB

F134

E .coli

MF

ACSuT

+

2 kb

+

+

blaOXA, cat, tetB

13/p

E. coli

P

ACSuT

+

2 kb

+

-

blaTEM, cat, tetB

14/p

E. coli

P

ACSuT

+

2 kb

+

-

blaTEM, cat, tetB

E. coli

F183 E. aerogenes C9271

E. coli

F66

E. cloacae

F110

E. coli

+…gen (integron) byl metodou PCR prokázán, -… gen nebyl metodou PCR prokázán MF = mléčné filtry, P = potraviny, VI = E. coli O157 veterinárního původu c A = ampicilin, Ac = amoxicilin-kyselina klavulanová, C = chloramfenikol , Kf = cefalotin, T = tetracyklin, S = streptomycin, Su = sulfonamidy, Sxt = trimetoprim-sulfmetoxazol a

b

66

Výsledky detekce integronu, genu int1 a genových kazet podrobně popsané v Tabulce 19

je možné shrnout do následujících bodů:


Gen int1 byl prokázán celkem u 81 % (13/16) vybraných izolátů, tedy u 8 % z celkového

počtu 167 rezistentních izolátů. U všech 13 izolátů s prokázaným genem int1 byl

detekován i integron třídy 1 (oblast 5’-3’CS) o velikosti 1 kb (6 izolátů), 1,6 kb (3) a 2 kb (4). Integron byl prokázán u 7 izolátů E. coli z potravin, tedy u 25 % ze všech

rezistentních

izolátů z tohoto materiálu, dále u 5 (5,2 %) rezistentních E. coli

a koliformních bakterií z mléčných filtrů a 1 (2,9 %) rezistentního izolátu E. coli O157

veterinárního původu. U žádného izolátu E. coli humánního původu nebyla přítomnost

integronu zjištěna.


U 2 izolátů z mléčných filtrů (F2 a F183) a jednoho izolátu z potravin (C9271) s prokázaným genem aadA nebyla zjištěna přítomnost genu int1 ani integronu třídy 1.

Tyto izoláty neobsahovaly ve svém genomu ani gen sul1.




U všech izolátů obsahujících integron o velikosti 1 kb byla zjištěna přítomnost genu aadA. Genové kazety aadA a dfr1, byly prokázány u všech 3 izolátů s integronem o velikosti 1,6 kb.




Byly prokázány 2 typy integronů o velikosti 2 kb u 4 izolátů (F118, F134, 13/p a 14/p). U izolátů E. coli F118 a F134 z mléčných filtrů byl nalezen integron o velikosti 2

kb a zároveň genom obou těchto izolátů obsahoval geny aadA a blaOXA. U izolátů E.

coli 13/p a 14/p z potravin, které byly mimo jiné citlivé ke streptomycinu, nebyla přítomnost genu aadA prokázána.


U testovaných izolátů byla zjištěna závislost mezi přítomností genů sul1, aadA , int1 a integronu. U všech izolátů obsahujících gen sul1 byl detekován gen int1 a integron. Obdobně u 79 % (11/14) izolátů s prokázaným genem aadA byl zjištěn i gen int1 a integron. U 85 % (11/13) izolátů s prokázaným genem int1 a integronem byl zjištěn gen sul1. Podobná závislost byla potvrzena u genu aadA; u 85 %(11/13) izolátů s genem

int1 a integronem byl nalezen gen aadA. U 68 % (9/13) izolátů s prokázaným

integronem a genem int1 byl zjištěn gen sul1 a současně i gen aadA.




Byly zachyceny 3 izoláty citlivé ke streptomycinu, u kterých byl detekován gen aadA (EC116, F118 a F134).

67

4.8 Průkaz genů antibiotické rezistence a integronu u multirezistentních izolátů E. coli O157:H7 izolovaných v Jordánsku

U 8 multirezistentních izolátů E. coli O157:H7 získaných z ovcí a koz v Jordánsku

byly metodou PCR se specifickými primery prokazovány geny antibiotické rezistence; výsledky jsou shrnuty v Tabulce 20.

Tabulka 20: Seznam multirezistentních izolátů E. coli O157:H7 z Jordánska, fenotyp jejich antibiotické rezistence a prokázané genetické determinanty této rezistence. číslo izolátu

fenotyp antibiotické rezistencea

EC313

ACSSuT

EC312

EC314

EC315

ACSSuT

blaTEM, cat, strA, sul2, tetA

ACSSuT

blaTEM, cat, strA, sul2, tetA

blaTEM, cat, strA, sul2, tetA

ACSSuT

EC316

ACSSuT

EC317

AacKfCCazCnSSuSxtT

EC318

ACSSuT

EC319

prokázané geny

blaTEM, cat, strA, sul2, tetA

blaTEM, cat, strA, sul2, tetA

blaTEM, cat, strA, aadA, sul1, sul2, tetA, int1, integron (1 kb) blaTEM, cat, strA, sul2, tetA

AAcCSSuSxtT

blaTEM, cat, strA, sul2, tetA

A = ampicilin, Ac = amoxicilin-kyselina klavulanová, Kf = cefalotin, C = chloramfenikol, Caz = ceftazidim, Cn = gentamycin, S = streptomycin, Su = sulfonamidy, Sxt = trimetoprim-sulfmetoxazol, T = tetracyklin

a




U 6 multirezistentních izolátů E. coli O157:H7 (EC 312-316 a EC318) byl prokázán

identický fenotyp antibiotické rezistence a byly detekovány shodné geny odpovědné za tuto rezistenci. Odlišné z hlediska fenotypu a genotypu antibiotické rezistence byly izoláty EC317 a EC319. Izobát EC319 se lišil od výše popsaných 6 izolátů fenotypem rezistence, ale byly

u něj prokázány totožné geny rezistence. Bylo zjištěno, že jedinečné postavení mezi 8 jordánskými izoláty má izolát EC317 rezistentní k celkem 10 testovaným antimikrobiálním

látkám, u kterého byly na rozdíl od ostatních izolátů prokázány navíc geny aadA, sul1, int1

a integron o velikosti 1 kb a dále širokospektrá β-laktamáza (viz. kapitola 4.5.2). 68

5. DISKUZE Antibiotická rezistence je v posledních letech hlavním tématem v oblasti

antimikrobiální terapie lidí i zvířat, ale i mnohých epidemiologických studií zaměřujících se

na poznání výskytu, zdrojů a cest šíření rezistentních klonů bakterií v různém prostředí. Pozornost je věnována mechanizmům rezistence k antimikrobiálním látkám, hledání genů

odpovědných za tuto rezistenci a studiu možnosti jejich přenosu mezi bakteriemi. Jsou hledány a zkoumány tzv. indikátorové druhy bakterií, jejichž monitorování dává informace o stavu a vývoji antimikrobiální rezistence v populacích člověka, zvířat a jejich prostředí. Takovými mikroorganizmy jsou například Escherichia coli a koliformní bakterie. Rezistentní

bakterie se mohou ze zvířat šířit do volné přírody a také k člověku prostřednictvím potravinových produktů, dále z lidské populace, kde dochází k dalšímu selekčnímu tlaku antibiotik, se rezistentní bakterie dostávají do prostředí a k organizmům, které běžně do kontaktu s antibiotiky nepřichází.

Do současnosti bylo prostudováno mnoho mechanizmů antibiotické rezistence

bakterií a nalezeno velké množství genů odpovědných za tuto rezistenci. V mnohých případech je tedy velmi obtížné determinantu rezistence přesně prokázat. K tomuto účelu bylo

vyvinuto mnoho metod. Problémem však zůstává, že některé z nich z důvodu jejich časové

náročnosti a finančních nákladů nelze v běžné praxi v klinických laboratořích použít. A právě

v terapii člověka je přesný a rychlý průkaz citlivosti popřípadě rezistence původce nákazy kritický.

5.1

Antibiotická rezistence vyšetřovaných izolátů a její vztak ke spotřebě

antimikrobiálních látek v ČR

Procentuální výskyt antibiotické rezistence u 4 skupin izolátů rozdělených podle

původu není možné mezi sebou blíže porovnávat, což ani nebylo cílem této práce. Odlišnosti ve frekvenci výskytu rezistentních izolátů v jednotlivých skupinách mohou být způsobeny několika faktory – skupiny jsou různě velké, jsou tvořeny různými druhy bakterií a pochází

s různých prostředí. Bylo prokázáno, že antibiotická rezistence úzce souvisí s množstvím

a druhem aplikované antimikrobiální látky v daném chovu nebo u daných pacientů, která vede 69

v různé míře k selekci bakterií rezistentních k dané substanci (Schwarz a Chaslus-Dancla,

2001). Vyšetřované bakteriální izoláty však mají společné to, že β-laktamová antibiotika následovaná tetracyklinem, streptomycinem a sulfonamidy patřila mezi antimikrobiální látky,

ke kterým byla velká část izolátů rezistentní. Frekvence výskytu rezistence vyšetřovaných izolátů pravděpodobně souvisí s aplikací antibiotik u potravinových zvířat a lidí, ze kterých

naše izoláty pochází. Tuto hypotézu částečně potvrzují údaje týkající se spotřeby antibiotik

ve veterinární medicíně v České republice v roce 2004, podle kterých jsou tetracykliny nejčastěji aplikovaná antibiotika při léčbě bakteriálních infekcí a jsou následovány β-

-laktamovými antibiotiky, diterpeny, sulfonamidy a makrolidy (Hera a kol., 2005). Na základě informací získaných ze Státního zdravotního ústavu pro kontrolu léčiv v Praze byla v humánní medicíně v roce 2004 používána nejvíce β-laktamová antibiotika, dále tetracykliny a sulfonamidy (Ing. Višňovská, písemné sdělení). Některé naše izoláty však byly

získány před rokem 2004 a pro srovnání vztahu mezi výskytem rezistentních izolátů a spotřebou antibiotik byla použita pouze data z roku 2004, proto výše zmíněné souvislosti lze jen předpokládat. Pro přesnější srovnání tohoto vztahu by bylo nutné použít data týkající

se spotřeby antibiotik v humánní a veterinární medicíně v jednotlivých letech, ze kterých dané

skupiny izolátů pochází. Různé evropské studie rovněž potvrzují, že β-laktamová antibiotika, tetracykliny, sulfonamidy a streptomycin jsou nejčastějšími antibiotiky, ke kterým jsou

izoláty E. coli získané z humánního a veterinárního materiálu i z potravin a prostředí

rezistentní (Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Sáenz a kol., 2004; Van den Bogaard a kol., 2000).

Přestože aminoglykosidy, mezi které patří i streptomycin, nejsou příliš používanými

antibiotiky v humánní (Ing. Visňovská, písemné sdělení) ani ve veterinární medicíně (Hera

a kol., 2005), bylo zachyceno velké procento bakterií rezistentních ke streptomycinu ve všech

4 vyšetřovaných skupinách izolátů rozdělených podle původu. Bylo prokázáno, že některé determinanty rezistence, například geny odpovědné za rezistenci k sulfonamidům, streptomycinu i jiné geny rezistence, jsou lokalizovány na stejných plazmidech a v důsledku

selekčního tlaku spojeného s častým použitím sulfonamidů a jiných antimikrobiálních látek při terapii zvířat a člověka dochází automaticky i k selekci bakterií rezistentních

ke streptomycinu (Huovinen a kol.,1995; Rådström a kol., 1991). Tato společná selekce genů antibiotické rezistence může být vysvětlením našich výsledků.

Zajímavým byl záchyt E. coli a koliformních bakterií z mléčných filtrů a potravin

rezistentních k chloramfenikolu. Použití chloramfenikolu u potravinových zvířat bylo v roce 70

1994 v Evropě zakázáno (Arcangioli a kol., 1999). I přes odstranění selekčního tlaku vyvolaného aplikací chloramfenikolu v chovech, jsou ze zvířat i dnes izolovány bakterie

rezistentní k tomuto antibiotiku. Sáenz a kol. (2001) a Lanz a kol. (2003) prokázali rezistenci k chloramfenikolu u 8 – 10 % izolátů E. coli získaných ze skotu, prasat a potravin.

5.2 Vyhodnocení antibiotické rezistence jednotlivých skupin izolátů a její srovnání s jinými studiemi

U E. coli a koliformních bakterií z mléčných filtrů odebraných na farmách mléčného

skotu byla zjištěna vysoká frekvence výskytu rezistentních izolátů (48 %); i jiné studie dokumentují vysoký výskyt rezistentních izolátů E. coli u skotu (Asai a kol., 2005;

DeFrancesco a kol., 2004; Guerra a kol., 2003; Kijima-Tanaka a kol., 2003). Srovnatelnou

frekvenci výskytu rezistence k ampicilinu, streptomycinu a tetracyklinu u izolátů E. coli pocházejících ze skotu prokázali Lanz a kol. (2003) a to přibližně u 20 % izolátů. Oproti našim izolátům z mléčných filtrů, kterých bylo více 26 – 30 % rezistentních k amoxicilinu

s kyselinou klavulanovou a cefalotinu, tito autoři rezistenci k těmto antibiotikům vůbec

nezaznamenali. Rozdíl je s největší pravděpodobností způsoben tím, že soubor našich izolátů tvoří především koliformní bakterie rodů Enterobacter a Citrobacter, u kterých je rezistence

k β-laktamovým antibiotikům způsobena především produkcí inducibilních β-laktamáz, které oproti neinducibilním β-laktamázám E. coli rozkládají účinněji cefalosporiny než ampicilin a jsou rezistentní k inhibitorům β-laktamáz (kyselině klavulanové) (Livermore, 1995).

Bylo rovněž prokázáno vysoké procento rezistentních izolátů E. coli potravin

(41 %), rezistentní izoláty pocházely převážně ze syrového popřípadě tepelně upraveného drůbežího a vepřového masa. Některé studie potvrzují, že antibiotická rezistence izolátů E. coli získaných z prasat a drůbeže je ve srovnání s izoláty z jiných zvířat mnohem vyšší

(Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Sáenz a kol., 2001). Původ rezistentních bakterií je tedy možné hledat u zvířat, ze kterých daný potravinový produkt pochází, a u kterých byla pravděpodobně ve větší míře aplikována antibiotika. Ke kontaminaci rezistentními bakteriemi

však mohlo dojít i při hrubém porušení technologických postupů výroby potravin. Nelze

vyloučit ani kontaminaci rezistentními bakteriemi u potravin, při jejichž výrobě není užito tepelné opracování, například tepelně neopracované masné výrobky, syrové mléko a podobně.

Vysoký výskyt antibiotické rezistence u našich izolátů je možné srovnat s několika zahraničními studiemi. Podobných výsledků dosáhli Sáenz a kol. (2001), kteří prokázali 71

rezistenci k ampicilinu u 47 % a k amoxicilinu s kyselinou klavulanovou u 13 % izolátů E. coli získaných z potravin. Tito autoři rovněž zjistili vysoký výskyt rezistence ke kyselině

nalidixové a trimetoprimu-sulfmetoxazolu, kterou jsme rovněž zaznamenali u našich izolátů. Rezistence k sulfonamidům byla prokázána u 20 % našich izolátů E. coli z potravin a stejných

výsledků dosáhli i Hammerum a kol. (2006) u izolátů E. coli z vepřového masa.

Nízký záchyt rezistentních izolátů E. coli O157 (12 %) ze sbírky kultur Ústavu

mikrobiologie a imunologie FVL VFU Brno získaných ze skotu lze porovnat s výsledky

Wilkersona a kol. (2004), kteří zachytili pouze 7 % izolátů E. coli O157:H7 rezistentních

alespoň k jedné z testovaných antimikrobiálních látek. Frekvenci výskytu rezistence k jednotlivým antibiotikům je možné srovnat s několika studiemi, ve kterých byla rezistence

k ampicilinu, streptomycinu, tetracyklinu a sulfonamidům prokázána u 2 – 7 % izolátů E. coli O157 (Galland a kol., 2001; Kim a kol., 1994; Schroeder a kol., 2002). Ve většině studií

ve srovnání s naší a výše zmíněnými pracemi byl u izolátů E. coli O157 získaných ze zvířat prokázán mnohem vyšší výskyt rezistence a to až u 70 % izolátů (Meng a kol., 1998; Mora a kol., 2005; Murinda a kol., 2005; You a kol., 2006).

Procentuální výskyt rezistence u izolátů E. coli izolovaných ze stolice průjmujících

lidí se velmi blíží výsledkům Schroedera a kol. (2002), kteří studovali výskyt antibiotické rezistence u izolátů E. coli O157 humánního původu. Bližší srovnání s touto prací a jinými

studiemi však není možné, neboť u většiny našich izolátů se nepodařilo prokázat O-antigen a zařadit je tak do některé ze 4 skupin patogenních E. coli (EPEC, EIEC, ETEC

a STEC). Dalším problémem, který znesnadňuje srovnání, je poměrně malý soubor izolátů. Pro ověření, zda naše izoláty patří mezi STEC by bylo nutné otestovat jejich růst na MacConkeyho agaru se sorbitolem pro ověření neschopnosti fermentovat tuto látku a dále provést průkaz Shiga toxinů popřípadě jiných faktorů virulence.

5.3 Průkaz determinant antibiotické rezistence 5.3.1 Průkaz širokospektré β-laktamázy Produkce širokospektré β-laktamázy „double-disk synergy testem” nebyla prokázána

u žádného z izolátů E. coli a koliformních bakterií rezistentních k některému z testovaných

β-laktamových antibiotik, které byly izolovány v České republice. Tento výsledek pravděpodně odráží racionální antibiotickou terapii ve veterinární i humánní oblasti v naší 72

zemi. Stejně jako Thomson a Sanders (1992) jsme prokázali, že tento specifický test je citlivější při vzdálenosti 20 mm mezi středy antibiotických disků oproti 30 mm.

5.3.2 Průkaz inducibilní β-laktamázy Test na průkaz produkce inducibilní β-laktamázy, který popsali Qin a kol. (2004), je

velmi jednoduchým a poměrně spolehlivým testem. V některých případech je však obtížné posoudit jeho výsledek (zda došlo či nedošlo ke zmenšení inhibiční zóny v okolí indikátorových disků). Inducibilní β-laktamázy jsou kromě β-laktamových antibiotik s úzkým

spektrem účinku schopné hydrolyzovat i cefalosporiny 2. a 3. generace a aztreonam. Všechny testované izoláty byly citlivé k cefalosporinovému antibiotiku ceftazidimu a u témeř 78 %

těchto citlivých izolátů byla zjištěna produkce inducibilní β-laktamázy. Naše výsledky tedy potvrzují skutečnost, že rezistentní bakterie produkující tyto enzymy není možné standardními

dilučními nebo difuzními metodami odhalit. Podle Koláře a kol. (2002) však nemusí inducibilní produkce těchto enzymů znamenat neúspěch léčby cefalosporiny 3. generace, ale

nebezpečí těchto bakterií spočívá v možnosti mutace, která vede ke konstitutivní nadprodukci těchto enzymů.

Je možné, že naše izoláty rezistentní k některému z testovaných β-laktamových

antibiotik, u kterých nebyly inducibilní β-laktamázy ani geny blaTEM, blaOXA nebo blaSHV

prokázány, geny ampC (kódující inducibilní β-laktamázy) obsahují, ale není je možné

použitým testem zachytit. Qin a kol. (2004), kteří prokázali produkci inducibilní β-laktamázy

u 76 % vybraných enterobakterií citlivých k cefalosporinům vyšší generace, vysvětlují získané výsledky tím, že geny ampC jsou vysoce polymorfické, proto není možné všechny

izoláty obsahující tyto geny zachytit. Je rovněž možné, že k indukci exprese některých variant genů ampC je vyžadována delší dobu kultivace v přítomnosti antibiotika nebo může být

exprese lépe indukována antibiotikem jiným (například ampicilinem nebo karbapenemy).

Jedná se ale pouze o hypotézy, které by bylo nutné potvrdit dalšími testy a podrobnou analýzou těchto genů, například zjištěním hladiny jejich exprese, síly jejich promotorů, přítomnosti různých bodových mutací a dalšími charakteristikami.

73

5.3.3 Výskyt genů rezistence k β-laktamovým antibiotikům Bylo prokázáno, že gen blaTEM patří mezi nejčastější determinanty rezistence k β-

-laktamovým antibiotikům u izolátů E. coli z mléčných filtrů, zvířat, potravin i lidí a vedle

genů ampC kódujících inducibilní β-laktamázy se vyskytuje i u dalších koliformních bakterií.

Frekvence výskytu tohoto genu u našich izolátů může být ještě vyšší, než která byla

prokázána, neboť izoláty koliformních bakterií z mléčných filtrů a potravin s prokázanou produkcí inducibilní β-laktamázy nebyly z ekonomických důvodů podrobeny PCR reakci pro průkaz jiných determinant rezistence k β-laktamovým antibiotikům. Vysoký výskyt genu

blaTEM u E. coli rezistentních k β-laktamovým antibiotikům izolovaných ze zvířat, potravin

a lidí potvrzují i jiné studie (Briñas a kol., 2002; Cole a kol., 2005; Guerra a kol., 2003; Malík a kol., 2004).

U části izolátů E. coli a koliformních bakterií z mléčných filtrů a E. coli

O157 veterinárního původu se za použití daných metod nepodařilo žádnou determinantu rezistence k β-laktamovým antibiotikům prokázat. Rezistence těchto izolátů může být způsobena méně obvyklými enzymy, například plazmidově kódovanými neinduktivními β-

laktamázami AmpC (Pérez-Pérez a Hanson, 2002) nebo jinými mechanizmy (sníženou

propustností antibiotika, přítomností „multidrug trasportérů“ nebo nadprodukcí proteinů

vázajících penicilin), které byly rovněž popsány (Ferrari a Turnidge, 2003; Putman a kol., 2000; Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001).

U bakteriálních izolátů z mléčných filtrů, u kterých se nepodařilo determinantu

rezistencek k β-laktamovým antibiotikům prokázat, se jednalo především o rody Citrobacter a Enterobacter, je tedy možné předpokládat, že rezistence těchto izolátů je způsobena

produkcí inducibilní β-laktamázy, kterou se již z výše diskutovaných důvodů nepodařilo prokázat.

Martinez a kol. (2001) popsali, že permeabilita vnější cytoplazmatické membrány

virulentních toxigenních izolátů E. coli je více omezená pro prostup antimikrobiálních

látek a může způsobit rezistenci k těmto látkám. Existence tohoto mechanismu je

pravděpodobně vysvětlením vysoké neúspěšnosti při průkazu genů rezistence k β-laktamům u 67 % našich izolátů E. coli O157 veterinárního původu rezistentních k ampicilinu a u 5

z celkového počtu 6 izolátů E. coli O157 z mléčných filtrů rezistentních k amoxicilinu-

-kyselině klavulanové.

74

5.3.4 Výskyt genů rezistence k tetracyklinu Naše výsledky ukazují, že geny tetA a tetB jsou nejčastější determinanty rezistence

k tetracyklinu u izolátů E. coli a koliformních bakterií získaných ze zvířat, potravin a lidí.

I z jiných studií vychází geny tetA a tetB u izolátů E. coli rezistetních k tetracyklinu

pocházejících z různého prostředí jako nejrozšířenější (Bryan a kol., 2004; Guerra a kol., 2003; Lanz a kol., 2003; Sengelov a kol., 2003; Wilkerson a kol., 2004).

Frekvence výskytu genů tet se u jednotlivých skupin vyšetřovaných izolátů

rezistentních k tetracyklinu lišila. Tyto rozdíly mohou být způsobeny pravděpodobně několika

faktory – jednotlivé skupiny izolátů jsou tvořeny různými druhy a sérotypy E. coli a koliformních bakterií a jsou izolovány z různých prostředí s odlišnou aplikací antibiotik

a jejich selekčním tlakem. Z hlediska mechanizmu rezistence není mezi geny tetA a tetB

rozdíl (Roberts, 1996). Bylo však prokázáno, že větší rezistenci poskytuje tetB, jehož produkt

umožňuje z buňky aktivně vylučovat tetracykliny první i druhé generace. „Eflux protein“

TetA poskytuje rezistenci pouze k tetracyklinům první generace (Chopra a Roberts, 2001). Právě substrátová specifita jednotlivých „eflux proteinů“ může být vysvětlením rozdílné diverzity genů tetA a tetB v odlišných prostředích, ve kterých podávání různých typů

tetracyklinových antibiotik vede k selekci genu výhodnějšího pro danou bakterii obývající toto prostředí. Toto tvrzení je však pouze hypotézou, kterou by bylo nutné potvrdit dalšími

studiemi. Rozdílný výskyt genů tet vysvětlují i Lanz a kol. (2003), podle kterých je tato diverzita způsobena specifickou asociací různých determinant rezistence, například společnou

lokalizací na specifických plazmidech a následnou společnou selekcí těchto determinant rezistence v závislosti na aplikaci antimikrobiálních látek v daném prostředí.

Rezistence k tetracyklinu izolátů E. coli a koliformních bakterií, u kterých nebyl

použitými primery žádný z genů tet prokázán, může být způsobena přítomností některého

z méně obvyklých genů tet, které nebyly v této práci prokazovány nebo jinými mechanizmy,

například sníženou propustností antibiotika skrze cytoplazmatickou membránu nebo přítomností „multidrug trasportérů“, které byly rovněž u izolátů E. coli rezistentních k tetracyklinu popsány (Putman a kol., 2000; Schwarz a Chaslus-Dancla, 2001).

75

5.3.5 Výskyt genů rezistence ke streptomycinu Nejčastější determinantou rezistence ke streptomycinu u vyšetřovaných izolátů byl

gen strA; naproti tomu gen aadA byl prokázán v mnohem nižší frekvenci. Naše výsledky se

liší od mnohých studií. Guerra a kol. (2003) prokázali, že geny aadA a strA se u izolátů E. coli

pocházejících z různých druhů zvířat v Německu vyskytují v přibližně shodné

frekvenci. Lanz a kol. (2003) zaznamenali u izolátů patogenních E. coli rezistentních ke streptomycinu získaných ze zvířat vyšší výskyt genu aadA ve srovnání s genem strA. Gen

aadA se nachází obvykle ve formě genové kazety jako součást integronu a z tohoto důvodu je

výskyt genu aadA a přítomnost integronu úzce spjata (Carattoli, 2001; Lanz a kol., 2003;

Sáenz a kol., 2004). Guerra a kol. (2003) prokázali integron u 30 % vyšetřovaných izolátů E. coli. Nízký výskyt integronů u našich izolátů (8 %) je možným vysvětlením i nízkého výskytu

genu aadA ve srovnání s výše citovanými studiemi. Výjimku tvoří izoláty z potravin, kde u 43 % izolátů E. coli

rezistentních

ke

streptomycinu

byl detekován gen aadA nebo

kombinace genů strA a aadA. Zvýšený výskyt genu aadA u izolátů z potravin je tedy

s nejvyšší pravděpodobností spojen s vysokým záchytem integronů (u 25 % rezistentních izolátů) ve srovnání s ostatními skupinami vyšetřovaných izolátů E. coli a koliformních

bakterií. Vysoký výskyt genu strA, u 80 % izolátů rezistentních ke streptomycinu, lze také zdůvodnit tím, že tyto geny mohou být lokalizovány plazmidech, které umožňují

jejich

na

velkých

konjugativních

snadnější a rychlejší šíření v bakteriální populaci

prostřednictvím konjugace (Aalbæk a kol., 1991). Pro potvrzení této hypotézy by bylo nutné zjistit plazmidový profil našich izolátů, u kterých byl gen strA prokázán.

U 2 izolátů z mléčných filtrů rezistentních ke streptomycinu, u kterých se geny strA

ani aadA nepodařilo prokázat, je možným vysvětlením přítomnost bodové mutace v některém

z těchto genů, které tak nemohly být PCR reakcí použitými primery prokázány. Rezistence ke streptomycinu ale může být způsobena i jiným mechanizmem, například sníženou propustností cytoplazmatické membrány, produkcí „eflux proteinů“ AcrD, která byla popsána u izolátů E. coli (Rosenberg a kol., 2000), nebo jiným dosud neznámým mechanizmem.

5.3.6 Výskyt genů rezistence k sulfonamidům Bylo prokázáno, že nejčastější determinantou rezistence k sulfonamidům u našich

izolátů je gen sul2. Vysoký výskyt tohoto genu dokumentují i jiné studie, podle kterých je 76

frekvence výskytu genu sul2 ve srovnání s genem sul1 u většiny izolátů E. coli z různého humánního i veterinárního materiálu vyšší (Enne a kol., 2001; Infante a kol., 2005; Kerrn

a kol., 2002; Lanz a kol., 2003). Rådström a kol. (1991) vysvětlují tuto skutečnost nadměrnou aplikací sulfonamidů při terapii bakteriálních infekcí u zvířat a lidí, která stimuluje rozvoj R

plazmidů, které nesou tyto geny rezistence. Vyšší výskyt genu sul2 oproti genu sul1 u našich

izolátů je možné vysvětlit také tím, že gen sul1 se nachází především u bakterií nesoucích

integron (Sáenz a kol., 2004; Zhao a kol., 2001) a takových izolátů jsme zachytili málo.

Výjimkou byly izoláty z potravin, kde byl gen sul1 popřípadě jeho kombinace s genem sul2 prokázán u 43 % izolátů rezistentních k sulfonamidům. U E. coli z potravin byl navíc zjištěn

vysoký výskyt integronů ve srovnání s ostatními skupinami izolátů. Je tedy možné předpokládat, že tyto výsledky spolu úzce souvisí.

Rezistence k sulfonamidům u 2 izolátů E. coli z mléčných filtrů a potravin, u kterých

se nepodařila prokázat přítomnost genu sul1 ani sul2, může být způsobena mutací genu folP

lokalizovaného na chromozomu kódujícího enzym dihydrofolátsyntetázu se sníženou afinitou k sulfonamidům, jak bylo již dříve popsáno u izolátů E. coli z prasat (Sköld, 2001; Swedberg

a kol., 1993; Vedantam a kol., 1998; Vedantam a Nichols, 1998). Rezistence těchto izolátů může být rovněž důsledkem přítomnosti méně frekventovaného genu sul3, který jsme bohužel

neprokazovali.

5.3.7 Výskyt genů rezistence k chloramfenikolu Gen cat je nejčastější determinanta rezistence k chloramfenikolu u gramnegativních

i grampozitivních bakterií (Schwarz a kol., 2001). Naše výsledky je možné srovnat se studií

Guerry a kol. (2003), kteří prokázali, že hlavní determinantou rezistence k chloramfenikolu u izolátů E. coli pocházejících z různých druhů zvířat je gen cat a u 7 % izolátů se jim

determinantu rezistence k tomuto antibiotiku nepodařilo zjistit. Rezistenci 2 našich izolátů z mléčných filtrů, u kterých nebyly geny cat ani cmlA prokázány, je možné vysvětlit přítomností méně frekventovaného genu floR pro „eflux neznámým mechanizmem rezistence.

77

systém“ nebo jiným dosud

5.3.8 Průkaz genu int1, genových kazet a integronu V některých zemích je z humánního i veterinárního materiálu izolováno velmi

vysoké procento (20 – 40 %) rezistentních E. coli, které obsahují ve svém genomu integron,

což je důsledek především vysoké a neuvážené spotřeby antibiotik v těchto zemích (Infante a kol., 2005; Zhao a kol., 2001). Výskyt multirezistentních bakterií obsahujích determinanty rezistence ve struktuře integronu je problémem především nemocničního prostředí, ve kterém je selekční tlak antibiotik ještě výraznější; integrony jsou v těchto prostředích detekovány u 40 – 50 % rezistentních izolátů E. coli (Chang a kol., 2000; Jones a kol., 1997; Martinez-

-Freijo, 1998). U námi vyšetřovaných izolátů E. coli a koliformních bakterií získaných

ze zvířat, potravin a lidí byl prokázán mnohonásobně nižší výskyt integronů (u 8 % rezistentních izolátů), který pravděpodobně souvisí s nižší a racionální aplikací antibiotik

v naší zemi. Velmi zajímavým výsledkem byl vyšší výskyt integronů u izolátů E. coli z potravin (25 %) ve srovnání s ostatními skupinami izolátů; tyto izoláty pocházely převážně z kuřecích a vepřových výrobků. Vysoké procento izolátů E. coli z potravin obsahujích

integron byl pravděpodobně způsoben zvýšenou spotřebou antibiotik v chovech prasat

a drůbeže, ze kterých dané potraviny pocházejí. Tuto souvislost je však možné pouze předpokládat, neboť přesný původ vzorku a použití antimikrobiálních látek u zvířat, ze kterých byl daný potravinový produkt získán, není možné zpětně zjistit.

V literatuře nejčastěji popisovanými integrony u izolátů E. coli z humánního

i veterinárního materiálu jsou integrony o velikosti 1 kb obsahující genovou kazetu aadA

a dále integrony o velikosti 1,6 - 1,8 kb s genovými kazetami aadA a některým z genů dfr

(nejčastěji dfr1, dfr12 nebo dfr17) (Chang a kol., 2000; Infante a kol., 2005; Sáenz a kol.,

2004; Skurnik a kol., 2005; Zhao a kol., 2001). Guerra a kol. (2003) detekovali integron o velikosti 1 kb s genovou kazetou aadA u 30 % a integron o velikosti 1,6 kb s genovými

kazetami dfr1 a aadA u 40 % izolátů E. coli s prokázaným integronem izolovaných

z hospodářských zvířat.

Srovnatelných výsledků jako ve výše citovaných studiích bylo

dosaženo i u námi testovaných izolátů.

Integrony jsou velmi variabilní struktury, bylo popsáno okolo 70 genových kazet,

které mohou být jejich součástí (Mazel, 2004). U 2 izolátů E. coli z potravin (13/p a 14/p)

s prokázaným integronem o velikosti 2 kb, u kterých se použitými primery nepodařilo

detekovat žádnou genovou kazetu, je možné předpokládat přítomnost jiných genových kazet,

78

které nebyly prokazovány nebo otevřených čtecích rámců (ORF – „open reading frame”) kódujících proteiny neznámé funkce.

Zajímavé byly rovněž 2 izoláty E. coli z mléčných filtrů (F118 a F134)

s prokázaným integronem o velikosti 2 kb, genovou kazetou aadA a genem blaOXA kódujícím

β-laktamázu, která se u E. coli vyskytuje ve velmi nízké frekvenci (Briñas a kol., 2002). Bylo prokázáno, že geny blaOXA mohou tvořit součást integronu (Recchia a Hall, 1995; Zhao a kol.,

2001). Jelikož se u těchto 2 izolátů nepodařilo kromě genů aadA použitými primery prokázat přítomnost jiné genové kazety, gen blaOXA bude pravděpodobně součástí integronu, ale není

možné vyloučit lokalizaci tohoto genu mimo integron a stejně jako u výše diskutovaných

izolátů z potravin (13/p a 14/p) přítomnost jiných genových kazet, které nebyly prokazovány. Velmi podobný izolát S. Typhimurium pocházející z roku 1984 s prokázaným integronem,

genem int1, sul1, aadA a blaOXA byl zachycen v České republice, sekvencováním bylo

zjištěno, že gen blaOXA i aadA jsou součástí integronu (Faldynová a kol., 2003). Podobného

výsledku dosáhli i Guerra a kol. (2003), kteří prokázali integron o velikosti 2 kb a současně gen blaOXA a aadA u 2 rezistentních izolátů E. coli.

Dalším neočekávaným výsledkem bylo zachycení 2 izolátů E. coli z mléčných filtrů

(F118 a F134) a izolátu E. coli O157 veterinárního původu (EC116) obsahujících integron

a genovou kazetu aadA a zároveň citlivých ke streptomycinu. Izobáty E. coli citlivé ke streptomycinu a nesoucí gen aadA dokumentovali i Lanz a kol. (2003). Martinez-Freijo

a kol. (1998) vysvětlují tyto výsledky nízkou hladinou exprese genových kazet včleněných

uvnitř integronu. Podle těchto autorů geny rezistence k aminoglykosidům spojené

s integronem poskytují spíše sníženou citlivost než úplnou rezistenci. Bylo rovněž popsáno, že pozice genových kazet uvnitř integronu ovlivňuje hladinu jejich exprese a tím i rezistenci

k příslušnému antibiotiku; nejvyšší rezistence je dosaženo, pokud je genová kazeta lokalizována přímo za 5’-konzervativní oblastí integronu (Collins a Hall, 1995).

Průkaz 3 izolátů E. coli a koliformních bakterií rezistentních ke streptomycinu

s prokázanou genovou kazetou aadA (F2, F183, C9271), u kterých nebyl detekován gen int1,

byl neobvyklým výsledkem. U těchto izolátů nebyl navíc ani prokázán gen sul1, specifická

součást integronu. Přítomnost integronu u těchto izolátů je tedy možné s nejvyšší

pravděpodobností vyloučit. Podle Carattoliho (2001) existuje v genomu velké množství genových kazet nezačleněných do integronu, což může být vysvětlením našeho výsledku.

79

Zajímavé bylo i zachycení 2 izolátů (F103 a 10/p) s prokázaným integronem, genem

int1 a dalšími geny rezistence, u kterých se nepodařilo prokázat gen sul1. Integrony tohoto

typu jsou dokumentovány i v jiných studiích (Guerra a kol., 2003; Infante a kol., 2005). Tyto

izoláty pravděpodobně obsahují defektní integrony s mutací v oblasti genu sul1; z tohoto

důvodu nemohl být gen sul1 PCR reakcí prokázán. Právě v 3’-konzervativní oblasti

integronu, kde je gen sul1 lokalizován, často dochází k mutacím nebo ztrátám některých genů

(Carattoli, 2001).

Integrony jsou velmi variabilní a různorodé struktury, které mohou obsahovat

i dosud nepopsané genové kazety. Pro zjištění přesné a kompletní struktury integronu u všech 13 izolátů by bylo nutné tyto integrony sekvencovat.

5.4 Multirezistentní izoláty E. coli O157:H7 z Jordánska Osm multirezistentních izolátů E. coli O157:H7 pocházelo z trávicího traktu ovcí

určených k produkci mléka chovaných na farmě v Jordánsku. V tomto chovu bylo potvrzeno intenzivní používání antimikrobiálních látek (Novotná a kol., 2005), které pravděpodobně souvisí s výskytem

multirezistentních izolátů (izolátů rezistentních ke 2 a více

antimikrobiálním látkám) a zachycením izolátu rezistentního dokonce k 10 testovaným

antibiotikům a produkujícího širokospektrou β-laktamázu. Tyto izoláty byly vyšetřovány

i Novotnou a kol. (2005), u 7 multirezistentních izolátů E. coli O157:H7 (EC 312 – EC316 a EC318 – EC319), u kterých byly zároveň detekovány shodné geny antibiotické rezistence, byl metodou RAPD-PCR prokázán stejný profil; jedná se tedy pravděpodobně o jeden klon.

Naproti tomu u izolátu EC 317, který se výrazně lišil fenotypem antibiotické rezistence, byly

prokázány některé odlišné geny, integron a dále metodou RAPD-PCR rozdílný profil. Jordánsko je zemí bez antibiotické politiky a s potenciálně zvýšeným rizikem infekce člověka

vysoce rezistentními patogenními bakteriemi skrze potravinové produkty. V sousední

Palestině, kde není spotřeba antibiotik rovněž regulována, byla u přibližně 50 % izolátů STEC získaných ze stolice lidí a syrového hovězího masa prokázána rezistence ke 3 a více antimikrobiálním látkám (Adwan a kol., 2002; Adwan a Adwan, 2004).

80

6. ZÁVĚR V oblasti antibiotické rezistence bylo v posledních letech získáno mnoho nových

poznatků, bylo popsáno mnoho mechanizmů a genů odpovědných za tuto rezistenci. Vytvořit

přehled determinant rezistence k vybraným antimikrobiálním látkám bylo z těchto důvodů obtížné, bližší pozornost byla věnována pouze determinantám, které se u izolátů E. coli a koliformních bakterií vyskytují v nejvyšší frekvenci. Průkazu těchto nejčastějších determinant rezistence byla následně věnována praktická část této diplomové práce.

Mezi izoláty E. coli a koliformních bakterií z potravního řetězce člověka byly

diskovou difuzní metodou prokázány izoláty rezistentní k antimikrobiálním látkám.

Frekvence výskytu rezistence se u 4 vyšetřovaných skupin izolátů lišila. Nejvyšší výskyt

rezistence byl prokázán u izolátů z mléčných filtrů (48 %) a potravin (41 %); naproti tomu

nejnižší procento rezistentních izolátů (12 %) bylo zaznamenáno u E. coli O157 veterinárního původu. Velká část izolátů E. coli a koliformních bakterií ze zvířat, potravin a lidí byla

rezistentní k β-laktamovým antibiotikům, tetracyklinu, streptomycinu a sulfonamidům.

Zvýšený výskyt rezistence k těmto antimikrobiálním látkám s nejvyšší pravděpodobností souvisí s jejich častým použitím při terapii zvířat a člověka.

U téměř 78 % izolátů rodů Enterobacter, Citrobacter a Serratia z mléčných filtrů

a potravin rezistentních k některému z testovaných β-laktamových antibiotik byla zjištěna

produkce inducibilní β-laktamázy. Pouze u jednoho izolátu E. coli O157:H7 z Jordánska byla

„double disk synergy testem” prokázána širokospektrá β-laktamáza.

Geny odpovědné za rezistenci k dané antimikrobiální látce se metodou PCR u všech

vybraných rezistentních izolátů nepodařilo prokázat. Distribuce genů antibiotické rezistence se u jednotlivých skupin izolátů částečně lišila. U izolátů rezistentních k tetracyklinu byly

prokázány geny tetA nebo tetB, k ampicilinu gen blaTEM, streptomycinu gen strA,

sulfonamidům gen sul2 a rezistence k chloramfenikolu byla spojena s přítomností genu cat.

Bylo zachyceno 8 % rezistentních izolátů obsahujících integron; nejvyšší výskyt integronů byl zaznamenán u izolátů E. coli z potravin.

V posledních letech byl přístup k antibiotikům přehodnocen a současný trend omezit

jejich spotřebu v humánní i veterinární oblasti neustále pokračuje. Od ledna 2006 bylo

v zemích EU u potravinových zvířat zakázáno použití antimikrobiálních látek jako růstových

stimulátorů, což by mohlo vést k poklesu výskytu rezistentních bakterií. Zda tento krok 81

skutečně výrazně ovlivní neustále trvající problém antibiotické rezistence je otázkou budoucnosti. Bylo by tedy velmi zajímavé zopakovat podobnou studii i v následujících letech a získané výsledky porovnat.

82

7. LITERATURA Aalbæk, B., Rasmussen, J., Nielsen, B., Olsen, J. E. (1991): Prevalence of antibiotic resistant Escherichia coli in Danish pigs and cattle. APMIS 99: 1103-1110.

Adwan, K., Abu-Hasan, N., Essawi, T., Bdir, M. (2002): Isolation and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli strains from nothern Palestine. J. Med. Microbiol. 51: 332-335.

Adwan, M. A., Adwan, K. M. (2004): Isolation of Shiga toxigenic Escherichia coli from raw beef in Palestine. Int. J. Food Microbiol. 97: 81-84.

Aerestrup, F. M. a Wegener, H. C. (1999): The effects of antibiotics usage in food animals on the development of antimicrobial resistance of importance of humans in Campylobacter and Escherichia coli. Microbes Infect. 1: 639-644.

Arcangioli, M. A., Leroy-Sétrin, S., Martel, J. L., Chaslus-Dancla, E. (1999): A new chloramphenicol a florphenicol resistance gene flanked by two integron structures in Salmonella Typhimurium DT104. FEMS Microbiol. Lett. 174: 327-332.

Asai, T., Kojima, A., Harada, K., Ishihara, K., Takahashi, T., Tamura, Y. (2005): Correlation between the usage volume of veterinary therapeutic antimicrobials and resistance in Escherichia coli isolated from feces of food-producing animals in Japan. Jpn. J. Infect. Dis. 58: 369-372. Bednář, M., Fraňková, V., Schindler, J., Souček, A., Vávra, J. (1999): Lékařská mikrobiologie. Nakladatelství Marvil, Praha, 558 s.

Bettelheim, K. A., Hornitzky, M. A., Djordjevic, S. P., Kuzevski, A. (2003): Antibiotic resistance among verocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC) and non-VTEC isolated from domestic animals and humans. J. Med. Microbiol. 52: 155-162.

Bissonnette, L., Champetier, S., Buisson, J. P., Roy, P. H. (1991): Characterization of the nonenzymatic chloramphenicol resistance (cmlA) gene of the In4 integron of Tn1696: similarity of the product to transmembrane transport proteins. J. Bacteriol. 173: 4493-4502.

Bitzan, M., Moebius, E., Ludwig, K., Miller-Wiefel, D. E., Heeseman, J., Karch, H. (1991): High incidence of serum antibodies to Escherichia coli O157 lipopolysacharide in children with hemolytic-uremic syndrome. J. Pediatr. 119: 380-385.

Bopp, C. A., Greene, K. D., Downes, F. P., Wells, J. G., Wachsmuth, I. K. (1987): Unusual verotoxin-producing Escherichia coli associated with hemorrhagic colitis. J. Clin. Microbiol. 25: 1486-1489. Borczyk, A. A., Karmali, M. A., Lior, H., Runcán, L. M. (1987): Bovine reservoir for verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7. Lancet 1: 98.

83

Bradford, P. A. (2001): Extended-spectrum β-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin. Microbiol. Rev. 14: 933-951.

Briñas, L., Zaraga, M., Sáenz, Y., Ruiz-Larrea, F., Torres, C. (2002): β-lactamases in ampicilin-resistant Escherichia coli isolates from foods, humans, and healthy animals. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 3156-3160.

Bryan, A., Shapir, N., Sadowsky, J. (2004): Frequency and distribution of tetracycline resistance genes in genetically diverse, nonselected, and nonclinical Escherichia coli strains isolated from human and animal sources. Appl. Environ. Microbiol. 70: 2503-2507. Butaye, P., Devriese, L. A., Haesebrouk, F. (2003): Antimicrobial growth promotors used in animal feed: efect of less well known antibiotics on gram-positive bacteria. Clin. Microbiol. Rev. 16: 175-188.

Carattoli, A. (2001): Importance of integrons in the diffusion of resistance. Vet. Res. 32: 243-259.

Cimolai, N., Carter, J. E., Morrison, B. J., Anderson, J. D. (1990): Risk factors for the progression of Escherichia coli O157:H7 enteritidis to hemolytic-uremic syndrome. J. Pediatr. 116: 589-592.

Clark, N. C., Olsvik, Ø., Swenson, J. M., Spiegil, C. A., Tenover, F. C. (1999): Detection of a streptomycin/spectinomycin adenyltransferase gene (aadA) in Enterococcus faecalis. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 157-160. Cockerill, F. R., III. (1999): Genetic methods for assesing antimicrobial resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 199-212.

Cole, D., Drum, D. J. V., Stallknecht, D. E., White, D. G., Lee, M. D., Ayers, S., Sobsey, M., Maurer, J. J. (2005): Free-living Canada geese and antimicrobial resistance. Emerg. Infect. Dis. 11: 935-938. Collins, C. M., Hall, R. M. (1995): Expression of antibiotic resistance genes in the integrated cassettes of integrons. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 155-162. Datta, N., Kontomichalou, P. (1965): Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in Enterobacteriaceae. Nature 208: 239-244.

DeFrancesco, K. A., Cobbold, R. N., Rice, D. H., Besser, T. E., Hancock, D. D. (2004): Antimicrobial resistance of comensal Escherichia coli from dairy cattle associated with recent multi-resistant salmonellosis outbreaks. Vet. Microbiol. 98: 55-61.

Englen, M. D., Fedorka-Cray, P. J., Ladely, S. R., Dargatz, D. A. (2005): Antimicrobial resistance patterns of Campylobacter from feedlot cattle. J. Appl. Microbiol. 99: 285-291.

Enne, V. I., Livermore, D. M., Stephens, P., Hall, R. M. (2001): Persistance of sulfonamide resistance in Escherichia coli in the UK despite national prescribing restriction. Lancet 357: 1325-1328. 84

Faldynová, M., Pravcová, M., Šišák, F., Havlíčková, H., Koláčková, I., Čížek, A., Karpíšková, R., Rychlík, I. (2003): Evolution of antibiotic resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium strains isolated in Czech Republic between 1984 and 2002. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 2002-2005.

Ferrari, M. J., Turnidge, J. D. (2003): Antibacterial agents and suspectibility test methods. In: Murray, P. R., Baron, E. J., Jorgensen, J. H., Pfaller, M. A., Yolken, R. H. (eds.), Manual of clinical microbiology. 1037-1196. ASM Press Washington, D.C.

Finch, R. G., Greenwood, D., Norrby, S. R., Whitley, R. J. (2003): Antibiotics and chemotherapy. Anti-infective agents and their use in therapy. Churchill Livingstone, 964 p. Fluit, A. C., Schmitz, F. J. (1999): Class 1 integrons, gene cassettes, mobility, and epidemiology. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18: 761-770. Fluit, A. C., Visser, M. R., Schmitz, F. J. (2001): Molecular detection of antimicrobial resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 14: 836-871.

Galland, J., Hyatt, D., Crupper, S., Acheson, D. (2001): Prevalence, antibiotic suspectibility, and diversity of Escherichia coli O157:H7 isolates from longitudial study of beef cattle feedlots. App. Environ. Microbiol. 67: 1619-1627.

Gassama, A., Aïdara-Kane, A., Chainier, D., Denis, F., Ploy, M.-C. (2004): Integron associated antibiotic resistance in enteroaggregative and enteroinvasive Escherichia coli. Microb. Drug Resist. 10: 27-30. Gasser, C. C., Gautier, C., Steck, A., Siebenmann, R. E., Oechslin, R. (1955). Hämolytisch-uramische Syndrome. Bilaterale Nierenindennekrosen bei akuten erworbenen hämolytischen Anamien. Schweiz. Med. Woschenschr. 85: 905-909. Gibreel, A., Sköld, O. (1998): High-level resistance to trimethoprim in clinical isolates of Campylobacter jejuni by acquisition of foreign genes (dfr1 and dfr9) expressing drug-intensive dihydrofolate reductases. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 3059-3064. Grape, M., Sundström, L., Kronvall, G. (2003): Sulfonamide resistence gene sul3 found in Escherichia coli isolates from human sources. J. Antimicrob. Chemother. 52: 1022-1024.

Griffin, P. M., Tauxe, R. V. (1991): The epidemiology of infections caused by Escherichia coli O157:H7, other enterohemorrhagic E. coli, and the associated hemolytic uremic syndrome. J. Clin. Microbiol. 30: 1807-1810.

Guerra, B., Junker, E., Schroeter, A., Malorny, B., Lehmann, S., Helmuth, R. (2003): Phenotypic and genotypic characterization of antimicrobial resistance in German Escherchia coli isolates from cattle, swine ande poultry. J. Antimicrob. Chemother. 52: 489-492.

Gunzer, F., Bohm, H., Russman, H., Bitzan, M., Aleksic, S., Karch, H. (1992): Molecular detection of sorbitol-fermenting Escherichia coli O157 in pacients with hemolytic-uremic syndrome. J. Clin. Microbiol. 30: 1807-1810.

85

Hammerum, A. M., Sandvang, D., Anderson, S. R., Sevfarth, A. M. (2006): Detection of sul1, sul2 and sul3 in sulfonamide resistant Escherichia coli isolates obtained from healthy humans, pork and pigs in Denmark. Int. J. Food Microbiol. 106: 235-237.

Hera, A., Koutecká, L., Dorn, D., Psota, P. (2005): Spotřeba antibiotik ve veterinární medicíně v ČR v letech 2002-2004. Věstník Ústavu pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv 3: 48-49.

Hochhut, B., Lotfi, Y., Mazel, D., Faruque, S. M., Woodgate, R., Waldor, M. K. (2001): Molecular analysis of antibiotic resistance gene clusters in Vibrio cholerae O139 and O1 SXT constins. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 2991-3000. Huber, T. W., Thomas, J. S. (1994): Detection of resistance due to inducible β-lactamases in Enterobacter aerogenes and Enterobacter cloacae. J. Clin. Microbiol. 32: 2481-2486.

Huovinen, P., Sundström, L., Swedberg, G., Sköld, O. (1995): Trimethoprim and sulfonamide resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 279-289.

Chang, Ch.-Y., Chang, L.-L., Chang, Y.-H., Lee, T.-M., Chang S.-F. (2000): Characterization of drug resistance gene cassettes associated with class 1 integrons in clinical isolates of Escherichia coli from Taiwan, ROC. J. Med. Microbiol. 49: 1097-1102.

Chopra, I., Roberts, M. (2001): Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 232-260

Infante, B., Grape, M., Larsson, M., Kristiansson, C., Pallecchi, L., Rossolini, G. M., Kronvall, G. (2005): Acquired sulfonamide resistance genes in faecal Escherichia coli from healthy children in Bolivia and Peru. Int. J. Antimicrob. Agents 25: 308-312. Jarlier, V., Nicolas, M., Fournier, G., Philippon, A. (1988): Extended broad-spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and suspectibility pattern. Rev. Infect. Dis. 10: 867-878. Jones, M. E., Peters, E., Weersink, A. M., Fluit, A., Verhoef, J. (1997): Widespread occurance of integrons causing multiple antibiotic resistance in bacteria. Lancet 349: 1742-1743.

Kaper, J. B., O’Brien, A. D. (1998): Escherichia coli O157:H7 and other Shiga Toxin-producing E. coli strains. ASM Press Washington, D.C., 385 p.

Kerrn, M. B., Klemmensen, T., Frimodt-Møller, N., Espersen, F. (2002): Suspectibility of Danish Escherichia coli strains isolated from urinary tract infections and bacteraemia, and distribution of sul genes conferring sulfonamide resistance. J. Antimicrob. Chemother. 50: 513-516.

Kijima-Tanaka, M., Ishihara, K., Morioka, A., Kojima, A., Ohzono, T., Ogikubo, K., Takahashi, T., Tamura, Y. (2003): A national surveillance of antimicrobial resistance in

86

Escherichia coli isolated from food-producing animals in Japan. J. Antimicrob. Chemother. 51: 447-451.

Kim, H. H., Samadpour, M., Grimm, L., Clausen, C. R., Besser, T. E., Baylor, M., Kobayashi, J. M., Neill, M. A., Schoenknecht, F. D., Tarr, P. I. (1994): Characteristics of antibiotic-resistant Escherichia coli O157:H7 in Washington State, 1984-1991. J. Infect. Dis. 170: 1606-1609. Kolář, M., Látal, T., Čermák, P. (2002): Klinicko-mikrobiologické podklady racionální antibiotické léčby. Nakladatelství Trios, Praha, 110 s.

Konowalchuk, J., Speir, J. I., Stavric, S. (1977): Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. Infect. Immun. 18: 775-779.

Lanz, R., Kuhnert, R., Boerlin, P. (2003): Antimicrobial resistance and resistance gene determinants in clinical Escherichia coli from different animal species in Switzerland. Vet. Microbiol. 91: 73-84.

Leverstein-van Hall, M., Fluit, A. C., Paauw, A., Box, A. T. A., Brisse, S., Verhoef, J. (2002): Evaluation of the Etest ESBL and the BD Phoenix, VITEK 1, and VITEK 2 automated instruments for detection of extended-spectrum β-lactamases in multiresistant Escherichia coli and Klebsiella spp. J. Clin. Microbiol. 40: 3703-3711.

Levy, S. B., McMurry, M., Barbosa, T. M., Burdett, V., Courvalin, P., Hillen, W. Q., Roberts, M. C., Rood, J. I., Taylor, D. E. (1989): Nomenclature for tetracycline resistance determinants. Antimicrob. Agents Chemother. 33: 1373-1374.

Leung, P. H. M., Peiris, J. S. M., Ng, W. W. S., Robins-Browne, R. M., Bettelheim, K. A., Yam, W. C. (2003). A newly discovered verotoxin variant VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 69: 7549-7553.

Lhotová, H. (2001): Výskyt shigatoxin produkujících kmenů Escherichia coli v České Republice. Zprávy Centra epidemiologie a mikrobiologie (Státní zdravotní ústav, Praha) 10: 438-440. Lhotová H., Sevčíková A. (2000). Závažný průběh hemolyticko-uremického syndromu u dítěte vyvolaný kmenem E. coli O157:H7 produkujícím verotoxin. Zprávy Centra epidemiologie a mikrobiologie (Státní zdravotní ústav, Praha) 9: 405-406.

Lingwood, C. A., Law, H., Richardson, S., Petric, M., Brunton, J. L., De Grandi, S., Karmali, M. (1987). Glycolipid binding of purified and recombinant Escherichia coli produced verotoxin in vitro. J. Biol. Chem. 262: 8834-8839. Livermore, D. M. (1995): β-lactamases in laboratory and clinical resistence. Clin. Microbiol. Rev. 8: 557-584. Livermore, D. M. (2005): Minimising antibiotic resistance. Lancet Infect. Dis. 5: 450-459.

Madsen, L., Aerestrup, F. M., Olsen, J. E. (2000): Characterization of streptomycin resistance determinants in danish isolates of Salmonella Typhimurium. Vet. Microbiol. 75: 73-82. 87

Mainil, J. (1999). Shiga/verocytotoxins and shiga/verocytotoxigenic Escherichia coli in animals. Vet. Res. 30: 235-257. Malík, R., Pristaš, P., Javorský, P. (2004): Occurence of plasmid-mediated ampicillin resistance among enterobacteria from the ovine rumen. Folia Microbiol. 49: 187-190.

Martinez, M. B., Flickinger, M., Higgins, L., Krick, T., Nelsestuen, G. L. (2001): Reduced outer membrane permeability of Escherichia coli O157:H7 suggested role of modified outer membrane porins and theoretical function in resistance to antimicrobial agents. Biochem. 40: 11965-11974.

Martinez-Freijo, P., Fluit, A. C., Schmitz, F. J., Grek, V. S. C., Verhoef, J., Jones, M. E. (1998): Class I integrons in Gram-negative isolates from different European hospitals and association with decreased suspectibility to multiple antibiotic compounds. J. Antimicrob. Chemother. 42: 689-696.

Mascaretti, O. A. (2003): Bacteria versus antimicrobial agents an integrated aproach. ASM Press Washington, D.C., 393 p.

Mazel, D. (2004): Integrons and the origin of antibiotic resistance gene cassettes. ASM News. 70: 520-525. McEwen, S. A. a Fedorka-Cray, P. J. (2002): Antimicrobial use and resistance in animals. Clin. Infect. Dis. 34 (Suppl. 3): S93-S106.

Meng, J., Zhao, S., Doyle, M. P., Joseph, S. W. (1998): Antibiotic resistance of Escherichia coli O157:H7 and O157:NM isolated from animals, food, and humans. J. Food Prot. 61: 1511-1514.

Moore, P. R., Evanson, A., Luckey, T. D., McCoy, E., Elvehjen, C. A., Hart, E. B. (1946): Use of sulfasuxidine, streptothricin, and streptomycin in nutritional studies with chicks. J. Biol. Chemistry. 165: 437-441.

Mora, A., Blanco, J. E., Blanco, M., Alonso, M. P., Dhabi, G., Echeita, A., Golzánez, E. A., Bernández, M. I., Blanco, J. (2005): Antimicrobial resistance of Shiga toxin (verotoxin)-producing Escherichia coli O157:H7 and non-O157 strains from humans, cattle, sheep and food in Spain. Res. Microbiol. 156: 793-806.

Murinda, S. E., Ebner, P. D., Nguyen, L. T., Mathew, A. G., Oliver, S. P. (2005): Antimicrobial resistance and class 1 integrons in pathogenic Escherichia coli from dairy farms. Foodborne Pathog. Dis. 4: 348-352.

M’Zali, F. H., Heritage, J., Gascoyne-Binzi, S., Snelling, A. M., Hawkey, P. M. (1998): PCR single strand conformational polymorphism can be used to detect the gene encoding SHV-7 extended-spectrum beta-lactamase and to identify different SHV genes within the same strain. J. Antimicrob. Chemother. 41: 123-125. Nakaya, R., Nakamura, A., Murata, Y. (1960): Resistance transfer agents in Shigella. Biochem. Biophys. Res. Commun. 3: 654-659.

88

NCCLS (2002). Performance standards for antimicrobial disk and dilution suspectibility tests for bacteria isolated from animals, approved standard-second edition. NCCLS document M31-A2. Edited by NCCLS, Wayne, Pensylvania, 85 p.

Ng, L. K., Murvey, M. R., Martin, I., Peters, G. A., Johnson, W. (1999). Genetic characterization of a antimicrobial resistence in Canadian isolates of Salmonella serovar Typhimurium DT104. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 3018-3021.

Nijsten, R., London, N., van den Bogaard, A., Stobberingh, E. (1996): Antibiotic resistance among Escherichia coli isolated from faecal samples of pig farmers and pigs. J. Antimicrob. Chemother. 37: 1131-1140.

Novotná, R., Alexa, P., Hamřík, J., Madanat, A., Smola, J., Čížek, A. (2005): Isolation and characterization Shiga toxin-producing Escherichia coli from sheep and goats in Jordan with evidence of multiresistant serotypes O157:H7. Veterinární Medicína 50: 111-118.

Oullette, M., Paul, G. C., Philippon, A. M., Roy, P. H. (1988): Oligonucleotide probes (TEM-1, OXA-1) versus isoelectric focusing in β-lactamase characterization of 114 resistant strains. Antimicrob. Agents Chemother. 32: 397-399. Pérez-Pérez, F. J., Hanson, N. D. (2002): Detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 40: 2153-2162.

Perreten, V., Berlin, P. (2003): A new sulfonamide resistence gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in pig population of Switzerland. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 1169-72.

Pitout, J. D. D., Reisbig, M. D., Venter, E. C., Church, D. L., Hanson, N. D. (2003): Modification of the double-disk test for detection of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum and AmpC β-lactamases. J. Clin. Microbiol. 41: 3933-3935. Prescott, J. F., Baggot, J. D., Walker, R. D. (2000): Antimicrobial therapy in veterinary medicine. Iowa State University Press/Ames, Third Edition, 796 p. Putman, M., van Veen, H. W., Konings, W. N. (2000): Molecular properties of bacterial multidrug transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 672-693.

Qin, X., Weissman, S. J., Chesnut, M. F., Zhang, B., Shen, L. (2004): Kirby-Bauer disc approximation to detect inducible third-generation cephalosporin resistance in Enterobacteriaceae. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 3: 13.

Rådström, P., Swedberg, G., Sköld, O. (1991): Genetic analyses of sulfonamide resistance and its dissemination in Gram-negative bacteria illustrate new aspects of R plasmid evolution. Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1840-1848.

Ratman, S., March, S. B., Ahmed, R., Bezanson, G. S., Kasatiya, S. (1988): Characterization of Escherichia coli serotype O157:H7. J. Clin. Microbiol. 26: 2006-2012.

Recchia, G. D., Hall, R. M. (1995): Gene cassettes: a new class of mobile element. Microbiol. 141: 3015-3027.

89

Roberts, M. C. (1996): Tetracycline resistance determinants: mechanism of action, regulation of expression, genetic mobility, and distribution. FEMS Microbiol. Rev. 19: 1-24.

Rosenberg, E., Ma, D., Nikaido, H. (2000): AcrD of Escherichia coli is an aminoglycoside efflux pump. J. Bacteriol. 182: 1754-1756. Rumlová M., Pačes, V., Ruml, T. (2003): Základní metody genového inženýrství. JPM Tisk, Praha, 55 s.

Sáenz, Y., Briñas, L., Dmínguez, E., Ruiz, J., Zarazaga, M., Vila, J., Torres, C. (2004): Mechanisms of resistance in multiple-antibiotic-resistant Escherichia coli strains of humans, animal, and food origin. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 3996-4001. Sáenz, Y., Zarazaga, M., Briñas, L., Lantero, M. (2001): Antibiotic resistance in Escherichia coli isolates obtained from animals, foods and humans in Spain. Int. J. Antimicrob. Agents. 18: 353-358. Sanders, C. C., Sanders, W. E. Jr. (1979): Emergence of resistance to cefamandole: possible role of cefoxitin inducible beta-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 15: 792-797. Sengelov, G., Halling-Sorensen, B., Aestrup, F. M. (2003): Susceptibility of Escherichia coli and Enterococcus faecium isolated from pigs and broiler chickens to tetracycline degradation products and distribution of tetracycline resistance determinants in E. coli from food animals. Vet. Microbiol. 95: 91-101

Schroeder, C. M., Zhao, C., DebRoy, C., Torcolini, J., Zhao, S., White, D. G., Wagner, D. D., McDermott, P. F., Walker, R. D., Meng, J. (2002): Antimicrobial resistance of Escherichia coli O157 isolated from humans, cattle, swine, and food. Appl. Environ. Microbiol. 68: 576-581. Schwarz, S., Chaslus-Dancla, E. (2001): Use of antimicrobials in veterinary medicine and mechanisms of resistance. Vet. Res. 32: 201-225.

Schwarz, S., Kehrenberg, C., Walsh, T. R. (2001). Use of antimicrobial agents in veterinary medicine and food animal production. Int. J. Antimicrob. Agents. 17: 431-437. Sköld, O. (2001): Resistance to trimethoprim and sulfonamides. Vet. Res. 32: 261-273.

Skurnik, D., Le Menac´h, A., Zurakowski, D., Mazel, D., Courvalin, P., Denamur, E., Andremont, A., Ruimy, R. (2005): Integron-associated antibiotic resistance and phylogenetic grouping of Escherichia coli isolates from healthy subjects free of recent antibiotic exposure. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 3062-3065.

Sørum, H., Sunde, M. (2001): Resistance to antibiotics in the normal flora of animals. Vet. Res. 32: 227-241.

Stewart, A. I., Jones, G. A., McMenamin, J., Chaudhuri, A. K. R., Todd, W. T. A. (1997): Central Scotland E. coli O157 outbreak: clinical aspects (Monklands Hospital experiance). SCIEH Weekly Rep. Suppl. 1 97: 9-11. 90

Stokstad, E. L. R., Jukes, T. H., Pierce, J., Page, A. C. Jr., Franclin, A. L. (1949): The multiple nature of the animal protein factor. J. Biol. Chemistry. 180: 523-528. Swedberg, G., Castensson, S., Skö öld, O. (1993): Point mutations in the dihydropteroate synthase gene causing sulfonamide resistance. Adv. Exp. Med. Biol. 338: 555-558.

Tancrede, C. (1992): Role of human microflora in health and diseases. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11: 1012-1015.

Teale, C. J. (2002): Antimicrobial resistance and the food chain. J. Appl. Microbiol. 92: 85S-89S. The Oxoid Manual (1998). 8th edition. Oxoid Limited, UK, 116 p.

Thomson, K. S., Sanders, C. C. (1992): Detection of extended-spectrum beta-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the double-disk and three-dimensional tests. Antimicrob. Agents Chemother. 36: 1877-1882. Tollefson, L., Fedorka-Cray, P. J., Angulo, F. J. (1999): Public health aspects of antibiotic resistance monitoring in the USA. Acta Vet. Scan. Suppl. 92: 67-75.

Van den Bogaard, A. E. J. M., London, N., Stobberingh, E. E. (2000): Antimicrobial resistance in pig faecal samples from The Netherlands (five abattoirs) and Sweden. J. Antimicrob. Chemother. 45: 663-571.

Vedantam, G., Guay, G. G., Austria, N. E., Doktor, S. Z., Nichols, B. P. (1998): Characterization of mutations contibuting to sulfathiazole resistance in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 88-93. Vedantam, G., Nichols, B. P. (1998): Characterization of a mutationally altered dihydropteroate synthase contributing to sulfathiazole resistance in Escherichia coli. Microb. Drug Resist. 4: 91-97.

Votava, M., Černohorská, L., Heroldová M., Holá V., Mejzlíková, L., Ondrovčík, P., Fůžička,F., Dvořáčková, M., Woznicová, V., Zahradníček, O. (2003): Lékařská mikrobiologie speciální. Nakladatelství Neptun, Brno, 495 s. Walsh, Ch. (2003): Antibiotics – action, origin, resistance. ASM Press Washington, D.C., 335 p.

Walterspiel, J. N., Ashkenazi, S., Morrow, A. L., Clary, T. G. (1992). Effect of subinhibitory concentration of antibiotics on extracellular Shiga-like toxin I. Infection 20: 25-29. White, D. G., Zhao, S., Simjee, S., Wagnes, D. D., McDermott, P. F. (2002): Antimicrobial resistance of foodborne pathogens. Microbes Infect. 4: 405-412.

Wilkerson, Ch., Samadpour, M., van Kirk, N., Roberts, M. C. (2004): Antibiotic resistance and distribution of tetracycline resistance genes in Escherichia coli O157:H7 isolates from human and bovines. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 1066-1067 91

You, J.-Y., Moon, B.-M., Oh, I.-G., Baek, B.-K., Li, L.-G., Kim, B.-S., Stein, B. D., Lee, J. H. (2006): Antimicrobial resistance of Escherichia coli O157 from cattle in Korea. Int. J. Food Microbiol. 106: 74-78.

Zhao, S., White, D. G., Ge, B., Ayers, S., Friedman, S., English, L., Wagner, D., Gainers, S., Meng, J. (2001): Identification and characterization of integron-mediated antibiotic resistance among shiga toxin-producing Escherichia coli isolates. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1558-1564.

92

PŘÍLOHY Příloha 1A: Přehled izolátů z mléčných filtrů použitých pro průkaz genů antibiotické rezistence metodou PCR včetně jejich charakteristiky a detekovaných genů číslo

izolátu F2 F8 F10 F20 F32 F41 F47 F54 F52 F66 F67 F68 F71 F81 F82 F86 F88 F97 F102 F103 F105 F110 F116 F118 a

identifikace E. coli E. coli E. cloacae E. cloacae C. freundii E. coli C. farmeri E. vulneris K. oxytoca

fenotyp

antibiotické rezistence ACSSuSxtT ST ASSuT ACSSuT AAcKfT T T S A

E. cloacae

AAcCKfSSuT

C. braakii C. freundii C. freundii E. coli S. odorifera K. pneumoniae E. coli C. freundii C. freundii E. cloacae C. braakii E. coli S. odorifera

AAcKfS AAcCKfSSuT AAcCKfSSu ST KfSSu ST ACSSuT SSu ACKfSSu ACKfST ACKfSSuT ACSSuT AcKfS

E. coli

ACSuT

prokázané genya blaTEM, cat, aadA, sul2, tetB strA, tetB blaTEM, strA, sul2, tetB cat, strA, sul2, tetA tetB tetB tetA strA cat, aadA, strA, sul1, tetB, int1,

integron (1 kb) strA cat, strA, sul2, tetA cat, strA, sul2 strA, tetB strA, sul2 tetB strA, sul2 cat, strA, sul2 blaTEM, aadA, strA, tetA, int1, integron (1 kb) cat, strA, sul2, tetA cat, aadA, sul1, tetB, int1, integron (1 kb) blaTEM, strA blaOXA, cat, aadA, sul1, tetB, int1, integron (1 kb)

- ... metodou PCR nebyl použitými primery prokázán žádný gen antibiotické rezistence

93

Příloha 1B: Přehled izolátů z mléčných filtrů použitých pro průkaz genů antibiotické rezistence metodou PCR včetně jejich charakteristiky a detekovaných genů číslo

izolátu F126 F130 F134 F136 F141 F150 F152 F157 F164 F165 F174 F179 F181 F183 F184 F186 F187 F191 F195 F197 EC330 EC331 EC332 EC333 EC334 EC335 a

fenotyp

IDENTIFIKAC antibiotické E rezistence S. odorifera AcKfS C. braakii KfST E. coli

ACSuT

C. braakii C. braakii C. braakii E. coli E. cloacae E. aerogenes C. braakii E. cloacae C. freundii E. coli E. aerogenes C. freundii C. freundii C. braakii C. braakii E. coli C. braakii E. coli O157 E. coli O157 E. coli O157 E. coli O157 E. coli O157 E. coli O157

KfS KfS ST T AAcKfST ST ST KfST ST ST KfS SSu AAcKfST AAcCSSuT ACSSuT ASSuSxtT KfS AAcSSuSxt AAc AcT AcCSxtT AcSxt AcS

prokázané genya strA strA, tetB blaOXA, cat, aadA, sul1, tetB, int1,

integron (1 kb) strA strA strA, tetB tetB strA, tetB strA, tetA strA, tetA strA, tetB strA, tetB aadA strA, sul2 strA, tetB blaTEM, cat, strA, sul2, tetB blaTEM, cat, strA, sul2, tetA blaTEM, strA, sul2, tetA strA blaTEM, strA, sul2 strA

- ... metodou PCR nebyl použitými primery prokázán žádný gen antibiotické rezistence

94

Příloha 2: Přehled izolátů E. coli O157 veterinárního původu použitých pro průkaz

genů antibiotické rezistence metodou PCR včetně jejich fenotypu antibiotické rezistence a detekovaných genů číslo

fenotyp antibiotické

EC6 EC9 EC16 EC26 EC78 EC94 EC108 EC109 EC110 EC111 EC112 EC114 EC115 EC116 EC117 EC119 EC120 EC127 EC178 EC186 EC187 EC202 EC205 EC206 EC210 EC250 EC252 EC255 EC259 EC266 EC267 EC268 EC270 EC271 EC272

SSu ASSu SSu SSu AAcT A Su Su Su Su Su Su Su SuT Su Su Su AAc AAc AAc AAcSSuSxtT AAc A A AAc ASSuT AAc A AAc A A A A A AAc

izolátu

a

rezistence

prokázané geny a strA, sul2 blaTEM, strA, sul2 strA, sul2 strA, sul2 sul2 sul2 sul2 sul2 sul2 sul2 sul2 aadA, sul1, tetA, int1, integron (1 kb) sul2 sul2 sul2 strA, sul2, tetD blaTEM blaTEM, strA, sul2, tetA blaTEM blaTEM blaTEM -

- ... metodou PCR nebyl použitými primery prokázán žádný gen antibiotické rezistence 95

Příloha 3: Přehled izolátů z potravin použitých pro průkaz genů antibiotické rezistence metodou PCR včetně jejich charakteristiky a detekovaných genů číslo

izolátu

identifikace původ

fenotyp

antibiotické prokázané geny rezistence AST ACS ACS A ASSuT ASu ASu ASu ASu AST ASSuT AST ASSuT

mleté maso vepřové

9/p2

E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli

10/p

E. coli

výrobní maso

ASSuT

12/p

E. coli

vepřová sekaná

AT

13/p

E. coli

destrukt. stěr - prase

ACSuT

14/p

E. coli

drůbeží polotovar

ACSuT

1/p1 2/p1 3/p1 4/p

5/p1 5/p2 5/p3 6/p1 6/p2 7/p 8/p

9/p1

maso

syrová sekaná

kuřecí řízek chlazený kuřecí řízek chlazený kuřecí řízek chlazený stěr - dojnice stěr - dojnice

sekaná kořeněná

kuřecí křídla chlazená kuřecí křídla chlazená kuřecí křídla chlazená

kuřecí žaludky chlazené ASSuT

15/p1 C3604

mleté maso vepřové

E. coli

kuřecí řízky

ASSuT

C10101 E. coli C9277 E. coli

kuřecí žaludky chlazené A sekaná mix SSu

C10032

vepřová sekaná

C9271

C4231 467

E. coli E. coli E. coli

kuřecí řízek chlazený

syrové mléko sýr romadur

S

ASSu T T

96

blaTEM, strA, tetB blaTEM, cat, strA blaTEM, cat, strA blaTEM blaTEM, strA, sul2, tetA blaTEM, sul2 blaTEM, sul2 blaTEM, sul2 blaTEM, sul2 blaTEM, strA, tetB blaTEM, strA, sul2, tetA blaTEM, strA, tetA blaTEM, strA, tetA blaTEM, aadA, strA, sul2, tetA, dfr1, int1, integron (1,6 kb) blaTEM, tetA blaTEM, cat, sul1, tetB, int1, integron (2 kb) blaTEM, cat, sul1, tetB, int1, integron (2 kb) blaTEM, aadA, strA, sul1, sul2, tetA, dfr1, int1, integron (1,6 kb) blaTEM, aadA, strA, sul1, sul2, tetA, dfr1, int1, integron (1,6 kb) blaTEM aadA, sul1, int1, integron (1 kb) aadA blaTEM, aadA, sul1, int1, integron (1 kb) tetA tetA

Příloha 4: Přehled izolátů E. coli humánního původu získaných ze stolice průjmujících

lidí použitých pro průkaz genů antibiotické rezistence metodou PCR včetně jejich charakteristiky a detekovaných genů

číslo

izolátu

identifikace

19/ECS 305

E. coli O157

21161

E. coli

767

21161N 21164 2628

E. coli O7

fenotyp

antibiotické

prokázané geny

AST

blaTEM, strA, tetB

rezistence

E. coli

AKfSSu SSu

E. coli

S

E. coli

E. coli O55

ASSu ASSu AKfS

blaTEM, strA, sul2 strA, sul2

blaTEM, strA, sul2 strA

blaTEM, strA, sul2 blaTEM, strA

Vysvětlivky k Přílohám 1 – 4: A = ampicilin, Ac = amoxicilin-kyselina klavulanová, Kf = cefalotin, C = chloramfenikol, S = streptomycin, Su = sulfonamidy, Sxt = trimetoprim-sulfmetoxazol, T = tetracyklin

97