Indukovaná rezistence k chorobám a škůdcům Seminář pořádaný na Ministerstvu zemědělství ČR, Těšnov 65/17, Praha 1, místnost č. 101
Datum a čas pořádání: 22. 9. 2010. v 9,15 hod. Program semináře: Věchet, L.: Indukovaná rezistence rostlin k chorobám a škůdcům. Vrchotová, N.: Ovlivnění syntézy sekundárních metabolitů v rostlinách. Věchet, L.: Indukovaná rezistence pšenice proti padlí travnímu. Šerá, B. : Potenciální využiti rostlin v indukované rezistenci. Havelka, F., Věchet, L.: Vliv induktorů rezistence na tvorbu infekčních struktur v procesu vývoje padlí travního. Burketová, L.: Využití indukované rezistence u řepky proti významným patogenům. Věchet, L.: Vliv termínů ošetření pšenice induktory rezistence na snížení výskytu padlí travního v polních podmínkách. Pořádající organizace: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i. Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, v. v. i. Kontakt: Ing. Lubomír Věchet, CSc.; Email:
[email protected]
1
Indukovaná rezistence rostlin k chorobám a škůdcům. Věchet, L. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Praha 6 - Ruzyně Podle van Loona et al. (1998) je indukovaná rezistence fyziologický stav vytvořený specifickými vnějšími stimuly, který znamená zvýšenou obranyschopnost rostliny. Následnými biotickými změnami jsou zesíleny vrozené obranné mechanizmy rostliny. Tento stav zvýšené rezistence je účinný proti široké řadě patogenů, včetně hub, bakterií, virů, nematod, parazitických rostlin a dokonce býložravému hmyzu (Benhamou & Nicole, 1999; Kesler & Baldwin, 2002; McDowell & Dangl, 2000; Walling, 2000). Rezistenci rostlin indukovanou patogeny prvně rozpoznali Ray (1901) a Beauverie (1901). Chester (1933) potvrdil tyto studie a sumarizací polních pozorování předpokládal, že tato myšlenka může hrát důležitou úlohu v ochraně rostlin v přírodě. Cruickshank and Mandryk (1960) byli první, kdo podali zprávu o SAR na tabáku indukovanou houbovými patogeny. Prvé vysvětlení systémové rezistence u rostlin inokulovaných mozaikovým virem tabáku předložil Ross (1961). Tato problematika se začala ve světě intenzivně studovat od roku 1993 (Schönbeck et al., 1993). Systémová rezistence zahrnuje akumulaci antimikrobiálních sloučenin v části rostliny, vzdálené od místa infekce. Existují čtyři hlavní třídy sloučenin, které mohou akumulovat hydrolázy: k patogenezi vztažené proteiny (PR-proteiny), defensiny (Broekaert et al., 1995), inhibitory proteináz (Schaller & Ryan, 1996) a komponenty buněčné stěny, (Agrios, 1998) zvláště hydroxyprolinem bohaté glykoproteiny (HRGP), dále pak lignin (zpevňující polymer v rostlinách) a jeho prekurzory (Sticher et al., 1997). Podle van Loon et al.(2006) jsou známy čtyři typy indukované rezistence: A) Lokálně získaná rezistence (LAR - local acquired resistance) B) Systémově získaná rezistence (SAR - systemic acquired resistance) C) Indukovaná systémová rezistence (ISR - induced systemic resistance) D) Indukovaná rezistence proti poranění býložravým hmyzem (WIR - wound-induced resistance) Lokálně získaná rezistence. Rezistence zahrnuje akumulaci antimikrobiálních sloučenin v části rostliny, vzdálené od místa infekce. V místě kontaktu mezi patogenem a rostlinou jsou elicitory patogena schopny vzájemně reagovat s receptory rostliny, jako jsou například leucinem bohaté reprodukované proteiny, které nebyly nalezeny v živočišných buňkách. Samotné transdukční dráhy ještě nebyly vysvětleny, ale možná vyžadují tvorbu Ca 2+ nebo proteinkinázy anebo je iniciována tvorba peroxidu vodíku. Peroxid vodíku zabíjí buňky a bylo zjištěno, že indukuje syntézu kyseliny salicylové. Jestliže je kyselina salicylová produkována v dostačujících koncentracích, může být schopna indukovat lokálně získanou rezistenci v okolních živých tkáních, bez potřeby skutečného systémového signálu zahrnutého v SAR. Z toho důvodu hypersenzitivní reakce vede k lokálně získané rezistenci, která sama iniciuje systémově získanou rezistenci. Systémově získaná rezistence. Je vyjádřená v rostlině jako úplná v reakci k napadení patogenem. Je to rezistence tkání rostliny vzdálených od místa pokusu k penetraci patogena. Klasická forma SAR může být spuštěna vystavením rostliny virulentním, avirulentním a nepatogenním mikrobům. Vyžaduje signální molekulu kyseliny salicylové a je spojena s akumulací k patogenezi vztažených proteinů. Může být spuštěna vystavením rostliny virulentním, avirulentním a nepatogenním mikrobům nebo uměle chemikáliemi, tak jako jsou kyselina salicylová, 2, 6-dichloro-isonicotinická kyselina nebo S-metylester kyseliny 1, 2, 32
benzotiazolové, BTH (benzothiadiazol). Tato rezistence je cílená k širokému spektru potenciálních patogenů a ne pouze k jednomu patogenu, který tuto reakci inicioval. Hlavní složkou SAR je akumulace PR proteinů. Vyžaduje signální molekuly kyseliny salicylové ve všech částech rostliny. Narušení schopnosti rostliny akumulovat kyselinu salicylovou končí většinou ve ztrátě projevu k patogenezi vztažených genů a oslabení reakce SAR, a to zejména, když jsou pro indukci použity patogeny. PR proteiny se akumulují v obou, jednoděložných a krytosemenných rostlinách a ukázaly antimikrobiální aktivitu. Indukovaná systémová rezistence. Bakterie rhizosféry jsou přítomny ve velkém množství na povrch kořenů rostlin, kde jim exudáty a produkty lýzy poskytují živiny. Určité rasy rhizosférních bakterií stimulují růst rostliny a jsou tudíž nazývány rhizobakterie podporující růst rostliny. Rasy, které byly izolovány z půd přirozeně potlačující chorobu, jsou zejména fluorescenční Pseudomonas spp. Bylo demonstrováno, že redukují choroby rostlin potlačením v půdě zrozených patogenů. Její funkce je obvykle spojena s dráhou kyseliny jasmonové, vedoucí k defenzinům a inhibitorům proteáz. Tento typ indukované rezistence byl prvně popsán u rostlin Arabidopsis, inokulované nepatogenní bakterií Pseudomonas fluorescens, která kolonizuje kořeny. Listy těchto rostlin projevily rezistenci proti bakteriálnímu listovému patogenu Pseudomonas syringae pv. Tomato. Okamžitě po infekci patogenem jsou stimulovány produkce kyseliny jasmonové a etylénu. Indukovaná rezistence proti poranění býložravým hmyzem. Napadení rostlin hmyzem vede k systémovému projevu inhibitorů proteinázy, které redukují aktivitu enzymů býložravého hmyzu. Napadení hmyzími škůdci aktivuje dráhu octadecanoidu skrze kyseliny lipoxygenové a linoleové, které následně vytvářejí kyselinu jasmonovou. Kyselina jasmonová slouží jako signál pro projev množství sloučenin tak jako inhibitor protézy, polyfenol oxidázy a steoridních glycoalkaloidů, které se zdají, že přispívají k rezistenci rostliny proti mnoha škůdcům a některým patogenům. Infekce houbových, bakteriálních a virových patogenů indukuje odlišné biochemické dráhy, které produkují kyselinu salicylovou, jež následně signalizuje informaci k patogenezi vztažených proteinů a fytoalexinů. Indukovaná rezistence se zkouší proti řadě původců chorob a škůdců na různých plodinách. Je to zejména proti padlí travnímu, rzím, braničnatce pšeničné, fuzariózám u obilnin, ale i u jiných plodin, chorob a škůdců. Velké množství poznatků je hlášeno v indukované rezistenci rostlin k patogenům (houby, bakterie, viry) způsobující hypersensitivní nekrotické reakce (HR); avirulentním patogenům; škůdcům (hmyz, nematody - hlístice). Jako prostředky indukované se zkoušejí elicitory (metabolity patogena, které stimulují v hostitelské rostlině produkci fytoalexinu) biologického původu; abiotické elicitory, tj. chemické produkty, jako benzothiadiazol (BTH), β-aminomáselná kyselina (BABA); dichloroisonikotinová kyselina (INA), kyselina salicylová (SA), anorganické soli, atd. (Kessman et al., 1994; Lyon et al., 1995; Benhamou and Picard, 1999; Cohen, 2001; Kuc, 2001). Dále to je přípravek BABA, neproteinová aminokyselina, která se vyskytuje zřídka v přírodě. Byla zjištěna v kořenových exudátech rajčat na sluncem osvětlených půdách. Co dělá tuto substanci zajímavou je její těsný vztah na vysoce bioaktivní substance. Mšice vystavené ošetření hostitelských rostlin BABA (buď před, nebo po kladení vajíček) měly sklon k větší mortalitě, když parazitovaly. Indukuje rezistenci proti chorobám způsobených plísní okurkovou (Pseudoperonospora cubensis), jakož i nekrotrofními houbami a bakteriemi na mnoha plodinách. Proti rzi slunečnicové (Puccinia helianthi) postřikem na listy nebo namáčením kořenů byl nejvíce efektivní BABA a sodium salicylate – NaSA (salicylát sodný) byl nejméně efektivní. BABA neovlivnila klíčení uredospor, růst klíčku, tvorbu apresoria nebo počáteční vstup P. helianthi, ale silně potlačila kolonizaci mycelia v mezofylu a 3
následně tvorbu pustulí a uredospor. Postřikem rozpustných karbohydrátů na listy kukuřice, rajčat, brambor, rostlin fazolí a stromů jabloní. Na listech rajčat a fazolí byl pozorován vliv proti Botrytis cinerea. Nízká dávka postřiku listů a promáčení půdy také indukovala rezistenci proti několika druhům nematod napadající rajčata, brambory a zeleninu. Aplikace technologie v sadech jabloní a sadech zahrad po tři roky poskytla ochranu proti jejich hlavním škůdcům Cydia pomomella ( Lepidopera). Dále to je neurotransmiter γ-aminomáselná kyselina (GABA). Zkouší se také indukovaná rezistence pšenice proti fusariózám klasu (Fusarium culmorum, Fusarium graminearum) pomocí autoklávené biomasy tohoto patogena. Fungicidní aktivita Curcuma longa ,z rhizomů odvozený materiál kurkumin, byla testována proti Botrytis cineria, Erysiphe graminis, Phytopthtora infestans, Puccinia recondita, Rhyzoctonia solani. Napadení hmyzími škůdci aktivuje dráhu octadecanoidu skrze kyseliny lipoxygenové a linolenové (LOX), které následně vytvářejí kyselinu jasmonovou. Kyselina jasmonová slouží jako signál pro projev množství sloučenin, tak jako inhibitoru proteázy (PINI), polyfenolu oxidázy a steoridních glycoalkaloidů, u kterých se zdá, že přispívají k rezistenci rostliny proti mnoha škůdcům a některým patogenům. Byly studovány interakce mezi odrůdami bílého zelí (Brassica oleracea var. capitata) a housenkou Pieris rapae a mšicí (Brevicoryne brassicae). Vodní extrakt listů neemu (Azadirachta indica (A. Juss )), velký východoindický strom, z jehož plodů se získává léčivý aromatický olej, poskytl kontrolu patogena listové pruhovitosti (Drechslera graminea) na ječmeni. Přípravek byl efektivní jako fungicid Bavistin (Carbendazin). Na poli je projev indukované rezistence pravděpodobně ovlivněn vnějším prostředím, genotypem a výživou plodiny. Druhy běžných půdních hub Trichoderma jsou používány v biologické kontrole patogenních hub rostlin. Je známo, že Trichoderma produkuje širokou rozmanitost medicínských a zemědělsky důležitých sekundárních metabolitů. Tři druhy sloučenin jsou hlavně tvořeny různými druhy tohoto rodu: peptaibols (řada peptidů charakterizovaných přítomností AIB - amino kyselina izomáselná, acetylovaného N-terminus a hydroxylovaných C-terminálních aminokyselin, polyketidy - přírodní sloučeniny obsahující karbonylové a methylové skupiny a terpeny - rozšířeny v přírodě, hlavně v rostlinách jako složky silic (vytvářeny rostlinami jako ochrana před býložravci - éterické oleje), z nichž některé mají antifungální aktivitu.
Literatura Agrios G. N. (1988): Plant Patology. 3rd Ed. Academic Press Inc., San Diego, USA. Beauverie J. (1901): Essais d’immunisation des végétaux contre les maladies cryptogamiques. CR Acad. Sci. Paris. 133: 107-110. Benhamou N., Nicole M. (1999): Cell biology of plant immunization against microbial infection: The potential of induced resistance in controlling plant diseases. Plant Physiol. Biochem. 37, 703-719. Broekaert W. F., Teras F. R. G., Cammue B. P. A., Sborn R. W. (1995): Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the defense system. Plant Physiol. 108, 1353-1358. Cohen Y. (2001): The BABA story of induced resistance. Phytoparasitica. 29, 375-378. Chester K. S. (1933): The problem of acquired physiological immunity in plants. Quat. Rev. Biol. 8, 275-324. Cruickshank I. A.M., Mandryk M. (1960): The effect of stem infestations of tobacco with Peronospora tabacina Adam on foliage reaction to blue mold. J. Aust. Inst. Agric. Sci. 26, 369-372. 4
Kessler, A., Baldwin I. T. (2002): Plant responses to insect herbivory: The emerging molecular analysis. Annu. Rev. Plant Biol. 53, 299–328. Kessman H, Staub T, Hofman C, Maetzke T, Herzog J. (1994): Induction of systemic acquired disease resistance in plants by chemicals. Ann. Rev. Phytopathol. 32, 439459. Lyon G. D., Reglinski T, Newton A. C.. (1995): Novel disease kontrol compounds: the potential to “immunize” plants against infection. Plant Pathol. 44, 407-427. Kuc J. (2001): Concepts and direction of induced systemic resistence in plants and its application. Eur. J. Plant. Pathol. 107,7-12. McDowell J. M., Dangl J. L. (2000): Signal transduction in the plant immune response. Trends Biochem. Sci. 25, 79-82. Ray J. (1901): Les maladies cryptogamiques des végétaux. Rev Gen Bot. 13: 145-151. Ross, A. F. (1961). Systemic acquired resistance induced by localized virus infections in plants. Virology, 14, 340-458. Schaller A., Ryan C. A. (1996): Molecular cloning of a tomato leaf cDNA encoding an aspartic protease, a systemic wound response protein. Plant Mol. Biol. 31, 19731977. Schönbeck F, Steiner U and Kraska T. (1993): Induzierte Resistenz:Kriterien, Mechanismen, Anwendung und Bewertung. J. Plant Dis. Protection. 100, 541-557. Schneider M, Schweizer P, Meuwly P, Métraux J. P.. (1996): Systemic acquired resistance in plants. In: Jeon KW, ed. International review of cytology, vol. 168. San Diego: Academic Press, 303-340. Sticher L., Mauch-Mani B., Metraux J. P. (1997): Systemic acquired resistence. Annu. Rev. Phytopathol. 35, 235-270. Walling, L. L. (2000): The myriad plant responses to herbivores. J. Plant Growth Regul. 19, 195-216. van Loon, L. C., Bakker P. A. H. M, Pieterse C. M. J. (1998): Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 36, 453-483. van Loon L. C, van Oosten V. R., Ton J., de Vos M., Pieters C. M. J. (2006): Adaptive induced resistence response to pathogens and erbivorous insects. In: 8th Conference of the European Foundation for Plant Pathology & British Society for Plant Pathology Presidental Meeting 2006. 13-17 August KVL, Frederiksberg, Denmark.
5
Ovlivnění syntézy sekundárních metabolitů v rostlinách. Vrchotová, N. Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, v.v.i., Branišovská 31, České Budějovice Termíny sekundární a primární metabolity byly vytvořeny Albrechtem Kösselem (nositel Nobelovy ceny za fyziologii a medicinu 1910). Primární metabolismus definoval jako metabolismus, který zajišťuje základní životní funkce organismu, sekundární metabolity jako metabolity, které nejsou sice pro buňku nezbytné, mohou být však užitečné pro organismus jako celek. Tyto termíny se používají dodnes, i když primární a sekundární metabolismus je navzájem propojený a nelze vždy striktně rozlišit, co je primární a co sekundární metabolit (např. některé fenolické kyseliny jsou součástí buněčné stěny). Primární metabolismus zajišťuje základní životní funkce organismu – reprodukce, stavba buněk, fotosyntéza, zajišťování energie… Sekundární metabolity působí jako atraktanty, mají vlastnosti allelopatické (ovlivňují klíčení a růst jiných rostlin tím, že např. uvolňují metabolity kořenovým systémem do půdy, také rozkladem nadzemních částí v půdě, uvolňování látek do ovzduší), antimikrobiální, insekticidní a fungicidní (obrana proti patogenům) a působí jako antioxidanty (ochrana proti UV záření). Všechny rostliny obsahují celkem asi 200 000 různých metabolitů. K primárním metabolitům patří nukleové kyseliny, bílkoviny, lipidy, aminokyseliny, cukry… Sekundární metabolity jsou velmi různorodé, řadíme k nim např.:
terpenické látky (29 000)
alkaloidy (12 000)
polyaminy
steroly
glukosinoláty
fenolické sloučeniny (8 000) - hydroxybenzoová a skořicová kyselina a jejich deriváty, kumariny, flavonoidy (katechiny, flavony a flavonoly, flavanony a flavanonoly, isoflavony, anthokyanidiny a anthokyaniny, chalkony a aurony), stilbeny, ligniny a třísloviny, chinony, …
6
Obr. 1 a 2 znázorňují metabolické dráhy syntézy sekundárních metabolitů.
CO2 Fotosyntéza
Sacharidy
Pentózafosfátový cyklus
Erythróza 4fosfát Cesta šikimové kyseliny Aromatické aminokyseliny
Glykolýza
Fosfoenolpyruvát
Acetyl CoA
Alifatické aminokyseliny
Cyklus trikarboxylových kyselin
Dusíkaté sekundární produkty
Cesta mevalonové kys. mevalonové
Cesta malonové kyseliny Terpény Fenolické látky
7
Obr. 1 Schéma syntézy sekundárních metabolitů (Taiz and Zeiger 1991).
Obr. 2 Schéma
syntézy
fenolických
látek:
skořicová
kyselina
tvořená
z
fenylalaninu
fenylalaninamoniumlyasou (PAL) je prekurzorem řady fenolických látek. U některých rostlin se tvoří 4-hydroxyskořicová kyselina obdobnou drahou z tyrosinu. Další aromatický kruh se tvoří, buď chalkonsynthasou nebo stilbensynthasou (Minami et al. 1989; Adámková et al. 2006).
8
Rostliny zvyšují produkci sekundárních metabolitů jako odpověď na stresové vlivy prostředí. Tyto vlivy jsou velmi různorodé, a to jak biotické (houby, plísně, viry, herbivorní živočichové), tak abiotické (UV záření, kvalita půdy, závlaha, množství ozónu, látky znečišťující životní prostředí). Při poškození dochází v rostlině k uvolnění tzv. signálních molekul (např. hydroxyskořicová a salicylová kyselina), které aktivují enzymy účastnící se biosyntézy sekundárních metabolitů. Klíčovým enzymem je L-fenylalaninamoniumlyasa (PAL), dále je to např. chalkonsynthasa a stilbensynthasa (Adámková et al. 2006). Dochází také k aktivaci syntézy bílkovin (enzymů), které se podílejí na syntéze sekundárních metabolitů. Existuje i zpětná vazba, nahromaděné metabolity inhibují enzymatickou aktivitu. Vzhledem k tomu, že rostlinné sekundární metabolity se široce využívají ve farmakologii, je snaha ovlivnit syntézu metabolitů jak v buněčných kulturách, tak i v polních podmínkách. A poněvadž sekundární metabolity mají antimikrobiální, insekticidní a fungicidní vlastnosti zkoumá se, které typy rostlinných metabolitů by byly vhodné k ochraně zemědělských plodin a vedly by ke snížení toxických syntetických pesticidů apod. K elicitaci jsou používány např. salicyláty, bakteriální a rostlinné extrakty, extrakty z plísní, linolová kyselina, chitosan, alginát, pektiny. K indukci sekundárních metabolitů se však také využívají ionty titanu, lanthanu, benzothiadiazol, UV záření. Existuje celá řada studií zabývajících se stimulací sekundárního metabolismu. Níže jsou uvedeny některé z nich. Tkáňové kultury: Tkáňová kultura Rheum palmatum – elicitor (salicylová kyselina) - indukována zvýšená syntéza anthracenových derivátů (Kašparová et al. 2002). Tkáňová kultura Trifolium pratense – elicitor (síran měďnatý) - indukována zvýšená syntéza flavonoidů a isoflavonoidů (Kašparová et al. 2007). Tkáňová kultura Taxus spp. – elicitor (ionty lanthanu) - stimulace produkce taxolu (Wu et al. 2001). Celé rostliny, polní pokusy: Echinacea purpurea (třapatka nachová) – elicitory (acetylsalicylová kyselina, salicylová kyselina, methylsalicylát, askorbát titanu) - zvýšená syntéza kaftarové a cichorové kyseliny (Kužel et al. 2009).
9
Vitis vinifera (réva vinná) – elicitory (extrakty bohaté na anthrachinony z Rheum palmatum a Frangula alnus) - zvýšená syntéza stilbenů, které působí proti plísni Plasmopara viticola na listech révy (Godard S. et al. 2009). Vitis vinifera – elicitory (chlorid hlinitý) - zvýšená syntéza stilbenů (Adrian et al. 1996). Cucumis sativus (okurka setá) – elicitor (extrakt z Reynoutria sachalinensis) - stimulace syntézy hydroxyskořicových kyselin, zvýšila se odolnost proti padlí (Daayf et al. 1997, 2000). Triticum (pšenice) – elicitory (extrakty z křídlatky sachalinské, zázvoru a kurkumy, salicylová kyselina, benzodithiazol) - sledování vlivu elicitorů na odolnost proti padlí travnímu (Věchet et al. 2006, 2009a, 2009b).
Literatura: Adámková et al. (2006): Chem. Listy 100: 486-494. Daay, F. F. et al. (1997): Plant Physiology 113: 719-727. Daay, F. F. et al. (2000): J. Chem. Ecol. 26: 1579-1593. Godard, S. et al. (2009): Plant Physiology and Biochemistry 47: 827-837. Kašparová, M. et al. (2002): Čes. Slov. Farm. 4: 177-181. Kašparová, M. et al. (2007): Čes. Slov. Farm. 56: 225-229. Kužel, S. et al. (2009): J. Agric. Food Chem. 57: 7907-7911. Minami, E. et al. (1989): Eur. J. Biochem. 185: 19-25. Taiz, L. et al. (1991): Plant Physiology. Věchet, L. et al. (2009a): Aktuální poznatky v pěstování, šlechtění, ochraně rostlin a zpracování produktů, Vědecká příloha časopisu Úroda. Věchet, L. et al. (2009b): Crop Protection 28: 151-154. Věchet, L. et al. (2006): 8th Conference of the European Foundation for Plant Pathology & British Society for Plant Pathology Presidential meeting, Wu et al. (2001): Journal of Biotechnology 85: 67-73. Další literatura k tématu: Adrian, M. et al. (1996): Flavonoids and Other Polyphenols: In Methods in Enzymology (ed. Parker L.), vol. 335, Academic Press 2001. J. Agric. Food Chem. 44:1979-1981. Harborne, J. B. (1993): Introduction to Ecological Biochemistry, Academic Press. Havsteen, B. H. (2002): Pharmacology and Therapeutic 96: 67-202. Lunerová, K. a kol. (2003): Přírodní látky jako chemoprotektiva, Čes. Slov. Farm. 52: 126-130 10
Macholán, L. (2002): Sekundární metabolity, Brno. Míka, V. a kol. (2001): Fenolické látky v lučních rostlinách. VÚRV Praha. Moravcová, J. (2003): Biologicky aktivní přírodní látky, Praha. Procházka, S. a kol. (1998): Fyziologie rostlin, Academia Praha. Velíšek, J. (1999): Chemie potravin, OSSIS Tábor. Vodrážka, Z. (2002): Biochemie, Academia Praha.
11
Indukovaná rezistence pšenice proti padlí travnímu (Blumeria graminis f.sp. tritici). Věchet, L. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Praha 6 - Ruzyně
Abstrakt Induktory biologického a chemického původu snížily napadení pšenice v přirozených podmínkách padlím travním a to v průměru mezi 35% až 54% závažnosti choroby v porovnání s neošetřenou kontrolou. Nejvíce účinný byl přípravek BION, křídlatka sachalinská, v některém roce glycin betain a kurkuma. V posledním roce pokusů byly vysoce účinné extrakty z netýkavky žlaznaté a kopřivy dvoudomé. Induktory rezistence potvrdily dlouhodobý účinek na snížení závažnosti choroby. Klíčová slova: padlí travní; pšenice; induktory rezistence; závažnost choroby Úvod Strategie rezistence k chorobám je důležitým komponentem moderního, udržitelného zemědělství. Pochopení mechanizmů, kterými rostliny tolerují napadení patogeny, hmyzem nebo snášejí abiotické stresy je rozhodující část znalostí, jak zvýšit produkci rostlin a výnos plodin, ve výrazu poklesu globálních zemědělských zdrojů. Indukovaná rezistence ve svém nejširším smyslu znamená kontrolu patogenů a hmyzu předchozí aplikací geneticky programovaných obranných drah rostliny. Je třeba zkoumat schopnost rostlin tolerovat taková napadení a stresy a zjišťovat v podrobnostech různé stránky rezistentních reakcí a mechanizmů rezistence. Systémová rezistence je charakterizována lokální hypersensitivní reakcí vedoucí k programovému odumření buňky kolem infikovaných buněk (Kombrink a Schmelzer, 2001), lokálními změnami ve struktuře buněčné stěny a složení, které zabraňuje další penetraci patogena, lokální a systémovou expresí k patogenezi vztažených (PR) proteinů (van Loon, 1997). Uměle vytvořený elicitor rezistence BION, indukuje rezistenci k chorobám u 18 druhů rostlin (Heil, Ploss, 2006). BION může být aplikován zevně na rostliny a indukuje rezistenci k chorobám u jednoděložných a krytosemenných rostlin. Indukovaná rezistence proti padlí travnímu, biotrofnímu patogen, se začala u nás (VÚRV) sledovat ve spolupráci s ÚEB AV od roku 2004. Za sedm let maloparcelkových pokusů byly dosaženy a publikovány zajímavé výsledky. Cílem pokusů bylo zjistit časovou účinnost induktorů rezistence, účinnost jednotlivých induktorů proti padlí travnímu v polních podmínkách Metody V letech 2008 – 2010 byly založeny maloparcelkové pokusy ve dvou opakováních, délka řádku 1m. Dva sousední řádky byly ošetřeny induktorem, pět řádků bez ošetření. V pokusech byla použita odrůda pšenice ozimé Kanzler, náchylný standard k padlí travnímu. Ošetření induktory bylo provedeno v roce 2008: 1. ošetření 6. 12. 2007, 2. ošetření 28. 4, 2008, 3. ošetření 15. 5. 2008; v roce 2009: 1. ošetření 1. 12. 2008, 2. ošetření 1. 4. 2009 a 3. ošetření 25. 5. 2009; v roce 2010 bylo provedeno pouze 1. ošetření 7. 12. 2009. Hodnocení choroby bylo provedeno v roce 2008 ve dnech 3., 5. a 6. 6., v roce 2009 ve dnech 11., 15., 17., 18. 6. a v roce 2010, ve dnech10. a 11. 6. Infekce padlím travním (Blumeria graminis f.sp. tritici) byla přirozená. Hodnotilo se napadení všech živých listů na rostlině, ve dvou opakováních, 12
v každém opakování 15 rostlin. Závažnost choroby byla hodnocena podle devítibodové stupnice (Saari & Prescott, 1975). Z dat závažnosti napadení bylo vypočteno kumulativní procento napadení – CPLAD (napadení všech listů na rostlině), které vyjadřuje napadení celé rostliny (Věchet & Kocourek, 1987; Briére et al., 1994). V roce 2009 byly použity induktory (Věchet et al, 2005) chemického původu: benzothiadiazol (BTH), kyselina salicylová (SA) a induktory biologického původu: glycin betain, extrakty z dubové kůry (OB, Quercus robur L.), křídlatka sachalinská (RS, Reymoutria sacchalinsis L.), kurkuma (CU, Curcuma longa L.), zázvor (GI, Zingiber officinale Roscoe). Jedna varianta, neošetřená induktory, byla zařazena jako kontrola (KO). Jako induktory byly použity v roce 2008 a 2009: Benzothiadiazol (BTH) - S -m et yl es t er k ysel i n y 1,2,3 -benz ot i az ol ové, kom er ční pří pravek Bi on® (S YNGENTA ). Kyselina salicylová (SA) funguje jako hormon rostlin. Glycin betain (GB) ( N,N,N -t ri m et h yl gl yci n) látka, která hraje důležitou úlohu v rostlinách při různých stresech (vysoké množství solí v půdě, nízké teploty). Dubová kůra (DK) (Quercus robur L.) je používána v biologicko-dynamickém zemědělství. Podporuje odolnost rostlin k chorobám. Křídlatka sachalinská (KS) (Reynoutria sacchaliensis L.) patří do čeledi rdesnovitých (Polygonaceae) extrakty z listů mají preventivní ochranný efekt proti padlí travnímu u mnoha plodin. Kurkuma (KU) tropická rostlina z čeledi zázvorovitých (Curcuma longa L.) obsahuje účinnou složku kurkumin a kurkumol (kurkumový olej) připravený z jejich rhizomů. Zázvor (ZA) (Zingiber officiinale Roscoe) tropická rostlina z čeledi zázvorovitých, rod Zinginber. Oddenky obsahují zingiberelin, zingeron, fellandren, kamfen, zingiberol a jeho estery. V roce 2010 jsme do pokusů zařadili: Kopřiva dvoudomá (KD) (Urtica dioca) je zdrojem léčivých účinků. Hojně rozšířená plevelná rostlina. Netýkavka žláznatá (NZ) (Impatiens gladilufera), jednoletá rostlina, původem z Kašmíru a Nepálu. K nám se dostala na počátku 20. stol. Okrasná a medonosná rostlina. Výsledky Výskyt padlí travního ve třech letech pokusů by rozdílný. Nejnižší byl v roce 2010 a nejvyšší v roce 2009. Ošetření induktory rezistence ve třech odlišných termínech aplikace přineslo ve dvouletých pokusech rozdílné výsledky. V roce 2008 (Tab. 1) se závažnost choroby oproti kontrole (100%) v jednotlivých termínech ošetření pohybovala od 43,97 do 49,78%. Nejlepší průměr ze třech ošetření byl u benzothiadiazolu (BTH), křídlatky sachalinské (KS) a kyseliny salicylové (SA). Nejhorší průměr byl po ošetření glycin betainem (GB). Efektivnější bylo druhé ošetření induktory u 4 induktorů (BTH, SA, GB a KS). První ošetření bylo nejvíce efektivní u dvou induktorů (KU, ZA). V souběžných pokusech byla Tab. 1. Účinek induktorů rezistence na závažnost napadení pšenice, odrůdy Kanzler, padlím travním. 1. ošetření - 6. 12. 2007, 2. ošetření – 28. 4.2008, 3. ošetření – 15. 5. 2008. Induktor KO BTH 1. ošetření
% napadení 13,10 5,40 13
2. ošetření 3. ošetření průměr SA 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr GB 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr DK 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr KS 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr KU 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr ZA 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr Průměr induktory 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření Procento induktory ke kontrole 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření
1,25 5,10 3,92 5,25 3,90 4,65 4,60 13,75 7,60 7,90 9,75 5,20 5,35 5,15 5,23 3,05 2,80 6,70 4,18 4,70 9,45 8,20 7,45 6,50 9,95 7,00 7,82 6,26 5,76 6,39 47,78 43,97 49,78
sledována u odrůdy Vlasta, se specifickými geny rezistence Pm2 a Pm6, vysoce odolná k padlí travnímu, kde závažnost choroby byla 2,6% a odrůdy Mikon, standard s částečnou rezistencí k padlí travnímu, kde závažnost choroby byla 9,7%. Toto srovnání ukazuje, že druhé ošetření BTH dalo lepší výsledek, než odrůda se specifickou rezistencí k padlí travnímu. Druhé ošetření KS bylo podobné jako závažnost padlí travního u odrůdy Vlasta. Efektivita ošetření induktory znamenala ve většině případů nižší závažnost choroby, než byla zjištěna u odrůdy s částečnou rezistencí Mikon. V roce 2009 (Tab. 2), kdy byl nejvyšší výskyt choroby a závažnost choroby po ošetření induktory se pohybovala v rozmezí 8% až 25%, oproti kontrole (100%), kde byla téměř 27%. Nejnižší průměr mělo první ošetření induktory, následovalo druhé a třetí ošetření. Průměrné procento závažnosti ošetření induktory se pohybovalo od 43,56% u prvního ošetření až do 53,93% u třetího ošetření ve vtahu ke kontrole. Nejnižší závažnost napadení byla v průměru zaznamenána po ošetření kurkumou (KU) a nejvyšší po ošetření kyselinou salicylovou (SA). První ošetření bylo nejúčinnější u třech induktorů (BTH, SA a GB), druhé ošetření u dvou 14
induktorů (DK, KS). Třetí ošetření bylo nejméně úspěšné u čtyř induktorů (BTH, GB, DK, ZA). Tab. 2. Účinek induktorů rezistence na závažnost napadení pšenice, odrůdy Kanzler, padlím travním. 1. ošetření 1. 12. 2008, 2. ošetření 1. 4. 2009, 3. ošetření 25. 5. 2009. Induktor KO BTH 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr SA 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr GB 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr DK 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr KS 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr KU 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr ZA 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření průměr Průměr induktory 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření Procento induktory ke kontrole 1. ošetření 2. ošetření 3. ošetření
% napadení 26,70 8,36 12,55 16,75 12,53 10,85 25,36 16,35 17,52 8,35 12,55 16,75 12,55 14,30 12,65 14,40 13,78 12,35 11,70 9,80 11,28 13,15 8,60 11,20 9,98 13,65 13,60 15,55 14,27 11,63 13,86 14,40 43,56 51,91 53,93
Jediné ošetření induktory v roce 2010 (Tab. 3), provedené jako první koncem roku 2009, mělo v průměru závažnost choroby 34,60% ve vztahu ke kontrole(100%). Celkový průměr ošetření induktory byl ve vztahu ke kontrole téměř třetinový. Nejnižší závažnost choroby byla
15
po ošetření netýkavkou žláznatou (NZ), kopřivou dvoudomou (KD) a benzothiadiazolem (BTH). Naopak nejvyšší závažnost choroby byla po ošetření glycin betainem (GB). Tab. 3. Účinek induktorů rezistence na závažnost napadení pšenice, odrůdy Kanzler, padlím travním. 1. ošetření 7. 12. 2009. Induktor KO BTH SA GB DK KS KU ZA KD NZ Průměr induktory Procento induktory ke kontrole
% napadení 3,70 0,68 1,84 2,74 1,40 1,30 0,42 1,84 0,68 0,64 1,28 34,60
Diskuse Použití induktorů rezistence proti padlí travnímu na pšenici snížilo závažnost padlí travního od 34,60% (2010) do 53,93% v průměru s neošetřenou kontrolou. Efektivita termínů ošetření kolísala s rokem pokusů a s typem induktoru. Byla potvrzena dlouhodobá účinnost prvního ošetření induktory v raných stádiích vývoje porostu pšenice ozimé, před nástupem zimy. V pokusech v roce 2010 je náznak úspěšného použití extraktů z netýkavky žláznaté a kopřivy dvoudomé. Bude třeba dále prověřovat účinnost stávajících i dalších případných induktorů rezistence a sledovat vliv počasí na závažnost padlí travního a na účinnost jednotlivých induktorů rezistence. Poděkování Tato práce byla finančně podpořena projektem Ministerstva zemědělství QH 72117.
Literatura Brière S.C., Kushalappa A.C., Mather D.E. (1994): Screening for partial resistance to an isolate of crown rust (Puccinia recondita f.sp. avenae) race 264 in oat cultivars and breeding lines. Can. J. Plant Pathol., 16: 4-55. Heil M., Ploss K. (2006): Induced resistance enzymes in wild plants-do „early birds“ escape from patogen attack? Naturwissenschften. DOI 10.1007/s00114-006-0129-7. Kombrink E., Schmelzer E. (2001): The hypersensitive response and its role in local and systemic disease resistance. Eur. J. Plant Pathol., 107: 69-78. Saari E. E., Prescott J. M. (1975): A scale for appraising the foliar intensity of wheat diseases. Plant Dis. Rep. 59: 377-380. van Loon L. C. (1997): Induced resistence in plants and the role of pathogenesis-related proteins. Eur. J. Plant Pathol., 103: 753-765. Věchet L., Kocourek F. (1987): The effect of the time of treatment of Erysiphe graminis f.s. hordei and on it causes to spring barley. Ochrana Rostlin, 23: 117-124. 16
Potenciální využití rostlin v indukované rezistenci Šerá, B. Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, Na Sádkách 7, České Budějovice, CZ-37005 Stěžejním tématem společného výzkumu několika vědeckých institucí v rámci projektu “Biostimulátory a induktory rezistence biologického původu u obilovin a olejnin” bylo nalézt induktory rostlinného původu navozující systémově získanou rezistenci u pšenice seté a řepky olejky. Na základě literární rešerše byly vytipovány druhy rostlin se specifickými biologickými a chemickými vlastnostmi, u kterých se předpokládal biochemický vliv na růst jiných rostlin. Testovány byly následující rostlinné druhy a jejich části. Dub letní (Quercus robur L.) - kůra Durman obecný (Datura stramonium L.) – nadzemní část Jerlín japonský (Sophora japonica L.) - kůra Kmín kořenný (Carum carvi L.) - plody Kopřiva dvoudomá (Urtica dioica L.) – nadzemní část Křídlatka japonská (Reynoutria japonica Houtt) - list Křídlatka sachalinská (Reynoutria sachalinensis (F. Schmidt) Nakai) - list Křídlatka x česká (Reynoutria x bohemica Chrtek at Chrtková) -list Kurkuma dlouhá (Curcuma longe L.) – oddenek Netýkavka nedůtklivá (Impatiens nolitangere L.) – nadzemní část Netýkavka malokvětá (Impatiens parviflora DC.) – nadzemní část Netýkavka žláznatá (Impatiens glandulifera Royle) – nadzemní část Šalvěj lékařská (Salvia officinalis L.) – nadzemní část Zázvor pravý (Zingiber officinale Roscoe) - oddenek Práce byla podpořena grantem NAZV č. QH72117 a výzkumným záměrem ÚSBE č. AV0Z60870520.
17
Indukovaná rezistence k padlí travnímu Blumeria graminis f.sp. tritici Havelka, F.1, 2, Věchet, L.2 2 1
VURV,v.v.i, OGŠKP, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně,
Česká zemědělská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Kamýcká 129, Praha 6 – Suchdol, 165 21,
[email protected],
[email protected] Abstrakt V rámci testování biostimulátorů a induktorů k indukované rezistence u pšenice Triticum aestivum L. byla zvolena odrůda Kanzler, standard, náchylný k padlí travnímu. K vlastnímu testování bylo vybráno čtrnáct látek, induktorů rezistence. Jedná se o induktory jak živočišného původu, odpadu z jatek s odlišnou koncentrací dusíku, obsahem sušiny a přítomností enzymových, či neenzymových hydrolyzátů chromitých postružin a hydrolyzátů kolagenního materiálu, tak rostlinných produktů. Statisticky významné účinnosti při inhibici jednotlivých infekčních fází vůči padlí travnímu prokázaly induktory netykavky žláznaté, glycin betain, křídlatky žláznaté etc.
Klíčová slova: padlí travní; infekční struktury; induktory rezistence; odpady živočišného původu
Úvod Padlí travní Blumeria graminis f.sp. tritici patří mezi časté každoročni, tzv. biotrofní patogeny pšenice i ostatních zástupců čeledi Graminea. Šíření padlí je uskutečňováno asexuální cestou pomocí konidií unášených větrem /1/. Počáteční příznaky výskytu napadení se nejčastěji objevují na listové čepeli a pochvě ve formě mycelia se sporami (konidie) /2/. Vývojové fáze padlí v období odnožování pšenice lze pozorovat, jako bělavé, mycelium. Změna barevnosti z bílé na šedohnědou, či béžovou probíhá nejčastěji v době metání. Po ošetření stimulátory rezistence indukující obranné mechanizmy rostlin byly zjišťovány reakce v různých infekčních fázích: množství klíčících a neklíčících konidií, vliv induktorů na délky klíčků ve čtvrté hodině od inokulace, délku primárních a sekundárních hyf v sedmnácté a čtyřicáté osmé hodině. Získané údaje nám umožní rozšířit spektrum látek využitelných v integrované ochraně kulturních plodin.
18
Materiál a Metoda U odrůdy Kanzler bylo, jako infekční inokulum zvoleno padlí travní Axminster s genem rezistence Pm1 získaný z oblasti Hadačka u Kralovic, Plzeň. Vybrané induktory rezistence byly aplikovány na pšenici v květináčích ve stáří čtrnácti dní. Induktory pocházející ze živočišných odpadů byly značeny: vzorek A hydrolyzát kolagenního materiálu, obsah sušiny min.90%, dusík v sušině min. 17%.Vzorek B hydrolyzát enzymové hydrolýzy, sušina min. 90%, dusík v suš. min. 14%. Vzorek C neenzymový hydrolyzát, sušina min. 90%, dusík 15%. Vzorek D enzymová hydrolýza, sušina max. 98%, dusík 16%. Sedm dní po ošetření následovala inokulace čtrnácti denním padlím prostřednictvím sedimentační věže /3/. K testování účinnosti látek byla vybrána metoda listových segmentů umístěných na benzothiadiazolovém agaru umístěných v plastových krabičkách. Monitoring infekčních fází probíhal pod mikroskopem ve 4 hod (klíčení konidií), 17 hod. (počátek tvorby apresoria a prim. hyf) a 48 hod. (tvorba sek. hyf) po inokulaci Výsledky a diskuse Ve fázi čtvrté hodiny po počátku infekce bylo zjištěno: Tab.1 Induktory
Kontrola GB Netykavka Induktor C Křídlatka Kys. SA BTH Kopřiva Induktor A Kmín Jerlín Blín Kurkuma D Dubová kůra Šalvěj Zázvor B
4hodina infekce Celkem Infekčních konidií (%) 75 7 8,5 12,5 18,5 20,5 47,5 25 26 26,5 30 33,5 40 43 47,5 50 68,5 78,5
Neklíčící
Klíčení
Klíčení při tvorbě apresoria
Tvorba apresoria
25 93 91,5 87,5 81,5 79,5 52,5 75 74 73,5 70 66,5 60 57 52,5 50 31,5 21,5
68 7 8 12,5 18,5 20,5 41,5 24,5 12,5 24 30 33 40 43 41,5 50 68,5 49,5
1 0 0,5 0,5 0 0 1,5 0 2,5 2 0 0 0 0 4,5 0 0 12,5
6 0 0 0 0 0 4,5 0,5 11 0,5 0 0,5 0 0 1,5 0 0 16,5
U vzorků ve čtvrté hodině po infekci statisticky významné inhibice vykázaly induktory GB: 93 % neklíčících konidií, 7 % infekčních konidií. Impatiens glandulifera: 91,5% neklíčících konidií, 8,5 % infekčních konidií. Induktor C: 87,5 % neklíčících konidií, 12,5 % infekčních konidií.
19
Reynoutria sachalinensis: 81,5 % neklíčících konidií, 18,5 % infekčních konidií. Neošetřená kontrola vykazovala za induktorem B druhého nejvyššího počtu klíčících konidií. viz. tab. 1. Lze tedy konstatovat, že výše jmenované induktory významně potlačují počátek infekční fáze, fázi klíčení konidie. Pozitivně tak přispívají k nižšímu listovému napadení v pozdější fázi. Ve fázi sedmnácté hodiny po počátku infekce bylo zjištěno: Tab. 2 17 hodina infekce Induktory Kmín Netykavka Induktor C Dubová kůra Blín Křídlatka Kurkuma Jerlín Šalvěj BTH Induktor A Zázvor Induktor B Induktor D Kys. SA Kopřiva Kontrola GB
Celkem Infekčních konídií (%) 23,5 27 35 47 47,5 48,5 51 56,5 63,5 64 65,5 65,5 73 73 79 79,5 87 89
Neklíčící
Klíčící
76,5 73 65 53 52,5 51,5 49 43,5 36,5 36 34,5 34,5 27 27 21 20,5 13 11
3,5 7,5 9,5 5 12 17 20 11 20 14,5 16 10,5 13,5 12,5 17,5 11 12,5 8
Klíčení při tvorbě apresoria 4,5 6 6,5 11 10,5 10,5 5 19,5 10 15,5 12,5 16 19,5 24 13,5 27 40 29
Tvorba ap.
Tvorba prim.hyf
Tvorba sek.hyf
11,5 12,5 16 20 25 18,5 22,5 20 25,5 24,5 28,5 33 38,5 35,5 40 37,5 32 39
4 1 3 11 0 2,5 3,5 6 4 9,5 8,5 6 1,5 1 6,5 4 2,5 13
0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 1,5 0 0 0
V 17 h při tvorbě apresoria, primární hyfy nejlepších výsledků dosáhly: Carum carvi:76,5 % neklíčících konidií, 23,5 % infekčních konidií. Impatiens glandulifera: 73 % neklíčících konidií, 27 % neklíčících konidií. Induktor C:65% neklíčících konidií, 35 % neklíčících konidií. Hyoscyamus niger:52,5 % neklíčících konidií, 47,5 % neklíčících konidií. Testovaný induktor glycin betain vykázal vyššího počtu infekčních konidií 89%, kontrola 87 %. Oproti předchozí fázi ve čtvrté hodině induktor GB neprokázal inhibiční účinky v 17 hodině. Z předchozích výsledků je zřejmé, že účinnost induktoru glycin betainu leží převážně v počáteční fázi inhibice ve čtvrté hodině. 7 % výskyt klíčících konidií to jen potvrzuje. Sedmnáctá hodina, tak odkryla podstatu samotné efektivnosti výše jmenovaného induktoru i dalších, rozdílnou účinnost v iniciaci inhibice v pozdějších fází, jako např. tvorby apresoria a primárních hyf. viz. tab. 2.
20
Naproti tomu induktory z netykavky žláznaté a křídlatky sachalinské prokázaly stabilní antifungální aktivitu v jednotlivých infekčních fází viz. tab. 1, 2. Ve fázi čtyřicáté osmé hodiny bylo zjištěno: Tab. 3 Induktor Křídlatka GB Jerlín Blín Kurkuma Dubová kůra Kopřiva Induktor B Kys. SA Induktor C Šalvěj Induktor A Kmín BTH Netykavka Induktor D Zázvor Kontrola
48 hodina infekce Celkem infekčních konídií (%) 20 25 40 43,5 45,5 59,5 53 62 63,5 67 69,5 69,5 73 74,5 77 80 80,5 90,5
Neklí čící
Klíčící
80 75 60 56,5 54,5 40,5 47 38 36,5 33 30,5 30,5 27 25,5 23 20 19,5 9,5
18 3,5 7,5 11,5 18,5 7 8,5 9 11,5 9 7,5 15 14,5 15 4,5 13 11,5 12,5
Klíčení při tvorbě apresoria 0 5,5 1 7,5 4,5 4 2 8 4 8,5 4,5 10,5 6,5 15 5,5 7 5 14
Tvorba ap.
Tvorba prim.hyf
0,5 7 4,5 15 15 18 16,5 18,5 16 18,5 15,5 18 19,5 22,5 21 15,5 12,5 16
0,5 6 6 8,5 6 21 17 6 9 10 8,5 14 11,5 14,5 23 24,5 13,5 16,5
Tvorba sekundár ních hyf 1 3 2 1 1,5 9,5 9 20,5 23 21 33,5 12 21 7,5 23 20 38 31,5
Celkem primárních a sekundárních hyf 1,5 9 8 9,5 7,5 30,5 26 26,5 32 31 42 26 32,5 22 46 44,5 51,5 48
Uvedené výsledky 48h charakterizovány typickou tvorbou primárních a sekundárních hyf poodkryly vliv jednotlivých induktorů v čase. Statisticky významných výsledků bylo dosaženo: Reynoutria sachalinensis: 80 % neklíčících konidií, 20 % infekčních konidií. GB:75 % neklíčících konidií, 25 % infekčních konidií. Sophora japonica:60 % neklíčících konidií, 40 % infekčních konidií. Hyoscyamus niger:56,5 % neklíčících konidií, 43,5 % infekčních konidií. Komerční přípravek glycin betain prokázal schopnost indukovat obranné mechanismy rostliny, jak ve 4 h, tak samotný přechod z primárních hyf na konečnou fázi tvorby sekundárních hyf, nikoliv však zabránit přeměnu apresoria v primární hyfu v 17 h. Povzbudivých výsledků bylo dosaženo u rostlinných induktorů křídlatky sachalinské, jerlínu japonského a překvapivě i u blínu. Induktory pocházející z živočišných odpadů dosáhly průměrných, až podprůměrných výsledků ve 48 h. Vysoké zastoupení dusíku v induktorech A,B,C,D je možnou příčinou možné iniciace rozvoje choroby padlí travního a jednotlivých fází, nikoliv jejich inhibice viz tab. 3.
21
Tab. 4 Vlivu induktorů na délku infekčních vláken Induktor A B C D Blín BTH Dubová kůra GB Jerlín Kopřiva Kmín Kurkuma Křídlatka Netykavka SA Šalvěj Zázvor Kontrola
Délka klíčku(μm) 15,5 17,1 6,9 17,9 9,1 17,5 9,75 15,5 4,45 8,5 6,7 7,4 17,3 4,2 4,6 5 11,7 15,5
Délka primární hyfy (μm) 22,9 29 28,45 25,85 21,7 20,45 26,5 31,3 22,3 29,5 27,1 32,5 22,3 31,3 27,7 29,5 31,3 31,3
Délka sekundární hyfy (μm) 52,75 219,3 127,15 110,5 69,9 72,1 100,9 151,23 97,7 97,7 52,9 148,5 84,9 129,7 190,5 212,9 200,1 193,7
Vliv induktoru iniciovat rezistenci vůči padlí travnímu, tak jeho vlivu na délku infekčních struktur byl pozorován u řady testovaných látek s potenciálním využitím při indukované rezistenci a naopak. Výše zmiňované induktory živočišného původu vykazovaly jedny z nejvyšších hodnot délek infekčních vláken. Přesahující hodnotu 10 (μm) u délky klíčku konidie ve 4 h. Netykavka žlánatá statisticky významnou měrou inhibovala iniciaci délky klíčku s délkou 4,2 (μm) viz. tab. 4. Naproti tomu křídlatka, účinný induktor stimulovala klíček konidie k délce dosahující 17,3 (μm), spolu s dalšími induktory, jako např. BTH 17,5 (μm) nebo glycin betain 15,5 (μm), které rovněž významnou měrou přesáhly nejnižší naměřenou délku klíčku konidie s kontrolou 15,5 (μm). Obdobné výsledky byly zaznamenány, jak při tvorbě primární hyfy, tak sekundární hyfy v 17 a 48h. Důležitého ukazatele účinnosti induktoru vůči padlí travnímu. Nejnižší délky u sekundárních hyf vykazoval překvapivě induktor A 52,7 (μm), u kterého jsme nepředpokládaly výše zmiňované výsledky. Na základě již citovaného předpokladu vlivu obsahu dusíku i výsledkům ostatních induktorů B, C, D s délkou přesahující 100 (μm) viz. tab. 4. Kmín spolu s blínem zaznamenaly druhé a třetí nejnižší délky sekundárních hyf 52,9 a 69,9 (μm) oproti kontrole 193,7(μm). Pozitivní vliv induktoru a samotný princip účinku na délku infekčních vláken nelze spolehlivě ze zjištěných dat potvrdit ani vyvrátit. Lze se domnívat, že se jedná o spíše kladný vedlejší efekt inhibice rozvoje a přechodu jednotlivých infekčních fází.
22
Hodnocení Použité induktory naznačily jejich možné využití pro posílení obranných schopností pšenice proti padlí travnímu. Bude ale nutné v tomto výzkumu dále pokračovat. Poděkování Tato práce byla finančně podpořena projektem Ministerstva zemědělství QH 72117.
Literatura /1/ Daayf F. et al. (1995): The effects of plant extracts of Reynoutria sachalinensis on powdery mildew development and leaf physiology of long english cucumber. Plant dinase. 79, no. 6: 577-580. /2/ Garcion C. et al. (2007): Mechanism of defence to pathogens: biochemistry and physiology. In: Walters D. et al. Induced resistance for plant disease control: A sustainable approach to crop protection. Oxford: Blackwell Publishing. 109-132. /3/ Yamaoka N., Matsumoto I., Nishiguchi M. (2006),: The role of primary germ tubes (PGT) in the life cycle of Blumeria graminis: The stopping of PGT elongation is necessary for the triggering of appressorial germ tube (AGT) emergence. Physiological and molecular plant pathology. 69, is. 4-6, 153-159. /4/ Sarah E. P., Green R. J. (2001): Infection structures of biotrophic and hemibiotrophic fungal plant pathogens. Molecular plant pathology, vol.2, is. 2, 101–108. /5. Carver T. L.W, Roberts P. C., Thomas B. J., Lyngkaer M. F. (2001): Inhibition of Blumeria graminis germination and germling development within colonies of oat mildew. Physiological and molecular plant pathology, 58: 209-228.
23
Využití indukované rezistence u řepky proti významným patogenům Burketová, L.1, Špácová, M.2, Šašek, V.1,3 a Valentová, O.2 1 – Ústav experimentální botaniky AV ČR, Laboratoř patofyziologie, Praha 2 – Vysoká škola chemicko-technologická, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Ústav biochemie a mikrobiologie, Praha 3 – Česká zemědělská univerzita, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Prahal Abstrakt Možnost využití indukované rezistence u řepky proti houbovým patogenům Leptosphaeria maculans, původci fomové hniloby řepky, a Sclerotinia sclerotiorum, původci hlízenky byla sledována v v laboratorních podmínkách. Byly testovány jednak chemické induktory, jejichž účinnost byla prokázána v jiných patosystémech, hydrolyzáty kolagenu a elicitory produkované L. maculans do kultivačního média. V inokulačních testech bylo zjištěno, že k oběma patogenům lze indukovat rezistenci chemickými induktory, v případě L. maculans byly také účinné separované elicitory a hydrolyzáty kolagenu. Klíčová slova: Leptosphaeria maculans, Sclerotinia sclerotiorum, fomová hniloba, hlízenka, indukovaná rezistence, elicitor, hydrolyzáty kolagenu. Úvod Trendem současného moderního zemědělství je snižovat vstupy cizorodých látek, které přecházejí do potravního řetězce. Vzhledem k tomu, že jsou hlavním zástupcem skupiny těchto nebezpečných látek pesticidy, je žádoucí věnovat pozornost alternativním metodám ochrany rostlin. U řady patosystémů byla prokázána úspěšnost tzv. indukované rezistence. Jedná se o přístup, který využívá vlastního obranného potenciálu rostliny, kterým je rostlina vybavena. O tom, jestli se rostlina patogenu ubrání, rozhoduje rychlost, jakou je patogen rozpoznán a zda jsou bezprostředně aktivovány obranné arzenály napadené rostliny. Indukovaná rezistence využívá strategie přípravy rostliny na infekci ještě před výskytem patogena v porostu a to buď přímou aktivací obranných genů a tím spuštěním syntézy obranných proteinů a toxických sekundárních metabolitů, nebo určitým zcitlivěním rostliny, která na patogenní organismus reaguje mnohem rychleji než normálně (Chester 1933, Walters et al. 2005, Conrath 2006). K tomuto účelu lze využít látky produkované patogenem, složky jeho buněčných stěn (Angelova et al. 2006), ale také signální látky, které se v rostlinách po rozpoznání patogena syntetizují a signalizují napadení i v částech rostliny vzdálených od místa napadení. Mezi tyto látky patří především rostlinné hormony, jejichž role byla prokázána při obranné odezvě k různým typům patogenů. Cílem naší práce bylo nalézt látky indukující rezistenci k významným patogenům řepky a popsat mechanismus jejich účinku. Zaměřili jsme se proto na houbové patogeny Leptosphaeria maculans, způsobující na řepce fómovou hnilobu, a Sclerotinia sclerotiorum, původce hlízenky obecné. L. maculans je hemibiotrofní patogen. Po infekci rostlin askosporami brzy na podzim kolonizuje mezibuněčné prostory hostitele téměř bez příznaků choroby. V pozdější fázi vegetace přechází v nekrotrofní stádium, na stonku se objevují léze a dochází k trouchnivění bazální části stonku. Patogen dále přežívá na kořenovém krčku odumřelé rostliny, kde dochází i k pohlavnímu rozmnožování (Howlett et al. 2001). Díky němu je L. maculans patogen s obrovským evolučním potenciálem a velmi rychle překonává 24
monogenně založenou rezistenci získanou především introdukcí genů rezistence z druhu Brassica rapa (Rouxel a Balesdent 2005). S. sclerotiorum je nekrotrofní patogen, který vyvolává nekrózy stonku a listů. Mrtvé pletivo je pak pro patogena zdrojem živin a umožňuje mu dokončit jeho vývojový cyklus. V našich experimentech jsme jednak sledovali, které ze známých signálních drah se obranné odezvy účastní a dále se pokusili nalézt induktory a elicitory rezistence vůči těmto patogenů. Materiál a metody Rostliny řepky olejky (odrůda Columbus) byly pěstovány hydroponicky za řízených podmínek v kultivačním boxu (fotoperioda 16/8h; 22/18°C). Ve stáří 14 dnů byly ošetřeny postřikem induktory a elicitory. Jako chemické induktory rezistence byly použity látky se známým účinkem u jiných patosystémů: benzothiadiazol (BTH) – 30 µM, kyselina salicylová (SA) – 3 mM, kyselina β- aminomáselná (BABA) – 10 mM, riboflavin – 1 mM, menadion bisulfit sodný (MSB) - 200 µM. Zdrojem elicitorů bylo kultivační médium L. maculans izolát JN2. Segmenty mycelia pěstovaného na zpevněném médiu V8 byly vloženy do tekutého média Fries (Férézou et al. 1977) a kultivovány 14 dní ve tmě za stálého třepání (100 ot./min). Kultivační médium bylo poté odděleno od mycelia filtrací, dialyzováno proti vodě (cut off dialyzační membrány 8 kDa) a použito pro aplikaci na rostliny. Dále byly použity hydrolyzáty kolagenu HCu, C1, C2 a K1 z UTB Zlín. 72h po aplikaci induktorů a elicitorů byly děložní listy inokulovány suspensí konidií L. maculans izolátem JN2 (107/ml), po dvou týdnech skenovány a velikost lézí stanovena na základě obrazové analýzy pomocí programu DPlan4Lab. Kontrolní rostliny byly ošetřeny vodou a kultivačním médiem bez L. maculans. Pro hodnocení rezistence k S. sclerotiorum byly pravé listy řepky inokulovány připevněním terčíku mycelia o průměru 5 mm na adaxiální stranu listu. Rostliny byly poté udržovány téměř ve 100 % vlhkosti vzduchu. 24 h po inokulaci byly listy skenovány a velikost lézí kvantifikována pomocí programu DPlan4Lab. Výsledky a diskuse Účinnost indukované rezistence byla potvrzena u řady patosystémů, ale jednalo se převážně o biotrofy, tj. patogeny, kteří jsou závislí na metabolismu hostitelské rostliny a proto hostitelské buňky neusmrcují. Pokud jde o patogeny s jiným životním stylem, je literárních údajů poskrovnu. V našich experimentech jsme hodnotili účinek látek, které byly dříve popsány jako induktory rezistence proti jiným patogenům. Děložní listy řepky byly ošetřeny induktory a s odstupem 72h inokulovány konidiální suspensí L. maculans, nebo byly pravé listy inokulovány terčíky mycelia S. sclerotiorum. Výsledky inokulačních testů (Obr. 1) potvrdily, že známé induktory rezistence BTH a SA vyvolávají rezistenci i v patosystému řepka - L. maculans v děložních listech. Naopak MSB, který byl dříve popsán jako účinný induktor rezistence k tomuto patogenu (Borges et al. 2003) elicitační účinek v našich experimentech neprokázal. Vzhledem k tomu, že patogeni produkují řadu látek, které mají usnadnit patogenezi a současně v rostlině spouštějí obranné reakce, analyzovali jsme látky produkované L. maculans do kultivačního média a hodnotili jejich schopnost indukovat rezistenci pomocí inokulačního testu. Protože L. maculans produkuje do média i řadu nízkomolekulárních metabolitů včetně toxinů, které není možné aplikovat na rostliny jako elicitor vzhledem k jejich vysoké fytotoxicitě, byly tyto látky nejprve odstraněny pomocí dialýzy. Výchozí filtrát kultivačního média a nízkomolekulární frakce výchozího filtrátu získaná při dialýze musely být 10x zředěny, aby je bylo možné k aplikaci na rostliny použít. Samotné kultivační médium bez L. maculans, které sloužilo jako 25
kontrola, bylo zpracováno stejným způsobem. Z dosažených výsledků vyplývá, že výchozí filtrát kultivačního média L. maculans, stejně jako jeho vysokomolekulární (>8 kDa) a nízkomolekulární (<8 kDa) složky indukují rezistenci proti L. maculans v děložních listech.
20
2
velikost léze [mm ]
25
15 10 5 0 -v ola r t ko
a od
H BT
SA
A
B BA
av ofl rib
in
t a B ium ilt rá Da Da kD f 8 MS méd 8k <8k . > > m . . m L. ola diu L.m L.m ntr me ko
Obr.1. Vliv induktorů a elicitorů na retardaci růstu L. maculans v děložních listech řepky cv. Columbus. Induktory: BTH – benzothiadiazol (30 µM), SA - kyselina salicylová (3 mM), BABA kyselina β- aminomáselná (10 mM), riboflavin (1 mM), MSB - menadion bisulfit sodný (200 µM); elicitory: médium - kultivační médium (kontrola), L.m. filtrát – filtrát kultivačního média po kultivaci L. maculans, a dále frakce nad a pod 8 kDa připravené dialýzou média, resp. filtrátu kultury L. maculans. Chybové úsečky značí interval spolehlivost.
Při hledání dalších možných induktorů rezistence řepky k fomové hnilobě byly také testovány odpady kožedělného průmyslu a použity jak hydrolyzované postružiny, tak hydrolyzáty čistého kolagenu. Po jeich aplikaci na rostliny a následné inokulaci L. maculans jsme zjistili významné snížení rozsahu nekrotických lézí na děložních listech (Obr. 2). Z tohoto výsledku lze usuzovat na perspektivní využití tohoto odpadu v ochraně rostlin. Obr. 2. Účinek hydrolyzátů kolagenu na rozvoj příznaků způsobených L. maculans. Rostliny byly ošetřeny hydrolyzáty HCu. Kontrolní rostliny byly ošetřeny vodou. BTH - pozitivní kontrola benzothiadiazol. Chybové úsečky představují střední chybu průměru. Hodnoty průkazně se lišící od kontroly (voda) na základě nepárového t-testu jsou označeny * (p < 0,05) a ** (p < 0,01).
Experimenty s patogenem S. sclerotiorum demonstrovaly, že rezistenci lze indukovat i k nekrotrofním patogenům. Jako induktorů lze využít látky aktivující dráhu SA (tj. SA, BTH) i JA (MeJA) a ethylen (ACC) (Obr. 3).
26
Obr. 3. Indukce rezistence k hlízence (Sclerotinia sclerotiorum) pomocí chemických induktorů. Plocha nekrotických lézí 24h po inokulaci. Kontrola- ošetření vodou, ACC (prekursor ethylenu), BTH – benzothiadiazol, SA – kyselina salicylová,DMSO-dimethylsulfoxid, MeJa – methyljasmonát.
Naše výsledky nasvědčují možnosti uplatnění indukované rezistence v ochraně řepky proti oběma studovaným patogenům. Poděkování Tato práce vznikla díky projektům MZe - NAZV QH72117 a QH81201. Použitá literatura Angelova, Z., Georgiev, S., Roos, W. (2006): Elicitation of plants. Biotechnology and biotechnological Equipment 20: 72-83. Borges, A. A., Cools, H. J., Lucas, J. A. (2003): Menadione sodium bisulphite: a novel plant defence activator which enhances local and systemic resistance to infection by Leptosphaeria maculans in oilseed rape. Plant Pathol. 52: 429-436. Conrath, U. (2006): Priming: Getting Ready for Battle. Molecular Plant-Microbe Interactions 19: 1062-1071Fitt B.D.L. et al. 1997. Prospects for developing a forecasting scheme to optimise use of fungicides for disease control on winter oilseed rape in the UK. Aspects of Applied Biology 48: 135–42. Chester, K. S. (1933): The Problem of Acquired Physiological Immunity in Plants. The Quarterly Review of Biology 8: 275-324. Férézou, J. P., Riche, C., Quesneau-Thierry, A., Pascard-Billy, C., Barbier, M., Bousquet, J. F., Boudart, G. (1977): Structures de deux toxines isolées des cultures du champignon Phoma lingam Tode: La sirodesmine PL et la desacetylsiradesmin PL. Journal de Chimie 1: 327-334. Howlett, B. J., Idnurm, A., Pedras, M. S. C. (2001): Leptosphaeria maculans, the Causal Agent of Blackleg Disease of Brassicas. Fungal Genetics and Biology 33: 1-14. Rouxel, T., Balesdent, M. H. 2005. The stem canker (blackleg) fungus, Leptosphaeria maculans, enters the genomic era. Molecular Plant Pathology 6: 225-241. Walters, D., Newton, A. and Lyon, G. (2005): Induced resistance: helping plants to help themselves. Biologist 52: 28-33.
27
28
29
