20
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Penambahan Ekstrak Herbal terhadap Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat Pengaruh penambahan ekstrak herbal terhadap pertumbuhan BAL pada saat proses fermentasi susu dapat dilakukan secara langsung dengan menghitung populasi pada saat proses fermentasi susu. Saat proses fermentasi, BALyang tumbuh menghasilkan asam dan akan menurunkan pH susu. Nilai pH yang turun lebih cepat dan total asam tertitrasi (TAT) yang lebih tinggi juga dapat digunakan sebagai indikator meningkatnya populasi BAL pada susu yang ditambahkan ekstrak herbal. Nilai pH Penurunan pH dadih dan kefir diukur selama fermentasi, dan fermentasi dihentikan saat pH mencapai 4.5 atau titik isoelektrik. pH dadih plain mengalami fase lag pada satu jam pertama (Gambar 1). Pada jam kedua pH dadih mulai mengalami penurunan. Penambahan herbal pada dadih mempercepat penurunan pH. Penurunan pH dadih herbal berbeda nyata lebih cepat (P<0.05) dimulai pada jam ke-3 (5.826, 5.732) dibandingkan dengan pH dadih plain (5.967). pH 4.5 tercapai tercepat oleh dadih O. americanum L diikuti oleh M. spicata L dan dadih plain. pH dadih herbal (O. americanum L dan M. spicata L) mencapai pH 4.5 pada jam ke-8 sedangkan pada dadih plain pada jam ke-12. Penambahan herbal juga mempercepat penurunan pH kefir (Gambar 2). Penurunan pH kefir nyata lebih cepat (P<0.05) dimulai pada jam ke-9 (5.6045.685) dibandingkan dengan pH kefir plain (5.718). pH 4.5 tercapai tercepat oleh kefir M. spicata L diikuti kefir O. americanum L dan kefir plain. Kefir herbal herbal (O. americanum L dan M. spicata L) mencapai pH 4.5 pada jam ke-14, sedangkan kefir plain pada jam ke-16. Fermentasi
terjadi
sebagai
akibat
pertumbuhan
mikroba
yang
menggunakan laktosa sebagai sumber metabolit. Hal ini terjadi karena mikroba akan
mengkatabolisasi
sumber
karbon
(glukosa
dan
galaktosa)
untuk
21
menghasilkan energi pada kondisi anaerobik untuk memproduksi asam laktat. Pembentukan asam laktat pada kondisi anaerobik akan menurunkan pH susu. 7 6 5 pH
4 3 2 1 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Waktu (Jam)
Gambar 1 Penurunan pH dadih plain ( ) atau dengan penambahan M. spicata L( ) dan O. americanum L ( ) selama proses fermentasi pada suhu 37oC. 7 6 5 pH
4 3 2 1 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17
Waktu (Jam)
Gambar 2 Penurunan pH kefir plain ( ) atau dengan penambahan M. spicata L( ) dan O. americanum L ( ) selama proses fermentasi pada suhu ruang. Pada penelitian ini nilai pH awal dadih serta kefir M. spicata L dan O. americanum L tidak berbeda nyata dengan dadih serta kefir plain. Hal ini mengindikasikan bahwa keasaman ekstrak herbal minimal. Penurunan pH dadih dan kefir herbal yang lebih cepat mengindikasikan adanya komponen herbal yang
22
mempercepat pertumbuhan mikroba (BAL) dan mempercepat penurunan pH susu fermentasi. Penurunan pH dadih dan kefir ekstrak herbal yang lebih cepat dibandingkan dengan dadih dan kefir plain juga mengindikasikan bahwa pertumbuhan BAL tidak terhambat akibat penambahan ekstrak herbal. Hal ini didukung oleh penelitian menggunakan BAL Lb. acidophilus RM-01 dan Lc. lactis RM-01 pada keju yang ditambahkan kemangi dan peppermint bahwa populasi BAL keju yang ditambahkan ekstrak kemangi dan peppermint lebih tinggi dibandingkan keju plain (Ribka 2012). Pada penelitiannya terjadi peningkatan populasi BAL pada keju yang ditambahkan ekstrak peppermint sebesar 2.25% (7.68 log 10 cfu/g) dan dengan yang ditambahkan ekstrak kemangi sebesar 5.59% (7.96 log 10 cfu/g) dibandingkan dengan keju plain (7.5 log 10 cfu/g). Penambahan ekstrak kemangi dan peppermint tidak menghambat pertumbuhan BAL. Total Asam Tertitrasi TAT dadih herbal berbeda nyata lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan TAT dadih plain pada jam ke-6 (Gambar 3). TAT tertinggi adalah dadih O. americanum L (1.09%), diikuti oleh M. spicata L (0.89%) dan dadih plain (0.69%). Total asam tertitrasi (TAT) kefir juga diukur selama fermentasi. TAT dihitung berdasarkan persentase (%) asam laktat selama fermentasi (Gambar 4). TAT kefir herbal berbeda nyata lebih (P<0.05) dibandingkan dengan TAT kefir plain. TAT tertinggi adalah kefir O. americanum L (1.69%), diikuti oleh kefir M. spicata L (1,65%) dan kefir plain (1.25%). Tingginya total asam tertitrasi (TAT) pada susu fermentasi yang ditambahkan herbal dibandingkan dengan susu fermentasi plain disebabkan tanaman herbal tersebut mengandung fenol yang merupakan asam lemah. Hal ini sejalan dengan pernyataan Vermerris dan Nicholson (2006) bahwa tanaman mengandung komponen fenolik yang bersifat asam lemah. BAL dan kefir grain juga dapat tumbuh dengan baik dan dapat memfermentasi susu dan menghasilkan asam laktat yang lebih tinggi dibandingkan dengan dadih dan kefir plain.
23
TAT (% asam laktat)
1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13
Waktu (Jam)
Gambar 3 Peningkatan total asam tertitrasi (TAT) dadih plain ( ) atau dengan penambahan M. spicata L ( ) dan O. americanum L ( ) selama o proses fermentasi pada suhu 37 C.
1,8
TAT (% asam laktat)
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17
waktu (Jam)
Gambar 4 Peningkatan total asam tertitrasi (TAT) kefir plain ( ) atau dengan penambahan M. spicata L ( ) dan O. americanum L ( ) selama proses fermentasi pada suhu ruang. Total Komponen Fenol Herbal mengandung komponen fenol. Penambahan herbal pada susu menghasilkan kandungan fenol berbeda nyata lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dadih tanpa penambahan herbal (Gambar 5). Total fenol tertinggi dicapai oleh dadih M. spicata L, diikuti oleh dadih O. americanum L dan dadih plain (34.56 µg/ml; 27.5 µg/ml; 23.31 µg/ml).
24
Penambahan ekstrak herbal pada susu menghasilkan kandungan fenol secara nyata lebih tinggi dibandingkan kefir tanpa penambahan ekstrak herbal (P<0.05) (Gambar 6). Total komponen fenol tertinggi dicapai oleh kefir M. spicata L, diikuti oleh kefir O. americanum L dan kefir plain (35.06 µg/ml; 28.87 µg/ml; 23.86 µg/ml). 40,00
34.55±2.33c
Total fenol (µg/ml)
35,00 30,00 25,00
27.50±2.46b 23.32±0.68a
20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 plain
M. spicata
O. americanum
Jenis dadih
Gambar 5 Total komponen fenol (µg/ml) ekstrak dadih plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L. 45,00
Total fenol (µg/ml)
40,00
35.10±2.22c
35,00 30,00
28.87±0.85b 23.85±0.31a
25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 plain
M. spicata
O. americanum
Jenis Kefir
Gambar 6 Total komponen fenol (µg/ml) ekstrak kefir plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L. Substansi fenolik adalah kategori fitonutrient yang memiliki sifat antioksidan yang kuat. Substansi ini dapat diklasifikasikan menjadi fenol sederhana, asam fenolik, derivatif asam hidroksinamat dan flavonoid. Diantara
25
semuanya, asam fenolik mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi dan dilaporkan
memiliki
aktivitas
antibakteri,
antivirus,
antikarsinogenik
antiinflamasi dan vasoliditas (Sahidi dan Naczk 1995). Pada dadih dan kefir yang tidak mengandung ekstrak herbal, komponen fenol seluruhnya didapatkan dari susu. Pada dadih dan kefir herbal, komponen fenol didapatkan dari susu dan ekstrak herbal yang ditambahkan ke dalam susu. Flavonoid termasuk golongan fenol yang mempunyai aktivitas antioksidan yang sangat efektif (Yanishlieva-Maslarova 2001). Flavonoid sendiri merupakan kelompok besar komponen fenol termasuk flavone, flavonol, isoflavone, flavonone dan chalcone. Karakteristik flavonoid berupa struktur C6-C3-C6 dengan kelompok hidroksil bebas yang melekat pada ring aromatik, yang menghambat oksidasi lipid dengan mengikat radikal bebas atau mengikat metal dan menghambat lipoxygenase (Yanishlieva-Maslarova 2001). Aktivitas Antioksidan Radikal bebas adalah molekul dengan elektron bebas yang sangat reaktif. Radikal bebas terbentuk pada semua mahluk hidup selama reaksi oksidasi yang terjadi sebagai bagian dari metabolisme normal. Pada keadaan tertentu seperti stress lingkungan dan serangan patogen, konsentrasi radikal bebas meningkat diatas level normal. Radikal bebas dapat membuat kerusakan pada mahluk hidup. Radikal bebas dapat bereaksi dengan DNA dan membran (lipid dan protein) dengan reaksi berantai. Reaksi berantai terjadi ketika radikal bebas bereaksi dengan molekul lain, mengacaukan elektron dan selanjutnya membentuk radikal bebas baru yang bereaksi dengan molekul lain (Vermeris dan Nicholson 2006). Reactive oxygen species/ROS (spesies oksigen reaktif) merupakan molekul yang mengandung atom oksigen yang sangat reaktif sebagai hasil dari adanya radikal bebas, atau konfigurasi atom oksigen yang lebih banyak elektron dari yang biasa. Contoh kelas pertama adalah radikal hidroksil (OH) dan superoksida (O 2 -), sedangkan contoh kelas kedua adalah peroksida (O 2 2-) dan ion hipoklorit (ClO-). Hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) juga dimasukkan ke dalam ROS karena kereaktifannya. Mahluk hidup telah mengembangkan cara mengatasi ROS. Salah satu mekanismenya dengan inaktivasi enzim. Enzim superoksida dismutase
26
(E.C.1.15.1.1) mengkatalisis superoksida menjadi oksigen via oksidasi, dan H 2 O 2 via reduksi. H 2 O 2 yang memang reaktif dihilangkan dengan reaksi enzim katalase (E.C.1.11.1.6) dan glutathione peroksidase (E.C.1.11.1.9). Katalase mengkatalisis konversi H 2 O 2 menjadi air dan oksigen sedangkan glutathione peroksidase mengkatalisis pembentukan glutathione teroksidasi (G-S-S-G) dari glutathione tereduksi dengan keberadaan H 2 O 2 (Valko et al. 2007). Mekanisme lain yang digunakan untuk inaktivasi ROS adalah dengan antioksidan. Antioksidan dapat bereaksi dengan radikal bebas dan merubahnya memjadi molekul yang lebih stabil. Antioksidan mengikat elektron bebas, menghentikan reaksi berantai dan mencegah kerusakan lebih lanjut. Kestabilan antioksidan dihasilkan oleh ikatan terkonjugasi sehingga elektron radikal dapat terdelokalisasi (Vermeris dan Nicholson 2006). Fungsi antioksidan adalah menghambat oksidasi molekul lain dengan menghambat inisiasi reaksi oksidasi oleh radikal bebas (Valko et al. 2007). Antioksidan dapat diklasifikasikan menurut cara kerjanya, yaitu antioksidan primer dan antioksidan sekunder. Antioksidan primer menghambat oksidasi dengan memberikan atom hidrogen atau elektron kepada radikal bebas sehingga menjadi produk yang lebih stabil. Antioksidan sekunder bekerja dengan berbagai mekanisme, termasuk mengikat ion metal, mengkonversi hidroperoksida menjadi nonradikal, menyerap radiasi ultraviolet dan menonaktifkan oksigen tunggal (Ibrahimzadeh et al. 2010). DPPH merupakan radikal bebas stabil dan menurunnya aktivitas DPPH dilihat berdasarkan menurunnya absorbansi pada 517nm karena terjadinya reduksi oleh antioksidan yang bereaksi dengan radikal bebas (Ibrahimzadeh et al. 2010). Aktivitas antioksidan dadih yang ditambahkan dengan herbal nyata lebih tinggi dibandingkan dadih tanpa herbal (P<0.05) (Gambar 7). Kandungan herbal yang kaya akan antioksidan meningkatkan aktivitas antioksidan dadih sapi herbal. Aktivitas antioksidan tertinggi dicapai oleh M. spicata L (49.16%), diikuti oleh O. americanum L (33.99%) dan dadih plain (30.03%). Hal serupa dijumpai pada kefir yang ditambahkan dengan ekstrak herbal. Aktivitas antioksidan kefir yang ditambahkan dengan ekstrak herbal nyata lebih tinggi dibandingkan kefir tanpa herbal (Gambar 8). Aktivitas antioksidan tertinggi
27
dicapai oleh kefir M. spicata L (50.02%), diikuti oleh kefir O. americanum L (37.83%) dan kefir plain (32.41%).
% Penghambatan DPPH
60,00
49.16±1.21b
50,00 40,00
34.00±3.24a
30.03±4.37a
30,00 20,00 10,00 0,00 plain
M. spicata
O. americanum
Jenis Dadih
Gambar 7 Persentase (%) penghambatan DPPH ekstrak dadih plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L.
% penghambatan DPPH
60,00
50.03±2.22c
50,00 40,00
37.83±1.56b 32.41±1.72
a
30,00 20,00 10,00 0,00 plain
M. spicata
O. americanum
Jenis kefir
Gambar 8 Persentase (%) penghambatan DPPH ekstrak kefir plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L. Pada penelitian ini dadih dan kefir plain memiliki aktivitas antioksidan walaupun tidak sebesar persentase aktivitas antioksidan dadih dan kefir dengan penambahan herbal. Antioksidan tersebut
dihasilkan oleh protein susu yang
difermentasi oleh mikroba (khamir dan BAL). Hal ini sejalan dengan pernyataan Hartmann dan Meisel (2007) bahwa susu memiliki peptida antioksidan. Peptida tersebut kebanyakan berasal dari protein susu (kasein) hasil perombakan oleh
28
BAL pada proses fermentasi. Peptida tersebut mencegah oksidasi enzimatik dan nonenzimatik asam lemak essensial. Fitokimia fenolik merupakan metabolit sekunder yang disintesis oleh tanaman untuk melindungi diri dari stres biologi dan lingkungan (Shetty et al. 2006). Penelitian saat ini memperlihatkan bahwa fenolik fitokimia mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi dan manfaat terapeutik termasuk antidiabetes dan antihipertensi (Kwon et al. 2006). Tanaman mempunyai substansi kimia yang bermacam-macam yang biasa disebut fitokimia. Diantara komponen fitokimia yang terdapat pada tanaman termasuk flavonoid, tokoferol dan asam askorbat (Vermeris dan Nicholson 2006). Ekstrak tanaman berkontribusi dalam perlindungan dari deteriorasi radikal bebas yang menyebabkan perlambatan oksidasi lipid. Hal tersebut membuat susu fermentasi yang ditambahkan ekstrak herbal mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih tinggi. Yadegarinia et al. (2006) melaporkan bahwa komponen fenolik M. spicata yang memiliki aktivitas antioksidan adalah monoterpene ketone (menthone dan isomenthone) dan 1,8 cineole. Pada Ocimum, komponen fitokimia yang memiliki aktivitas antioksidan adalah eugenol, thymol, carvacrol dan 4allylphenol (Lee et al. 2005). Konsentrasi Peptida OPA Konsentrasi peptida dadih yang ditambah ekstrak herbal nyata lebih tinggi dibandingkan dadih tanpa ekstrak herbal (P<0.05) (Gambar 9). Peptida dihasilkan oleh bakteri asam laktat selama proses fermentasi dengan memecah protein susu menjadi peptida. Konsentrasi peptida dadih herbal yang lebih tinggi disebabkan herbal tersebut mempengaruhi aktivitas bakteri dalam menghasilkan peptida dari protein susu. Konsentrasi peptida tertinggi adalah dadih M. spicata L (0,86 mg/g) diikuti oleh dadih O. americanum L (0.83 mg/g) dan dadih plain (0.63 mg/g). Konsentrasi peptida kefir dengan penambahan herbal nyata lebih tinggi dibandingkan tanpa penambahan herbal (Gambar 10). Konsentrasi peptida tertinggi adalah kefir O. americanum L (0.72 mg/g) diikuti oleh kefir M. spicata L (0.69 mg/g) dan kefir plain (0.62 mg/g).
peptida (mg/g)
29
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
0.86±0.04b
0.83±0.07b
M. spicata
O. americanum
0.63±0.04a
plain
jenis dadih
Gambar 9 Kandungan peptida OPA (mg/g) ekstrak dadih plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L. Peptida dengan aktivitas biologi yang dilepaskan selama proses pencernaan atau proses pembuatan makanan dapat berakibat pada regulasi metabolik dan modulasi. Peptida bioaktif bertindak sebagai bahan makanan fungsional untuk meningkatkan kesehatan dan mereduksi penyakit. Banyak penelitian yang melaporkan bahwa peptida dari berbagai macam makanan bersifat bioaktif, termasuk antihipertensi, antioksidan, antikanker, antimikroba, bekerja sebagai modulator sistem imun dan efek menurunkan kolesterol (Shahidi dan
peptida (mg/g)
Zhong 2008). 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
0.87±0.04b
0.84±0.07b
M. spicata
O. americanum
0.63±0.04a
plain
Jenis kefir
Gambar 10 Kandungan peptida OPA (mg/g) ekstrak kefir plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L.
30
Fermentasi susu oleh BAL pada tipe dadih dan kefir yang berbeda menghasilkan perbedaan pada jumlah peptida OPA. Hal ini merefleksikan meningkatnya proteolisis susu sebagai pengaruh penambahan ekstrak herbal. Penghambatan Enzim ACE Uji
Angiotensin
I-converting
enzyme
(ACE)
dilakukan
untuk
mengevaluasi aktivitas penghambatan peptida bioaktif susu fermentasi terhadap enzim ACE. Protein susu, terutama kasein merupakan sumber utama peptida bioaktif ini. Peptida bioaktif ini terperangkap pada strukur utama protein susu dan dapat dilepaskan pada proses pencernaan atau pembuatan makanan. Peptida bioaktif yang memiliki aktivitas penghambatan enzim ACE ini telah diisolasi pada berbagai macam produk susu. Semua dadih dengan penambahan herbal nyata (P<0.05) memperlihatkan persentase (%) penghambatan ACE yang lebih tinggi dibandingkan dengan dadih plain (Gambar 11). Persentase penghambatan ACE tertinggi diperlihatkan oleh dadih M. spicata L (78.50%), diikuti oleh dadih O. americanum L (63.34%) dan dadih plain (47.06%).
Aktivitas penghambatan ACE (%)
100,00 78.50±6.03b
90,00 80,00
65.34±11.30ab
70,00 60,00
47.39±9.35a
50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 plain
M. spicata
O. americanum
Gambar 11 Persentase penghambatan aktivitas enzim ACE (%) ekstrak dadih plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L. Persentase penghambatan aktivitas enzim ACE kefir herbal berbeda nyata lebih tinggi dibandingkan kefir sapi plain (P<0.05). Persentase penghambatan
31
aktivitas ACE tertinggi diperlihatkan oleh kefir M. spicata (84.3%), diikuti oleh kefir O. americanum L (63.64%) dan kefir plain (45.53%) (Gambar 12). Aktivitas anti-ACE dari susu fermentasi plain dan herbal (dadih dan kefir) berkorelasi dengan peptida OPA dimana meningkatnya konsentrasi OPA pada susu fermentasi herbal akan meningkatkan aktivitas penghambatan ACE. Hal ini mengindikasikan bahwa dengan semakin tingginya proteolisis akan meningkatkan aktivitas penghambatan ACE. Proteolisis merupakan proses biokimia yang penting yang terjadi selama fermentasi. BAL kultur starter dan probiotik akan merombak kasein susu selama fermentasi menjadi peptida bioaktif valyl-prolyl-proline (Val-Pro-Pro) dan isoleucyl-prolyl-proline (IIe-Pro-Pro). Hal ini sejalan dengan Rhyanen et al. (2001) yang melaporkan bahwa peptida penghambat ACE (Val-Pro-Pro dan IIePro-Pro) ditemukan dalam yogurt dan keju yang difermentasi oleh L. casei ssp. rhamnosus, L. acidophilus dan strain bifidobacteria. Perombakan kasein susu menjadi tripeptida bioaktif dikatalisis oleh enzim proteinase ekstraseluler BAL. Enzim proteinase ekstraseluler tersebut spesifik bergantung pada spesies dan strain BAL, tetapi mempunyai homologi yang mirip. Wakai dan Yamamoto (2012) melaporkan bahwa enzim ekstraseluler Lactobacillus helveticus yang dapat merombak kasein menjadi peptida Val-Pro-Pro dan IIe-Pro-Pro mempunyai berat molekul 45 dan 170 kDa. Enzim ini mempunyai homologi yang tinggi dibandingkan dengan enzim yang diproduksi oleh Lactobacillus acidophillus. Susu fermentasi yang mengandung peptida bioaktif valyl-prolyl-proline (Val-Pro-Pro) dan isoleucyl-prolyl-proline (II-Pro-Pro) memperlihatkan dapat menurunkan tekanan darah pada hipertensi spontan. Peptida bioaktif susu fermentasi Val-Pro-Pro dan IIe-Pro-Pro dapat langsung diserap masuk ke sirkulasi darah dan menghasilkan efek sistemik. Peptida bioaktif diserap via transport pembawa atau difusi paraseluler. Tripeptida secara aktif ditransportasikan via pembawa spesifik (PepT1) dan oligopeptida via paraseluler (Shimizu 2004; Faltz et al. 2008). Matsuda et al. (1996)
dalam percobaannya menggunakan
spontaneous hypertensive rats (SHR) dan Winstar-Kyoto (WKY) melaporkan bahwa setelah administrasi oral susu fermentasi (susu asam Calpis), aktivitas ACE menurun pada aorta SHR secara nyata. Lebih lanjut, Val-Pro-Pro dan IIe-Pro-Pro
32
terdeteksi dengan HPLC pada ekstrak aorta abdominal. Val-Pro-Pro dan IIe-ProPro terdeteksi pada aorta SHR, tetapi tidak pada WKY yang diberikan susu fermentasi. Matsuda menyimpulkan bahwa tidak ada cukup jumlah ACE pada aorta WKY untuk menangkap Val-Pro-Pro dan IIe-Pro-Pro. Peptida Val-Pro-Pro dan IIe-Pro-Pro bertindak sebagai penghambat ACE yang akan mengikat secara kompetitif dan mencegah pemecahan substrat, furanacrylyl-Phe-Gly-Gly (FAPGG) menjadi produk furanacrylyl-Phe (FAP) dan Gly-Gly (GG) (FitzGerald et al. 2004). Pada penelitian ini memperlihatkan meningkatnya peptida bioaktif pada susu fermentasi (dadih dan kefir) akan menurunkan aktivitas ACE. Penambahan ekstrak herbal (M. spicata L dan O.americanum L) pada susu memperlihatkan penghambatan aktivitas ACE yang lebih tinggi dibandingkan susu fermentasi plain. Hal ini berakibat pada meningkatnya nilai terapeutik susu fermentasi ekstrak herbal dibandingkan dengan susu fermentasi plain.
Aktivitas penghambatan ACE (%)
120 100
84.30±0.50c
80 60
63.64±1.29b 45.53±2.06a
40 20 0 plain
M. spicata
O. americanum
Gambar 12 Persentase (%) penghambatan aktivitas enzim ACE ekstrak kefir plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L. Pada ekstrak susu fermentasi yang ditambahkan ekstrak herbal, kandungan fenol herbal yang ditambahkan pada susu juga menghambat aktivitas ACE. Hal ini didukung oleh laporan Balasuria dan Rupasinghe (2011) pada penelitiannya menggunakan ekstrak kulit apel bahwa kandungan fenolik (flavonoid) ekstrak kulit apel dapat menghambat aktivitas ACE. Hasil penelitiannya memperlihatkan
33
bahwa flavonoid berpotensi dalam menghambat aktivitas ACE in vitro dan penghambatannya bervariasi menurut tipe gula yang diserang pada posisi C-3. Mekanisme dibalik menurunnya tekanan darah oleh anthocyanin dilaporkan melalui aktivitas antioksidan, preservasi nitrat oksida endhotelium dan pencegahan oksidasi serum lipid. Aktivitas penghambatan ACE dari anthochyanins in vitro dapat dijelaskan oleh kemampuan flavonoid mengikat metal dengan grup hidroksil pada posisi 3, 5, 7 dan 3, 4. Struktur planar molekul anthocyanin juga terindikasi penting dalam penghambatan metallopeptidase. Pada hewan, tingkat absorpsi dan korespondensi metabolit dari anthocyanin mempengaruhi penghambatan enzim. (Balasuria dan Rupasinghe 2011). Flavonoid adalah kelompok besar metabolit sekunder tanaman dengan sejumlah keuntungan farmakologi. Dikenalnya flavonoid sebagai biomolekul efektif telah membuat peneliti untuk menyelidiki potensi flavonoid dan ekstrak kaya flavonoid sebagai penghambat ACE alami. Hampir semua subkategori dari flavonoid yang diteliti mempunyai aktivitas penghambat ACE (Balasuria dan Rupasinghe 2011). Beberapa penelitian telah difokuskan pada penemuan tipe flavonoid yang dapat menghambat aktivitas enzim. Anthocyanin memperlihatkan penghambatan ACE kompetitif. Dhelphinidin-3-O-sambubioside, cyanidin-3-O-sambubisioside dan fraksi anthocyanin dari spesies Hibiscus adalah salah satu dari yang diteliti (Ojeda et al. 2010). Jenis peptida bioaktif penghambat aktivitas ACE pada penelitian ini tidak diuji. Pengujian selanjutnya menggunakan analisis HPLC dan asam amino diperlukan untuk mengetahui peptida spesifik pada susu fermentasi ekstrak herbal yang mempunyai aktivitas penghambat ACE. Penghambatan Enzim α-Amilase Enzim α-amilase merupakan salah satu enzim yang berada di saluran pencernaan. Enzim ini berperan dalam perombakan polisakarida pada makanan menjadi oligosakarida. Oligosakarida selanjutnya akan dirombak lagi menjadi monosakarida (glukosa) yang dapat diserap oleh fili usus ke peredaran darah.
34
Pada penderita diabetes tipe 2, peningkatan level gula darah (glukosa) terjadi sesaat setelah makan (postpandrial). Penghambatan aktivitas enzim α-amilase ini menjadi salah satu kunci untuk mengurangi insiden postpandrial. Pada penelitian ini, semua susu fermentasi memperlihatkan penghambatan aktivitas enzim α-amilase. Persentase penghambatan aktivitas enzim α-amilase ekstrak dadih dan kefir diperlihatkan pada Gambar 13 dan 14. Ekstrak dadih herbal nyata lebih tinggi (P<0.05) memperlihatkan penghambatan aktivitas enzim α-amilase yang lebih tinggi dari dadih plain. Persentase penghambatan aktivitas enzim α-amilase tertinggi ditunjukkan oleh dadih M. spicata L (31.24%), diikuti oleh dadih O. americanum L (19.11%) dan dadih plain (17.50%). Ekstrak kefir herbal juga memperlihatkan penghambatan aktivitas enzim α-amilase yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak kefir plain (P<0.05). Secara berturut-turut persentase penghambatan aktivitas enzim α-amilase dari yang tertinggi sampai terendah adalah ekstrak kefir M. spicata L, O. americanum L dan kefir plain (31.46%, 20.27% dan 18.17%). Banyak komponen kimia sekunder disintesis oleh tanaman yang beperan dalam pertahanan tanaman tersebut. Komponen kimia sekunder yang disintesis ini termasuk penghambat enzim α-amilase pada saluran pencernaan hewan dan serangga yang menghidrolisis pati (polisakarida). Enzim α-amilase memainkan peranan yang penting dalam mencerna pati tanaman (Ryan 1990). Pada penelitian ini ekstrak susu fermentasi mempunyai aktivitas penghambatan enzim yang lebih tinggi dibandingkan dengan susu fermentasi plain. Hal ini karena komponen kimia yang terdapat pada herbal yang ditambahkan pada susu fermentasi akan meningkatkan penghambatan aktivitas enzim α-amilase. Penambahan ekstrak M. spicata L pada susu memperlihatkan efek penghambatan aktivitas enzim αamilase tertinggi dibandingkan dengan O. americanum L dan susu fermentasi plain. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan ekstrak tanaman tertentu akan meningkatkan penghambatan aktivitas enzim α-amilase pada susu fermentasi.
35
Penghambatan aktivitas α-amilase (%)
40,00 31.24±0.88c
35,00 30,00 25,00
19.11±0.40b
17.48±0.57a
20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 plain
M. spicata
O. americanum
Gambar 13 Persentase (%) penghambatan aktivitas enzim α-amilase ekstrak dadih plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L. Penghambatan aktivitas α-amilase (%)
40,00 31.46±0.44c
35,00 30,00 25,00
20.27±0.46b
18.17±0.59a
20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 plain
M. spicata
O. americanum
Gambar 14 Persentase (%) penghambatan aktivitas enzim α-amilase ekstrak kefir plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L. Eugenol telah diketahui dapat menurunkan level gula darah, tryglycerida dan kolesterol dan aktivitas LDH, GPT, GOT dan alkaline phosphatase (enzim diagnosa klinis) dalam serum darah yang menjelaskan potensi O. sanctum L sebagai agen antidiabetes, cardioprotective, hypolipidemic dan hepatoprotective (Prakash dan Gupta 2005). Pada penelitiannya menggunakan beberapa tanaman tradisional India, Ponnusamy et al. (2011) menyatakan bahwa mekanisme penghambatan enzim αamylase menurunkan hidrolisis pati yang dapat menurunkan kadar gula darah.
36
Analisis fitokimia memperlihatkan bahwa adanya alkaloid, protein, tanin, dan flavonoid sebagai komponen penghambat enzim α-amilase. Penghambatan Enzim α-Glukosidase Pada saluran pencernaan, selain enzim α-amilase, ada juga enzim αglukosidase yang berperan dalam merombak pati. Enzim ini berperan dalam merombak oligosakarida yang terkandung dalam makanan secara langsung atau pati yang telah dirombak oleh enzim α-amilase menjadi monosakarida agar dapat diserap oleh pili usus dan beredar dalam saluran peredaran darah (Kawaba et al. 2007). Penghambatan aktivitas enzim tersebut dapat mengurangi efek peningkatan gula darah pada penderita diabetes tipe 2 postpandrial. Ekstrak susu fermentasi dengan penambahan herbal nyata (P<0.05) dapat meningkatkan penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase dibandingkan dengan susu fermentasi tanpa ekstrak herbal (Gambar 15 dan 16). Hasil yang didapatkan pada ekstrak dadih dan kefir memperlihatkan adanya peningkatan penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase pada kedua produk susu fermentasi tersebut. Secara berturut-turut ekstrak dadih dan kefir yang mempunyai aktivitas penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase dari tertinggi hingga terendah adalah ekstrak dadih dan kefir M. spicata L, O. americanum L dan dadih dan kefir plain (15.82%, 11.32%, 9.00%; 18.13%, 12.35%, 9.69%). Lebih tingginya persentase penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase ekstrak susu fermentasi herbal terjadi karena penambahan ekstrak herbal yang juga dapat menghambat aktivitas enzim α-glukosidase. Hal ini sejalan dengan pernyataan Kaushik et al. (2008) bahwa tanaman herbal tertentu dapat menjadi penghambat enzim α-glukosidase yang efektif. Anurakkun et al. pada penelitiannya menggunakan tanaman Alstonia scholaris dalam menghambat aktivitas enzim sukrase dan maltase melaporkan bahwa kandungan flavonoid (3O-β-D-xylopyranosil,
-β-D-galactopyranoside
dan
–lyoniresinol
3-O-β-D-
glucopyranoside) yang bertanggung jawab dalam menghambat enzim sukrase dan maltase. Pada penelitian ini, ekstrak susu fermentasi M. spicata L memperlihatkan penghambatan aktivitas enzim glukosidase yang paling tinggi. Hal ini dapat menjadi salah satu solusi dalam manajemen diabetes tipe 2 postpandrial.
37
Penghambatan aktivitas α-glukosidase (%)
20 15.82±0.38c
18 16 14 12
11.32±0.12b 9.00±0.49a
10 8 6 4 2 0 plain
M. spicata
O. americanum
Gambar 15 Persentase (%) penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase ekstrak dadih plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L.
Penghambatan aktivitas α-Glukosidase (%)
25 18.13±0.50c
20
12.35±0.26b
15 9.69±0.71a 10 5 0 plain
M. spicata
O. americanum
Gambar 16 Persentase (%) penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase ekstrak kefir plain atau dengan penambahan M. spicata L dan O. americanum L.
