11
secara perlahan beberapa kali kemudian segera ditambah dengan 400 μl larutan buffer netralisasi (1.32 M natrium asetat pH 4.8), divorteks dan disentrifugasi pada suhu 4 0C dengan kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit. Supernatan diekstrak dengan penambahan PCI (fenol-kloroformisoamilalkohol dengan perbandingan 25:24:1) sebanyak 1x volume supernatan. Kemudian divorteks dan disentrifugasi pada suhu 20 0C dengan kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit. Fase jernih (bagian di atas PCI) diendapkan dengan penambahan natrium asetat 2 M pH 5.2 sebanyak 0.1x volume dan etanol absolut sebanyak 2x volume awal (fase jernih). Larutan diinkubasi pada suhu -20 0C selama 2 jam kemudian diendapkan dengan sentrifugasi 10 000 rpm pada suhu 4 0C selama 25 menit. Endapan (DNA plasmid) dibilas dengan menggunakan alkohol 70% (v/v) dengan bantuan sentrifugasi 10 000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C. Endapan dikeringkan dan disuspensikan dengan ddH2O. Suspensi DNA palsmid ditambah RNAse (100 μg/ml) sebanyak 0.1 x volume suspensi dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama semalam. Kemudian ditambah dengan ddH2O hingga volume akhir menjadi 500 μl. Plasmid hasil isolasi tersebut akan digunakan sebagai cetakan PCR untuk mendapatkan gen LGST12 dan SGST12 yang digunakan dalam analisis selanjutnya. Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA Pengurutan DNA (DNA sequencing) dilakukan menggunakan DNA sequencer ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Urutan nukleotida dari gen GST12 dianalisis kemiripan dan homologinya dengan gen GST12 lainnya dengan menggunakan program BLAST2(Basic_Local_Alignment_Search_Tools) (http://www.ebiac.uk/blast2). Analisis kesamaan dan filogenetik berdasarkan deduksi asam amino GST12 dari spesies lain dilakukan dengan menggunakan program MAFFT (Multiple Alignment Fast Fourier Transform) ver.5.8 (Katoh et al. 2005). Analisis daerah terkonservasi dan domain dilakukan dengan menggunakan program conserved domain NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi). HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Konfirmasi GST 12 dari Stok cDNA Konfirmasi keberadaan GST12 dari stok cDNA dan produk PCR dari penelitian sebelumnya (Mashuda 2006; Sawitri 2007) dengan menggunakan primer spesifik GST12 (AF243367) menunjukan hasil positif, ukuran pita yang diperoleh sekitar 720 pb (Gambar 1). M M 1 M2 1
M M 1 M2 1 2
720pb
(a) (b) Gambar 2 cDNA LGST12 (a); cDNA SGST12 (b). 1= LGST12 berukuran sekitar 720 pb, 2= SGST12 berukuran sekitar 720 pb. Elektroforesis pada 1.5% (b/v) agarosa. M= λ 50 ng; M1= λ 100 ng; M2= Marker 100 bp (RBC) Tanda panah: gen GST12 Pengklonan gen GST12 Setelah amplikon GST12 diligasikan dengan plasmid pGEM®-T Easy dan kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α serta diinkubasi overnight, dijumpai dua jenis koloni yaitu koloni putih dan biru.
Koloni putih
Koloni biru
12
Gambar 3 Penampilan koloni E. coli DH5α yang diduga membawa plasmid rekombinan (koloni putih) pada media seleksi (ampisilin, X-gal, dan IPTG) PCR koloni dilakukan untuk memastikan adanya sisipan amplikon di dalam beberapa koloni E. coli putih yang tumbuh pada media seleksi. Koloni putih yang produk PCR-nya berupa amplikon yang berukuran sama dengan hasil konfirmasi keberadaan GST12 sebelum-nya yaitu sekitar 720 pb akan dipilih sebagai koloni yang akan digunakan pada proses analisi selanjutnya (Gambar 4). M 1 2 3 4 5
M 1 2 3 4 5 6
720 pb
(a) (b) Gambar 4 PCR koloni putih E. coli yang membawa GST12. Elektroforesis pada 1.5% (b/v) agarosa. Kultivar Lumut: dari 5 koloni putih hanya dijumpai 1 koloni positif pembawa plasmid rekombinan (a); kultivar Slamet: dari 6 koloni putih dijumpai 5 koloni positif pembawa plasmid rekombinan (b). M= Marker 100 bp (RBC). Tanda panah: gen GST12 DNA plasmid rekombinan telah diisolasi dari koloni putih yang terpilih melalui PCR koloni. Keberadaan amplikon sisipan kembali dipastikan dengan PCR menggunakan plasmid hasil isolasi sebagai cetakan. Hasil elektroforesis menunjukkan hal yang sama dengan elektroforesis hasil PCR koloni (Gambar 4) yaitu menunjukkan amplikon yang berukuran sekitar 720 pb (Gambar 5). M
1
M1 1
2
plasmid 720 pb
13
(a)
(b)
Gambar 6 Penjajaran (alignment) asam amino LGST12 dan SGST12 terhadap GST12 Glycine max (AF243367)
Keterangan: Size = 12 sequences × 76 sites; Method = NJ ÆConserved sites (76 aa) with un-rooted tree ; Model = JTT ; Alpha = ∞; Bootstrap re-sampling = 100 (50-1000)Æ The number of sequences must be <1000 for Poisson model, or <100 for other models.
Gambar 7 Pohon filogenetik berdasarkan urutan asam amino GST dari berbagai spesies Gambar 5 Elektroforesis plasmid utuh rekombinan (a). Elektroforesis produk PCR GST12 dari plasmid utuh rekombinan (b). 1= LGST12, 2= SGST12. Elektroforesis pada 1.5% (b/v) agarosa. M= Marker λ 50 ng; M1= Marker 100 bp (RBC). Tanda panah: gen GST12 Pengurutan cDNA dan analisis urutan cDNA Hasil sekuensing menunjukkan bahwa panjang cDNA dari kodon awal sampai kodon akhir kedua cDNA LGST12 dan SGST12 adalah 722 pb. Analisis cDNA dilakukan untuk melihat kesamaan dan kekerabatan LGST12 dan SGST12 terhadap gen GST12 koleksi GenBank. cDNA LGST12 memiliki kesamaan sebesar 85 % dan SGST12 sebesar 92 % terhadap bagian GST12 dari Glycine max (AF243367). Kedua sekuen gen tersebut memiliki nilai bit score (BS) di atas 50 bits (908 dan 1146 bits) dan nilai expectation value (E-value) sebesar 0 (nol). Nilai BS dan nilai Evalue merupakan nilai yang menunjukan signifikansi kemiripan sekuen (Claverie & Notredame 2003). Sekuen atau urutan nukleotida cDNA LGST12 dan SGST12 diterjemahkan menjadi 237 asam amino. Urutan asam amino tersebut kemudian dianalisis kekerabatannya terhadap beberapa sekuen asam amino dari beberapa spesies yang tersedia di GenBank dengan menggunakan
LGST12 SGST12 Glycine max Glycine max
14
MAFFT v6. 500a (Gambar 6). Hasil analisis ditampilkan dalam bentuk pohon filogenetik (Gambar 7). Penelusuran daerah domain terkonservasi dilakukan dengan menggunakan program conserved domain NCBI untuk daerah N-terminal dan C-terminal pada kelompok GST_Tau. Hasil penelusuran menunjukkan bahwa LGST12 hanya memiliki N terminal GST_Tau, sedangkan SGST12 selain memiliki GST_C_Tau juga memiliki GST_N_Tau (Gambar 8). Pembahasan Konfirmasi GST 12 dari Stok cDNA Selain untuk memastikan keberadaan gen target yang akan diklon dan dianalisis, hasil GST_N_Tau
GST_C_Tau
GST12 ( Glycine max max)) (EM_PL:AF243367
1
60
238
98
80
LGST12
Gambar 8 Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara LGST12 dan 10 80 SGST12 terhadap GST12 Glycine max (AF243367) dari GenBank
237
SGST12
10
85
120
220
237
konfirmasi ini juga menunjukkan kosentrasi cDNA GST12 yang tersimpan dalam stok. Kosentrasi cDNA GST12 dari masing-masing stok didapatkan dengan cara membandingkan visualisasi kecerahan pita amplikon GST12 terhadap marker lamda (λ) pada gel elektroforesis. Hasil elektroforesis menunjukkan kosentrasi GST12 pada stok cDNA var. Lumut adalah 10 ng/μl sedangkan var. Slamet adalah 20 ng/μl. Pengklonan gen GST12 Hasil seleksi koloni pada media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin, X-gal dan IPTG menunjukkan adanya koloni E. coli yang berwarna putih. Namun, tidak semua koloni putih membawa plasmid rekombinan (Gambar 4). Plasmid pGEM®-T Easy selain sebagai vektor pembawa juga digunakan sebagai marker penyeleksi karena mengadung gen lacZ yang menyandikan β-galaktosidase (β-gal) yaitu suatu enzim yang dapat mendegradasi disakarida laktosa menjadi monosakarida glukosa dan galaktosa yang disertai dengan perubahan warna media. X-gal adalah senyawa khromogenik yang memiliki struktur mirip dengan laktosa, media akan menjadi biru ketika β-gal memotong struktur X-gal tersebut. Amplikon GST12 menyisip pada gen lacZ, menyebabkan gen lacZ tidak dapat diekspresikan sehingga β-gal tidak dihasilkan dan koloni E. coli berwarna putih (tidak menghasilkan perubahan warna menjadi biru). Hal sebaliknya terjadi jika amplikon tidak menyisip pada gen lacZ maka koloni E. coli akan menjadi biru karena gen LacZ diekspresi menjadi β-gal. Pengurutan cDNA dan analisis urutan cDNA Sekuensing dua arah yang menggunakan primer GST12F dan GST12R menghasilkan urutan nukleotida cDNA LGST12 dan SGST12 lengkap, dimulai dari kodon awal ATG yang merupakan bagian dari primer GST12F dan kodon akhir TGA yang merupakan bagian dari primer GST12R (Lampiran 1 dan 2). Setelah sekuen LGST12 dan SGST12 diterjemahkan menjadi asam amino (Lampir-an 3) dengan menggunakan program expasy translate tool (http://www.expasy.ch/cgi-bin/ dna_aa). Dengan menggunakan program conserved domain NCBI (Marchel-Bauer et al. 2007; www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd /wrpsb.cgi), sekuen LGST12 dan SGST12 memiliki daerah domain terkonservasi yang berbeda. Program ini berkerja mirip dengan sistem kerja program BLAST, namun berbeda pada basis data yang digunakannya. Pada program ini basis data yang digunakan berupa koleksi daerah domain terkonservasi protein yang telah didaftarkan dalam database conserve domain NCBI. Protein LGST12 hanya direkomendasikan untuk dimasukkan ke dalam GST tipe GST_N_Tau (cd03058) saja. Menurut Dixon et al. (2003), daerah domain terkonservasi GST tipe ini terdiri atas 3 feature spesifik yaitu GSH binding site (G-site), dimer interfa, dan C-terminal. Sedangkan
15
protein SGST12 selain direkomendasikan untuk dimasukan ke dalam GST tipe GST_N_Tau (cd03058) juga direkomedasikan untuk dimasukkan ke dalam GST_C_Tau (cd03185). GST_C_Tau juga terdiri dari 3 feature spesifik yaitu dimer interfa, substrat (H-site), dan Nterminal (Riechers et al. 1997). GST_N_Tau pada protein LGST12 dijumpai pada posisi asam amino ke-10 sampai urutan ke80. Sedangkan pada SGST12, GST_N_Tau dijumpai pada posisi yang hampir sama dengan LGST12 yaitu pada asam amino ke-10 sampai ke-85 (Gambar 8). Hal tersebut bersesuaian dengan laporan Mannervik dan Danielson (1998), yang menyatakan bahwa asam amino yang berada pada posisi 60-80 merupakan daerah yang sangat terkonservasi. Selain itu, daerah ini juga mengandung katalis tirosin, serin atau sistein yang akan berinteraksi dengan grup tiol GSH (Dirr et al. 1994). Menurut Dixon et al. (1998), daerah ini merupakan sisi pengikatan spesifik untuk GSH atau disebut G-site yang terbentuk dari kelompok residu asam amino yang konservatif di dalam domain ujung polipeptida. Dari penjelasan tersebut dapat disimpulkan bahwa kedua protein LGST12 dan protein SGST12 masing-masing memiliki G-site. Sedangkan GST_C_Tau yang hanya direkomendasikan untuk SGST12 dijumpai pada posisi asam amino ke-120 sampai 220 (Gambar 8). Daerah tersebut menurut Dixon et al. (1998) merupakan situs pengikatan substrat hidrofobik Hsite yang strukturnya paling bervariasi dan terbentuk dari residu domain ujung karboksil; sehingga dapat disimpulkan bahwa protein LGST12 dan protein SGST12 berbeda dalam hal keberadaan GST_C_Tau-nya. Perbedaan tersebut kemungkinan akan menyebabkan adanya perbedaan kelengkapan feature untuk menjalankan fungsi GST12 secara utuh. Karena menurut Dixon et al. (1998), hanya GST dari kelas yang sama saja yang akan membentuk dimer, dimana dimer tersebut terdiri dari sisi katalik yang tersusun dari dua komponen yaitu G-site dan H-site. Perbedaan ini diduga menjadi faktor penting penyebab perbedaan respon kedua var. kedelai terhadap cekaman Al dan pH rendah di lapangan. Hasil analisis kesejajaran lokal dengan menggunakan BLAST2-NCBI menunjukkan bahwa cDNA LGST12 dan SGST12 memiliki nilai kemiripan yang tinggi terhadap bagian GST12 dari Glycine max (AF243367). Tingkat keyakinan nilai kemiripan tersebut selain ditunjukkan oleh nilai persentase kemiripan yang tinggi juga harus disertai dengan nilai BS dan E-value yang dimiliki kedua sekuen. Menurut Claverie dan Notredame (2003) nilai BS suatu sekuen harus di atas 50 bits agar dapat diyakini tingkat kemiripannya terhadap sekuen pembanding. Sedangkan E-value adalah nilai pengulangan pengurutan hingga diperoleh pengurutan terbaik. Jika suatu sekuen memiliki nilai E-value semakin mendekati nilai 0 (nol) maka akan semakin dapat disimpulkan kemiripannya terhadap pasangan pengurutannya. Sebaliknya, jika suatu sekuen memiliki nilai E-value diatas 0.001 maka pengurutan sekuen tersebut sulit untuk disimpulkan kemiripannya. Hasil serupa diperoleh dalam analisis kesamaan dengan menggunakan MAFFT berdasarkan nukleoti-da dan asam amino. cDNA LGST12 dan SGST12 memiliki kedekatan kekerabatan dengan gen GST12 dari kedelai (Glycine max) yang telah didaftarkan di dalam GenBank bahkan terhadap beberapa sekuen gen yang telah dipatenkan. Berdasarkan kedekatan kekerabatan dan kesamaan ini, dapat diduga bahwa cDNA LGST12 dan SGST12 memiliki peran yang sama dengan gen-gen GST12 yang telah dilaporkan sebelumnya yaitu menyan-dikan protein yang memiliki peranan dalam detoksifikasi herbisida, cekaman kimia (dalam hal ini berupa cekaman Al), dan dalam sistem antioksidasi. SIMPULAN cDNA LGST12 dan cDNA SGST12 memiliki kesejajaran lokal yang tinggi dengan bagian gen GST12 dari Glycine max (AF243367). Analisis kesamaan asam amino menunjukkan bahwa protein LGST12 dan protein SGST12 memiliki kedekatan kekerabatan dengan protein GST12 Glycine max meskipun memiliki perbedaan dalam hal letak, jumlah dan komposisi asam amino untuk masing-masing domain. Protein LGST12 direkomendasikan untuk dimasukkan ke dalam daerah domain terkonservasi tipe GST_N_Tau saja sedangkan SGST12 selain direkomendasikan untuk dimasukkan ke dalam daerah domain terkonservasi tipe GST_N_Tau juga ke dalam daerah domain terkonservasi tipe GST_C_Tau. SARAN Untuk mengetahui fungsi gen secara jelas perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan cara mendelesi secara parsial urutan asam aminonya.
