HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA Total Tumbuhan Isolasi DNA total merupakan tahap awal dari pembuatan pustaka genom. DNA dipisahkan dari bahan-bahan lain yang ada dalam sel.
DNA total yang
diperlukan untuk pembuatan genom,
kualitas maupun
harus bagus dalam
kuantitas. DNA harus utuh, sedikit mengandung fragmen DNA yang berukuran kecil.
Selain utuh, DNA yang diperlukan juga harus mempunyai konsentrasi
yang tinggi.
Konsentrasi yang tinggi ini dapat dicapai dengan cara pemekatan
atau dengan mengurangi jumlah pelarut. Konsentrasi DNA yang rendah dapat dipekatkan dengan pengendapan kembali menggunakan isopropanol sebanyak 0.7 x volume. Pengendapan kadang dapat menurunkan kualitas DNA. Tingkat kemurnian DNA dari kontaminan protein diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280nm. digunakan harus
DNA yang
murni dengan nilai 260/280 > 1.75 (Promega 1996).
Sementara hasil perhitungan
260/280 nm dari DNA tumbuhan yang telah
diisolasi adalah sebesar 1.2 yang berarti bahwa DNA tersebut kurang murni, dan masih terdapat adanya kontaminan yang berupa protein.
Selain protein, DNA
M. malabathricum banyak terkontaminasi oleh polisakarida yang cukup tinggi. Adanya kontaminan polisakarida menyebabkan rendemen isolasi DNA menjadi rendah. Usaha yang telah dilakukan dalam mengurangi kontaminan antara lain: dengan penambahan PVP (poly vinil pirolidon) sebanyak 2 % pada saat isolasi, dan isolasi dengan DNA mini kit yang menggunakan saringan berbahan resin. Pemotongan DNA Tumbuhan secara Parsial Hasil pemotongan 8 μg DNA M. malabathricum L. secara parsial menggunakan enzim restriksi Sau3A I pada konsentrasi 0.01 hingga 0.04 unit untuk setiap g DNA menunjukkan bahwa pemotongan dengan 0.01 unit menghasilkan potongan yang berukuran besar (Gambar 3). Konstruksi pustaka genom memerlukan DNA yang cukup banyak, sehingga untuk mendapatkan potongan DNA besar dalam jumlah banyak dilakukan pemotongan dengan skala besar. Pemotongan skala besar menggunakan 20 μg DNA total yang dipotong secara parsial dengan enzim restriksi Sau3A I pada konsentrasi 0.01 unit tiap µg DNA,
19 menghasilkan fragmen DNA yang sebagian besar terdapat pada ukuran 2 - 15 kpb (Gambar 4). pb
M
1
2
3
4
15000 -
5000 4000 3000 -2000 1000 -
Gambar 3 Hasil pemotongan parsial terhadap 8 μg DNA M. malabathricum menggunakan enzim restriksi Sau3A I dengan berbagai konsentrasi pada suhu 37oC selama 30 menit. M=marker, 1=0.010 U, 2=0.015 U 3=0.020 U, 4=0.040 U. pb
M
1
15000 80004000300020001000-
Gambar 4 Hasil pemotongan parsial terhadap 20 μg DNA M. Malabathricum menggunakan enzim restriksi Sau3A I dengan konsentrasi 0.010 U pada suhu 37oC selama 30 menit. M= marker, 1= fragmen DNA hasil pemotongan. Enzim Sau3A I mengenali situs spesifik NGATC yang memotong antara N dan G sehingga pemotongan dengan Sau3A I menghasilkan fragmen yang berujung kohesif dengan nukleotida GATC. Setelah disisipi dengan nukleotida dATP dan dGTP menghasilkan ujung 5’GA3’ yang tidak dapat berpasangan dengan ujung 3’AG5’ dari fragmen DNA yang lain sehingga penyambungan kembali di antara fragmen dapat dicegah (Gambar 5)
20
Potong dg Sau3A I
Gambar 5 Fill in dATP dan dGTP pada fragmen DNA M. malabathricum hasil pemotongan parsial dengan Sau3A I. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor fage Enzim restriksi Xho I mengenali situs spesifik 5’CTCGAG3’ yang memotong antara C dan T sehingga vektor fage yang dipotong dengan enzim restriksi Xho I menghasilkan fragmen DNA menggantung yang menyisakan basa nitrogen 5’TCGA3’di ujung yang satu dan 3’AGCT5’ di ujung lainnya. Kedua ujung tersebut dapat berpasangan kembali bila tidak dicegah. Penambahan dTTP dan dCTP menyisakan 5’TC3’di satu ujung dan 3’CT5’ di ujung lain yang menyebabkan kedua ujung tersebut tidak dapat berpasangan secara`komplementer (Gambar 6)
Potong dg C GAGCT
TCGAG C
Pengisi
lac
Xho I
C GAGCT
TCGAG C
Tambah dTTP & dCTP C TC GAGCT
TCGAG CT C
Pengisi
Kedua lengan dan pengisi
lac
C TC GAGCT
TCGAG CT C
tidak cocok
Gambar 6 Fill in dTTP dan dCTP terhadap vektor λ BlueSTAR-1 yang dipotong XhoI.
21 Setelah vektor fage dicampur dengan potongan DNA M. malabathricum dalam satu tabung,
maka
potongan
DNA
fage
berujung basa 5’TC3’ akan
berpasangan dengan basa 3’AG5’ yang terdapat pada ujung potongan DNA M. malabathricum. Pasangan kedua fragmen DNA tersebut selanjutnya diligasi oleh DNA T4 ligase (Gambar 7).
λ BlueSTAR-1 λ
CTC GATC GAGCTAG
M.malabathricum
GATCGAG λ BlueSTAR-1 CT AGCTC
Gambar 7 Penyisipan fragmen DNA M. malabathricum ke dalam vektor λ BlueSTAR-1. Penyisipan 0.5 g DNA M. malabathricum ke dalam vektor fage dengan perbandingan 2.9 : 1 berdasarkan molaritas, menghasilkan DNA rekombinan. Setelah dikemas dalam mantel protein, fage rekombinan ini ditransveksikan ke dalam E coli galur ER1647. Dalam media yang mengandung IPTG dan X-gal, fage rekombinan membentuk plak bening yang terdapat di antara koloni biru (non rekombinan) (Gambar 8). Konstruksi pustaka genom dilakukan dua kali.
non rekombinan
rekombinan
Gambar 8 Koloni E. coli galur ER1647 non rekombinan (biru) dan plak putih (fage rekombinan). 5
Proses pengemasan menghasilkan titer sebesar antara 1.4 x 10 dan 2.3 x 10
5
5
dengan rata-rata 1.9 x 10 pfu/ml (Tabel 1). Persentase fage rekombinan yang terbentuk adalah berkisar antara 5.4% dan 17.3% dengan rata-rata
11.4%,
22 4
sehingga besarnya titer rekombinan yang terbentuk adalah 2.2 x 10
pfu/ml.
Persentase fage rekombinan ini lebih rendah dibandingkan dengan persentase fage rekombinan pada konstruksi pustaka genom kedelai yang dilakukan oleh Suharsono (2002). Tabel 1. Jumlah titer dan persentase fage λ rekombinan Perco baan I
II
Pengenceran (x) 100 1000 100 1000
Jumlah plak (pfu) Biru Bening Total 83 13 96 15 4 19 Rata-rata I 226 15 21 1
% plak rekombinan 13.5 21.1
241 22
Rata-rata II Rata-rata I dan II
17.3 6.2 4.5 5.4 11.4
Konsentrasi fage (pfu /ml) 5 0.96 x 10 5 1.9 x 10 5 1.4 x 10 5 2.41 x 10 5 2.2 x 10 5 2.3 x 10 5 1.9 x 10
Persentase fage rekombinan yang rendah disebabkan oleh DNA M. malabathricum yang digunakan kurang murni. Hal ini disebabkan oleh adanya kontaminan, terutama oleh polisakarida. Polisakarida ini dapat menghambat proses pemotongan DNA oleh enzim restriksi. Masalah lain adalah adanya DNA yang tidak utuh (smear). Hal ini dapat terjadi jika DNA disimpan terlalu lama, atau diendapkan beberapa kali untuk pemekatan. Selain itu proses isolasi DNA dapat menyebabkan terpotongnya DNA secara fisik. Untuk mengetahui ukuran DNA M. malabathricum yang menyisip ke dalam fage , fage rekombinan (Gambar 9A) dari plak putih hasil lisis E coli galur ER1647 selanjutnya ditransveksikan ke E. coli galur BM 25.8. Di dalam E. coli galur BM 25.8, fage rekombinan mengalami proses eksisi dan berubah menjadi plasmid rekombinan (Gambar 9B, 9C). Hal ini terjadi karena galur BM25.8 dapat mensintesis rekombinase cre yang dapat menginduksi proses rekombinasi pada dua situs loxP yang saling berpasangan yang ada pada fage tersebut.
Dua situs loxP tersebut mengapit situs pengklonan, titik asal replikasi
(ori) dan gen resistensi terhadap ampisilin (Ap) (Gambar 2 & 9). Rekombinasi pada loxP ini menyebabkan kedua ujung λ BlueSTAR-1 sebelum loxP pertama dan setelah loxP kedua hilang, dan daerah yang diapit dua loxP tersebut membentuk molekul sirkuler berupa plasmid (Gambar 9B, 9C). Setelah diisolasi,
23 Lox P
Lox P
A
Ori Ap OriAp
B Lox P Plasmid rekombinan Ori Ap C Hilang
D
Fragmen DNA M. malabathricum
Gambar 9 Proses eksisi fage λ rekombinan menjadi plasmid rekombinan A, Fage λ rekombinan (linear), B.Pindah silang pada situs Lox P C. Plasmid rekombinan mengandung Ori & Ap, dan fragmen turunan DNA tanpa Ori (hilang), D. Plasmid rekombinan & situs penyisipan.
24 plasmid rekombinan diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5 agar mudah diperbanyak. Ukuran fragmen DNA sisipan Setelah diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5plasmid rekombinan diisolasi, kemudian dipotong dengan enzim EcoRI untuk memastikan bahwa DNA plasmid tersebut merupakan DNA rekombinan, sekaligus mengetahui ukuran dari fragmen DNA yang disisipkan ke dalam plasmid tersebut. Tiga sampel plasmid rekombinan berhasil
diisolasi.
Hasil isolasi ini
dipotong dengan EcoR1, kemudian dimigrasikan pada gel elektroforesis yang menghasilkan dua fragmen atau lebih (Gambar 10) Plasmid rekombinan I (No.1, Gambar 10)
setelah dipotong dengan
EcoR1 menghasilkan fragmen DNA berukuran 2100 pb (pasangan basa) dan 1200 pb (No.4, Gambar 10).
Plasmid rekombinan II (No.2, Gambar 10) setelah
dipotong dengan Eco R1 menghasilkan fragmen DNA berukuran 2100 pb dan 850 pb (No.5, Gambar 10). Plasmid rekombinan III (No.3, Gambar 10) setelah dipotong dengan EcoR1 menghasilkan fragmen DNA sebesar 8000 pb, 3500 pb dan 2100 pb (No. 6, Gambar 10). pb
M
1
2
3
4
5
6
pb -8000 -3500 -2100 -1200 - 850
Gambar 10 Plasmid rekombinan hasil proses eksisi yang tidak dipotong dan yang dipotong dengan enzim EcoR1. M=marker; 1, 2, 3 = plasmid rekombinan I, II, III yang tidak dipotong; 4, 5, 6 = plasmid rekombinan I, II, III yang dipotong Eco R1. Ketiga plasmid ini (No. 4, 5, 6, Gambar 10) mengandung fragmen DNA berukuran 2100 pb, yang merupakan plasmid pengklonan turunan dari λ Blue
25 STAR-1 , sedangkan fragmen DNA yang berukuran 1200 pb (plasmid No. 4), 850 pb (plasmid No. 5), serta 8000 pb dan 3500 pb (plasmid No. 6) merupakan fragmen DNA sisipan yang berasal dari M. malabathricum. Hal ini menunjukkan bahwa besarnya DNA M. malabathricum yang menyisip ke dalam fage adalah antara 850 pb dan 11500 pb (Tabel 2). Tabel 2 Hasil analisis restriksi menggunakan enzim restriksi EcoRI Sampel Ukuran fragmen (kpb) Ukuran sisipan Rata-rata sisipan plasmid total DNA DNA total Turunan Sisipan DNA rekombinan fage λ tumbuhan tumbuhan (kpb) tumbuhan (kpb) 1 2.1 1.2 1.2 4.52 2 2.1 0.85 0.85 3 2.1 8.0 & 11.5 3.5 Panjang
gen pada tumbuhan telah diketahui oleh beberapa peneliti,
khususnya panjang cDNA. Mao et al. (2004) telah mengidentifikasi 20 fragmen yang berasal dari transkripsi (Transcript derived fragments =TDFs) gen OsAR (Oryza sativa Al- regulated) yang diregulasi oleh Al dengan cDNA-AFLP pada padi yang berukuran antara 112 pb dan 572 pb. Zang et al. (2007) menggunakan Differensial Display Reverse Transcription- Poly Chain Reaction (DDRT-PCR) telah mencatat lebih dari 140 cDNA responsif terhadap Al pada tanaman padi, dengan ukuran antara 141-624 pb serta 12 gen asimilasi sulfur berukuran antara 319-1090 pb. Kovermann et al. (2007) melaporkan bahwa cDNA AtALMT9 (Arabidopsis thaliana Aluminum-Activated Malate Transporter) berukuran 1797 pb mempunyai enam ekson, yang ditranskripsi dari gen yang panjangnya sekitar 3000 pb. Berdasarkan ukuran gen cDNA dan perkiraan ukuran intronnya, maka dengan rata-rata besarnya sisipan fragmen DNA M. malabathricum sebesar 4.52 kpb kemungkinan bisa mengandung gen utuh. Mengingat ukuran genom M. malabathricum belum diketahui, maka untuk mengetahui kelengkapan pustaka genomnya harus dibandingkan dengan genom dari spesies yang terdekat. M. malabathricum dan Dissotis canescens termasuk anggota famili Melastomataceae. Genom haploid Dissotic canescens berukuran 1.81 x 105 kpb (Hanson et al. 2001), sehingga ukuran genom diploidnya adalah 5
3.62 x 10 kpb. Dengan ukuran DNA sisipan rata-rata M. malabathricum sebesar
26 4.52 kpb, maka diperlukan klon rekombinan
minimal sebesar 8 x 104 agar
mencakup seluruh pustaka genom. Dalam penelitian ini, titer rekombinan yang terbentuk sebesar 2.2 x 10
4
4
pfu/ml, sehingga dalam 0.5 ml fage rekombinan terdapat 1.1 x 10 pfu. Dengan menggunakan rumus N = ln(1-p)/ln(1-f), dimana N = jumlah fage rekombinan, p = peluang sembarang gen terdapat dalam pustaka genom, dan f = rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom (Sambrook et al. 1989), maka peluang sembarang gen yang terdapat di dalam pustaka genom M. malabathricum adalah sebesar 12.6 %.
