HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi RNA Total RNA total M. malabathricum telah berhasil diisolasi melalui modifikasi metode Chang et al. (1993). Modifikasi dilakukan pada larutan penyangga dengan peningkatan konsentrasi β-mercaptoetanol sampai 200μl dan penambahan 1% PVP (Polivinil polivirolidon) dan pada fase ekstraksi yaitu menggunakan fenol pH 9. Pengujian hasil isolasi RNA total menunjukkan rendemen antara 171-247 μg/g bahan tumbuhan. Analisis kemurnian RNA melalui metode spektrofotometri menunjukkan nilai rasio absorban pada panjang gelombang 260nm dan 280nm sebesar 1.87 hingga 1.9 (Tabel 1). Menurut Farrel (1993) jika nilai rasio absorban pada panjang gelombang 260nm dan 280nm berkisar 1.8-2.0 maka RNA total yang diisolasi adalah murni yang bebas dari kontaminan protein. Tabel 1 Data hasil isolasi RNA total Nilai Absorbansi No. 1 2 3
Bahan Tumbuhan Akar Daun Daun pucuk
λ 260
λ 280
0.229 0.203 0.294
0.112 0.109 0.155
Rasio Absorbansi (λ 260 /λ 280) 1.87 1.86 1.90
Rendemen RNA (μg/g bahan tumbuhan) 192 171 247
Pengujian keutuhan RNA dengan elektroforesis menunjukkan adanya dua pita dominan pada RNA total yang diisolasi dari akar, daun tua dan daun pucuk. Dua pita dominan ini kemungkinan adalah RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S (Gambar 5). Munculnya pita rRNA dalam bentuk utuh mengindikasikan bahwa RNA total yang telah berhasil diisolasi adalah utuh. 1
2
3
28S 18S
Gambar 5. Hasil elektroforesis RNA total. RNA total dari (1) akar, (2) daun, (3) daun pucuk
Sintesis cDNA total cDNA total M. malabathricum L. berhasil disintesis dengan RNA total sebagai cetakan (template) melalui proses transkripsi balik dua langkah. Keberhasilan sintesis cDNA dan kualitas mRNA diuji dengan PCR menggunakan primer spesifik gen aktin sebagai kontrol. Hasil visualisasi PCR cDNA dengan primer actin (Gambar 6) menunjukkan hasil amplifikasi sekitar 450bp yang berarti sintesis cDNA total melalui transkripsi balik berlangsung dengan baik karena daerah yang diamplifikasi adalah hanya cDNA ekson1-ekson2 bukan DNA ekson1 - ekson2 dari gen aktin yang berukuran sekitar 600 pb. RNA total yang diisolasi memiliki kualitas bagus karena dapat digunakan untuk mensintesis cDNA dan bersih dari kontaminasi DNA. M
1
2
3
1000 pb Hasil PCR cDNA dengan primer aktin
500 pb
Gambar 6. Pita cDNA ekson1-ekson2 aktin hasil PCR. cDNA (1) daun tua, (2) daun pucuk, (3) akar sebagai cetakan
Isolasi fragmen cDNA MmFSNR melalui PCR Fragmen berukuran 700 pb berhasil diisolasi dengan menggunakan cDNA daun M. malabathricum dan primer spesifik yang selanjutnya disebut sebagai MmFSNR (Gambar 7). 1
2
M
1000 pb 700 pb
Gambar 7. Pita fragmen cDNA MmFSNR hasil PCR. (1) cetakan cDNA akar, (2) cetakan cDNA daun, M=1 kb ladder
19
Pengklonan fragmen MmFSNR ke dalam plasmid pGEM-T Easy Fragmen MmFSNR berhasil diligasikan dalam plasmid pGEM-T® Easy pada gen lacZ. Hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke dalam E coli galur DH5α dan diseleksi menggunakan media yang mengandung antibiotik ampisilin, IPTG dan X-gal. E. coli yang membawa plasmid rekombinan tumbuh dalam bentuk koloni putih karena ketidakmampuannya mengekspresikan enzim β-galaktosidase yang memecah substrat Xgal menjadi berwarna biru dengan adanya induksi IPTG terhadap promoter gen lacZ (Gambar 8). Hal ini terjadi karena menyisipnya fragmen MmFSNR ditengah-tengah gen lacZ. Keberadaan sisipan kemudian dikonfirmasi melalui PCR terhadap koloni putih. PCR terhadap koloni putih menghasilkan fragmen berukuran 700 pb sesuai fragmen MmFSNR yang disisipkan ke dalam plasmid tersebut sebelumnya. Sisipan cDNA yang terdapat di dalam plasmid yang ada dalam koloni dievaluasi dengan pengurutan DNA (DNA sequencing).
M
(a)
(b)
1000 pb 700 pb
Gambar 8. Hasil transformasi E. coli DH5α dan PCR terhadap koloni putih. (a) Seleksi biru putih koloni E. coli DH5α yang ditransformasi dengan hasil ligasi pGEM®–T Easy dan MmFSNR, (b) Hasil PCR terhadap koloni DH5α putih
20
Analisis fragmen MmFSNR Hasil pengurutan nukleotida fragmen cDNA sisipan menunjukkan bahwa DNA sisipan MmFSNR berukuran 700 pb (Lampiran 1 dan 2). Urutan DNA MmFSNR termasuk posisi primer dan situs pengklonan pada pGEM®-T Easy, disajikan dalam Gambar 9. T7 GCGGAGTCCATGCTGCTGCTGCTAGGTGGCGCTTGAATTCGATTATGGATATTGATCACGGCA GATAAGCGGCGGGCGAGGGCGATGATGCTTTATGGGGTTTCTTGAGATTTTGCTTTTGATCCC GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGAGAAGAAGAAGGGGGGAGGGGGATGGAGCC TCCGAGGGGATTCCTGCCTACCCTCGCCAAGTTCTTACTCTTCCTCCCCTATTTCCTCGGCTTATT GCTCCTTGGCACCCTCAAGGGAGTCGTCATCTGCCCTTTCTCTTGCCTTATCCTCACCGTCGGCA ACACCGGCGTCGTCCTGTGCATGTGGCCCGTCCACTTCCTCTGGACGTATTACTCCATCTTGAGG GCTAGGATTATCGGCCCCATCCTGAAGTTTCTCCTCTTTATTACCCTGCCTGTTCCGTTGATCTTG TGGCCGGTGGTTGCTATCCTCGGGAGTGTCTCTGGAGGCCTCGCGTTCGGCTTTCTTTCTCCTAT CTTCGCTACTTTCGAGGCAGTAGGGAAGGGGAAGGCCAACGATGTGTTCCACTGCTTTTATGA TGGAACGTGGAGCACAATTGAGCGGAGCATGACCATCGTGAGGGACTTTTGGGACATTTGTTG CCATTCATATTTCTCAATCGTGAATGAGCTGCGGAATCAAGAGCCTACCGGTGGGAAGTACTAC GAGATCAGATTGTTGTACCTTCCTTTGCCTGACGTGGTTATAATCACTAGTGAATTCGC Keterangan Hitam : DNA sisipan Merah : Primer spesifik A1‐F dan A1‐R Hijau : Situs restriksi Eco RI Kuning : Situs restriksi Spe I Biru : Bagian dari vektor pGEM®‐T Easy
Gambar 9. Hasil pengurutan DNA sisipan (MmFSNR) pada pGEM®-T Easy menggunakan primer T7
Analisis situs pemotongan enzim restriksi terhadap fragmen MmFSNR menunjukkan bahwa fragmen ini tidak mengandung situs EcoR1 sehingga situs EcoR1 dapat digunakan untuk mengeluarkan sisipan fragmen MmFSNR dari vektor pengklonan plasmid pGEM-T® Easy. Analisis peta restriksi pada fragmen MmFSNR berguna sebagai dasar informasi dalam konstruksi gen SNR dan secara umum penting diketahui untuk melakukan rekayasa genetika. fragmen MmFSNR disajikan pada Gambar 10.
21
Peta restriksi
Gambar 10. Peta restriksi MmFSNR Analisis kesejajaran lokal berdasarkan nukleotida menggunakan program BLASTN
(http://www.ebi.ac.uk/BLASTN)
menunjukkan
bahwa
fragmen
MmFSNR mempunyai kemiripan sebesar 65% dengan mRNA dari unknown protein At3g27390 Arabidopsis thaliana (Tabel 2). Tabel 2. Hasil analisis kemiripan sekuen nukleotida MmFSNR dengan program BLASTN (http://www.ebi.ac.uk/BLASTN) Align. 1
DB:ID EM_EST:CN916233
Source 030203ABPB004005HT (ABPB) M9 root tips Malus x domestica cDNA clone ABPB004005, mRNA sequence.
Length 710
Score 1032
Identities Positives 65.0 65.0
EO 1.8E-38
650
1032
65.0
65.0
1,9E-38
807
961
64.0
64.0
2.5E-35
786
954
65.0
65.0
5.3E-35
2011
957
65.0
65.0
6.1E-35
795
944
65.0
65.0
1.5E-34
747
944
65.0
65.0
1.6E-34
Cross-refeerences and related information in:Ontologies
2
EM_EST:CN916808
030108ABPB001620HT (ABPB) M9 root tips Malus x domestica cDNA clone ABPB001620, mRNA sequence. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
3
EM_EST:CX542902
4
EM_EST:FS338946
UCRPT01_5_003_D08_T3 Poncirus trifoliate CTV-chalanged cDNA library - UCRPT01-UCR2 citrus trifoliate cDNA clone UCRPT01_003_T3D08, mRNA sequence. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
Lotus japonicus cDNA, clone: LjFL3063-CB12, 5’-end sequence. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
5
EM_PL:BT002384
Arabidopsis thaliana Unknown protein (At3g27390) mRNA, complete cds. Cross-refeerences and related information in:Nucleotide Sequence Genomes Ontologies Protein Sequence
6
EM_EST: FS323108
Lotus japonicus cDNA, clone: LjFL3015-AG09, 5’-end sequence. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
7
EM_EST: FS322413
Lotus japonicus cDNA, clone: LjFL3013-AG06, 5’-end sequence. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
22
Berdasarkan analisis kesejajaran ganda (multiple sequence alignment) menggunakan ClustalW pada program Bioedit versi 7.0.0, MmFSNR mempunyai kesamaan dengan
DNA sisipan
sekuen nukleotida SNR dari padi
(Os02g0597800) dan Medicago truncantula yang dimulai dari nukleotida ke 133 dari primer yang digunakan untuk mengisolasi fragmen MmFSNR (Gambar 11).
Gambar 11. Hasil analisis kesejajaran ganda nukleotida MmFSNR dengan nukleotida SNR padi dan M. truncantula Fragmen 132 nukleotida di ujung 5’ dari MmFSNR tidak mempunyai kemiripan baik dengan SNR dari padi (OsSNR) maupun SNR dari M. truncantula (MtSNR). Karena tidak mempunyai kesamaan dengan OsSNR dan MtSNR, bagian nukleotida MmFSNR yang berbeda tersebut yakni 132 pasang basa dari primer, dihilangkan dan hasilnya disebut sebagai MmFSNRcut. Fragmen nukleotida MmFSNRcut selanjutnya dianalisis kembali menggunakan program BLASTN untuk melihat apakah pemotongan 132 basa berpengaruh terhadap hasil analisis kemiripan DNA sisipan dengan database sekuen di GenBank. Analisis kesejajaran lokal berdasarkan nukleotida menggunakan program BLASTN
(http://www.ebi.ac.uk/BLASTN)
menunjukkan
bahwa
fragmen
MmFSNRcut mempunyai kemiripan sebesar 66% atau hanya meningkatkan 1%
23
dari nilai kemiripan sebelumnya dengan mRNA dari unknown protein At3g27390 A. thaliana (Tabel 3).
Pemotongan 132 pasang basa pada sekuen MmFSNR
ternyata tidak menghasilkan pengaruh nyata dalam pencarian hasil kemiripan DNA sisipan dengan database sekuen dalam GenBank. Tabel 3 Hasil analisis kemiripan sekuen nukleotida MmFSNRcut dengan program BLASTN (http://www.ebi.ac.uk/BLASTN) Align. 1
DB:ID EM_EST:CN916233
Source Brassica oleraceae var. achephala mRNA, clone: KALE-009K18, 5’ end sequence.
Length 679
Score 531
Identities 67.0
Positives 67.0
EO 5.8E-32
2011
555
66.0
66.0
6.5E-32
712
575
67.0
67.0
8.8E-32
818
531
67.0
67.0
1.7E-31
826
548
66.0
66.0
4.8E-31
846
503
66.0
66.0
7.1E-31
780
503
66.0
66.0
7.7E-31
686
927
64.0
64.0
1.0E-33
712
906
64.0
64.0
8.7E-33
879
897
64.0
64.0
1.8E-32
846
890
65.0
65.0
3.9E-32
780
890
65.0
65.0
4.2E-32
Cross-refeerences and related information in: Ontologies
2
EM_EST:CN916808
Arabidopsis thaliana Unknown protein (At3g27390) mRNA, complete cds. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
3
EM_EST:CX542902
vsu-ars_011439_LI10Contig_15980 VSU-ARS-L10 Phaseolus acutifolius cDNA, mRNA sequence. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
4
EM_EST:FS338946
Brassica oleraceae var. achephala mRNA, clone: KALE-084E22, 5’ end sequence.
5
EM_PL:BT002384
Pv026B_M13F_E05. ab1 Phaseolus vulgaris cv Early gallatin Phaseolus vulgaris cDNA, mRNA sequence.
Cross-refeerences and related information in:Ontologies
Cross-refeerences and related information in:Nucleotide Sequence Genomes Ontologies Protein Sequence
6
EM_EST:CN916233
Brassica oleraceae var. achephala mRNA, clone: KALE-016H10, 5’ end sequence. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
7
EM_EST:FS323108
Brassica oleraceae var. achephala mRNA, clone: KALE-154D20, 5’ end sequence. Cross-refeerences and related information in:Ontologies
8
EM_EST:GW468405
CA00-XXFR-022-C01-CB.F Coffea arabica FR2 Coffea arabica cDNA cloneCA00-XX-FR2-022-C01-CB mRNA sequence Cross-refeerences and related information in:Ontologies
9
EM_EST:HO786406
vsuars_011439_LI110contig_15980_VSU _ARS-L10 Phaseolus acutifolius cDNA, mRNA sequence Cross-refeerences and related information in:Ontologies
10
EM_EST :DK459251
Brassica oleracea var.acephala mRNA, clone KALE-009K18, 5’end sequence Cross-refeerences and related information in:Ontologies
11
EM_EST:DK461847
12
EM_EST:DK514523
Brassica oleracea var.acephala mRNA, clone KALE-0016H10, 5’end sequence Cross-refeerences and related information in:Ontologies
Brassica oleracea var.acephala mRNA, clone KALE-154D20, 5’end sequence Cross-refeerences and related information in:Ontologies
24
Hasil deduksi asam amino menunjukkan bahwa MmFSNR menyandi 232 asam amino (Gambar 12).
1 47 16 92 31 137 46 182 61 227 76 272 91 317 106 362 121 407 136 452 151 497 166 542 181 587 196 632 211 677 226
ATGG ATA TTG ATC ACG GCA GAT AAG CGG CGG GCG AGG GCG ATG ATG Trp Ile Leu Ile Thr Ala Asp Lys Arg Arg Ala Arg Ala Met Met CTT TAT GGG GTT TCT TGA GAT TTT GCT TTT GAT CCC GAA GAA GAA Leu Tyr Gly Val Ser End Asp Phe Ala Phe Asp Pro Glu Glu Glu GAA GAA GAA GAA GAA GAA GGA GAA GAA GAA GGG GGG AGG GGG ATG Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Gly Arg Gly Met GAG CCT CCG AGG GGA TTC CTG CCT ACC CTC GCC AAG TTC TTA CTC Glu Pro Pro Arg Gly Phe Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Leu Leu TTC CTC CCC TAT TTC CTC GGC TTA TTG CTC CTT GGC ACC CTC AAG Phe Leu Pro Tyr Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly Thr Leu Lys GGA GTC GTC ATC TGC CCT TTC TCT TGC CTT ATC CTC ACC GTC GGC Gly Val Val Ile Cys Pro Phe Ser Cys Leu Ile Leu Thr Val Gly AAC ACC GGC GTC GTC CTG TGC ATG TGG CCC GTC CAC TTC CTC TGG Asn Thr Gly Val Val Leu Cys Met Trp Pro Val His Phe Leu Trp ACG TAT TAC TCC ATC TTG AGG GCT AGG ATT ATC GGC CCC ATC CTG Thr Tyr Tyr Ser Ile Leu Arg Ala Arg Ile Ile Gly Pro Ile Leu AAG TTT CTC CTC TTT ATT ACC CTG CCT GTT CCG TTG ATC TTG TGG Lys Phe Leu Leu Phe Ile Thr Leu Pro Val Pro Leu Ile Leu Trp CCG GTG GTT GCT ATC CTC GGG AGT GTC TCT GGA GGC CTC GCG TTC Pro Val Val Ala Ile Leu Gly Ser Val Ser Gly Gly Leu Ala Phe GGC TTT CTT TCT CCT ATC TTC GCT ACT TTC GAG GCA GTA GGG AAG Gly Phe Leu Ser Pro Ile Phe Ala Thr Phe Glu Ala Val Gly Lys GGG AAG GCC AAC GAT GTG TTC CAC TGC TTT TAT GAT GGA ACG TGG Gly Lys Ala Asn Asp Val Phe His Cys Phe Tyr Asp Gly Thr Trp AGC ACA ATT GAG CGG AGC ATG ACC ATC GTG AGG GAC TTT TGG GAC Ser Thr Ile Glu Arg Ser Met Thr Ile Val Arg Asp Phe Trp Asp ATT TGT TGC CAT TCA TAT TTC TCA ATC GTG AAT GAG CTG CGG AAT Ile Cys Cys His Ser Tyr Phe Ser Ile Val Asn Glu Leu Arg Asn CAA GAG CCT ACC GGT GGG AAG TAC TAC GAG ATC AGA TTG TTG TAC Gln Glu Pro Thr Gly Gly Lys Tyr Tyr Glu Ile Arg Leu Leu Tyr CTT CCT TTG CCT GAC GTG GTT ATA 700 Leu Pro Leu Pro Asp Val Val
46 15 91 30 136 45 181 60 226 75 271 90 316 105 361 120 406 135 451 150 496 165 541 180 586 195 631 210 676 225
Gambar 12. Deduksi asam amino dari urutan nukleotida fragmen cDNA MmFSNR Hasil kesejajaran berdasarkan urutan asam amino dengan program BLASTP
(http://www.ebi.ac.uk/BLASTP)
menunjukkan
bahwa
MmFSNR
mempunyai kesamaan 53% dengan protein Uncharacterized membrane protein GN : At3g27390 OS : Arabidopsis thaliana (Uniprot : Y3739_ARATH) dan 47% dengan protein Steroid Nuclear Reseptor dari M. truncantula (Tabel 4).
25
Tabel 4 Hasil analisis kemiripan sekuen deduksi asam amino MmFSNR dengan program BLASTP (http://www.ebi.ac.uk/BLASTP) Align. 1
DB:ID TR:B9SLS8_RICCO
Source Putative uncharacterized protein OS=Ricinus communis GN=RCOM_0530980 PE=4 SV=1
Length 582
Score 580
Identities 55.0
Positives 71.0
EO 1.1E-54
584
561
53.0
72.0
1.2E-52
588
552
55.0
70.0
1.1E-51
53.0
69.0
4.1E-50
Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Ontologies
2
TR:D7SPY0_VITVI
Whole genome shotgun sequence of line PN40024, scaffold_219.assembly12x (Fragment) OS=Votis vinifera GN=VIT_00003979001 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequence Literature Protein Sequence Ontologies
3
TR:D7LPF9_ARALL
Putative uncharacterized protein OS=Arabidopsis lyrata subsp. lyrata GN=ARALYDRAFT_484528 00003979001 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Ontologies
4
SP:Y3739_ARATH
Uncharacterized membrane protein AT3g27390 OS=Arabidopsis thaliana GN= AT3g27390 PE=4 SV=2
588
537
Cross-refeerences and related information in:Gene Expression Nucleotide Sequences Genomes Ontologies Literature Protein Sequences
5
TR:B9GIX9_POPTR
Predicted protein OS=Populus trichocarpa GN=POPTRDRAFT_752632 PE=4 SV=1
586
510
51.0
67.0
3.0E-47
586
494
49.0
67.0
1.5E-45
586
494
50.0
66.0
1.5E-45
595
494
50.0
66.0
1.5E-45
586
483
48.0
65.0
2.2E-44
586
477
48.0
63.0
9.0E-44
588
477
58.0
63.0
9.4E-33
582
474
47.0
65.0
2.0E-43
Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Genomes literature Ontologies
6
TR:D7MJ54_ARALL
Putative uncharacterized protein OS=Arabidopsis lyrata subsp. lyrata GN=ARALYDRAFT_493918 00003979001 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in:Ontologies
7
TR:Q84K38_ARATH
Putative uncharacterized protein At5g40640 OS=Arabidopsis thaliana GN=At5g40640 PE=2 SV=1 Cross-refeerences and related information in:Ontologies
8
TR:Q9FM34_ARATH
DBJlBAA 95714.1 OS=Arabidopsis thaliana PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in:Ontologies
9
TR:C5YAV96_SORBI
Putative uncharacterized protein Sb06g020560 OS=Sorghum bicolor GN= Sb06g020560 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Genomes literature Ontologies
10
TR:B8AVJ1_ORYSI
Putative uncharacterized protein OS=Oryza sativa subsp. indica GN= Osl_16361 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Genomes literature Ontologies
11
TR:Q7FAW5_ORYSJ
OSJNBa0081L15.3 protein OS=Oryza sativa subsp. japonica GN= OSJNBa0081L15.3 PE=2 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Genomes literature Ontologies
12
TR:Q2HU72_MEDTR
Steroid nuclear receptor, ligand binding protein OS=Medicago truncantula GN=MtrDRAFT_AC149208g42v2 PE=4 SV=2 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Ontologies
Adapun hasil kesejajaran terhadap deduksi asam amino dari fragmen sisipan yang sudah dihilangkan 132 pasang basa dari primer (MmFSNRcut) 26
dengan program BLASTP menunjukkan bahwa MmFSNRcut mempunyai kesamaan 61% dengan protein Uncharacterized membrane protein GN : At3g27390 OS : A. thaliana (Uniprot : Y3739_ARATH) dan 54% dengan protein SNR dari M. truncantula (Gambar 16). Tabel 5 Hasil analisis kemiripan sekuen deduksi asam amino nukleotida MmFSNRcut dengan program BLASTP (http://www.ebi.ac.uk/BLASTP) Align. 1
DB:ID TR:B9SLS8_RICCO
Source Putative uncharacterized protein OS=Ricinus communis GN=RCOM_0530980 PE=4 SV=1
dari
Length 582
Score 677
Identities 63.0
Positives 80.0
EO 3.0E-69
584
657
60.0
81.0
5.0E-67
588
650
63.0
79.0
3.0E-66
588
635
61.0
78.0
2.0E-64
586
603
59.0
77.0
1.0E-60
595
590
57.0
75.0
3.0E-59
586
590
57.0
75.0
3.0E-59
586
588
57.0
77.0
5.0E-59
586
590
57.0
75.0
3.0E-59
586
590
57.0
75.0
3.0E-59
588
574
56.0
72.0
2.0E-57
582
571
54.0
75.0
5.0E-57
Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Ontologies
2
TR:D7SPY0_VITVI
Whole genome shotgun sequence of line PN40024, scaffold_219.assembly12x (Fragment) OS=Votis vinifera GN=VIT_00003979001 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequence Literature Protein Sequence Ontologies
3
TR:D7LPF9_ARALL
Putative uncharacterized protein OS=Arabidopsis lyrata subsp. lyrata GN=ARALYDRAFT_484528 00003979001 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Ontologies
4
SP:Y3739_ARATH
Uncharacterized membrane protein AT3g27390 OS=Arabidopsis thaliana GN= AT3g27390 PE=4 SV=2 Cross-refeerences and related information in:Gene Expression Nucleotide Sequences Genomes Ontologies
5
TR:B9GIX9_POPTR
Predicted protein OS=Populus trichocarpa GN=POPTRDRAFT_752632 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Genomes literature Ontologies
6
TR:Q9FM34_ARATH
Dbj|BAA95714.1 OS=Arabidopsis thaliana PE=4 SV=1
7
TR:Q64K36_ARATH
Putative uncharacterized protein At5g40640 OS=Arabidopsis thaliana GN=At5g40640 PE=2 SV=1
Cross-refeerences and related information in:Ontologies
Cross-refeerences and related information in:Ontologies
8
TR:D7MJ54_ARALL
Putative uncharacterized protein OS=Arabidopsis lyrata subsp. lyrata GN=ARALYDRAFT_493916 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in:Ontologies
9
TR:C5YAV96_SORBI
Putative uncharacterized protein Sb06g020560 OS=Sorghum bicolor GN= Sb06g020560 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Genomes literature Ontologies
10
TR:Q7FAW5_ORYSJ
OSJNBa0081L15.3 protein OS=Oryza sativa subsp. japonica GN= OSJNBa0081L15.3 PE=2 SV=1 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Genomes literature
11
TR:B8AVJ1 _ORYSI
Putative uncharacterized protein OS=Oryza sativa subsp. indica GN= Osl_16361 PE=4 SV=1 Cross-refeerences and related information in:Ontologies
12
TR:Q2HU72_MEDTR
Steroid nuclear receptor, ligand binding protein OS=Medicago truncantula GN=MtrDRAFT_AC149208g42v2 PE=4 SV=2 Cross-refeerences and related information in: Nucleotide Sequences Ontologies
27
Pemotongan 132 pb pada sekuen nukleotida ternyata meningkatkan nilai kemiripan identity terhadap masing-masing protein tersebut sebesar 8% dan 7% dibandingkan tanpa pemotongan. Penyejajaran sekuen (sequence alignment) adalah sebuah prosedur untuk membandingkan dua pasang urutan (pair-wise alignment) atau lebih (multiple sequence alignment) dengan
pencarian
serangkaian karakter individu atau pola-pola karakter yang berada dalam urutan atau ordo (order) yang sama dalam sekuen (Mount 2001).
Gambar 13. Hasil penyejajaran deduksi asam amino dari nukleotida MmFSNRcut dengan protein At3g27390 dan SNR dari M. truncantula
28
Analisis penyejajaran sekuen berguna untuk menghasilkan kemungkinan terbaik atau kesejajaran ‘optimal’ untuk menemukan berbagai informasi baik informasi fungsional, struktural maupun informasi evolusioner dari suatu sekuen biologi. Sekuen-sekuen yang sangat mirip atau sama dalam bahasa analisis sekuen, kemungkinan mempunyai kesamaan fungsi, mempunyai peran pengaturan yang sama (bila menyangkut molekul DNA), atau mempunyai fungsi biokimia dan struktur tiga dimensi yang sama (bila menyangkut sekuen protein). Hasil analisis penyejajaran deduksi asam amino dari nucleotida MmFSNRcut masingmasing dengan protein At3g27390 dan protein SNR dari M. truncantula disajikan dalam Gambar 13. Hasil analisis hidrofobisitas antara protein MmFSNR, MtSNR dengan protein At3g27390 dari A. thaliana menunjukkan bahwa ketiganya mempunyai pola yang sama (Gambar 14).
Analisis hidrofobisitas protein berguna untuk
mengetahui area hidrofob dan hidrofil dari urutan asam amino sebuah protein, yang lebih lanjut dapat digunakan untuk menduga area dimana kemungkinan protein tersebut berada.
Gambar 14. Perbandingan hidrofobisitas fragmen protein putatif MmFSNR, MtSNR dan At3g27390 Dengan
adanya
kemiripan
berdasarkan
peptida
SNR
dari
M.
malabathricum (MmFSNR) dengan SNR M. truncantula (MtSNR), maka SNR M.
29
malabathricum diduga memiliki peran dan fungsi yang mirip dengan SNR pada M. truncantula. SNR merupakan salah satu faktor transkripsi yang berperan mengatur pengikatan RNA polimerase terhadap DNA. Faktor transkripsi didefinisikan sebagai protein yang mengikat pada sekuen spesifik DNA yang mampu mengaktifkan atau menekan proses transkripsi (Germain et al. 2003). Menurut Udvardi et al. (2007), pada tanaman, perkembangan dan diferensiasi sel dan organ secara primer diatur pada level transkripsi gen yang dikendalikan oleh faktor transkripsi dan protein-protein lain yang dapat mengaktifkan RNA polimerase untuk menempel pada DNA yang akan ditranskripsikan. Proses inilah yang menentukan kemampuan tanaman untuk tumbuh, berkembang dan melakukan proses reproduksi sekaligus di saat yang bersamaan berhasil mengatasi berbagai cekaman lingkungan ekstrim. SNR sebagai faktor transkripsi pada melastoma diduga memainkan peran sebagai reseptor xenobiotik yang mendeteksi senyawa
xenobiotik dan menginduksi beragam aktivitas enzimatik dan
transporter untuk mendetoksifikasi senyawa berbahaya semacam Al. Sebagaimana diketahui melastoma adalah akumulator Al bahkan pertumbuhan dan penyerapan hara pada melastoma yang justru semakin meningkat dengan keberadaan Al (Osaki et al. 1997), padahal Al sangat beracun bagi tanaman. Menurut Morel et al. (2000), ketika berikatan dengan sebuah ligan senyawa xenobiotik, NR berperan penting dalam induksi enzim-enzim detoksifikasi semacam MDR, Sitokrom P450, GST, maupun MRP. Richard et al. (1998) menyatakan bahwa GST yang dikenal sebagai antioksidan pada Arabidopsis thaliana diinduksi oleh Al. Sasaki et al. (2002) menyatakan ekspresi MDR pada barley diinduksi oleh Al. Oleh sebab itu, toleransi terhadap Al kemungkinan berhubungan dengan ekspresi gen faktor transkripsi seperti SNR. Menurut Shen dan Schulze-lefert (2007) pada tanaman, NR diduga berperan signifikan dalam sensor imunitas. Lintasan pensinyalan didalamnya paralel dengan mekanisme kontrol regulator pada reseptor steroid hewan. Hasil penyejajaran asam amino MmFSNR juga menunjukkan adanya kemiripan sebesar 53% dengan protein At3g27390. Protein At3g27390 adalah salah satu protein yang diekspresikan akibat induksi flagelin, dan diprediksi terkait dengan pensinyalan awal terhadap elisitor pada A. thaliana (Benschop et al. 2007).
30
Flagelin adalah salah satu elisitor umum yang dikeluarkan oleh patogen. Sebagai senyawa berbahaya bagi tanaman, flagelin dapat disebut sebagai senyawa xenobiotik yang memicu respon pertahanan dari tanaman. SNR melastoma diduga juga memainkan peran terkait respon lanjut tanaman terhadap elisitor sebagai senyawa berbahaya bagi tanaman. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian bahwa Melastoma malabathricum L. menghasilkan metabolit berbasis stachyurin, kompleks tannin malabathrin A, E dan F (Yoshida et al. 2010) bagian dari tanin kompleks (flavono-elagitanin) yang merupakan senyawa metabolit sekunder yang bersifat antioksidatif, anti tumor dan anti bakteri (Yoshida et al. 2000).
31