13
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan Fraksinasi Sampel buah mahkota dewa yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari kebun percobaan Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor dalam bentuk simplisia yang kemudian dijadikan serbuk dengan ukuran 80 mesh. Kadar air serbuk mahkota dewa yang diperoleh sebesar 2.12%. Kadar air yang diperoleh kurang dari 10% merupakan kadar air yang baik karena pada tingkat kadar air tersebut waktu simpan sampel akan relatif lebih lama dan terhindar dari pencemaran yang disebabkan oleh mikroba dan memenuhi syarat sebagai bahan baku herbal (Winarno 1992; BPOM 2004). Ekstraksi serbuk buah mahkota dewa sebanyak 200 g dilakukan dengan cara refluks menggunakan pelarut metanol, disaring dan diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 30oC. Ekstrak pekat yang diperoleh sebanyak 39.0776 g dengan rendemen 20.85%. Selanjutnya ekstrak metanol yang diperoleh dipartisi menggunakan kloroform. Hasil partisi dengan kloroform diperoleh fraksi metanol dengan rendemen 72.25% dan fraksi kloroform 24.98% dari ekstrak kasar metanol. Untuk mengetahui kandungan kimia dari fraksi metanol dan fraksi kloroform dilakukan uji fitokimia antara lain uji flavonoid, triterpenoid, steroid dan uji fenol. Hasil pengujian fitokimia fraksi metanol dan fraksi kloroform buah mahkota dewa dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Hasil uji fitokimia fraksi metanol dan fraksi kloroform buah mahkota dewa Golongan Senyawa Fraksi Metanol Fraksi Kloroform Fenol +++ ++ Flavonoid ++++ ++ Benzofenon +++ ++ Steroid +++ ++ Triterpenoid + +++ Keterangan : (+) : terdeteksi , semakin banyak (+) intensitas warna semakin meningkat
14
Hasil uji fitokimia pada Tabel 2 menunjukkan bahwa pada fraksi metanol golongan triterpenoid memperlihatkan warna ungu yang tidak terlalu kuat, sedangkan pada fraksi kloroform warna ungu terlihat pekat sehingga diduga triterpenoid terpisahkan pada partisi dengan kloroform. Sementara itu steroid pada kedua fraksi baik fraksi metanol maupun kloroform menunjukkan intensitas warna hijau yang kuat,
yang menunjukkan keberadaan golongan steroid.
Flavonoid pada fraksi metanol lebih kuat intensitas warnanya dibanding pada fraksi kloroform, hal itu terlihat dari warna merah yang kuat pada lapisan amil alkohol dari fraksi metanol. Pada uji fenol, fraksi metanol menunjukkan intensitas warna hijau yang lebih kuat dibanding fraksi kloroform. Oleh karena itu pada penelitian ini tujuan utamanya adalah untuk memperoleh golongan benzofenon yang merupakan bagian dari fenol, maka fraksinasi selanjutnya dilakukan pada fraksi metanol. Pencarian eluen terbaik untuk penggabungan fraksi hasil kromatografi kolom menggunakan pelat kromatografi lapis tipis (KLT), fraksi yang memiliki nilai Rf yang sama atau hampir sama akan digabung. Pencarian eluen dimulai dari eluen tunggal yaitu metanol, etil asetat, kloroform, aseton, butanol, diklorometana, dan n-heksana. Eluen tunggal yang dipilih adalah etil asetat (semipolar) dan metanol (polar) sebagai eluen tunggal terbaik karena noda yang terbentuk cukup banyak dan terpisah. Selanjutnya dilakukan penggabungan 2 eluen terbaik etil asetat:metanol dengan perbandingan 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9. Penggabungan 2 eluen belum diperoleh noda yang terpisah dengan baik (Lampiran 2), maka dilakukan penggabungan 3 eluen dengan menambahkan nheksana yang merupakan eluen nonpolar. Hasil penggabungan 3 eluen dengan berbagai perbandingan diperoleh eluen terbaik yaitu campuran n-heksana:etil asetat:metanol (7:14:3) seperti ditunjukkan pada Gambar 3.
15
Gambar 3 Pola KLT eluen terbaik eluen n-heksana:etil asetat: metanol (7:14:3) Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan fraksi metanol sehingga diperoleh senyawa golongan benzofenon yang bersifat sitotoksik melalui uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Fraksinasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dengan metode step gradient (peningkatan kepolaran) dimulai dari eluen n-heksana, etil asetat, dan metanol. Tujuan peningkatan polaritas sistem eluen agar semua komponen yang terlarut dalam fraksi metanol akan terbawa lebih cepat dan pemisahan dapat berlangsung dengan baik. Fraksinasi yang dilakukan terhadap fraksi metanol
menghasilkan 167
tabung yang digabung berdasarkan pola KLT dengan eluen campuran nheksana:etil asetat:metanol (7:14:3) sehingga diperoleh 12 fraksi (fraksi 1-12) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4. Harga Rf dan jumlah spot masingmasing fraksi dapat dilihat pada Lampiran 3.
16
E F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 Gambar 4 Pola KLT penggabungan fraksi hasil kromatografi kolom dengan eluen terbaik eluen n-heksana:etil asetat: metanol (7:14:3)
Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Fraksi Hasil Kromatografi Kolom Uji toksisitas dilakukan pada fraksi 4-12 yang diduga mengandung senyawa golongan benzofenon. Terhadap fraksi 1-3 tidak dilakukan uji toksisitas karena diduga kuat tidak terdapat senyawa golongan benzofenon yang bersifat polar, sementara itu fraksi 1-3 diduga merupakan kelompok senyawa nonpolar karena fraksi 1-3 diperoleh setelah dielusi dengan eluen nonpolar. Nilai LC50 fraksi 4-12 dapat dilihat pada Tabel 3. Dari hasil uji toksisitas BSLT (Tabel 3) diperoleh 3 fraksi terbaik yang memiliki toksisitas yaitu fraksi 4, 10, dan 11. Contoh perhitungan nilai LC50 dapat dilihat pada Lampiran 4. Fraksi 4 merupakan yang paling baik dengan nilai LC50 yang paling rendah. Hasil yang diperoleh lebih tidak aktif dibandingkan penelitian yang dilakukan oleh Lisdawati
17
(2002) terhadap ekstrak kasar metanol mahkota dewa (LC50 berkisar antara 0.1615-11.8351 μg/ml). Diduga hal tersebut disebabkan oleh perbedaan lokasi tanam, iklim, dan waktu simpan yang membuat kandungan metabolit sekundernya berbeda. Tabel 3 Toksisitas BSLT fraksi hasil kolom (fraksi 4-12) fraksi metanol buah mahkota dewa Fraksi F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
Nilai LC50 (μg/ml) 30.90 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 588.57 814.19 -
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Fraksinasi golongan senyawa benzofenon pada fraksi 4 dilakukan dengan menggunakan KLTP. Sebelum dilakukan pemurnian menggunakan KLTP terhadap fraksi 4 sebagai fraksi paling sitotoksik pada uji BSLT, terlebih dahulu dilakukan pencarian eluen terbaik, karena eluen yang digunakan pada penggabungan fraksi-fraksi hasil kolom belum diperoleh spot yang terpisah dengan baik.
Hasil pencarian eluen menggunakan eluen campuran antara
kloroform:metanol:air
dengan berbagai perbandingan dan studi literatur,
diperoleh eluen campuran antara kloroform:metanol:air dengan perbandingan 70:20:2. Eluen ini untuk selanjutnya digunakan pada KLTP, hasilnya ditunjukkan pada Gambar 5.
18
Gambar 5 Pola KLT preparatif fraksi 4 hasil kromatografi kolom, eluen kloroform:metanol:air (70:20:2) Proses pemurnian fraksi 4 dengan KLTP menggunakan adsorben silika gel. Berdasarkan pemisahan yang dilakukan diperoleh 8 fraksi (fraksi 41-48). Noda yang terbentuk dapat dilihat dari pola KLT fraksi 4 hasil KLTP pada Gambar 6. Nilai Rf ke-8 fraksi hasil KLTP ini dapat dilihat pada Lampiran 5.
F4 F41 F42 F43 F 44 F 45 F 46 F 47 F48 Gambar 6 Pola KLT hasil KLTP fraksi 4 dengan eluen kloroform:metanol:air (70:20:2)
19
Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Fraksi Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Hasil fraksinasi menggunakan KLTP ini diuji toksisitas BSLT-nya untuk mendapatkan fraksi yang berpotensi sitotoksik. Adapun hasil pengujian aktivitas toksisitas BSLT terhadap 8 fraksi KLTP yang diperoleh ditunjukkan pada Tabel 4. Tabel 4. Toksisitas BSLT fraksi hasil KLTP (fraksi41-48) Fraksi hasil KLTP F41 F42 F43 F44 F45 F46 F47 F48
Nilai LC50 (μg/ml) >1000 >1000 >1000 >1000 899.28 >1000 100.00 >1000
Data pada Tabel 4 menunjukkan bahwa fraksi hasil KLTP yang memiliki potensi sitotoksik yang paling baik dengan nilai LC50 paling rendah adalah fraksi 47 dengan nilai LC50 100 μg/ml, akan tetapi nilai ini tidak sebaik nilai LC50 fraksi 4 hasil kromatografi kolom yaitu sebesar 30.90 μg/ml. Hal ini diduga karena komponen aktif tidak terpisah dengan baik pada KLTP atau disebabkan oleh komponen yang bekerja secara sinergis pada fraksi 4 menjadi berkurang setelah difraksinasi menggunakan KLTP.
Sementara itu fraksi 45 menunjukkan nilai
LC50 di bawah 1000 μg/ml, yaitu 899.28 μg/ml, yang berpotensi sitotoksik.
Keberadaan Golongan Benzofenon pada Fraksi Hasil Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Uji kualitatif golongan benzofenon dilakukan terhadap fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom dan KLTP yang telah diuji toksisitas BSLTnya. Uji kualitatif ini dilakukan untuk mengetahui senyawa yang bersifat sitotoksik termasuk senyawa golongan benzofenon. Uji kualitatif fraksi hasil kolom, yaitu fraksi 4-12 dan fraksi hasil KLTP, yaitu fraksi 41-48. Uji kualitatif dilakukan dengan cara menyemprotkan reagen pendeteksi senyawa benzofenon Fast Blue Salt B 1%
20
dalam metanol air 1:1 pada plat KLT yang telah dielusi dengan eluen terbaik yaitu campuran kloroform:metanol:air (70:20:2). Hasil uji kualitatif fraksi-fraksi hasil kolom ditunjukkan pada Gambar 7.
E F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 Gambar 7 Pola KLT uji kualitatif fraksi hasil kolom dengan eluen kloroform:metanol:air (70:20:2) Hasil uji kualitatif diperoleh beberapa fraksi yang diduga positif mengandung benzofenon yaitu fraksi 4, 5, 6, 10, dan 11. Hal ini terlihat dari perubahan warna spot pada plat KLT menjadi merah ungu terang sesaat setelah disemprot dengan reagen pendeteksi dan merah kecoklatan setelah teroksidasi. Pada fraksi 4 dengan Rf 0,37 warna merah ungu sangat kontras, pada fraksi 5 terdapat 2 spot yang positif benzofenon yaitu pada spot ke-5 dengan Rf 0,37 warna merah ungu juga sangat kontras dan pada spot ke-4 dengan Rf 0.30. Jumlah spot dan harga Rf masing-masing fraksi yang diduga mengandung benzofenon ditunjukkan pada Tabel 5.
21
Tabel 5 Jumlah spot dan nilai Rf dari fraksi yang diduga positif mengandung senyawa benzofenon Fraksi hasil kolom 4 5 6 10 11
Jumlah spot 1 2 2 3 2
Nilai Rf 0.37 0.30;0.37 0.15;0,37 0.15;0.30;0.37 0.30;0.37
Selanjutnya dilakukan uji kualitatif terhadap fraksi hasil KLTP yaitu fraksi 41-48 melalui cara yang sama dengan yang dilakukan pada fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom. Hasil uji kualitatif fraksi hasil KLTP ditunjukkan pada Gambar 8.
F4 F41 F42 F43 F44 F45 F46 F47 F48 Gambar 8
Pola KLT uji kualitatif fraksi 4 hasil KLTP dengan eluen kloroform:metanol:air (70:20:2).
Dari hasil uji kualitatif fraksi hasil KLTP diperoleh fraksi 44 dan 45 yang diduga positif mengandung senyawa benzofenon. Pada fraksi 45 spot dengan nilai Rf 0.37 warnanya terlihat sangat kontras dibanding fraksi 44 yaitu merah ungu setelah disemprot menggunakan Fast Blue Salt B dan menjadi coklat kemerahan setelah teroksidasi. Sementara itu fraksi 44 pada uji toksisitas BSLT tidak menunjukkan aktivitas yang baik, fraksi 45 menunjukkan aktivitas yang cukup baik walaupun tidak sebaik aktivitas fraksi 47, tetapi pada uji kualitatif fraksi 47 tidak terdeteksi mengandung senyawa benzofenon. Sementara itu dari hasil uji toksisitas BSLT fraksi 47 merupakan fraksi yang paling aktif, berwarna coklat tua
22
dan memiliki potensi sitotoksik terbaik dibanding fraksi hasil KLTP lainnya, diduga fraksi 47 merupakan senyawa turunan fenolat lain. Untuk mengidentifikasi golongan senyawa dideteksi menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan IR. Rangkuman hasil fraksinasi, uji toksisitas dan uji kualitatif yang telah dilakukan selengkapnya ditunjukkan pada Tabel 6. Tabel 6 Hasil fraksinasi kromatografi kolom dan KLTP, toksisitas BSLT dan keberadaan benzofenon Uji Kualitatif Fraksi Jumlah spot Rendemen LC50 BSLT Benzofenon hasil total (%) (µg/ml) kolom 4 8 14.63 30.90 ++ 5 9 7.69 ++ 6 10 12.50 ++ 7 8 12.19 8 4 1.71 9 3 1.67 10 10 6.17 588.57 ++ 11 7 7.40 814.19 + 12 3 7.20 Fraksi hasil KLTP 41 1 0.58 42 2 0.68 43 5 0.72 44 2 0.84 + 45 3 2.80 899.28 ++ 46 3 1.08 47 2 1.20 100.00 48 3 0.80 Keterangan : pada uji kualitatif : (-): tidak terdeteksi; (+): intensitas warna cukup kuat; (++): intensitas warna kuat; pada LC50 : (-): tidak toksik
Dari data pada Tabel 6 terlihat bahwa fraksi 4 hasil kolom dari fraksi metanol selain memiliki rendemen terbanyak, juga paling toksik pada uji BSLT dan positif mengandung benzofenon pada uji kualitatif. Dari data tersebut diduga bahwa pada fraksi 4 yang bersifat sitotoksik adalah senyawa benzofenon. Sementara itu fraksi 47 hasil KLTP yang tidak terdeteksi mengandung benzofenon dari uji BSLT ternyata memiliki toksisitas yang tinggi, sedangkan fraksi 45 yang terdeteksi mengandung benzofenon memiliki toksisitas yang rendah, hal ini
23
diduga pada fraksinasi menggunakan KLTP senyawa aktif belum terpisah dengan baik sehingga efek toksisitasnya menurun. Fraksi 47 merupakan fraksi hasil pemisahan dari fraksi metanol yang pada uji fitokimia diduga
terdeteksi memiliki kandungan flavonoid yang tinggi sehingga
senyawa yang bersifat sitotoksik pada fraksi 47 merupakan senyawa
golongan flavonoid. Untuk mengetahui golongan senyawa dari fraksi 45 dan 47 maka dilakukan identifikasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan IR. Analisis Spektrofotometer UV-Vis Fraksi Hasil KLTP Fraksi 45 hasil KLTP yang dari uji kualitatif diduga merupakan senyawa golongan benzofenon dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Hasil analisis menunjukkan fraksi 45 memiliki panjang gelombang maksimum (λmax) dalam MeOH pada 200 nm dan serapan lainnya pada 264 nm (Gambar 9).
Gambar 9 Spektrum UV-Vis Fraksi 45 hasil KLTP Serapan pada panjang gelombang maksimum 200 nm dan 264 nm menunjukkan adanya transisi elektron dari π ke π* yang merupakan ciri khas untuk sistem ikatan rangkap terkonjugasi dari suatu cincin aromatik yaitu kromofor C=C aromatik dan C=O. Cariphenone B yang berhasil diisolasi oleh Bernardi et al. (2004) dari Hypericum carinatum merupakan senyawa turunan benzofenon memiliki λmax 216, 254 dan 294 nm. Serapan fraksi 45 hasil KLTP
24
berada pada kisaran panjang gelombang senyawa benzofenon yang telah dilaporkan oleh Bernardi et al. (2004). Sementara itu pada fraksi 47 hasil KLTP yang pada uji kualitatif tidak mengandung senyawa benzofenon, tetapi melalui uji sitotoksik BSLT memiliki nilai LC50 paling rendah, memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 249 dan 341 nm (Gambar 10), menurut Markham (1988) kisaran panjang gelombang 250-280 nm dan 310-350 nm tergolong flavonoid yaitu jenis flavon, λmaks 250-270 nm menurut Harborne (1982) merupakan golongan flavon.
Gambar 10 Spektrum UV-Vis Fraksi 47 hasil KLTP Analisis Spektrofotometer IR Fraksi Hasil KLTP Analisis spektrum IR fraksi 45 hasil KLTP (Gambar 11) menunjukkan uluran pada bilangan gelombang 3399, 2922, 1919, 1618, 1511, dan 1436 cm-1. Vibrasi regang pada bilangan gelombang 3399 cm-1 dengan bentuk pita lebar menunjukkan adanya gugus OH, vibrasi regang pada 2922 cm-1 menunjukkan grup C-H jenuh atau metil (-CH3), serapan pada bilangan gelombang 1618 cm-1 secara kuat mengindikasikan keberadaan α β C=O tak jenuh dan vibrasi regang pada 1511 dan 1436 cm-1 mengindikasikan keberadaan cincin aromatik.
25
Gambar 11 Spektrum IR fraksi 45 hasil KLTP Sementara itu analisis spektrum fraksi 47 (Gambar 12) hasil KLTP terdapat uluran pada bilangan gelombang 3399, 2927, 2855, 1706, 1609, 1469, 1283 cm-1 dimana pada bilangan gelombang 3399 cm-1 menunjukkan gugus OH, 2927 dan 2852 cm-1 menunjukkan gugus CH2, vibrasi regang pada bilangan gelombang 1706 cm-1 menandakan adanya gugus karbonil.
Sedangkan pada
bilangan gelombang 1609 dan 1465 cm-1 mengindikasikan keberadaan cincin aromatik. Dari data UV-Vis dan IR fraksi 47 diduga merupakan golongan flavonoid yaitu flavon.
Gambar 12. Spektrum IR fraksi 47 hasil KLTP
26
Berdasarkan dugaan gugus fungsi yang didapatkan, terbukti adanya senyawa golongan benzofenon pada fraksi 45 hasil kLTP dan golongan flavonoid yaitu flavon pada fraksi 47 hasil KLTP yang dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7 Absorpsi IR gugus-gugus fungsi fraksi 45 dan 47 hasil KLTP Bilangan gelombang (cm-1) Fraksi 45 3399 2922 1919 1618 1511 1436
Fraksi 47 3399 2927 2855 1706 1609 1469
Phalerin* 3387 2922 2698 1616 1512 1436
Dugaan gugus fungsi Gugus OH C-H jenuh C-H tak jenuh Regangan C=O Cincin aromatik C=C Cincin aromatik C=C
Literatur Bilangan gelombang (cm-1) 3000-3700*** 2800-3000** 2700-3000*** 1650-1900*** 1450-1600** 1450-1600**
Keterangan: *)Hartati et al. 2005; **)Fessenden & Fessenden J.S 1986; ***)Colthup et al. 1975 Fraksi 45 hasil KLTP yang diduga senyawa golongan benzofenon terbukti memiliki serapan pada panjang gelombang yang mirip dengan phalerin (glikosida benzofenon) yang berhasil diisolasi oleh Hartati et al. (2005) dari ekstrak metanol daun mahkota dewa.
