27
HASIL DAN PEMBAHASAN Desain Primer Primer spesifik didesain untuk mendapatkan promotor dari suatu gen. Primer spesifik ini didesain berdasarkan sekuen DNA target. Selain berdasarkan urutan DNA target, primer juga didesain sesuai vektor dan teknologi yang di gunakan. Dalam penelitian ini digunakan beberapa primer seperti M13 dan primer khusus gateway. M13 digunakan karena plasmid yang digunakan yaitu TOPO 2.1 (Shuman, 1991; Shuman, 1994) mempunyai sekuen M13 yang komplemen baik reverse dan forward. Primer khusus gateway dibuat menurut aturannya. Pembuatan primer gateway dalam penelitian ini memperhatikan sekuen att yang ditambahakan pada urutan DNA primer, dan urutan 4 basa guanin(GGGG) sebelum situs att. Tabel 6. Urutan DNA primer PSA tanpa att >Aka_F GGGCCTCTAG-----------AACGTTAAAA 522 >Aka_R TAGTACGGCC-----------TCGGATTCCC 554 Isolasi DNA PSA Isolasi DNA merupakan tahap awal yang penting dan menentukan keberhasilan dari penelitian. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode Chaimdamsari (2005).
Kloning PSA dengan menggunakan TOPO 2.1 Reaksi kloning dengan menggunakan vektor TOPO 2.1 bertujuan untuk memasukan DNA PSA kedalam vektor untuk pemeriksaan DNA PSA ini. Setelah proses kloning TOPO 2.1 dilakukan, kemudian dilakukan transformasi ke bakteri kompoten dengan menggunakan bakteri kompoten E. coli XL-1 Blue. Selanjutnya di lakukan isolasi plasmid dan eletroforesis gel agarose dengan konsentrasi 1% untuk memeriksa hasil plasmid yang ditransformasikan. Hasil uji kualitatis dengan elektroforesis menunjukan adanya pita yang berkisar pada ukuran berkisar pada 5000 bp (Gambar 10).
28
12000 pb 5000 pb 2000pb 1620 pb
1000 pb 850 pb 650pb 500 pb 400 pb 300pb 200 pb
100 pb
Gambar10. Hasil elektroforesis Plasmid PSA yang sudah tersisipkan pada vektor TOPO 2.1 Vektor TOPO 2.1 memilki 3931 bp, sehingga di perkirakan DNA yang tersisipkan pada vektor berkisaran 1000 bp. Setelah mendapatkan ukuran vektor yang sudah tersisipkan DNA target, hal yang selanjutnya dilakukan periksaan adalah perkiraan DNA kita yang tersisip dengan menggunakan primer M13 (Gambar 11). Primer M13 dapat kita gunakan karena pada plasmid TOPO 2.1 yang kita gunakan urutan dari sekuen M13 telah tersedia.
29
Gambar 11. Letak primer M13 pada vektor TOPO 2.1
850 pb
Gambar 12. Hasil elektroforesis koloni PSA (TOPO 2.1) Hasil PCR koloni (lampiran 6) dengan menggunakan pimer M13 menunjukan DNA PSA berukuran dikisaran 850 pb (Gambar 12). Setelah didapatkan pita DNA PSA maka tersebut akan kita elusikan dengan cara memotong pita tersebut. Purifikasi DNA PSA dilakukan dengan menggunakan PureLink Quick Gel Etraction Kit dari invitrogen. Hasil purifikasi kemudian disekuen untuk melihat urutan DNA PSA tersebut. Konfirmasi kembali dilakukan dengan elektroforesis gel agarose 1% (Gambar 13).
30
850 pb
Gambar 13. Hasil elektroforesis elusi PSA Metode Gateway Pada metode ini yang akan digunakan adalah primer khusus gateway yang sudah kita konstruksi dengan menggunakan urutan khusus dimana terjadi penambahan urutan -GGGG- dan 20bp situs att pada primer PSA. Setelah itu dilakukan amplifikasi PSA dengan primer khusus gateway yang telah dikonstruksi. Setelah amplifikasi dilakukan pada proses PCR dengan suhu annaeling 450C, 500C, 550C didapatkan hasil berupa pita pada kisaran di bawah 850 pb. Hal ini menunjukan sedikit perbedaan dengan menggunakan primer M13 karena primer khusus gateway yang digunakan teramplifikasi lansgsung pada DNA PSA dengan ukuran yang lebih kecil (Gambar 14).
850 pb
Gambar 14. Hasil Elektroforesis amplifikasi primer gateway dengan PSA pada ann 450C, 500C, 550C.
31
Pita hasil amplifikasi kemudian dielusikan dan di cek lagi menggunakan elektroforesis 1%(Lampiran 6). Hasil purifikasi menunjukan smear yang positif (Gambar 15). Kemudian hasil dari purifikasi ini kembali sekuen untuk melihat
850 pb
Gambar 15. Hasil elektroforesis purifikasi PSA Konfirmasi DNA Target sebagai Promotor Dari hasil sekuen terbaca DNA target memiliki 809 bp. Kemudian digunakan software bioinformatik untuk menentukan DNA target sebagai promotor. Software yang digunakan yaitu TSSP (transcription start positions predicts) dan NSITE (number site transcription elements) dari Softberry inc, serta software modENCODE Consortium yaitu Neural Network Promoter Prediction. Untuk IUPAC Nucleotide Code lihat lampiran 7. Berikut ini hasil sekuen DNA target PSA dengan 809 pb pada program TSSP (Solovyev & Salamov 1997; Solovyev 2001; Solovyev & Shahmuradov 2003). Hasil menunjukan terdapat dua element yang menandakan bahwa DNA target merupakan promotor yaitu promotor pos TATA box pada line 697 dan enhancer pos. > test sequence Length of sequence-
809
Thresholds for TATA+ promoters -
0.02, for TATA-/enhancers -
0.04 2 promoter/enhancer(s) are predicted Promoter Pos:
730 LDF-
0.18 TATA box at
697
22.20
32
Enhancer Pos:
757 LDF-
0.05
Transcription factor binding sites/RegSite DB: for promoter at position -
730
562 (+) RSP00003
CCWWWWWWRG
464 (+) RSP00016
caTGCAC
527 (+) RSP00026
gcttttgaTGACtTcaaacac
514 (+) RSP00076
AACGTT
525 (+) RSP00161
WAAAG
567 (+) RSP00161
WAAAG
464 (+) RSP00327
CATGCA
711 (+) RSP00438
GGCGGC
662 (+) RSP00477
TTTAA
636 (+) RSP00483
GCCGC
453 (+) RSP00512
cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc
530 (+) RSP00512
cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc
for promoter at position -
757
562 (+) RSP00003
CCWWWWWWRG
464 (+) RSP00016
caTGCAC
527 (+) RSP00026
gcttttgaTGACtTcaaacac
514 (+) RSP00076
AACGTT
525 (+) RSP00161
WAAAG
567 (+) RSP00161
WAAAG
464 (+) RSP00327
CATGCA
711 (+) RSP00438
GGCGGC
662 (+) RSP00477
TTTAA
636 (+) RSP00483
GCCGC
530 (+) RSP00512
cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc
Pemeriksaan data diatas ditemukan motif promotor dari 23 spesies pada pemeriksaan pada 1816 element regulatory dari berbagai spesies (Softberry Inc. 2001-2009; Last Update: 2009). Berikut ini adalah hasil pemeriksaan konfirmasi Regulatory Elements(RE) yang berasal dari RegSite DB PLANT division (Softberry Inc. 2001-2009; Last Update: 2009) : for promoter at position 562 (+) RSP00003
730
CCWWWWWWRG
AC: RSP00003//OS: arabidopsis (Arabidopsis thaliana) /GENE: Synthetic oligonucleotides/RE: CArG1 (AGL3) /BF: AGL3; MADS-box containing positively transcription factor
33
464 (+) RSP00016
caTGCAC
527 (+) RSP00026
gcttttgaTGACtTcaaacac
26. AC: RSP00026//OS: tobacco (Nicotiana tabacum) /GENE: G13/RE: -141 sequence /BF: TGA1a; PG13;
514 (+) RSP00076
AACGTT
519 (-) RSP00076
AACGTT
76. AC: RSP00076//OS: rice (Oryza sativa) /GENE: rifa-7-P-glucuronidase transgene/RE: T-box /BF: bZIP factor
525 (+) RSP00161
WAAAG
567 (+) RSP00161
WAAAG
161.
AC:
RSP00161//OS:
maize
(Zea
mays)
/GENE:
Synthetic
oligonucleotids/RE: Dof1 BSopt /BF: Dof1
464 (+) RSP00327
CATGCA
327. AC: RSP00327//OS: Brassica napus /GENE: napA/RE: RY /BF: ABI3
711 (+) RSP00438
GGCGGC
438. AC: RSP00438//OS: arabidopsis (Arabidopsis thaliana) /GENE: PR-1/RE: PR-box /BF: unknown nuclear factor
662 (+) RSP00477
TTTAA
477. AC: RSP00477//OS: barley (Hordeum vulgare), Brassica napus /GENE: rbcSF1/RE: S-box /BF: unknown nuclear factor
636 (+) RSP00483
GCCGC
482. AC: RSP00482//OS: maize (Zea mays) /GENE: Adh1/RE: GT-1 /BF: unknown nuclear factor
453 (+) RSP00512
cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc
530 (+) RSP00512
cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc
512. AC: RSP00512//OS: oat (Avena fatua) /GENE: alpha-Amy2/A/RE: Inr /BF: unknown nuclear factor
34
Data ini menunjukan bahwa urutan DNA mempunyai kemungkinan sebagai promotor setelah proses pencocokan motif DNA pada alat bioinformatika ini. Pemeriksaan
dilanjutkan
dengan
menggunakan
program
NSITE(hahmuradov et al 1986; Solovyev & Kolchanov 1994; Heinemeyer 1999). Pada hasil NSITE ditemukan kesamaan homologi regulatory element(RE) 80% dengan perbedaan pada RE bloks 20%. Ditemukan 10 motif yang sama pada pemeriksaan 1816 RE dengan 11 perbedaan RE bloks. Program
NSITE
(Softberry Inc.)
Search for motifs of
| Version 2.2004
1432 Regulatory Elements (REs)
| SET of
REs: REGSITE DB: Plant Transcription Regulatory Sites [Last Update: April 10, 2007] ____________________________________________________________ Search PARAMETRS: Expected
Mean
Number
Statistical Siginicance Level
:
0.0100000
:
0.9500000
Level of homology between known RE and motif:
80%
Variation of Distance between RE Blocks
20%
NOTE: RE - Regulatory Element/Consensus
:
| AC - Accession No of
RE in a given DB OS - Organism/Species
| BF - Binding Factor or One of
them Mism. - Mismatches Number
| Mean. Exp. Number - Mean Expected
| Up.Conf.Int. - Upper Confidence Interval
============================================================ QUERY: > test sequence Length of Query Sequence: Frequencies:
A -
0.30
809 bp
G -
0.20
| Nucleotide
T -
0.26
C -
0.23
............................................................ RE:
201. AC: RSP00201//OS: maize (Zea mays) /GENE: rab17/RE:
GRA /BF: unknown nuclear factor Motifs on "-" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 34
0.00935
Up.Conf.Int.
1
CACTGGCgGCCg
23 (Mism.= 2)
............................................................ RE:
397. AC: RSP00397//OS: tobacco (Nicotiana tabacum) /GENE:
RNP2/RE: CDE /BF: unknown nuclear factor
35
Motifs on "-" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 644
0.00910
Up.Conf.Int.
1
AGTGGCGG
637 (Mism.= 0)
............................................................ RE:
445. AC: RSP00445//OS: maize /GENE: cyPPDK1/RE: box e /BF:
DOF1 Motifs on "+" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 565
0.00234
Up.Conf.Int.
1
AAAAAAGAGA
574 (Mism.= 0)
............................................................ RE:
757. AC: RSP00757//OS: potato (Solanum tuberosum) /GENE:
S2-RNase/RE: motif I /BF: unknown transcription factor Motifs on "-" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 60
0.00250
Up.Conf.Int.
1
AGGAAgA
54
--15--
38
aTCACACT
31
(Mism.= 1/ 1) ............................................................ RE:
864. AC: RSP00864//OS: arabidopsis (Arabidopsis thaliana)
/GENE: STK/RE: GA-5 /BF: BPC1 Motifs on "+" Strand: Mean Exp. Number 1
Found
0.00335
Up.Conf.Int.
2
570
AGAGAGAGA
578 (Mism.= 0)
572
AGAGAGAGA
580 (Mism.= 0)
............................................................ RE:
1217. AC: RSP01209//OS: Lepidium africanum /GENE: LaCRC/RE:
EM1 (CArG box 1) /BF: MADS box proteins Motifs on "-" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 571
0.00212
Up.Conf.Int.
1
CTTTTTTTGG
562 (Mism.= 0)
............................................................ RE:
1291. AC: RSP01283//OS: OS: soybean (Glycine max) /GENE:
gsa1/RE: GAGA element /BF: unknown nuclear factor Motifs on "+" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 565
0.00096
Up.Conf.Int.
1
aAaAaAGAGAGAGAGAA
581 (Mism.= 3)
............................................................ RE:
1304. AC: RSP01296//OS: oat (Avena fatua) /GENE: Amy2/D/RE:
TATA box /BF: TBF
36
Motifs on "+" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 700
0.00868
Up.Conf.Int.
1
CTATAAATA
708 (Mism.= 0)
............................................................ RE:
1353. AC: RSP01345//OS: cucumber, Cucumis sativus /GENE:
ms/RE: IMH2 /BF: Unknown nuclear factor Motifs on "+" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 665
0.00419
Up.Conf.Int.
1
AAGCCCACCCT
675 (Mism.= 1)
............................................................ RE:
1355. AC: RSP01347//OS: cucumber, Cucumis sativus /GENE:
ICL/RE: IMH2 /BF: Unknown nuclear factor Motifs on "+" Strand: Mean Exp. Number 1
Found 665
0.00419
Up.Conf.Int.
1
AAGCCCACCCT
675 (Mism.= 2)
............................................................ Totally
11 motifs of
10 different REs have been found
------------------------------------------------------------
Pemeriksaan dengan software Neural Network Promoter Prediction (Reese & Eeckman1995; Reese et al 1996 ) menghasilkan data sebagai berikut : Promoter predictions for 1 eukaryotic sequence with score cutoff 0.80 (transcription start shown in larger font): Promoter predictions for seq0 : Start End
Score
268 318
0.98
510 560
0.92
691 741
1.00
Promoter Sequence AAAAAAAAAATTTAAAAAAAAAGGGAATCCGATCTTCCTCAACTATATAG AGCAAACGTTAAAAATAAAGGGATTTGACATCAGAGGCTCATAGCCCTCC TGAAAACGCCTATAAATATGGGCGGCACCCAAGCCTCTTTCCTCACAGCC
Dari data ini bisa diartikan pada skor 0,98 menunjukan 20% situs pengenalan promotor dengan 0,1 % tingkat kesalahan dan 0,38% koefisien korelasi. Skor 0,92 menunjukan 30% situs pengenalan promotor dengan 0,3 %
37
tingkat kesalahan dan 0,50% koefisien korelasi. Skor 1 menunjukan bahwa promotor 100% bukan berasal dari genome manusia. Artinya dari ketiga data penggunaan software untuk memprediksikan promotor diatas menunjukan bahwa DNA hasil purifikasi adalah promotor spesifik akar(PSA) kelapa sawit.
