Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Určení spolehlivosti mikrosatelitového panelu pro ověření původu a individuální identifikaci u psů Diplomová práce
Vedoucí práce: doc. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Brno 2008
Vypracovala: Bc. Marta Bryndová
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………................................................ vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne………………………………………. podpis diplomanta……………………….
Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala doc. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za ochotu a pomoc při tvorbě diplomové práce. Dále děkuji Mgr. Lence Putnové, Ph.D. za cenné rady při laboratorní práci a pracovníkům na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, kteří mi pomohli při řešení diplomové práce. V neposlední řadě děkuji také všem, kteří mi ochotně poskytli vzorky DNA svých čtyřnohých miláčků. Poděkování patří i mé rodině za podporu při studiu.
ABSTRAKT
Pro určení spolehlivosti panelu mikrosatelitů komerčního kitu firmy Applied Biosystems (FHC 2010, FHC 2054, FHC 2059, PEZ 1, PEZ 3, PEZ 5, PEZ 6, PEZ 8, PEZ 12 a PEZ 20) byl vybrán soubor 124 jedinců různých plemen (7 jezevčíků, 5 kníračů, 12 německých špiců, 4 šarplaninští pastevečtí psi, 6 rhodéských ridgebacků, 5 belgických ovčáků, 64 bernských salašnických psů, 8 českých fousků, 5 irských vlkodavů, 8 zlatých retrívrů). Polymorfní informační obsah (PIC) v populaci byl v rozmezí od 0 (FHC 2054 a FHC 2079 plemeno zlatý retrívr a PEZ 6 plemeno belgický ovčák) do 0,7786 (PEZ 1 plemeno jezevčík). Nejvyšší CEP byla spočítána pro plemeno jezevčík (0,9977, 0,9645, 0,9999), naopak nejnižší byl u plemene belgický ovčák (0,8607, 0,6135, 0,9619). Použitý panel mikrosatelitů lze považovat za spolehlivý pro ověření původu a individuální identifikaci u psů.
ABSTRACT 124 individuals of different breeds (number of 7 Dachshunds, 5 Schnauzers, 12 German Spitzs, 4 Yugoslavian Shepherd Dogs, 6 Rhodesian Ridgebacks, 5 Belgian Shepherds, 64 Bernese Mountain Dogs, 8 Czech fousek, 5 Irish Wolfhounds, 8 Golden Retrievers) were chosen for determination reliability microsatellites panel of commercial kit firm Applied Biosystems (FHC 2010, FHC 2054, FHC 2059, PEZ 1, PEZ 3, PEZ 5, PEZ 6, PEZ 8, PEZ 12 and PEZ 20). PIC in population ranged from 0 (FHC 2054 and FHC 2079 Golden Retriever and PEZ 6 Belgian Shepherd) to 0,7786 (PEZ 1 Dachshund). The highest CEP was quantified for Dachshund (0,9977, 0,9645, 0,9999), on the other hand the lowest CEP was for Belgian Shepherd (0,8607, 0,6135, 0,9619). Used microsatellite panel is supposed to be high reliable for parentage testing and individual identification of dogs.
OBSAH 1. Úvod.............................................................................................................................. 6 2. Cíl práce........................................................................................................................ 7 3. Literární přehled ........................................................................................................... 8 3.1 Původ a charakteristika plemen psů........................................................................ 8 3.1.1 Skupina 1: Plemena ovčácká, pastevecká a honácká (s výjimkou švýcarských salašnických psů) ................................................................................. 8 3.1.2 Skupina 2: Pinčové, knírači, plemena molossoidní a švýcarští salašničtí psi.. 9 3.1.3 Skupina 4: Jezevčíci....................................................................................... 11 3.1.4 Skupina 5: Špicové a tzv. primitivní plemena ............................................... 11 3.1.5 Skupina 6: Honiči, barváři a příbuzná plemena............................................. 12 3.1.6 Skupina 7: Ohaři ............................................................................................ 12 3.1.7 Skupina 8: Slídiči a retrívři ............................................................................ 14 3.1.8 Skupina 10: Chrti ........................................................................................... 14 3.2 Polymorfismus ...................................................................................................... 15 3.3 Genetické markery................................................................................................ 17 3.3.1 Charakteristika genetických markerů ............................................................ 17 3.3.2 Rozdělení genetických markerů..................................................................... 18 3.3.3 Přímé a nepřímé markery............................................................................... 18 3.4 Mikrosatelity......................................................................................................... 19 3.5 Ověřování rodičovství u psů ................................................................................. 20 3.5.1 Vývoj metod pro ověřování ........................................................................... 20 3.5.2 Praktické použití metod ................................................................................. 21 4. Materiál a metody zpracování..................................................................................... 22 4.1 Referenční skupina zvířat ..................................................................................... 22 4.2 Použité metody ..................................................................................................... 22 4.2.1 Izolace DNA .................................................................................................. 22 4.2.2 PCR................................................................................................................ 23 4.2.3 Fragmentační analýza .................................................................................... 23 4.3 Statistické vyhodnocení ........................................................................................ 24 4.3.1 Použité ukazatele ........................................................................................... 24 5. Výsledky práce a diskuse............................................................................................ 26 5.1 Výpočet statistických ukazatelů u jednotlivých plemen....................................... 26 5.1.1 Belgický ovčák .............................................................................................. 26 5.1.2 Knírač............................................................................................................. 27 5.1.3 Šarplaninský pastevecký pes ......................................................................... 28 5.1.4 Bernský salašnický pes .................................................................................. 29 5.1.5 Jezevčík.......................................................................................................... 30 5.1.6 Německý špic................................................................................................. 32 5.1.7 Rhodéský ridgeback....................................................................................... 33 5.1.8 Český fousek.................................................................................................. 34 5.1.9 Zlatý retrívr .................................................................................................... 35 5.1.10 Irský vlkodav ............................................................................................... 36 5.2 Výpočet statistických ukazatelů u celé populace.................................................. 38 6. Závěr ........................................................................................................................... 46 7. Seznam použité literatury ........................................................................................... 48
1. ÚVOD
Psi byli od nepaměti věrnými společníky člověka. Doprovázeli ho při lovu, pomáhali mu hlídat stáda, poskytovali mu přátelství. Od těch dob se mnohé změnilo, psi se využívají i k dalším aktivitám spojeným s lidskou činností, vyhledávání drog, zraněných, pomáhají nemocným při cannisterapii nebo handicapovaným. I z těchto důvodů byl často kladen důraz na hledání vhodných jedinců, kteří by odpovídali požadovaným kriteriím. Pro výběr takových jedinců je zapotřebí správná plemenitba a odpovídající chov se zárukou původu, který by měl být cílem všech poctivých chovatelů. V některých případech se ovšem můžeme setkat i s tím, že si nebudeme jisti, jaký má dané zvíře původ. Zde přichází na řadu použití některých metod ověření původu nebo rodičovství. V současnosti mezi nejběžnější metody patří ověřování pomocí DNA analýz resp. pomocí mikrosatelitů. Základem je poznatek, že genotyp jedince se nemění v průběhu celého jeho života, proto mohou být mikrosatelity použity jako nezaměnitelné genetické markery. V laboratořích se často používají komerčně dodávané kity, které usnadňují jak izolaci DNA, tak i vlastní mikrosatelitní analýzu v sekvenátoru. Tyto analýzy se řadí mezi zaběhnuté postupy a poskytují vysoké informační hodnoty a vysokou spolehlivost. I přesto je důležité určit vhodnost použití těchto genetických markerů u jednotlivých plemen psů a v konkrétních populacích.
6
2. CÍL PRÁCE
Hlavním cílem diplomové práce bylo: Zpracování literatury k metodám určování parentity a individuální identifikace zvířat Zpracování metodiky pro analýzu 10 mikrosatelitů pro určení parentity u psů Odběr vzorků a následná izolace DNA z krve resp. dalších tkání, laboratorní testování vzorků Výpočet frekvence alel a genotypů a skutečné heterozygotnosti u vlastních vzorků a vzorků z databáze LamGen Výpočet statistických hodnot: polymorfní informační obsah (PIC), teoretická heterozygotnost, pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče, je-li znám genotyp potomka a obou rodičů; pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče, je-li genotyp jednoho z rodičů neznámý a pravděpodobnost vyloučení obou rodičů, je-li znám genotyp potomka a obou rodičů Diskuze ke spolehlivosti využití uvedené metody a panelu mikrosatelitů, srovnání metod
7
3. LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Původ a charakteristika plemen psů 3.1.1 Skupina 1: Plemena ovčácká, pastevecká a honácká (s výjimkou švýcarských salašnických psů) Pastevečtí psi patří do starobylé kategorie, po mnohá staletí byli využíváni k dohledu na pohyb hospodářských zvířat. Nejvíce jsou používáni k pasení ovcí a skotu. Vývoj pasteveckých psů byl zpravidla lokálně omezen, což se odráží v různosti těchto plemen dodnes (ALDERTON, 1996). 3.1.1.1 Belgický ovčák (Chien de Berger Belge, Belgian Shepherd) Původ: Belgie Vznik
plemene:
kolem
roku
1200
(ALDERTON, 1996) V 19. století bylo v Belgii velké množství psů hlídajících stáda, jejichž typ i barva srsti se značně lišily (KCHBO, 2008). Chov belgického ovčáka začal náhodou asi v roce 1890. Nicholas Rose, majitel belgické kavárny, vyšlechtil černé štěně a opatřil si další, (Foto: ANONYM 1, 2008) vzniklý pár dal základ plemene. Tervuren byl vyvinut pod vedením profesora Reula na Belgické škole veterinárních věd v r. 1891. Obzvlášť blízká příbuznost tohoto plemene vyšla najevo, když se náhodně spářili dva belgičtí ovčáci a výsledkem bylo narození štěněte tervurena. To bylo v podstatě stejně jako u ostatních belgických pasteveckých psů (ALDERTON, 1996). Dne 3.dubna 1892 byl vydán první podrobný standard plemene Klubem belgického ovčáka. Tento standard definoval jedno plemeno se třemi možnými variantami srsti (KCHBO, 2008). Dnes plemeno belgický ovčák zahrnuje 4 plemena odlišující se zbarvením a délkou srsti: groenendael, laekenois, tervuren, malinois (ALDERTON, 1996).
8
3.1.2 Skupina 2: Pinčové, knírači, plemena molossoidní a švýcarští salašničtí psi 3.1.2.1 Knírač (Schnauzer) Původ: Německo Vznik plemene: kolem roku 1400 (ALDERTON, 1996) Předpokládá se, že trpasličí forma knírače vznikla křížením standardního knírače a opičího pinče. Nejnověji vyšlechtěný je velký knírač. Je pravděpodobné, že se vyvinul z drsnosrstého dobytkářského psa, který byl spářen s menším kníračem (ALDERTON, 1996). Původně byl špic používaný v regionu jižního Německa jako vyrovnaný pes zvláště zběhlý ve společnosti koní.
(Foto: FCI, 2006)
Byl horlivý při lovu hlodavců. Díky tomu brzy dostal přezdívku „Rattler” (lovec krys). Když byl v roce 1895 založen Klub pinčů a špiců, byl označen jako hrubosrstý pinč (FCI, 2006).
3.1.2.2 Šarplaninský ovčák (Yugoslavian Shepherd Dog, Sarplaninac) Původ: dřívější Jugoslávie Vznik
plemene:
kolem
roku
1200
(ALDERTON, 1996) Podle historických pramenů přišli pastevci do oblasti dnešní planiny Šar, odkud šarplaninec pochází, zhruba na rozhraní starého a nového věku, kdy migrovali z Asie do Evropy. S sebou měli přivést i velké pastevecké psy.
(Foto: FCI, 2006)
Za nejpůvodnější formu všech se proto považuje tibetská doga (SC, 2006). Plemeno se vyvíjelo v Illyrské oblasti, která představuje dnešní Bosnu a Albánii (ALDERTON, 1996). Vedle názvu šarplaninec se proto můžeme setkat i s názvem illyrijský ovčák. Původně byl registrován i v mezinárodní kynologické organizaci FCI pod tímto názvem. Teprve v roce 1956 se registroval standard šarplaninec podle nového názvu místa původu – planiny Šar mezi Makedonií a Černou horou. Podle horských oblastí, kde psi žili a pracovali pro člověka, se pak vyvíjela různá plemena. Vznikl pyrenejský pastevecký pes, kavkazský, pamirský, šarplaninský. Šarplaninec se ve své
9
domovině vyvíjel izolovaně dva tisíce let. Pro jeho odvahu a další vlastnosti se dnes používá ve své domovině jako služební pes (SC, 2006).
3.1.2.3 Bernský salašnický pes ( Bernese Mountain Dog) Země původu: Švýcarsko Vznik plemene: kolem roku 100 př. Kr. (ALDERTON, 1996) Je
možné,
že
křížení
mezi
domorodými švýcarskými psy salašnickými a hlídacími psy dovezenými do Švýcarska při invazi římských legií položilo prvotní základ
tohoto
plemene
(ALDERTON,
1996). Bernský salašnický pes je farmářský pes se starým původem, byl využíván jako jako hlídací,
(Foto: FCI, 2006)
honácký a tažný pes v předalpských oblastech a částech švýcarského středozemí v okolí Bernu. Původně byl nazýván „dürrbachský pes” (německy „Dürrbächler”) podle osady a hostince Dürrbach u Riggisbergu, kde se tento dlouhosrstý, tříbarevný pes vyskytoval.V letech 1902, 1904 a 1907 bylo několik nejlepších psů předvedeno na výstavách a v roce 1907 se několik chovatelů těchto psů z Burgdorfu rozhodlo chovat bernské salašnické psy jako čistou rasu a založili Švýcarský klub dürrbachských psů (FCI, 2006).
10
3.1.3 Skupina 4: Jezevčíci Patří mezi nejstarší a nejustálenější lovecká plemena. Můžeme tak usuzovat podle mnohých kreseb už z doby starověkého Egypta. Pes na kresbě, která velmi připomíná jezevčíka, je označený názvem „tekel”. Původ současné formy jezevčíka se odvozuje od nízkonohých honičů. V 18. a 19. století se jezevčíci formovali na kontinentu ve střední Evropě souběžně s formováním jezevčíků v Anglii. Svědčí o tom zejména hrubosrstá varianta, která tu byla vyšlechtěná vlivem teriérů (BAKOŠ, 1998). 3.1.3.1 Jezevčík drsnosrstý (Dachshund rauhhaar, Dackel, Teckel) Původ : Německo Vznik
plemene:
kolem
roku
1900
(ALDERTON, 1996) Vznikl jezevčíka
krátkosrstého
křížením s
teriéry,
zejména se skotským, s Dandie Dinmont a se sky teriérem (BAKOŠ, 1998).
(Foto: ANONYM 2, 2008)
Jezevčík (také nazývaný jako Dachshund, Dackel, Teckel) je znám od středověku. Neustálou plemenitbou byli šlechtěni z brakýřů psi vhodní především pro lov pod zemí. Z těchto krátkonohých psů se vyvinul i jezevčík, který je uznáván jako jedno z nejvšestrannějších lovecky upotřebitelných plemen. Po desetiletí se jezevčík chová ve třech různých velikostech a to jako jezevčík, jezevčík trpasličí a jezevčík králičí a ve třech různých druzích osrstění jako krátkosrstý, drsnosrstý a dlouhosrstý (FCI, 2006).
3.1.4 Skupina 5: Špicové a tzv. primitivní plemena 3.1.4.1 Německý špic (Deutscher Spitz) Původ : Německo Vznik plemene: kolem roku 1800 (ALDERTON, 1996) Němečtí
špicové
jsou
potomky
psa
rašelinného Canis Familiaris palustris Rüthimeyer z doby kamenné a pozdějšího špice Lake Dweller’s (Pfahlbau). Jsou nejstarším psím plemenem Střední Evropy (FCI, 2006).
(Foto: FCI, 2006)
11
Předkové těchto psů byli přivezeni do Holandska Vikingy (ALDERTON, 1996). Z německého špice se vyvinul velký počet dalších plemen. Mimo německy mluvící země je vlčí špic také nazýván Keeshond a trpasličí špic Pomeranian (FCI, 2006).
3.1.5 Skupina 6: Honiči, barváři a příbuzná plemena 3.1.5.1 Rhodéský ridgeback (Rhodesian Ridgeback) Původ: jižní Afrika Vznik
plemene:
kolem
roku
1800
(ALDERTON, 1996) Byl vyšlechtěn Búry na konci 19. století, jeho standard byl stanoven v Rhodezii (Zimbabwe) v roce 1922. V lovu na lvy byl proslulý pro svou velkou vytrvalost a překapující pohyblivost.
(Foto: ANONYM 3, 2008)
Předpokládá se, že unikátní hřeben chlupů (ridge) u tohoto plemene byl zděděn od dnes již vyhynulého hotentotského psa (ALDERTON, 1996). Psi Hotentotů byli používání k lovu i velké zvěře a v podstatě pracovali jako honiči. Podle stavby těla se zdá, že byli blízcí tzv. šensi (schensi) psům, které i dnes známe z různých především tropických oblastí světa. Z tropů Afriky jich známe ještě dnes několik, např. tošensi pes Zulů, šensi pes z Libérie, šensi pes z Kamerunu a
šensi pes Kafrů a Hotentotů.
V podstatě jsou šensi psi chováni čistokrevně a představují přírodní plemena. Na konci 19. století došlo ke křížení domácích afrických honičů Hotentotů s evropskými plemeny loveckých psů. Nejčastěji se hovoří o bloodhoundech, pointrech, německých ohařích, retrívrech, někdy se uvádějí i mastif, německá doga, chrti a teriéři (VIKTORIN, 1999).
3.1.6 Skupina 7: Ohaři Ohaři u nás patří mezi nejpoužívanější lovecké psy. Vyznačují se větším počtem plemen a odlišují se v osrstění, zbarvení a částečně i velikostí. Jejich typickou vlastností je hledání zvěře spojené s vystavováním (BAKOŠ, 1998).
12
3.1.6.1 Český fousek Původ: dříve Československo, nyní Česká republika Vznik
plemene:
kolem
roku
1800
(ALDERTON, 1996) Český
fousek
je
národním
původním plemenem psů České republiky. Jeho doložitelné dějiny sahají do ranného středověku,
kdy byl
nepostradatelnou
součástí šlechtických dvorů s právem lovu (FCI, 2006).
(Foto: ANONYM 4, 2007)
Prapředky tohoto psa můžeme najít již v období panování českého krále Karla IV. ve 14. století a později i podle historických dokladů v 16. století. Český fousek vznikl z hrubosrstého ohaře, který se postupně vyvinul v Čechách (BAKOŠ, 1998). V období před první světovou válkou byl český fousek nejrozšířenější ostnosrstý stavěcí pes na území dnešní České a Slovenské republiky. Světová válka měla za důsledek to, že český fousek ve dvacátých letech téměř zanikl. Proto se přistoupilo k oživení plemene. Základem se stalo několik původních a typických jedinců, z nichž se podařilo systematickou plemenitbou získat současného českého fouska (FCI, 2006).
13
3.1.7 Skupina 8: Slídiči a retrívři Obě plemena retrívrů (přinašečů), která u nás lovecky využíváme, jsou zařazená mezi slídiče. Byli vyšlechtěni v Anglii, i když každého z jejich předků přivezli do Anglie z jiného světadílu. Vyšlechtili je hlavně proto, že v 19. století měla Anglie vysoké stavy zvěře a při používání zdokonalených střelných zbraní se lovy vyznačovaly bohatými úlovky. Angličané se rozhodli vyšlechtit plemena specializovaná pouze na dohledávání a přinášení drobné zvěře (BAKOŠ, 1998). 3.1.7.1 Zlatý retrívr (Golden Retriever) Původ : Velká Británie Vznik
plemene:
kolem
roku
1800
(ALDERTON, 1996) Vznikl
z
Flat
Coated
retrivera
ruského původu a z malého hnědého vodního španěla, kterého později nazývali anglický retrívr (BAKOŠ, 1998). Toto plemeno
je
druhým
nejrozšířenějším
plemenem retrívrů v České republice.
(Foto: ANONYM 5, 2003)
Zlatý retrívr je plemeno poměrně mladé a o jeho přesném původu se stále diskutuje. V padesátých letech 19. století se o jeho rozvoj zasloužil lord Tweedmouth. Použil pravděpodobně žlutého retrívra s vlnitou srstí a dnes již neexistujícího tweed water španěla, později použil také irské setry a pískově zbarvené bloodhoundy. Výsledkem byl pes s vynikajícími povahovými vlastnostmi, vrozenou chutí k přinášení a s výborným čichem (KUBEŠ, 2000).
3.1.8 Skupina 10: Chrti 3.1.8.1 Irský vlkodav (Irish Wolfhound) Původ : Irsko Vznik
plemene:
kolem
roku
100
př.
Kr.
(ALDERTON, 1996) Jeho historie je starší než název země, která mu dala své jméno. Předpokládá se, že vlkodavové přišli do Irska s Kelty, kteří byli nejen vynikajícími chovateli dobytka, ale i psů (HOLKOVÁ, 2002). (Foto: ANONYM 5, 2003) 14
Jeho předek se objevuje před mnoha stoletími a vznikl ze starobylé linie královských psů (ALDERTON, 1996). Do různých částí Evropy bylo vyváženo tolik vlkodavů, že se stali vzácní i ve své domovině. Byli vyváženi do Anglie, Španělska, Dánska, Persie, Indie a Polska. Proto byl za vlády Cromwella roku 1652 vydán zákaz vývozu vlkodavů z Irska a Anglie (HOLKOVÁ, 2002). Vyhubení vlků v Irsku kolem roku 1800 vedlo téměř úplnému vymizení tohoto plemene. Bylo zachráněno pouze zásluhou skotského kapitána George Grahama (ALDERTON, 1996).
3.2 Polymorfismus Polymorfismus v genetice znamená výskyt více než dvou alternativních alelických variant určitého genu v populaci, přičemž udržení výskytu nejméně frekventované varianty v populaci nezávisí na opakované mutaci. Někdy bývá pro definici genetického polymorfismu stanovena hranice výskytu další genetické varianty v populaci ve frekvenci nad 1 % (DROSENOVÁ et ŘEHOUT, 2000). Uvedené vymezení pojmu genetický polymorfismus znamená, že sem nepatří znaky, kde má zřídkavá varianta frekvenci menší než 1% (tj. např. geneticky podmíněné choroby), dále znaky, jejichž variabilita není podmíněná geneticky (infekční choroby), znaky s kontinuální variabilitou (tělesná hmotnost, výška) a konečně znaky, kde se v rámci druhu vyskytují různé varianty, avšak v různých navzájem oddělených populacích (barva kůže aj.) (ANONYM 6, 2004 ). Genetický polymorfismus úzce souvisí s pojmem mnohočetný alelismus. To je případ, kdy gen má více forem tvořící alelickou sérii. Pokud není zaznamenána klasická podvojná forma genu tj. dialelismus, takový gen označujeme jako monomorfní (DROSENOVÁ et ŘEHOUT, 2000). Široký pojem genetického polymorfismu lze podle objektu studia členit do několika skupin na: 1. polymorfismus DNA Každá genetická variabilita má svůj podklad ve variabilitě na úrovni DNA. To platí pro každou variabilitu detekovatelnou na fenotypové úrovni, tedy i pro biochemický, imunologický a morfologický polymorfismus, pro bodové, chromosomální i genomové mutace (ANONYM 6, 2004 ). Prvotně lze polymorfismus pozorovat na úrovni DNA, kde se může projevit v molekulárním polymorfismu proteinů (záměna aminokyselin) (DROSENOVÁ et ŘEHOUT, 2000). Na úrovni DNA tedy existuje velké množství
15
polymorfismů, jejichž detekce je možná jen metodami molekulární genetiky (ANONYM 6, 2004 ). •
bodový polymorfismus
Tento typ je způsoben změnou v sekvenci bazí, nejčastěji bodovou mutací (většinou záměna nukleotidu nebo delece několika bazí) v určitém místě DNA. Bodový polymorfismus je označován jako SNP (single nucleotide polymorphism). •
repetitivní sekvence
Jako repetitivní se označují sekvence, které se v genomové DNA vyskytují v mnoha kopiích (například mikrosatelity) (ANONYM 6, 2004 ).
2.
polymorfismus biochemický a imunologický
Polymorfismus proteinů je odrazem změn v DNA. Podstatou polymorfismu proteinů je záměna aminokyseliny nebo vazba různých chemických postranních skupin (DROSENOVÁ et ŘEHOUT, 2000). Variabilita proteinů je dána změnami v jejich primární struktuře, počtem prostetických skupin, velikostí a celkovým uspořádáním molekuly, změnami ve velikosti elektrického náboje. Polymorfní proteiny u člověka a řady živočišných druhů byly zjištěny v séru, erytrocytech, spermiích, v semenné plazmě, mozkomíšním moku, játrech, mléce aj., vyskytují se také u rostlin. Polymorfismus proteinů lze využít k mapování genomu a konstrukci chromosomových map, k tomuto účelu se však v poslední době využívá více polymorfismu DNA. Lze jej využít při ověřování paternity (ANONYM 6, 2004 ). Mezi imunologické polymorfismy se řadí histokompatibilní antigeny (HLA), erytrocytární antigeny (systém AB0), Rh faktor, Lutheran (Lua, Luab), Lewis (Lea, Leb), Duffy (Fya, Fyb), Kell (K, k), Xg (Xga, Xg) (ANONYM 6, 2004 ).
3. polymorfismus morfologický (ANONYM 6, 2004 )
16
3.3 Genetické markery 3.3.1 Charakteristika genetických markerů Genetický marker může být jakýkoliv segment DNA, který lze identifikovat nebo jehož lokalizace na chromosomu je známá. Takže se může používat jako referenční bod při mapování či lokalizaci jiných genů. Může se jednat o gen, který má identifikovatelný fenotypový projev, jehož pomocí se dá zjistit přítomnost či absence jiných genů na stejném úseku DNA (ANONYM 7, 2006). Základní charakteristika molekulárně-genetických markerů: vyskytují se ve velkých počtech, jsou polymorfní vykazují mendelistickou kodominantní dědičnost jsou vysoce informativní a jednoznačně detekovatelné mohou být relativně snadno identifikovány z malého množství tkáně v libovolném věku jedince (na úrovni zárodečného vývoje nebo i zárodečných buněk a dokonce až po smrti jedince) (KNOLL et VYKOUKALOVÁ, 2002) markery pro znaky vyskytující se jen u jednoho pohlaví se dají zjistit i u druhého pohlaví (URBAN, 2006) DNA může být dlouhodobě uchována dají se exaktně testovat (KNOLL et VYKOUKALOVÁ, 2002) varianty jednoho markeru mají mezi sebou kodominantní vztah, tzn. dají se přesně určit jednotlivé genotypy i heterozygotní, které se ve fenotypu neprojeví na základě znalostí genotypů markerů se mohou záměrně vybírat rodiče, provádět plemenitba a tak cíleně produkovat jatečná zvířata s určitými, ekonomicky výhodnými genotypy (URBAN, 2006)
17
3.3.2 Rozdělení genetických markerů Genom savců zahrnuje 3 kategorie markerů: •
markery I. typu – jsou to kódující sekvence uvnitř genů, které se používají pro komparativní mapování a pro identifikaci genů u příbuzných druhů (přesněji u genů různých druhů, které pocházejí od společného předka). Následkem nízkého polymorfismu mají nízkou vypovídací hodnotu pro studium rodokmenů nebo populační diversity.
•
markery II. typu – představují nekódující hypervariabilní mikrosatelity také nazývané jako krátké tandemové repetice (STRs). Jsou vysoce informativní v rodokmenových, soudních, a populačních studiích, protože jsou nahodile rozptýleny v genomu savců v počtu skoro 100,000 a každý jednotlivý mikrosatelit je tvořen mnohočetnými alelami.
•
markery III. typu – jsou to běžné bialelické jednonukleotidové polymorfismy (SNPs, single nucleotid polymorphismus). Nacházejí se v kódujících regionech a nebo více často v nekódujících
intronech a
intergenových místech v DNA. SNPs se mohou použít i pro
studium
rodokmenů, rodin nebo variabilitu populací unitř druhů. Pro jejich detekci se používají techniky založené na automatickém array genotypování. SNP se vyskytují jednou za 500 až 1000 párů bází (bp) v lidském genomu, celkový počet se odhaduje na 3 miliony (O´BRIEN et al., 1999).
3.3.3 Přímé a nepřímé markery Existují dva základní typy genetických markerů: 1. Přímé markery nacházející se v sekvenci určitého genu, mají vliv na vznik určitého proteinu (projev znaku) (MONTALDO et MEZA-HERRERA, 1998). Jsou to tzv. kandidátní geny, které mohou být charakterizovány dvěma typy polymorfismů: •
Funkční markery (Funkcional marker), což je vlastní příčinná mutace (nalezená např. na základě komparativního mapování).
•
Přímé markery (Direct marker), což je polymorfismus DNA přímo v sekvenci genu. (URBAN, 2006)
18
2. Nepřímé markery, ty jsou ve vazbě na geny, které se nachází na stejném chromosomu v tzv. lokusu kvantitativního znaku (QTL). Několik studií demonstrovalo vztahy mezi molekulovými variantami a fenotypem několika znaků u různých živočišných druhů. Lze je zjistit RFLPs, mikrosatelity nebo dalšími podobnými molekulárními systémy. Nejznámější metodou je MAS (marker assisted selection) (MONTALDO et MEZA-HERRERA, 1998). Nepřímé markery je z hlediska praktického využití třeba rozdělit na dva typy: o
LD markery - markery které jsou s QTL ve vazbové nerovnováze (linkage disequilibrum markers) LE markery - markery, které jsou s QTL ve vazbové rovnováze (linkage
equilibrum markers) Z hlediska molekulární genetiky mohou být nepřímé genetické markery dvojího typu: mikroasatelity nebo SNPs (URBAN, 2006).
3.4 Mikrosatelity Mikrosatelity jsou krátké tandemové repetitivní jednoduché sekvence, které se hojně a namátkově vyskytují ve většině eukaryotních genomech (HEARNE et al.,1992). Mikrosatelitní sekvence, stejně jako minisatelity, patří do třídy polymorfismů nejčastěji nalezených v savčí DNA (ZAJC et al. ,1994). Jsou snadno klonovatelné, charakterizovatelné a rozpoznatelné, představují významné polymorfismy díky velké variabilitě opakovaných jednotek. Tento polymorfismus je využitelný v genetických analýzách (HEARNE et al.,1992). Krátké tandemové repetice, stejně jako nějaké minisatelitní sekvence, jsou potenciálně využitelné jako genetické markery, pro mapování psího genomu, a také pro určování otcovství a populační analýzu (ROTHUIZEN et al.,1994). Systém založený na testování mikrosatelitů je více určující než minisatelity (DNA fingerprint) a vyžaduje jen 0.1 ml krve (ZAJC et al. ,1994 ). Jsou to ideální markery k identifikaci míst souvisejích s běžnými genetickými nemocemi (HEARNE et al.,1992). V jaderném genomu eukaryotických organismů je vysoce roztroušená dinukleotidová repetitivní sekvence (GT)n, která má možná i funkční roli v genetické rekombinaci nebo modulaci transkripční aktivity (STALLINGS et al. ,1991). V psím genomu jsou zdaleka nejvíce časté sekvence (CA)n a (GT)n s vypočítanou průměrnou 19
vzdáleností mezi za sebou jdoucími místy 42 kb. Průměrná vzdálenost mezi místy tri nebo čtyř- nukleotidových opakování byla asi 330 kb. Mezilokusová vzdálenost byla 320 kb pro (GGC)n, 205 kb pro (GTG)n, 563 kb pro (AGG)n, 320 kb pro (TCG)n, 233 kb pro (TTA)n, 384 kb pro (CCTA)n, 368 kb pro (CTGT)n, 122 kb pro (TTCC)n, 565 kb pro (TCTA)n a 229 kb pro (TAGG)n (ROTHUIZEN et al.,1994). Francisco et al. (1996) identifikoval a charakterizoval třídu polymorfních markerů v psím genomu. Jedná se o tetranukleotidovou repetitivní sekvenci (GAAA)n. Genetické markery odvozené z tohoto opakování jsou vysoce polymorfní ve srovnání s dalšími psími mikrosatelity, vyskytují se s dostatečnou četností.
3.5 Ověřování rodičovství u psů 3.5.1 Vývoj metod pro ověřování První technologie používaná pro genetickou identifikaci a ověřování původu u zvířat byla založena na analýze krevních skupin. Imunologické metody pro skot a koně byly vyvinuty v 70. letech a ověřování původu postupně začalo být požadováno pro registraci zvířat. První metody založené na analýze DNA, jako bylo například RFLP (polymorfismus v délce restrikčního fragmentu), nemohly cenově konkurovat krevně skupinovému ověřování. Nicméně, irský Coursing Club, první chovný registr psů, zavedl DNA testování ve spoluprácí s laboratoří, která provedla (RFLP) s Jeffreyovým sondováním. Nedostatečná variabilita krevních skupin u psů a zároveň vysoká diskriminační hodnota DNA analýzy měla za následek širší použití této metody (ZAJC et SAMPSON, 1999). V roce 1989 byly poprvé v lidském genomu popsány mikrosatelity jako řetězec dinukleotidů opakujících se jedinečně v molekule DNA (WEBER et MAY, 1989). Tyto markery byly brzo použity pro genové mapování a byly popsány u dalších druhů zvířat. První studie se zaměřily především na koně a skot, první zpráva popisující psí mikrosatelity se objevila v roce 1993 (OSTRANDER et al, 1993). Ze začátku se objevily dohady, zda inbríding běžně používaný u hospodářských a domácích zvířat nebude redukovat variabilitu alel mikrosatelitů. Avšak s objevy dalších a dalších lokusů mikrosatelitů se zvyšuje i jejich polymorfní variabilita a diskriminace. Krevně skupinové techniky byly rychle nahrazeny DNA analýzami u většiny živočichů a staly se užitečným nástrojem pro ověřování původu nejen u zvířat, ale i u člověka (HALVERSON et BASTEN, 2005).
20
Současně s vývojem mikrosatelitních markerů se rozvinuly i další prostředky a reagencie potřebné pro jejich detekci. Rozšíření PCR (polymerázové řetězové reakce) a hlavně vývoj „hot start ” Taq polymerázy, která zredukovala stutter (koktání), umožnil použití multiplex PCR . Využití speciálních systémů fluorescenčních barev pro zvýšení množství informací získaných při průchodu vzorku gelovou kapilárou, stejně tak jako vývoj softwaru, přispělo k zavedení testování pomocí mikrosatelitů do běžné rutiny (HALVERSON et BASTEN, 2005).
3.5.2 Praktické použití metod Dnes je popsáno okolo 150 000 tzv. mikrosatelitových úseků DNA, kde se několikrát opakují dvě, tři nebo čtyři báze, které pak dávají nevypočitatelné množství kombinací. To znamená, že je již možné najít skutečné rodiče psa mezi desítkami tisíc jedinců (DOSTÁL, 2007). První tetranuklotidové mikrosatelity byly publikovány v roce 1996 (FRANCISCO et al., 1996). Od roku 1998 do roku 2001 American Kennel Club (AKC) provedl velkou studii s 9548 psy patřícími ke 107 plemenům a otestoval mikrosatelitní lokusy detekované pomocí komerčně dodávaného kitu Applied Biosystems (DENISE et al., 2004). Psí mikrosatelity mohou být adekvátně využity pro testy při ověřování otcovství (ZAJC et al.,1994). K ověření původu stačí i zbytek semene v pejetce, která byla použita ke konzervaci psího semene, z níž bylo semeno použito k inseminaci feny. V některých případech je možné použít i několik chlupů ze srsti psa, výtěr bukální sliznice, případně zbytky jakékoliv tkáně (DOSTÁL, 2007).
21
4. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ
4.1 Referenční skupina zvířat Pro pokus byl vybrán soubor zvířat, který obsahoval celkem 124 jedinců. Z toho 7 psů představovalo plemeno jezevčík (J), 5 kníračů (K), 12 německých špiců (NŠ), 4 šarplaninští pastevečtí psi (ŠP), 6 rhodéských ridgebacků (RR), 5 belgických ovčáků (BO), 64 bernských salašnických psů (BSP), 8 českých fousků ČF), 5 irských vlkodavů (IV), 8 zlatých retrívrů (ZR). Většina výsledků otestovaných vzorků byla získána z databáze LamGen Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně. 17 vzorků bylo získáno odběrem z bukální sliznice jedince, byla provedena izolace DNA a následně vlastní určení mikrosatelitů.
4.2 Použité metody 4.2.1 Izolace DNA Izolační kit: JETQUICK® blood and cell culture dna spin kit/50 cat.No.440050 Vzorek: Kartáček Cytobrush® Plus Cell collector - stěr z bukální sliznice Postup izolace: Kartáček se stěrem z bukální sliznice byl vyluhován v 200 µl PBS pufru. Bylo přidáno 20 µl GENOMED proteázy (20 mg/ml) a 200
µl pufru K1 a poté
provedeno zvortexování vzorku. Inkubace proběhla v termostatu 10 minut při 58°C. Dále bylo přidáno 200 µl etnolu a obsah byl
zvortexován. Získaný obsah byl
přepipetován do kolonky s 2 ml zkumavkou. Centrifuguce byla provedena 1 min při 10 000 rpm. Vzniklý obsah vylit a bylo přidáno 500 µl pufru KX,centrifugace 1 minutu při 10 000 rpm. Obsah zase vylit, bylo přidáno 500 µl pufru K2, centrifugugace 1 minutu při 10 000 rpm. Obsah vylit a ještě jednou centrifugugován při 13 000 rpm 1 minutu. Kolonka byla přesunuta do čisté 1,5 ml zkumavky, přidáno 200 µl 10 mM Tris - HCl pufru (pH 9),který byl nejprve inkubován při 70°C v termostatu. Inkubace 2 minuty při pokojové teplotě, poté centrifugace 2 minuty při 10 000 rpm. Vzniklé vzorky byly ověřeny elektroforeticky nanesením na 1 % gel. Vizualizace na gelu a elektroforéza: Gel byl připraven z 0,33 g agarózy, 30 ml TBE pufru povařením v mikrovlnné troubě. Ochlazen na 50 - 60°C a bylo přidáno 6 µl ethidium bromidu. Na gel bylo
22
naneseno 5 µl izolátu DNA s 1 µl nanášecího pufru. Elektroforéza proběhla při velikosti napětí 5V/cm (100 V) přibližně 30 minut. DNA byla uchována v mrazničce při teplotě - 20 °C.
4.2.2 PCR Název termálního cykleru: GeneAmp TM PCR System 9700 Složení reakční směsi: Multiplex PCR (pro jeden vzorek, celkový objem 5 µl) Tab. 1: Složení mastermixu Jednotlivé komponenty StockMarks PCR pufr
Master mix Objem (1 vzorek v µl) Objem (17 vzorků v µl) 0,695 12,51
25mM MgCl2 dNTP mix AmpliTag polymeráza Amplification primer mix deionizovaná voda Celkový objem (µl) DNA
0,18 1,1 0,18 1,4 0,945 4,5 0,5
3,24 19,8 25,2 3,24 17,01 81
Teplotní a časový průběh reakce: 1 cyklus iniciační denaturace 95°C 10 minut 20 cyklů ( denaturace 95°C 30 sec, annealing 58°C 30 sec, elongace 72°C 60 sec) závěrečná elongace 72°C 30 minut, 4°C ∞
4.2.3 Fragmentační analýza Název sekvenátoru: ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer Složení reakční směsi: 0,5 µl GeneScan - 500 ROX Size Standard 0,5 µl PCR produktu 11,5 µl formamidu
Postup: Před vložením do automatického sekvenátoru byly vzorky denaturovány při 95°C po dobu 2 minut a poté ochlazeny na ledu. Separace PCR fragmentů kapilární elektroforézou proběhla v polyakrylamidovém gelu za pomoci laserového scanování
23
fluorescenčně značených mikrosatelitů. Závěrečné vyhodnocení bylo provedeno softwarovými programy GeneScan ® 3.7 NT a Genotyper ® 3.7 NT software. Tab. 2: Fluorescenční barvy jednotlivývch mikrosatelitů Mikrosatelit Fluorescenční barva Barva PEZ 1 FAM modrá FHC 2054 FAM modrá FHC 2010 FAM modrá PEZ 5 JOE zelená PEZ 20 JOE zelená PEZ 12 JOE zelená PEZ 3 NED žlutá PEZ 6 NED žlutá PEZ 8 NED žlutá FHC 2079 NED žlutá (Zdroj: APPLIED BIOSYSTEMS, 2007)
4.3 Statistické vyhodnocení Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí programu EXEL zadáním vzorců pro výpočet polymorfního informačního obsahu, teoretické heterozygotnosti, pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče, je-li znám genotyp potomka a obou rodičů, pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče, je-li genotyp jednoho z rodičů neznámý, pravděpodobnosti vyloučení obou rodičů, je-li znám genotyp potomka a obou rodičů a kombinované pravděpodobnosti vyloučení (KNOLL, 2003).
4.3.1 Použité ukazatele Polymorfní informační obsah (Polymorphism information content) -vyjadřuje informativnost polymorfních markerů n −1
n
PIC = 1 − ∑ Pi 2 − ∑ i =1
n
∑ 2P P 2
i
i =1 j =i +1
2 j
2
k k PIC = 1 − ∑ x − ∑ xi2 + ∑ xi4 i =1 i =1 i =1 k
2 i
24
Teoretická (očekávaná) heterozygotnost (Theoretical heterozygosity) -pro každý mikrosatelitní lokus: k
h = 1 − ∑ xi2 i =1
xi – frekvence i-té alely Paternity exclusion -pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče, je-li znám genotyp potomka a obou rodičů 2
k k k k k k k PE (1) = 1 − 2∑ xi2 + ∑ xi3 + 2∑ xi4 − 3∑ xi5 − 2 ∑ xi2 + 3∑ xi2 ∑ xi3 i =1 i =1 i =1 i =1 i =1 i =1 i =1
One parental genotype unavailable -pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče, je-li genotyp jednoho z rodičů neznámý 2
k k k PE (2) = 1 − 4∑ x + 2 ∑ xi2 + 4∑ xi3 − 3∑ xi4 i =1 i =1 i =1 i =1 k
2 i
Parentage exclusion (exclude both parents) -pravděpodobnost vyloučení obou rodičů, je-li znám genotyp potomka a obou rodičů
2
k k k k PE (3) = 1 + 4∑ x − 4∑ x − 3∑ x − 8 ∑ xi2 + 8∑ xi2 ∑ xi3 + 2 ∑ xi3 i =1 i =1 i =1 i =1 i =1 i =1 i =1 k
k
4 i
k
5 i
6 i
Combined exclusion probability (CEP):
CEP = 1 − (1 − PE1 )(1 − PE2 )(1 − PE3 )...(1 − PEk )
25
2
5. VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE
5.1 Výpočet statistických ukazatelů u jednotlivých plemen 5.1.1 Belgický ovčák Počet jedinců: 5 Tab. 3: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene belgický ovčák Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 227, 231 147, 155, 163 289, 293 110, 114 123, 126, 132 102, 106 180 227, 235, 243 272, 296 175, 179
Počet alel 2 3 2 2 3 2 1 3 2 2
PIC tH PE1 PE2 PE3 0,1638 0,18 0,0819 0,0162 0,1439 0,4918 0,58 0,2885 0,1682 0,427 0,2688 0,32 0,1344 0,0512 0,2166 0,3648 0,48 0,1824 0,1152 0,2749 0,4992 0,56 0,3014 0,1568 0,4527 0,1638 0,18 0,0819 0,0162 0,1439 0 0 0 0 0 0,5478 0,62 0,336 0,1922 0,4859 0,3648 0,48 0,1824 0,1152 0,2749 0,2688 0,32 0,1344 0,0512 0,2166 0,3134 0,372 CEP 1 CEP2 CEP3 0,8607 0,6135 0,9619
U belgického ovčáka byl monomorfní mikrosatelit PEZ 6, všechny ostatní mikrosatelity byly polymorfní. Na lokusu FHC 2079 byla nalezena alela 293, která se nevyskytla u žádného dalšího pozorovaného plemene. Počet alel se pohyboval od 1 (PEZ 6, monomorfní lokus) do 3 (FHC 2054, PEZ 3 a PEZ 8). Frekvence alel byla v rozmezí od 0,1 (FHC 2010 alela 227, FHC 2054 alela 155, PEZ 5 alela 102) do 1 (PEZ 6 alela 180). Největší polymorfní obsah (PIC) vykazoval mikrosatelit PEZ 8 (0,5478), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,62. Průměrný polymorfní obsah byl 0,3134. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 86,07 % (pro PE 1), 61,35 % (pro PE 2), 96,19 % (pro PE 3).
26
Tab. 4: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene belgický ovčák Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 1 0 0,8 0,2 0,4 0,6 0,8 0,2 0,4 0,6 0,2 0,8 0 1 0,8 0,2 0,2 0,8 0,4 0,6 0,58 0,42
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazovaly lokusy FHC 2054, PEZ 1, PEZ 8, PEZ 12 a to 0,8. Naopak nejnižší nulová pozorovaná heterozygotnost byla na lokusu PEZ 6. Průměrná pozorovaná heterozygotnost byla 0,58, průměrná pozorovaná homozygotnost 0,42.
5.1.2 Knírač Počet jedinců: 5 Tab. 5: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene knírač Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 227, 231, 235 151, 155 269, 273 114, 118, 122, 126 93, 117, 123, 132 106, 110 176, 184, 188 227, 235, 239 260, 268, 280 175, 179
Počet alel 3 2 2 4 4 2 3 3 3 2
PIC tH PE1 0,5478 0,62 0,336 0,1638 0,18 0,0819 0,1638 0,18 0,0819 0,45 0,48 0,2815 0,672 0,72 0,4723 0,2859 0,3457 0,143 0,5862 0,66 0,3655 0,4918 0,58 0,2885 0,4992 0,56 0,3014 0,3648 0,48 0,1824 0,4225 0,4806 CEP 1 0,9531
PE2 0,1922 0,0162 0,0162 0,1236 0,2976 0,0597 0,2178 0,1682 0,1568 0,1152
PE3 0,4859 0,1439 0,1439 0,4518 0,6493 0,2273 0,5141 0,427 0,4527 0,2749
CEP2 CEP3 0,7803 0,9938
U knírače byly všechny mikrosatelity polymorfní. Počet alel se pohyboval v rozmezí od 2 do 4. 4 alely se vyskytly na lokusu PEZ 1 a PEZ 3. Frekvence alel se pohybovala od 0,1 (FHC 2054 alela 151, FHC 2079 alela 269, PEZ 1 alely 114, 122, 126, PEZ 8 alela 239) do 0,9 (FHC 2054 alela 155, FHC 2079 alela 273). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit PEZ 3 (0,672), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,72. Průměrný polymorfní obsah byl 0,4225. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 95,31 % (pro PE 1), 78,03 % (pro PE 2), 99,38 % (pro PE 3).
27
Tab. 6: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene knírač Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,8 0,2 0,8 0,2 0,2 0,8 0,6 0,4 1 0 0,4 0,6 0,8 0,2 0,8 0,2 0,8 0,2 0,2 0,8 0,66 0,34
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazoval lokus PEZ 3 s hodnotou 1. Naopak nejnižší pozorovaná heterozygotnost byla na lokusech FHC 2054 a FHC 2079 (0,2). Průměrná pozorovaná heterozygotnost byla 0,66, průměrná pozorovaná homozygotnost 0,34.
5.1.3 Šarplaninský pastevecký pes Počet jedinců: 4 Tab. 7: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene šarplaninský pastevecký pes Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 227, 231, 235 151, 167 269, 273 110, 118, 122 105, 120, 126, 135 102, 106, 110 172, 176, 180, 184, 188 223, 231, 235 264, 276, 280, 288, 296 175, 179, 183
Počet alel 3 2 2 3 4 3 5 3 5 3
PIC 0,4683 0,3047 0,3047 0,5815 0,6675 0,5112 0,7119 0,4683 0,7456 0,5547 0,5318
tH 0,5313 0,375 0,375 0,6563 0,7188 0,5938 0,75 0,5313 0,7813 0,625 0,5938
PE1 0,2772 0,1523 0,1523 0,3616 0,4652 0,3051 0,5283 0,2772 0,5663 0,3418
PE2 0,1411 0,0703 0,0703 0,2153 0,2935 0,1763 0,3486 0,1411 0,3872 0,1953
PE3 0,4225 0,2388 0,2388 0,5102 0,6392 0,4483 0,7141 0,4225 0,7459 0,4927
CEP 1 CEP2 CEP3 0,988 0,9065 0,9993
U šarplaninského pasteveckého psa byly všechny mikrosatelity polymorfní. Na lokusu PEZ 3 byla nalezena alela 105 a na lokusu PEZ 12 alela 288, které se nevyskytly u žádného dalšího pozorovaného plemene. Počet alel se pohyboval od 2 do 5. Nejvyšší počet alel se vyskytl na lokusech PEZ 6 a PEZ 12. Frekvence alel se pohybovala v rozmezí od 0,125 (FHC 2010 alela 231, PEZ 3 alela 120, PEZ 5 alela 110, PEZ 6 alely 172, 184 a 188, PEZ 8 alela 223, PEZ 12 alela 264 a 296) do 0,75 (FHC 2054 alela 151, FHC 2079 alela 273). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit PEZ 12 (0,7456), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,7813. Průměrný polymorfní obsah byl 0,5318.
28
Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 98,8 % (pro PE 1), 90,65 % (pro PE 2) , 99,93 % (pro PE 3).
Tab. 8: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene šarplaninský pastevecký pes Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,75 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 1 0 1 0 0,75 0,25 0,25 0,75 0,75 0,25 1 0 0,75 0,25 0,775 0,225
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazovaly lokusy PEZ 1, PEZ 3, PEZ 12 a to 1. Naopak nejnižší pozorovaná heterozygotnost byla na lokusech FHC 2054 a FHC 2079 (0,5). Průměrná pozorovaná heterozygotnost byla 0,775, průměrná pozorovaná homozygotnost 0,225.
5.1.4 Bernský salašnický pes Počet jedinců: 64 Tab. 9: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene bernský salašnický pes Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 223, 227, 231, 235 151, 155, 159, 163, 167 269, 273, 277 114, 118, 122, 126 93, 120, 123, 126, 129, 132, 135 102, 106, 110, 114 172, 180, 182, 184, 188, 192, 196 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247 204, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 296, 300 167, 175, 176, 183
Počet alel 4 5 3 4 7 4 7 7
PIC 0,4134 0,5912 0,3527 0,5162 0,5595 0,4049 0,6128 0,7096
tH 0,4428 0,6526 0,3859 0,5653 0,604 0,4396 0,6602 0,75
PE1 0,2521 0,3886 0,2014 0,3258 0,3742 0,2428 0,4234 0,5237
9 0,6353 0,666 0,458 4 0,4132 0,4642 0,2418 0,5209 0,5631 CEP1 0,9868
PE2 0,1035 0,231 0,0744 0,1686 0,2074 0,101 0,2535 0,346
0,2739 0,6632 0,1104 0,3858 CEP2 CEP3 0,8808 0,9995
U bernského salašnického psa byly všechny mikrosatelity polymorfní. Na lokusu PEZ 6 (alela 196), PEZ 8 (alela 247), PEZ 12 (alely 204 a 300) a PEZ 20 (alela 167) byly nalezeny alely, které se nevyskytly u žádného dalšího pozorovaného plemene. Počet alel na jednotlivých lokusech byl v rozmezí 3 až 9. Nejvyšší počet alel se vyskytl
29
PE3 0,4115 0,5582 0,3326 0,4938 0,5603 0,3948 0,6111 0,7071
na lokusu PEZ 12. Frekvence alel se pohyboval v rozmezí od 0,008 (PEZ 6 alela 172, PEZ 8 alela 243, PEZ 12 alely 204 a 272) do 0,766 (FHC 2079 alela 269). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit PEZ 8 (0,7096), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,75. Průměrný polymorfní obsah byl 0,5209. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 98,68 % (pro PE 1), 88,08 % (pro PE 2), 99,95 % (pro PE 3).
Tab. 10: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene bernský salašnický pes Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,429 0,571 0,719 0,281 0,391 0,609 0,547 0,453 0,484 0,516 0,5 0,5 0,594 0,406 0,641 0,359 0,609 0,391 0,359 0,641 0,527 0,473
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazoval lokus FHC
2054
(0,7187).
Naopak
nejnižší
pozorovaná
heterozygotnost byla na lokusu PEZ 20 (0,3594). Průměrná
pozorovaná
heterozygotnost
byla
0,527,
průměrná pozorovaná homozygotnost 0,473.
5.1.5 Jezevčík Počet jedinců: 7 Tab. 11: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene jezevčík Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 227, 231, 235 151, 155, 159, 163, 167, 171 269, 273, 277 106, 110, 114, 118, 122, 126 117, 120, 123, 129 102, 110 176, 180, 184, 188 227, 231, 235, 239 264, 268, 272, 273, 275, 276 155, 163, 171, 175, 179, 183
Počet alel 3 6 3 6 4 2 4 4 6 6
PIC tHe PE1 PE2 PE3 0,4275 0,5 0,2433 0,125 0,3746 0,7444 0,7755 0,5733 0,3929 0,7607 0,5674 0,6429 0,3505 0,2066 0,4992 0,7786 0,8061 0,6164 0,4386 0,7965 0,5474 0,6224 0,3454 0,205 0,5046 0,375 0,5 0,1875 0,125 0,2813 0,5407 0,6122 0,3408 0,1984 0,5011 0,6414 0,6939 0,4403 0,2707 0,6165 0,7444 0,7755 0,5733 0,3929 0,7607 0,7444 0,7755 0,5733 0,3929 0,7607 0,6111 0,6704 CEP 1 CEP2 CEP3 0,9971 0,9645 0,9999
U jezevčíka byly všechny mikrosatelity polymorfní. Na lokusech PEZ 1 (alela 106), PEZ 12 (alely 273 a 275) a PEZ 20 (alely 155 a 163) byly nalezeny alely, které se nevyskytovaly u žádného dalšího pozorovaného plemene. Na jednotlivých lokusech se 30
vyskytovaly alely v rozmezí od 2 do 6. Nejčetnější byly na lokusech FHC 2054, PEZ 1, PEZ 12, PEZ 20. Frekvence alel se pohybovala v rozmezí od 0,071 (FHC 2010 alela 213, FHC 2054 alely 167 a 171, PEZ 1 alela 114, PEZ 3 alely 123 a 129, PEZ 6 alely 176 a 188, PEZ 12 alely 273 a 275, PEZ 20 alely 155 a 163) do 0,643 (FHC 2010 alela 235). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit PEZ 1 (0,7786), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,8061. Průměrný polymorfní obsah byl 0,6111. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 99,71 % (pro PE 1), 96,45 % (pro PE 2), 99,99 % (pro PE 3).
Tab. 12: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene jezevčík Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,1429 0,8571 1 0 0,4286 0,5714 0 1 0,4286 0,5714 0,1429 0,8571 0,8571 0,1429 0,4286 0,5714 0,8571 0,1429 0,7143 0,2857 0,6143 0,3857
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazovaly lokusy FHC 2054, PEZ 1 a to 1. Naopak nejnižší pozorovaná heterozygotnost byla na lokusech FHC PEZ 5 (0,1429). Průměrná pozorovaná
2010 a
heterozygotnost byla 0,6143, průměrná pozorovaná homozygotnost 0,3857.
31
5.1.6 Německý špic Počet jedinců: 12 Tab. 13: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene německý špic Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 223,227,231,235,239 147,151,155,167,175 269,273,277 110,114,118,122,126,130 120,123,126,132,135 102,110,114 164,176,180,184 223,227,231,235,239 260,268,272,276 171,175,179,187
Počet alel PIC tHe PE1 5 0,6053 0,6563 0,4088 5 0,7024 0,7438 0,5148 3 0,5815 0,6563 0,3616 6 0,7502 0,7813 0,5806 5 0,6647 0,7118 0,4698 3 0,4917 0,552 0,2958 4 0,6665 0,7188 0,4638 5 0,6668 0,7153 0,4727 4 0,4664 0,5451 0,2751 4 0,5994 0,6528 0,3995 0,6195 0,6734 CEP1 0,9965
PE2 0,2414 0,3373 0,2153 0,4011 0,296 0,1523 0,293 0,3004 0,1526 0,2339
PE3 0,5885 0,6933 0,5102 0,7667 0,6513 0,4464 0,6372 0,6542 0,4171 0,5749
CEP2 CEP3 0,9547 0,9999
U německého špice všechny mikrosatelity polymorfní. Alely na jednotlivých lokusech se pohybovaly v rozmezí 3 až 6. Nejpočetnější alely (celkem 6) byly na lokusu PEZ 1. Frekvence jednotlivých alel byla pozorována v rozmezí od 0,042 (FHC 2010 alely 223 a 231, PEZ 3 alela 120, PEZ 8 alela 239, PEZ 12 alely 260 a 268). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit PEZ 1 (0,7502), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,7813. Průměrný polymorfní obsah byl 0,6195. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 99,65 % (pro PE 1), 95,47 % (pro PE 2), 99,99 % (pro PE 3).
Tab. 14: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene německý špic Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,5 0,5 0,917 0,083 0,25 0,75 1 0 0,75 0,25 0,833 0,167 0,667 0,333 0,75 0,25 0,333 0,667 0,583 0,457 0,658 0,342
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazoval lokus PEZ 1 s hodnotou 1. Naopak nejnižší pozorovaná heterozygotnost byla na lokusu Průměrná průměrná
pozorovaná pozorovaná
32
FHC 2079 (0,25).
heterozygotnost
byla
homozygotnost
0,658, 0,342.
5.1.7 Rhodéský ridgeback Počet jedinců: 6 Tab. 15: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene rhodéský ridgeback Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 227, 231, 235 147, 151, 155, 171, 175 269, 273, 277 114, 118, 122 120, 123, 135, 138, 141 102, 106, 110 172, 176, 180, 184 223, 227, 231, 235, 239 256, 264, 272, 276 175, 179
Počet alel PIC 3 0,5045 5 0,699 3 0,5045 3 0,5511 5 0,5766 3 0,5355 4 0,476 5 0,7078 4 0,3929 2 0,3047 0,5253
tHe PE1 0,5694 0,3044 0,7361 0,5146 0,5694 0,3044 0,6281 0,3374 0,6111 0,394 0,6111 0,3256 0,5139 0,2991 0,75 0,5188 0,4167 0,2389 0,375 0,1523 0,5781 CEP 1 0,9862
PE2 PE3 0,1621 0,4544 0,3334 0,7036 0,1621 0,4544 0,1973 0,4854 0,2162 0,5892 0,1867 0,4736 0,1413 0,4697 0,342 0,6997 0,092 0,3965 0,0703 0,2388 CEP2 CEP3 0,8858 0,9993
U rhodéského ridgebacka byly všechny mikrosatelity polymorfní . Na lokusu FHC 2079 byla nalezena alela 293, která se nevyskytla u žádného dalšího pozorovaného plemene. Počet alel na jednotlivých lokusech se pohyboval od 2 do 5. Nejčetnější alely se vyskytly na lokusech FHC 2054, PEZ 3, PEZ 8. Frekvence alel byly pozorovány v rozmezí 0,083 (FHC 2054 alela 155, PEZ 3 alely 135, 138 a 141, PEZ 6 alela 184, PEZ 8 alely 235 a 239, PEZ 12 alely 256, 264 a 272) do 0,750 (PEZ 12 alela 276, PEZ 20 alela 175). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit PEZ 8 (0,5478), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,62. Průměrný polymorfní obsah byl 0,5253. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 86,07 % (pro PE 1), 61,35 % (pro PE 2), 96,19 % (pro PE 3).
33
Tab. 16: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene rhodéský ridgeback Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,6667 0,3333 0,8333 0,1667 0,5 0,5 0,8333 0,1667 0,6667 0,3333 0,5 0,5 0,5 0,5 0,1667 0,8333 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6333 0,3667
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazovaly lokusy FHC 2054, PEZ 1, PEZ 8 (0,8333). Naopak nejnižší pozorovaná heterozygotnost byla na lokusech FHC 2079, PEZ5, PEZ 6, PEZ 12, PEZ 20 (0,5). Průměrná pozorovaná heterozygotnost byla 0,6333, průměrná pozorovaná homozygotnost 0,3667.
5.1.8 Český fousek Počet jedinců: 8 Tab. 17: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene český fousek Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 223, 227, 231, 235 155, 159, 163, 171 269, 273, 277, 289 110, 114, 130 123, 126, 129, 144 102, 106 172, 180, 184, 192 223, 227, 239, 243 264, 272 175, 179
Počet alel PIC tHe 4 0,5098 0,5781 4 0,6943 0,7422 4 0,5925 0,6484 3 0,4465 0,5391 4 0,5925 0,6484 2 0,3047 0,375 4 0,5815 0,6484 4 0,6445 0,6953 2 0,3589 0,4688 2 0,3589 0,4688 0,5084 0,5813
PE1 0,3152 0,4943 0,3906 0,2521 0,3906 0,1523 0,3775 0,4437 0,1794 0,1794
PE2 PE3 0,1754 0,4726 0,3194 0,6679 0,2278 0,5625 0,1453 0,38 0,2278 0,5625 0,0703 0,2388 0,2256 0,5431 0,2725 0,6208 0,1099 0,2713 0,1099 0,2713
CEP 1 CEP2 0,981 0,8813
CEP3 0,9985
U českého fouska byly všechny mikrosatelity polymorfní. Na lokusu PEZ 3 byla nalezena alela 144, která se nevyskytla u žádného dalšího pozorovaného plemene. Počet alel se na jednotlivých lokusech pohyboval od 2 do 4. Tento nejvyšší počet se vyskytl na lokusech FHC 2010, FHC 2054, FHC 2079, PEZ 3, PEZ 6 a PEZ 8. Frekvence alel se pohybovala od 0,063 (FHC 2010 alely 227 a 231, FHC 2079 alela 277,PEZ 1 alela 130, PEZ 3 alela 126, PEZ 6 alela 184) do 0,75 (PEZ 5 alela 102). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit FHC 2054 (0,6943), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,7422. Průměrný polymorfní obsah byl
34
0,5084. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 98,1 % (pro PE 1), 88,13 % (pro PE 2), 99,85 %.(pro PE 3).
Tab. 18: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene český fousek Lokus FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,75 0,25 0,875 0,125 0,875 0,125 0,875 0,125 0,25 0,75 0,5 0,5 0,875 0,125 0,25 0,75 0,25 0,75 0,75 0,25 0,725 0,275
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazovaly lokusy FHC 2054, FHC 2079, PEZ 1, PEZ 6 a to 0,875. Naopak nejnižší pozorovaná heterozygotnost byla na lokusu PEZ 12 (0,25). Průměrná pozorovaná heterozygotnost byla 0,725, průměrná pozorovaná homozygotnost 0,275.
5.1.9 Zlatý retrívr Počet jedinců: 8 Tab. 19: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene zlatý retrívr Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 231, 235 167 273 114, 118 123, 120 102, 110 176, 180, 184 223, 235 264, 268, 272, 276, 284 175, 179
Počet alel PIC tHe PE1 PE2 PE3 2 0,375 0,5 0,1875 0,125 0,2813 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 2 0,3374 0,4297 0,1687 0,0923 0,2584 2 0,3457 0,4444 0,1728 0,0988 0,2634 2 0,3374 0,4297 0,1687 0,0923 0,2584 3 0,5901 0,6641 0,3684 0,2205 0,5168 2 0,375 0,5 0,1875 0,125 0,2813 5 0,7081 0,75 0,5197 0,3426 0,7011 2 0,2583 0,3047 0,1291 0,0464 0,2099 0,3327 0,4023 CEP 1 CEP2 CEP3 0,9003 0,7222 0,9761
U zlatého retrívra byl monomorfní mikrosatelit FHC 2054 a FHC 2079, všechny ostatní mikrosatelity byly polymorfní. Na lokusu PEZ 12 byla nalezena alela 284, která se nevyskytla u žádného dalšího pozorovaného plemene. Počet alel byl v rozmezí
35
1 až 5. 5 alel se vyskytlo na lokusu PEZ 12. Frekvence alel se pohybovala v rozmezí od 0,063 (PEZ 12 alela 264) do 1 (FHC 2054 alela 167, FHC 2079 alela 273). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit PEZ 12 (0,7081), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,75. Průměrný polymorfní obsah byl 0,3327. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 90,03 % (pro PE 1), 72,22 % (pro PE 2), 97,61 % (pro PE 3).
Tab. 20: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene zlatý retrívr Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,75 0,25 0 1 1 0 0,625 0,375 0,5 0,5 0,625 0,375 1 0 0,75 0,25 0,875 0,125 0,375 0,625 0,55 0,45
Nejvyšší
pozorovanou
heterozygotnost
vykazoval
lokus PEZ 6 (1). Naopak nejnižší nulová pozorovaná heterozygotnost byla na lokusech FHC 2054 a FHC 2079. Průměrná pozorovaná heterozygotnost byla 0,55, průměrná pozorovaná homozygotnost 0,45.
5.1.10 Irský vlkodav Počet jedinců: 5 Tab. 21: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene irský vlkodav Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr CEP
Alely 227, 231 155, 159, 171 273, 277 110, 114, 118 120, 123, 132, 135, 138, 141 102, 106 180, 184, 188 227, 231, 235, 268, 272, 276 175, 179
Počet alel PIC tHe 0,42 2 0,3318 3 0,4992 0,56 2 0,1638 0,18 3 0,4992 0,56 6 0,7482 0,78 2 0,3318 0,42 3 0,3142 0,34 3 0,4992 0,56 3 0,5478 0,62 2 0,375 0,5 0,431 0,494
PE1 PE2 0,1659 0,0882 0,3014 0,1568 0,0819 0,0162 0,3014 0,1568 0,578 0,399 0,1659 0,0882 0,177 0,0578 0,3014 0,1568 0,336 0,1922 0,1875 0,125
PE3 0,2551 0,4527 0,1439 0,4527 0,764 0,2551 0,2995 0,4527 0,4859 0,2813
CEP 1 CEP2 CEP3 0,9592 0,8037 0,9952
U irského vlkodava byly všechny mikrosatelity polymorfní. Počet alel se pohyboval v rozmezí 2 až 6. Nejvyšší počet (6) se vyskytl na lokusu PEZ 3. Frekvence
36
alel byla pozorována v rozmezí od 0,1 (FHC 2079 alela 277, PEZ 3 alely 123, 132, 135 a 138, PEZ 6 alely 180 a 188) do 0,9 (FHC 2079 alela 273). Největší polymorfní obsah vykazoval mikrosatelit PEZ 3 (0,7482), stejně tak i nejvyšší teoretickou heterozygotnost 0,78. Průměrný polymorfní obsah byl 0,431. Kombinovaná pravděpodobnost vyloučení (CEP) byla 95,92 % (pro PE 1), 80,37 % (pro PE 2), 99,52 % (pro PE 3).
Tab. 22 : Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene irský vlkodav Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ12 PEZ 20 Průměr
pHe pHo 0,6 0,6 0,2 0,6 0,8 0,6 0,4 0,6 0,6 1 0,6
0,4 0,4 0,8 0,4 0,2 0,4 0,6 0,4 0,4 0 0,4
Nejvyšší pozorovanou heterozygotnost vykazoval lokus PEZ 20 a to 1. Naopak nejnižší pozorovaná heterozygotnost byla na lokusu FHC 2079 (0,2). Průměrná
pozorovaná
heterozygotnost
průměrná pozorovaná homozygotnost 0,4.
37
byla
0,6,
5.2 Výpočet statistických ukazatelů u celé populace Počet alel Tab. 23: Absolutní četnosti alel mikrosatelitů u všech plemen a v celé populaci Lokus/MS FHC 2010 FHC 2054 FHC 2079 PEZ 1 PEZ 3 PEZ 5 PEZ 6 PEZ 8 PEZ 12 PEZ 20
J 3 6 3 6 4 2 4 4 6 6
NŠ K ŠP RR BO BSP ČF IV ZR Součet alel 5 3 3 3 2 4 4 2 2 5 5 2 2 5 3 5 4 3 1 8 3 2 2 3 2 3 4 2 1 5 6 4 3 3 2 4 3 3 2 7 5 4 4 5 3 7 4 6 2 12 3 2 3 3 2 4 2 2 2 4 4 3 5 4 1 7 4 3 3 9 5 3 3 5 3 7 4 3 2 7 4 3 5 4 2 9 2 3 5 14 4 2 3 2 2 4 2 2 2 8
Tab. 24: Počty alel mikrosatelitů u všech zkoumaných plemen Lokus/MS Počet alel 6 FHC 2010 12 FHC 2054 10 FHC 2079 10 PEZ 1 17 PEZ 3 7 PEZ 5 22 PEZ 6 14 PEZ 8 24 PEZ 12 10 PEZ 20
(Zdroj: DeNISE et al., 2004) V porovnání s výsledky studie (DeNISE et al., 2004) byly počty alel všech plemen u jednotlivých lokusů nižší. U lokusu FHC 2010 se počet všech detekovaných alel lišil pouze o 1 alelu , u lokusu FHC 2054 o 4 alely, u lokusu FHC 2079 a PEZ 3 o 5 alel, u lokusu PEZ 1 a PEZ 5 se alely lišily o 3. Nejvyšší rozdíl byl u lokusu PEZ 6, kde DeNISE et al. (2004) detekoval o 13 alel více.U PEZ 8 se alely lišily o 7, u PEZ 12 o 10 a u PEZ 20 o 2.
38
Frekvence alel Tab. 25: Frekvence alel všech plemen u lokusu FHC 2010 Lokus/MS Alely 223 FHC 2010 227 231 235 239
J
K
0,286 0,071 0,643
NŠ ŠP RR BO 0,042 0,3 0,5 0,625 0,583 0,1 0,5 0,042 0,125 0,167 0,9 0,2 0,25 0,25 0,25 0,167
BSP 0,128 0,728 0,056 0,088
ČF IV ZR 0,313 0,063 0,7 0,063 0,3 0,5 0,563 0,5
Na lokusu FHC 2010 byla nejfrekventovanější alela 231 u belgického ovčáka s frekvencí 0,9. Naopak nejméně frekventované (0,042) byly alely 223 a 231 u německého špice.
Tab. 26: Frekvence alel všech plemen u lokusu FHC 2054 Lokus/MS Alely 147 FHC 2054 151 155 159 163 167 171 175
J 0,143 0,143 0,357 0,214 0,071 0,071
K
NŠ ŠP 0,182 0,1 0,364 0,75 0,9 0,91
0,273 0,091
RR BO BSP ČF IV ZR 0,167 0,5 0,167 0,32 0,083 0,1 0,469 0,25 0,6 0,2 0,008 0,313 0,4 0,148 0,188 0,25 0,055 1 0,167 0,25 0,2 0,417
Na lokusu 2054 se s frekvencí 1 vyskytovala alela 167 (zlatý retrívr). Nejnižší frekvenci vykazovala alela 159 u bernského salašnického psa a to 0,008.
Tab. 27: Frekvence alel všech plemen u lokusu FHC 2079 Lokus/MS Alely J K NŠ ŠP RR BO 269 0,357 FHC 2079 0,1 0,25 0,25 0,25 273 0,214 0,9 0,375 0,75 0,167 277 0,429 0,375 0,583 289 0,2 293 0,8
BSP ČF IV ZR 0,766 0,25 0,102 0,188 0,9 1 0,133 0,063 0,1 0,5
Nejvíce frekventovaná na lokusu FHC 2059 byla alela 273 u zlatého retrívra (1). Nejnižší frekvence byla pozorovány na u alel 269 u knírače 277 u irského vlkodava (0,1).
39
Tab. 28: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 1 Lokus/MS Alely J K NŠ ŠP 106 0,214 PEZ 1 110 0,286 0,333 0,25 114 0,071 0,1 0,083 118 0,143 0,7 0,25 0,375 122 0,143 0,1 0,083 0,375 0,1 0,125 126 0,143 130 0,125
RR
0,182 0,364 0,455
BO
BSP
ČF
0,6 0,375 0,4 0,172 0,563 0,609 0,18 0,039 0,063
IV
ZR
0,2 0,6 0,688 0,2 0,313
U lokusu PEZ 1 nejvyšší frekvenci vykazovala alela 118 u knírače (0,7). Nejnižší frekvenci měla alela 114 u jezevčíka (0,071).
Tab. 29: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 3 Lokus/MS Alely 93 PEZ 3 105 117 120 123 126 129 132 135 138 141 144
J
K
NŠ
ŠP
RR
BO
0,4
BSP ČF 0,047
IV
ZR
0,25 0,429 0,429 0,071
0,2 0,042 0,125 0,583 0,2 0,208 0,167 0,083 0,375
0,071 0,2
0,25 0,417
0,25 0,083 0,083 0,083
0,071 0,2 0,575 0,5 0,2 0,016 0,063 0,236 0,25 0,6 0,008 0,047
0,3 0,333 0,1 0,667
0,1 0,1 0,1 0,3
0,188
Nejvyšší frekvenci na lokusu PEZ 3 měla alela 123 u zlatého retrívra (0,667). Nejnižší frekvenci vykazovala alela 132 u bernského salašnického psa (0,008).
Tab. 30: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 5 Lokus/MS Alely J K NŠ ŠP RR BO 102 0,5 0,609 0,5 0,5 0,1 PEZ 5 106 0,222 0,375 0,333 0,9 110 0,5 0,778 0,174 0,125 0,167 114 0,217
BSP ČF IV ZR 0,726 0,75 0,3 0,688 0,7 0,06 0,25 0,162 0,315 0,051
Na lokusu PEZ 5 se s nejvyšší frekvencí 0,9 vyskytovala alela 106 u belgického ovčáka. Naopak nejnižší frekvenci měla stejná alela u bernského salašnického psa (0,06).
40
Tab. 31: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 6 Lokus/MS Alely 164 PEZ 6 172 176 180 182 184 188 192 196
J
K
0,071 0,5
NŠ ŠP 0,125 0,125 0,4 0,208 0,25 0,333 0,375
RR
0,357 0,071
0,3 0,333 0,125 0,083 0,3 0,125
BO
0,167 0,083 0,667
BSP
ČF
IV
ZR
0,008 0,375 1
0,5 0,438 0,031 0,273 0,063 0,086 0,023 0,125 0,078
0,313 0,1 0,313 0,8 0,375 0,1
Nejfrekventovanější alelou na lokusu PEZ 6 byla alela 180 u belgického ovčáka (1). Nejnižší frekvenci měla alela 172 u bernského salašnického psa (0,008).
Tab. 32: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 8 Lokus/MS Alely 223 PEZ 8 227 231 235 239 243 247
J
K
0,143 0,429 0,286 0,143
Š ŠP 0,125 0,125 0,5 0,375 0,333 0,625 0,4 0,125 0,25 0,1 0,042
RR BO 0,25 0,333 0,5 0,25 0,083 0,2 0,083 0,3
BSP 0,077 0,172 0,352 0,273 0,141 0,008 0,008
ČF IV ZR 0,438 0,5 0,125 0,2 0,6 0,2 0,5 0,188 0,25
Na lokusu PEZ 8 se s nejvyšší frekvencí vyskytla alela 231 u šarplaninského pasteveckého psa (0,625). Alely 243 a 247 vykazovaly nejnižší frekvenci u bernského salašnického psa (0,008).
Tab. 33: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 12 Lokus/MS Alely 204 PEZ 12 256 260 264 268 272 273 275 276 280 284 288 296 300
J
K
Š
ŠP
RR
BO
BSP ČF 0,008
IV
ZR
0,083 0,2 0,042 0,214 0,357 0,143 0,071 0,071 0,143
0,125 0,083 0,2 0,042 0,583
0,333 0,6
0,083
0,25 0,25
0,102 0,023 0,375 0,055 0,4 0,008 0,625
0,75
0,18 0,023
0,063 0,5 0,313 0,3 0,313
0,2 0,125 0,188
0,25 0,125
0,6
41
0,7 0,531
Nejvíce frekventovaná alela na lokusu PEZ 12 byla alela 272 u českého fouska (0,625). Nejnižší frekvenci vykazovaly alely 204 a 272 u bernského salašnického psa (0,008).
Tab. 34: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 20 Lokus/MS Alely J K Š ŠP RR BO 155 0,071 PEZ 20 163 0,071 167 171 0,143 0,167 0,6 0,5 0,5 0,75 0,2 175 0,143 179 0,214 0,4 0,083 0,25 0,25 0,8 183 0,357 0,25 187 0,25
BSP
ČF
IV
ZR
0,023 0,695 0,375 0,219 0,625 0,063
0,5 0,188 0,5 0,813
Na lokusu PEZ 20 se vyskytla s nejvyšší frekvencí (0,813) alela 179 u zlatého retrívra. U bernského salašnického psa měla nejnižší frekvenci alela 167 (0,023).
Frekvence genotypů Mezi nejfrekventovanější genotypy na lokusu FHC 2010 patřil homozygotní genotyp 231/231 u belgického ovčáka (0,8). Nejnižší frekvenci měly homozygotní genotypy 223/223 a 235/235 u bernského salašnického psa. Nejvyšší frekvenci na lokusu FHC 2054 měl homozygotní genotyp 167/167 u zlatého retrívra (1). Mezi nejméně frekventované patřily heterozygotní genotypy 159/163 a 163/167 a homozygotní genotyp 167/167 (0,016) u bernského salašnického psa. Na lokusu FHC 2079 vykazoval nejvyšší frekvenci homozygotní genotyp 273/273 (1) u zlatého retrívra. Nejnižší frekvence (0,016) se vyskytly u homozygotních genotypů 273/273 a 277/277 a heterozygotního genotypu 273/277 (bernský salašnický pes). Nejvíce frekventovaným genotypem na lokusu PEZ 1 byl heterozygotní genotyp 110/114 u belgického ovčáka (0,8). Nejnižší frekvenci měl heterozygotní genotyp 122/126 a homozygotní genotypy 114/114 a 126/126 (0,016) u bernského salašnického psa. Na lokusu PEZ 3 se s nejvyšší frekvencí (0,5) vyskytly heterozygotní genotypy 105/126 (šarplaninský pastevecký pes) a 120/123 (zlatý retrívr). Naopak nejnižší
42
frekvenci (0,016) vykazovaly heterozygotní genotypy 123/126, 126/135, 129/132 a homozygotní genotyp 120/120 u bernského salašnického psa. Nejvyšší frekvenci (0,625) pro lokus PEZ 5 měl heterozygotní genotyp 102/110 u zlatého retrívra. Homozygotní genotyp 106/106 vykazoval nejnižší frekvenci (0,016) u bernského salašnického psa. Na lokusu PEZ 6 se s nejvyšší frekvencí (1) vyskytl homozygotní genotyp 180/180 u belgického ovčáka. Naopak nejnižší frekvence (0,016) vykazovaly heterozygotní genotypy 172/180, 180/182, 182/188 a homozygotní genotypy 182/182 a 196/196 u bernského salašnického psa. Nejvíce frekventovaným (0,75) na lokusu PEZ 8 byl heterozygotní genotyp 223/235 u zlatého retrívra. Nejnižší frekvenci (0,016) měly heterozygotní genotypy 223/235, 223/243 a 223/247 u bernského salašnického psa. Na lokusu PEZ 12 byla pozorována nejvyšší frekvence (0,8) u heterozygotního genotypu 272/296 belgického ovčáka.
Nejnižší frekvence (0,016) se vyskytly u
bernského salašnického psa u heterozygotních genotypů 260/300, 264/296, 272/204 a homozygotního genotypu 276/276. Nejvyšší frekvenci (1) na lokusu PEZ 20 vykazoval heterozygotní genotyp 175/179 u irského vlkodava. Nejnižší frekvenci (0,016) měl heterozygotní genotyp 167/175 bernského salašnického psa (tabulka viz příloha).
Teoretická heterozygotnost Tab. 35: Teoretická heterozygotnost u všech plemen J FHC2010 FHC2054 FHC2079 PEZ1 PEZ3 PEZ5 PEZ6 PEZ8 PEZ12 PEZ20 Průměrná tH
K NŠ ŠP RR BO BSP ČF IV ZR prům. tH 0,5 0,62 0,6563 0,5313 0,5694 0,18 0,4428 0,5781 0,42 0,5 0,49979 0,7755 0,18 0,7438 0,375 0,7361 0,58 0,6525 0,7422 0,56 0,53451 0 0,6429 0,18 0,6563 0,375 0,5694 0,32 0,3859 0,6484 0,18 0 0,39579 0,8061 0,48 0,7813 0,6563 0,6281 0,48 0,5653 0,5391 0,56 0,4297 0,59259 0,6224 0,72 0,7118 0,7188 0,6111 0,56 0,604 0,6484 0,78 0,4444 0,64209 0,5 0,3457 0,552 0,5938 0,6111 0,18 0,4396 0,375 0,42 0,4297 0,44469 0,6122 0,66 0,7188 0,75 0,5139 0,34 0,6641 0,55676 0 0,6602 0,6484 0,6939 0,58 0,7153 0,5313 0,75 0,62 0,75 0,6953 0,56 0,5 0,63958 0,7755 0,56 0,5451 0,7813 0,4167 0,48 0,666 0,4688 0,62 0,75 0,60634 0,7755 0,48 0,6528 0,625 0,375 0,32 0,4642 0,4688 0,5 0,3047 0,4966 0,6704 0,4806 0,6734 0,5938 0,5781 0,372 0,5631 0,5813 0,494 0,4023
Teoretická (očekávaná) heterozygotnost se u sledovaných plemen pohybovala od 0 (FHC 2054 a FHC 2079 u zlatého retrívra, PEZ 6 u belgického ovčáka) do 0,7813 (PEZ 1 u německého špice). Průměrná teoretická heterozygotnost byla nejvyšší u plemene německý špic 0,6734, naopak nejnižší byla u plemene belgický ovčák 0,372. 43
Nejvyšší heterozygotnost pro celou populaci zvířat vykazoval lokus PEZ 3 (0,64209), nejnižší FHC2079 (0,39579).
Tab. 36: Průměrný polymorfní informační obsah u všech plemen a u jednotlivých mikrosatelitů, CEP u všech plemen Plemeno J K NŠ BO RR ŠP BSP ČF IV ZR
Průměrný PIC CEP 1 CEP2 CEP3 0,6111 0,9971 0,9645 0,9999 0,4225 0,9531 0,7803 0,9938 0,9965 0,9547 0,9999 0,6195 0,3134 0,8607 0,6135 0,9619 0,5253 0,9862 0,8858 0,9993 0,5318 0,9880 0,9065 0,9993 0,5209 0,9868 0,8808 0,9995 0,5084 0,9810 0,8813 0,9985 0,431 0,9592 0,8037 0,9952 0,3327 0,9003 0,7222 0,9761
Prům. Lokus/MS PIC 0,4347 FHC 2010 0,4891 FHC 2054 FHC 2079 0,3500 0,5276 PEZ 1 PEZ 3 0,5873 0,3742 PEZ 5 0,5080 PEZ 6 0,5752 PEZ 8 0,5463 PEZ 12 0,4242 PEZ 20
Průměrný polymorfní informační obsah se v celé populaci pohyboval od 0,3134 (belgický ovčák) do 0,6195 (německý špic). Nejvyšší průměrný polymorfní informační obsah vykazoval lokus PEZ 3 (0,5873), naopak nejnižší polymorfní informační obsah byl na lokusu FHC 2079 (0,35). Nejvyšší CEP byl spočítán pro plemeno jezevčík (0,9977, 0,9645, 0,9999), naopak nejnižší byl u plemene belgický ovčák (0,8607, 0,6135, 0,9619).
44
Tab. 37: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u všech plemen J FHC 2010 pHe pHo FHC 2054 pHe pHo FHC 2079 pHe pHo PEZ 1 pHe pHo PEZ 3 pHe pHo PEZ 5 pHe pHo PEZ 6 pHe pHo PEZ 8 pHe pHo PEZ 12 pHe pHo PEZ 20 pHe pHo prům. pHe prům. pHo
K
NŠ
RR
BO
0,5 0,5
0,75 0,667 0,25 0,333
0,2 0,917 0,8 0,083
0,429 0,571
0,2 0,8
0,25 0,75
1 0
0,6 0,4
0,429 0,571
1 0
0,143 0,857 1 0
0,8 0,2
ŠP
BSP 1 0,429 0 0,571
ČF
IV
ZR
prům.He prům.Ho
0,75 0,25
0,6 0,4
0,75 0,25
0,639
0,5 0,833 0,5 0,167
0,8 0,719 0,875 0,2 0,281 0,125
0,6 0,4
0 1
0,644
0,5 0,5
0,5 0,5
0,4 0,391 0,875 0,6 0,609 0,125
0,2 0,8
0 1
0,374
1 0
1 0,833 0 0,167
0,8 0,547 0,875 0,2 0,453 0,125
0,6 0,625 0,4 0,375
0,788
0,75 0,25
1 0,667 0 0,333
0,6 0,484 0,4 0,516
0,8 0,2
0,5 0,5
0,698
0,6 0,625 0,4 0,375
0,525
0,4 0,6
1 0
0,644
0,212
0,302
0,75 0,25
0,5 0,5
0,857 0,143
0,8 0,667 0,2 0,333
0,75 0,25
0,5 0,5
0,571 0,429
0,8 0,2
0,75 0,833 0,25 0,167
0,8 0,641 0,2 0,359
0,75 0,25
0,6 0,4
0,75 0,25
0,725
0,857 0,143
0,8 0,333 0,2 0,667
0,5 0,5
0,8 0,609 0,2 0,391
0,25 0,75
0,6 0,875 0,4 0,125
0,662
0,359 0,75 0,641 0,25 0,527 0,725 0,473 0,275
1 0,375 0 0,625 0,6 0,55 0,4 0,45
0,623
0,714 0,286 0,614 0,386
0,8 0,2 0,66 0,34
0,583 0,75 0,5 0,457 0,25 0,5 0,658 0,775 0,633 0,342 0,225 0,367
0,5 0,5
0,626
0,6 0,833 0,4 0,167
1 0
0,5 0,5
0,356
0,143 0,857
0,75 0,25
0,2 0,8
0,75 0,25
0,361
0 0,594 0,875 1 0,406 0,125
0,4 0,6 0,58 0,42
0,475
0,356
0,275
0,338
Nejvyšší pozorovaná heterozygotnost (1) byla pozorována na lokusech FHC 2010 (belgický ovčák), FHC 2054 (jezevčík), PEZ 1 (jezevčík, německý špic, šarplaninský pes), PEZ 3 (knírač, šarplaninský pes), PEZ 6 (zlatý retrívr), PEZ 12 (šarplaninský pes) a PEZ 20 (irský vlkodav). Naopak nejnižší pozorovaná heterozygotnost (0) byla na lokusu FHC 2054 a FHC 2079 (zlatý retrívr) a na lokusu PEZ 6 (belgický ovčák). Nejvyšší průměrná pozorovaná heterozygotnost byla nejvyšší u plemene šarplaninský pes (0,775) a lokusu PEZ 1 (0,788). Nejnižší pozorovaná heterozygotnst byla vypočítána pro plemeno zlatý retrívr (0,55) a pro lokus FHC 2079 (0,374).
45
0,381
6. ZÁVĚR
Porovnáním molekulárních dat získaných ze souboru 124 jedinců jsem získala statistickou charakteristiku všech 10 ti mikrosatelitů (FHC 2010, FHC 2054, FHC 2059, PEZ 1, PEZ 3, PEZ 5, PEZ 6, PEZ 8, PEZ 12 a PEZ 20), které jsou součástí komerčně dodávaného kitu firmy Applied Biosystems. Hodnotila jsem frekvenci alel, genotypů, teoretickou a pozorovanou heterozygotnost, PIC (polymorfní informační obsah) a CEP (kombinovaná pravděpodobnost vyloučení) u všech plemen (jezevčík, knírač, německý špic, šarplaninský pastevecký pes, rhodéský ridgeback, belgických ovčák, bernský salašnický pes, český fousek, irský vlkodav a zlatý retrívr). U některých plemen byly pozorovány alely, které se vyskytly pouze u tohoto konkrétního plemene. Jednalo se o alelu 293 na lokusu FHC 2079 u belgického ovčáka, alelu 144 na lokusu PEZ 3 u českého fouska nebo alelu 284 na lokusu PEZ 12 u zlatého retrívra. U šarplaninského psa to byla alela 105 (lokus PEZ 3) a alela 288 (lokus PEZ 12), u rhodéského ridgebacka alela 256 (lokus PEZ 12). U plemene jezevčík se objevilo několik jedinečných alel, alela 106 (lokus PEZ 1), alela 273 a 275 (lokus PEZ 12), alela 155 a 163 (lokus PEZ 20). Vysoký počet alel byl také sledován u plemene bernský salašnický pes, alela 196 (lokus PEZ 6), alela 247 (lokus PEZ 8), alela 204 a 300 (lokus PEZ 12) a alela 167 (lokus PEZ 20). Pro upřesnění těchto výsledků by bylo dobré porovnání i s dalšími autory, použitelné informace ovšem v literatuře nebyly nalezeny. V populaci bylo identifikováno i několik monomorfních lokusů, byl to lokus FHC 2054 (alela 167) a lokus FHC 2079 (alela 273) u zlatého retrívra, PEZ 6 (alela 180) u plemene belgický ovčák. Příčinou mohl být i úzký koeficient příbuznosti, kdy se mohlo jednat o jednu rodinu jedinců, kteří byli homozygotní v tomto lokusu. Polymorfní informační obsah (PIC) v populaci byl v rozmezí od 0 (FHC 2054 a FHC 2079 plemeno zlatý retrívr a PEZ 6 plemeno belgický ovčák) do 0,7786 (PEZ 1 plemeno jezevčík). Průměrný polymorfní informační obsah se v celé populaci pohyboval od 0,3134 (belgický ovčák) do 0,6195 (německý špic). Pozorovaná heterozygotnost byla pozorována v rozmezí od 0 (FHC 2054 a FHC 2079 plemeno zlatý retrívr, PEZ 6 plemeno belgický ovčák) do 1 (FHC 2010 plemeno belgický ovčák, FHC 2054 plemeno jezevčík, PEZ 1 plemeno jezevčík, německý špic a šarplaninský pes, PEZ 3 plemeno knírač, šarplaninský pes, PEZ 6
46
plemeno zlatý retrívr, PEZ 12 plemeno šarplaninský pes a PEZ 20 plemeno irský vlkodav). Teoretická (očekávaná) heterozygotnost se u sledovaných plemen pohybovala od 0 (FHC 2054 a FHC 2079 u zlatého retrívra, PEZ 6 u belgického ovčáka) do 0,7813 (PEZ 1 u německého špice). Nejvyšší CEP byl spočítán pro plemeno jezevčík (0,9977, 0,9645, 0,9999), naopak nejnižší byl u plemene belgický ovčák (0,8607, 0,6135, 0,9619). Shrnutím výsledků v této práci je možné zhodnotit použitý panel mikrosatelitů za spolehlivý pro ověření původu a individuální identifikaci u populace sledovaných psů. Limitujícím faktorem je ovšem nízký počet použitých jedinců u některých plemen psů, proto mohou mít výsledky nižší vypovídací hodnotu. Mezi objektivní zjištění patří především absolutní zhodnocení výskytu alel a genotypů. Jediným problémem byla izolace DNA ze stěru z bukální sliznice, kdy použitý izolační kit JETQUICK® blood and cell culture dna spin kit poskytoval nízkou výtěžnost vyizolované DNA a následně PCR produktu. Doporučovala bych především změnu kitu nebo získání vzorků z jiné tkáně například z krve nebo chlupových cibulek, což by ale mohlo být u psů obtížnější.
47
7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
ALDERTON, D. Psi, Obrazový průvodce s vyobrazením více než 300 plemen psů z celého světa. 1.vyd. Martin, Slovenská republika: vydavatelství Osvěta, 1996. 304 s. ISBN 80–88824–14–1
APPLIED BIOSYSTEMS. StockMarks® Horse, Cattle, and Dog Genotyping Kits Protocol. [online]. © 2007. str 3 - 24. Dostupné z:
ANONYM 1, KLUB CHOVATELŮ BELGICKÉHO OVČÁKA (KCHBO). Belgický ovčák. [online]. Poslední aktualizace: 28.04.2008. Dostupné z:
ANONYM 2. Jezevčík. [online]. Poslední aktualizace: 12.5.2008. Dostupné z:
ANONYM 3. Rhodéský ridgeback. [online]. © 2008 Dostupné z:
ANONYM 4. Český fousek. [online]. © 2007 Dostupné z:
ANONYM 5. Zlatý retrívr. Irský vlkodav. [online]. © 2003. Dostupné z:
ANONYM 6. Genetický polymorfismus (výukový text). [online]. © 2004. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích. Dostupné z: <www.zsf.jcu.cz/struktura/katedry/kko/ucebni_texty/zaklady-genetiky-aporadenstvi/10.pdf/>
48
ANONYM 7. Genetické pojmy. [online]. © 2006 Dostupné z:
BAKOŠ, A. Plemena loveckých psů. 1.vyd. Bratislava: Kontakt plus, s.r.o., 1998. 112 s. ISBN 80–88855–21–7
DeNISE, S., JOHNSTON, E., HALVERSON, J., MARSHALL, K., ROSENFELD, D., McKENNA, S., SHARP, T., EDWARDS, J. Power of exclusion for parentage verification and probability of match for identity in American Kennel Club breeds using 17 canine microsatellite markers. Anim Genet. 2004; 35:14-17.
DOSTÁL, J. Genetika a šlechtění plemen psů. 1. vyd. České Budějovice: Dona, 2007. 261 s. ISBN 978–80–7322–104–1. DROSENOVÁ R., ŘEHOUT V. Genetický polymorfismus. [online]. © 2000. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta. Dostupné z z: <www.xarquon.jcu.cz/zf/veda_a_vyzkum/svoc_a_dsp/svoc/2000/sbdsp/asekzoo/Drosen ov%E1.rtf >
FCI (Mezinárodní kynologická organizace). Standardy plemen. [online]. © 2006. Dostupné z:
FRANCISCO L.V., LANGSTON A.A., MELLERSH C.S., NEAL C.L., OSTRANDER E.A. A class of highly polymorphic tetranucleotide repeats for canine genetic mapping. Mamm Genome. 1996; 7:359-62.
HALVERSON, J., BASTEN, C. A. PCR multiplex and database for forensic DNA identification of dogs. J Forensic Sci. 2005; 50:352-63.
HEARNE, C. M., GHOSH, S., TODD, J. A. Microsatellites for linkage analysis of genetic traits. Trends in Genet. 1992; 8:288-94.
49
HOLKOVÁ, D., WOLF AND DEER HOUND KLUB (WDK). Historie irského vlkodava. [online]. © 2002. Dostupné z: < http://www.wdk.cz/cz/vlkodav/historie/>
KLUB CHOVATELŮ BELGICKÝCH OVČÁKŮ (KCHBO). Historie plemene. [online]. © 2008. Dostupné z:
KNOLL, A. Program na výpočet statistických ukazatelů ověřování parentity (EXEL). MZLU v Brně. 2003.
KNOLL, A., VYKOUKALOVÁ, Z.: Molekulární genetika zvířat (Metody detekce polymorfizmů DNA genů). (scriptum). MZLU v Brně, 2002. 100 s.
KUBEŠ, J. Z historie chovu zlatých retrieverů v Československu. [online]. © 2000. Dostupné z:
MONTALDO, H. H., MEZA-HERRERA, C. A. Use of molecular markers and major genes in the genetic improvement of livestock. [online]. © 1998. Electronic Journal of Biotechnology. Dostupné z:
O´BRIEN, S. J., MENOTTI-RAYMOND, M., MURPHY, W. J., NASH, W. G., WIENBERG, J., STANYON, R., COPELAND, N. G., JENKINS, N. A., WOMACK, J. E., MARSHALL GRAVES, J. A. The Promise of Comparative Genomics in Mammals. Science. 1999; 286, s. 458–481.
OSTRANDER, E.A., SPRAGUE, G.F. J.R., RINE,,J. Identification and characterization of dinucleotide repeat (CA)n markers for genetic mapping in dog. Genomics. 1993; 16:207-13.
ROTHUIZEN, J., WOLFSWINKEL, J., LENSTRA, J.A. FRANTS, R.R. The incidence of mini- and micro-satellite repetitive DNA in the canine genome. Theoretical and Applied Genetics 1994; 89, 403–6.
50
SARPLANINAC CLUB (SC). [online]. © 2006. Dostupné z:
STALLINGS, R.L., FORD, A.F., NELSON, D., TORNEY, D.C., HILDEBRAND, C.E., MAYRIS, R.K. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes. Genomics 1991;10, 807–815.
URBAN, T. Virtuální svět genetiky 3, QTL & MAS - genetické markery. [online]. © 2006. Dostupné z:
VIKTORIN, R., KLUB CHOVATELŮ RHODÉSKÉHO RIDGEBACKA. Historie plemene. [online]. © 1999. Dostupné z:
WEBER, J.L., MAY, P.E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am J Hum Genet. 1989;44:388-96.
ZAJC I., MELLERSH C., KELLY E.P., SAMPSON J. A new method of paternity testing for dogs, based on microsatellite sequences. Vet. Records. 1994;135, 545–547.
ZAJC I, SAMPSON J. Utility of canine microsatellites in revealing the relationships of pure bred dogs. J Hered. 1999;90, 104-7.
51
8. SEZNAM TABULEK Tab. 1: Složení mastermixu Tab. 2: Fluorescenční barvy jednotlivývch mikrosatelitů Tab. 3: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene belgický ovčák Tab. 4: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene belgický ovčák Tab. 5: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene knírač Tab. 6: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene knírač Tab. 7: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene šarplaninský pastevecký pes Tab. 8: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene šarplaninský pastevecký pes Tab. 9: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene bernský salašnický pes Tab. 10: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene bernský salašnický pes Tab. 11: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene jezevčík Tab. 12: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene jezevčík Tab. 13: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene německý špic Tab. 14: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene německý špic Tab. 15: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene rhodéský ridgeback Tab. 16: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene rhodéský ridgeback Tab. 17: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene český fousek
52
Tab. 18: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene český fousek Tab. 19: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene zlatý retrívr Tab. 20: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene zlatý retrívr Tab. 21: Jednotlivé alely a jejich absolutní četnosti, PIC, tH, PE 1, PE 2, PE 3 a CEP u plemene irský vlkodav Tab. 22 : Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u plemene irský vlkodav Tab. 23: Absolutní četnosti alel mikrosatelitů u všech plemen a v celé populaci Tab. 24: Počty alel mikrosatelitů u všech zkoumaných plemen Tab. 25: Frekvence alel všech plemen u lokusu FHC 2010 Tab. 26: Frekvence alel všech plemen u lokusu FHC 2054 Tab. 27: Frekvence alel všech plemen u lokusu FHC 2079 Tab. 28: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 1 Tab. 29: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 3 Tab. 30: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 5 Tab. 31: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 6 Tab. 32: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 8 Tab. 33: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 12 Tab. 34: Frekvence alel všech plemen u lokusu PEZ 20 Tab. 35: Teoretická heterozygotnost u všech plemen Tab. 36: Průměrný polymorfní informační obsah u všech plemen a u jednotlivých mikrosatelitů, CEP u všech plemen Tab. 37: Pozorovaná heterozygotnost a pozorovaná homozygotnost u všech plemen
53
9. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK BO (belgický ovčák) BSP (bernský salašnický pes) ČF (český fousek) FCI (mezinárodní kynologická organizace) He (heterozygotnost) IV (irský vlkodav) J (jezevčík) K (knírač) KCHBO (klub chovatelů belgického ovčáka) MAS (marker assisted selection) MS (mikrosatelit) NŠ (německý špic) PIC (polymorfní informační obsah) RR (rhodéský ridgeback) QTL (lokus kvantitativního znaku) SC (sarplaninac club) ŠP (šarplaninský pastevecký pes) WDK (wolf and deer club) ZR (zlatý retrívr)
54
