Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Genetické markery ve studiu genetické diverzity v populacích hospodářských zvířat Bakalářská práce

Vedoucí práce: doc. Ing. Tomáš Urban, Ph.D. Brno 2009

Vypracovala: Martina Kosťuková

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma "Genetické markery ve studiu genetické diverzity v populacích hospodářských zvířat" vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně.

V Brně, dne 18. 5. 2009 Podpis

PODĚKOVÁNÍ

Předem mé bakalářské práce bych chtěla poděkovat doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za odborné vedení a všestrannou pomoc, kterou mi v průběhu zpracování této práce poskytoval. Dále mé poděkovaní patří rodičům za finanční a také morální pomoc při studiu a nemalé díky patří mému příteli.

Abstrakta Tato bakalářská práce se zabývá problematikou genetických markerů u hospodářských zvířat a jejich použitím ve výzkumu a plemenářství. Důraz je přitom kladen především na různé typy genetických markerů a jejich výhody či nevýhody pro výzkum daných vlastností zvířat. Každý z diskutovaných typů genetických markerů má své specifické vlastnosti, jež jej do jisté míry předurčují ke konkrétnímu využití. Dalším stěžejním bodem práce jsou genetické procesy, jež mohou sehrát významnou úlohu při utváření genetického fondu zkoumaných populacích zvířat a vše, co s nimi souvisí. Jedná se zejména o procesy ovlivňující selekci a frekvenci různých alel v populaci a o techniky, jimiž lze tyto procesy sledovat a na jejich základě poté určit další možný vývoj situace v populaci, nebo naopak pátrat, jaká byla situace před určitým počtem generací. V závěru práce je nabídnuto několik možností provedení analýzy genetické informace pomocí počítačového softwaru. V této kapitole je několik základních faktů o fylogenetickém programu Arlequin 3.11. Klíčová slova: populace, polymorfismus, genetický marker, diverzita, DNA Abstract This work is focused on the topic of genetic markers in livestock and its use in research and breeding. There is an emphasis on describing various types on genetic markers and discussing their advantages and/or disadvantages for studying various livestock traits. Each of the mentioned types of genetic markers disposes with its specific attributes that make it more or less useful for a concrete usage. The next hinge of this work is represented by processes that can play a significant role in modifying genetic pool of a population and their eventual features. These are mainly factors which adjust selection and allele frequency in the population and the technics, by which these processes can be watched. This gives us an opportunity to estimate further development of a population or to explore how was the situation a certain number of populations before the current state. At the end of this work, there is a proposal of a few types of genetic information analysis performed with computer software. In this chapter, there are a few basic facts about the software Arlequin 3.11. Key words: populations, polymorphism, genetic marker, diversity, DNA

Obsah: 1

Úvod ......................................................................................................................... 7

2

Cíl práce................................................................................................................... 8

3

Evoluce DNA ........................................................................................................... 9 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 3. 6 3. 7

Genetický drift .................................................................................................. 9 Mutace ............................................................................................................ 10 Fixace genů ..................................................................................................... 12 Substituční rychlost......................................................................................... 13 Generační doba ............................................................................................... 15 Molekulární fylogenetika................................................................................ 15 Polymorfismy v evoluci.................................................................................. 18

4

Polymorfismus....................................................................................................... 20

5

Genetické markery a metody jejich identifikace ............................................... 22 5.1 Zkoumání kvantitativních znaků vede k objevu tří typů genetických markerů.... 23 5. 1. 1 Genetické markery 1. typu...................................................................... 23 5. 1. 2 Genetické markery 2. typu...................................................................... 23 5. 1. 3 Genetické markery 3. typu...................................................................... 23 5. 2 Molekulární metody vyhledávání genetických markerů ................................ 25 5. 2. 1 Metody detekce molekulárních markerů založené na restrikčním štěpení a hybridizaci............................................................................................................ 25 5. 2. 2 Metody detekce molekulárních markerů založené na metodě PCR ....... 26 5. 2. 3 Metody detekce molekulárních markerů založené na různých kombinacích restrikčního štěpení, hybridizace a amplifikace ................................ 27

6

Genetická variabilita ............................................................................................ 30 6. 1 Míra genetické variace.................................................................................... 30 6. 1. 1 Typy polymorfismu ................................................................................ 31 6. 2 Metody analýzy genetické variability............................................................. 33 6. 2. 1 Frekvence alely ....................................................................................... 33 6. 2. 2 Hardy-Weinbergova rovnováha.............................................................. 34 6. 2. 3 Heterozygotnost ...................................................................................... 35 6. 2. 4 Wrightovy F – statistiky ......................................................................... 35 6. 2. 5 Genový tok.............................................................................................. 37 6. 2. 6 Efektivní počet alel ................................................................................. 37 6. 2. 7 Shannonův index..................................................................................... 38 6. 2. 8 PIC - polymorfní informační systém ...................................................... 39 6. 2. 9 Genetické distance .................................................................................. 39 6. 3 Výběr vhodné metody analýzy ....................................................................... 40

7

Software pro populační genovou analýzu 7. 1 7. 2 7. 3 7. 4

41

Software pro analýzy nukleotidových sekvencí ............................................. 42 Software pro analýzy variability alel a genotypů ........................................... 43 Fylogenetický software PHYLIP 3.68 .............................................................. 44 Arlequin 3.11 .................................................................................................. 45

8

Závěr ...................................................................................................................... 49

9

Seznam literatury.................................................................................................. 50

10

Seznam použitých zkratek ................................................................................... 56

1 ÚVOD Jednotlivá plemena hospodářských zvířat se vyvíjela po mnoho staletí pod vlivem přírodního a lidského výběru. Každý z druhů byl přizpůsobován tak, aby byl schopen přežívat v různých podmínkách a vyhovoval potřebám člověka. Z tohoto podnětu se začalo zjišťovat, jakým způsobem funguje genetický přenos informací z rodiče

na

potomka.

V posledním

desetiletí

stoupá zájem

o detekci

genů

a genomických regionů jak u člověka, tak i u jiných organismů. Hospodářská zvířata jsou předmětem studií díky existenci divokých předků a kříženců, na nichž lze sledovat značné rozdíly v morfologii, fyziologii a vlastnostech. Domestikované formy od sebe nebyly odděleny jen mnoha tisíci kilometry, ale také mnoha tisíci let soustavného šlechtění a tudíž začaly vznikat formy velmi rozdílné. Ani jejich předkové nepatří mezi vyhynulé živočišné druhy, ale naopak existují i v současnosti. Vzhledem k tomu se u těchto živočichů nabízí jedinečná příležitost studovat savčí evoluční historii a definovat selekční prvky vyplývající z domestikace a přírodního výběru. Pokud je populace geograficky rozšířena přes více ekosystémů nebo nik, je nucena se na jednotlivá prostředí adaptovat, což může vést k diferenciaci genů. Diferencovaná populace je značně dynamická – může přežívat, vyhynout, fúzovat s rodičovskou populací, nebo se od ní čím dál více diferencovat do té míry, že se stane reprodukčně izolovanou jednotkou, která vytvoří nový druh. Jendá se o přirozenou selekci, v zootechnické praxi se setkáváme se selekcí umělou, kdy řídící jednotkou nejsou přírodní vlivy, nýbrž je hlavním iniciátorem člověk. Cíleným křížením může značně ovlivnit budoucí využití a znaky užitkovosti jednotlivých druhů hospodářských zvířat.

7

2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je studium proměnlivosti genetických markerů ve vztahu ke genetické diverzitě v populacích hospodářských zvířat. Dílčí cíle jsou: -

studovat vlivy působící na průběh evoluce deoxirybonukleové kyseliny (DNA),

-

seznámit se s různými typy genetických markerů, metodami jejich identifikace a možnostmi jejich použití pro další výzkum,

-

popsat parametry genetické variability a diverzity a statistické metody jejich stanovení,

-

popsat využití a funkce softwarů pro genovou analýzu populací.

8

3 EVOLUCE DNA Většina biologicky důležitých informací (fenotyp) organismu je zapsána v genetické informaci jedince. Základem je nukleová kyselina, která kóduje sekvenci DNA. Vývoj fenotypu organismu je úzce spjat s evolučními změnami na nukleové kyselině. Každá změna na úrovni organismu tudíž souvisí se změnou nukleové kyseliny. Evoluce fenotypu a evoluce nukleové kyseliny probíhají souběžně a jsou na sobě závislé, avšak mechanismy, ke kterým v průběhu přeměny dochází, se liší. Dlouho byl všeobecně uznáván názor, že silami řídícími evoluci jsou zejména domestikace a přírodní výběr. Je faktem, že domestikovaná prasata se vyskytují v poměrně širokém rozpětí přírodních podmínek. Pro rozeznávání jednotlivých druhů prasat jsou používány zejména tyto znaky: morfologie lebky a zubů, vnější proporce těla, barva a vzory na srsti, biochemické a molekulární polymorfizmy, ekologie a chování, reprodukční izolace (CHEN et al., 2007). Evoluční historie zahrnuje následující dva procesy; transformaci a rozdělení jednotlivých vývojových linií, což je zárukou zvyšování diverzity v populacích a druzích. Mutace, migrace, selekce a drift mění kvantity jednotlivých alel jak u jedinců tak i v populacích, čímž zajišťují divergenci a formování jednotlivých druhů. Tento proces však nezávisí jen na změně frekventovaností alel, ale též na ekologické diverzitě.

3. 1

Genetický drift Evoluce jak biologická tak evoluce DNA podléhá do jisté míry náhodě a její

vliv a utváření nelze dopředu zcela odhadnout. Některé události však lze do jisté míry zjistit a dále popsat. Jedním z nejdůležitějších přírodních dějů je genetický drift. Základní principy působení genetického driftu popsal ve svém evolučním díle FISHER (1958) a o rozvoj této teorie se zasloužili vědci WRIGHT, KIMURA a OHTA. Genetickým driftem (nebo též genetickým posunem) jsou míněny náhodné posuny ve frekvenci jednotlivých alel v genofondu určité populace (FLEGR, 2005). Posuny alel v genofondu nejsou způsobeny rozdíly v selekčních hodnotách. Jejich existence je závislá na volné kombinaci různých alel v genotypu a zastoupení jedinců v generaci. Přechod a zastoupení jednotlivých alel z generace na generaci závisí na náhodě a na zastoupení alel v předchozí generaci.

9

3. 2

Mutace Prase je typickým příkladem domestikovaného zvířete, jehož mnoho poddruhů

je od sebe evolucí přehledně odděleno. Souběžně s domestikovanými druhy prasat existují také zástupci volně žijící a z tohoto důvodu jsou prasata považována za jeden z nejvhodnějších živočišných druhů pro posuzování dědičných mutací a určování selektivních procesů. Dědičné mutace jsou důležité z několika důvodů: 1) pravděpodobnost dědičnosti alely je rovna frekvenci jejího výskytu, 2) pozitivní selekce má za následek regiony se sníženou heterozygotností a nadbytkem odvozených alel (CHEN et al., 2007). Při mutacích dochází ke změnám ve struktuře genetického materiálu; jsou tudíž jedním z mála zdrojů variability v populacích. Bez existence mutace by se biologická evoluce pravděpodobně zastavila. Stopnutí evolučních změn na organismu by mělo za následek vyhynutí neadaptibilních organismů (FLEGR, 2005). Nejsou-li brány v úvahu „adaptivní“ mutace, lze všechny mutace klasifikovat buď jako spontánní, nebo indukované. Tyto kategorie do určité míry překrývají, spontánní mutace však nastávají přirozenou cestou a s jejich výskytem není spjat žádný konkrétní faktor. Jsou tedy považovány za náhodné změny nukleotidových sekvencí v genech. Většina takových mutací je spjata s běžnými chemickými procesy měnícími strukturu nebo sled dusíkatých bází, jež jsou součástí existujících genů. Spontánní mutace se často objevují při enzymatické replikaci DNA. Případná chyba ve genetickém kódu může mít vliv na aminokyselinové složení výsledného proteinu. Nachází-li si pozměněná aminokyselina v části proteinu odpovědné za jeho strukturu či biochemickou aktivitu, může být pozměněna i funkce proteinu. Mutace indukované naopak vznikají vlivem či přímo působením důležitého faktoru. Všeobecně uznávaným faktem je, že jakýkoliv přirozený fenomén, jenž zvýší biochemickou aktivitu organismu, je schopen vyvolat (indukovat) mutaci. Například radiace z kosmických a minerálních zdrojů a sluneční ultrafialové (UV) záření jsou energetickými zdroji, jimž jsou organismy běžně vystavovány a zároveň jsou to faktory, které jsou potenciálními původci mutací. Prvním důkazem indukované mutace byl objev, že rentgenové paprsky vyvolávají mutaci u Drosophily (HERMANN, 1972). Spolu s různými formami záření je známo také mnoho chemikálií, jež jsou považovány za mutagenní.

10

Mutace lze dělit nejen dle příčiny jejich vzniku, ale také na základě jejich fenotypových projevů. Problémem je však to, že jedna mutace může splňovat podstatu více kategorií. Nejsnáze pozorovatelnými mutacemi jsou takové, jež nějakým způsobem ovlivňují morfologii organismu; tedy mutace, jejichž odchylky jsou pozorovatelné na základě rozdílů oproti fenotypu divokého typu. Do této kategorie patří například Mendelova pozorování a také mnoho experimentů prováděných na Drosophilách, neboť obojí se zakládá na sledování morfologických změn. Další rozsáhlou skupinou mutací jsou takové, jež vykazují fenotypové změny výživy nebo biochemické aktivity. U bakterií a hub je typickou změnou výživy neschopnost syntetizovat některý protein nebo vitamin. U prasat jsou takovými mutacemi hemofilie a anémie. Tyto mutace sice nejsou na první pohled rozeznatelné a nemusí ovlivňovat morfologické znaky, ale často mají zásadní vliv na prosperitu a přežívání daného organismu. Třetí kategorie mutací zahrnuje ty, jež nějakým způsobem ovlivňují vzorce chování daného organismu (páření, cirkadiánní rytmy). Primární efekt těchto behaviorálních mutací je často obtížné rozpoznat. Další typ mutací může mít efekt na genovou regulaci. Příkladem je lac operon (regulační gen), jenž produkuje molekuly ovlivňující transkripci dalších genů. Regulační mutace mohou také narušit normální procesy tím, že permanentně aktivují či deaktivují jakýkoliv gen. Tento typ mutací však není doposud dostatečně prozkoumán (KLUG, CUMMINGS, 2003) Mutace dále dělíme podle biologické zdatnosti jejich nositele, toto rozdělení je však relativní, neboť v prostředí, kde je daná mutace za určité situace negativní, může být za podmínek jiných neutrální. Dle vlivu na fitness nositelského organismu rozlišujeme tyto druhy mutací: pozitivní, jež jsou výhodné a užitečné tím, že zvyšují biologickou zdatnost svého nositele, dále pak mutace negativní, které jsou pro organismus škodlivé a snižují jeho biologickou zdatnost, a do třetice mutace selekčně neutrální, jež na nositele nemají vliv. Nutno podotknout ještě jednu skupinu a to mutace mírně negativní. U tohoto druhu mutací je biologická zdatnost záporná, ale vliv na nositele je velmi slabý. Nejvíce se vyskytují mutace selekčně neutrální a mírně negativní; ty se žádným výrazným způsobem neprojevují na fenotypu organismu a tudíž neznevýhodňují jedince z hlediska přírodního výběru. Neutrální mutace vznikají v jednotlivých úsecích DNA opakovaně v důsledku mutačního tlaku. Postupně pak ale zanikají působením 11

genetického driftu. Negativních mutací se vyskytuje více, než mutací pozitivních, neboť během dlouhé biologické evoluce byla funkce pozitivních mutací postupně zlepšována působením přirozeného výběru. Je však všeobecným předpokladem, že funkce žádné molekuly není natolik optimalizovaná, aby se nedala mutací více vylepšit. Odhaduje se, že 30-70% všech savčích genů prochází sestřihem (MODREK, LEE, 2003). Původ těchto sestřihů bývá přisuzován evolučnímu získání či naopak ztrátě exonů z genomu (THANARAJ et al., 2003). Konkrétní podoba sestřihu obvykle závisí na vývojovém stádiu organismu, konkrétní tkáni, případně fázi nemoci (THANARAJ et al., 2004). O sestřihových mutacích se dlouho hovořilo jako o možných zdrojích mnoha lidských nemocí (KRAWCZAK et al., 1992). Později bylo na základě náchylnosti lidských genů k nemocem, délce jejich kódujících oblastí a počtu intronů odhadnuto, že zhruba 60% všech dědičných chorob způsobených mutací připadá právě na alternativní sestřih. Tento fakt činí ze sestřihu jednoznačně nejčastější příčinu dědičných nemocí (LOPEZ-BIGAS et al., 2005). Přestože důležitost sestřihu pro různé biologické procesy jako jsou určení pohlaví (LOPEZ, 1998) a apoptóza je známa již po mnoho let, teprve genomické metody odhalily také jeho nenahraditelnou roli v genové regulaci (MODREK, LEE, 2002). Sekvenování genomu pak umožnilo zkoumat evoluční dopady sestřihu (XING, LEE, 2006).

3. 3

Fixace genů V průběhu evoluce byly jednotlivé geny důkladně zkoušeny a při zjištění

vhodnosti pro organismus následně fixovány. Přírodní výběr dává průchod takovým genům, které jsou pro organismus užitečné a geny s nevhodným uzpůsobením nechá zahynout. K fixaci vhodných genů může dojít rychlým evolučním tahem, ale i pomalým genetickým driftem. Neutrální mutace je možno fixovat evolučním svezením, neboť se v populacích rozšiřují jen díky tomu, že se nalézají v blízkosti mutací pozitivních. Tím dochází k fixaci na tento gen a následně i k předávání z generace na generaci. Toto funguje jen u organismů rozmnožujících se pohlavně. Účinnost genetického draftu je tudíž nepřímo úměrná pravděpodobnosti rekombinace v úseku mezi neutrální a pozitivní mutací, tedy přímo úměrná síle genové vazby mezi příslušnými lokusy. Rychlost fixací mutací v dané pozici úseku DNA se nazývá substituční rychlost. Vyjadřuje se jako počet fixovaných mutací v určité poloze za jeden rok. Závisí na mutační rychlosti v daném místě, na intenzitě a směru selekce. Nezávisí na velikosti 12

populace, neboť při zvětšování skupiny se zároveň zvětšuje počet mutací a tím se zvyšuje hodnota mutační rychlosti, zároveň s tím se však snižuje možnost fixace nově vzniklé mutace genetickým driftem. V případě neutrálních mutací se substituční rychlost rovná mutační rychlosti, v jiném případě tyto dvě hodnoty stejné nejsou. Mutační rychlost je popisována jako množství mutací vznikajících v dané pozici za časovou jednotku u všech členů populace a také závisí na přesnosti replikace, účinnosti reparačních procesů, intenzitě působení mutagenů a mutabilitě sekvenčního motivu a dané pozici sekvence DNA (FLEGR, 2005).

3. 4

Substituční rychlost Intenzita a charakter selekce v daném úseku genu výrazně ovlivňují substituční

rychlost. Substituční rychlosti jednotlivých genů téhož organismu se výrazně liší a to dokonce v rozmezí několika řádů. Nejmarkantnější rozdíly v rychlosti lze nalézt u substitučních rychlostí nesynonymních mutací, naopak u synonymních mutací se substituční rychlostí liší méně. Tento jev se vyskytuje proto, že rychlost a pravděpodobnost fixace nesynonymní mutace tj. mutace, která vede ke změně primární struktury kódovaného proteinu, je určována intenzitou selekčních tlaků, hrajících roli v evoluci daného genu. Tyto selekční tlaky jsou pro různé geny výrazně odlišné ( FLEGR, 2005). Je-li jedinec vystaven selekčnímu tlaku, obvykle to vyústí ve změnu genetického základu populace (NIELSEN, 2005). Nositelé výhodnějšího genotypu budou postupně potlačovat ostatní členy populace, což povede k fixaci alel prospěšných a zároveň eliminaci těch škodlivých. K identifikaci genů a genových toků bývají používány zejména dva postupy; prvním je použití kandidátního genu, což lze označit za genovou selekci založenou na metodách srovnávání funkcí genu. Druhá metoda zkoumá celý genom a zjišťuje, které z jeho oblastí jsou selekčními faktory. Děje se tak za pomoci asociace genotypu s fenotypem, tj. promítnutí se konkrétního genu do konkrétní vlastnosti (CHEN et al., 2007). Rychlosti fixace nesynonymních a synonymních mutací vykazují silnou pozitivní korelaci. Jejím zdrojem je především genetický draft nebo též evoluční svezení se. Díky existenci tohoto procesu se mutace neutrální fixují v daném genu, nebo jsou naopak potlačeny spolu s mutacemi selekčně významnými (BRAVERMAN et al., 1995, CHARLE,

GUTTMAN, 1996). Stane-li se gen předmětem selekce, ať už

pozitivní (směr k evoluční změně, fixace nových mutací), nebo negativní (směrem k evoluční stálosti, eliminace většiny mutací), změní se u něj rychlost fixace selekčně 13

významných i neutrálních mutací. Z tohoto důvodu se musíme při analýze genů zaměřit na takové, jež v minulosti neprodělaly změny selekčních tlaků a to i v případě, že pracujeme pouze se znaky selekčně neutrálními. Za povšimnutí stojí, že přesto, že mezi substituční rychlostí synonymních a nesynonymních mutací u jednotlivých genů existuje závislost, rychlost kumulace neutrálních mutací v genomu nemá přímý vliv na rychlost anagenetického vývoje druhu. K radikální změně substituční rychlosti může dojít, začne-li produkt některého genu plnit v organismu novou funkci, nebo dojde-li k duplikaci tohoto genu a organismus tak má v genomu dvě jeho kopie. V těchto případech může dojít k významné změně intenzity selekce, jíž je gen vystaven, což může vyústit ve změnu substituční rychlosti v daném úseku DNA. Studie provedené na pekařské kvasince Saccharomyces cerevisiae prokázala, že geny, jejichž absence má malý vliv na životaschopnost organismu, vykazují větší substituční rychlost (HIRSH, FRASER, 2001). Pro analýzu je všeobecně vhodné zvolit takový úsek genu, který u všech taxonů plní tutéž funkci a během evoluce byl podroben totožným selekčním tlakům. Z tohoto důvodu se hojně využívají geny pro proteiny replikačního, transkripčního nebo translačního aparátu. Vzhledem k tomu, že genetický draft je schopen ovlivnit v jednom místě chromozomu fixaci selekčně významných i neutrálních mutací v přilehlých oblastech, může mít změna funkce jednoho genu podstatný vliv na substituční rychlost v sousedních sekvencích DNA. Jedinou účinnou možností pro datování kladu genetických událostí je tedy použití většího počtu genů nezávislých jak funkčně tak i z hlediska genové vazby. Jedním z velmi důležitých genetických faktorů ovlivňujících substituční rychlost je intenzita genetických rekombinací. V úsecích genomu, kde dochází ke snížené četnosti rekombinace, je větší část geneticky neutrálních mutací eliminována společně s negativními mutacemi tzv. selekcí na pozadí, naopak menší část neutrálních mutací je fixována spolu s pozitivními mutacemi tzv. selekčním vymetením, které je součástí genetického draftu. Z toho vyplývá, že v oblastech genomu s nízkou frekvencí rekombinací je substituční rychlost zvýšená a vliv selekčního vymetení převažuje nad vlivem selekce na pozadí (AQUADRO, BEGUN, KINDAHL, 1994).

14

3. 5

Generační doba Převážná část mutací probíhá v průběhu buněčného dělení, délku generační

doby však negativně ovlivňuje mutační rychlost. Z toho vyplývá, že u organismů s delší generační dobou dojde během života k přibližně stejnému počtu buněčných dělení jako u organismů s generační dobou o několik řádů kratší. Z tohoto důvodu by měl být počet fixovaných neutrálních mutací zhruba konstantní pouze tehdy, je-li počet generačních dob daného druhu podobný (OTHA, 1995). KIMURA (1993) však ve svém díle uvádí, že pro nesynonymní mutace se efekt generační doby uplatňuje mnohem méně a počty fixovaných mutací jsou spíše úměrné absolutnímu času. Je obtížné definovat přesný čas vzniku nového druhu. Druh je skupinou (potenciálně) vzájemně se křížících populací, jež jsou v přírodě reprodukčně izolovány od ostatních takových skupin. U sexuálně se reprodukujících organismů je ke vzniku nového druhu třeba, aby původní genový pool byl rozdělen na nejméně dva oddělené genové pooly. Dalšími projevy odlišení se druhu bývají morfologické a fyziologické změny a též adaptace, tyto jevy však nejsou podmínkou vzniku nového druhu. Protože je divergence druhů a populací provázena genetickou diferenciací, je možné použít k rekonstrukci evoluční historie genetické šablony. Na základě dat získaných výzkumem genetické struktury populací a jejich divergence je možné odpovědět na otázky položené prve ( KLUG, CUMINGS, 2003)

3. 6

Molekulární fylogenetika Fylogeneze se zabývá studiem vzniku a vývoje jednotlivých vývojových linií,

snaží se rekonstruovat průběh kladogeneze a brát v úvahu anagenezi. Fylogenetika se tudíž zabývá historií evoluce života na Zemi. Pomocí fylogenetických studií lze rekonstruovat rodopisné vazby mezi jednotlivými druhy a také určit dobu, před níž organismy naposledy sdílely společného předka, tj. před níž došlo k divergenci. (CHEN et al., 2007) Molekulární fylogenetika zkoumá molekulární znaky molekulárně biologickými metodami a byla původně vyvinuta pro biologické obory jako je biochemie, fyziologie aj. Poznatky a data nasbíraná pomocí molekulárně fylogenetických metod je možné použít pro výzkum genetické struktury populace, její dynamiky a rozmnožovacího systému.

15

Při výzkumu molekulárně biologických znaků nejsme omezováni výběrem dat, neboť výběr úseku DNA není omezen. Limitováni jsme pouze množstvím finančních prostředků a také času, který může být do výzkumu investován. Neposkytne-li nám analýza dostatečné množství informací může být pokus opakován či porovnáván s daty nasbíranými s analýz jiných, ale vždy stejného úseku DNA. Fylogenezi lze porovnávat ze 2 hledisek; metodou klasickou a metodou molekulárně biologickou. Zatímco metody klasické se zabývají vnějšími člověku viditelnými znaky na organismu (utváření končetin různých druhů), molekulárně biologické metody se zabývají znaky na úrovni DNA a proto podávají komplexnější informace o daném problému. U metod klasických je třeba hovořit o porovnávání na základě subjektivního hodnocení, neboť je velmi často nesnadné rozhodnout např. o příbuznosti daných druhů. U molekulárně biologických metod je rozhodováno na základě dat získaných ze sekvenátorů či jiných přístrojů, které se využívají pro zjišťování

genetických

znaků.

Tyto

výsledky

jsou

vyhodnocovány

pomocí

matematického algoritmu, jedinou možností subjektivného ovlivnění výsledku je tedy výběr správného algoritmu pro daný případ. Molekulární znaky zjišťované na základě DNA mají kvalitativní charakter. Genetická informace je zapsaná v digitální formě. Může se jakkoli převádět do alfanumerických znaků, nedochází ke skreslení takto získané informace. Tyto informace pak lze porovnávat se zdánlivě nepříbuznými druhy a na základě provedeného srovnání je pak možno dospět k hledané odpovědi. SSR markery jsou užívány zejména pro fylogenetické studie a měření rozdílů v jednotlivých druzích. Pro své neutrální vlastnosti jsou však nevhodné pro objasňování změn fenotypu způsobených selekcí. Za tímto účelem jsou prováděny fylogenetické studie zaměřené na hodnocení genetické jedinečnosti. Fylogenetickou analýzou druhu lze určit původ a historii domestikovaných prasat. Domestikace prasat proběhla nezávisle na sobě u několika poddruhů eurasijských prasat, u nichž také mohlo v osmnáctém a devatenáctém dojít ke křížení (DARWIN, 1868, JONES, 1998). Při taxonomických studiích klasických znaků se vyskytuje zásadní problém; konvergentní a paralelní evoluce. Konvergentní znaky jsou takové, jež vznikly u nepříbuzných druhů pomocí selekčních tlaků a v průběhu času se vytvoří obdobné formy znaků. U paralelní evoluce se objevují dva druhy, jež si jsou na počátku podobné a sdílely velké množství původních tzv. pleziomorfních znaků. Působením podobných 16

selekčních tlaků se u těchto dvou podobných druhů vytvoří stejné formy znaků, různé od pleziomorfních forem znaků. Vzhledem k přítomnosti stejných nezávisle vzniklých znaků konvergentní či paralelní evolucí může být taxon zařazen do chybné či jiné skupiny. Takto vzniklá skupina může být vytvořena uměle, neboť v ní mohou chybět plezimorfní formy znaků. V případě molekulárně biologických metod je možno tyto obavy z chybného zařazení taxonu vypustit. Molekulárně biologické metody využívají ke studiu selekčně neutrální mutace. Sdílení stejné životní strategie či životního prostředí se neprojeví na molekulární úrovni fixace stejných neutrálních mutací. Míra sdílení molekulárně biologických znaků u dvou druhů přímo odráží vzájemnou příbuznost daných druhů. Není však vyloučeno, že může dojít ke vzniku selekčně neutrálních znaků u dvou nepříbuzných druhů. Avšak při použití velkého množství dat, které molekulárně biologické metody využívají, se vliv této náhody eliminuje natolik, že v podstatě vylučuje jakékoli nesprávné zařazení. Aby

bylo

v budoucnu

možno

splňovat

požadavky

zemědělství

a potravinářského průmyslu, je třeba konzervovat genetické zdroje. Za tímto účelem jsou prováděny fylogenetické studie zaměřené na hodnocení genetické jedinečnosti každého z druhů prasat. Ze získaných dat by měl být ustanoven plán pro zachování druhů prasat, který bude brát v potaz zejména následující kritéria: genetickou jedinečnost daného druhu a jeho stupeň ohrožení (RUANE, 1999). Fylogenetické studie používající genové markery nebo jednonukleodtidové polymorfismy (SNP) mající spojitost s konkrétními vlastnostmi jsou důležité pro zachování jednotlivých druhů prasat, eventuelně pro vytváření druhů nových, které budou splňovat požadavky trhu. Také mitochondriální DNA (mtDNA), jež je děděna pouze z matky na potomka, může poskytovat užitečné informace o mateřských liniích v každé populaci. Naproti tomu variabilní sekvence na chromozomu Y umožňují zjistit historii druhu a jeho fylogenetický původ (BRUFORD et al., 2003). Získávání molekulárně biologických dat je náročnější na prostředky, na vybavení laboratoří, na provoz laboratoře. Pro některé typy analýz tyto metody nejsou zcela vhodné a biologové budou nuceni neustále využívat metod klasických.

17

3. 7

Polymorfismy v evoluci Jednotliví zástupci stejného druhu se vzájemně liší výskytem různých

nukleotidů v mnoha pozicích svých genů, proto v genofondu všech druhů organismu existuje velké množství polymorfismů. Většina takovýchto polymorfismů se v genofondu populací vyskytuje jen proto, že jsou selekčně neutrální. Selekčně neutrální znaky mohou v populaci přetrvávat po velmi dlouhou dobu; za takovéto znaky považujeme mutace v těch částech genomu, které nekódují žádný protein, dále v intronech a synonymní mutace. Protože aminokyselina se může skládat z různých tripletů, nemusí nutně záměna jednoho nukleotidu vést k záměně celé aminokyseliny v kódovaném proteinu. Synonymní mutace tak nutně nemusí změnit aminokyselinu v sekvenci příslušného proteinu, ale může mít dopad na koncentraci v aminokyselin v genomu organismů. V malých populacích najdeme větší množství polymorfismů, než v populacích větších. Tato skutečnost je dána tím, že v malých populacích dojde ke stejnému počtu mutací jako u populací s větším výskytem jedinců, ale většina mutací se zařadí do kategorie selekčně neutrálních. U velkých populací naopak dojde k přechodu takovýchto mutací do mutací selekčně pozitivních nebo převážně negativních. Proto jsou obvykle velmi rychle eliminovány (NEVO et al., 1994, TAKAHATA, 1996). Závislost množství vnitropopulačních polymorfismů na velikosti populace je mnohem menší, než se předpokládá u genetického draftu. Největší množství neutrálních polymorfismů se v genomu nachází v oblastech s nejvyšší frekvencí genetické rekombinace (TAKAHATA, 1996). Vznik genetických rekombinací je provázen vznikem určitých typů mutací. Zvýšení mutační rychlosti nemá vliv na vznik daného jevu. Avšak v případě mezidruhové diverzity genetická rekombinace ovlivňována je, což je vždy důsledkem některého z typů genetického draftu, tedy buď selekce na pozadí, nebo selekčního vymetení. Pokud by se významná část genetických polymorfismů udržovala v populacích pouze selekcí ve prospěch heterozygotů, byla by biologická zdatnost homozygotů velmi nízká, nejspíše by jim dokonce nedovolovala se rozmnožovat (LEWONTIN, 1994). Z tohoto vyplývá, že reálnějším mechanismem udržujícím molekulární polymorfismus je selekce závislá na frekvenci alely. Pokud biologická zdatnost nositelů dané alely klesá s růstem jejich zastoupení v populaci, bude se tato alela dlouhodobě či trvale v populaci udržovat. Pokud však pomocí selekčního tlaku dojde k vychýlení této 18

rovnováhy, ta se časem vrátí do původních hodnot díky selekci závislé na frekvenci. Selekce závislá na frekvenci může dlouhodobě udržovat stabilní četnost alel v populaci, ale závisí také na vnějších podmínkách v místě výskytu dané populace. Molekulární polymorfismus je v přírodě udržován mutačním tlakem, ovšem velikost podílu selekce na udržení mutačního tlaku ve prospěch heterozygotů, případně velikost podílu selekce závislé na frekvenci zatím nejsou známy. V průběhu zkoumání tohoto jevu byly vysloveny dva názory; neutralistický a selekcionistický. Tyto dva směry nelze pojímat jako zcela rozdílné, spíše se jedná o dva hraniční body možností, jež jsou mezi nimi. Neutralisté nepovažují přírodní výběr za hlavní faktor evoluce; namísto toho poukazují na fakt, že genotypy některých organismů jsou neadaptivní, jejich výskyt kolísá a jejich genotypy tedy mohly být zafixovány genetickým driftem. Naopak selekcionisté nepopírají, že genetický drift je jedním z důležitých faktorů při kolísání frekvence výskytu jednotlivých alel. Je velmi obtížné hledat argumenty proti tezi, že některé genetické variace musejí být neutrální. Rozdíl v obou výše popsaných teorií je spíše v míře neutrality, kterou uznávají.

19

4 POLYMORFISMUS V přírodě se vyskytuje genetická variace, jež má mnoho aplikací. Genetická variace poskytuje řadu zabudovaných markerů pro genetické studium organismů. V každé populaci existuje větší či menší polymorfismus v řadě kvantitativních i kvalitativních znaků. Některé znaky polymorfismů jsou nedědičné povahy; tyto znaky vznikají jako odpověď jedince na vlivy prostředí, s nimiž se během vývoje a života setkal. Většina polymorfismů je v různé míře povahy dědičná, pro tento typ polymorfismu je však nutná přítomnost dvou či více alel jednotlivých genů. Údaje o polymorfismu genů jsou užitečné při studiu genetických vztahů mezi populacemi jednotlivých druhů. S nástupem molekulární biologie bylo možno zkoumat jednotlivé geny bez znalosti jejich fenotypového projevu. Monoformní jsou takové geny, které se vyskytují v populaci v jedné variantě a proto dříve nebyly zkoumány. V dnešní době bylo zjištěno, že monoformní geny neexistují v populaci skoro neexistují, protože téměř všechny geny se v populacích vyskytují v mnoha variantách, které se liší jednotlivými bodovými mutacemi. Reverzní genetika nám umožňuje určit biologickou funkci genu i když se nachází pouze v jedné variantě. Výzkum probíhá buď pomocí transgenního organismu, nebo metodou genového odstřelu. Studium fenotypu takto geneticky modifikovaných organismů pak pomůže zjistit jaké znaky ten který gen určuje. Většina takovýchto mutací je fenotypově a selekčně neutrálních, jejich výskyt nevede k záměně aminokyselin v proteinovém řetězci. Většinou tedy nedochází k biologické změně funkčnosti proteinů. Tyto polymorfismy jsou označovány jako tzv. pseudopolymorfismy (FLEGR, 2005). Pokud pomineme pseudopolymorfizmy, které nemají vliv na fenotyp organismů, zjistíme, že existují dvě formy polymorfních genů. U prvního typu polymorfizmů rozeznáváme alely, které se vyskytují většinou přechodně, nebo jsou udržovány v dynamické rovnováze pomocí mutačního tlaku či selekce. Celá existence tohoto typu polymorfizmů vyplývá z vlastností evolučních procesů. U druhého typu polymorfismů se nedá přesně určit, která alela je standardní a která mutovaná, neboť se většina v populaci vyskytují s vysokou frekvencí. Výskyt těchto alel je navíc značně nepředvídatelný za předpokladu, že všechny organismy jsou vystaveny působení přirozeného výběru. V takovém případě by mělo být pravděpodobnější, že v populaci

20

nebudou dlouhodobě přetrvávat alely stejného druhu; alely s nejvhodnější genetickou informací by měly vytlačit alely méně vhodné.V přírodě existuje několik mechanismů, jež dokáží zabránit vytlačení méně vhodných alel. Patří mezi ně spojení mutačního tlaku s recesivitou znaků, superdominance, selekce závislá na frekvenci, cyklická selekce a vliv epistatických interakcí. Mutační tlak vzniká v důsledku opakovaného vzniku stejné alely. Působením mutačního tlaku se v populaci navyšuje procento kopií mutované alely. Proti mutačnímu tlaku v populaci působí selekce, která má za úkol z populace odstranit mutace snižující biologickou zdatnost oragnismu. Pokud je selekce recesivních alel nízká, je nízká i účinnost selekce a tyto alely se mohou v populací trvale vyskytovat s vysokou frekvencí. Rovnovážné zastoupení recesivních alel v populaci závisí na síle s jakou vznikají během jedné generace mutací alely recesivní z alel dominantních a na síle selekčního tlaku, který působí proti homozygotním nositelům mutovaných alel. Recesivní mutace mohou přetrvávat v populaci ve stabilním rovnovážném stavu narozdíl od dominantních alel, které se buď fixují, nebo se v genofondu populace skoro nevyskytují. Veliký

význam

mají

polymorfismy

v evoluci

populace.

Přítomnost

polymorfismů umožňuje schopnost reakce na krátkodobé tlaky prostředí, protože poskytuje genetický materiál k selekci. K přizpůsobení se prostředí nemusí selekce vyhledávat nové mutace, nýbrž vybírá z již vzniklých variací. Je výhodnější pro organismus vyhledávat z vlastních genetických zdrojů než vytvářet nové mutace, u kterých není zajištěn prospěšný výsledek. V případě cyklických změn v prostředí je tak zajištěno, že při návratu do původních podmínek se organismus snáze navrátí k původnímu genetickému stavu. Podle některých teorii má tato technika mikroevoluce za následek vyšší evoluční úspěch u pohlavně se rozmnožujících druhů (WILLIAMS, 1975). Nevýhodou u těchto druhů však je vznik malého množství nových alel a tím i omezení fixace. U geneticky polymorfního druhu tak může dojít k poměrně rychlému poklesu polymorfismu.

21

5 GENETICKÉ MARKERY A METODY JEJICH IDENTIFIKACE Existují dobře prozkoumané sekvence DNA, které jsou snadno a lehce identifikovatelné. Většina genetických markerů má známý způsob přenosu genetické informace a je zjistitelná v jakémkoli věku jedince jakéhokoli pohlaví. Tím, že jsou objasněny způsoby dědičnosti genetických markerů je možno sledovat dědičné choroby, případně hledat příčiny těchto nemocí. Také pro znaky produkce a kvality masa je možné hodnotit markery až po porážce zvířete, nebo u velmi mladých zvířat. Na základě znalosti genotypu rodičů mohou být produkována jatečná zvířata s výhodným genotypem. Úseky DNA, jež leží na chromozomu v těsné blízkosti se přenáší na potomstvo společně a z je z nich možno vysledovat informaci o genu, který nebyl ještě lokalizován. Jednotlivé varianty téhož markeru mezi sebou mají kodominantní vztah, tzn. mohou být určeny genotypy (i heterozygotní), které se ve fenotypu neprojeví (FLEGR, 2005) Důležitým předpokladem pro použití DNA markerů je nezávislost na podmínkách prostředí, čili jejich selektivní neutrálnost, což v některých případech nebývá splněno u isoenzymových markerů, na které může působit selekce přímo, nebo které bývají často ve vazbě se selekci vystavenými geny (BERGMANN, 1975). Odlišné úseky DNA jsou vystaveny různým selekčním tlakům. Většina sekvencí kódujících životně důležité proteiny podléhá silnému selekčnímu tlaku, a proto jsou nevariabilní a pro analýzy většinou nepoužitelné. Na druhou stranou v nekódujících oblastech (introny a mezigenové regiony), u kterých lze předpokládat selekční neutralitu, a jejichž míru polymorfismu může ovlivňovat pouze genetický drift, se snadno hromadí mutace a proto jsou tyto sekvence variabilní.

22

5.1 Zkoumání kvantitativních znaků vede k objevu tří typů genetických markerů 5. 1. 1 Genetické markery 1. typu tzv. přímé markery. Nejčastěji se jedná o kódující (exprimované) strukturní geny s nízkým stupněm polymorfismu. Jsou méně vhodné pro studium diverzity druhu a populací, ale zároveň se využívají pro komparativní mapování. Podle typu polymorfismu dělíme genetické markery na : •

Funkční markery, což je vlastní příčinná mutace

•

Přímé markery, což je polymorfismus DNA přímo v sekvenci genu

5. 1. 2 Genetické markery 2. typu tzv. nepřímé markery, které nemají vliv na vlastní variabilitu znaku. Nejčastěji se vyskytují jako mini- nebo mikrosatelity. Genetické markery jsou ve vazbě s lokusy kvantitativních znaků (QTL), čehož se využívá při mapování QTL a určování parentity. Vyhledávání takovýchto markerů vyžaduje dobře naplánovaný experiment, neboť vazba určité alely markeru a QTL může být pozměněna působením rekombinace. Proto je důležité pro použití nepřímých markerů provést rodokmenovou analýzu a zjistit užitkové vlastnosti rodičů. Z hlediska využití můžeme rozdělit nepřímé markery na: •

LD markery, které jsou s QTL ve vazbové nerovnováze

•

LE markery, které jsou s QTL v rovnováze

5. 1. 3 Genetické markery 3. typu které vycházejí z nepřímých genetických markerů. Jedná se o SNP markery v kódujících i nekódujících sekvencích, v intronech genů, nebo mimo geny. V těchto genech byl objeven polymorfismus podmíněný záměnou jedné báze nukleotidu (bodovou mutaci) v DNA. Ta tvoří přibližně 98% všech polymorfismů v DNA. Tyto markery poskytují informace o produkčních vlastnostech rostlin a zvířat a tím umožňují sledovat variabilitu genů v populacích (DVOŘÁK, 2001). SNP- single nukleotid polymorfismus SNP se v hojném počtu vyskytují téměř ve všech částech genomu organismu (v kódujících i nekódujících regionech) a poměrně rychle se z nich stávají markery 23

používané v populační genomice, evolučních analýzách a konzervační genetice. Vlastnostmi, které je k tomu předurčují jsou zejména efektivní genotypování, kvalita získaných dat a v neposlední řadě též cena daných metod. U většiny známých druhů se SNP obvykle vyskytují po každých 200-500 párů bází (MORIN et al., 2004); až 90% procent veškeré genové variability připadá na alelické varianty SNP, které se vyskytují s frekvencí větší než 1%. Nesynonymní SNP lokalizované uvnitř kódujících regionů lze považovat za kandidátní geny funkčních změn. Fenotypový efekt drtivé většiny SNP zatím není znám a může být odvozován pouze na základě evoluční dynamiky konkrétní alelové varianty nebo jejího vlivu na funkci daného proteinu. Poměr nesynonymních (dN) a synonymních (dS) SNP lze považovat za sílu selekce pro daný gen či celý genom. Je však pravdou, že i mezi produkty synonymních SNP mohou existovat mírné rozdíly. Jedna aminokyselina může být kódována více kodony, a přestože za předpokladu náhodné distribuce by se měly všechny takové varianty vyskytovat v přibližně stejném počtu, většinou tomu tak není. Z tohoto důvodu může mít SNP, který změní obvyklejší či preferovaný kodon za některou ze vzácnějších variant, vliv na syntézu či funkci výsledného proteinu a genovou expresi. Přestože většina SNP se objevuje v nekódujících částech genomu, některým je možno přiřadit zcela konkrétní funkci. Například substituce inzulínového růstového faktoru 2 (IGF2) a intronu má výrazný vliv na růst svaloviny prasat (VAN LAERE et al., 2003) a také ovlivňuje tloušťku hřbetního tuku u křížení druhů Meishan x Evropského bílého prasete (JUNGERIUS et al., 2004, DE KONING et al., 2000). Velké množství nekódujících oblastí genomu je u všech živočišných druhů konzervované, z čehož lze usuzovat, že selekce zasahuje do velké části genomu. SNP lze hodnotit s přihlédnutím k tomu, zda se nacházejí v konzervovaných či nekonzervovaných částech nekódujících oblastí genomu. Navíc byly pomocí srovnávacích a odhadových algoritmů vysvětleny regulační regiony genů (promotory, tlumiče, izolátory a místa vázající mitochondriální ribonukleová kyselina – mtRNA), což napomohlo určení regulačních nekódujících SNP. Například u SNP, jež se vyskytují na vazebných místech transkripčního faktoru určených pro navázání promotoru, existuje větší pravděpodobnost, že budou modifikovat funkci, než u SNP umístěných mimo regulační oblast genu (CLOP et al., 2006, HOUSTON et al., 2006). SNP mají dobrý předpoklad pro to, aby se staly mocným genetickým nástrojem, neboť na rozdíl od SSR a mtDNA poskytují kvalitnější data, nejsou příliš finančně nákladné a jsou schopny podat reprezentativní zprávu o větší části genomu. 24

5. 2

Molekulární metody vyhledávání genetických markerů Pomocí DNA markerů lze detekovat rozdíly v genetické informaci mezi

analyzovanými populacemi. DNA markery jsou založeny na polymorfismu sekvencí DNA a využívají se hlavně ke zjišťování otcovství, sledování genetické mapy, populační genetiky a při studiu evoluce na molekulární úrovni. Sledování molekulárních markerů je možné provádět u všech organismů, u kterých je známá technika izolace DNA. Molekulární markery jsou výhodné z fyzikálního hlediska, neboť molekula DNA je vysoce stabilní a proto je izolace DNA možná nejen z živých tkání (CANO et al.,1993), ale také in vitro. Na analýzu je třeba jen malé množství DNA, proto lze metodu použít u již velmi raných ontogenetických stádií, což znamená zefektivnění rychlosti práce především ve šlechtitelské oblasti. Princip molekulárních markerů je založený na: 1. specifickém restrikčním štěpení analyzované DNA a následné hybridizaci se značenou sondou 2. amplifikaci specifických fragmentů v in vitro podmínkách 3. na různých kombinacích restrikčního štěpení, hybridizace a amplifikace.

5. 2. 1 Metody detekce molekulárních markerů založené na restrikčním štěpení a hybridizaci RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism – polymorfismus délky restrikčních fragmentů RFLP patří mezi historicky nejstarší DNA markery. Pro rozvoj této metody byl nutným předpokladem první objev restrikčních enzymů (SMITH, WILCOX, 1970) a druhý objev přenosu elektroforeticky separované DNA z gelu na membránu – metoda Southern blot (SOUTHERN, 1975). Metoda RFLP využívá délkového polymorfismu restrikčních fragmentů analyzované DNA, který je po nitrocelulózovou membránu) detekován pomocí hybridizace s homologním fragmentem provedení elektroforetické separace a přenosu fragmentů z gelu na pevný nosič (nylonovou nebo DNA – specifickou sondou. RFLP markery na jaderné DNA vykazují kodominanci a jsou využívány pro genetické analýzy určování otcovství tzv. „fingerprinting“ a pro tvorbu genetických map

25

významných hospodářsky využitelných plodin. Širšímu využití RFLP na nukleární DNA ve fylogenetických studiích většinou brání pracnost, časová a finanční náročnost těchto metod (BACHMAN, 1992).

5. 2. 2 Metody detekce molekulárních markerů založené na metodě PCR PCR Polymerase Chain Reaction – polymerázová řetězová reakce PCR reakce byla vyvinuta v Cetus Corporation Emeryville v Kalifornii. Jde o enzymatickou amplifikaci DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (SAIKI et al., 1985, SAIKI et al., 1988). PCR-SPLAT (PCR-STS) Specific Polymorphic Locus Amplification Test – amplifikace specific. polymorfního lokusu (Single Tagged Site – amplifikace jednoho cílového místa) Jde o standardní PCR, kdy pomocí dvojice specifických primerů je nareplikován určitý fragment – lokus (URL 1). RT-PCR Reverse Transcription PCR – reverzní (zpětná) polymerázová reakce Jde o modifikovaný postup PCR určený pro amplifikaci molekul RNA. V prvním kroku je molekula RNA přepsána – reverzně transkribována pomocí reverzní transkriptázy na molekulu kompelmentární DNA (cDNA). Molekula cDNA je poté použita jako templát následné PCR (URL 1). Real Time – PCR Amplifikace probíhá obvyklým způsobem jako standardní PCR, avšak reakční směs obsahuje kromě dvojice primerů ještě specifickou vnitřní sondu (TaqMan sonda), která je fluorescenčně značená na 3’ konci tzv. zhášečem a na 5’ konci tzv. reportérem. (OVESNÁ, DRAŠNAROVÁ, 2001).

26

RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA – polymorfismus náhodně amplifikované DNA Časově a na vybavení laboratoře méně náročná metoda. Princip je založen na amplifikací fragmentů DNA za použití pouze jednoho oligonukleotidového primeru. Primery mají obvykle délku 10 bází (náhodně vybraných s ohledem na zastoupení jednotlivých bází – vyrovnaný poměr C:G). Krátká délka motivu a výrazně nižší teplota annealingu (35-38 oC) zvyšují pravděpodobnost nasednutí primeru na mnoha místech molekuly DNA (primery jsou tzv. nespecifické). Produkty amplifikace mohou odpovídat oblastem geneticky aktivní templátové DNA, stejně tak mohou odpovídat opakujícím se motivům. Amplifikované produkty jsou většinou elektroforeticky separovány na agarózovém gelu. Vizualizace se provádí pomocí etidium bromidu, přičemž pruhy na gelu jsou chápány jako fenotypová data přítomen/nepřítomen (1/0) (EXCOFFIER et al., 1992).

5. 2. 3 Metody detekce molekulárních markerů založené na různých kombinacích restrikčního štěpení, hybridizace a amplifikace I-PCR Inverse PCR – inverzní PCR Tento postup je používán pro amplifikaci fragmentů DNA s neznámou sekvencí, která je ohraničena známými sekvencemi. Metoda je založena na restrikčním štěpení známé sekvence, které umožní tvorbu kohezních konců. Druhým krokem je vytvoření cirkulární molekuly. Amplifikace je zahájena protisměrným připojením primerů ke známé sekvenci v cirkulární molekule. Tímto způsobem je zajištěna amplifikace vnitřního úseku cirkulární molekuly.

In situ – PCR Amplifikace DNA probíhá přímo v buňkách nebo cytologických preparátech. Produkt amplifikace je následně detekován hybridizací se specifickou sondou nebo s využitím imunochemických metod. Oproti standardně používané hybridizaci in situ je tento

27

postup mnohonásobně citlivější. Na principu in situ-PCR jsou obvykle založeny tzv. bio-čipy (URL 1).

CAPS (PCR-RFLP) Cleaved Amplified Polymorhic Sequence – délkový polymorfismus restrikčně štěpené amplifikované DNA Metoda CAPS v sobě zahrnuje spojení dvou postupů: PCR a RFLP. Úvodním krokem je amplifikace PCR markeru. Po následném rozštěpení restrikční endonukleázou jsou fragmenty elektroforeticky separovány na gelu. Díky bodovým mutacím lze odlišit dominantní a recesivní alely studovaných genů/mezigenových regionů.

VNTR Variable Number Tandem Repeats – variabilita v počtu tandemových opakování Opakující se sekvence obvykle čítá 15 – 100 párů bází a může se nacházet vně i uvnitř genů. Tyto motivy se velmi často objevují v nekódujících oblastech genomu v těsné vazbě se strukturními geny. Podle délky motivu a počtu opakování lze tyto oblasti rozdělit na: 1. satelity – oblasti 103-107 nukleotidů dlouhé, délka motivu 100 a více nukleotidů, 2. minisatelity – 102-105 dlouhé úseky, motiv sestávající z 10-100 nukleotidů, 3. mikrosatelity – délka do 102 nukleotidů, motiv 2-6 nukleotidů (CHAMBERS, MACAVOY, 2000)

Microsatellites (SSRs nebo STRs) Simple Sequence Repeats = Short Tandem Repeats – tandemová opakování krátkých motivů Mikrosatelity jsou sekvence DNA složené z mnohokrát se opakujících motivů. Délka motivu je 2-, 3-, 4- nebo 6-bazí (např. motivy (CA)n, (CAA)n). Celková délka lokusu obvykle nepřesahuje 100 párů bází (bp). Mikrosatelitové lokusy patří mezi nejvariabilnější oblasti genomu; jejich polymorfismus je dán zejména rozdílem v počtu opakování základního motivu (n), což je patrně způsobeno zejména „klouzáním“ DNA polymerázy během replikace (tzv. replication slippage) a také změnami sekvencí v okolí mikrosatelitového lokusu. Mikrosatelitové markery jsou kodominantní. Pokud známe sekvence primerů, jde o relativně levnou, časově a na laboratorní vybavení nenáročnou metodu. Bohužel, 28

pro většinu organismů žijících v přírodních populací jsou sekvence primerů zatím neznámé. Některé mikrosatelitové lokusy však leží v těsné blízkosti kódujících oblastí, nebo jsou přímo jejich součástí, a proto jsou velmi konzervované. Podle mnoha současných prací (PRIMMER et al., 1999) se zdá, že takovýchto konzervovaných mikrosatelitových lokusů existuje mnohem více, než se původně myslelo. Logika věci však napovídá, že čím bude daná oblast konzervovanější, tím menší polymorfismus bude vykazovat. Při studiích nového druhu lze vždy nejprve vyzkoušet tzv. crosstaxa/species amplifikaci, kdy jsou použity známé primery z jiného, již prozkoumného druhu (samozřejmě fylogeneticky co nejpříbuznějšího). Získání nových mikrosatelitových lokusů je bohužel pracné a časově i finančně náročné. Provádí se izolací mikrosatelitů z genomových knihoven a zahrnuje tyto kroky: 1. konstrukce genomové knihovny 2. detekce pozitivních klonů pomocí hybridizace s mikrosatelitovou sondou 3. sekvenování pozitivních klonů 4. navržení primerů pro amplifikaci mikrosatelitových lokusů 5. testování primerů

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism – délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů Princip je založen na selektivní amplifikaci restrikčních fragmentů celého genomu. Postup se skládá ze tří základních kroků: 1. rozštěpení genomické DNA na fragmenty, na něž se naligují adaptory 2. selektivní amplifikace fragmentů pomocí speciálních primerů 3. elektroforéza produktů a počítačová analýza (PERKIN, 1995). AFLP je velice výkonná metoda, pomocí níž lze za velmi krátký čas zmapovat velké množství nových markerů. Má mnoho výhod: je založená na PCR, dá se zautomatizovat, je neradioaktivní, není třeba znát žádné cílové sekvence studovaného organismu, výsledky jsou dobře reprodukovatelné a spolehlivé. Problémem je však jejich kodominantní charakter.

29

6 GENETICKÁ VARIABILITA Genetická diverzita, jež je u domestikovaných druhů přítomna, umožňuje zemědělcům vyvíjet nové vlastnosti zvířat tak, aby byla schopna se přizpůsobit vnějším podmínkám, chorobám a požadavkům trhu. Původní plemena jsou často nositeli takových genových kombinací a adaptací (odolnost proti chorobám, adaptace na špatné podmínky či nekvalitní krmivo), které u nověji vzniklých druhů nelze nalézt (MAUDET et al., 2002) V populaci neexistují dva geneticky shodní jedinci. Proto bylo zapotřebí začít zkoumat genetickou strukturu populací, její změny z generace na generaci, zdokumentovat přírodní genetickou rozmanitost, která má základ v evoluci. Samotná existence genetické variace je jednou z podmínek evoluce. Přímou souvislost mezi genetickou variací a rychlostí evoluce při působení přírodního výběru matematicky formuloval FISHER (1930). Uvedl v praxi teorii o rychlosti vzrůstu adaptivní hodnoty populace. Adaptivní hodnota populace v jakémkoli čase je rovna genetické variaci adaptivní hodnoty v tomtéž čase. Zkušební údaje je možno získat cíleným křížením, přičemž pokud hodnota daného znaku stoupne ve směru výběru byl tento znak ovlivněn genetickou variací.

6. 1

Míra genetické variace Většina

užitkových

vlastností

hospodářských

zvířat

náleží

do

sféry

kvantitativních znaků, proto je oblast genetiky zabývající se problematikou kvantitativních znaků pro zootechniku a plemenářství velmi důležitá. Údaje o složkách geneticky

podmíněné

variability

mohou

být

dobrým

vodítkem

pro

volbu

nejvhodnějších selekčních postupů a odhad vzniklého selekčního efektu. Užitečné je rovněž sledování vazeb mezi genotypem a fenotypem – tedy jak se zásah do genomu živočicha projeví v jeho fenotypu. Některé kvalitativní znaky lze ze zootechnického hlediska označit za znaky pomocné. Jejich prostřednictvím lze například určovat míru homogenity dané populace a u konkrétních jedinců pak zjišťovat jejich čistokrevnost. Za tímto účelem se nejčastěji používají kodominantně děděné znaky jako jsou krevní skupiny a složky tělních

30

tekutin, jež lze určit pomocí elektroforézy (NEČÁSEK, 1979). Kvantitativními ukazateli, které umožňují mezi sebou srovnávat populace jsou polymorfismus a heterozygotnost. K hodnocení genetické variability bývá používáno mnoho metod, které jsou založené na genetickém polymorfismu. Genetický polymorfismus se vyznačuje existencí více než jedné alely v lokusu převyšující svým výskytem 1% v populaci. Variabilita či diverzita může být pozorována v oblasti biochemie či genetiky. Varianty jednoho proteinu či varianty jednoho genu (alely) mohou pro nositele varianty v rámci populace vytvářet výhodnější či nevýhodnější výchozí pozici pro adaptaci na změny prostředí. Pro určování genetické variace v populaci jsou polymorfizmy méně vhodné, neboť četnost alel, které obsahují se pohybují v širokém rozmezí (včetně velmi vzácných alel s nízkou četností). Proto byla stanovena kritéria, dle nichž je lokus považován za polymorfní pouze tehdy, kdy četnost nejrozšířenější alely daného lokusu nepřevyšuje 0,95. Tato hodnota však není pevně stanovena a použitím jiného kritéria může hodnota vzrůst na 0,99. Tudíž se mohou zdát polymorfními i lokusy, které se při použití jiného kritéria jeví jako monoformní. Hodnota 0,95 je pouze náhodně zvolená a slouží k zaměření na geny s běžnou variací genů.

6. 1. 1 Typy polymorfismu

Proteinový polymorfismus S nástupem molekulárních technik od zhruba 50. let byla odhalena obrovská úroveň polymorfismu v přírodních populacích (ZIMA et al., 2004). Pro kontrolní účely a ověřování původu zvířat byly v minulosti hojně používány krevní skupiny a biochemické polymorfní znaky jako složky tělních tekutin, jež bylo možno snadno určit na základě rozdílné elektroforetické pohyblivosti bílkovin (NEČÁSEK, 1979). V dnešní době se imunogenetické a biochemicko-genetické metody používají pro parentitu pouze v omezeném měřítku u skotu nebo u prasat. Ve 21. století velmi rychle nastupují poznatky molekulární biologie a genetiky a proto se i v kontrole parentity skotu, prasat a koní uplatňují DNA analýzy.

31

Polymorfismus na úrovni jaderné DNA U N jedinců byla objevena sekvence úseku DNA o celkové délce L. Nejjednodušším

odhadem

genetické

proměnlivosti

je

počet

segregujících

(polymorfních) míst NS, který vyjadřuje počet míst s odlišnými sekvencemi nukleotidů ve vzorku sekvencí. Je-li počet segregujících míst aplikován na délku fragmentu DNA, výchozí hodnotou je podíl segregujících míst na nukleotidové místo S = NS /L. Podíl očekávaných segregujících míst vyšetřené DNA ve vzorku velikosti N jedinců, označovaný jako nukleotidový polymorfismus, je dán vztahem

θ=

S N −1

1

∑i i =1

Především proměnná S je závislá na velikosti vzorku, při porovnání hodnot S mezi jednotlivými studiemi je dobré na tento fakt pamatovat a porovnávat například hodnoty odvozené z podobně velkých vzorků. Další statistikou odhadu polymorfismu DNA je průměrný počet rozdílných nukleotidů mezi dvěma sekvencemi DNA. V literatuře je tato proměnná známa jako

nukleotidová diverzita a bývá označována π. Při odhadu nukleotidové diverzity lze postupovat tak, že je nejdříve stanoven průměrný počet párových nukleotidových rozdílů podle vzorce: Π=

1 ∑ Π ij , [n(n − 1) / 2] i < j

kde n je počet sekvencí DNA ve vzorku a Πij je rozdíl mezi sekvencemi i a j (index sčítání i<j v praxi znamená, že je porovnávána první sekvence s druhou, třetí, čtvrtou až n-tou, poté druhá s třetí, čtvrtou až n-tou, atd.). Jmenovatel v prvním členu ve vzorci označuje celkový počet párových porovnání sekvencí n (n-1)/2. Standardizací průměrného počtu rozdílů Π přes celkovou délku sekvence DNA lze provést odhad

nukleotidové diverzity π = Π/L Za předpokladu, že páření jedinců v populaci je náhodné (panmiktické), nukleotidová diverzita je odhadem heterozygotnosti na molekulární úrovni.

32

Polymorfismus na úrovni mitochondriální DNA Při analýze mitochondriální DNA bývá často zjištěn větší počet typů mtDNA, označovaných jako haplotypy. Haplotyp je obecné označení chromosomu s jedinečnou kombinací znaků. Je-li k dispozici dostatečný počet jedinců ve vzorcích, pak vhodným testem je test dobré shody, v případě menšího počtu měření G-test nezávislosti.

Analýza polymorfismu mtDNA: problém malých vzorků Výše uvedené testy mají určité podmínky použití a z toho vyplývající omezení: 1. Počet jedinců ve většině polí (>80%) musí být větší než 5. 2. Pokud se některý haplotyp v určitém vzorku nevyskytuje, pak je jeho frekvence nulová a G-test nelze použít, neboť ln(0) není definován. S další možností, jak mohou být obě podmínky porušeny, se lze nejčastěji setkat právě u analýzy mtDNA. Důvodem je, že zatímco je ve většině případů ve vzorcích přítomen jeden obecně zastoupený haplotyp, v podrobně vyšetřených vzorcích lze zjistit přítomnost většího počtu jinak málo zastoupených haplotypů. Dříve se tento problém řešil tím, že se málo početně zastoupené haplotypy slučovaly do jedné třídy, dokud nebyl počet vzorků na buňku roven alespoň pěti (ZIMA et al., 2004).

6. 2

Metody analýzy genetické variability

6. 2. 1 Frekvence alely Pro srovnávání různých genů v populaci bývají užívány četnosti alel a relativní zastoupení alel v daném lokusu. Četnost alel lze vypočítat jako dvojnásobný počet genů homozygotních alel plus počet heterozygotů s touto alelou děleno dvojnásobkem celkového počtu jedinců ve vzorku (RELICHOVÁ, 1997). Za předpokladu, že ve vzorku populace se vyskytují jedinci s genotypy AA, Aa, aa četnost alely A nazveme p a četnost alely a q, přičemž p + q = 1. Odhad p p= (2AA+ Aa)/2n a odhad variability vzorku je Var (p) = p(1- p)/2n

33

6. 2. 2 Hardy-Weinbergova rovnováha Z frekvence alel v určitém lokusu lze snadno vypočíst i frekvenci jednotlivých genotypů v rovnovážném stavu. Ve velké panmiktické populaci, tj. v populaci, jejíž příslušníci se množí mezi sebou zcela náhodně, se tento rovnovážný stav ustaví během jediné generace (FLEGR, 2005). Předpoklady pro vytvoření modelu předpovědi genotypových četností lze shrnout do těchto bodů: 1) organismy jsou diploidní, 2) rozmnožování se děje pohlavní cestou, 3) generace se nepřekrývají, 4) oplození je náhodné, 5) migrace je zanedbatelná, 6) početnost populace je velmi velká, 7) mutace lze zanedbat, 8) na alely nepůsobí přírodní výběr.

Podle tohoto modelu lze v populaci stanovit genotypové četnosti pro gen se dvěma alelami. Tab. 1 Hardy-Weinbergova rovnováha křížení

četnost spojení 2

genotypové četnosti v potomstvu AA

Aa

aa

1

0

0

AA x AA

P

AA x Aa

2PQ

1

1

0

AA x aa

2PR

0

1

0

Aa x Aa

Q2

1

1

1

Aa x aa

2QR

0

1

1

aa x aa

R2

0

0

1

Celkem (v další generaci) P' Q' R' Přičemž P' = P2 + 2PQ/2 + Q2/4 = (P + Q/2)2 = p2 Q' = 2PQ/2 + 2PR + Q2/2 + 2QR/2 = 2(P + Q/2)(R + Q/2) = 2pq R' = Q2/4 + 2QR/2 + R2 = (R + Q/2)2 = q2

34

Genotypové četnosti AA, Aa a aa jsou označeny P, Q a R, přičemž: P+Q+R = 1 (RELICHOVÁ, 1997). Ze zákonitostí kombinatoriky lze odvodit, že v rovnovážném stavu se budou genotypy AA, Aa, aa vyskytovat v poměru p2 : 2pq : q2 (FLEGR, 2005).

6. 2. 3 Heterozygotnost Měřítkem intrapopulační genetické variability je heterozygotnost, která do určité míry vypovídá o stavu inbreedingu populace. Heterozygotnost lze definovat pro jedotlivé lokusy, pro dané jedince nebo i pro celou populaci. Heterozygotnost i- tého lokusu v dané populaci je podíl jedinců nesoucích různé alely v homologních chromozómech k celkovému počtu jedinců v populaci. Odhad heterozygotnosti i-tého lokusu lze napsat jako hi = nhi /n kde n je počet náhodně vybraných jedinců z dané populace a nhi je počet jedinců z celkového počtu n, kteří jsou heterozygotní na i-tém lokusu. Ačkoli výpočet heterozygotnosti vychází z genotypu, NEI (1973) počítá heterozygotnost na základě frekvencí alel. Přitom předpokládá, že populace je v Hardyho – Weinbergově rovnováze. hi = 1 - ∑ p2ij kde

pij je frekvence j-té alely na i-tém lokusu ni je počet alel na i-tém lokusu hi je pravděpodobnost, že dvě alely na jednom lokusu nebudou stejné =

heterozygotnost

6. 2. 4 Wrightovy F – statistiky Měří redukci heterozygotnosti jedince podmíněnou nenáhodným oplozením uvnitř té které subpopulace (ZIMA et al., 2004).

HI – pozorovaná heterozygotnost jedince v subpopulaci HS - očekávaná heterozygotnost jedince v subpopulaci za předpokladu náhodného páření

HT - očekávaná heterozygotnost jedince v celé populaci za předpokladu náhodného páření

35

Z genetické

analýzy je možno

zjistit

průměrnou

heterozygotnost

HX

u zkoumaného lokusu na úrovních S1 až S3. 1. Průměrná heterozygotnost je: k

HI = ∑ Hx k x =1

kde Hx je pozorovaná heterozygotnost v subpopulaci x 2. Očekávaná heterozygotnost v subpopulaci je j

H S = 1 − ∑ pi2, x i =1

kde pi,x2 je frekvence i-té alely v subpopulaci x. Tento vztah platí za předpokladu, že subpopulace x je v Hardyho-Weinbergově rovnováze. Sčítání funguje pro všechny alely i (od 1 po j) zjištěných na genu. Logicky v modelu pro jeden lokus a dvě alely bude j = 2. Průměr HS ze všech subpopulací je k

H S = ∑ HS k x =1

3. Je-li frekvence alely A v celé populaci p0 a alely a q0 pak očekávaná

heterozygotnost v celé populaci bude H T = 2 p0 q0

Základní rozdíl mezi Wrightovým a Neiovým modelem je právě ve výpočtu

průměrné očekávané heterozygotnosti v celé populaci. Zjevně v modelu pro více alel na lokusu je nutné použít obecnější vztah k výpočtu heterozygotnosti. Nechť je průměrná frekvence alely i v celé populaci definována jako k

pi =

∑ pi

k

x =1

Průměrnou očekávanou heterozygotnost v celé populaci lze vypočítat dle vztahu j

HT = 1− ∑ pi

2

i =1

Součty 2

jsou 2

přes

všechny

očekávané

2

( p1 , p 2 , p 3 , atd.)

36

frekvence

homozygotních

kombinací

4. Snížení heterozygotnosti jedince kvůli nenáhodnému páření v subpopulaci je možno odhadnout jako

FIS =

H S − HI HS

5. Vliv rozdělení populace na subpopulace a genetického driftu je možné odhadovat jako

FST =

HT − H S HT

6. Celkový koeficient inbreedingu FIT zahrnuje podíl nenáhodného páření v subpopulaci a vliv genetického driftu. FIT měří redukci heterozygotnosti jedince ve vztahu k celkové populaci:

FIT =

HT − H I HT

6. 2. 5 Genový tok Je předáváním genů mezi populacemi, nejčastěji prostřednictvím migrujících jedinců. Genový tok je velmi důležitým evolučním faktorem. V závislosti na své intenzitě a na struktuře populace příslušného druhu může evoluci buď urychlovat, nebo ji naopak výrazně zpomalovat. Genový tok se uplatňuje jak u pohyblivých organismů, tak u organismů, které se za celý život nehnou z místa, tedy u přisedlých živočichů a rostlin. Z hlediska genového toku je nejdůležitějším parametrem nikoliv vlastní pohyblivost jedinců v populaci příslušného druhu, tj. virgilita, ale migrace. Schopnost migrace určuje, jak jsou mezi sebou vzdálená místa, kde se určitý jedinec narodil a kde se narodí jeho potomci (FLEGR, 2005).

6. 2. 6 Efektivní počet alel Jedná se o počet alel se stejnou frekvencí, která by byla potřeba ke vzniku stejné homozygotnosti, jako ve skutečné populaci (NEI, 1973). Enzymy lišící se v důsledku alelových rozdílů na jednom lokusu elektroforetickou pohyblivostí jsou nazývány alozymy. Důkazem genetické variace je alozymová reakce. Efektivní velikost aktuální populace je počet jedinců teoreticky ideální populaci, která má stejnou velikost náhodného genetického driftu jako skutečná populace. 37

Existují 3 způsoby měření efektivní populace: 1) změna v pravděpodobnosti identity podle původu F-koeficient (inbrední efektivní velikost) 2) změna ve varianci frekvence alely (efektivní velikost variance) 3) stupeň ztráty heterozygotnosti (vlastní hodnota* efektivní velikosti) (HARTL, CLARK, 2007)

6. 2. 7 Shannonův index Shannonův index diverzity (H΄) je dalším indexem, který je často užíván pro charakterizování biodiverzity. Je založen na informační teorii a je mírou průměrného stupně „neurčitosti“ v předpovídání, k jakému druhu bude náležet jedinec, namátkou vybraný ze sbírky druhů S a jedinců N. Tato průměrná neurčitost se zvyšuje tím více,

čím více se zvyšuje počet druhů a čím více se stává distribuce jedinců mezi druhy rovnoměrnou. Shanonnův

index

má

dvě

vlastnosti,

které

z něj

dělají

oblíbenou

charakteristikou druhové diverzity: a) H' = 0 jestliže je ve vzorku pouze jeden druh, b) H' je maximum, pouze když všechny druhy S jsou reprezentované stejným počtem jedinců. Když jsou všechny druhy ve vzorku rovnoměrné zastoupené, je logické, že index „nestrannosti“ by měl být maximální s odchýlením relativního zastoupení druhů od stejnoměrného by měl klesat směrem k nule (MEERMAN, 2004). •

ni Počet jedinců v druh i; abundance druhu i.

•

S Celkový počet druhů. Též nazýváno druhová hojnost.

•

N Celkový počet všech jedinců

•

pi Relativní abundance každého z druhů, vypočítaná jako podíl jedinců určitého druhu z celkového počtu jedinců v celé komunitě:

S

H' = −∑pi ln pi i=1

*

eigenvalue

38

ni

N

Je dokázáno, že pro jakýkoliv daný počet druhů existuje maximální hodnota H' => Hmax (= lnS), která se vyskytuje v případě, že všechny druhy jsou stejně početně zastoupeny.

6. 2. 8 PIC - polymorfní informační systém Hodnota PIC je definována jako pravděpodobnost, že genotyp markeru daného potomka umožní vyvodit, kterou ze dvou alel markeru získal od konkrétního heterozygotního rodiče (při nepřítomnosti crossing-overu). Pro výpočet PIC lze využít vzorec dle BOTSTEIN (1980): k

2

PIC = 1 − ∑ xi i =1

2

k  k 2 4 −  ∑ xi  + ∑ xi  i=1  i =1

kde xi je frekvence i na daných lolusech

6. 2. 9 Genetické distance Genetická vzdálenost mezi dvěma populacemi je definována alelickými frekvencemi všech lokusů v genomu. Je téměř nemožné stanovit všechny alely u všech lokusů v populaci. Proto je třeba odhadnout genetickou vzdálenost pomocí vzorku určitého počtu jedinců z populace a stanovit určitý počet lokusů tak, aby byl vzorek reprezentativní. Existuje mnoho metod populační kvalifikace a určování vzdálenosti. Patří mezi ně Pearsonův koeficient rasových vzdáleností, Mahalanobisova D2 statistika, Sanghviho vzdálenost, vzdálenost dle Sokala a Sneatha, dle Cavalli- Sforzy a Edwardse a mnoho dalších. Jednou z nejpoužívanějších metod je Mahalanobisova D2 statistika:

− p )2 yij =∑ − p )/2 j =1 ( p xij yij ni

d

x 2i

(p

xij

kde je pxij a pyij je frekvence j-té alely na i-tém lokusu v populaci X a Y, míra dx2i nabývá hodnot od 0 do 4, n = počet alel.

39

6. 3

Výběr vhodné metody analýzy Odebrané vzorky musí být náhodně vybrané tak, aby nedocházelo k ovlivňování

výsledků vybíráním nadprůměrných či podprůměrných jedinců v populaci. Velikost porovnávaných skupin taktéž musí být stejná, jinak jsou dosažené výsledky negativně ovlivňovány. Na každou populaci neustále působí činitelé, kteří zajišťují změny jejího genového fondu. Jsou to jednak tzv. procesy systematické (migrace, mutace, selekce), jejichž účinky na genovou frekvenci (směr i velikost změny) lze do značné míry předvídat a dále procesy disperzivní, které nejčastěji vznikají při rozdělení velké populace na několik dílčích jednotek. Zde se uplatňuje variabilita volby, takže lze předvídat rozsah změny, její směr však nikoliv.

40

7 SOFTWARE PRO POPULAČNÍ GENOVOU ANALÝZU Softwary pro analýzy populací vyhodnocují genetická data populací. Jedním z jejich cílů je aplikací vhodných metody odhadnout vnitropopulační a mezipopulační genetickou strukturu analyzovaných (výběrových) vzorků. Logickým krokem je zjistit, jaké síly ovlivňují strukturu získaných dat a zda jsou zjištěná data v souladu s teoreticky očekávaným modelem. Od dob matematicko-statistického hodnocení štěpných poměrů hrachu uplynulo již více jak jedno století a tomu odpovídá i nárůst více sofistikovaných přístupů analýzy genetických dat. Ty jsou většinou uschovány v algoritmech nesčíslných statistických programů dostupných buď komerčně, nebo volně jako shareware (či freeware) na webových stránkách. Rozmanitost parametrů je výhodná pro uživatele, který je dostatečně seznámen s teorií a s výhodami a limitami použitých metod. V opačném případě může být uživatel alespoň částečně v rozpacích, který z uvedených parametrů použít. Statistické analýzy genetických dat vyžadují znalost jejich základních charakteristik (typ rozdělení, průměr a rozptyl dat v souboru), teoretických modelů (konstrukce nulových hypotéz nebo očekávaných frekvencí) a aplikaci vhodné statistické metody. V tomto úvodu je dobré si uvědomit, že genetická data nelze chápat jen jako soubor naměřených hodnot. K řešení problému je často nutno znát další informace o charakteru dat, např. o podílu genetické a negenetické složky, o způsobu dědičnosti studovaného znaku, vzniku nové proměnlivosti díky mutacím, rekombinaci nebo migraci. V nezměrném množství softwarů pro analýzu genetických populací je zde popsáno několik volně stažitelných programů. Principielně pracují všechny programy na stejné bázi.

41

7. 1

Software pro analýzy nukleotidových sekvencí Zde jsou popsány programy pro analýzy sekvencí DNA, které jsou k dispozici

na webových stránkách www.biology.isu.edu/general/software.html

1. COALESCE 1.5 BETA Odhadne efektivní velikosti populace s použitím nerekombinantních sekvencí; pracuje s modelem, který má jedinou populaci konstantní velikosti a odhaduje 4Nu, kde N je efektivní velikost populace a u je množství neutrálních mutací v daném místě.

2. DNASP 5 Jedná se o sadu programů pro analýzu nukleotidových polymorfizmů z uspořádaných dat DNA sekvencí. Software DNASP 5 je schopen provádět odhady sekvenčních variací DNA uvnitř populací i mezi nimi (v nekódujících, synonymních a nesynonymních místech, případně v různých kodonových pozicích). Dále software umí odhadnout nerovnováhu spojení, rekombinace, genový tok a parametry genové konverze a provádět testy neutrality. Výsledky analýz jsou zobrazovány v tabulce či grafické formě.

3. GENETREE 9 Unikátní program popisující mutační historii vzorku DNA sekvencí. Za předpokladu nerecidivujících mutací lze na základě výstupu z tohoto programu sestavit fylogenetický strom. Tyto kladogramy jsou vytvářeny na základě výpočtů maximální pravděpodobnosti mutace, intenzity migrací a populačního růstu. Software je také schopen určit čas rozdělení dvou poddruhů ze společného předka a přibližná období, kdy došlo k mutacím. Dalšími výhodami programu jsou například možnost určení, ve které subpopulaci se vyskytla mutace a jak byla celková populace geograficky rozložena.

4. PROSEQ 3 PROSEQ je program určený pro analýzu evolučních dat a editaci DNA sekvencí. Software byl navržen pro zjednodušení přípravy a analýzy DNA sekvenčních dat pro genetické, fylogenetické a molekulárně ekologické studie. Editor sekvencí umožňuje

42

také editaci chromatogramových jednotek, rozložení sekvencí v genomu, simulaci translace a další. Analytickými možnostmi programu jsou výpočty genové diversity, divergence, rozdělení populace do subpopulací a genový tok s testy významnosti založenými na permutacích. Několik druhů testu neutrality je samozřejmostí.

7. 2

Software pro analýzy variability alel a genotypů 1. ARLEQUIN 3.11 ARLEQUIN je sadou programů, jež zahrnuje několik základních i pokročilých

metod pro genetickou analýzu populačních dat. Ze schopností tohoto softwaru lze jmenovat: výpočet standardní genetické diversity, odhad výskytu konkrétních alel a haplotypů, odchylky od selekční neutrality a demografické rovnováhy, provádění testů pro zjištění odchylek od rovnováhy spojení a celkovou analýzu rozdělení populace na mnoho subpopulací. Verze 3.11 disponuje oproti svým předchůdcům kvalitnější analýzou vstupních dat a také dvěma nově zakomponovanými metodami; Bayesiánským odhadem gametické fáze z multi-lokusových genotypů a odhadem parametrů momentální prostorové expanze DNA sekvenčního polymorfizmu. ARLEQUIN je schopen pracovat s několika typy vstupních dat; s DNA sekvencemi, s daty mikrosatelitů, případně se standardními daty vícelokusových genotypů.

2. GENEPOP 4.0 Jedná se o program, který je schopen provádět testy Hardyho-Weinbergovy rovnováhy, populační diferenciace a genotypové nerovnováhy mezi jednotlivými páry lokusů. Software také provádí odhady F-statistiky, výskytu nefunkčních alel (alel v intronu) a počtu imigrantů do dané populace. Dalšími možnostmi jsou rozbor izolace dané populace na základě srovnávání jednotlivců či vzorků populací.

3. POPGENE 1.32 POPGENE je freewarový počítačový program určený k analýze genetických variací uvnitř populací i mezi nimi za použití kodominantních a dominantních markerů. 43

Současná verze programu se zaměřuje zejména na práci s daty diploidních a haploidních genomů. Software

je

schopen

zpracovávat

jak

podrobné

genetické

statistiky

(frekventovanost alel, diverzita genů, genetický odstup, G- a F-statistika), tak i statistiky komplexní (genový tok, testy neutrality, nerovnováha spojení, multilokusová struktura). Zdrojová data programu jsou limitována těmito maximálními hodnotami: 1400 populací, 150 skupin, 1000 lokusů a 52 alelami v jednom lokusu pro alelová data.

7. 3

Fylogenetický software PHYLIP 3.68 Jedná se o balíček programů pro vytváření kladogramů (fylogenetických

vývojových stromů). V užitých metodách výpočtů je zahrnuta úspornost systémových zdrojů, vzdálenostní matice a metody ověřování shody. Program je uživatelem kontrolován pomocí menu, kde lze nastavit parametry potřebné pro žádaný výpočet a ten poté zahájit. Zdrojová data jsou načítána z prostého textového souboru, jiné typy souborů nemohou být zpracovány. PHYLIP je zřejmě nejvíce rozšířeným fylogenetickým softwarem. Jedná se o třetí nejcitovanější program v oblasti.

Jelikož je ARLEQUIN jedním z často používaných softwarů pro populační analýzu alel, bude zde k němu napsáno několik základních faktů. Jedná se o komplexní balíček programů, který je schopen provádět mnoho druhů analýz a být tak užitečným pomocníkem při zjišťování genetických vlastností populací. S jeho pomocí je možno zjistit celou řadu aspektů. ARLEQUIN 3.11 je freewarový program u něž existuje mnoho verzí a neustále se pracuje na verzích nových.

44

7. 4

Arlequin 3.11 ARLEQUIN 3.11 je balíčkem aplikací, jehož cílem je poskytnout běžnému

uživateli možnost provádět statistické testy na základě dat získaných z konkrétní populace. Tento software pochází ze Švýcarska, byl vytvořen kolektivem autorů seskupených na Bernské univerzitě kolem EXCOFFIER (1998-2007). Jméno programu má původ v italské „Commedia dell'Arte“ (v překladu „Komedie profesionálních herců), což byla divadelní hra s ustálenými charaktery postav, jež se objevovaly v každém představení. Jednou z takových postav byl „Arlecchino“, jenž se ve hře vždy vyznačoval tím, že byl sluhou jednoho z pánů a obvykle velmi oblíbený u publika. Jeho hlavními znaky byly černá škraboška a pestrobarevný kostkovaný kostým, z nějž byla odvozena ikona tohoto programu.

Filosofie programu Tvůrci softwaru si předsevzali myšlenku řečenou výše – jedná se o snahu umožnit běžnému uživateli provádění statistických testů populační genetiky za účelem zjišťování genetických či demografických ze vzorku populace. Mezi přednosti ARLEQUINU 3.11 patří příznivé uživatelské rozhraní, které umožňuje jednoduché nastavení analýz, jež mají být se vzorkem provedeny, mnoho typů

dat,

s nimiž

je

program

schopen

pracovat

a v neposlední

řadě

také

optimalizovanost, která i při velké spolehlivosti a robustnosti prováděných výpočtů zajišťuje přijatelné hardwarové nároky. Program je k dispozici zdarma na adrese: http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3.

Data, s nimiž program pracuje 1. DNA sekvence ARLEQUIN 3.11 je schopen pracovat s DNA sekvencemi o libovolné délce. Každý nukleotid je považován za oddělený lokus. Nukleotidy C, T, A a G jsou u každého lokusu považovány za jednoznačné a pomlčka značí lokus, který podlehl deleci. Neznámé nukleotidy jsou obvykle označeny otazníkem.

2. RFLP data Program podporuje také RFLP haplotypy o libovolné délce. Každé místo restrikce vymezuje nový lokus. Přítomnost restrikčního místa je kódována číslicí „1“,

45

jeho absence naopak symbolem „0“. Pakliže restrikční místo prošlo delecí, je použit symbol pomlčky.

3. Data mikrosatelitů Data jsou zde reprezentována alelami jednoho či libovolného množství mikrosatelitových lokusů. Je třeba mít určen počet opakování sekvence mikrosatelitu, pro alelovou definici každého lokusu, pokud mají být data podrobena analýze dle modelu postupné mutace (slouží ke zjištění genetické struktury). Může nastat situace, kdy je absolutní počet opakování neznámou veličinou, v takovém případě může jako reference sloužit minimální délka amplifikovaného produktu. K tomu však musí být splněna podmínka, že rozdíly v délce amplifikovaných produktů jsou důsledkem změny počtu opakování. Pokud tomu tak není, nelze model s postupnou mutací použít k analýze daného vzorku.

4. Standardní data Jedná se o data, pro něž není definován molekulární základ polymorfizmu, nebo jsou-li dvě různé alely stejné ve svém mutačním účinku. U tohoto typu haplotypových dat je tedy porovnáván obsah každého jednotlivého lokusu, přičemž není brán v úvahu původ daných alel, který může být rozdílný.

5. Frekventovanost alel Základní data sestávají pouze z frekventovanosti alel, není tedy třeba znát žádná haplotypová data. Vzorky z daných populací jsou porovnávány lokus po lokusu.

Metody obsažené v Arlequinu Analýzy prováděné softwarem ARLEQUIN 3.11 lze rozdělit do dvou hlavních katogorií populační a mezipopulační. U první kategorie je genetická informace získávána z každé populace zvlášť (tedy nezávisle), zatímco v druhém případě jsou získaná data porovnávána.

46

Tab č. 2 Seznam analýz prováděných softwarem ARLEQUIN 3.11:

Populační metoda

Popis metody

Standardní ukazatele

Počet polymorfismů, genová diverzita

Molekulární diverzita

Vypočítává několik údajů jako je například diverzita nukleotidů a rozdílné odhady populačního parametru θ

Rozmístění nepárových míst

Výskyt

a rozmístění

haplotypy,

z nichž

párových lze

rozdílů

odhadnout

mezi

parametry

demografické či prostorové expanze populace Odhad četnosti haplotypů

Odhad četnosti výskytu haplotypů v dané populaci metodami maximální podobnosti

Nerovnováha spojení

Test nenáhodného párování alel rozdílných lokusů

Hardy-Weinbergova rovnováha

Test nenáhodného párování alel v diploidních jedincích

Tajimův test neutrality

Test selekční neutrality náhodného vzorku DNA sekvencí či RFLP haplotypů

Fuův test neutrality

Test selekční neutrality náhodného vzorku DNA sekvencí či RFLP haplotypů

Ewens-Wattersonův

test Testy selekční neutrality založené na Ewensově

neutrality

vzorkovací teorii

Chakrabortyův slučovací test

Test selekční neutrality a populační homogenity. Tato metoda může být použita, očekáváme-li heterogenitu vzorku

Minimální větvení sítě

Vypočítavá minimální větvení stromu a sítě mezi haplotypy. Tento strom může být pro všechny haplotypy

různých

populací

provádění analýzy AMOVA

47

vypočítáván

při

Mezipopulační metoda

Popis metody

Vyhledání sdílených haplotypů

Srovnání

haplotypového obsahu vzorků populací.

Výsledky jsou shrnuty do tabulky AMOVA

Rozdílné analýzy molekulárních odchylek za účelem hodnocení genetické struktury populace

Genetická vzdálenost párů

Analýza genetické vzdálenosti na bázi FST

Exaktní test diferenciace populace

Test nenáhodných distribucí haplotypů do vzorků populací

Přiřazovací test genotypů

Přiřazování jednotlivých genotypů určitým populacím dle očekáváných frekventovaností alel

48

8

ZÁVĚR Velmi důležitou roli v genetice populací a ve studiu diversity v populacích hrají

polymorfismy. Pro většinu polymorfismů je důležité mít v genotypu dvě a více alel. Jsou to

polymorfismy dědičné, pomocí nichž je možno sledovat průběh evoluce

a různé evoluční činitele. Pomocí genetických markerů, jež jsou založeny na polymorfismu DNA, se sledují vybrané geny pro užitkovost. Díky snadné zjistitelnosti a známému přenosu genetické informace jsou genetické markery vhodným kandidátem pro sledování znaků produkce a kvality užitkových vlastností nejen za života zvířete, ale v jeho mládí, případně po jeho smrti. Pro detekci genetických markerů se používají metody analýzy DNA a následné hybridizace se značenou sondou založené různých kombinacích restrikčního štěpení, hybridizace a amplifikace. Výsledky dosažené detekcí genetických markerů a jejich analýza za použití vhodných statistických vyhodnocení mohou být dobrým vodítkem pro volbu nejvhodnějších selekčních postupů, odhad vzniklého selekčního efektu a zachování přiměřené genetické variability v populacích hospodářských zvířat. Pro ucelení získaných dat bylo vyvinuto mnoho softwarů pro analýzu genetických dat aplikací nejvhodnější metody pro výzkum dané problematiky a správného zařazení výběrových vzorků. Jejich výběr záleží na specifičnosti dat, zkušenosti výzkumníka a jeho volby vhodného softwaru.

49

9

SEZNAM LITERATURY

AQUADRO C.F., BEGUN D.J., KINDDAHL E.C., Selection, recombination, and DNA polymorphismin Drosophila. In: GOLDING B., Non – neutral evolution Theories and molecular data. Chaptman and Hall, New York, 1994;46- 56.

BACHMAN K. Nuclear DNA markers in angiosperm taxonomy. Acta Botanica Neerlandica 1992; 39: 369-384.

BOTSTEIN D., WHITE R.L., SKOLNICK M., DAVIS R.W., Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Genetics 1980; 32: 314–331.

BRAVERMAN J.M, HUDSON R.R., KAPLAN N.L., LANGLEY C.H., STEPHAN W., The hitchhiking effect on the site frequency spectrum of DNA polymorphisms, Genetics 1995; 140: 783- 796.

BRUFORD M.W., BRADLEY D.G., LUIKART G., DNA markers reveal the complexity of livestock domestication. Nat Rev Genet. 2003; 4(11): 900-910.

CANO R.J., POINAR H.N., PIENIAZEK N.J., ACRA A.

A

POINAR JR., G.O., Amplification

and sequencing of DNA. Nature 1993; 363: 536-538.

CLOP A., MARCQ F., TAKEDA H., A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep. Nat Genet. 2006; 38(7):813-818.

CUMINGS M. R., KLUG W. S., Genetics: A Molecular perspective, Prentice Hall 2003, 683 s. DARWIN C., The Variation of Animals and Plants Under Domestication 1st ed. London, 1868.

50

DE

KONING D.J., RATTINK A.P., HARLIZIUS B.,

VAN

ARENDONK J.A., BRASCAMP E.W.,

GROENEN M.A., Genome-wide scan for body composition in pigs reveals important role of imprinting. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97(14): 7947-7950.

DVOŘÁK J., VRTKOVÁ I., Malá genetika prasat II., MZLU v Brně, 2001, 91 s.

EXCOFFIER L., SMOUSE P.E.

A

QUATTRO J.M., Analysis of molecular variance inferred

from metric distances among DNA haplotypes; application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 1992; 131: 479-491.

EXCOFFIER, L. G. LAVAL, and S. SCHNEIDER, Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics 2005, Online 1:47-50.

FISHER R.A., The genetical theory of natural selection. Dover Publications, New York, 1958. FLEGR J., Evoluční biologie, Academica 2005, 513 s.

GIUFFRA E, KIJAS JM, AMARGER V, CARLBORG O, JEON JT, ANDERSSON L., The origin of the domestic pig: Independent domestication and subsequent introgression. Genetics 2000; 154(4):1785-1791.

HARTL D. L., CLARK A. G., Principles of population genetics. Sinauer Associates, Fourth Ed., 2007, 652.

HIRSH A.E., FRASER H.B., Protein dispensability and rate of evolucin. Nature 2001; 441: 1046- 1049.

HOUSTON R.D., HALEY C.S., ARCHIBALD A.L., CAMERON N.D., PLASTOW G.S., RANCE K.A., A polymorphism in the 5'-untranslated region of the porcine cholecystokinin type a receptor gene affects feed intake and growth. Genetics 2006; 174(3):1555-1563.

CHAMBERS G.K.

A

MACAVOY E.S., Microsatellites: consensus and controversy.

Comparative Biochemistry and Physiology Part B 2000; 126: 455-476. 51

CHEN K., BAXTER T., MUIR W., GROENEN M., SCHOOK L., Genetic resources, genome mapping and evolutionary genomics of the pig (Sus scrofa). Int J Biol Sci. 2007; 3:153– 165.

JONES G.F., Genetic aspects of domestication, common breeds and their origin. In: ROTSCHILD M.F, RUVINSKY A., eds. The Genetic of the pig. Oxon, UK: CAB International 1998: 7-50.

JUNGERIUS B.J.,

VAN

LAERE A.S., TE PAS M.F.,

VAN

OOST B.A., ANDERSSON L.,

GROENEN M.A., The IGF2-intron3-G3072 A substitution explains a major imprinted QTL effect on backfat thickness in a meishan x european white pig intercross. Genet Res. 2004; 84(2):95-101.

KIMURA M., Retrospective of the last quarter century of the neutral theory. Jpn. J. Genet. 1993; 68: 521- 528.

KRAWCZAK M., REISS J., COOPER D.N., The mutational spectrum of single base-pair substitutions in mRNA splice junctions of human genes: Causes and consequences. Hum Genet. 1992; 90(1-2):41-54.

LEWOTIN R.C., The genetic basis of evolutionary change. Columbia University Press, New York 1974.

LOPEZ A.J., Alternative splicing of pre-mRNA: Developmental consequences and mechanisms of regulation. Annu Rev Genet. 1998; 32:279-305.

LOPEZ-BIGAS N., AUDIT B., OUZOUNIS C., PARRA G., GUIGO R., Are splicing mutations the most frequent cause of hereditary disease? FEBS Lett. 2005; 579(9):1900-1903.

MAUDET C., LUIKART G., TABERLET P., Genetic diversity and assignment tests among seven French cattle breeds based on microsatellite DNA analysis. J. Anim. Sci. 2002; 80: 942–950.

52

MODREK B, LEE C., A genomic view of alternative splicing. Nat Genet. 2002; 30(1):1319.

MODREK B., LEE C.J., Alternative splicing in the human, mouse and rat genomes is associated with an increased frequency of exon creation and/or loss. Nat Genet. 2003; 34(2):177-180.

MORIN P.A., LUIKART G., WAYNE R.K., the SNP workshop group - SNPs in ecology, evolution and conservation. Trends Ecol Evol. 2004; 19(4):208-216.

NEČÁSEK J., Úvod do genetiky, SPN Praha, 1979, 564 s.

NEI M., Analysis of Gene Diversity in Subdivided Populations. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1973; 70:3321-3323.

NEVO E., FILIPPUCCI M.G., BEILES A., Genetic polymorphisms in subterranean mammals in the Near East revisited: Patterns and theory. Heredity 1994; 72: 465- 487.

NIELSEN R., Molecular signatures of natural selection. Annu Rev. Genet. 2005; 39:197218.

OVESNÁ J.

A

DRAŠNAROVÁ Z., Identifikace transgenů v rostlinách, semenech

a odvozených produktech. Osivo a sadba – V. odborný a vědecký seminář, Praha, 2001. PERKIN ELMER (1995) AFLPTM Plant mapping kit protokol (P/N 402083).

PRIMMER C.R., MOLER A.P.

A

ELLEGREN H., A wide-range survey of cross-species

microsatellite amplification in birds. Molecular Ecology 1999; 5: 365-378.

RELICHOVÁ J., Genetika populací, Masarykova universita v Brně 1997, 175 s.

RUANE J., A critical review of the value of genetic distance studies in conservation of animal genetic resources. J Ani Breed Genet. 1999; 116:317-323.

53

SAIKI R.K., GEFFAND D.H., STOFFEL S., SCHARF S.J., HIGUCHI R., HORN G.T., MULLIS K.B.,

A

ERLICH H.A., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with

thermostable DNA-polymerase. Science 1988; 239: 487-491.

SAIKI R.K., SCHARF S., FALOONA F., MULLIS K.B., HORN G.T., ERLICH H.A. A

ARNHEIM N., Enzymatics amplification of β-globin genomic sequences and

restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia. Science 1985; 230: 13501354.

SMITH H.H.

A

WILCOX K., Restriction endonuclease from Haemophilus influenzae.

Jornal of Molecular Biology 1970; 51: 379-391.

SOUTHERN E.M., Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Jornal of Molecular Biology 1975; 503-517.

TAKAHATA N., Neutral theory of molecula evolutin. Curr.Opin. Genet. Develop. 1996; 6: 776- 772. THANARAJ T.A, CLARK F., MUILU J., Conservation of human alternative splice events in mouse. Nucleic Acids Res. 2003; 31(10):2544-2552.

THANARAJ T.A., STAMM S., CLARK F., RIETHOVEN J.J., LE TEXIER V., MUILU J., ASD: The alternative splicing database. Nucleic Acids Res. 2004; 32:D64-9.

VAN LAERE A.S., NGUYEN M., BRAUNSCHWEIG M., A regulatory mutation in IGF2 causes a major QTL effect on muscle growth in the pig. Nature 2003; 425(6960):832836.

WILIAMS G.C., Sex and evolution, Princeton University, Princeton 1975.

XING Y, LEE C., Alternative splicing and RNA selection pressure - evolutionary consequences for eukaryotic genomes. Nat Rev Genet. 2006; 7(7):499-509.

54

ZHANG Y., XIAO-XIA WANG , RYDER O.A., LI H., ZHANG H., YONG Y., WANG P., Genetic diversity and conservation of endangered animal species. Pure Appl. Chem. 2002; 74 (4): 575–584.

ZIMA J., MACHOLÁN M., MUNCLINGER P., PIÁLEK Z., Genetické metody v zoologii, nakladatelství Karolinum, Praha, 2004.

URL 1: < http://www.eamos.cz/amos/bc/externi/bc_154/Markery_Milena.doc > [cit. 2009- 4-1]

URL 2: < http://www.biology.lsu.edu/general/software.html > [cit. 2009- 4- 4]

55

10

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

AA - genotyp domimantní homozygot Aa - genotyp heterozygotní aa - genotyp recesivní homozygot AFLP - délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů (Amplified Fragment Length Polymorphism)

bp - pár bází, označuje velikost molekuly DNA (Base Pair) CAPS - délkový polymorfismus restrikčně štěpené amplifikované DNA (Cleaved Amplified Polymorhic Sequence)

cDNA - komplementární DNA dN SNP - nesynonymní SNP DNA - deoxyribonukleová kyselina dS SNP - symonymní SNP dx2i - genetická distance FIS - snížení heterozygotnosti jedince FTI - celkový koeficient inbreedingu FTS - vliv rozdělení populace na subpopulace a genetického driftu H´ - Shannonův index diversity hi - heterozygotnost HI - pozorovaná (průměrná) heterozygotnost jedince v subpopulaci HS - očekávaná heterozygotnost jedince v subpopulaci za předpokladu náhodného páření

HT - očekávaná heterozygotnost jedince v celé populaci za předpokladu náhodného páření

IGF2 - inzulínového růstového faktoru 2 (Insuline Growth Factor 2) I-PCR - inverzní PCR (Inverse PCR) lac operon - regulační gen LD marker - marker ve vazebné nerovnováze (Linkage Disequilibrum markers) LE marker - markec ve vazebné rovnováze (Linkage Equilibrum markers) mtDNA - mitochondriální DNA mtRNA - mitochondriální RNA PCR - polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction) 56

PCR-SPLAT - amplifikace specific. polymorfního lokusu (Specific Polymorphic Locus Amplification Test)

PCR-STS - amplifikace jednoho cílového místa (Single Tagged Site) PIC - polymorfní informační systém QTL - lokusy kvantitativních znaků (Quantitative Trait Locus) RAPD - polymorfismus náhodně amplifikované DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

RFLP - polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RNA - ribonukleová kyselina RT-PCR - reverzní (zpětná) polymerázová reakce (Reverse Transcription PCR) SNP - jednonukleotidové polymorfismy (Single Nukleotid Polymorphism) SSRs, STRs - tandemová opakování krátkých motivů (Simple Sequence Repeats, Short Tandem Repeats)

UV záření - ultrafialové záření VNTR - variabilita v počtu tandemových opakování (Variable Number Tandem Repeats)

θ - nukleotidový polymorfismus π - nukleotidová diversita

57