Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Detekce polymorfizmu genu KIT a jeho vztah ke zbarvení u koní Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

doc. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.

Pavla Chalupová

Brno 2008

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Detekce polymorfizmu genu KIT a jeho vztah ke zbarvení u koní vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

dne………………………………………. podpis diplomanta……………………….

PODĚKOVÁNÍ Ráda

bych

na

tomto

místě

poděkovala

především

svému

školiteli,

doc. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za trpělivost, cenné odborné připomínky a příkladné vedení mé diplomové práce. Dále Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D. za praktické rady při práci v laboratoři a doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za ochotu a laskavou pomoc. Za další nápady a rady děkuji Mgr. Heleně Gilíkové, Ph.D. a svojí sestře Martě. Mé díky patří také mé rodině za podporu. Zvláštní poděkování všem chovatelům a majitelům, kteří ochotně poskytli vzorky od svých koní, umožnili fotografování nebo snímky poskytli. Special thanks to breeders who provided photos of their horses.

ABSTRAKT Strakatost typu tobiano u koní je charakteristická bílými skvrnami, přecházejícími přes hřbet a rozsáhlými odznaky na končetinách. Je způsobena dominantním genem To. Mutace v genu KIT jsou asociovány s několika vzory skvrnitosti, včetně tobiano. Byl testován polymorfizmus v intronu 13 KIT genu metodou PCR-RFLP a výskyt chromozomální inverze ECA3 (distální část zlomu se nachází v blízkosti KIT genu) metodou PCR u 61 koní fenotypu tobiano a 89 non-tobiano. Polymorfizmus v intronu 13 nevykazoval úplnou asociaci – tři koně s jedním rodičem tobiano byli pro SNP homozygotní. Při testování chromozomální inverze však byli homozygotní jen jedinci s oběma rodiči tobiano. Chromozomální inverze ECA3 je vhodným markerem pro rutinní test zygotnosti a nelze vyloučit, že je příčinou tobiano skvrnitosti u koní. Klíčová slova: kůň, tobiano, KIT, polymorfizmus

ABSTRACT Tobiano spotting pattern is characterized by large patches of white that cross the dorsal midline and include legs. Tobiano is caused by dominant gene To. Mutations in KIT gene are associated with different spotting patterns, tobiano including. Totally 61 tobiano horses and 89 non-tobiano hoses were tested by PCR-RFLP for polymorphism in intron 13 of the KIT gene and for chromosomal inversion on ECA3 (distal breakpoint is localized near KIT). Association of SNP in intron 13 was not complete – three horses with just one tobiano pattern were found homozygous. When tested to chromosomal inversion, only tobiano with both tobiano parents were homozygous. Results suggest, that chromosomal inversion on ECA 3 could cause tobiano spotting pattern in horses. This marker is suitable for zygosity testing. Key words: horse, tobiano, KIT, polymorphism

OBSAH 1 ÚVOD ............................................................................................................... 10 2 CÍL PRÁCE..................................................................................................... 11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED................................................................................ 12 3.1 VÝZNAM PIGMENTACE ................................................................................ 12 3.2 PIGMENTACE A IDENTIFIKACE JEDINCŮ ...................................................... 13 3.3 PIGMENTY ................................................................................................... 15 3.4 KARYOTYP A GENOM KONĚ......................................................................... 16 3.5 GENY A ZBARVENÍ ...................................................................................... 17 3.5.1 Základní barvy ............................................................................................... 17 3.5.1.1 Lokus E (Extension – MC1R)............................................................................ 17 3.5.1.2 Lokus A (Agouti – ASIP) .................................................................................. 22 3.5.1.3 Lokus B (Brown – TYRP1) ............................................................................... 25

3.5.2 Ředěné barvy.................................................................................................. 25 3.5.2.1 Lokus C (Color/Cream – MATP) ...................................................................... 25 3.5.2.2 Lokus D (Dilution/Dun)..................................................................................... 30 3.5.2.3 Lokus Z (Silver dapple – PMEL17)................................................................... 34 3.5.2.4 Mushroom .......................................................................................................... 37 3.5.2.5 Lokus F (Flaxen)................................................................................................ 38 3.5.2.6 Lokus Ch (Champagne) ..................................................................................... 39 3.5.2.7 Lokus Prl (Pearl – Barlink factor)...................................................................... 41

3.5.3 Pigmentované vzory a modifikátory lokálního odstínu.................................. 41 3.5.3.1 Brindle................................................................................................................ 41 3.5.3.2 Bend Or spots..................................................................................................... 43 3.5.3.3 Mealy (Pangaré)................................................................................................. 43 3.5.3.4 Sooty (Smutty) ................................................................................................... 44

3.5.4 Bílá srst a její kombinace se srstí pigmentovanou......................................... 44 3.5.4.1 Lokus G (Gray) .................................................................................................. 44 3.5.4.2 Lokus Rn (Roan – KIT) ..................................................................................... 48 3.5.4.3 Lokus Rb (Rabicano) ......................................................................................... 49 3.5.4.4 Lokus W (White – KIT)..................................................................................... 50 3.5.4.5 Birdcatcher spots................................................................................................ 52 3.5.4.6 Lacing ................................................................................................................ 52 3.5.4.7 Lokus Lp (Leopard complex – Appaloosa) ....................................................... 53 3.5.4.8 Lokus Fr (Frame overo – EDNRB).................................................................... 57 3.5.4.9 Lokus Sb (Sabino – KIT) ................................................................................... 60 3.5.4.10 Odznaky na hlavě a končetinách...................................................................... 61 3.5.4.11 Lokus Spl (Splashed white) ............................................................................. 63 3.5.4.12 Gen To (Tobiano – KIT) .................................................................................. 64 3.5.4.13 Kombinace vzorů ............................................................................................. 72

4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ.................................................. 73 4.1 ODBĚR VZORKŮ........................................................................................... 73 4.2 IZOLACE DNA............................................................................................. 73 4.3 DETEKCE POLYMORFIZMU V INTRONU 13 GENU KIT .................................. 74 4.3.1 PCR................................................................................................................ 74 4.3.2 RFLP.............................................................................................................. 75

4.4 DETEKCE CHROMOZOMÁLNÍ INVERZE ECA3 (PCR)................................... 76 4.5 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ ....................................................................... 77 4.5.1 Frekvence genotypů a alel ............................................................................. 77 4.5.2 Vyhodnocení v programu SAS ....................................................................... 78 4.5.2.1 Pearsonův χ2 test ................................................................................................ 78 4.5.2.2 Fisherův exaktní test .......................................................................................... 79

5 VÝSLEDKY PRÁCE...................................................................................... 80 5.1 IZOLACE DNA............................................................................................. 80 5.2 DETEKCE POLYMORFIZMU V INTRONU 13 GENU KIT.................................. 80 5.2.1 Ověření kvality PCR produktu intronu 13 genu KIT ..................................... 80 5.2.2 Stanovení genotypu intronu 13 genu KIT ...................................................... 82

5.3 DETEKCE CHROMOZOMÁLNÍ INVERZE ECA3 (PCR)................................... 83 5.4 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ ....................................................................... 85 5.4.1 Frekvence genotypů a alel ............................................................................. 85 5.4.1.1 Frekvence genotypů a alel intronu 13 genu KIT................................................ 85 5.4.1.2 Frekvence genotypů a alel chromozomální inverze ECA3 ................................ 87 5.4.1.3 Absolutní frekvence genotypů vzhledem k fenotypu rodičů ............................. 89

5.4.2 Vyhodnocení v programu SAS ....................................................................... 89

6 DISKUZE......................................................................................................... 93 7 ZÁVĚR............................................................................................................. 96 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY........................................................... 97 9 SEZNAM OBRÁZKŮ .................................................................................. 106 10 SEZNAM TABULEK ................................................................................. 109

SEZNAM ZKRATEK A – adenin Al – albumin ADH1C – alcohol dehydrogenase 1C (alkohol dehydrogenáza) APHA – American Paint Horse Association Arg – arginin AS-PCR – alelově specifická PCR ASD – anterior segment dysgenesis (anomálie přední oční komory) ASIP, ASP – agouti signální protein Asn – asparagin Asp – kyselina asparagová α-MSH – alfa melanocyty stimulující hormon bp – páry bazí C – cytosin CDK – cyklin dependentní kináza CDKN2a – inhibitor cyklin dependentní kinázy 2a Cys – cystein ČT – český teplokrevník DOPA – dihydroxyphenylalanin ECA – Equus caballus (označuje koňský chromozom) EDNRB – endothelin receptor type B (endothelinový receptor B) FISH – fluorescenční in situ hybridizace G – guanin GABRB1 – gamma-aminobutyric acid receptor, beta 1 (receptor gamma aminobutyrové kyseliny) HSA – Homo sapiens (označuje lidský chromozom) k. – kůň KDR – kinase insert domain receptor (receptor tyrozin kinázy, typ III) KIT – tyrozin kináza KITLG – KIT ligand LA – Long and Accurate (polymeráza s vysokou přesností; i pro dlouhé PCR produkty) LG – linkage group (vazbová skupina) LS – levá strana MATP – membrane associated transporter protein (membránový transportní protein) MC1R – melanocortinový 1 receptor

MGF – mast cell growth factor (růstový faktor mastocytů) MITF – microphthalmia-associated transcription factor (tr. f. asoc. s microphthalmií) MspI – Moraxella surface proteins (restrikční enzym izolovaný z Moraxella sp.) OCA – okulokutánní albinismus PCR – polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce) PDLIM5 – PDZ a LIM doména 5 PDGFRA – platelet-derived growth factor alpha (růstový faktor pocház. z trombocytů) PH – paint horse PMEL17 – pre-melanosomal protein 17 (pre-melanozomální protein 17) PMG – primitive marking gene (gen pro primitivní odznaky) PS – pravá strana P tab. – tabulková pravděpodobnost QH – quarter horse RFLP – restriction fragment length polymorphism (polymorfizmus délky restrikčních fragmentů) rpm – rounds per minute (otáčky za minutu) RTK – receptorová tyrozin kináza SCF – stem cell factor (faktor kmenových buněk) SNP – single nucleotide polymorphism (jednonukleotidový polymorfizmus) SSC – Sus scrofa (označuje chromozom prasete) SSCP – single strand conformation polymorphism (polymorfizmus jednovláknových řetězců) T – thymin TaqI – polymeráza (termostabilní enzym izolovaný z Thermus aquaticus) TBE – Tris-borátový pufr tepl. – teplokrevník TRPM1 – transient receptor potential cation channel, subfamily M member 1 (melastatin) TYR – tyrozináza TYRP1 – tyrosinase-related protein (protein spjatý s tyrozinázou) UTR – untranslated region (netranslatovaná oblast) VGL – Veterinary Genetics Laboratory WGS – whole genome scanning (celogenomový skríning) WPB – welsh part bred (plemeno pony) Z angl. – z angličtiny

1 ÚVOD Zbarvení srsti je pro zvířata žijící ve volné přírodě důležité z hlediska přizpůsobení

prostředí,

ochrany

před

slunečním

zářením

i

predátory,

u domestikovaných koní však postupně získává další významy. Znalost genetiky zbarvení je pro chovatele přínosná z hlediska přesné identifikace jedince, předpovědi barvy hříběte a v některých případech i jako prevence letálních efektů. V mnoha případech je zbarvení srsti i plemenným znakem a náleží k předním ukazatelům selekce. Může být první indicií chybné parentity. Zbarvení koní je ovlivněno řadou genů, které ve vzájemné interakci působí na výsledný fenotyp. Genetika zbarvení u koní prochází rychlým vývojem. Jsou odhalovány asociované markery i příčinné mutace, jejichž detekce pomůže chovatelům při sestavování rodičovských párů, predikci zbarvení hříbat a chovu koní žádaných barev i prevenci letálních efektů. Strakatí koně různých vzorů si v České republice získávají stále více příznivců, a to nejen z řad chovatelů tzv. westernových plemen (např. paint horse – zde je strakatost plemenným znakem a podmínkou pro zápis do základního registru), ale i mezi mnoha teplokrevnými plemeny a plemeny pony. Nejčetnější skupinou ze vzorů strakatosti je tobiano. Z fenotypu jedince nelze spolehlivě určit, zda je kůň pro tobiano homozygotní, či nikoliv. Zjišťování genotypu zaznamenáváním fenotypu potomstva je zdlouhavé, především u klisen, trendem se proto stává jeho nahrazení jednoduchými, spolehlivými a finančně přijatelnými metodami, které tuto dobu zkrátí z řádu let na několik hodin. Významné postavení zaujímají metody molekulární genetiky, pomocí nichž lze otestovat jedince na markery asociované s určitým fenotypem. Testování různých markerů pomůže chovateli určit zygotnost koně a lépe stanovit připařovací plán pro produkci nejen kvalitních a životaschopných, ale i atraktivně zbarvených potomků, u nichž může předpokládat vyšší finanční zhodnocení. S rostoucí oblibou chovu netradičně zbarvených koní sílí i poptávka chovatelů po testech genů pro zbarvení srsti. Test genotypu tobiano koní by mohl být zajímavým nejen pro chovatele paint horse, kde je strakatost požadována.

10

2 CÍL PRÁCE Za cíl diplomové práce byla stanovena detekce polymorfizmu v intronu 13 genu KIT metodou PCR-RFLP a chromozomální inverze ECA3 metodou PCR, dále zhodnocení asociace se zbarvením srsti u koní – strakatostí tobiano, výpočet alelových a genotypových frekvencí jedinců zkoumaného souboru, porovnání výsledků obou metod, provedení statistického vyhodnocení a zjištění vhodnosti pro rutinní testování.

11

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Přehled literatury částečně vychází z informací obsažených v bakalářšké práci Genetika pigmentace u koní. Pro přehlednost a návaznost jsou základní popisné charakteristiky uváděny i v této práci. Údaje jsou aktualizovány a doplněny především o molekulárně-genetický pohled.

3.1 Význam pigmentace Pigmentace divokých zvířat odpovídá prostředí, ve kterém žijí. Je přirozenou ochranou – proto mají zvířata žijící ve stepích nejčastěji zbarvení plavé, v horách tmavošedé a zvířata polární bílé (KOŽELUHA et al., 1965). Lesní živočichové bývají tmavší, často s pruhováním nebo skvrnitostí, což napodobuje efekt světla prostupujícího skrz stromy. Pouštní zvířata bývají zbarvení žlutavého, snědého nebo červeného odstínu, často se vzorem agouti – pruhováním. Mnohá mláďata se rodí s ochrannými primitivními odznaky, které často s věkem vymizí (BATTEATE, 1997). Zvířata, která jsou hůře vidět, je těžší ulovit, a mají tak větší šanci na přežití. Čím déle přežijí, tím mohou mít více potomků. Z fosilních nálezů nelze zbarvení přesně detekovat (RIVERS, 2008). Během domestikace se zbarvení vychýlilo dvěma směry. Na jedné straně došlo k vyšší intenzitě zbarvení, na straně druhé ke snížení pigmentace, které končí úplnou ztrátou pigmentu – albinismem. Původní zbarvení divokých zvířat si uchovávají plemena primitivní, málo zušlechtěná (KOŽELUHA et al., 1965). Typickým příkladem je Převalského kůň (viz obr. 1) – jediný žijící předek koně domácího. Primitivní odznaky si zachovala i další plemena – huculský kůň, fjordský kůň, mongolský kůň, sorraia a další (BOWLING, 1996).

Obr. 1 Mealy bay dun (Převalského kůň).

12

Pigmentace srsti, kůže a očí je dána pohlcováním světla melaniny. Zdá se, že pomáhají chránit tělo před škodlivými látkami (včetně volných radikálů) a mohou mít rovněž anti-melanomové účinky. Pohlcování světla melaninem má několik biologických funkcí, zahrnujících fotoreceptorovou ochranu, termoregulaci, fotopretekci, maskování v přírodě, pohlavní dimorfizmus a předvádění se během námluv. Slovo melanin je řeckého původu (µέλανος = tmavý, černý). Melaniny poskytují mechanickou oporu a patrně chrání protein před degradací (RILEY, 1997). Chovatelská selekce vytvořila značnou diverzitu mezi domestikovanými plemeny, která jsou adaptována na rozdílné podmínky vnějšího prostředí. Dvě různá plemena domestikovaných zvířat mohou být fenotypově stejně divergentní jako druhy v přírodě (ANDERSSON, 2003).

3.2 Pigmentace a identifikace jedinců Správná identifikace barvy koně je klíčovou složkou pro pochopení genetického a biologického základu zbarvení. Standardní klasifikace je pro rozlišení detailů mezi specifickými barvami nezbytná. Ideální systém klasifikace koresponduje s genotypem, přičemž každý genotyp vede k jedinečnému termínu pro zbarvení. Základní barvy se vyskytují nezávisle na jakémkoli typu skvrnitosti a bílých odznacích (SPONENBERG, 2003). Pigmentace je charakterizována ve čtyřech hlavních oblastech: ƒ

popis barev na základě eumelaninu a phaeomelaninu,

ƒ

distribuce eumelaninu a phaeomelaninu,

ƒ

změna intenzity pigmentování,

ƒ

bílé skvrny (JAKUBEC, 1998a).

Všichni koně mají schopnost produkovat pigment na celém těle. Tato vlastnost je u některých koní změněna a pak je barevná srst nahrazována bílou (zčásti nebo zcela). Bílé chlupy jsou důsledkem nedostatku pigmentových zrn. Kůže je charakteristicky růžová, což je způsobeno přítomností krve v povrchových kapilárách. Při identifikaci je nutné nejdříve rozpoznat základní barvu, bílé skvrny či odznaky se popisují následně. U zcela bílých koní nebývá určení základní barvy možné (SPONENBERG, 2003). Koně s tímtéž slovním popisem nemusejí být stejného genotypu (BOWLING, 1996).

13

Většinu zbarvení koní pojmenováváme kombinací barvy trupu a „okrajů“ těla (hříva, ocas, distální část končetin, lem uší). Správné určení těchto krajin je obvykle pro identifikaci konkrétního zbarvení rozhodující. Černá hříva a ocas mohou zesvětlat působením slunečního záření dohněda. V těchto případech je nejpřesnějším ukazatelem barvy distální část končetin. Existují další důvody chybné identifikace okrajů těla a následně i konečného zbarvení – u hříbat a koní s rozsáhlými bílými odznaky. Mnohá hříbata mají velmi světlé okraje těla, přestože je v dospělosti budou mít černé. Ačkoli zkušení chovatelé mohou obvykle barvu koně předpovědět již z barevné charakteristiky hříběte, výjimky jsou četné a předpověď nezřídka chybná. Problémy při rozpoznání barvy jsou často způsobeny ročním obdobím, věkem zvířete nebo přemístěním do rozdílných klimatických podmínek. Na jaře, po vylínání, jsou obvykle koně tmavší. Slunce, vítr a déšť se podílejí na vyblednutí barvy. Někteří koně jsou vůči těmto vlivům odolní. Zvíře může často změnit odstín barvy kvůli úrovni výživy. Koně dobře krmení, zdraví a v dobré kondici mívají tmavší odstín. Další překážkou správné identifikace je skutečnost, že každá barva se vyskytuje v mnoha odstínech. Proto můžeme vždy najít koně, kteří jsou na hranici dvou vymezených barev (SPONENBERG, 2003). Způsob popisu barev koní v anglickém jazyce závisí na skutečnosti, zda byl kůň popsán ve Velké Británii nebo v Americe, kde se do názvů barev mísí mnohé španělské názvy. Mnohdy má vliv i zeměpisná poloha ve stejném státě (MATOUŠEK, 1999a). Anglické názvy zbarvení jsou přesnější než české a lépe korespondují s genotypem jedince, proto budou v této práci využívány přednostně (v textu použita americká angličtina). Například pro zbarvení buckskin a dun je v češtině souhrnný výraz plavák. Každé je přitom způsobeno jiným genem a rovněž fenotyp je rozdílný. Obdobně je tomu u vzorů strakatosti, nezřídka zahrnovaných pod všeobecný termín strakoš. Některá zbarvení nemají český ekvivalent vůbec (perlino, champagne atd.), neznalost korektního termínu vede často k chybné identifikaci barvy i jedince.

14

3.3 Pigmenty Nejdůležitějším pigmentem kožní barvy u savců je melanin. Objevuje se v podobě pigmentových zrn v chlupech, kůži, duhovce a některých vnitřních orgánech. Vyskytuje se ve dvou různých formách, jimiž jsou velká oválná zrna eumelaninu (černá a hnědá) a menší kulatá zrna phaeomelaninu (červená a žlutá) (BOWLING, 1996). Velmi zřídka může být eumelanin hnědý (typ běžný u psů). Tmavý phaeomelanin se někdy může podobat hnědému eumelaninu. První případ je však mnohem častější. Tmavému

phaeomelaninu

obvykle

zůstává

alespoň část

červeného

nádechu

(SPONENBERG, 2003). Zbarvení srsti je způsobeno přítomností, absencí nebo poměrným zastoupením melaninových pigmentů, syntetizovaných v epidermálních melanocytech. Melaniny jsou vysokomolekulární, světlo pohlcující biopolymery, vyskytující se v několika obdobných formách (SCOTT, 2006). Melanocyty migrují do kůže během embryonální fáze vývoje. Zakládají se podél neurální lišty, z níž se rovněž vytváří mícha a mozek. „Pigmentový systém“ a nervový systém jsou tedy během embryonálního života těsně propojeny, některé geny ovlivňují oba systémy. Melanocyty mohou produkovat buď phaeomelanin, nebo eumelanin. Rozlišení je dosaženo povrchovým receptorem, který může být aktivován melanocyty stimulujícím

hormonem,

produkovaným hypofýzou.

Je-li

receptor

aktivován,

výsledkem je tvorba eumelaninu. V opačném případě buňky tvoří phaeomelanin. (SPONENBERG, 2003). Základním substrátem v syntéze melaninových pigmentů je aminokyselina tyrozin. Klíčovým enzymem nezbytným pro syntézu všech typů kožního pigmentu je tyrozináza. Melanocyty předávají vytvořený pigment ve formě tzv. melanozomového komplexu ostatním buňkám pokožky – keratinocytům. Zbarvení kůže je pak dáno nejen rozložením a množstvím těchto předaných melanozomů do buněk pokožky, ale také vzájemným poměrem a množstvím jednotlivých typů melaninu v melanozomech (KRATOCHVIL, 2007). Oba pigmenty jsou tvořeny v melanocytech, ale phaeomelanin se liší svým obsahem síry a nižší schopností rozpouštění v alkáliích. Prvním krokem tvorby je oxidace tyrozinu na 3,4-dihydroxyphenylalanin (DOPA) prostřednictvím měď obsahujícího enzymu tyrozinázy. Tato reakce je pomalá. Poněkud ji zrychluje DOPA, působící jako katalyzátor. Druhým krokem je podstatně rychlejší dehydrogenace DOPA

15

katalyzovaná tyrozinázou – vzniká dopachinon. V tomto stadiu se phaeomelanin biosynteticky odděluje od eumelaninu. Phaeomelanin se tvoří interakcí dopachinonu s aminokyselinou cysteinem obsahující síru (viz příloha I) (JIRÁSKOVÁ, 2001). Změny ve vnitřním aparátu melanocytu obvykle vedou ke změnám množství produkovaného pigmentu a jeho zabalení. Takto jsou determinována spíše ředění než typ produkovaného pigmentu. Bílá skvrnitost je kontrolována lokusy, které ovlivňují migraci, životnost nebo funkci melanocytů. Přepínání mezi produkcí eumelaninu a phaeomelaninu může být ovlivňováno několika rozdílnými kroky. ƒ

Přítomností nebo absencí melanocyty stimulujícího hormonu. Tento případ je dosti vzácný a nepodstatný, neboť MSH je konstantně přítomen ve všech buňkách těla.

ƒ

Hladina povrchového receptoru. Je kódována lokusem Extension. Některé mutace, jako např. dominantní černá, produkují receptor zachycený v „zapnuté“ pozici. Výsledkem je zcela eumelanotický fenotyp. Další mutace, jako je chestnut, je způsobena inaktivovaným receptorem, který není schopen odpovědět na MSH – důsledkem je fenotyp phaeomelanotický.

ƒ

Blokování povrchového receptoru externě, což činí receptor neschopný se aktivovat, přestože je normální a MSH je přítomen (princip Agouti lokusu). Výsledkem jsou phaeomelanotické oblasti v místech, kde se exprimoval agouti protein, a eumelaninotické tam, kde protein chybí (SPONENBERG, 2003).

3.4 Karyotyp a genom koně Karyotyp domestikovaného koně je tvořen 64 chromozomy. Skládá se ze 13 párů metacentrických nebo submetacentrických, 18 párů akrocentrických a páru pohlavních chromozomů (BOWLING et RUVINSKY, 2000). Genom koně je mezi domestikovanými zvířaty jedním z nejlépe zmapovaných. Přibližně 4350 markerů je rozmístěných po ~2 680 Mbp dlouhém genomu (obdobně jako u savců), což poskytuje zhruba jeden marker každých 620 kb. Genom obsahuje ~1,5 milionu SNP (CHOWDHARY et RAUDSEPP, 2008). Pokrytí shotgun sekvenováním je 6,8 * (Horse Genome Project, 2008). Proteiny kódujících genů je 20 737 (z toho 746 genů kódujících známý protein) (Ensembl Horse, 2008).

16

3.5 Geny a zbarvení Pigmentace srsti se řadí mezi kvalitativní znaky, faktory prostředí působí jen nepatrně (JAKUBEC et al., 2003). Kromě fotografií v textu jsou další ilustrativní snímky variabilního fenotypu k dispozici v přiloženém CD–ROMu ve složce „Zbarvení a vzory“. Je třeba zohlednit skutečnost, že fotoaparát může dle poměru světla a stínu způsobit zkreslení barev.

3.5.1 Základní barvy 3.5.1.1 Lokus E (Extension – MC1R) Gen byl nazván Extension (z angl. „rozšíření“), protože dominantní alela E je zodpovědná za rozšíření – produkci eumelaninu. V případě absence jakýchkoli modifikujících genů bude kůň černý (black). U recesivních homozygotů (ee) bude srst phaeomelanotická. Základním zbarvením tedy bude red/chestnut/sorrel (ryzák). Všichni koně mají základní barvu srsti černou nebo červenou bez ohledu na konečný fenotypový projev (KOSTELNIK, 2002–2007; Color Information, 2002–2004). Syntéza eumelaninu je stimulována vazbou α-melanocyty stimulujícího hormonu k funkčnímu MC1R, který je exprimován v melanocytech (SCOTT et al., 2002). Extension kóduje melanokortinový receptor 1 (MC1R), který se nachází na povrchu melanocytů. Přepínání mezi produkcí eumelaninu a phaeomelaninu je regulováno interakcí MC1R s α-melanocyty stimulujícím hormonem (α-MSH) nebo agouti signálním proteinem ASIP – kódován genem Agouti (viz příloha II) (SCOTT, 2006). Ve všech experimentálně prokázaných případech jsou dominantní mutace spojovány s funkcí MC1R, vedoucí k tmavému zbarvení, kdežto recesivní mutace redukují

či

blokují

funkce

MC1R

a

vyúsťují

ve

zbarvení

světlé

(ROSENBLUM et al., 2004). MC1R se nachází na ECA3p12 v blízkosti centromery (RAUDSEPP et al., 1999). Byl nalezen SSCP (single strand conformation polymorphism) vykazující úplnou asociaci s fenotypem chestnut. Všichni koně chestnut byli ee, zatímco všichni nonchestnut Ee nebo EE (výsledky odpovídaly rodokmenu). V kodonu 83 byla odhalena „missense“ mutace (TCC→TTC; C901T) vedoucí k záměně serinu za fenylalanin.

17

Asociace s fenotypem chestnut byla úplná. Mutaci lze detekovat pomocí PCR-RFLP použitím restriktázy TaqI. Sekvence MC1R u koní je vysoce homologní se sekvencí člověka, skotu a myši. Substituce patrně vede ke změně struktury α-helixu druhé transmembránové domény, což může zapříčinit defektní receptor (MARKLUND et al., 1996). Sponenberg et Weise (1997) zvažují třetí alelu ED, dominantní k předchozím dvěma a epistatickou vůči Agouti. Podporou existence dominantní černé u koní je arabský hřebec (black), jehož 12 potomků z klisen bay bylo černých nebo téměř černých a 16 černých nebo téměř černých z klisen chestnut. Některá hříbata se narodila v barvě bay, ale nakonec přelínala do zcela nebo téměř černého zbarvení. Dominantní alela ED „zamyká“ receptor pro α-MSH v zapnuté pozici. Výsledkem je produkce eumelaninu nezávisle na genotypu Agouti, protože informace je uvnitř buňky. Agouti je blokován, protože je vně buňky, a je tedy obcházen. Alela ED se exprimuje od velmi tmavé „jet black“ (z angl. „černý jako smůla“) po hnědočernou (SPONENBERG, 2003). Žádná mutace zvyšující funkci (ED) MC1R u koní (narozdíl od mutací dříve nalezených u ostatních savčích druhů) nebyla ve zkoumaném souboru odhalena. Další sekvenování by mohlo zodpovědět otázku, zda u koní dominantní černá alela existuje (RIEDER et al., 2001). Wagner et Reissmann (2000) uvádějí další alelu nalezenou u chestnut koní ea. Alela má mutaci v kodonu 84 (GAC→AAC), neobsahuje TaqI restrikční místo a způsobuje záměnu aminokyselin (Asp – kyselina asparagová → Asn – asparagin). Uvnitř testované populace 60 chestnut koní různého odstínu nebyla pozorována žádná asociace mezi alelou e, respektive ea a odstínem koně. Nový polymorfizmus však může při identifikaci koní chestnut a použití TaqI-RFLP způsobovat falešné negativní výsledky. Pro přehlednost budou v genotypech uváděny pouze alely E a e. Black (vraník) Barva trupu, končetin, hřívy i ocasu je černá (s výjimkou bílých odznaků). Kůže a oči jsou tmavé. Vlivem slunce může mít barva některých jedinců světlejší odstín (fading black – viz obr. 2). Tito koně se rodí světlejší, do černého odstínu přelínají. Koně sytě černé barvy s modravým nádechem (jet black) se rodí černí a jejich barva není slunečním zářením ovlivněna (GOWER, 2000; Color Information, 2002–2004; Horse Colors). 18

V současné době není známo, který genetický mechanizmus tento jev způsobuje. Teorie heterozygotních Ee fading black a homozygotních EE jet black byla vyvrácena. (KOSTELNIK, 2002–2007).

Obr. 2 Fading black (fríský kůň).

Black má genotyp EEaa nebo Eeaa (gen A musí být v homozygotně recesivní formě, aby kůň mohl být black – pomineme-li případnou existenci alely ED). Zbarvení black se objevuje u většiny plemen, přestože je vzácnější než chestnut/sorrel (ryzák) a bay (hnědák). Tato skutečnost je zapříčiněna nízkou frekvencí alely a. Black je považován za jedinou barvu u fríských koní a starokladrubských vraníků (zřídka se může objevit i chestnut/sorrel). U některých plemen byla černá barva selekcí z populace odstraněna – například u suffolského koně nebo haflinga (BOWLING, 1996; SPONENBERG, 2003; Color Information, 2002–2004). Tab. 1 Křížení dvou heterozygotních koní black (Ee) rodiče

black Eeaa

black Eeaa gamety

Ea

ea

Ea

EEaa black

Eeaa black

ea

Eeaa black

eeaa chestnut

Narodí-li se po černě pigmentovaném hřebci 5 hříbat s černým pigmentem (žádný chestnut/sorrel), je tento kůň s 97% pravděpodobností homozygotní EE. Se vzrůstajícím

19

počtem potomků roste i jistota homozygotnosti. Získáme-li 10 černě pigmentovaných hříbat, pravděpodobnost se zvyšuje na 99,9 % (BOWLING, 1996). Stanovení genotypu koně na lokusu Extension (tzv. red factor test) je velmi užitečné především pro chovatele černých koní. Potomek homozygotního koně EE nikdy nebude chestnut (Horse Coat Color Tests, 2008). Statisticky významný rozdíl byl nalezen mezi světle hnědým odstínem – Ee a tmavší hnědé EE genotypu. Světlejší odstíny hnědáků by tedy mohly být alespoň částečně vysvětleny aditivním efektem v průměru o 50 % snížené funkce MC1R díky alele e. Nicméně tento závěr může být zkreslen strukturou zvoleného souboru koní a v současné době neznámou genetickou odchylkou (RIEDER et al., 2001). Chestnut/sorrel (ryzák) Chestnut/sorrel má srst červenou v různých odstínech (viz obr. 3-6), hlava, hříva, ocas a distální část končetin jsou téže barvy jako srst trupu nebo světlejší či tmavší (nikdy však černé) (DUŠEK, 2007). Tmavší odstíny bývají nazývány chestnut (z angl. „kaštan“), světlejší sorrel (z angl. „šťovík“). Použitý termín rovněž závisí na konkrétním plemeni a asociaci. Chovatelé quarter horse uvádějí termín sorrel pro jasně a světleji zbarvené koně, zatímco u arabských plnokrevníků se užívá temín chestnut pro všechny odstíny. Pro zjednodušení bývá někdy uváděn souhrnný termín „red“ (Color Information, 2002– 2004).

20

Obr. 3 Light chestnut/sorrel (ČT).

Obr. 4 Copper chestnut (ČT).

Obr. 5 Red chestnut (anglický plnokrevník).

Obr. 6 Liver chestnut (ČT).

Předpokládá se, že rozdílné alely genu A – Agouti ovlivňují odstín chestnut/sorrel (GOWER, 2000). Pro chovatele je chestnut/sorrel snadno dosažitelnou barvou. Výsledkem křížení dvou takových koní bude vždy chestnut/sorrel (GOWER, 2000; LEČÍKOVÁ, 2005). Z předcházejících informací vyplývá, že genotyp koně chestnut/sorrel je eeaa, eeAa nebo eeAA – pomineme-li další možné alely genu A. Dále bude pro zjednodušení uváděn především termín chestnut. U tzv. amerických plemen (paint horse, quarter horse atd.) bude dodržováno zbarvení uvedené v registru (obvykle sorrel). Pro flaxen koně bude taktéž užíván termín sorrel.

21

3.5.1.2 Lokus A (Agouti – ASIP) Agouti byl pojmenován po jihoamerickém hlodavci s pruhovanou srstí. Je zodpovědný za distribuci eumelanotických a phaeomelanotických oblastí u koní, kteří jsou eumelanin schopni tvořit (E-). Účinkuje pomocí agouti signálního proteinu (ASIP nebo také ASP), který blokuje povrchový receptor pro α-MSH na melanocytech. V místech výskytu agouti proteinu není možná stimulace α-MSH a je tvořen pouze phaeomelanin (výsledkem je bay – hnědák). Oblasti, v nichž není agouti protein exprimován, nejsou blokované a produkují eumelanin. Genotyp ee je epistatický k lokusu Agouti a maskuje jeho expresi (SPONENBERG, 2003). . ASIP soutěží s α-MSH o vazbu na MC1R. Funkční MC1R je pro odpověď savčích melanocytů na agouti signální protein nezbytný (ABDEL–MALEK et al., 2001). Pravděpodobně existuje několik alel tohoto genu. V pořadí snižování dominance to jsou: A+, A, At a a. Alela A+ je zodpovědná za divoké zbarvení koní, které se podobá ochrannému zbarvení většiny divokých zvířat tak, jak je tomu u Převalského koně. V tomto případě jde o světle hnědou barvu. Ostatní tři alely modifikují černou barvu následujícím způsobem: ƒ

Alela A omezuje výskyt černé barvy na hřívu, ocas a distální část končetin.

ƒ

Alela At, v genotypech AtAt a Ata, neomezuje černou barvu tak jako alela A. Dochází však k zesvětlení černé barvy na tmavě hnědou, která je mnohdy zaměňována za černou barvu. Světlejší odstíny vykazují tmavě hnědou barvu zejména za lopatkou a ve slabinách.

ƒ

Alela a je v homozygotní formě zodpovědná za černou barvu (společně s E-) na celém těle. Jedinci jsou zcela černí (JAKUBEC, 1998b).

Obdobně se vyjadřuje i Gower (2000). Stálým trendem pozorovaným u ostatních savčích druhů je, že „dominantnější“ alely Agouti způsobují rozsáhlejší plochu červené, zatímco recesivní vedou k rozšířenějším černým oblastem (SPONENBERG, 2003). Zbarvení koně Převalského bývá uváděno jako příklad alely A+, ale fotografie naznačují, že se ve skutečnosti jedná o dun. Není vyloučeno, že mají alelu A+ i dun. Je možné, že tento gen, ač dříve běžný, byl z moderní populace téměř vytěsněn. Alela At by měla být dominantní k a a recesivní k ostatním alelám a je patrně příčinou zbarvení seal (z angl. „tuleň“) brown. Předpokládá se, že rozličné alely Agouti mají vliv pouze na eumelanin srsti (KOSTELNIK, 2002–2007).

22

Gower (2000) však uvádí účinky Agouti na fenotyp koní chestnut: ƒ

A+-,ee: light chestnut,

ƒ

A-,ee: red chestnut,

ƒ

At-,ee: standard chestnut,

ƒ

aa,ee: liver chestnut (játrový ryzák).

Sponenberg (2003) zvažuje multifaktoriální vliv na intenzitu odstínu základních barev. Výsledky naznačují, že delece 11 bp v exonu 2 genu ASIP (ECA22q) je příčinou recesivní alely a u koní, způsobuje ztrátu funkce proteinu, signální proces není blokován a eumelanin je tvořen v rozsahu celého těla. Nebyla nalezena žádná asociace mezi genotypem Agouti (AA versus Aa) a intenzitou základního odstínu koně. Sekvenování dalších částí genu ASIP, především 5´a 3´ UTR netranslatovaných oblastí by mohlo odhalit další mutace ovlivňující zbarvení u koní (např. původní, „divokou“ alelu, či brown) (RIEDER et al., 2001). Bay (hnědák) Trup má různé odstíny červené a hnědé (viz obr. 7, 8). Končetiny jsou od kopyt po (nebo nad) karpální a hlezenní klouby černé (s výjimkou bílých odznaků). Hříva a ocas jsou černé. Hříbata mají obvykle světlou srst na nohou, která se však po vylínání změní na černou (Color Information, 2002–2004). Podle odstínu zvířete se označují dalšími přívlastky – např. light bay (světlý hnědák), mahogany bay (mahagonový), copper bay (měděný) atd. (GOWER, 2000). Genotyp E-A-

Obr. 7 Bay (ČT).

Obr. 8 Dark bay (ČT).

23

Obr. 9 Brown (ČT).

Obr. 10 Seal brown (ČT).

Brown (tmavý hnědák) Srst je černá nebo tmavohnědá. Krajiny huby, slabin, okolí očí, vnějšího a vnitřního stehna jsou světlejší. Někteří jedinci mají srst se žlutavým nebo červeným nádechem – obvykle se nazývají brown (viz obr. 9). Velmi tmaví koně se světlejšími krajinami se nazývají seal brown (viz obr. 10; příloha III, obr. F) (The horse guide, 2007). Předpokládaný genotyp E-Ata nebo E-AtAt (JAKUBEC,1998b; GOWER, 2000). Termín brown je používán pro jedince tmavší než bay a světlejší než black (SPONENBERG, 2003). Molekulárně genetické testy prokázaly, že seal brown koně nejsou black a nemají genotyp aa, což odporuje předcházející teorii, že tito koně byli ve skutečnosti black s modifikujícím faktorem pangare (SCOTT, 2006). Tab. 2 Křížení heterozygotního koně bay (EeAa) a homozygotního chestnut (eeaa) rodiče chestnut eeaa

bay EeAa gamety

EA

Ea

Ae

ea

ea

EeAa bay

Eeaa black

eeAa chestnut

eeaa chestnut

24

3.5.1.3 Lokus B (Brown – TYRP1) Vliv genu B je rozsáhle diskutován, autoři nejsou jednotní, pokud jde o polymorfizmus a fenotypový projev tohoto genu. Lokus Brown kóduje enzym – TYRP1 (tyrosinase related protein), který mění černou na hnědou díky změnám ve struktuře melanozomů. Je nutno zdůraznit, že TYRP1 účinkuje pouze na eumalanotickou dráhu, phaeomelanin zůstává nezměněn (SPONENBERG, 2003). Předpokládá se, že gen TYRP1 ovlivňuje syntézu „čokoládového“ melaninu, reprezentovaného u koní fenotypy dark chestnut, liver chestnut, silver nebo seal brown. Byly nalezeny dva SNP – v exonu 2 substituce C189T způsobující záměnu threoninu za methionin prozatím neznámého efektu a v intronu 2 substituce A1188G. Ani jedna mutace však nevykázala zřejmou asociaci se zbarvením srsti. Až doposud byli všichni koně s domnělým čokoládovým fenotypem základu chestnut (ee), což znamená, že tento fenotyp je způsoben jiným genem ve spolupráci s MC1R (RIEDER et al., 2001). Čokoládově hnědé zbarvení se vyskytuje např. u labradorských retrívrů. Neobjevil se žádný důkaz podporující tvrzení, že Brown lokus přispívá k variabilitě zbarvení u koní. Všichni koně mají na tomto lokusu pouze B+ alelu („divokého typu“), tedy jej můžeme opomíjet (SPONENBERG, 2003). Statistická analýza souboru 1369 potomků po 5 hřebcích naznačuje, že tmavší odstíny základních barev (dark chestnut, dark bay) jsou u plemene Franches-Montagnes děděny recesivně (HENNER et al., 2002).

3.5.2 Ředěné barvy Základná barva koně může být zesvětlena účinky několika genů. Ovlivňují pouze eumelanin, pouze phaeomelanin, nebo oba pigmenty. Kombinace několika takových genů může vyústit v extrémní ředění (SPONENBERG, 2003).

3.5.2.1 Lokus C (Color/Cream – MATP) U koní jsou známy dvě alely tohoto genu, původní C a Ccr (cream). Gen C vykazuje

neúplnou

dominanci.

Plně

pigmentovaný

kůň

má

genotyp

CC.

U heterozygotních jedinců CCcr je červený pigment ředěný na žlutou, ale černý pigment ovlivněn není (nebo jen nepatrně). K heterozygotním „jednou zesvětleným“ barvám 25

řadíme koně palomino, buckskin a smokey black. Geneticky černý kůň (E-aa) může nést alelu cream, aniž by se projevila (smokey black). U koní homozygotního genotypu (CcrCcr) je kompletně ředěn phaeomelanin i eumelanin na velmi světle krémovou (případně s rezavým nádechem okrajů těla). Tato skupina je reprezentována barvami cremello, perlino a smokey cream. Kůže je růžová a oči modré (GOWER, 2000; Color Information, 2002–2004). Cream alela (Ccr) se vyskytuje u mnoha plemen, např. paso fino, morgan, Tennessee walking horse, quarter horse. Výjimečně se objeví v populaci anglického plnokrevníka a pravděpodobně zcela chybí u arabského plnokrevníka (BOWLING, 1996). V České republice je známé plemeno Kinských koní, pro něž je typická barva palomino a buckskin. Je třeba si uvědomit, že nelze mít chov, v němž by byli všichni jedinci palomino (Ccr je neúplně dominantní). Proto i u koní Kinských najdeme kromě jedinců s ředěnou barvou srsti také jedince chestnut a bay. Frekvence genotypů u Kinského koně jsou následující: CcrCcr = 0,03; CcrC = 0,52; CC = 0,45. Četnost Ccr alely je tedy u Kinského koně 0,29 (JAKUBEC et al., 2003). Lokus C je u koní ve vazbě s mikrosatelitními markery na ECA21. Předběžné výsledky naznačují vazbu Ccr k HTG10, který se nachází mezi mikrosatelitními markery COR68 a LEX31. Komparativní a syntenní data naznačují, že lokus C není shodný s genem pro tyrozinázu (TYR) (LOCKE et al., 2001). Umístění C lokusu na chromozomu 21 potvrzují i Mariat et al. (2003). Zdá se, že Ccr by mohl být lokalizován v oblasti ECA21p17. Porovnání sekvencí exonu 2 genu MATP (membrane associated transporter protein) od koní bay a cream odhalilo SNP v kodonu 153 (GAT→AAT), vedoucí k záměně aminokyselin (Asp – kyselina asparagová je u cream koní nahrazena Asn – asparaginem). Tato transice patrně vede k narušení sekundární struktury transmembránové domény transportního proteinu. Gen kóduje transportní protein, který může být částečně nebo zcela narušen, situace je v souladu se statusem neúplné dominance, což dokládá fenotyp. Všichni cream koně byli homozygotní A/A, všechna palomina a buckskini heterozygotní A/G, bay homozygotní G/G. Nalezený SNP lze považovat za mutaci příčinnou. U člověka způsobuje shodná transice (G→A) v MATP genu okulokutánní albinismus (OCA), projevující se sníženou pigmentací očí, kůže a vlasů (OCA může být zapříčiněn rovněž mutacemi v genu TYR, P a TYRP1) (NEWTON et al., 2001). Tatáž bodová mutace byla nalezena u myší fenotypu underwhite (DU et FISHER, 2002). 26

Fenotypový projev koní nesoucích jednu alelu cream(CCcr) Smokey black Black s jednou alelou Ccr (viz obr. 11). Černý pigment není ovlivněn (Color Information, 2002–2004). Černý kůň přenáší jednu alelu skrytě, neboť nemá červený pigment, na němž by se účinek ředění projevil. Srst však může vykazovat slabé známky zesvětlení do kouřového odstínu (odtud termín „smokey“), oči jsou jantarové (viz příloha VI, obr. A). Chybnou identifikaci koně obvykle prozradí žluté potomstvo (BOWLING, 1996; SPONENBERG, 2003). Bývají nesprávně zařazeni jako seal brown, fading black, liver chestnut nebo dark (sooty) bay (KOSTELNIK, 2002-2007). Genotyp: E-,aa,CCcr Buckskin (plavák) Buckskin (viz obr. 12, 13) je výsledkem účinku jedné cream alely na fenotyp koně bay. Trup je obvykle žlutý, zlatavý. Hříva, ocas a distální části končetin jsou černé, oči tmavé, ale i jantarové (SPONENBERG, 2003). V ocasu či hřívě se může objevit několik světlejších žíní. Často je zaměňován za zbarvení dun, avšak buckskin nemá pravý úhoří pruh ani jiné primitivní znaky. Může mít tmavé stínování hřbetu (viz příloha VIII, obr. A), což může úhoří pruh připomínat. Tento znak však nebude jasně ohraničený a ostrý. Může se objevit grošování, skvrny na nohou nebo tmavší maska (BATTEATE, 1996a). Genotyp: E-,A-,CCcr Palomino (izabela/žluťák) Zbarvení palomino (viz obr. 14) je výsledkem účinku jedné alely Ccr na koně chestnut. Existuje široká škála odstínů srsti trupu palomina od téměř bílé po čokoládově hnědou (BOCKMAN). Palomina se rodí velmi světlá. Kůže je obvykle růžová, ale s postupujícím věkem hříběte tmavne. Nejobvyklejší je zlatavá, písková barva. Hříva a ocas jsou nejčastěji bílé, někdy tmavší, krémové. Koně palomino mohou být zaměněni za velmi světlé koně chestnut s flaxen hřívou. Tmavé jedince s modifikací sooty si lze splést s koňmi silver dapple (BOWLING, 1996; SCOTT, 2006). Gower (2000) popisuje efekt alel genu Agouti na odstín palomina obdobně jako na koně chestnut. A+- krémový, A- zlatý, At- tzv. sezónní palomina (mění odstín v závislosti na ročním období), aa čokoládový. Genotyp: ee,aa(A-),CCcr 27

Obr. 11 Smokey black (ČT).

Obr. 12 Sooty buckskin (ČT).

Obr. 13 Buckskin (quarter horse).

Obr. 14 Palomino (ČT).

Fenotypový projev koní nesoucích dvě alely cream(CcrCcr) Koně těchto barev byli dlouho na okraji zájmu chovatelů, protože nemohli být často registrováni a jako domnělí albíni byli vyřazováni z chovu. Dnes se situace obrací a smetanoví koně jsou žádanými barvami. Mohou dávat požadovanou barvu se 100% jistotou (LEČÍKOVÁ, 2005). Mnozí chovatelé uvádějí, že koně vyhledávají stín. Jsou fotosenzitivní, patrně mají zhoršený zrak (téměř jako by byli krátkozrací) (REINHEIMER, 2006). Pro cream koně je typická růžová kůže, modré oči (viz příloha VI, obr. B) a extrémní zesvětlení srsti. Sluneční záření, teplo a tlak mohou kůži podráždit a vyústit v puchýře nebo dokonce rakovinu kůže. Někteří jedinci se mohou na slunci opálit do tmavšího odstínu, který poskytuje jistou ochranu (GOWER, 2000).

28

Smokey cream Dvakrát zesvětlený black alelou Ccr. Trup je krémově zbarven, hříva, ocas a distální části končetin jsou tmavší, často s kávovým nebo žlutavým nádechem (SCOTT, 2006). Genotyp: E-,aa,CcrCcr Perlino Dvakrát zesvětlený bay alelou Ccr (kůň získal alelu Ccr od obou rodičů). Trup perlina (viz obr. 15) je krémový, ocas, hříva a distální část končetin jsou tmavší. (Color Information, 2002–2004). Genotyp: E-,A-,CcrCcr Cremello Dvakrát zesvětlený chestnut alelou Ccr. Srst cremella (viz obr. 16; přiloha V, obr. A) je zbarvena od velmi světlé po tmavší krémovou. Případné bílé odznaky nemusí být u velmi světlých jedinců viditelné (Color Information, 2002–2004). Genotyp: ee,aa(A-),CcrCcr

Obr. 15 Perlino (quarter horse).

Obr. 16 Cremello (ČT).

Mnoho chovatelů chybně označuje koně cremello, perlino a smokey cream jako pravé albíny. Jedná se však o tzv. pseudoalbinismus (modrá barva oka a krémové zbarvení srsti naznačují přítomnost pigmentu). U ostatních savců (včetně člověka) se objevuje recesivní alela c, způsobující pravý albinismus. Homozygoti cc postrádají pigment v chlupech, kůži i očích. Oči a kůže jsou růžové (efekt proudění krve v podpovrchových cévách). Albinismus je často doprovázen vrozenými vývojovými vadami. Žádný pravý albín u koní doposud nebyl pozorován, pravděpodobně nejsou schopni přežít a umírají již v děloze (raná embryonální mortalita) (SCOTT, 2006).

29

Bílé odznaky a skvrny bývají označovány jako parciální albinismus (KOŽELUHA et al., 1965). Tab. 3 Křížení smokey black genotypu EeaaCCcr a palomina eeAaCCcr smokey black EeaaCCcr

rodiče gamety

EaC

eaC

EaCcr

eaCcr

eAC

EeAaCC bay

eeAaCC chestnut

EeAaCCcr buckskin

eeAaCCcr palomino

eaC

EeaaCC black

eeaaCC chestnut

EeaaCCcr smokey black

eeaaCCcr palomino

cr

EeAaCCcr buckskin

eeAaCCcr palomino

EeAaCcrCcr perlino

eeAaCcrCcr cremello

cr

EeaaCCcr smokey black

eeaaCCcr palomino

EeaaCcrCcr smokey cream

eeaaCcrCcr cremello

palomino

eeAaCCcr

eAC

eaC

3.5.2.2 Lokus D (Dilution/Dun) Gen D vykazuje úplnou dominanci. Alela D zesvětluje nejen phaeomelanin (jako alela Ccr), ale rovněž eumelanin a je zodpovědná za zbarvení typu dun (z angl. „šedohnědý“). Červené zbarvení těla je ředěno na růžově-červenou, žlutě-červenou nebo žlutou, černé na šedou. Hlava, hříva, ocas a distální části končetin mají tendenci zachovávat tmavou barvu (BOWLING, 1996; SPONENBERG, 2003). Příčinná mutace není doposud známa. V současné době neexistuje přímý test tohoto genu, byly však identifikovány DNA markery asociované s Dun (Dun zygosity test, 2008). U ostatních druhů zvířat je D lokus recesivní (dd pro ředění) (BATTEATE, 1996b). Rovnoměrné zesvětlení srsti je způsobeno nahromaděním pigmentových granul na jedné straně, což propouští více světla do chlupu. Tento jev vytváří efekt zředění barvy. (BOWLING, 1996; BATTEATE, 1996b; SCOTT, 2006). Je možné, že primitivní odznaky a ředění barvy asociované s dun jsou výsledkem dvou vázaných genů. Pokud by byly tyto dvě složky důsledkem genové vazby, pak by se příležitostně mohl objevit crossing-over. Výsledkem by byli jedinci tmavých, primitivně značených koní, stejně tak jako koně dun odstínu bez primitivních odznaků. Zatímco někteří tmaví koně mají slabé primitivní odznaky, žádný je nemá tak výrazné,

30

aby doložil porušení genové vazby. Rovněž všichni dun koně primitivní odznaky mají, což je silným argumentem pro jeden gen s pleiotropním efektem (SPONENBERG, 2003). Scott (2006) uvádí, že primitivní odznaky se příležitostně objevují i u non-dun koní. Patrně jsou primitivní odznaky a ředění způsobeny odlišnými, vzájemně vázanými geny (u domestikovaných koní na ECA8). Pravděpodobně existuje více alel Dun genu. (RIVERS, 2008). Castle (2008) se domnívá, že primitivní odznaky jsou přítomny u všech koní, avšak u většiny nejsou viditelné, neboť jsou stejně zbarvené jako „podkladová“ srst. Dun gen odznaky nezředí, a tím je zviditelní. Uvádí „primitive marking gene“ (PMG) jako možnou příčinu primitivních odznaků. Dun (plavák) je nazýván barvou divokého typu, neboť jsou pro něj typické odznaky původních koní žijících ve volné přírodě (Převalského kůň, mongolský kůň). K těmto primitivním znakům (atavismus) řadíme: úhoří pruh na hřbetě (viz obr. 17), oslí kříž (tmavý, nejasně ohraničený širší pruh na plecích) a zebrování nohou (viz obr. 18), u některých koní se objevují tmavé obrysy a mřížování ucha, „pavoučí síť“ na čele (viz obr. 19) a tmavá maska (viz obr. 22). Každý chlup na trupu je zbarvený (nejedná se o směs tmavých a bílých chlupů jako u vzoru roan nebo gray) (KOSTELNIK, 2002-2007).

Obr. 17 Úhoří pruh.

Obr. 18 Zebrování končetin.

31

Obr. 19 Pavoučí síť.

Dun musí mít viditelný úhoří pruh. Ačkoli i ostatní charakteristiky by měly být patrné, často není jednoduché je rozeznat. Sooty modifikátor může vytvořit dojem úhořího pruhu. Tento znak bývá obvykle viditelný během zimních měsíců, nikoliv v létě (ELMORE, 2008). Mnoho hříbat se rodí s úhořím pruhem (případně dalšími primitivními znaky), které obvykle zmizí nebo budou méně viditelné, když hříbě přelíná. Tyto koně za dun nepovažujeme. Jedná se o maskování podobné např. skvrnitosti u kolouchů, které s věkem vybledne. Dun zbarvení najdeme u mnoha plemen. Fjordský kůň a sorraia jsou výlučně dun, u arabského a anglického plnokrevníka se alela D nevyskytuje vůbec (Color Information, 2002–2004). Podle základní barvy, na níž alela D působí, rozlišujeme několik možných typů dun. Black dun – grullo/grulla Alela D zde ovlivňuje eumelanin a mění barvu trupu do šedivého odstínu. Grullo (viz obr 20.) znamená ve španělštině „jeřáb“. Obdobně jako tento pták mají i koně grullo béžově až břidlicově zbarvený trup. Termín grullo se používá pro samce, grulla pro samice. Hříva, ocas a distální části končetin jsou obvykle černé, hlava tmavá. Jsou přítomny primitivní znaky (SPONENBERG, 2003). Genotyp: E-,aa,DBay dun Velmi častá forma dun a také nezřídka zaměňovaná za buckskina. Barva těla je nejčastěji světle žlutá až hnědavá. Může se pohybovat od krémově žluté (viz obr. 22), po hnědou (viz obr. 21). Úhoří pruh je tmavohnědý nebo černý. Světlí koně mívají bílou kštici a část žíní hřívy a ocasu. Zebrování nohou začíná obvykle černou barvou od zápěstního a hlezenního kloubu a směrem nahoru hnědne (GOWER, 2000; NESTAAS, 2006). Genotyp: E-,A-,DChestnut (red) dun Trup je zbarvený do světle červeného, oranžového, často až meruňkového odstínu (viz obr. 23). Úhoří pruh je červený nebo červenohnědý (příloha VIII, obr. B), vždy tmavší než podkladová srst. Hříva a ocas jsou obvykle velmi světlé, žlutavé, u velmi světlých koní bílé. Hříbata mohou mít bílá kopyta, která však věkem ztmavnou (GOWER, 2000; NESTAAS, 2006). Genotyp: ee,aa(A-),D32

Obr. 20 Black dun (huculský kůň).

Obr. 21 Bay dun (huculský kůň).

Obr. 22 Bay dun (hafling/huculský kůň).

Obr. 23 Chestnut dun (quarter horse).

Dominantní alela D může být samozřejmě přítomná spolu s jakoukoli alelou (alelami) jiného genu (genů). Například zbarvení dunalino (viz příloha IV, obr. C) je projevem D alely na palominu. Takový kůň bude mít genotyp: ee,aa(A-),CCcr,D-. Obdobně dunskin (viz příloha III, obr. A) je projevem D alely na buckskinovi. Genotyp: E-,A-,CCcr,D- (Color Information, 2002–2004). Kombinace těchto genů v heterozygotní formě nevede k extrémnímu ředění (BOWLING, 1996).

33

3.5.2.3 Lokus Z (Silver dapple – PMEL17) Gen Z (někdy také S – Silver) vykazuje autozomálně dominantní dědičnost a účinkuje ředěním eumelaninu, avšak pouze malým nebo žádným účinkem na červený phaeomelanin. Dominantní alela Z ovlivňuje pouze eumelanin a ředí barvu hřívy a ocasu na bílou, stříbřitě šedou nebo lněnou (podle základního odstínu koně). Mírně může zesvětlit i odstín trupu (GOWER, 2000; BOWLING, 2000). Název Silver dapple může být matoucí, protože ne všichni koně ovlivnění tímto genem musejí být grošovaní (dapple) a ne všichni mají hřívu a ocas stříbřité barvy (silver). Hříva a ocas mohou věkem tmavnout. Alelu Z nalezneme například u plemen: Rocky Mountain horse, shetlandský pony, islandský pony (Color Information, 2002– 2004). Přívlastek dapple vede některé majitele k záměně zbarvení za gray, často jsou tito koně chybně registrováni (BOWLING, 1996). Z těchto důvodů Gower (2000) a Scott (2006) upřednostňují termín taffy (z angl. „karamelový“ – označující obvyklý odstín trupu). U plemene Rocky Mountain horse jsou tito koně nazýváni chocolate (čokoládový) namísto silver (SPONENBERG, 2003). Hříbata jsou velmi světlá, hříva a ocas bílé, často mají pruhovaná kopyta a bílé oční řasy. Zdá se, že u homozygotních jedinců (ZZ) se projevuje vyšší zředění ve srovnání s heterozygoty, nicméně tento náznak je třeba ověřit. Koně chestnut, u nichž je exprimován pouze phaeomelanin, nebudou vykazovat žádný zřejmý fenotypový efekt Silver mutace, ačkoli existuje možnost, že nepatrně bude zesvětlen i phaeomelanin. Kandidátním genem pro fenotyp silver je PMEL17 (BRUNBERG et al., 2006). Gen kóduje pre-melanozomální protein 17 (transmembránový). Ovlivňuje produkci eumelaninu a je přítomný v melanozomu, ale jeho přesné působení zůstává sporné. Přestože jeho funkce doposud nebyly plně popsány, protein jasně hraje hlavní roli v biogenezi raných stádií pigmentových organel – melanozomů u ptáků a savců (THEOS et al., 2005). Byl sekvenován 5,3 kb dlouhý úsek PMEL17 genu (vyjma oblastí intronů 1, 3 a repetitivní oblasti uvnitř intronu 6). Porovnání sekvencí koní silver a non-silver odhalilo dva polymorfizmy asociované se silver. V páté bázi exonu 11 byla odhalena C→T transice. Tato missense mutace způsobuje záměnu aminokyseliny arginin za cystein (Arg618Cys). Druhé SNP obsahující A→T transverzi bylo identifikováno v pozici 48 intronu 9. Vzdálenost mezi těmito dvěma SNP je 759 bazí. Pomocí pyrosekvenování

34

byla testována asociace identifikovaných SNP s fenotypem silver. Obě mutace vykázaly kompletní asociaci se silver a také chyběly u koní non-silver, s výjimkou chestnut klisny, u níž bylo potvrzeno několik silver potomků, při páření s non-silver hřebci. Mutaci v intronu nelze jako příčinnou vyloučit, avšak jako pravděpodobnější příčina se jeví exonová mutace. Pravděpodobněji byla tato intronová mutace přítomna v haplotypu předka, u něhož se silver alela vyskytla, a doposud nebyla rekombinací separována. Obdobné mutace a fenotypový projev se vyskytují u myši a slepice (BRUNBERG et al., 2006). Reissmann et al. (2007) uvádějí tytéž substituce (C→T v exonu 11; A→T v intronu 9) zcela asociované s fenotypem silver. Dodávají, že mutace nemusejí být příčinné a slouží spíše jako markery. Další tři SNP byly nalezeny jak u silver, tak u nonsilver koní. Black silver (taffy) Fenotypovým projevem je slabě ředěná barva trupu, často s grošováním a zářivě jasně bílá nebo slámově žlutá hříva a ocas (BRUNBERG et al., 2006). Obvyklý je velmi tmavý odstín, občas domodra, s oranžovo-červeným odleskem, zejména na ventrálních částech těla. Hříva a ocas mají stříbrný nádech, což je zapříčiněno kombinací světlých a tmavých žíní (GOWER, 2000). Tmavě čokoládový odstín může snadno vést k záměně za zbarvení chestnut (Color Information, 2002–2004). Genotyp: E-,aa,ZBay silver (taffy) Phaeomelanotický trup není ovlivněn, distální část končetin je z černé ředěna na tmavě šedivou, hříva a ocas jsou tvořeny směsí bílých a šedivých žíní (viz obr. 24, 25) (BRUNBERG et al., 2006). Jedinci s velmi světlou barvou distální části končetin bývají zaměňováni za flaxen chestnut (Color Information, 2002–2004). Genotyp: E-,A-,ZBuckskin silver (viz příloha IV, obr. D) se může velmi podobat palominu. Distální část končetin a okraje uší však budou mít tmavší odstín (Color Information, 2002–2004). Genotyp: E-,A-,Ccr,Z-

35

Obr. 24 Bay silver (morgan/arabský pln.).

Obr. 25 Bay silver (morgan).

ASD (anterior segment dysgenesis) Jedná se o onemocnění spojované nejčastěji s koňmi silver. Projevuje se dvěma rozdílnými fenotypy: ƒ

velké cysty vystupující z řasnatého tělesa a periferní části sítnice,

ƒ

mnohočetné anomálie přední oční komory (ASD), zahrnující ciliární cysty, hypoplasii duhovky, iridocorneální adheze, zákal rohovky, nukleární kataraktu, megalocorneu a kraniofaciální abnormality.

Onemocnění se často objevuje u koní plemene Rocky Mountain horse. Výsledky podporují hypotézu, že oční cysty a ASD jsou děděny kodominantně s expresí cyst v heterozygotním stavu a komplexem poruch ASD v homozygotním stavu. U několika jedinců se objevila non-penetrance heterozygotního fenotypu (cyst). ASD u koní je patrně homologní k obdobným očním abnormalitám u ostatních druhů (člověk, myš, krysa) (EWART et al., 2000). Klinické a histologické nálezy na očích u Rocky Mountain horse jsou obdobné kongenitální mióze při megalophthalmos anterior a megalocornee u člověka (RAMSEY et al., 1999). Je možné, že Silver gen buď způsobuje oční abnormality (má tedy pleiotropní efekt), nebo je s příčinným genem v těsné vazbě. Koně s nejsvětlejšími hřívami a ocasy jsou postiženi nejvíce, což pravděpodobně znamená, že srst homozygotních jedinců je také více ředěna. ASD se příležitostně vyskytuje i u koní ostatních barev, což by naznačovalo, že gen je oddělený od Silver genu (ale úzce vázaný). Ačkoli nelze vyloučit, že v těchto případech působí úplně jiný gen (SCOTT, 2006).

36

Lokus náchylnosti je umístěn na ECA6. Nejvíce asociovaným markerem je SNP v exonu 11 genu PMEL17. Genotypy téměř zcela korelovaly s fenotypovými údaji – tedy zdraví jedinci homozygotní, koně s cystami heterozygotní, zatímco jedinci vykazující fenotyp ASD byli homozygotní pro opačnou alelu než zdraví. V současné době probíhá sekvenování oblasti (ANDERSSON et al., 2008).

3.5.2.4 Mushroom Nové ředění srsti „mushroom“ (z angl. „hřib, houba“) se objevilo u shetlandských pony. Fenotypově je obdobný jako silver dapple. Někteří mushroom pony (viz obr. 26) jsou výsledkem křížení black/black, což odporuje silver dapple (dominantní alelu Z nemůže nést black skrytě). Další jedinci se narodili ze spojení chestnut/chestnut, které vylučuje potomka černě pigmentovaného jako u silver dapple (HALE, 2004). Hříbata se rodí světlá, některá světle béžová, občas s šedavým nebo růžovým nádechem. Jedinci bývají chybně registrováni jako gray, dark chestnut, roan nebo cream. Vyskytují se sporadicky. Letní srst je stejně zbarvená jako zimní. Nově dorůstající srst je mírně tmavší, nicméně vybledne velmi rychle, nezávisle na vlivu počasí. Barva může být velmi světlá, ale i téměř černá se stříbrnou barvou hřívy a ocasu, oči jsou světlejší. Srst postrádá červený nádech. Nevykazují žádné známky ASD. Křížení dvou jedinců mushroom produkuje pouze mushroom (MEAD, 2007). Z předcházejících údajů lze usuzovat, že zbarvení mushroom vykazuje recesivní dědičnost.

Obr. 26 Mushroom (shetlandský pony).

37

3.5.2.5 Lokus F (Flaxen) Modifikátor Flaxen (z angl. „lněný“) zesvětluje hřívu a ocas u koní chestnut (černý pigment ovlivněn není) do lněného, medového, slonovinového nebo i bílého odstínu (viz obr. 27, 28). Mohou být zesvětleny i končetiny. Často se uvádí, že Flaxen gen (F) má pouze dvě alely – původní F+, dominantní nad f, která v homozygotním stavu (ff) způsobuje flaxen hřívu a ocas. Avšak existují případy, kdy křížení dvou flaxen koní nevyústilo v hříbě flaxen. Odpovědí by mohla být teorie působení dvou nebo více genů, jejichž společný účinek by byl nutný k zesvětlení. Recesivní alely produkují nefunkční proteiny. Pokud by kůň byl pro jeden nebo oba geny homozygotně recesivní, nebyl by pigment tvořen. Recesivní homozygoti pro oba geny by měli hřívu a ocas světlejší. Jednou z dalších možností je pouze částečná penetrance genotypu (SCOTT, 2006). Velmi zřídka (především u arabských plnokrevníků) Flaxen penetruje rovněž do bay, což se fenotypově projeví stříbřitě pruhovaným ocasem (GOWER, 2000). Flaxen jedince můžeme nalézt například u plemen: Tennessee walking horse, quarter horse, anglický plnokrevník, shetlandský pony a miniature horse. Hafling je výlučně flaxen sorrel (Color Information, 2002–2004).

Obr. 27 Flaxen sorrel (norický kůň).

Obr. 28 Flaxen sorrel (hafling).

38

3.5.2.6 Lokus Ch (Champagne) Champagne (šampaňský) gen je úplně dominantní. Alela Ch ředí phaeomelanin i eumelanin, zesvětluje srst, kůži i oči. Červený pigment je ředěn na zlatou, černý na světle čokoládovou. Stupeň zesvětlení je různý (SPONENBERG, 2003). Hříbata se rodí obvykle tmavá, barvy black, bay nebo chestnut s růžovou kůží a přelínají na světlejší. Oči jsou modré, postupně se mění od světle jantarové, případně zelenavé na oříškově hnědý odstín, ale ne vždy. Všichni champagne se rodí s růžovou kůží, která postupně ztmavne do nachově-hnědé. Tmavě pihovatá kůže je obvyklá a objevuje se v krajinách kolem očí, na hubě, mléčné žláze a pod ocasem. Mnoho koní má kovový odlesk. Neobjeví se však u všech, stejně tak je možné, že lesklou srst budou mít i recesivní homozygoti (chch) (Color Information, 2002–2004). Champagne se vyskytuje zejména u Tennessee walking horse, american saddlebred, Missouri foxtrotter, quarter horse a plemen pony (SCOTT, 2006). Classic champagne Na základu black se alela Ch projeví jako classic champagne. Srst je ředěna na atraktivní snědě-šeříkovou nebo světle kouřově hnědou, okraje těla mají tmavší odstín téže barvy. Často bývají zaměňováni za buckskin nebo grullo. Je pravděpodobné, že předpokládaný fenotyp čokoládově hnědé barvy je důsledkem champagne, spíše než existencí recesivní alely b na lokusu Brown (SCOTT, 2006). Genotyp: E-,aa,ChSable champagne Je projevem champagne na brown koni. Odstín sable (z angl. „sobol“) champagne se pohybuje mezi classic a amber, přičemž může být obtížné je rozlišit. Při pochybnostech napomůže test genotypu Agouti (classic champagne bude aa) (SCOTT, 2006). Genotyp: E-,Ata(At At),ChAmber champagne Amber (jantarový) champagne (viz obr. 30) je projevem alely Ch na koni základu bay. Obvykle snědě-zlatavý trup, okraje těla jsou tmavě hnědé. Může být zaměněn za buckskina nebo dun (SCOTT, 2006). Genotyp: E-,A-,Ch-

39

Gold champagne Chestnut, který nese alespoň jednu alelu Ch. Gold champagne (viz obr. 29) je podobný palominu – se zlatým trupem, bílou hřívou a ocasem (někteří však mohou mít hřívu a ocas zlatavého odstínu) (SCOTT, 2006). Od palomina jej rozlišíme pomocí růžové kůže (KOSTELNIK, 2002–2007). Genotyp: ee,aa(A-),Ch-

Obr. 29 Gold champagne (quarter horse).

Obr. 30 Amber champagne (quarter horse).

Při společném působení alely Ch a Ccr bude účinek ředění zesílen. Při vlivu na koně chestnut bude výsledkem zbarvení gold cream – ivory (viz příloha III, obr. B). Srst trupu je v barvě slonoviny (ivory), hříva a ocas jsou bílé. Podobají se cremellu, nicméně oči jsou jantarové, nikoli modré. Obdobně se bude účinek ředění zesilovat při působení na ostatní základní barvy, ovšem okraje těla, případně i trup budou tmavší (SCOTT, 2006). Genotyp: ee,aa(A-),Ccr,Ch-

40

3.5.2.7 Lokus Prl (Pearl – Barlink factor) Ředění pearl a Barlink factor byla dříve posuzována samostatně (Horse Coat Color Tests, 2008). Pearl (z angl. „perlový“) se objevilo v souvislosti se dvěma andaluskými koňmi: hřebcem Bravio – bay a klisnou Chica – liver chestnut (KOSTELNIK, 2002–2007). Několik koní bylo chybně popsáno jako champagne. Všichni byli příbuzní paint horse hřebce Barlink Macho Man – chestnut, splashed white, frame overo (SHEPARD, 2006). Veterinary Genetics Laboratory (VGL) identifikovaly u quarter horse a paint horse mutaci asociovanou s ředěním Barlink factor. Další výzkum prokázal, že tatáž mutace je přítomná i u španělských koní s fenotypem pearl. Výskyt mutace u QH a PH pravděpodobně odráží původ těchto moderních plemen ve španělských koních, proto je vhodné nazvat ji Pearl. Gen se chová jako recesivní. Jedna mutovaná alela neovlivňuje zbarvení black, bay ani chestnut. Dvě alely působí na pozadí chestnut světlou, jednolitě meruňkovou barvu těla, hřívy a ocasu. Kůže je rovněž světlá (Horse Coat Color Tests, 2008). V interakci s cream genem způsobuje dvojité ředění srsti, kůže a očí. Tato kombinace vytváří barvy pseudo-cremello, pseudo-smokey cream a na buckskinovi patrně pseudo-perlino (SHEPARD, 2006).

3.5.3 Pigmentované vzory a modifikátory lokálního odstínu 3.5.3.1 Brindle Obdobný vzor je rozšířený u psů (např. stafordshirský bulteriér, německá doga, bandog), ale velmi vzácný u koní. Způsobuje jemné vertikální pruhy na těle (viz obr. 31; viz příloha VII, obr. B), bývá zaměňován s dun. Obvykle neovlivňuje hlavu a nohy v takovém rozsahu jako trup. Nejvyšší koncentrace vzoru bývá na krku a v krajině ramenního kloubu (Color Information, 2002–2004). U psů a skotu se vzor dědí dominantně. Výsledky z páření koní brindle vedou k obdobnému závěru i u koní (SPONENBERG, 2003). Koně se vzorem brindle (z angl. „žíhaný“) se objevili u plemen: arabský plnokrevník, anglický plnokrevník, mustang, quarter horse, Tennessee walking horse, německý a bavorský teplokrevník, ruský kůň, španělských koní a také u oslů a mul. 41

Dříve se předpokládalo, že brindle je pouze varianta dun faktoru. Intenzita vzoru je různá a může být ovlivněna ročním obdobím nebo věkem zvířete. Vzor může být tmavý i bílý (BATTEATE, 2007).

Obr. 31 Chestnut brindle (quarter horse).

Při ověřování parentity potomka po dvou brindle koních – hřebci Dunbars Gold a klisně Sharp One byla nepředpokládaně vyloučena parentita obou rodičů. Případem se zabývala Cecilia Penedo (Veterinary Genetics Laboratory, UC Davis). Z analýzy krevních vzorků hřebce vyplynulo, že geneticky odpovídá samičímu pohlaví. Následně byly testovány vzorky z jednotlivých chlupových cibulek – některé odpovídaly samičímu pohlaví, jiné samčímu, což vedlo k závěru, že Dunbars Gold je chiméra (jedinec tvořený z dvou odlišných linií buněk). Předpokládanou příčinou je fúze embryí dvouvaječných dvojčat. Přestože Dunbars Gold byl chimerický v kůži a chlupech, pohlavní orgány byly zřejmě vytvořeny jeho samčí DNA. Všechna jeho hříbata pocházela ze samčí linie buněk. Sharp One, matka hříběte, vykazovala opačný stav hřebce – chimerismus v krvi, ale ne v žíních, obě linie však byly samičí. Laboratoř otestovala DNA z chlupů tmavších oblastí a světlejších oblastí. U Sharp One byly identifikovány dvě různé linie buněk ve tmavých a světlých pruzích brindle vzoru. Když porovnali hříbě narozené 2004 s hříbětem narozeným 2003, zjistili, že každé pochází z různých samičích linií. Nelze říct, že je to vždy fúze embryí, která vede k brindle 42

vzoru. Penedo předpokládá, že vnější důkaz chimerismu bude viditelný, pokud se spojí dvě embrya, která mají geny kódující kontrastující barvu srsti (HAMILTON, 2006). Chimerismus není jediná příčina brindle vzoru, v některých liniích je vzor dědičný (BATTEATE, 2007). Sponenberg (2003) teoretizuje o stínování sooty, exprimovaném v podobě vertikálních pruhů, jako o jedné z možných příčin brindle.

3.5.3.2 Bend Or spots Náhodné tmavé skvrny (spots) byly pojmenovány po anglickém plnokrevníkovi Bend Or. Odstín i velikost skvrn jsou různé. Nejčastěji se objevují na koních palomino a chestnut (viz příloha V, obr. C), výjimečně na tmavších zvířatech. Skvrny nemusejí být přítomné od narození. Genetická kontrola není známá, patrně je dědičnost dominantní (Color Information, 2002–2004). V české terminologii se nazývají Eclipsovy skvrny (MISAŘ et JISKROVÁ, 1997). Gower (2000) se domnívá, že dědičnost je založena spíše recesivně.

3.5.3.3 Mealy (Pangaré) Efekty tohoto modifikátoru jsou viditelné na ventrální straně těla (viz obr.1; příloha III, obr. C). Na hubě, kolem očí, pod loketními klouby, podél břicha, ve slabinách a na hýždích (nemusí se projevit na všech těchto místech). Výsledný odstín těchto oblastí závisí na původní barvě koně (nejčastěji světle snědý až bílý). Mealy (z angl. „zaprášný od mouky“) je obvyklý u všech plemen. Některá jsou téměř výlučně modifikována: hafling je dobrým příkladem rozdílného stupně mealy chestnut a exmoorský pony mealy bay (Color Information, 2002–2004). Sponenberg (2003) se domnívá, že seal brown jsou ve skutečnosti mealy black. Předpokládá, že za fenotyp mealy je zodpovědná dominantní alela (Pa – podle španělského termínu pangaré = jízdní kůň). S tímto názorem nesouhlasí Kostelnik (2002–2007) – test genotypu Agouti prokázal, že koně seal brown nejsou homozygotní aa, tedy nemohou být mealy black (nebo black s jiným modifikátorem). Existují mealy hříbata od rodičů bez tohoto znaku, stejně tak jednobarevná hříbata od rodičů s mealy, což vylučuje monogenní dědičnost.

43

3.5.3.4 Sooty (Smutty) Modifikátor, nacházející se u mnoha plemen, ovlivňuje červený i černý pigment ztmavením v určitých oblastech (viz obr. 12). Sooty (z angl. „začouzený od sazí“) se pohybuje od několika černých chlupů přes tmavší odstín podél hřbetu až po rovnoměrné ztmavení, které může být zaměněno za jinou barvu. Sooty je nejkoncentrovanější v dorzální linii. Kůň vypadá jako posypaný popelem, může se objevit grošování (Color Information, 2002–2004). Gower (2000) uvádí dominantní alelu Sty. Sponenberg (2003) zvažuje další alelu genu Extension – EB (extension brown), která by vedla k tmavému odstínu u koní brown (A-EB, oproti A-E- u bay). Alela EB však nevysvětluje sooty u koní chestnut. U většiny plemen se zdá, že sooty chestnut je dominantní k jasnějším odstínům, což nemusí ve všech případech nezbytně znamenat monogenní dědičnost. Zřejmý je i vliv prostředí. U koní kvalitně krmených bude Sooty modifikátor exprimován více. Vliv může mít i roční období nebo věk zvířete.

3.5.4 Bílá srst a její kombinace se srstí pigmentovanou 3.5.4.1 Lokus G (Gray) Gray (vybělující bělouš) Dědí se jako jednoduchý autozomálně dominantní znak (SWINBURNE et al., 2002). Hříbata nesoucí alelu G se rodí v jakékoliv barvě (v závislosti na genotypu ostatních genů pro zbarvení). Brzy po narození se objeví mezi zbarvenou srsti bílé chlupy, obzvláště na hlavě (viz příloha V, obr. B), které se úměrně s věkem budou rozšiřovat na celém těle (BOWLING, 2000). Jedná se o tzv. leucismus (DUŠEK, 2007). Bílé kruhy v okolí očí („brýle“) bývají prvním náznakem vybělování. Rychlost vybělování je značně proměnlivá, proces je patrně pod kontrolou modifikujících genů. Dostatečné množství bílých chlupů pro správnou identifikaci se nejčastěji objeví po přelínání hříběte (SWINBURNE et al., 2002; Color Information, 2002–2004; SPONENBERG, 2003). Proces je obdobný důvěrně známému vybělování vlasů v humánní populaci, avšak u koní je mnohem rychlejší (BOWLING, 1996). Depigmentace chlupů začíná od jejich špičky a pokračuje k bazální části, kde se pigment udržuje nejdéle. Nejdříve se ztrácejí pigmentová zrna uložená v kůře a dřeni a

44

drobné vakuoly vzniklé na místě zrn se vyplňují vzduchem, poté mizí pigment difúzně rozpuštěný (KOŽELUHA et al., 1965). Směs bílých a pigmentovaných chlupů u mladých koní (viz obr. 32) na počátku procesu vybělování vytváří často dojem ocelově šedé barvy (steel gray), později se přidává grošování (viz obr. 33) (Color Information, 2002–2004). Groše jsou uprostřed světlé, na okrajích pigmentované. Tento jev je důsledkem větvení kapilár, a tudíž nerovnoměrného prokrvování. Na okrajích grošů je síť vlásečnic nejhustší, probíhá intenzivní tkáňová oxidace a vytváří se více pigmentu než v centrální oblasti groše (KOŽELUHA et al., 1965). Starší jedinci mají srst zcela bílou (viz obr. 34) nebo bílou s tečkováním (viz obr. 35). Kůže i oči zůstávají obvykle tmavé (BOWLING, 2000). Koně, kteří zcela nevybělí, mají drobné zbarvené tečky (flea-bitten = poštípaný od blech) indikující původní barvu srsti před vybělením (GOWER, 2000). Předpokládá se, že vzor flea-bitten je kontrolován samostatným a patrně recesivním genem nevázaným ke genu G (SCOTT, 2006). V některých partiích může být kůže lokálně depigmentovaná (často v krajině huby, viz příloha VII, obr. A nebo očí). Tento stav se nazývá vitiligo a může se objevit i u koní jiných barev. Vyskytuje se také u člověka. (Color Information, 2002–2004). Přestože terminologie se stále mění, trendem je používat obecnějšího termínu leukoderma a vyčlenit termín vitiligo pro specifický typ leukodermy u člověka (STANNARD, 2000). Velmi vzácně se mohou objevit okrouhlé bílé skvrny, tzv. Tetrarchovy (viz příloha VIII, obr. C) (Color Information, 2002–2004). Gray se běžně vyskytuje u mnoha plemen a je převládající u lipických a andaluských koní (SPONENBERG, 2003). U některých plemen (např. fríský kůň, hafling, clevelandský hnědák) však byla dominantní alela selekcí odstraněna. (Color Information, 2002–2004).

45

Obr. 32 Steel gray (anglický plnokrevník).

Obr. 33 Dappled gray (slovenský tepl.).

Obr. 34 Gray (ČT).

Obr. 35 Flea-bit. gray (starokladrubský k.).

Během života kůže vybělujících běloušů tmavne v přímé úměře, jak chlupy vybělují. Někdy dochází ke tvorbě pigmentových nádorů (melanomů)(MATOUŠEK, 1999b). Vitiligo pravděpodobně s rozvojem melanomu nesouvisí (SUTTON et COLEMAN, 1997). Melanomy převažují u gray koní spíše než u pigmentovaných. Zduření se nejčastěji nacházejí na hlavě či kořeni ocasu, ale mohou postihnout jakýkoli orgán. Přibližně 95 % melanomů je benigních. Jsou-li maligní, mohou zapříčinit dysfunkci orgánů a vést k úhynu (BOWLING, 1996). Frekvence melanomů u zbarvených koní je velmi nízká, což podporuje domněnku, že mezi rozvojem melanomu a biochemií tvorby gray existuje úzká asociace. Lokalizace melanomů je různá, nejčastěji bývají na ventrální straně ocasu nebo v perineální krajině. Taktéž se objevují na hlavě, krku, příušní žláze, vnějších

46

genitáliích a vnitřních orgánech. Histologicky se jedná o shluky melanocytů a melanofágů v kůži (SWINBURNE et al., 2002). Pigmentové léze se vyskytují přibližně u 80 % koní starších 15 let. Pravděpodobně jsou všichni gray náchylní k rozvoji nemoci, pokud žijí dostatečně dlouho. První změnou identifikovatelnou na mikroskopické úrovni je akumulace pigmentu kolem a pod vlasovými cibulkami, formující „misku“ melaninového pigmentu. V bílých i pigmentovaných chlupech byly léze markantní kolem folikulů bílých chlupů. Zesvětlení srsti a rozvoj nádoru spolu pravděpodobně souvisejí. Léze vykazují stejnou ultrastukturu a histologické znaky jako modrý névus u člověka (SUTTON et COLEMAN, 1997). Existence zvířat bez melanomů vylučuje gray jako přímou příčinu zhoubného nádoru. Patrně vzhledem k redukci, nebo dokonce ukončené aktivitě kožních melanocytů je u gray koní proliferace nádoru a metastázování pomalejší než u jedinců zbarvených. Tato hypotéza by vysvětlila významně zvýšený počet postižených koní v současné populaci koní gray. Northern blot analýzou byla zjištěna zvýšená exprese PMEL17 a TYRP1 ve vzorcích nádoru v porovnání se vzorky kůže zbarvených koní (normální exprese) a gray (snížená exprese), což ukazuje vzájemnou korelaci s obsahem melaninu (RIEDER et al., 2000). Testováním rodin polosourozenců metodou celogenomového skríningu (WGS – whole genome scanning) pomocí skupin mikroasatelitních markerů byl lokus gray přiřazen na ECA25. Za účelem zjištění, zda gray přispívá k rozvoji melanomu u koní, bude nezbytné identifikovat gen a příčinnou mutaci (SWINBURNE et al., 2002). Locke et al. (2002) potvrzují, že Gray se nachází na chromozomu 25. Jejich výsledky však TYRP1 a PMEL17 jako kandidátní geny fenotypu gray vylučují. Lokus náchylnosti k melanomu u lidí leží v chromozomálním regionu 9p21, kde se rovněž nachází CDKN2a (inhibitor cyklin dependentní kinázy 2a). CDK (cyklin dependentní kinázy), respektive jejich inhibitory jsou klíčovými regulátory buněčného cyklu. Změna funkce, nebo přímo absence CDK inhibitorů jsou indikátory zhoubných nádorů. Doposud žádná mutace v CDKN2a nebyla nalezena (RIEDER et al., 2000). Role CDKN2a v náchylnosti k melanomům u gray koní zůstává neobjasněna. Konzervace genomu člověka, myši a koně však předpokládá umístění CDKN2a na ECA23 spíše než v blízkosti Gray (LOCKE et al., 2002).

47

Nebyl nalezen žádný zřetelný kandidátní gen, který by byl spojován s poruchami pigmentace nebo vznikem melanomů, což vede k závěru, že gray je zapříčiněn mutací v novém genu (PIELBERG et al., 2005).

3.5.4.2 Lokus Rn (Roan – KIT) Roan (smíšený bělouš) Vzor roan (z angl. „prokvetlý“ – doslovný překlad „grošovaný“ je zavádějící) je způsoben dominantní alelou Rn, někdy také značena jako R. Bílé chlupy jsou poměrně pravidelně rozmístěny mezi tmavou srstí na trupu (viz obr 36, 37). Hlava, hříva, ocas a distální část končetin zachovávají původní barvu (s výjimkou případných bílých odznaků). Vzor může být patrný až po prvním přelínání, ale pak zůstává po celý život. Někteří roan mohou věkem tmavnout (gray vždy naopak). Poměrné zastoupení bílých chlupů se obvykle mění s ročním obdobím, v létě bývá srst světlejší. Po poranění roste v místě jizev srst zbarvená, narozdíl od bílé u většiny koní (SCOTT, 2006).

Obr. 36 Bay roan (norický kůň).

Obr. 37 Chestnut roan (norický kůň).

Vzor může být exprimován již od několika depigmentovaných chlupů ve slabinách až po převládající bílou srst, což vytváří dojem stříbrného odstínu. Mladí gray koně mohou být chybně klasifikováni jako roan, nicméně průzkum rodokmenu by měl situaci objasnit (gray musí mít alespoň jednoho rodiče gray). Dědičnost osamocených bílých chlupů, občas nazývaných „roaning“ není zatím objasněna (Introduction to coat color genetics, 2008).

48

Z křížení dvou koní roan byl výsledný poměr 2:1 ve prospěch roan namísto předpokládaného poměru 3:1. Vznikla tedy teorie, že je RnRn letální (KOSTELNIK, 2002–2007). Zatím není známá studie dokumentující letální efekt, související s homozygoty roan. Předcházející názory předpokládaly, že homozygotní roan není životaschopný a v populaci se nevyskytuje (REINHEIMER, 2006). Bylo zaznamenáno několik koní, jejichž veškeré potomstvo bylo roan – jako by byli pro roan homozygotní. Objevili se u plemen quarter horse a spanish mustang. Není jasné, jak obvyklí tito homozygoti jsou, ale vyskytují se u široce divergentních plemen (SPONENBERG, 2003). Roan lze pozorovat například u quarter horse, paso fino, peruánského pasa velškého pony a dalších. Nevyskytuje se u anglických a arabských plnokrevníků (BOWLING, 1996). Fenotypová podobnost s poruchami pigmentace u člověka a myši společně s komparativním mapováním určily KIT jako hlavní kandidátní gen pro lokus Rn. Byla odhalena synonymní substituce v exonu 19, vykazující vysoce signifikantní vazbovou nerovnováhu mezi Rn a KIT (lze identifikovat RFLP – restrikční endonukleázou TaqI). U heterozygotů Rnrn jsou exprimovány oba alelické KIT transkripty, tedy je vysoce nepravděpodobné, že je Rn regulační mutací rušící KIT mRNA expresi. Fenotyp u heterozygotních koní a předpokládaná letalita v homozygotním stavu jsou ve shodě s fenotypovým projevem mutací v KitW u myši. Výsledky naznačují úzkou vazbu mezi KIT a Rn, avšak příčinná mutace nebyla odhalena (MARKLUND et al., 1999). Gen KIT bude detailně popsán v kapitole 3.5.4.12 Gen To (Tobiano – KIT)

3.5.4.3 Lokus Rb (Rabicano) Vzor rabicano (termín pochází ze španělštiny a označuje koně s bílými žíněmi v ocasu) je také nazýván „coon tailed ticking“ což vyjadřuje podobnost se vzorováním ocasu mývala – coon (viz příloha VIII, obr. D),, nebo obdobně „skunk tail“ (ocas skunka) (viz příloha III, obr. E) nebo jednoduše „white ticking“. Obvykle je vzor omezen pouze na několik bílých chlupů na kořeni ocasu a ve slabinách. U koní s extrémním projevem se bílá srst propojuje ve vertikální pruhy, které zasahují na hrudník. Patrně se dědí dominantně. Vyskytuje se u anglických a arabských plnokrevníků (GOWER, 2000; SPONENBERG, 2003).

49

3.5.4.4 Lokus W (White – KIT) White (bělouš) Koně se rodí s nepigmentovanou srstí i kůží a zpravidla tmavýma očima. Oči jsou normálně pigmentované – patrně vzhledem k

odlišnému původu sítnicových

melanocytů, které se vyvíjejí z lokálního neuroektodermu a nikoliv z neurální lišty jako kožní melanocyty. Dědí se jako monogenní autozomálně dominantní znak. Dominantní bílá se nachází rovněž u člověka, prasete a myši (HAASE et al., 2007). White (viz obr. 38) je epistatická ke všem ostatním genům pro zbarvení srsti, překrývá jejich působení, a je tedy nemožné z fenotypu zvířete rozeznat, jaké alely pro ostatní geny nese. Studie rodokmenu ukazují, že křížením white koní jsou produkována jak zbarvená tak i bílá hříbata. Poměr bílých hříbat k barevným se přibližuje poměru 2:1, což naznačuje gen s letálním efektem v homozygotním stavu (WW) (BOWLING, 1996).

Obr. 38 White (velšský pony).

Dominantní alela W patrně není vždy plně penetrována. Bílí koně mají většinou drobné reziduální pigmentové skvrny a mohou příležitostně dávat skvrnité, vzoru sabino podobné, potomky. V mnoha plemenech jsou známy případy narození bílého nebo téměř bílého hříběte od zbarvených rodičů. Všichni tito koně však následně předávali svým potomkům barvu dominantně. Doposud není známo, zda tyto heterogenní

50

fenotypy sdílejí společné genetické pozadí. Zdá se, že fenotyp white je důsledkem nezávislých spontánních mutací v různých plemenech vedoucích k totožnému fenotypu. Vyvstává otázka, zda je dominantní bílá ve skutečnosti maximálně exprimovaným vzorem sabino, či zda je sabino výsledkem neúplné penetrance dominantní bílé. Zvláštní pozornost je třeba věnovat zjištění důsledků W mutace na ranou embryogenezi (MAU et al., 2004). Gower (2000) se domnívá, že většina koní fenotypu white jsou ve skutečnosti bílá sabina. Pro genomový skríning bylo použito 70 mikrosatelitních markerů pokrývajících všechny koňské autozomy. Lokus W je ve vazbě s mikrosatelitním markerem ASB23 na chromozomálním regionu 3q21–22, kde se rovněž nachází KIT gen. Výsledky pozičního klonování a komparativní data naznačují, že KIT kóduje W lokus u koní (MAU et al., 2004). U plemene Franches-Montagnes byla u white koní nalezena C→G transverze lokalizována v exonu 15 KIT genu, která do otevřeného čtecího rámce předčasně zařadila stop kodon. Všichni bílí koně byli pro C→G polymorfizmus heterozygotní. Všichni jednobarevní byli homozygotní pro původní alelu C. Tři jiné kandidátní mutace byly identifikovány u dalších plemen. U arabského plnokrevníka byla nalezena substituce A→T v exonu 4, u Camarillo white horse v exonu 12 C→T a u anglického plnokrevníka v exonu 13 G→A. Výsledky naznačují alelickou heterogenitu dominantních white koní mezi plemeny. U několika bílých koní nebyla nalezena v KIT genu žádná mutace a není známo, zda depigmentace u těchto zvířat je zapříčiněna doposud nepopsanými mutacemi v genu KIT, nebo v genech jiných (HAASE et al., 2007).

51

3.5.4.5 Birdcatcher spots Vzor byl pojmenován po anglickém plnokrevníkovi Birdcatcher (GOWER, 2000). Projevuje se malými bílými skvrnami na těle koně, které by neměly být zaměňovány se snowlake (viz kapitola 3.5.4.7). Genetická kontrola vzoru není známa (Color Information, 2002–2004). Ve veterinární praxi se označuje jako skvrnitá leukotrichia. Zvířata mají mnohočetné, ostře vymezené oblasti leukotrichia. Skvrny mají průměr obvykle 1–3 cm (STANNARD, 2000).

3.5.4.6 Lacing Vzor lacing (z angl. „sešívání, šněrování“) je znám ve veterinární literatuře jako retikulární leukotrichia. Synonymem pro lacing je giraffe (z angl. „žirafa“) a marble (z angl. „mramor“). Je omezen pouze na jisté linie, což předpokládá genetický vliv. Rozvoj u některých koní je patrně vázán na použití určitých vakcín nebo propuknutí vzácného onemocnění kůže erythema multiforme (SPONENBERG, 2003). U mnoha koní se onemocnění rozvine v jednom roce věku, příležitostně se však může objevit i u starších zvířat. Léze se tvoří na dorzální střední linii od kohoutku po kořen ocasu. Počáteční léze obsahují lineární krusty, po jejich vymizení následuje dočasná alopecie. Nově narostlé chlupy jsou bílé (leukotrichia). Krusty, alopecie i leukotrichia se rozvíjejí v charakteristickém síťovaném vzoru. Leukotrichia se jeví jako permanentní (STANNARD, 2000). Někteří majitelé tvrdí, že koně se vzorem lacing neprošli žádnou fází kožních změn. Vzor se objevil u plemen quarter horse, peruánský paso, paso fino a american miniature horse (SPONENBERG, 2003).

52

3.5.4.7 Lokus Lp (Leopard complex – Appaloosa) Appaloosa První zmínky o skvrnitosti appaloosa pocházejí z nástěnných maleb v jeskyních Lascaux a Peche-Merle ve Francii okolo 18 tis. př. Kr. (The Appaloosa Museum, 2007). Postupně se koně z Evropy rozšiřovali do ostatních světadílů, kde ovlivňovali zbarvení dalších koní. Název appaloosa pochází od stejnojmenného plemene skvrnitých koní chovaných indiánským kmenem Nez Percé v blízkosti řeky Palouse protékající Idahem. Osadníci říkali těmto koním „a Palouse horse“, postupně se z tohoto označení vyvinul termín appaloosa (SCOTT, 2006). Všechny vzory leopard complex jsou zapříčiněné dominantní alelou Lp. Rozdílný fenotypový projev je ovlivněn dalšími modifikujícími geny (SPONENBERG, 2003). Koně jsou charakterističtí různými vzory bílé, které jsou společně popisovány jako leopard complex (Lp) a třemi atributy (TERRY et al., 2004). Atributy doprovázející skvrnitost appaloosa: ƒ

bílá bělima (viz obr. 39; příloha VI, obr. D),

ƒ

skvrnitá kůže na hlavě a genitáliích (viz obr. 40),

ƒ

vertikálně pruhovaná kopyta (viz obr. 41).

Obr. 39 Bílá bělima.

Obr. 40 Skvrnitá kůže huby.

Obr. 41 Pruhované kopyto.

Skvrnitost kůže je patrná při narození pouze u 1/3 hříbat, rozvíjí se později. Další 2 charakteristiky jsou viditelné ihned (GOWER, 2000). Ne každý jedinec vykazuje všechny tyto znaky. Bílé vzory mají sklon k symetrickému rozmístění a jsou soustředěné mezi kyčelními hrboly a na zádi. Koně,

53

kteří zdědí alelu Lp, budou vykazovat některý z mnoha appaloosa vzorů, v rozsahu od několika bílých skvrn na zádi po téměř celoplášťově bílou. Alela je neúplně dominantní k lp. Zdá se, že homozygoti (LpLp – few spot leopard a snowcap) jsou méně pigmentovaní než heterozygotní jedinci. Za rozmanitost appaloosa vzorů jsou pravděpodobně zodpovědné další modifikátory (TERRY et al., 2004). Vzor se může s věkem rozšiřovat, přibližně do 5 let, avšak alespoň některé charakteristiky budou patrné již při narození. Vzor najdeme např. u plemen: appaloosa (odtud také název vzoru), knabstrupský kůň, falabella, mongolský kůň a norický kůň (BOWLING, 1996). Vzory appaloosa Blanket (z angl. „deka“): Zbarvený kůň s bílou srstí na zádi, která se může rozšiřovat distálně nebo přes hřbet. Přechody mezi bílou a zbarvenou srstí mohou být ostré, skvrnité nebo prokvetlé. V bílé oblasti se nacházejí barevné skvrny, které mohou s věkem zvířetem měnit tvar a rozmístění (viz obr. 42). Leopard: Bílý kůň s barevnými skvrnami po celém těle. Skvrny mohou být více koncentrovány na hlavě a končetinách (viz obr. 43). Snowflake (z angl. „sněhová vločka“): Pigmentovaný kůň s bílými skvrnami kdekoli na těle (viz obr. 44). Varnish roan (z angl. „lakovaný“): Rodí se barevní a vybělují věkem (nesouvisí s genem G). Kůň může zůstat na určitých krajinách pigmentovaný (hlava, kohoutek, boky, končetiny atd.). Prokvétání obvykle hlavu zasahuje. V různých krajinách se mohou objevit barevné skvrny (viz obr. 45). Frost (z angl. „mráz“): Bílá srst prokvétající podél dorzální linie koně (viz obr. 46). Snowcap (z angl. „sněhová čepice“): Fenotyp je podobný vzoru blanket, avšak chybějí skvrny v bílé oblasti. Vzor se může rozšiřovat ke kohoutku a pokrývat značnou část trupu. Pigmentovaná srst zůstává na hlavě, končetinách, krajině loketního kloubu a ve slabinách. Patrně homozygotní LpLp (viz obr. 47) (Color Information, 2002–2004). Mnoho homozygotních koní je šeroslepých (SPONENBERG, 2003). Few spot leopard (z angl. „leopard s několika skvrnami“): Maximální vyjádření vzoru leopard, patrně homozygotní jedinci LpLp. Koně jsou téměř bílí, pouze s několika pigmentovanými skvrnami (obvykle na hlavě, krku, krajině loketního kloubu nebo ve slabinách) (Color Information, 2002–2004).

54

Obr. 42 Bay blanket (appaloosa).

Obr. 43 Bay dun leopard (appaloosa).

Obr. 44 Bay snowflake (kříženec).

Obr. 45 Bay varn. roan (slezský norický k.).

Obr. 46 Brown frost (appaloosa).

Obr. 47 Brown snowcap (appaloosa).

Koně s genem Lp, ale žádnými dalšími geny budou vykazovat alespoň jeden ze tří základních atributů appaloos (skvrnitá kůže, bílá bělima, pruhování kopyt). U hřebců je vzor více exprimován (SCOTT, 2006). Gower (2000) jmenuje několik možných alel ovlivňujících společně s Lp výsledný fenotyp. Pro snowcap neúplně dominantní alela Sc, projevující se v homozygotní formě fenotypem few spot leopard. Pro tmavé skvrny Sd (reprezentované fenotypy blanket 55

různého rozsahu po leopard), snowflake Sn, varnish roan Sv. Kůň nemusí nést žádné modifikující geny, pak bude fenotyp následující (viz tab. 4). U hřebců jsou atributy více znatelné než u klisen. Tab. 4 Fenotyp hřebců a klisen v závislosti na genotypu lokusu Lp (GOWER, 2000). genotyp

hřebci

klisny

lplp

jednobarevní

jednobarevné

Lplp

3 atributy

pouze 1-2 atributy

LpLp

málo vyjádřený snowflake

3 atributy

Vazbová

analýza

rodin

polosourozenců

z

křížení

appaloosa

hřebců

s jednobarevnými klisnami vyloučila gen KIT jako příčinu vzoru appaloosa (TERRY et al., 2001). Kromě KIT genu byl jako příčinný vyloučen i MITF (microphthalmiaassociated transcription factor) (TERRY et al., 2002). Lokus Lp se nachází na ECA1. Fenotypový projev je obdobný hypopigmentaci u myši i člověka (TERRY et al., 2004). Z výsledků komparativního mapování vyplývá, že geny TRPM1 (melastatin) a OCA2 (okulokutánní albinismus II. typu) se nacházejí ve stejné chromozomální oblasti jako Lp na ECA1, což je činí vhodnými kandidáty pro skvrnitost appaloosa (BELLONE et al., 2006).

56

3.5.4.8 Lokus Fr (Frame overo – EDNRB)

Termín overo znamená „vzor ptačího vejce“ (BOWLING, 1996). Tímto slovem španělského původu se v Jižní Americe už po staletí označují všichni strakatí koně (Typy zbarvení, 2007). Výraz frame (z angl. „rám“) vzor výstižně charakterizuje – bílé skvrny se nacházejí přibližně uprostřed trupu a krku a jsou orámované zbarvenou srstí (viz obr. 48–53). Overo se řadí společně se vzory tobiano, sabino a splashed white mezi tzv. pinto vzory (SPONENBERG, 2008). Končetiny jsou nejčastěji pigmentované. Hlava bude mít obvykle bílé odznaky, které mohou začínat na malé hvězdě a končit velmi rozsáhlou, nepravidelnou lucernou. Bílé skvrny mají jasné okraje (většinou ostřejší než tobiano), s tendencí horizontálního uspořádání zřídkakdy přecházející přes hřbet. Obvyklé jsou modré oči, a to i v případě, že srst v oblasti oka je barevná. Běžná je pigmentace obdélníkového tvaru na horním rtu (Color Information, 2002–2004). American Paint Horse Association (APHA) rozeznává tři geneticky odlišné vzory (frame overo, sabino a splashed white) a zařazuje je pod souhrnnou skupinu overo (SPONENBERG, 2008). Gen Frame je v homozygotní formě letální, koně jsou postiženi syndromem OLWS (Overo Lethal White Syndrome). Hříbata jsou téměř nebo zcela bílá (vzhledem k nepřítomnosti melanocytů v kůži) a umírají během několika dní na komplikace způsobené intestinální agangliózou. V humánní populaci se objevuje Hirschsprungova nemoc (vyskytuje se přibližně u 1/5000 živě narozených dětí), která je charakterizována absencí ganglií v různě dlouhém úseku gastrointestinálního traktu. Může být pozorováno i abnormální zbarvení kůže a pigmentové vzory. Obdobné onemocnění se vyskytuje i u hlodavců. Jako příčina byla zjištěna mutace v genu pro endothelinový receptor B (EDNRB). Gen reguluje tvorbu buněk neurální lišty, z níž se diferencují střevní ganglia a melanocyty (SANTSCHI et al., 1998). Onemocnění nelze řešit léčbou ani chirurgickým zákrokem (BOWLING, 1996).

57

Obr. 48 Bay frame overo (PH); PS

Obr. 49 Bay frame overo (PH); LS.

Obr. 50 Buckskin frame overo (PH); PS.

Obr. 51 Buckskin frame overo (PH); LS.

Obr. 52 Sorrel frame overo (PH); PS.

Obr. 53 Sorrel frame overo (PH); LS.

58

Hříbata postižená OLWS by měla být humánně uspána. Důležité je s jistotou vědět, že hříbě je skutečně lethal white, neboť bílí koně mohou být rovněž výsledkem maximálního vyjádření jednoho nebo několika vzorů a jsou plně životaschopní (Color Information, 2002–2004). Nepředpokládaný výskyt skvrnitých hříbat po jednobarevných rodičích vedl k hypotéze, že frame overo je děděno recesivně. Přezkoumáním záznamů plemenné knihy APHA (Americen Paint Horse Association) vyšlo najevo, že frame overo se předává jako autozomálně dominantní znak. Pokud by frame overo vykazovalo recesivní dědičnost, chovatelé by získali z křížení dvou frame koní zase pouze frame. Při takovém křížení je však výsledkem: 50 % frame overo (Frfr), 25 % jednobarevný kůň (frfr) a 25 % letální bílá (FrFr), což naznačuje dominantní alelu (BOWLING, 1996). Minimálně exprimovaný vzor vede často ke špatné identifikaci. Existují i koně frame overo, kteří nemají žádnou bílou skvrnu, pouze modré oči. Test genotypu frame overo tak nabývá na významu (Color Information, 2002–2004). Polymorfizmus v koňském EDNRB (mechanizmus účinku viz příloha X)genu je úzce asociován s OLWS. Následkem substituce v kodonu 118 dochází uvnitř první transmembránové domény k záměně isoleucinu za lysin. Všechna hříbata OLWS byla homozygotní, zatímco jejich rodiče heterozygotní. Jednobarevní koně byli homozygotní pro původní alelu. Polymorfizmus byl detekován AS-PCR. Výsledky silně naznačují, že Lys118 EDNRB alela hraje klíčovou roli v overo fenotypu. Jedna klisna s alelou Lys neměla žádný vzor. Ostatní geny mohou expresi vzoru ovlivňovat. Nelze vyloučit existenci další alely EDNRB u ostatních rodin paint horse, které nemusejí být letální v homozygotním stavu (SANTSCHI et al., 1998). V EDNRB genu (ECA17) byla nalezena dinukleotidová mutace. Substituce TC→AG způsobuje v první transmembránové doméně proteinu záměnu isoleucinu za lysin (kodon 118). Asociační analýza potvrdila homozygotní mutaci u všech hříbat OLWS. Mutace byla identifikována nejprve porovnáním sekvencí a poté potvrzena ASPCR (YANG et al., 1998). Tutéž dinukleotidovou mutaci v EDNRB genu uvádějí i Metallinos et al. (1998), navíc upozorňují na variabilní penetranci alely. Vzor tobiano může projev frame overa maskovat. Identifikace zodpovědného genu za OLWS pomůže chovatelům redukovat počet postižených hříbat. Gen je mezi savci vysoce konzervován.

59

3.5.4.9 Lokus Sb (Sabino – KIT) Termín sabino pochází podle některých zdrojů ze španělštiny – byli takto označováni clydesdaleští a arabští koně s typickým bílým vzorem. Jiné prameny uvádějí, že sabino znamená „náležející k oblasti Sabino“ – městu v severní Itálii (GOWER, 2000). V doslovném překladu ze španělštiny znamená „světlý“ nebo „tečkovaný“, v Mexiku a Argentině používají termín pro jedince flea bitten gray a ostatní vzory skvrnitosti. V Evropě a USA se používá označení sabino pro jedinečný vzor strakatosti (SPONENBERG, 2008). Charakteristikou sabina (viz obr. 54, 55; příloha III, obr. F; příloha V, obr. D) jsou bílé odznaky na hlavě, od několika bílých chlupů po rozsáhlou lucernu a odznaky na nohou – od bílé korunky po vysokou punčochu (není dáno, kolik bílých nohou má sabino mít, ale obecně – alespoň jedna noha bude bílý odznak mít). Skvrny směřují od břicha dorzálně. V maximálním projevu je kůň bílý. Okraje skvrn jsou prokvetlé, neostré a oči zřídkakdy modré (oproti frame overo). Prokvétání nemusí být u hříbat patrné, věkem se může rozšiřovat. Kůže bývá na některých místech tečkovaná. Málo projevená sabina nemusejí mít odznaky na hlavě vůbec (Color Information, 2002– 2004). Nejspolehlivějším znakem minimálně exprimovaného sabina je skvrna na bradě (GOWER, 2000). Sabino se objevuje u mnoha plemen: u Tennessee walking horse, quarter horse, morgana, anglického plnokrevníka a mnoha dalších. Plemena clydesdaleský a shirský kůň jsou výlučně sabina (Color Information, 2002–2004).

Obr. 54 Chest. sabino (westfálský kůň); PS.

Obr. 55 Chest. sabino (westfálský kůň); LS.

60

Sponenberg (2003) zkoumal potomky z jednobarevných klisen po pěti různě exprimovaných sabino hřebcích. Ze studie vyplývá, že sabino vykazuje polygenní dědičnost. Obecně – čím větší zastoupení bílé srsti hřebci měli, tím vyšší bylo procento jejich skvrnitých potomků. Lze však pozorovat i výjimky. Je dobře patrné, že několik genů malého účinku společně ovlivňuje množství a rozložení bílé u všech koní, ne pouze sabina. Vliv mají i faktory prostředí během prenatálního vývoje hříběte (SCOTT, 2006). Na základě obdobného fenotypu u člověka a prasete je KIT gen zvažován jako možný původce skvrnitosti sabino. Byl zkoumán jeden z typů sabina, označený sabino 1 (SB1). Heterozygoti se obecně projevují třemi ze čtyř následujících charakteristik: bílými odznaky na 2 a více končetinách, širokou lysinou na hlavě, skvrnami nebo prokvétáním na trupu a „roztřepenými“ okraji bílých skvrn. Homozygotní jedinci jsou téměř nebo zcela bílí. Sekvenování odhalilo v KIT genu substituci T → A v intronu 16, která vede k přeskočení exonu 17. Ztráta exonu 17 může vyústit v částečně nebo zcela nefunkční protein. Exon 17 kóduje část druhé domény tyrozin kinázy. Mutovaná alela ruší MnlI restrikční místo, což umožňuje detekci PCR-RFLP. Všichni koně homozygotní pro mutaci byli bílí, všichni heterozygoti vykazovali fenotyp sabino 1 (případně kombinaci více vzorů). U 13 koní s jiným typem sabino skvrnitosti však SNP nebyl nalezen. Fenotypy sabino a white jsou heterogenní a existují i další mechanizmy, jak mohou vzniknout. Pravděpodobně se jedná o další mutace uvnitř KIT nebo ostatních genů (BROOKS et BAILEY, 2005).

3.5.4.10 Odznaky na hlavě a končetinách Přítomnost odznaků je jedním z viditelných znaků, které odlišují domestikované koně od divokých předků. Kůže pod odznaky je nejčastěji růžová. Jsou obvyklé u většiny plemen a slouží jako cenný nástroj pro identifikaci koně. U některých plemen se odznaky nevyskytují – např. u fríského koně a clevelandského hnědáka. Značná rozmanitost je patrně zapříčiněna mnoha alelami, které ovlivňují migraci melanocytů. Vliv prostředí je patrný – ani u jednovaječných dvojčat nejsou bílé odznaky shodné (BOWLING, 1996). U arabských plnokrevníků se dědí kvantitativně, patrně obdobně je tomu i u ostatních plemen. Odznaky jsou kontrolovány více geny na samostatných lokusech, jejichž kombinace určuje jejich rozsah. Některé vzory skvrnitosti však mohou

61

významnou měrou k odznakům přispět. Minimálně exprimovaná sabina mají rozsáhlé bílé odznaky. Genetická kontrola vzoru sabino je komplikovaná a kontroverzní a její vztah k odznakům není jasný. Dalšími kandidáty monogenního efektu jsou frame overo, tobiano a splashed white (SPONENBERG, 2003). Gower (2000) si pokládá otázku: „Kde končí bílé odznaky a začíná vzor sabino“? Nabízí teorii původní alely „no white“ N, dominantní vůči normálním bílým odznakům n. Tzn. – kůň bez odznaků musí mít alespoň jednoho takového rodiče. Zmiňuje možnost samostatných genů pro odznaky na hlavě a končetinách. U recesivních homozygotů nn by rozsah bílé ovlivňovaly modifikující geny jako sabino. Je rovněž možné, avšak neobvyklé, že nn nemusí nést žádné modifikující alely, tedy odznaky mít nebude. Genotyp a fenotypový projev by byl následující: N-Sb- a N-sbsb bez jakýchkoliv odznaků; nnSb- fenotyp sabino (i maximálně exprimované); nnsbsb standardní bílé odznaky. U plemene Franches-Montagnes se, v rozporu s chovným cílem, za posledních 30 let depigmentované oblasti značně rozšířily. Heritabilita pro bílé odznaky je vysoká (h2 > 0,5). Segregační analýza naznačuje model zahrnující polygenní dědičnost a bialelický majorgen, jehož recesivní alela zvyšuje rozsah bílé. Pomocí multilokusové analýzy vazbové nerovnováhy byl tento lokus umístěn do chromozomální oblasti ECA3q, kde se nachází KIT gen. Mezi alelou chestnut (e) MC1R genu a rozsahem odznaků byla zjištěna vysoce pozitivní korelace. Tato skutečnost může být výsledkem vazbové nerovnováhy mezi e alelou MC1R a recesivní alelou doposud neznámého majorgenu nacházející se blízko KIT genu (RIEDER et al., 2008). Obdobný problém nastává u starokladrubského vraníka – bílé odznaky jsou nežádoucí, podléhají negativní selekci, přesto se v chovu rozšiřují. Situace je závažnější, neboť chovná zákládna je velmi úzká (REGNER, 2007).

62

3.5.4.11 Lokus Spl (Splashed white) Splashed white Splashed white (viz obr. 56, 57) je ze všech pinto vzorů nejméně obvyklý, nicméně jeho výskyt má stoupající tendenci. Sporadicky se objevuje především u plemen: velšský pony, islandský pony, paint horse a finský kůň. Rozmístění vzoru vytváří dojem koně ponořeného do bílé barvy (splashed = rozstříknutý). Končetiny jsou obvykle bílé, stejně tak hlava a ventrální část trupu, oči jsou často modré. Přechody bílé a zbarvené srsti jsou jasné, neprokvetlé. Vzor se dědí dominantně. Mnoho koní je postiženo hluchotou. Doposud nebyl evidován žádný homozygotní splashed white, což vede k podezření, že tito jedinci nejsou životaschopní (SPONENBERG, 2008). Gen pro splashed white není znám, ani nebyl doposud zmapován (BROOKS et BAILEY, 2005).

Obr. 56 Buck. splashed white (morgan); PS.

Obr. 57 Buck. splashed white (morgan); LS.

63

3.5.4.12 Gen To (Tobiano – KIT) Tobiano Vzor byl pojmenován po brazilském generálovi Tobíasovi, který přitáhl se svým vojskem v polovině 19. století do Argentiny. Mnoho vojáků doprovázejících Tobíase jelo právě na strakatých tobiano koních z Brazílie (SPONENBERG, 2003; 2008). Vzor tobiano je determinován autozomálně dominantní alelou To. Kůň fenotypu tobiano (případně v kombinaci s jiným vzorem) bude mít tedy genotyp ToTo nebo Toto, non-tobiano toto. Strakatost je patrná již při narození. Charakteristikou tobiana jsou odznaky na končetinách a jasně ohraničené okrouhlé bílé skvrny různého rozsahu, přecházející přes hřbet s tendencí vertikálního uspořádání. Odznaky na hlavě se vyskytují ve stejné míře jako u ostatních koní, pro tobiano nejsou typické. Kůže pod skvrnami je růžová, nicméně v místech, kde přechází bílá srst v pigmentovanou, může být kůže tmavá, což vytváří tzv. efekt svatozáře nebo stínu (viz obr. 64, 65). Oči jsou obvykle tmavé, hříva a ocas mohou být dvojbarevné. Rozsah skvrnitosti je různý (viz obr. 58–67), minimálně exprimovaní jedinci budou mít pouze rozsáhlé odznaky na končetinách, v maximálním vyjáření budou téměř bílí, pigmentovaná zůstane pouze hlava (tzv. medicine hat). Zvláštností tobiana jsou malé skvrny, ink spots – „inkoustové kaňky“ nebo paw prints – „otisky tlapek“ (viz příloha IV, obr. B; příloha VII, obr. C, D), které se mohou objevit na bílé srsti a jsou asociovány s homozygotností ToTo, která však není absolutní (BOWLING, 1996; GOWER, 2000; SPONENBERG, 2003). Projevení „paw prints“ nebo „ink spots“ může být potlačeno geny, které zvyšují rozsah bílé. Další nedefinované geny mohou vytvářet skvrny i u heterozygotních koní (BOWLING, 1996). Se vzorem tobiano není spojováno žádné onemocnění nebo defekt (BOWLING, 1996; GOWER, 2000; SPONENBERG, 2003). Ve Velké Británii se strakatí koně rozdělují bez ohledu na vzor do kategorií „piebald“ (černobíle strakatý), „skewbald“ (bílé skvrny s jednolitou barvou kromě černé) a „odd-coloured“ (bílá s jednou či více barvami) (BOWLING, 1996). Doposud není přesně znám mechanizmus, který ovlivňuje rozsah skvrnitosti. Gower (2000) předpokládá, že vliv mají modifikující geny, které nesou všichni koně, avšak projeví se pouze u tobiana. Uvádí příklad jednobarevného chestnut hřebce Rannock. Ze spojení hřebce s pěti různě exprimovanými tobiano klisnami byla všechna narozená hříbata téměř identického vzoru, což naznačuje vliv modifikujících genů, které Rannock nese.

64

Mezi plemena s výskytem tobiano patří například paint horse, shetlandský pony, islandský pony, Missouri foxtrotter, Tennessee walking horse, american saddlebred, paso fino, mongolský kůň a mnoho dalších. Tobiano vzor však neobjevíme u anglického plnokrevníka, quarter horse nebo arabského plnokrevníka (BOWLING, 1996). V České republice nalezneme strakatost tobiano rovněž u paint horse, dále u českého teplokrevníka, huculského koně, českého sportovního pony, shetlandského pony a dalších.

Obr. 58 Bay tobiano (paint horse); PS.

Obr. 59 Bay tobiano (paint horse); LS.

Obr. 60 Bay dun tobiano (4 plem. kříž.); PS.

Obr. 61 Bay dun tobiano (4 plem. kříž.); LS.

65

Obr. 62 Sorrel tobiano (paint horse); PS.

Obr. 63 Sorrel tobiano (paint horse); LS.

Obr. 64 Black tobiano (paint horse); PS.

Obr. 65 Black tobiano (paint horse); LS.

Obr. 66 Sorrel tobiano (paint horse); PS.

Obr. 67 Sorrel tobiano (paint horse); LS.

Z fenotypu nelze spolehlivě usuzovat na zygotnost tobiana. Kombinaci alel lze odvodit z potomstva. Hřebec tobiano, který při křížení s nejméně 10 jednobarevnými klisnami dal všechna hříbata tobiano, je s 99,9% pravděpodobností homozygotní (BOWLING, 1996).

66

Gen To tvoří vazbovou skupinu (LG II) s geny pro albumin (Al), pro vazebné proteiny pro vitamin D (GC – group-specific component), extension (E) a roan (Rn) a esterázu (ES) (ANDERSSON et SANDBERG, 1982). Se vzorem tobiano jsou asociovány alely AlB a GCS. Nejméně 90 % tobiano koní má AlB a GCS alely. Test je biochemický a pro co nejpřesnější výsledek se provádí u zkoumaného jedince i obou rodičů. Součástí je analýza rodokmenu. Vysoká frekvence GCS mezi tobiany je nápadná, protože tento marker je u většiny plemen velmi vzácný. Kombinace genů by mohla být udržována chromozomální inverzí, která pomáhá vazbovou skupinu konzervovat. U non-tobiano koní je vzdálenost mezi E a Al-GC 7 cM, což předpokládá 7 % rekombinací u potomků. U tobiano koní je výskyt mnohem nižší, což podporuje teorii chromozomální inverze. Inverze konzervuje Al-B a GC-S a brání crossing overu mezi E (MC1R) a Al-GC (BOWLING, 1996). Duffield et Goldie (1998) uvádějí, že alela To je ve vazbě s AlA i AlB. Frekvence To:AlA byla mezi homozygotními tobiano koňmi 0,08; To:AlB haplotyp se vyskytoval ve frekvenci 0,92. Předpokládají, že frekvence To:AlA vzroste s využíváním koní tohoto haplotypu v plemenitbě. Gen KIT Silným kandidátním genem pro tobiano je protoonkogen C-kit (KIT), který u člověka, prasete a myši způsobuje bílou skvrnitost (BROOKS et al., 2002). KIT kóduje receptor s transmembránovou tyrozin kinázou (stem cell factor receptor). Ligandem tohoto receptoru je KITLG (KIT ligand) neboli SCF (stem cell factor – faktor kmenových buněk; také nazýván mast cell growth factor – růstový faktor mastocytů), který ovlivňuje tvorbu, zrání a přežívání (tlumení apoptózy) nejen mastocytů, ale i melanoblastů a melanocytů, krvetvorných kmenových buněk, intraepiteliálních T-gama/delta lymfocytů, intersticiálních Cajalových buněk a zárodečných buněk (HRUŠKOVIČ et HRUŠKOVIČ, 1999). Tento ligand je kódován genem KITLG (BEGHINI, 1998). Nachází se na ECA28 (Ensembl Horse, 2008). Jakmile prekurzory melanocytů exprimující KIT dosáhnou epidermis, rozšiřují se během následujících 2–3 dnů po povrchu embrya. Exprese začíná od hlavy a pokračuje přes hřbet k ocasu. Mutace v KIT nebo KITLG genu blokují migraci stejně tak jako přežití prekurzorů melanocytů. Mnohé mutace v genu KIT jsou charakterizovány rozsáhlými chromozomálními inverzemi nebo delecemi (WEHRLE-HALLER, 2003).

67

Receptorové tyrozinkinázy (RTK) jsou transmembránové proteiny, skládající se z části extracelulární, transmembránové a intracelulární, přičemž extracelulární část vytváří receptor pro specifický ligand a část intracelulární je nositelem tyrozinkinázové domény, která je aktivována konformačními změnami proteinu po vazbě ligandu. Tato aktivace vede k dimerizaci příslušné RTK a autofosforylaci tyrosinových zbytků v tyrosinkinázové doméně, čímž se stabilizuje vazné místo pro intracelulární signální molekuly (DAUM et al., 2006–2008). U koní se KIT nachází na ECA3q21 (RAUDSEPP et al., 1999). Chromozom ECA3 je dlouhý 119 479 920 bp, obsahuje 32 genů kódujících známý protein, 803 genů kódujících nový protein a 146 pseudogenů (Ensembl Horse, 2008). KIT gen je dlouhý přibližně 80 tis. bp a obsahuje 22 exonů (National Center for Biotechnology Information, 2008). Tobianu je fenotypově podobný bílý pás, který se nachází u některých plemen prasat (Hampshire). Belt (z angl. „pás“) lokus se u Hampshira nachází na SSC8p12 v oblasti genu KIT. Rozsah bílé je patrně ovlivňován dalšími geny (GIUFFRA et al., 1999). Další homologii nacházíme u člověka. Piebaldismus u lidí je autozomálně dominantní

porucha

vývoje

melanocytů.

Je

charakterizován

vrozenými

depigmentovanými skvrnami kůže a vlasů lokalizovanými především na čele, temeni, končetinách a trupu. Piebaldismus je způsoben chybnou proliferací nebo migrací melanoblastů z neurální lišty během raného vývoje a je zapříčiněn abnormalitami v KIT, který se u člověka nachází na HSA4q12 (SPRITZ, 1992). Cooper et al. (2005) pozorovali vazbu bílé skvrnitosti u koček ke KIT genu. Nevylučují ani PDGFRA (platelet-derived growth factor alpha), neboť tvoří s KIT genem vazbovou skupinu. Rovněž u myši způsobuje KIT gen bílou skvrnitost (MOTRO et al., 1991). Mutace Rw (rump-white) je důsledkem inverze na 5. chromozomu (STEPHENSON et al., 1994). Porovnáváním DNA sekvencí jednobarevných koní a koní homozygotních pro gen tobiano (To) byl nalezen v intronu 13 protoonkogenu C-kit (KIT) polymorfizmus MspI (substituce C→G v pozici 693). Alela s restrikčním místem asociovaná se vzorem tobiano byla nazvána KM1, alela bez restrikčního místa KM0. Všech 129 koní tobiano neslo alelu KM1, nicméně 3 ze 104 testovaných jednobarevných koní rovněž nesli alelu KM1. Přestože alela KM1 je silně vázaná s genem To, asociace není absolutní. Nicméně,

68

test se jeví mnohem účinnější pro identifikaci homozygotů ToTo než současný biochemický test využívající Al a GC haplotypu (BROOKS et al., 2002). Raudsepp et al. (1999) testovali možnou přítomnost chromozomální inverze u tobiano koní pomocí metody FISH mapováním KIT, PDGFRA, Al a MC1R . Sondy byly nejdříve aplikovány individuálně, posléze v kombinacích (KIT-Al; KIT-MC1R; KIT-PDGFRA a Al-PDGFRA a Al-MC1R) u tobiano a non-tobiano koní, u heterozygotních i homozygotních koní. Nebyl nalezen žádný rozdíl v chromozomální lokalizaci jednotlivých sond mezi koňmi třech zmíněných genotypů. Tento výsledek nevylučuje inverzi postihující chromozomální region nacházející se uvnitř mapovaných lokusů. Porovnání ECA3 třech různých genotypů G-pruhováním neukázalo žádné rozdíly.

69

Rovněž Brooks et al. (2007) zkoumali možný výskyt inverze ECA3. Metodou FISH (viz obr. 68) bylo označeno několik markerů na ECA3: KDR (kinase insert domain receptor), 5´ netranslatovaná oblast a exon 1, KIT – exon 21, ALB (albumin), Clock marker, GABRB1 (gamma-aminobutyric acid receptor, beta 1) a „558“ (konzervovaná intergenová sekvence korespondující s oblastí lidského chromozomu HSA4q, nacházející se v místě zlomu). Sondy byly vybírány na základě homologie se sekvencí člověka. Porovnání výsledků od koní tobiano a non-tobiano odhalilo chromozomální paracentrickou inverzi, která zahrnuje přibližně třetinu celkové délky ECA3. Dva homozygotní tobiano koně nesli pouze chromozomy s inverzí, čtyři heterozygotní 1 invertovaný a 1 normální, u 2 non-tobiano koní inverze pozorována nebyla (BROOKS et al., 2007).

Obr. 68 Normální ECA3 a s inverzí – FISH (BROOKS et al., 2007).

70

Distální zlom inverze je lokalizován mezi KDR (kinase insert domain receptor) a KIT v oblasti ECA3q21. Proximální zlom leží mezi geny ADH1C (alcohol dehydrogenase 1C) a PDLIM5 (PDZ and LIM domain 5) v oblasti 3q13 (viz obr. 69). Distální zlom lze identifikovat pomocí PCR – přímý primer ohraničuje zlom zdola, 2 reverzní primery jsou pak specifické pro non-tobiano a pro tobiano (viz příloha XIII). Test PCR opět vykázal úplnou asociaci inverze s tobiano fenotypem. Paracentrická inverze (zasahuje jen jedno raménko) neruší kódující sekvenci žádného známého genu a není zcela jasné, jakým mechanizmem způsobuje tobiano fenotyp. Inverze by mohla porušit konzervovanou nekódující nebo regulační sekvenci KIT genu. Výskyt inverze mezi plemeny rozdílného původu naznačuje, že je starší, než evoluční rozdělení plemen. Doposud nebyla nalezena žádná výjimka mezi asociací této inverze s tobiano fenotypem (BROOKS et al., 2007).

Obr. 69 Schéma inverze ECA3 a přeskupení genů (BROOKS et al., 2007).

71

3.5.4.13 Kombinace vzorů U kombinací je často obtížné rozlišit z fenotypu jednotlivé vzory. Projev jednoho ze vzorů může být potlačen. Kombinace může vyústit v rozsáhlé zastoupení bílé plochy na úkor pigmentované, což nebývá žádoucí (GOWER, 2000). Příkladem může být medicine hat (z angl. „sesterský čepec“), u něhož zůstává pigmentovaná nejčastěji pouze krajina okolo uší (odtud název). Medicine hat může být výsledkem homozygotního sabina, overo/tobiano (tovero), sabino/overo nebo sabino/tobiano (SPONENBERG, 2003). Tovino je výsledkem kombinací všech tří alel (GOWER, 2000). Obecnou charakteristikou tovera (viz příloha IV, obr. A, B) je tmavá pigmentovaná srst v okolí uší, která se může rozšiřovat na čelo a (nebo) oči, jedno nebo obě modré oči, tmavá pigmentace kolem huby, která se může po stranách protahovat a tvořit skvrny. Rozsah bílé na trupu je v různém rozsahu (Tovero Pattern, 2008). Genotyp T-,Frfr. Dva příklady kombinace se vzorem tobiano (viz obr. 70, 71). Nelze vyloučit, že fenotyp koně na obr. 66, 67 (registrován jako tobiano) je výsledkem kombinace vzorů (patrně tobiano/sabino).

Obr. 70 Bay tobiano/sabino (ČT).

Obr. 71 Bay tobiano/varnished roan (WPB).

72

4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Odběr vzorků Z počtu 150 koní bylo 130 vzorků odebráno osobně. Byl vytržen svazek žíní z hřívy nebo ocasu a uložen do označeného plastikového sáčku na zip. Fenotyp byl zaznamenán, ve většině případů včetně fotografické dokumentace. Zbylé vzorky zaslali chovatelé (fenotyp doložen slovním popisem a fotografií). Z celkového počtu 150 koní bylo 61 tobiano (do této skupiny byly zahrnuty i minimálně exprimované vzory, kombinace s jiným vzorem a gray tobiano, kde již strakatost nemusí být z fenotypu rozpoznatelná). Tabulka plemen a fenotypů koní zkoumaného souboru je uvedena v příloze IX.

4.2 Izolace DNA DNA byla izolována z chlupových cibulek pomocí JETQUICK® Blood & Cell culture DNA Spin Kit (GENOMED). Postup izolace ƒ

Odstřižené chlupové cibulky (průměrně 10) vyluhovány v 200 µl PBS.

ƒ

Přidáno 20 µl GENOMED proteázy (20 mg/ml) nebo 25 µl proteinázy K (dle šarže), následně 200 µl pufru K1, vortexováno.

ƒ

Inkubace 20 min. při 58 ºC (proteináza K – 20 min. při 70 ºC).

ƒ

Zchlazeno na pokojovou teplotu, přidáno 200 µl absolutního ethanolu, vortexováno.

ƒ

Roztok (bez cibulek) přepipetován do kolonky s 2 ml centrifugační zkumavkou, centrifugace 1 min. při 10 000 rpm.

ƒ

Obsah centrifugační zkumavky vylit, přidáno 500 µl pufru KX, centrifugace 1 min. při 10 000 rpm.

ƒ

Obsah centrifugační zkumavky vylit, přidáno 500 µl pufru K2, centrifugace 1 min. při 10 000 rpm.

ƒ

Obsah centrifugační zkumavky vylit, cetnrifugace 1 min. při 13 000 rpm.

ƒ

Kolonka přemístěna do sterilní 1,5 ml zkumavky, přidáno 100 µl elučního pufru 10mM Tris-Cl pH 9, zahřátého na 70 ºC .

73

ƒ

Inkubováno 2 min. při pokojové teplotě, následně centrifugace 2 min. při 10 000 rpm.

ƒ

Ve zkumavce získán roztok (Jetquick Blood & Cell Culture DNA Spin Kit).

Výsledek izolace byl ověřen na 2% agarózovém gelu (pufr TBE), vizualizace ethidium bromidem za použití UV světla. Shodný způsob vizualizace byl použit i ve všech navazujících analýzách.

4.3 Detekce polymorfizmu v intronu 13 genu KIT Dle metodiky Brooks et al. (2002), optimalizace vlastní.

4.3.1 PCR PCR optimalizována pro termální cykler PTC 200 (MJ Research) (viz obr. 72). Primery: KIT-II 3-11F 5´- ACCCGCTTGCATTTTATCACCTGTCG - 3´ KIT-II 3-1235R 5´- CGAGCATATAGGAAAAGGGTAGAAAGAGGTGAG - 3´

Optimalizovaná reakční směs Celkový objem 25 μl ƒ

2 μl templátové DNA

ƒ

19,55 μl H2O

ƒ

2,5 μl 10 x LA PCR buffer complete (Top-Bio)

ƒ

0,5 μl 10mM dNTP mixu (Fermentas)

ƒ

0,125 μl primeru KIT-II 3-11F (10 pmol/μl) (Invitrogen™)

ƒ

0,125 μl primeru KIT-II 3-1235R (10 pmol/μl) (Invitrogen™)

ƒ

0,2 μl LA DNA polymerázy (5 U/μl) (Top-Bio)

74

Teplotní profil PCR reakce: Optimalizace ƒ

úvodní denaturace 95 °C/2 min.

ƒ

35 cyklů

ƒ

–

denaturace 95 °C/20 s

–

annealing 65 °C/30 s

–

elongace 68 °C/70 s

závěrečná elongace 68 °C/10 min. Obr. 72 PTC 200 (MJ Research).

PCR produkt byl vizualizován na 2% agarózovém gelu.

4.3.2 RFLP PCR produkt byl štěpen restrikční endonukleázou MspI. Celkový objem 15 μl ƒ

5 μl PCR produktu

ƒ

8,4 μl H2O

ƒ

1,5 μl 10x Buffer Y+/TANGO™ with BSA (Fermentas)

ƒ

0,1 μl (1 U) MspI (Fermentas)

Inkubováno při 37 °C přes noc. Štěpené fragmenty byly elektroforeticky separovány na 2% agarózovém gelu (pufr TBE).

75

4.4 Detekce chromozomální inverze ECA3 (PCR) PCR byla optimalizována pro termální cykler PTC 200 (MJ Research). Byla použita metodika dle Brooks et al. (2007), optimalizace vlastní. Primery: ECA3-F 5´- TGATAGATCAGTGTAGACGTAGTGTGACAGAGAC - 3´ ECA3xR 5´- AACAGCTACTCCCACTCTAGCATAGGTTC - 3´ ECA3toR 5´- TTCACCACAGAGTATCCAATTATGTCTTTCACATAATGC- 3´

Optimalizovaná reakční směs Celkový objem 25 μl ƒ

2 μl templátové DNA

ƒ

18,3 μl H2O

ƒ

2,5 μl 10 x LA PCR buffer complete (Top-Bio)

ƒ

0,5 μl 10 mM dNTP mixu (Fermentas)

ƒ

0,5 μl primeru ECA3-F (10 pmol/μl) (Invitrogen™)

ƒ

0,5 μl primeru ECA3xR (10 pmol/μl) (Invitrogen™)

ƒ

0,5 μl primeru ECA3toR (10 pmol/μl) (Invitrogen™)

ƒ

0,2 μl LA DNA polymerázy (5 U/μl) (Top-Bio)

Teplotní profil PCR reakce: ƒ

úvodní denaturace 95 °C/2 min.

ƒ

30 cyklů

ƒ

–

denaturace 95 °C/20 s

–

annealing 57 °C/30 s

–

elongace 68 °C/20 s

závěrečná elongace 68 °C/7 min.

76

4.5 Statistické vyhodnocení 4.5.1 Frekvence genotypů a alel Tab. 5 Výpočet frekvencí genotypů (URBAN, 2006). Genotypy

absolutní frekvence

relativní frekvence

AA

D

d = D/N

Aa

H

h = H/N

aa

R

r = R/N

Σ

D+H+R=N

d+h+r=1

Tab. 6 Výpočet frekvencí alel (URBAN, 2006). Alely

absolutní frekvence

relativní frekvence

A

P = 2D + H

p = (2D + H)/2N = d + ½ h

a

Q = 2R + H

q = (2R + H)/2N = r + ½ h

Σ

P + Q = 2N

p+q=1

D, H, R = absolutní frekvence genotypů d, h, r = relativní frekvence genotypů P, Q = absolutní frekvence alel p, q = relativní frekvence alel N = absolutní frekvence všech jedinců

77

4.5.2 Vyhodnocení v programu SAS Výsledky zpracovány ve statistickém programu SAS (verze pro Windows 9.1.3), pomocí procedury FREQ. Byl použit χ2 test a Fisherův exaktní test. Oba testy slouží k testování asociací mezi kategorickými proměnnými (Statistical examples).

4.5.2.1 Pearsonův χ2 test Pearsonův χ2 test dobré shody vychází z tabulky frekvencí a testuje nulovou hypotézu (H0), která předpokládá, že četnosti v jednotlivých kategoriích se rovnají četnostem očekávaným. Hypotéza H0 udává, že neexistuje žádná asociace mezi dvěma proměnnými. Očekávané četnosti vycházejí z náhodného rozdělení. Je-li vypočítaná hodnota vyšší než tabulková, zamítáme H0. Rozdíl mezi skutečnými četnostmi v souboru a očekávanými je tedy příliš velký na to, aby byl pouze důsledkem náhodného výběru (je statisticky významný) (RIMARČÍK, 2000–2008; Chí-kvadrát test).

χ 2 = ∑∑ i

(Oij − Eij )2 Eij

j

Oij = pozorovaná frekvence (observed) Eij = očekávaná (expected); předpokládaná, teoretická frekvence dle nulové hypotézy

Eij =

ni × nj n

ni = součet hodnot v řádku nj = součet hodnot v sloupci n = celkový součet v tabulce

78

df = (R − 1)× (C − 1) df = stupně volnosti (degrees of freedom) R = počet řádků tabulky (row) C = počet sloupců tabulky (column) (Chi SquareTests and Statistics, 1999).

4.5.2.2 Fisherův exaktní test Fisherův exaktní test (faktoriálový) je alternativou ke χ2 testu. Je založen na přesných pravděpodobnostech specifické, hypergeometrické distribuce. Výstupem testu je P hodnota (SIMON, 2008).

P=

(a + b ) !(c + d ) !(a + c ) !(b + d ) ! n !a !b !c !d !

a, b, c, d = zjištěné hodnoty v jednotlivých buňkách tabulky (uvedeno pro tabulku 2*2) n = celkový součet v tabulce (Fisherův test, 2008).

79

5 VÝSLEDKY PRÁCE 5.1 Izolace DNA

Obr. 73 Ověření výsledku izolace.

Výsledek izolace byl ověřen na 2% agarózovém gelu (viz obr. 73). Přestože standardně se k izolaci DNA z chlupových cibulek používá Kit pro izolaci z tkání – JETQUICK® Tissue DNA Spin Kit (GENOMED), lze konstatovat, že při prodloužení doby inkubace z doporučovaných 10 (pro izolaci z krve) na minimálně 20 minut je JETQUICK® Blood & Cell culture DNA Spin Kit pro izolaci DNA z chlupových cibulek koní vhodný.

5.2 Detekce polymorfizmu v intronu 13 genu KIT 5.2.1 Ověření kvality PCR produktu intronu 13 genu KIT Při prvních reakcích PCR (annealing v souladu s metodikou Brooks et al. (2002) 60 °C/30 s) vznikaly výrazné nespecifické produkty – dimery primerů (viz obr. 74). Proto byl objem obou primerů snižován z původních 0,5 μl až na výsledné 0,125 μl a současně zvyšována teplota annealingu (65 °C/30 s) (viz obr. 75). Tímto postupem se podařilo nespecifické produkty téměř odstranit a současně optimalizovat intenzitu PCR produktu pro následné štěpění restrikční endonukleázou.

80

Obr. 74 Ověření kvality PCR produktu I.

Obr. 75 Ověření kvality PCR produktu II – optimalizace.

Z izolátů velmi sytě zbarvených koní chestnut nevznikal PCR produkt. Denaturací těchto vzorků se nepodařilo problém odstranit, řešením bylo snížení množství templátové DNA (na 0,5 μl) a zvýšení cyklů PCR (až na 40). Vizualizované izoláty „problémových“ vzorků nejevily na gelu žádnou odlišnost od vzorků ostatních. Inhibice PCR reakce by mohla být zapříčiněna obsahem neznámých inhibitorů.

81

5.2.2 Stanovení genotypu intronu 13 genu KIT PCR produkt (1249 bp) tvoří po štěpění MspI v závislosti na genotypu fragmenty následujících velikostí (viz obr. 76). . ƒ KM0KM0 – 189 a 1060 bp ƒ

KM1KM0 – 189, 397, 663 a 1060 bp

ƒ

KM1KM1 – 189, 397 a 663 bp

Se vzorem tobiano je asociována alela KM1. Pozn. Sekvence intronu byla vyhledána v databázi NCBI (GenBank) pod přístupovým číslem AY048669 (BROOKS et al., 2002). Oblasti nasedání primerů a restrikční místa MspI jsou znázorněny v příloze XII. Sekvence o délce 1460 bp byla vložena do programu Sequence extractor. Velikost PCR produktu vyhodnocená programem byla 1222 bp (provedena i manuální kontrola), což je o 27 nukleotidů kratší, než udávají Brooks et al. (2002). Velikost štěpených fragmentů je pak 163, 397 a 662 bp. Z gelu nelze s jistotou tak malý rozdíl rozpoznat. Sekvenování PCR produktu nebylo provedeno. Nelze vyloučit chybně zadanou sekvenci v databázi nebo chybný údaj ve článku. V práci uváděna velikost PCR produktu dle Brooks et al., (2002).

Obr. 76 Stanovení genotypů – intron 13 genu KIT (RFLP), 2% gel.

82

Použitá

2%

koncentrace

gelu

–

v

souladu

s metodikou Brooks et al. (2002) – je pro detekci polymorfizmu dostačující, nicméně pro lepší přehlednost, vizualizaci nejkratšího fragmentu a odhalení případných nespecifit je vhodnější 3% gel (viz obr.77). Vliv může mít i použitá agaróza.

Obr. 77 Gel 3%.

5.3 Detekce chromozomální inverze ECA3 (PCR) Velikost PCR produktu ƒ

209 bp u chromozomu s inverzí (tobiano)

ƒ

152 bp u normálního chromozomu

Obr. 78 Stanovení genotypů – chromozomální inverze ECA3 (PCR).

83

U několika vzorků vznikl i nespecifický PCR produkt o velikosti přibližně 100 bp (viz obr. 79). Při opakování vzorků při zvýšené teplotě annealingu (60 °C) byly nespecifity slabší, případně nevznikly vůbec. Výskyt nespecifity neovlivňuje detekci chromozomální inverze.

Obr. 79 Stanovení genotypů – chromozomální inverze ECA3 (PCR), nespecifický produkt.

84

5.4 Statistické vyhodnocení 5.4.1 Frekvence genotypů a alel 5.4.1.1 Frekvence genotypů a alel intronu 13 genu KIT Tab. 7 Frekvence genotypů intronu 13 genu KIT celého zkoumaného souboru. Genotyp

četnost absolutní

četnost relativní

KM1 KM1

8

0,0533

KM1 KM0

53

0,3533

KM0 KM0

89

0,5933

Σ

150

1

Tab. 8 Frekvence genotypů intronu 13 genu KIT pouze koní tobiano. Genotyp

četnost absolutní

četnost relativní

KM1 KM1

8

0,1311

KM1 KM0

53

0,8689

KM0 KM0

0

0

Σ

61

1

Frekvence stanoveny samostatně i pro koně plemene paint horse vzhledem k významu strakatosti u tohoto plemene i vysokému zastoupení ve zkoumaném souboru (viz tab. 9, 10, 17, 18). Tab. 9 Frekvence genotypů intronu 13 genu KIT koní plemene paint horse. Genotyp

četnost absolutní

četnost relativní

KM1 KM1

6

0,1091

KM1 KM0

36

0,6545

KM0 KM0

13

0,2364

Σ

55

1

85

Tab. 10 Frekvence alel intronu 13 genu KIT celého zkoumaného souboru. Alela

četnost absolutní

četnost relativní

KM1

69

0,23

KM0

231

0,77

Σ

300

1

Tab. 11 Frekvence alel intronu 13 genu KIT pouze koní tobiano. Alela

četnost absolutní

četnost relativní

KM1

69

0,5656

KM0

53

0,4344

Σ

122

1

Tab. 12 Frekvence alel intronu 13 genu KIT koní plemene paint horse. Alela

četnost absolutní

četnost relativní

KM1

48

0,4364

KM0

62

0,5636

Σ

110

1

86

5.4.1.2 Frekvence genotypů a alel chromozomální inverze ECA3 Tab. 13 Frekvence genotypů chromozomální inverze ECA3 celého zkoumaného souboru. Genotyp

četnost absolutní

četnost relativní

Inv Inv

5

0,0333

Inv +

56

0,3733

++

89

0,5933

Σ

150

1

Tab. 14 Frekvence genotypů chromozomální inverze ECA3 pouze koní tobiano. Genotyp

četnost absolutní

četnost relativní

Inv Inv

5

0,082

Inv +

56

0,918

++

0

0

Σ

61

1

Tab. 15 Frekvence genotypů chromozomální inverze ECA3 koní plemene paint horse. Genotyp

četnost absolutní

četnost relativní

Inv Inv

5

0,0909

Inv +

37

0,6727

++

13

0,2364

Σ

55

1

Tab. 16 Frekvence alel chromozomální inverze ECA3 celého zkoumaného souboru. Alela

četnost absolutní

četnost relativní

Inv

66

0,22

+

234

0,78

Σ

300

1

87

Tab. 17 Frekvence alel chromozomální inverze ECA3 pouze koní tobiano. Alela

četnost absolutní

četnost relativní

Inv

66

0,541

+

56

0,459

Σ

122

1

Tab. 18 Frekvence alel chromozomální inverze ECA3 koní plemene paint horse. Alela

četnost absolutní

četnost relativní

Inv

47

0,4273

+

63

0,5727

Σ

110

1

88

5.4.1.3 Absolutní frekvence genotypů vzhledem k fenotypu rodičů Tab. 19 Absolutní frekvence genotypů vzhledem k fenotypu rodičů. KM0 KM0

++

KM1 KM0

Inv +

KM1 KM1

Inv Inv

tobiano s 1 rodičem tob.

0

0

42

45

3

0

tobiano s 2 rodiči tob.

0

0

11

11

5

5

non-tobiano s 1 rodičem tob.

8

8

0

0

0

0

non-tob. s 2 rodiči non-tob.

81

81

0

0

0

0

Z tabulky vyplývá, že tři jedinci s pouze jedním rodičem tobiano byli homozygotní KM1KM1 pro polymorfizmus v intronu 13 genu KIT.

5.4.2 Vyhodnocení v programu SAS Tab. 20 Fenotyp v závislosti na genotypu intronu 13 genu KIT – pro všechny jedince. genotyp non-tobiano tobiano

četnost oč./poz. pozorovaná

KM0 KM0 89

KM1 KM0 0

KM1 KM1 0

očekávaná

52,807

31,447

4,7467

pozorovaná

0

53

8

očekávaná

36,193

21,553

3,2533

89

53

8

Σ

Hodnota χ2 testu: 150,00; 2 stupně volnosti; P < 0,0001 Hodnota Fisherova exaktního testu: 1,467 * 10-43 ; P < 0,01 Programem SAS bylo vyhodnoceno, že některé buňky mají hodnotu menší než 5 a χ2 kvadrát může být testem neplatným. Pokud je očekávaná hodnota v tabulce proměnných menší než 5, je vhodné použít Fisherův exaktní test (Statistical examples). Ve všech případech výsledky Fisherova testu potvrdily χ2 test.

89

Σ 89 61 150

Tab. 21 Fenotyp v závislosti na genotypu ECA3 – pro všechny jedince. genotyp non-tobiano tobiano

četnost oč./poz.

Σ

pozorovaná

++ 89

Inv + 0

Inv Inv 0

očekávaná

52,807

33,227

2,9667

pozorovaná

0

56

5

očekávaná

36,193

22,773

2,0333

89

56

5

150

Σ

Σ

89 61

Hodnota χ2 testu: 150,00; 2 stupně volnosti; P < 0,0001 Hodnota Fisherova exaktního testu: 1,467 * 10-43; P < 0,01

Tab. 22 Fenotyp v závislosti na genotypu intronu 13 genu KIT – paint horse. genotyp non-tobiano tobiano

četnost oč./poz. pozorovaná

KM0 KM0 13

KM1 KM0 0

KM1 KM1 0

očekávaná

3,0727

8,5091

1,4182

pozorovaná

0

36

6

očekávaná

9,9273

27,491

4,5818

13

36

6

55

Σ

Σ

13 42

Hodnota χ2 testu: 55,00; 2 stupně volnosti; P < 0,0001 Hodnota Fisherova exaktního testu: 6,891 * 10-13 ; P < 0,01

Tab. 23 Fenotyp v závislosti na genotypu ECA3 – paint horse. genotyp non-tobiano tobiano

četnost oč./poz. pozorovaná

++ 13

Inv + 0

Inv Inv 0

očekávaná

3,0727

8,7455

1,1818

pozorovaná

0

37

5

očekávaná

9,9273

28,255

3,8182

13

37

5

Σ

13 42 55

Hodnota χ2 testu: 55,00; 2 stupně volnosti; P < 0,0001 Hodnota Fisherova exaktního testu: 6,891 * 10-13 ; P < 0,01 Všichni tobiano koně nesli alelu KM1 i Inv. U non-tobiano koní byly nalezeny pouze alely KM0 a +.

90

Tab. 24 Genotyp intronu 13 genu KIT podle fenotypu rodičů – pro všechny jedince. genotyp KM0KM0 KM1KM0 KM1KM1

četnost oček./poz.

Σ

pozorovaná

2 rodiče non-tobiano 81

1 rodič tobiano 8

2 rodiče tobiano 0

očekávaná

48,06

31,447

9,4933

pozorovaná

0

42

11

očekávaná

28,62

18,727

5,6533

pozorovaná

0

3

5

očekávaná

4,32

2,8267

0,8533

81

53

16

150

Σ

Σ

89 53 8

Hodnota χ2 testu: 136,6334; 4 stupně volnosti; P < 0,0001 Hodnota Fisherova exaktního testu: 1,140 * 10-34 ; P < 0,01

Tab. 25 Genotyp inverze ECA3 podle fenotypu rodičů – pro všechny jedince. genotyp ++ Inv + Inv Inv

četnost oč./poz. pozorovaná

2 rodiče non-tobiano 81

1 rodič tobiano 8

2 rodiče tobiano 0

očekávaná

48,06

31,447

9,4933

pozorovaná

0

45

11

očekávaná

30,24

19,787

5,9733

pozorovaná

0

0

5

očekávaná

2,7

1,7667

0,5333

81

53

16

Σ

Hodnota χ2 testu: 158,0254; 4 stupně volnosti; P < 0,0001 Hodnota Fisherova exaktního testu: 1,883 * 10-36; P < 0,01

91

89 56 5 150

Tab. 26 Genotyp intronu 13 genu KIT podle fenotypu rodičů – paint horse. genotyp

četnost oč./poz. pozorovaná

KM0KM0 očekávaná pozorovaná

KM1KM0 očekávaná pozorovaná

KM1KM1 očekávaná Σ

2 rodiče non-tobiano 6

1 rodič tobiano 7

2 rodiče tobiano 0

1,4182

8,2727

3,3091

0

27

9

3,9273

22,909

9,1636

0

1

5

0,6545

3,8182

1,5273

6

35

14

Σ 13 36 6 55

Hodnota χ2 testu: 33,5994; 4 stupně volnosti; P < 0,0001 Hodnota Fisherova exaktního testu: 2,331 * 10-06; P < 0,01

Ze tří nepředpokládaně homozygotních KM1KM1 koní (pouze jeden rodič tobiano) byl jeden zástupcem plemene paint horse.

Tab. 27 Genotyp inverze ECA3 podle fenotypu rodičů – paint horse. genotyp ++ Inv + Inv Inv

četnost oč./poz. pozorovaná

2 rodiče non-tobiano 6

1 rodič tobiano 7

2 rodiče tobiano 0

očekávaná

1,4182

8,2727

3,3091

pozorovaná

0

28

9

očekávaná

4,0364

23,545

9,4182

pozorovaná

0

0

5

očekávaná

0,5455

3,1818

1,2727

6

35

14

Σ

Hodnota χ2 testu: 37,8482; 4 stupně volnosti, P < 0,0001 Hodnota Fisherova exaktního testu: 3,559 * 10-07; P < 0,01 Ve všech případech byly výsledky χ2 testu i Fisherova exaktního testu vysoce průkazné.

92

Σ 13 37 5 55

6 DISKUZE Bylo testováno 61 koní fenotypu tobiano (případně kombinace s jiným vzorem) a 89 koní non-tobiano. Metodou PCR–RFLP byl analyzován polymorfizmus v intronu 13 genu KIT. Všichni koně fenotypu tobiano nesli alespoň jednu alelu KM1. Všichni koně non-tobiano měli genotyp KM0KM0, avšak tři jedinci pouze s jedním rodičem tobiano vykazovali homozygotní genotyp KM1KM1. Do této skupiny byl zařazen i valach gray tobiano bez původu (viz příloha III, obr. D). Vzhledem k fenotypu je však pravděpodobnost dvou rodičů tobiano mnohem nižší. Předpoklad se potvrdil v následující analýze – avšak ani v tomto případě nelze oba rodiče tobiano zcela vyloučit, neboť i heterozygotní jedinci mohou být výsledkem spojení dvou rodičů tobiano (z nichž je alespoň jeden heterozygotní). Další dvě nepředpokládaně homozygotní tobiano klisny byly z jednobarevných matek (potvrzeno chovateli, parentita nebyla ověřována). Test tedy může vést k falešným výsledkům při určování homozygotnosti. Pro srovnání, Brooks et al. (2002) testovali 129 tobiano koní a 104 jednobarevných (anglický plnokrevník). Nepředpokládaně homozygotní vyšel jeden kůň (jeden z rodičů anglický plnokrevník – non-tobiano). Tři jednobarevní angličtí plnokrevníci však alelu KM1 nesli. Obdobně tedy, v případě chybného určení fenotypu jednobareveného koně, který je pokládán za minimálně exprimovaný vzor tobiano a bude nositelem KM1 alely, by byl výsledek chybný. Ve zkoumaném souboru nebyla alela KM1 u jednobarevných koní prokázána, což může být důsledkem zvolené skladby plemen (pouze 5 zástupců plemene anglický plnokrevník), i méně rozsáhlým souborem testovaných jedinců. Je však nutno zdůraznit, že např. v případě minimálně exprimovaného tobiana nemusí být vzor rozpoznán (viz obr. 58, 59 – hříbě je potomkem homozygotního hřebce, alely KM1 i Inv byly prokázány). Obdobně je tomu i u gray tobiano koně, který již zcela vybělil. U flea-bitten gray tobiano bývají pigmentované tečky koncentrovány v oblasti původního výskytu tmavé srsti a při bližším zkoumání lze rozdíl identifikovat. Metodou PCR byla testována přítomnost chromozomální inverze ECA3. Brooks et al. (2007) u žádného z 58 jednobarevných anglických plnokrevníků inverzi neobjevili, včetně těch, kteří nesli KM1 alelu, 96 tobiano koní bylo heterozygotních Inv+, 25 homozygotních InvInv. Zygotnost ve vztahu k fenotypu rodičů není uvedena. V souladu s výsledky Brooks et al. (2007) byla u sledovaného souboru chromozomální

93

inverze ECA3 odhalena pouze u koní tobiano. Jako homozygotní InvInv byli zjištěni pouze jedinci s oběma rodiči tobiano. Výskyt chromozomální inverze ECA3 vykazuje u testovaného souboru kompletní asociaci s fenotypem tobiano u koní. V porovnání s výsledky markeru KM1 všichni tři jedinci s jedním rodičem tobiano, kteří byli pro marker KM1 homozygotní, vykazovali heterozygotní genotyp pro inverzi ECA3. Fenotypovými markery homozygotnosti tobiano jsou tzv. ink spots a paw prints. U všech pěti zjištěných homozygotů se ink spots nebo paw prints projevily, avšak vzhledem k nízkému počtu pozorovnání nelze vyvodit závěry ohledně asociace skvrn s homozygotností tobiano. U dvou heterozygotních koní se objevily méně výrazné paw prints. U gray tobiano a minimálně exprimovaných koní nebylo možné zjistit, zda je znak přítomný. Lze proto souhlasit s názorem Bowling (1996), že fenotypový projev přídatných skvrn není spolehlivým ukazatelem homozygotnosti tobiano. Bowling (1996) si ohledně existence těchto odznaků pokládá otázky: Jaký je mechanizmus jejich vzniku – jsou výsledkem zpětné mutace tobiano na non-tobiano? Nebo vznikají uvolněním buněk z inhibice tvorby pigmentu? Jedná se o ovlivění migrace buněk? Proč jsou obvykle potřeba dva geny k jejich projevení? Je-li tobiano vzor způsoben chromozomální inverzí ECA3, mohly by být malé přídatné skvrny zapříčiněny přerušením v některém genu (nebo v jeho blízkosti), který se nachází v oblasti distálního nebo proximálního zlomu a vykazuje recesivní dědičnost. Zajímavým problémem je, jakým způsobem jsou determinovány zbarvené a depigmentované plochy, když genotyp všech buněk je shodný. Fleischman et al. (1991) diskutují problém u piebaldismu u člověka. Uvádějí, že heterozygotní delece v genu pro receptor by normálně vedla k produkci poloviny receptorů v každé buňce. Jednou z možností je, že redukce v počtu receptorů poškozuje migraci, proliferaci nebo přežití kmenových pigmentových buněk z neurální lišty, což vede k neúspěchu při osidlování melanocytů v místech nejvíce vzdálených od neurální lišty.

Další

možnou

příčinou

by

mohla

být

snížená

koncentrace

KITLG

v depigmentovaných oblastech. Pro aktivaci intracelulární signální kaskády je zřejmě třeba určitého počtu KIT receptorů a KITLG, proto v oblastech, kde je jejich koncentrace snížena, nedochází k pigmentaci. Je-li tobiano zapříčiněno chromozomální inverzí ECA3, která patrně ovlivňuje regulační oblast KIT genu (BROOKS et al., 2007), je možné, že mechanizmus účinku

94

bude u koní obdobný jako u člověka. Rozsah vzoru (tzn. podílu bílých skvrn) může být ovlivněn mutací genů pro další proteiny účastnící se signální dráhy (viz příloha X). Brooks et al. (2007) diskutují možnou sníženou plodnost u jedinců heterozygotních pro inverzi vzhledem k produkci geneticky nevyvážených gamet. Parametry plodnosti nebyly v této práci zkoumány. Ve shodě s Brooks et al. (2002; 2007) jsem dospěla k obdobným závěrům, tzn., že asociace polymorfizmu v intronu 13 genu KIT s To alelou není úplná – 3 jedinci s jedním rodičem tobiano vykazovali homozygotní genotyp KM1KM1. Chromozomální inverze ECA3 však ukázala kompletní asociaci bez výjimek. Nelze vyloučit, že chromozomální inverze na ECA3 je příčinou tobiano vzoru u koní.

95

7 ZÁVĚR Cílem práce bylo ověřit vztah polymorfizmu intronu 13 genu KIT a chromozomální inverze ECA3 se strakatostí tobiano u koní. Oba polymorfizmy byly detekovány u 150 koní fenotypu tobiano i non-tobiano. Zatímco genotyp intronu 13 genu

KIT testovaný

metodou

PCR–RFLP

ve

třech

případech neodpovídal

předpokládanému, v případě testování inverze metodou PCR byla asociace úplná. Výsledky naznačují, že chromozomální inverze ECA3 by mohla být příčinou tobiano skvrnitosti u koní. Doposud není známo, jaký mechanizmus ovlivňuje úroveň exprese a jak vznikají fenotypové znaky doprovázející homozygotní koně tobiano. Lze tedy shrnout, že test chromozomální inverze ECA3 pomocí metody PCR je možné doporučit pro rutinní testování genotypu koní tobiano. Může být vhodným doplňkem při identifikaci koní minimálně exprimovaných či kombinovaných vzorů. Metoda je vhodná i z hlediska jednoduchosti, časové nenáročnosti a finanční přijatelnosti. Molekulárně-genetická analýza koní tobiano by mohla být jedním z prvních testů nabízených chovatelům pro stanovení genotypu zbarvení.

96

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ABDEL-MALEK, Z.A., SCOTT, M.C., FURUMURA, M., LAMOREUX, M.L., OLLMANN, M., BARSH, G.S., HEARING, V.J. The melanocortin 1 receptor is the principal mediator of the effects of agouti signaling protein on mammalian melanocytes. Journal of Cell Science, 2001, Vol. 114, p. 1019–1024. ANDERSSON, L. Melanocortin Receptor Variants with Phenotypic Effects in Horse, Pig and Chicken, Annals New York Academy of Sciences, 2003, Vol. 994, p. 313–318. ANDERSSON, L.S., COTHRAN, G., EWART, S., LINGREN, G. Mapping the Causative Mutation for Anterior Segment Dysgenesis in the Horse [online]. 2008 [cit. 2008-3-16]. Plant & Animal Genomes XVI Conference, San Diego. Dostupné z: . ANDERSSON, L., SANDBERG, K. A linkage group composed of three coat color genes and three serum protein loci in horses, The Journal of Heredity, 1982, Vol. 73, No. 2, p. 91– 94. BATTEATE, J.S. Striping on the Palomino/Buckskin/Cream (Ccr dilution). [online]. 1996a [cit. 2008-2-11]. Dostupné z: . BATTEATE, J.S. Dun Factor Striping and Foal Coat Color. [online]. 1996b [cit. 2008-2-12]. Dostupné z: < http://members.aol.com/stripedhos/dunfoal/dunfoal.htm>. BATTEATE, J.S. Striping and Camouflage in Horses. [online]. © 1997 [cit. 2008-2-12]. Dostupné z: . BATTEATE, J.S. Brindle Horses (Donkeys and Mules too) [online]. 2007, © 2007 [cit. 2008-3-08]. Dostupné z: < http://members.aol.com/brindlehos/>. BEGHINI, A., KITLG (KIT ligand) [online]. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, 1998 [cit. 2008-4-11]. Dostupné z: . BELLONE, R., LEAR, T., ADELSON, D.L., BAILEY, E. Comparative mapping of oculocutaneous albinism type II (OCA2), transient receptor potential cation channel, subfamily M member 1 (TRPM1) and two equine microsatellites, ASB08 and 1CA43, among four equid species by fluorescence in situ hybridization. Cytogenetic and Genome Research, 2006, Vol. 114:93A, p. 1–3. BOCKMAN, W., Cremello & Perlino Educational Association [online] [cit. 2008-2-18]. Dostupné z: . BOWLING, A. Horse Genetics. Cambridge: CABI Publishing, 1996. 224p. ISBN 0851991017. Chapter 2–9, p. 19–81.

97

BOWLING, A. Genetics of Colour Variation. IN BOWLING, A., RUVINSKY, A. The Genetics of the Horse. Cambridge: CABI Publishing, 2000, p. 53–70. ISBN 0 85199 429 6. BOWLING, A., RUVINSKY, A. Genetic Aspects of Domestication, IN BOWLING, A., RUVINSKY Breeds and their Origins In The Genetics of the Horse. Cambridge: CABI Publishing, 2000, p. 32. ISBN 0 85199 429 6. BROOKS, S.A., BAILEY, E., Exon skipping in the KIT gene causes a Sabino spotting pattern in horses. Mammalian Genome, 2005, Vol. 16, No. 11, p. 893–902. BROOKS, S.A., LEAR, T.L., ADELSON, D.L., BAILEY, E. A chromosome inversion near the KIT gene and the Tobiano spotting pattern in horses. Cytogenetic and Genome Research, 2007, Vol. 119, p. 225–230. BROOKS, S.A., TERRY, R.B., BAILEY, E. A PCR-RFLP for KIT associated with tobiano spotting pattern in horses. Animal Genetics, 2002, Vol. 33, p. 301–303. BRUNBERG, E., ANDERSSON, L., COTHRAN, G., SANDBERG, K., MIKKO, S., LINGREN, G. A missense mutation in PMEL17 is associated with the Silver coat color in the horse, BioMed Central Genetics, 2006, Vol. 7, No. 46, p. 1–10. CASTLE, N. Primitive Marking Theory [online]. 2008, © 2008 [cit. 2008-4-5]. Dostupné z: . CHALUPOVÁ, P. Genetika pigmentace u koní. Brno, 2006. 46 s. Bakalářská práce na Agronomické fakultě Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně. Vedoucí práce Josef Dvořák. Color Information [online]. 2002–2004, © 2001 [cit. 2008-2-10]. Dostupné z: . COOPER, M.P., FRETWELL, N., BAILEY, S.J., LYONS, L.A. White spotting in the domestic cat (Felis catus) maps near KIT on feline chromosome B1. Animal Genetics, 2005, Vol., 37, p. 163–165. DAUM, O., LINKE, Z., VANĚČEK, T., ŠÍMA, R., MICHAL, M., MUKENŠNABL, P., GROSSMANN, P., SMITKOVÁ, V. Gastrointestinální stromální tumor [online] © 2002–2008 [cit. 2008-5-1]. Dostupné z: . DU, J., FISHER, J.D., Identification of Aim-1 as the underwhite Mouse Mutant and Its Transcriptional Regulation by MITF. The Journal of Biological Chemistry, 2002. Vol. 277, No. 1, p. 402–406. DUFFIELD, D.A., GOLDIE, P.L. Tobiano Spotting Pattern in Horses: Linkage of To With AlA and Linkage Disequilibrium. Journal of Heredity, 1998, Vol. 89, No. 1, p.104–106. Dun zygosity test [online]. Veterinary Genetics Laboratory – UC Davis, 2008 , © 2008 [cit. 2008-2-20]. Dostupné z: < http://www.vgl.ucdavis.edu/services/dunhorse.php>.

98

DUŠEK, J. Barvy koní. IN DUŠEK, J., MISAŘ, D., MÜLLER, Z., NAVRÁTIL, J., RAJMAN, J., TLUČHOŘ, V., ŽLUMOV, P. Chov koní. 2. vyd., Praha: Brázda, 2007, s. 24–27. ISBN 80-209-0352-6. ELMORE, R. The Dun Factor E: The Mysterious Dun Gene [online]. 2008, © 2008 [cit. 2008-4-6]. Dostupné z: . Ensembl Horse [online]. © 2008 [cit. 2008-4-20]. Dostupné z: . EWART, S.L., RAMSEY, D.T., XU, J., MEYERS, D. The Horse Homolog of Congenital Aniridia Conforms to Codominant Inheritance. The American Genetic Association, 2000, Vol. 91, p. 93–98. T

Fisherův test [online]. © 2008 [cit. 2008-5-20]. Dostupné z: < http://www.stahroun.me.cz/interstat/kategorialni/asociace/fisher.htm>. FLEISCHMAN, R.A., SALTMAN, D.L., STASTNY, V., ZNEIMER, S. Deletion of the c-kit protooncogene in the human developmental defect piebald trait. Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, Vol. 88, p. 10885–10889. GIUFFRA, E., EVANS, G., TÖRNSTEN, A., WALES, R., DAY, A., LOOFT, H., PLASTOW, G., ANDERSSON, L. The Belt mutation in pigs is an allele at the Dominant white (I/KIT) locus. Mammalian Genome, 1999, Vol. 10, p. 1132–1136. GOWER, J. Horse Colour Explained: A Breeder´s Perspective, The Crowood Press, Ramsbury – Marlborough, 2000. 144 p. ISBN 1 86126 384 8. HAASE, B., BROOKS, S.A., SCHLUMBAUM, A., AZOR, P.A., BAILEY, E., ALAEDDINE, F., MEVISSEN, M., BURGER, D., PONCET, P.A., RIEDER, S., LEEB, T. Allelic Heterogeneity at the Equine KIT Locus in Dominant White (W) Horses. PloS Genetics, 2007, Vol. 3, No. 11, p. 2103–2108. HALE, K. Horse Colors: Part IV – Identifying the Colors [online]. © 2004 [cit. 2006-3-22]. Dostupné z: . HAMILTON, Ch. One In A Million. The American Quarter Horse Journal, 2006, No. 2. p. 52–55. HENNER, J., PONCET, P.A., AEBO, L., HAGGER, C., STRANZINGER, G., RIEDER, S. Horse breeding: genetic tests for the coat colors chestnut, bay and black. Results from a preliminary study in the Swiss Freiberger horse breed. Schweiz Arch Tierheilkd, 2002. Vol., 144(8), p. 405-412. Horse Coat Color Tests [online]. Veterinary Genetics Laboratory – UC Davis, 2008 © 2008 [cit. 2008-3-15]. Dostupné z: < http://www.vgl.ucdavis.edu/services/coatcolorhorse.php>.

99

Horse Colors [online]. [cit. 2008-2-10]. Dostupné z: . Horse Genome Project [online]. Broad Institute, 2008, © 2005-2007 [cit. 2008-4-17]. Dostupné z: . HRUŠKOVIČ, I., HRUŠKOVIČ, B. Lidské mastocyty ve zdraví a nemoci [online]. Medicína – odborné fórum lékařů a farmaceutů, 1999. Dostupné z: . Chí-kvadrát test [online]. [cit. 2008-5-19]. Dostupné z: . Chi Square Tests and Statistics [online]. SAS Institute, © 1999 [cit. 2008-5-19]. Dostupné z: . CHOWDHARY, B.P., RAUDSEPP, T. The Horse Genome Derby: racing from map to whole genome sequence, Chromosome Research, 2008, Vol. 16, p. 109–127. Introduction to Coat Color Genetics [online]. Veterinary Genetics Laboratory – UC Davis, 2008, © 2008 [cit. 2008-3-1]. Dostupné z: < http://www.vgl.ucdavis.edu/services/coatcolor.php#other>. JAKUBEC, V. Nový systém popisu barvy srsti koní. Náš chov, 1998a, roč. 58, č. 3, s. 54–55. JAKUBEC,V. Nové poznatky o dědičnosti barev koní. Náš chov, 1998b, roč. 58, č. 10 , s. 43–44. JAKUBEC, V., REISSMANN, M., VOLENEC, J. Zbarvení a dědičnost barvy u Kinského koně [online]. Equus Kinsky, 2003 [cit. 2008-2-11]. Dostupné z: . Jetquick Blood & Cell Culture DNA Spin Kit, Protocol Handbook, GENOMED GmbH, 11p. JIRÁSKOVÁ, M. Fyziologie kůže. In VOSMÍK F., JIRÁSKOVÁ, M., PÁNKOVÁ, R., RESL, V., SKOŘEPOVÁ, M., ŠTORK, J., VOHRADNÍKOVÁ, O., ZÁRUBA, F. Dermatovenerologie. Praha: Karolinum, 2001, s.10–12. ISBN 80-7184-633-3. KOSTELNIK, B. The Horse Colors Site [online]. © 2002–2007 [cit. 2008-3-10]. Dostupné z: . KOŽELUHA, V., GRANÁT, J., KARAKOZ, A., KOUBEK, K., MAŠEK, N., NOVÁK, M., NOVÝ, J., SVOZIL, B., ŠMERHA, J., ZELNÍK, J., ZEMÁNEK, F., ŽUPKA, Z. Obecná zootechnika. 1. vyd. Praha: SZN, 1965. 559s. ISBN 07-081-65. Zbarvení tělesného krytu, s. 165–174. KRATOCHVIL, F. Arbutin – bezpečné řešení pigmentových skvrn. [online]. 2007, © 2007 [cit. 2008-3-2]. Dostupné z: .

100

LEČÍKOVÁ, S. Genetika barev a zbarvení: Výroba barvy. Jezdectví, 2005, roč. 53, č. 6, s. 42. LIN, J.Y., FISHER, D.E. Review Article Melanocyte biology and skin pigmentation.

Nature, 2007, Vol. 445. p. 843-850. LOCKE, M.M., PENEDO, M.C.T., BRICKER, S.J., MILLION, L.V., MURRAY, J.D. Linkage of the grey coat colour locus to microsatellites on horse chromosome 25. Animal Genetics, 2002, Vol. 33, p. 329–337. LOCKE, M.M., RUTH, L.S., MILLION, L.V., PENEDO M.C.T., MURRAY, J.D., BOWLING, A.T. The cream dilution gene, responsible for the palomino and buckskin coat colours, maps to horse chromosome 21. Animal Genetics, 2001, Vol. 32, p. 340–343. MARIAT, D., TAOURIT, S., GUÉRIN, G., A mutation in the MATP gene causes the cream coat colour in the horse. Genet. Sel. Evol., 2003, Vol. 35, p. 119–133. MARKLUND, L., JOHANSSON MOLLER, M., SANDBERG, K., ANDERSSON, L. A missense mutation in the gene for melanocyte-stimulating hormone receptor (MC1R) is associated with the chestnut coat color in horses. Mammalian Genome, 1996, Vol. 7, p. 895-899. MARKLUND, S., MOLLER, M., SANDBERG, K., ANDERSSON, L. Close association between sequence polymorphism in the KIT gene and the roan coat color in horses. Mammalian Genome, 1999, Vol. 10, p. 283–288. MATOUŠEK, V. Popis barev koní v angličtině. Náš chov, 1999a, roč. 59, č. 7, s. 32. MATOUŠEK, V. Barvy koní. Náš chov, 1999b, roč. 59, č. 6, s. 32. MAU, C., PONCET, P.A., BUCHER, B., STRANZINGER, G., RIEDER, S. Genetic mapping of dominant white (W), a homozygous lethal condition in the horse (Equus caballus). J. Anim. Breed. Genet., 2004, Vol. 121, p. 374–383. T

MEAD, B. „Mushroom“ – a New Dilution or Silver Variant? [online]. 2007, [cit. 2008-2-20]. Dostupné z: . METALLINOS, D.L., BOWLING, A.T., RINE, J. A missense mutation in the endothelin-B receptor gene is associated with Lethal White Foal Syndrome: an equine version of Hirschsprung Disease. Mammalian Genome, 1998, Vol. 9, p. 426–431. MISAŘ, D., JISKROVÁ, I. Chov koní, cvičení. 1. vyd. Brno: MZLU v Brně, 1997. 68 s. ISBN 80-7157-246-2. MOTRO, B., VAN DER KOOY, D., ROSSANT, J., REITH, A., BERNSTEIN, A. Contiguous patterns of c-kit and steel expression: analysis of mutations at the W and Sl loci. Development, 1991, Vol. 113, p. 1207–1221.

101

National Center for Biotechnology Information [online]. 2008 [cit. 2008-4-20]. Dostupné z: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>. NESTAAS, T. The Colours of the Norwegian Fjordhorse [online].2006, © 1998–2006 [cit. 2008-3-12]. Dostupné z: . NEWTON, J.M., COHEN-BARAK, O., HAGIWARA, N., GARDNER, J.M., DAVISSON, M.T., KING, R.A., BRILLIANT, M.H. Mutations in the Human Orthologue of the Mouse underwhite Gene (uw) Underlie a New Form of Oculocutaneous Albinism, OCA4. Am. J. Hum. Genet., 2001, Vol. 69, p. 981–988. PIELBERG, G., MIKKO, S., SANDBERG, K., ANDERSSON, L. Comparative linkage mapping of the Grey coat colour gene in horses. Animal Genetics, 2005, Vol. 36, p. 390–395. RAMSEY, D.T., EWART, S.L., RENDER, J.A., COOK, C.S., LATIMER, C.A. Congenital ocular abnormalities of Rocky Mountain Horses. Veterinary Ophthalmology, 1999, Vol. 2, p. 47–59. T

RAUDSEPP, T., KIJAS, J., GODARD, S., GUÉRIN, G., ANDERSSON, L., CHOWDHARY, B.P. Comparison of horse Chromosome 3 with donkey and human chromosomes by crossspecies painting and heterologous FISH mapping. Mammalian Genome, 1999, Vol. 10, p. 277–282. RCSB Protein data bank [online] © 2008 [cit. 2008-5-5]. Dostupné z: . REGNER, K. Podzimní třídění koní ve Slatiňanech, ústní sdělení, 2007 [cit. 2007-10-5]. REINHEIMER, CH. Coat Colors: The Genetics behind the Hide, Horse Color Genetics. [online]. Poslední revize 18.1.2006 [cit. 2008-2-11]. Dostupné z: . REISSMANN, M., BIERWOLF, J., BROCKMANN, G.A. Two SNPs in the SILV gene are associated with silver coat colour in ponies. Animal Genetics, 2007, Vol. 38, p. 1–6. RIEDER, S., HAAGER, Ch., OBEXER-RUFF, G., LEEB, T., PONCET, P.A. Genetic Analysis of White Facial and Leg Markings in the Swiss Franches-Montagnes Horse Breed. Journal of Heredity, 2008, Vol. 99, No. 2, p. 130–136. T

RIEDER, S., STRICKER, S., JOERG, H., DUMMER, R., STRANZINGER, G. A comparative genetic approach for the investigation of ageing grey horse melanoma. J. Anim. Breed. Genet., 2000, Vol. 117, p. 73–82. RIEDER, S., TAOURIT, S., MARIAT, D., LANGLOIS, B., GUÉRIN, G. Mutations in the agouti (ASIP), the extension (MC1R), and the brown (TYRP1) loci and their association to coat color phenotypes in horses (Equus caballus). Mammalian Genome, 2001, Vol. 12, p. 450–455.

102

RILEY, P.A. Melanin. Int. J. Biochem. Cell Biol., 1997, Vol. 29, No. 11, p. 1235-1239. RIMARČÍK, M. Chi kvadrát test dobrej zhody [online] © 2000–2008 [cit. 2008-5-3]. Dostupné z: . RIVERS, P. A potted history of coat colour evolution in horses. [online]. 2008 [cit. 2008-4-5]. Dostupné z: . ROSENBLUM, E.B., HOEKSTRA, H.E., NACHMAN, M.W. Adaptive reptile color variation and the evolution of the MC1R gene. Evolution, 2004, Vol. 58, No. 8, p. 1794–1808. SANTSCHI, E.M., PURDY, A.K., VALBERG, S.J., VROTOS, P.D., KAESE, H., MICKELSON, J.R. Endothelin receptor B polymorphism associated with lethal white foal syndrome in horses. Mammalian Genome, 1998, Vol. 9, p. 306–309. SCOTT, M.C, WAKAMATSU, K., ITO, S., KADEKARO, A.L., KOBAYASHI, N., GRODEN, J., KAVANAGH, R., TAKAKUWA, T., VIRADOR, V., HEARING, V.J., ABDEL-MALEK, Z.A. Human melanocortin 1 receptor variants, receptor function and melanocyte response to UV radiation. Journal of Cell Science, 2002, Vol. 115, p. 2349–2355. SCOTT, G. The Horse Genetics Web Site. [online].2006 [cit. 2008-2-15]. Dostupné z: . SHEPARD, C. The „Barlink Factor“: Possible New Dilution Gene in Paint Horses. [online]. 2006 © 2005–2007 [cit. 2008-2-19]. Dostupné z: . SIMON, S. Fisher´s Exact Test [online].2008 [cit. 2008-5-19]. Dostupné z: . SPONENBERG, D.P. Equine Color Genetics. 2nd ed. Iowa State University Press, Blackwell Publishing, 2003. 215 p. ISBN 0-8138-0759-X. SPONENBERG, D.P. Genetic Equation [online]. American Paint Horse Association, © 2008 [cit. 2008-3-2]. Dostupné z: . SPONENBERG, D.P., WEISE, M.C. Dominant black in horses, Genet. Sel. Evol., 1997, Vol. 29, p. 403–408. SPRITZ, R.A. The Molecular Basis of Human Piebaldism. Pigment Cell Research, 1992, Vol. 5, p. 340–343. STANNARD, A.A. Pigmentary disorders. Veterinary Dermatology, 2000, Vol. 11, p. 205–210. Statistical examples [online]. The University of Western Ontario [cit. 2008-5-19]. Dostupné z: .

103

STEPHENSON, D.A., LEE, K.H., NAGLE, D.L., YEN, C.H., MORROW, A., MILLER, D., CHAPMAN, V.M., BUĆAN, M. Mouse rump-white mutation associated with an inversion of Chromosome 5. Mammalian Genome, 1994, Vol. 5, No. 6, p. 342–348. SUTTON, R.H., COLEMAN, G.T. Melanoma and the Greying Horse. Rural Industries Research and Development Corporation, [online]. © 1997 [cit. 2008-2-20]. Dostupné z: < http://www.rirdc.gov.au/reports/HOR/UQ-28A.doc>. SWINBURNE, J.E., HOPKINS, A., BINNS, M.M. Assignment of the horse grey coat colour gene to ECA25 using whole genome scanning. Animal Genetics, 2002, Vol. 33, p. 338–342. TERRY, R.B., ARCHER, S., BROOKS, S., BERNOCO, D., BAILEY, E. Assignment of the appaloosa coat colour gene (LP) to equine chromosome 1. Animal Genetics, 2004, Vol. 35, p. 134–137. TERRY, R.R., BAILEY, E., BERNOCO, D., COTHRAN, E.G. Linked markers exclude KIT as the gene responsible for appaloosa coat colour spotting patterns in horses. Animal Genetics, 2001, Vol. 32, p. 98–101. TERRY, R.B., BAILEY, E., LEAR, T., COTHRAN, E.G. Rejection of MITF and MGF as the genes responsible for appaloosa coat colour patterns in horses. Animal Genetics, 2002, Vol. 33, p. 82–84. The Appaloosa Museum [online]. © 2007 [cit. 2008-3-20]. Dostupné z: . THEOS, A.C., TRUSCHEL, S.T., RAPOSO, G., MARKS, M.S. The Silver locus product Pmel17/gp100/Silv/ME20: controversial in name and in function. Pigment Cell Research, 2005, Vol. 18, p. 322–336. The Horse Guide [online].2007, © 2007 [cit. 2008-2-20]. Dostupné z: . Tovero pattern [online]. American Paint Horse Association, © 2008 [cit. 2008-4-11]. Dostupné z: . Typy zbarvení [online]. Paint horse club ČR, 2007 [cit. 2008-3-2]. Dostupné z: . URBAN, T. Virtuální svět genetiky 3 – genetika kvantitativních znaků [online].2006, © 2006 [cit. 2008-5-3]. Dostupné z: . WAGNER, H.J., REISSMANN, M. New polymorphism detected in the horse MC1R gene. Animal Genetics, 2000. Vol. 31, p. 280–291. WEHRLE-HALLER, B. The Role of Kit-Ligand in Melanocyte Development end Epidermal Homeostasis. Pigment Cell Research, 2003, Vol. 16, p. 287–296.

104

YANG, G.C., CROAKER, D., ZHANG, A.L., MANGLICK, P., CARTMILL, T., CASS, D. A dinucleotide mutation in the endothelin-B receptor gene is associated with lethal white foal syndrome (LWFS); a horse variant of Hirschsprung disease (HSCR). Human Molecular Genetics, 1998, Vol. 7, No. 6, p. 1047–1052. Použité programy SAS, verze pro Windows 9.1.3 Sequence extractor [online]. Dostupné z: .

105

9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Mealy bay dun (Převalského kůň); foto: Martina Vostřelová Obr. 2 Fading black (fríský kůň) Obr. 3 Light chestnut/sorrel (ČT) Obr. 4 Copper chestnut (ČT) Obr. 5 Red chestnut (anglický plnokrevník) Obr. 6 Liver chestnut (ČT) Obr. 7 Bay (ČT) Obr. 8 Dark bay (ČT) Obr. 9 Brown (ČT) Obr. 10 Seal brown (ČT) Obr. 11 Smokey black (ČT) Obr. 12 Sooty buckskin (ČT) Obr. 13 Buckskin (QH) Obr. 14 Palomino (ČT) Obr. 15 Perlino (QH); foto: Cherie Reinheimer, . Obr. 16 Cremello (ČT) Obr. 17 Úhoří pruh Obr. 18 Zebrování končetin Obr. 19 Pavoučí síť Obr. 20 Black dun (huculský kůň) Obr. 21 Bay dun (huculský kůň) Obr. 22 Bay dun (hafling/huculský kůň) Obr. 23 Chestnut dun (quarter horse) Obr. 24 Bay silver (morgan/arabský plnokrevník); foto: Nancy Castle Obr. 25 Bay silver (morgan); foto: Nancy Castle Obr. 26 Mushroom (shetlandský pony); foto: Beth Mead Obr. 27 Flaxen sorrel (norický kůň) Obr. 28 Flaxen sorrel (hafling) Obr. 29 Gold champ. (QH); foto: Cherie Reinheimer, . Obr. 30 Amber champ. (QH); foto: Cherie Reinheimer, . Obr. 31 Chestnut brindle (QH); foto: Denise Charpilloz Obr. 32 Steel gray (anglický plnokrevník) 106

Obr. 33 Dappled gray (slovenský tepl.) Obr. 34 Gray (ČT) Obr. 35 Flea-bitten gray (starokladrubský kůň); foto: Martina Vostřelová Obr. 36 Bay roan (norický kůň) Obr. 37 Chestnut roan (norický kůň) Obr. 38 White (velšský pony) Obr. 39 Bílá bělima Obr. 40 Skvrnitá kůže huby Obr. 41 Pruhované kopyto Obr. 42 Bay blanket (appaloosa) Obr. 43 Bay dun leopard (appaloosa) Obr. 44 Bay snowflake (kříženec) Obr. 45 Bay varnished roan (slezský norický kůň) Obr. 46 Brown frost (appaloosa) Obr. 47 Brown snowcap (appaloosa) Obr. 48 Bay frame overo (PH); PS Obr. 49 Bay frame overo (PH); LS Obr. 50 Buckskin frame overo (PH); PS Obr. 51 Buckskin frame overo (PH); LS Obr. 52 Sorrel frame overo (PH); PS Obr. 53 Sorrel frame overo (PH); LS Obr. 54 Chestnut sabino (westfálský kůň); PS Obr. 55 Chestnut sabino (westfálský kůň); LS Obr. 56 Buckskin splashed white (morgan); PS; foto: Jennifer-Weske Monroe Obr. 57 Buckskin splashed white (morgan); LS; foto: Jennifer-Weske Monroe Obr. 58 Bay tobiano (paint horse); PS Obr. 59 Bay tobiano (paint horse); LS Obr. 60 Bay dun tobiano (4 plem. kříž.); PS Obr. 61 Bay dun tobiano (4 plem. kříž.); LS Obr. 62 Sorrel tobiano (paint horse); PS 107

Obr. 63 Sorrel tobiano (paint horse); LS Obr. 64 Black tobiano (paint horse); PS Obr. 65 Black tobiano (paint horse); LS Obr. 66 Sorrel tobiano (paint horse); PS Obr. 67 Sorrel tobiano (paint horse); LS Obr. 68 Normální ECA3 a s inverzí – FISH (BROOKS et al., 2007) Obr. 69 Schéma inverze ECA3 a přeskupení genů (BROOKS et al., 2007) Obr. 70 Bay tobiano/sabino (ČT) Obr. 71 Bay tobiano/varnished roan (WPB) Obr. 72 PTC 200 (MJ Research) Obr. 73 Ověření výsledku izolace Obr. 74 Ověření kvalite PCR produktu Obr. 75 Ověření kvality PCR produktu – optimalizace Obr. 76 Stanovení genotypů – intron 13 genu KIT (RFLP), 2% gel Obr. 77 Gel 3% Obr. 78 Stanovení genotypů – chromozomální inverze ECA3 (PCR) Obr. 79 Stanovení genotypů – chromozomální inverze ECA3 (PCR), nespecifický produkt

Pozn.: Není-li uvedeno jinak – foto: Pavla Chalupová

108

10 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Křížení dvou heterozygotních koní black (Ee) Tab. 2 Křížení heterozygotního koně bay (EeAa) a homozygotního chestnut (eeaa) Tab. 3 Křížení smokey black genotypu EeaaCCcr a palomina eeAaCCcr Tab. 4 Fenotyp hřebců a klisen v závislosti na genotypu lokusu Lp (GOWER, 2002) Tab. 5 Výpočet frekvencí genotypů (URBAN, 2006) Tab. 6 Výpočet frekvencí alel (URBAN, 2006) Tab. 7 Frekvence genotypů intronu 13 genu KIT celého zkoumaného souboru Tab. 8 Frekvence genotypů intronu 13 genu KIT pouze koní tobiano Tab. 9 Frekvence genotypů intronu 13 genu KIT koní plemene paint horse Tab. 10 Frekvence alel intronu 13 genu KIT celého zkoumaného souboru Tab. 11 Frekvence alel intronu 13 genu KIT pouze koní tobiano Tab. 12 Frekvence alel intronu 13 genu KIT koní plemene paint horse Tab. 13 Frekvence genotypů chromozomální inverze ECA3 celého zkoumaného soub. Tab. 14 Frekvence genotypů chromozomální inverze ECA3 pouze koní tobiano Tab. 15 Frekvence genotypů chromozomální inverze ECA3 koní plemene paint horse Tab. 16 Frekvence alel chromozomální inverze ECA3 zkoumaného souboru Tab. 17 Frekvence alel chromozomální inverze ECA3 koní tobiano Tab. 18 Frekvence alel chromozomální inverze ECA3 koní plemene paint horse Tab. 19 Absolutní frekvence genotypů vzhledem k rodičům Tab. 20 Fenotyp v závislosti na genotypu intronu 13 genu KIT – pro všechny jedince Tab. 21 Fenotyp v závislosti na genotypu ECA3 – pro všechny jedince Tab. 22 Fenotyp v závislosti na genotypu intronu 13 genu KIT– paint horse Tab. 23 Fenotyp v závislosti na genotypu ECA3 – paint horse Tab. 24 Genotyp intronu 13 genu KIT podle fenotypu rodičů – pro všechny jedince Tab. 25 Genotyp inverze ECA3 podle fenotypu rodičů – pro všechny jedince Tab. 26 Genotyp intronu 13 genu KIT fenotypu podle rodičů – paint horse Tab. 27 Genotyp inverze ECA3 podle fenotypu rodičů – paint horse

109

PŘÍLOHY

SEZNAM PŘÍLOH Příloha I

Biosyntéza melaninu (SCOTT, 2006)

Příloha II

Ovlivnění produkce melaninu vazbou α-MSH nebo ASIP k MC1R

Příloha III

Zbarvení a vzory 1 Obr. A Dunskin (QH) Obr. B Gold cream (QH); foto: Cherie Reinheimer; Obr. C Mealy flaxen sorrel (norický kůň) Obr. D Gray tobiano (kříženec) Obr. E Bay tovero rabicano (PH) Obr. F Seal brown sabino (gelderlandský k.)

Příloha IV

Zbarvení a vzory 2 Obr. A Bay tovero (PH) Obr. B Sorrel tovero – paw prints (PH) Obr. C Dunalino (QH); foto: Cherie Reinheimer; Obr. D Buckskin silver (morgan); foto: Tamara Dirrim

Příloha V

Zbarvení a vzory na hlavě Obr. A Cremello (PH) Obr. B Počátek vybělování u gray (ČT) Obr. C Bend Or spots (holštýnský kůň) Obr. D Sabino – bílé skvrny (ČT)

Příloha VI

Zbarvení očí Obr. A Jantarové oko Obr. B Modré oko Obr. C Částečně modré oko Obr. D Částečně modré oko se znaky appaloosa

Příloha VII

Zbarvení a vzory – detail Obr. A Depigmentace u huby Obr. B Náznak brindle vzoru Obr. C Paw prints Obr. D Ink spots

Příloha VIII

Odznaky a vzory na zádi Obr. A Countershading (QH) Obr. B Úhoří pruh – chestnut dun (QH) Obr. C Tetrarch spots (klusák) Obr. D Coon tail (QH)

Příloha IX

Zastoupení plemen, barev a vzorů ve zkoumaném souboru koní

Příloha X

Signální kaskáda MC1R, EDNRB a KIT u člověka (LIN et FISHER, 2007)

Příloha XI

Obr. A Protein KIT (RCSB Protein data bank, 2008) Obr. B Protein SCF – KITLG (RCSB Protein data bank, 2008)

Příloha XII

Detekce polymorfizmu intronu 13 genu KIT: Schéma nasedání primerů a MspI restrikčních míst

Příloha XIII

Strategie designu primerů pro detekci chromozomální inverze ECA3 (BROOKS et al., 2007)

CD–ROM

Diplomová práce MendelNet´07 (vlastní publikace) Zbarvení a vzory

Pozn.: Není-li uvedeno jinak – foto: Pavla Chalupová

I

Biosyntéza melaninu (SCOTT, 2006).

II

Ovlivnění produkce melaninu vazbou α-MSH nebo ASIP k MC1R.

III Zbarvení a vzory 1

Obr. A Dunskin (QH).

Obr. B Gold cream – ivory (QH).

Obr. C Mealy flaxen sorrel (norický kůň).

Obr. D Gray tobiano (kříženec).

Obr. E Bay tovero rabicano (PH).

Obr. F Seal br. sabino (gelderlandský k.).

IV Zbarvení a vzory 2

Obr. A Bay tovero (PH).

Obr. B Sorrel tovero – paw prints (PH).

Obr. C Dunalino (QH).

Obr. D Buckskin silver (morgan).

V Zbarvení a vzory na hlavě

Obr. A Cremello (PH).

Obr. B Počátek vybělování u gray (ČT).

Obr. C Bend Or spots (holštýnský kůň).

Obr. D Sabino – bílé skvrny (ČT).

VI Zbarvení očí

Obr. A Jantarové oko.

Obr. B Modré oko.

Obr. C Částečně modré oko.

Obr. D Část. modré oko; znaky appaloosa.

VII Zbarvení a vzory – detail

Obr. A Depigmentace u huby.

Obr. B Náznak brindle vzoru.

Obr. C Paw prints.

Obr. D Ink spots.

VIII Odznaky a vzory na zádi

Obr. A Countershading (QH).

Obr. B Úhoří pruh – chestnut dun (QH).

Obr. C Tetrarch spots (klusák).

Obr. D Coon tail (QH).

Pozn. : Pro přehlednost není u vzorů uváděna „podkladová“ barva. Koně kombinovaných vzorů jsou uváděni v obou sloupcích barevně, započítáváno jen jednou. Např. v řádku „český teplokrevník“ – 1 jedinec gray/appaloosa; 2 tobiano/sabino. Vzor tovero je pro svoji vysokou četnost v samostatném sloupci.

Zastoupení plemen, barev a vzorů ve zkoumaném souboru koní

IX

X

Signální kaskáda MC1R, EDNRB a KIT u člověka (LIN et FISHER, 2007).

Receptory MC1R, EDNRB a KIT po vazbě se svými ligandy spouštějí signální kaskádu (prostřednictvím různých protein kináz), vedoucí k aktivaci promotoru MITF (microphthalmia associated transcription factor) (LIN et FISHER, 2007).

XI

Obr. A Protein KIT (RCSB Protein data bank, 2008).

Obr. B Protein SCF – KITLG (RCSB Protein data bank, 2008).

XII Detekce polymorfizmu intronu 13 genu KIT: Schéma nasedání primerů a MspI restrikčních míst. Vygenerováno programem Sequence extractor, sekvence byla vyhledána dle přístupového čísla AY048669 (1460 bp) z NCBI – GenBank (BROOKS et al., 2002). PCR produkt: 1222 bp, fragmenty 163, 397 a 662 bp. KIT-II 3-11F 5´ACCCGCTTGCATTTTATCACCTGTCGAATTATCAGAAGGGGGAGATTTTGATATGATT ^130 ^140 ^150 ^160 ^170 TTGACAATGCTTGATTATAAGCTCCTTGCAAGATTTTTACCCAAGTTGTTGTTACCTCTT ^190 ^200 ^210 ^220 ^230 GCTAGAGTCCCCCCTGCAAGAGTTATTGTTGTTAAGAGTGTATATTTTAGTTTTCTCATC ^250 ^260 ^270 ^280 ^290 GTGGGGTGGGATAGTCCATGACATACCCTAGTTACTATCACGTATGTTGCATCCAAAGCA ^310 ^320 ^330 ^340 ^350 TTGACCTCTTGAATATCTCGAGAATGTCTCATCTTGTGCCCAAAGCTTTTCTTTTTATCT ^370 ^380 ^390 ^400 ^410 TGCAAGCTTTGTTTTGCTGGATCATATTTAGTCACTAAAGGGTTAATATTCATTTGCATA ^430 ^440 ^450 ^460 ^470 TCATAATTAAAAATAGGCCTTTAAGCCTATCAGCTCACAAATATACACCAAATGAAGCAA ^490 ^500 ^510 ^520 ^530 ACACCTCACTCCTGTAAAAAATAAATTTCCAATTCTAAAGCATTAGTCAAGCCTCCCATC ^550 ^560 ^570 ^580 ^590 AAGGATTTCTGTGGTGTTTCCAGAAAGCATTTTGGTCTTAAAGAAACAAAGATTAGTAAA ^640 ^650 ^610 ^620 ^630 ACGAGCTGTTCCTTGAGAACTGGAGAGATCCATGGTCACGTTGACAGCTTTATATAATTT ^670 ^680 ^690 ^700 ^710 CTTAAAGCAGACCCCATACCTTTTTGCCTCACCACGTCATGACTCATTCGTGAGAAATTT ^760 ^770 ^730 ^740 ^750 MspI CCGCCGGAGTTAATTAGTTGCTTGTTACCTTCAGAGCTGCAGTTTTAGGCATTCACAACA ^790 ^800 ^810 ^820 ^830 CCAAAAAACATTTTCGCCTAGTAGTGCTCAGAACGCAGGTGACGCCACCTCATTTCAGGT ^850 ^860 ^870 ^880 ^890 TGTCACCCGCTTTCCAGTCTCGTCTCAACGAGCTGGGCTGTTCCGTGTGGTTGGTTTTCC ^910 ^920 ^930 ^940 ^950 TCTTGTGCCGCAGTTTGCGCTCTCATCGTTTCCGTAATAACGTTAACCGAGAGGCGTGAT ^970 ^980 ^990 ^1000 ^1010 GCCCCACTGTAAACTGAAGGAAATCAAAGGATTTATGTAGGACGGTTGATAGTAGCGTAA ^1030 ^1040 ^1050 ^1060 ^1070 GTAACTCCTGTCTGTAAAACCAGCAGTCACACCTGGCCCCTAATCTCTCAGAAATTCAGG ^1090 ^1100 ^1110 ^1120 ^1130 MspI TAAAAAGGGGCTTGCTCATTTAGTTTTACTCCAAATAATGCCGGGTTTTGATAAGCAATG ^1150 ^1160 ^1170 ^1180 ^1190 TTAATAGAGAGGATTGTATTGGAACTAAGTAGGCTCATCCATTGAACCTGAATATTAATG ^1210 ^1220 ^1230 ^1240 ^1250 3´ GAGTGGAGA ACTCTGATCACCCTTGGGTATTTTAATGGGAGGCAAGAATTGTCTATATGTCTCACCTCT ^1270 ^1280 ^1290 ^1300 ^1310 AAGATGGGAAAAGGATATACGAGC 5´ KIT-II 3-1235R TTCTACCCTTTTCCTATATGCTCG 3´ ^1330 ^1340

XIII

Strategie designu primerů pro detekci chromozomální inverze ECA3 (BROOKS et al., 2007).