Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Analýza kandidátních genů USH1G a FSCN2 pro progresivní degeneraci tyčinek a čípků u psů
Doktorská disertační práce
Brno 2005
Ing. Pavel Horák
2
Předkládaná doktorská disertační práce byla vypracována v letech 2002 – 2005 na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Agronomické fakulty Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně ve spolupráci s Laboratoří genomiky živočichů Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR v Liběchově za podpory následujících projektů: GA ČR č.523/03/H076, FRVŠ MŠMT č.1208/2003, FRVŠ MŠMT 172/2004 a GA AV ČR č. 1QS500450578.
Doktorand: Ing. Pavel Horák Školitel: Prof. Ing. Josef Dvořák, CSc. Školitel specialista: Prof. dr. hab. Marek Switonski Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierzat, Wydzial Hodowli i Biologii Zwierzat, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskego w Poznaniu, Polsko
Studijní program: P 41 03 - Zootechnika Studijní obor: 1515V008 - Molekulární biologie a genetika živočichů
3
Věda je špičková moderní metoda, s jejíž pomocí lze vlastní zvídavost ukájet za státní peníz.
Arcimovič Lev Andrejevič
Chtěl bych touto cestou poděkovat prof. Ing. Josefu Dvořákovi, CSc., který mne dovedl nadchnout pro genetiku a řadu let byl a stále zůstává mým vzorem. Neméně děkuji doc. RNDr. Aleši Knollovi, PhD. za to, že se mne snažil zasvětit do tajů molekulárně genetického experimentování. Všem pracovníkům a doktorandům mateřského pracoviště děkuji za vytváření příjemného pracovního prostředí a podání pomocné ruky, kdykoli mi toho bylo třeba. Pracovníkům ÚŽFG AV ČR v Liběchově Ing. Jaromíru Dostálovi, DrSc., Doc. Antonínu Stratilovi, DrSc. a Ing. Stanislavu Čepicovi, DrSc. děkuji za odborné konzultace a cenné rady. Mé díky rovněž patří zahraničním spolupracovníkům, kteří mi byli nápomocni při řešení
disertační
práce
-
Dr.
Catherine
André
(Université
de
Rennes),
prof. dr. hab. M. Switonski a Dr. I. Szczerbal (AR im. A. Cieszkowskego w Poznaniu), Dr. Gaudenz Dolf (Universität Bern). MVDr. Pavle Trnkové děkuji za její ochotu a klíčovou pomoc při získávání biologických vzorků. V neposlední řadě bych chtěl vyjádřit hlubokou úctu a vděčnost svým rodičům za vše, co pro mne obětovali.
4
SUMMARY Research on inherited diseases in dogs is very interesting and important because many canine disorders are homologous to them described in man. Classic examples are generalised progressive retinal atrophy (gPRA) in dogs and human retinitis pigmentosa (RP). Canine gPRAs are a large group of inherited photoreceptor diseases which result in similar clinical signs (thinning of the neuroretina, reduction of blood supply to the retina, depigmentation of nontapetal fundus, atrophy of the optic nerve head etc.) and ultimately lead to blindness. One of the most common form of PRA is a progressive rod-cone degeneration (prcd) that has been shown to be genetically identical in miniature, toy and standard poodles, American cocker spaniels, English cocker spaniels, Labrador retrievers, Portuguese water dogs, and possibly some other breeds. This illness is inherited in an autosomal recessive manner but the causative gene has not been identified so far. However, this unknown gene has been proven to be localized in the centromeric part of CFA9, which is homologous to the HSA17q25 in human. The aim of the research was to trace some candidate genes, carry out molecular analysis and evaluate them as possible causative genes for prcd in specific canine breeds. The Usher syndrome 1G gene (USH1G) and retinal fascin 2 gene (FSCN2) were choosen as candidate genes. In humans, the USH1G gene is associated with Usher syndrome 1G type (deafness, vestibular dysfunction and retinitis pigmentosa) and the FSCN2 gene causes one of the types of retinitis pigmentosa. Both of them map onto the HSA17q25. To amplify a fragment of the canine USH1G gene with PCR the primers were designed from human cDNA sequence. The identity of PCR –product was verified with direct sequencing. The obtained sequence data (972 bp) were deposited in the GenBank database (accession no. AJ876618). The C189T polymorphism was identified in the sequence by comparison of several canine breeds. The polymorphism is detectable by RFLP method (digestion with endonuclease MnlI) and causes a conservative amino acid substitution (Leu → Phe) in deduced canine protein. The USH1G gene was typed on the radiation hybrid panel RHDF500-25 and data were incorporated into the 3270-marker version of the RH-map. The gene maps to the centromeric part of CFA9, close to the GALK1 and SRP68 markers at distances of 23 and 39 cR, respectively. The amplification of several specific fragments of the canine FSCN2 gene was carried out by using of primers designed from genomic sequence of the human othologous gene and predicted mRNA sequences of the canine FSCN2 gene. The identity of amplicons encompassing partially exon 1 and intron 1, and exons 2 – 5 with respective
5
introns was confirmed by direct sequencing and sequences data were saved in the GenBank database (accession no. AM050719, 929 bp; accession no. AM050720, 1965 bp). By comparison of sequences, three distinct polymorphic sites were found - G237A and A525G (exon 1) and A1071G (intron 1). All of them may be genotyped by the RFLP method using PstI, EagI, and MvaI endonucleases, respectively. Mutations G237A and A525G result in conservative amino-acid substitutions in deduced canine protein. The attempts to map the FSCN2 by radiation hybrid mapping, linkage mapping and fluorescence in situ hybridization failed. Nevertheless, with regard to results of its typing on radiation hybrid panel, it is most probably positioned on CFA 9, making a group of 2 markers with the PDEG gene, very close to the TK gene. The segregation analysis of described polymorphisms in the USH1G and FSCN2 gene was performed in a sample that consisted of both health and prcd-affected animals from the following breeds – poodle, American cocker spaniel and English cocker spaniel. Unfortunately, all investigated polymorphisms in both genes were proven to be noncausative for prcd in named breeds.
6
OBSAH 1. ÚVOD
8
2. LITERÁRNÍ PŘEHLED
9
2. 1. Struktura psího genomu
9
2. 1. 1. Chromosomální organizace
9
2. 1. 2. Subchromosomální struktura
10
2. 2. Mapování psího genomu
12
2. 2. 1. Metodologie mapování psího genomu
13
2. 2. 1. 1. Vazbové mapování
13
2. 2. 1. 2. Cytogenetické mapování
14
2. 2. 1. 2. 1. Hybridizace in situ
14
2. 2. 1. 2. 2. Mapování pomocí somatických hybridních panelů
15
2. 2. 1. 2. 3. Mapování pomocí radiačních hybridních panelů
15
2. 2. 1. 3. Komparativní mapování
16
2. 2. 2. Genomové a cDNA knihovny psího genomu
19
2. 2. 2. 1. Genomové knihovny
19
2. 2. 2. 2. cDNA knihovny
19
2. 3. Dědičná onemocnění u psů
20
2. 3. 1. Homologie dědičných onemocnění u psa a člověka
20
2. 3. 2. Dědičná onemocnění oka u psů
21
2. 3. 2. 1. Progresivní retinální atrofie (PRA)
21
2. 3. 2. 2. Progresivní degenerace tyčinek a čípků
24
2. 3. 2. 3. Mapování prcd lokusu a snahy o identifikaci kausálního genu
26
2. 3. 3. Retinitis pigmentosa
28
2. 4. Genetická analýza dědičných onemocnění a genetické testy
29
2. 4. 1. Genetická analýza dědičných onemocnění
29
2. 4. 1. 1. Metoda kandidátních genů
29
2. 4. 1. 2. Vazbová analýza
30
2. 4. 1. 3. Analýza vazbové nerovnováhy
30
2. 4. 2. Genetické testy
31
2. 5. Studované kandidátní geny
33
2. 5. 1. Gen Usher syndromu typu 1 G (USH1G)
33
2. 5. 2. Gen retinálního fascinu 2 (FSCN2)
34
7
3. CÍL PRÁCE
35
4. MATERIÁL A METODIKA
36
4. 1. Sledovaná populace zvířat
36
4. 2. Izolace DNA
37
4. 3. Polymerázová řetězová reakce (PCR)
37
4. 3. 1. Výběr primerů
37
4. 3. 2. Složení reakční směsi pro PCR
38
4. 3. 3. Teplotní a časový průběh PCR
38
4. 4. Sekvenování
42
4. 5. Analýza sekvenačních dat
43
4. 6. Detekce polymorfismu DNA – polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
43
4. 7. Radiační hybridní mapování
44
5. VÝSLEDKY A DISKUSE
45
5. 1. Gen Usher syndromu typu 1 G (USH1G)
45
5. 1. 1. Strukturní analýza, detekce polymorfismu a mapování genu
45
5. 1. 1. 1. Strukturní analýza a detekce polymorfismu
45
5. 1. 1. 2. Mapování genu USH1G
50
5. 1. 2. Hodnocení asociací mezi genem USH1G a progresivní degenerací tyčinek a čípků (prcd)
51
5. 2. Gen retinálního fascinu 2 (FSCN2)
53
5. 2. 1. Strukturní analýza, detekce polymorfismu a mapování genu
53
5. 2. 1. 1. Strukturní analýza, detekce polymorfismu
53
5. 2. 1. 2. Mapování genu FSCN2
66
5. 2. 2. Hodnocení asociací mezi genem FSCN2 a progresivní degenerací tyčinek a čípků (prcd)
67
6. SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ A ZÁVĚR
69
7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
71
8. LITERATURA
73
9. SEZNAM PUBLIKOVANÝCH PRACÍ
88
10. ŽIVOTOPIS
93
11. PŘÍLOHY
94
8
1. ÚVOD Bouřlivý rozvoj, který molekulární biologie a genetika v posledních letech zažívá, nám umožňuje rozšiřovat své poznání rychlostí, která v historickém kontextu těžko snese srovnání. Jednou z oblastí, ve kterých má dnes molekulární genetika své nezastupitelné místo, je studium dědičných onemocnění živočichů a člověka. U různých druhů zvířat je popsána široká paleta chorob, u kterých se předpokládá určitý genetický základ. Jejich výzkum se až do nedávné minulosti odehrával spíše na empirické úrovni. V současné době však máme možnost studovat genetickou podstatu těchto onemocnění přímo na molekulární úrovni, což je nesrovnatelně účinnější cesta k jejich poznání a eliminaci, neboť v okamžiku přesné identifikace genetické příčiny získáváme příležitost uplatnění nových preventivních a terapeutických přístupů. Z řady živočišných druhů, u kterých jsou dědičná onemocnění studována, do popředí zcela jasně vystupuje jeden- a tím je pes. Není to však jen proto, jak by se snad na první pohled mohlo zdát, že psi jsou po mnoho tisíciletí našimi věrnými společníky a pomocníky. Nejvážnějším důvodem je skutečnost, že u psů bylo popsáno mnoho podobných či identických chorob k těm, které postihují člověka. Výzkum psích homologních onemocnění tak přináší lidské společnosti i přímý prospěch. Především skutečnost, že je možno u psů využívat badatelské přístupy, které jsou u člověka zejména z etických důvodů nepřijatelné, ze psa činí naprosto nezastupitelný modelový objekt v humánní medicíně. V případě využití nových převratných metod jako je např. genová terapie výše uvedené platí dvojnásob. Cílem řešené disertační práce bylo rozšířit poznání genomu psa a přispět k odhalení genetické příčiny jedné z nejrozšířenějších chorob u psů, progresivní retinální atrofie (PRA).
9
2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2. 1. Struktura psího genomu 2. 1. 1. Chromosomální organizace Diploidní karyotyp psa je tvořen 38 páry akrocentrických autosomů, velkým submetacentrickým chromosomem X a malým metacentrickým chromosomem Y (Gustavsson, 1964). Standardizaci pohlavních chromosomů a 21 největších autosomů provedli pomocí G-pruhování Switonski et al. (1996). Pro chromosomy CFA22-38 pak byla nomenklatura doplněna kombinací techniky GTG-pruhování a FISH (Obr. 1) (Reimann et al., 1996). Obr. 1. Ideogram psa (Reimann et al., 1996)
10
2. 1. 2. Subchromosomální struktura Genom psa se svou délkou 2,4 Gb (Kirkness et al., 2003) blíží odhadované velikosti (2,5 Gb) genomu myši (Waterston et al., 2002), ale nedosahuje udávané délky (2,9 Gb) lidského genomu (Venter et al., 2001). Podíl repetitivních sekvencí v psím genomu je odhadován na 31%, což je opět méně než v případě lidského a myšího protějšku - 46% resp. 38% (Kirkness et al., 2003). Bentolila et al. (1999) zjistili přítomnost long interspersed nuclear elements (LINEs) v 13,8% klonů pocházejících z Sau3 A1 knihovny, přesnější odhad jejich početnosti však dosud chybí. Nejpočetnější LINEs psího genomu jsou repetitivní sekvence podobné L1MA9. Předpokládá se, že tyto repetice mají svůj původ v časných LINEs odvozených z L1MA9s, které jsou specifické pro vývojovou větev šelem (Kirkness et al., 2003). Short interspersed nuclear elements (SINEs) tvoří přibližně 1,8 – 3% genomu psa a jejich celkový počet je odhadován na 1,5 – 3 x 105 (Das et al., 1998) až 1,5 x 109 (Vassetzky et al., 2002). Nejpočetnější skupinou jsou SINEs odvozené od tRNA resp. tRNA - Lys, jejichž počet je odhadován na 400 000 (Bentolila et al., 1999). Nejčastěji
se
vyskytujícím
mikrosatelitním
motivem
psího
genomu
je
(CA)n(GT)n, který je přítomen přibližně každých 42 kb. Mezilokusová vzdálenost tri- a tetranukleotidových opakování je mnohem vyšší – 320 kb pro (GGC)n, 205 kb pro (GTG)n, 563 kb pro (AGG)n, 320 kb pro (TCG)n, 233 kb pro (TTA)n, 384 kb pro (CCTA)n, 368 kb pro (CTGT)n, 122 kb pro (TTCC)n, 565 kb pro (TCTA)n a 229 kb pro (TAGG)n (Rothuizen et al., 1994). Jouquand et al. (2000) odhadli, že di- a trinukleotidové repetice se vyskytují přibližně každých 42 kb resp. 117-875 kb. Z jejich celkového počtu je 80% resp. 30% polymorfních. Nejaktuálnější
údaj
hovoří
o
149
818
di-,
tri-
a
tetranukleotidových
polymorfismech identifikovaných v 1,5 Gb dlouhé sekvenci psího genomu (Kirkness et al., 2003). Z pohledu mapování jsou významné zejména tetranukleotidové repetice (GAAA)n, které vykazují vysokou úroveň polymorfismu a vyskytují se napříč celým genomem (Francisco et al., 1996). Pomocí hybridizace lidských sond 33.15 a 33.6 byly minisatelitní sekvence u psa poprvé popsány Jeffreyesem et Mortonem (1987). Shodným způsobem Joseph et Samson (1994) identifikovali sedm polymorfních minisatelitních sekvencí, jejichž heterozygotnost
11
se pohybovala v rozmezí 20-80%. Při hybridizaci devíti lidských minisatelitních sond určili Rothuizen et al. (1994) průměrnou vzdálenost lokusů 1400 kb. V psím genomu byly dosud identifikovány dva typy satelitních sekvencí - α repetice (Fanning, 1989) a opakování 37 bp dlouhého motivu (Bentolila et al., 1999). Mitochondriální genom je dlouhý více než 16,7 kb (neúplná délka) a zahrnuje vedle regulační oblasti 13 ORFs, 22 genů pro tRNA a 2 dva geny pro rRNA (Kim et al., 1998). Předpovídané frekvence výskytu jednonukleotidových polymorfismů DNA (SNPs) kolísají v rozmezí 1 SNP na 400 – 1500 bp (Brouillette et al., 2000; Kirkness et al., 2003). Poměrně velký rozptyl hodnot je pravděpodobně způsoben mimo jiné tím, že analýzy byly prováděny na zástupcích různých plemen, neboť u psů existuje velmi vysoká molekulárněgenetická meziplemenná variabilita (Zajc et al., 1997; Koskinen et Bredbacka, 2000). Popsaná četnost jednonukleotidových polymorfismů u psů je v přibližné shodě s odhady jejich výskytu (1 SNP / 1000 – 2000 bp) v lidském genomu (Sachidanandam et al., 2001).
12
2. 2. Mapování psího genomu Z iniciativy Institut für Genetik, Ernährung und Haltung von Haustieren, VetsuiseFakultät, Universität Bern, Švýcarsko a Division of Animal Genetics of The Royal Veterinary and Agricultural University Copenhagen, Dánsko byly v roce 1992 položeny základy mezinárodní spolupráce při mapováni psího genomu. Do tzv. DogMap projektu se postupně zapojilo 42 laboratoří z 20 zemí Evropy, Velké Británie, Austrálie a Severní Ameriky. Jeho cílem bylo především sestavení podrobné vazbové mapy s průměrnou vzdáleností markerů 20 cM a cytogenetická lokalizace vazbových skupin na chromosomy pomocí FISH. Za tímto účelem byly vytvořeny referenční rodiny založené na jedincích plemen beagle a německý ovčák. Aktuální informace o projektu a přístup do DogMap databáze je možno získat na webových stránkách - www.dogmap.ch (Dolf et al., 1999). V současné době, kdy většina cílů již byla naplněna, však intenzivní rozvoj aktivit v rámci projektu ustal (Switonski, 2004, nepublikováno). Jako součást mezinárodní spolupráce na poli genomiky psů byl pod vedením E. A. Ostrander na National Human Genome Research Institute (Rockville Pike Bethesda, USA) ustanoven THE NHGRI Dog Genome Project. Jeho cílem je především identifikace genetických markerů dědičných onemocnění. Výzkumným jádrem projektu je tvorba radiační hybridní mapy ve spolupráci s týmem F. Galiberta na UMR 6061-CNRS, Faculté de Médecine, Université Rennes (Rennes, Francie) (UMR 6061 – CNRS, 2005a; THE NHGRI Dog Genome Project, 2005). Do současné doby byly zveřejněny výsledky dvou projektů sekvenace psího genomu. První z nich probíhal ve spolupráci týmů na The Institute for Genomic Research a The Center for Advancement of Genomics (Rockville, USA). Získané genomové sekvence plemene pudl (1,5-násobek délky genomu) byly uloženy v databázi EMBL/GenBank pod přístupovými čísly AACN010000001 až AACN011089636 a CE000001 až CE853796. Srovnáním uvedených sekvencí s „hrubou verzí“ genomu člověka bylo v psím genomu identifikováno 18 473 (75%) lidských orthologních genů a 29 673 (80%) transkriptů (Kirkness et al., 2003). Výsledkem druhého projektu, který se uskutečnil na Broad Institute MIT/Harvard, Cambridge, USA, byly
sekvence genomu plemene boxer (7-násobek délky genomu)
(Lindblad-Toh, 2004). Sekvence byly rovněž zpřístupněny v databázi EMBL/GenBank.
13
2. 2. 1. Metodologie mapování psího genomu 2. 2. 1. 1. Vazbové mapování Vazbové mapování je založeno na sledování segregace alel polymorfních markerů ve vícegeneračních tzv. referenčních rodinách. Obecně platí, že poměr potomků s rekombinantním genotypem k potomkům s genotypem nerekombinantním není v případě markerů, které jsou ve vazbě, roven 0,5. Čím jsou markery na chromosomu umístěny vzájemně blíže sobě, tím větší je pravděpodobnost, že rodičovské alely nebudou crossingoverem vzájemně separovány a budou se u potomstva vyskytovat společně (Ostrander et al., 2001). Prvních 16 vazbových skupin psího genomu zahrnujících 43 markerů bylo popsáno Lingaasem et al. (1997), kteří ke studii využili referenčních rodin sestavených v rámci projektu DogMap (celkem 129 jedinců plemen německý ovčák a beagle). Na tyto výsledky navázali Jónasdóttir et al. (1999) určením pěti nových vazbových skupin a částečným propojením map publikovaných Lingaasem et al. (1997) a Mellersh et al. (1997). Postupně byl počet markerů rozšířen na 187 s průměrnou vzdáleností 8,9 cM tvořících celkem 39 vazbových skupin (Lingaas et al., 2001). Mellersh et al. (1997) vytvořili vazbovou mapu vycházející ze 17 třígeneračních rodin s celkovým počtem 212 jedinců plemen trpasličí a toy pudl, norský elkhound, irský setr, beagle a dobrman. Bylo identifikováno 30 vazbových skupin, jejichž velikost se pohybovala v rozmezí 2,3 – 106,1 cM a průměrná vzdálenost mezi markery činila 14,03 cM. Celková délka mapy byla odhadnuta na 2073 cM. Druhou generaci uvedené mapy představili Neff et al. (1999), kteří do 39 vazbových skupin rozdělili 276 markerů s průměrnou distancí přibližně 10 cM. Celková velikost psího genomu byla odhadnuta na 26,5 M. Významný pokrok v mapování psího genomu znamenalo umístění 14 vazbových skupin na příslušné chromosomy, kterého bylo dosaženo fyzickou lokalizací vybraných markerů na chromosomech pomocí fluorescenční in situ hybridizace. V této vazbové mapě třetí generace již bylo lokalizováno 341 markerů s průměrnou vzdáleností 9,0 cM (Werner et al., 1999a). Spojení vazbové a cytogenetické mapy psího genomu provedli Mellersh et al. (2000), kterým se podařilo lokalizovat 217 markerů pomocí vazbového i radiačního hybridního mapování, což vyústilo v identifikaci 44 syntenních skupin.
14
2. 2. 1. 2. Cytogenetické mapování Současné metody cytogenetického mapování psího genomu jsou založeny zejména na fluorescenční in situ hybridizaci (FISH), somatických hybridních panelech a radiačních hybridních panelech (RH-panely). 2. 2. 1. 2. 1. Hybridizace in situ Rozvoj fluorescenční in situ hybridizace (FISH) ve spojení s konstrukcí bakteriálních knihoven psího genomu (Li et al., 1999; Schelling et al., 2002; Schelling et al., 2004) významně rozšířilo paletu metod využitelných pro lokalizaci markerů na psí chromosomy. Ke značení DNA-sond pro FISH je možno využít dvou přístupů. Přímé značení využívá nukleotidy konjugované s fluorochromem (FITC-dUTP, Cy3-dUTP), kdy je po hybridizaci viditelný signál vytvářený konjugátem. Nepřímé značení vyžaduje vizualizaci sond značených hapteny (např. biotin-16-dUTP), které samy o sobě nejsou schopny emitovat signál, pomocí komplexů protilátka - fluorochrom. Optimální velikost DNA-sond pro hybridizaci kolísá v rozmezí několika až několika set kilobazí (Breen et al., 2001a). Metodu FISH lze použít k mapování markerů typu I i II (Stabej et al., 2004; Klukowska-Rotzler et al., 2005). Významným mezníkem v mapování psího genomu, ke kterému rovněž přispělo využití metody fluorescenční in situ hybridizace bylo sloučení cytogenetické (RH-mapy) a vazbové mapy. Celkem byla zahrnuta informace z 266 chromosomově specifických mikrosatelitních markerů lokalizovaných pomocí FISH, 1500 RH-markerů a 38 vazbových skupin. Výsledná mapa obsahovala 1800 markerů a pokrývala přibližně 90% psího genomu (Breen et al., 2001b). Dalším krokem bylo vytvoření FISH/RH mapy sestávající z 4106 vzájemně vázaných a 143 separátních markerů (900 genů, 1589 mikrosatelitů a 1760 BAC klonů). Průměrná vzdálenost markerů na chromosomech, pokud pomineme pohlavní chromosomy, se pohybovala mezi 0,47 Mb (chromosomy CFA12 a CFA20) a 1,2 Mb (chromosom CFA38). Pro 2233 markerů byly nalezeny lidské orthology, což umožnilo identifikaci 79 konzervovaných segmentů mezi genomem člověka a psa (Breen et al., 2004).
15
2. 2. 1. 2. 2. Mapování pomocí somatických hybridních panelů Somatické hybridní panely jsou tvořeny kolekcí mezidruhových hybridních linií buněk. Každý hybrid obsahuje vedle chromosomů původního akceptorového organismu také menší (mikrobuněčné hybridní panely) či větší počet (celobuněčné hybridní panely) chromosomů donorového organismu, který je předmětem studia. Poloha genetických markerů se určuje na základě jejich segregace mezi jednotlivými hybridy (Naylor, 1997). Langston et al. (1997) konstruovali somatický hybridní panel, který byl postaven na liniích psích a křeččích fibroblastů. Panel se sestává z 43 mikrobuněčných a 3 celobuněčných linií, přičemž jednotlivé linie obsahují 0,5 – 10 psích chromosomů. Na základě testace 159 mikrosatelitních markerů a 26 genů bylo identifikováno 31 syntenních skupin. 2. 2. 1. 2. 3. Mapování pomocí radiačních hybridních panelů Výchozím bodem při tomto způsobu mapování je konstrukce tzv. radiačního hybridního panelu, kdy jsou chromosomy donorového organismu vystaveny přesně definované dávce radiačního záření. Dochází k fragmentaci chromosomů, jejíž úroveň je přímo úměrná použité výši radiace. Následně je provedena fúze takto získaných fragmentů s neošetřenými buňkami akceptora, během které dochází k vytvoření hybridních linií buněk akceptorového organismu obsahujících přesně definovatelnou část chromosomů donora. Vlastní mapování markerů probíhá na základě určení jejich přítomnosti či absence v jednotlivých hybridech, přičemž se uvažuje, že pravděpodobnost společného výskytu markerů je nepřímo úměrná jejich fyzické vzdálenosti na chromosomech. Nespornou výhodou radiačně hybridního mapování je skutečnost, že lze uvedeným způsobem lokalizovat i nepolymorfní markery, což je také jeden z důvodů jeho poměrně rychlého rozšíření (Ostrander et al., 2001). První celogenomový radiační hybridní (WGRH- whole genome radiation hybrid) panel u psů nesl označení RHDF5000 (Vignaux et al., 1999a; Vignaux et al., 1999b). K jeho konstrukci bylo využito fúze psích fibroblastů a akceptorových buněk křečka. Výsledkem bylo celkem 126 linií buněk s průměrnou retenční frekvencí 21% a rozlišovací schopností 600 kb. Uvedený panel byl použit k sestavení první RH-mapy psího genomu zahrnující 218 genů a 182 mikrosatelitů (Priat et al., 1998), ve které bylo identifikováno 57 RH-skupin s LOD>6. Průměrná vzdálenost sousedních markerů byla 23 cR5000, což odpovídá přibližné fyzické vzdálenosti 3,8 Mb. Zmíněná prvotní mapa pokrývala přibližně
16
80% psího genomu. Její postupná saturace dalšími markery vyústila ve stanovení 77 RH-skupin (LOD>8) založených na 218 genech a 382 mikrosatelitech. Z tohoto počtu bylo 523 vázaných markerů s průměrnou vzdáleností 24,3 cR5000 (Mellersh et al., 2000). Poslední generace radiační hybridní mapy psího genomu vychází z hybridního panelu RHDF5000-2, který je odvozen z původní verze RHDF5000 (Vignaux et al., 1999a; Vignaux et al., 1999b) a zahrnuje 118 originálních linií. Zmíněná mapa je založena na 1 596 mikrosatelitech, 900 genech a ESTs, 668 BAC klonech a 106 STSs, přičemž průměrná interlokusová vzdálenost činí přibližně 1 Mb. Srovnáním informací o lokalizaci odpovídajících lidských a psích markerů bylo vymezeno 85 konzervovaných oblastí (Guyon et al., 2003). Pět, ve své době neznámých konzervovaných segmentů mezi lidským a psím genomem, se podařilo stanovit Roberts et al. (2003), kteří k RH-mapování použili ESTs ze psí mozkové cDNA knihovny. Na studium pohlavního chromosomu X se zaměřili Everts et al. (2002), kterým se na tomto chromosomu podařilo lokalizovat 45 markerů (geny, mikrosatelity, STSs) pokrývajících oblast přibližně 830 cR. Podrobné informace včetně aktualizovaného přehledu lokalizovaných markerů jsou dostupné na stránkách The canine radiation hybrid project (UMR 6061 – CNRS, 2005b) nebo THE NHGRI Dog Genome Project (2005). 2. 2. 1. 3. Komparativní mapování Komparativního mapování člověk – pes prvně využili Deschenes et al. (1994) k odhalení kausálního genu způsobujícího těžkou kombinovanou imunodeficienci psů vázanou na X chromosom (X-SCID). Zároveň upozornili na vysokou evoluční konzervovanost proximálních částí ramének q lidského a psího chromosomu X. Vzájemná podobnost chromosomů X u člověka a psa je s výjimkou primátů nejvyšší ze všech savců (Everts et al., 2002), Metodami vazbového mapování a FISH byla prokázána konzervovanost mezi lidským chromosomem 17 a chromosomy 9 a 5 u psa (Werner et al., 1997), kdy bylo poprvé použito jednosměrné hybridizace celochromosomových lidských sond. Breen et al. (1999) za použití reciproké Zoo-FISH, která zahrnovala sondy úplného karyotypu člověka a psa, identifikovali mezi oběma organismy 68 evolučně konservovaných segmentů. Nezávisle ve stejném období Yang et al. (1999) publikovali
17
komparativní mapu, ve které však určili 73 lidských homologních segmentů na chromosomech psa. Tato nesrovnalost může být způsobena rozdílnou kolekcí značených chromosomových sond použitých v obou experimentech (Switonski et al., 2004). Při opačném postupu tzn. hybridizaci psích chromosomálních sond na lidské chromosomy bylo určeno 90 homologních segmentů (Yang et al., 1999), z nichž většina byla později v následných studiích potvrzena (Sargan et al., 2000). Schematické znázornění rozložení konservovaných segmentů lidských a psích chromosomů dle Sargan et al. (2000) uvádí Obr. 2. Výše uvedené komparativní mapy člověk – pes jsou postupně zpřesňovány. Zejména pro psí chromosomy resp. jejich části, na nichž se předpokládá lokalizace např. kandidátních genů pro dědičná onemocnění, jsou k dispozici podrobné mapy homologních segmentů. Pro příklad je možno uvést chromosomy CFA5 (Thomas et al., 2001; Comstock et al., 2004), CFA9 (Sidjanin et al., 2003), CFA12 (Li et al., 2001) nebo chromosom X (Everts et al., 2002). Za zmínku stojí, že mikropřestavby konservovaných úseků lidského a psího genomu jsou velmi vzácné (Parker et al., 2001). Vedle člověka byly konstruovány více či méně podrobné a přesné komparativní mapy mezi genomem psa a dalších druhů savců jako např. prasetem domácím (Biltueva et al., 2004), liškou obecnou (Yang et al., 1999), kočkou domácí (Yang et al., 2000), polární liškou (Graphodatsky et al., 2000), psíkem mývalovitým (Nie et al., 2003) a psíkem mývalovitým japonským (Graphodatsky et al., 2001).
18
Obr. 2. Schematické znázornění rozložení konservovaných segmentů lidských a psích chromosomů vycházející z výsledků Breen et al. (1999), Yang et al. (1999) a Sargan et al. (2000). Převzato z publikace Sargan et al. (2000).
19
2. 2. 2. Genomové a cDNA knihovny psího genomu 2. 2. 2. 1. Genomové knihovny Genomové knihovny studovaného organismu jsou neocenitelným nástrojem strukturní genomiky, který umožňuje pracovat se specifikovaným chromosomovým segmetem a využívat ho pro řadu aplikací např. in situ hybridizaci, Southern-blot, chromosome walking apod.. První bakteriální knihovnu psího genomu (BAC library – Bacterial Artificial Chromosome library) sestrojili Li et al. (1999). Obsahuje celkem 165 888 klonů s průměrnou délkou insertu 155 kb, což v souhrnu představuje více než osminásobek genomu. Prvotní verze bakteriální knihovny psího genomu, která byla vytvořena v rámci projektu DogMap, sestávala z více než 96 tis. klonů s pokrytím 77% (Schelling et al., 2002). Za účelem zvýšení rozsahu byla následně rozšířena na celkový počet 211 968 klonů s průměrnou velikostí inzertu 110 kb (4-násobek délky genomu) a pokrytím 93% (Schelling et al., 2002). 2. 2. 2. 2. cDNA knihovny Obdobně jako u ostatních druhů organismů dosáhly cDNA knihovny širokého uplatnění při studiu struktury a funkce psího genomu. Namátkou je možno uvést několik příkladů, kdy bylo v různých aplikacích využito psích cDNA knihoven připravených z mozkové tkáně (Roberts et al., 2003), hlavové části embrya (Haworth et al., 2001), sítnice (Zhang et al., 1997) či sleziny (Tang et al., 2001).
20
2. 3. Dědičná onemocnění u psů 2. 3. 1. Homologie dědičných onemocnění u psa a člověka Vysoká podobnost genetické informace mezi jednotlivými druhy savců je dobře známa. Mezidruhové rozdíly ve struktuře genů resp. proteinů jsou velmi malé – jedná-li se o geny kódující strukturní proteiny, peptidové hormony, enzymy intermediárního metabolismu či receptory. Na tomto podkladě je možno formulovat dvě základní teze vztahující se ke studiu dědičných chorob u savců: 1) možný počet a typy onemocnění u jednotlivých druhů jsou podobné 2) onemocnění vyskytující se u jednoho druhu může představovat homologní onemocnění k chorobě postihující jiný druh Přínos výzkumu dědičných onemocnění u jednotlivých druhů organismů je vzájemný, neboť poznatky získané u jednoho druhu ve velké míře přispívají k rozšíření znalostí u dalšího. Pokrok v diagnostice lidských chorob je obvykle následován identifikací jejich homologů u zvířat. A právě jejich studium pak přináší neocenitelné informace o patogenezi či možnostech léčby pro humánní medicínu (Patterson et al., 1988). Výše uvedené platí zejména v případě nemocí vyskytujících se u psa a člověka. Do roku 2004 bylo popsáno 479 chorob psů, u kterých je předpokládán určitý genetický základ. Z tohoto počtu je většina považována za homologní onemocnění člověka. Výčet genetických onemocnění se však s rostoucím poznáním neustále rozšiřuje (Sargan, 2004). Z psích chorob, u nichž je znám způsob dědičnosti, je více než 70% autosomálně recesivních, X-vázaných či s komplexním genetickým základem. Zastoupení autosomálně dominantních chorob je nižší z důvodu jejich snadné eliminace v populaci (Ostrander et al., 2000) Biologická podobnost a analogické diagnostické resp. terapeutické přístupy činí ze psů ideální model pro preklinické zkoušky genové terapie lidských dědičných chorob (Kruth, 1996). Aktuální přehled o dědičných chorobách u psů je možno získat na webových stránkách Inherited Diseases in Dogs – IDID (Sargan, 2002 - 2005). Dalšími možnými informačními zdroji jsou OMIA Database - Online Mendelian Inheritance in Animals (Nicholas, 2003) a CIDD - Canine Inherited Disorders Database (Crook et al., 1998).
21
2. 3. 2. Dědičná onemocnění oka u psů 2. 3. 2. 1. Progresivní retinální atrofie (PRA) Označení progresivní retinální atrofie (PRA) zahrnuje rozsáhlou skupinu dědičných onemocnění sítnice u psů (Tab. 1), která postihují fotoreceptory, retinální epiteliální pigment popř. obojí. Klinicky je možno PRA rozdělit do dvou kategorií (Narfström et Ekesten, 1999): 1) centrální progresivní retinální atrofie (CPRA) – postihují především retinální epiteliální pigment, nemusí ve všech případech vést k oslepnutí jedince. V současné literatuře je původní pojmenování CPRA nahrazováno výstižnějším označením dystrofie retinálního epiteliálního pigmentu (RPED). 2) generalizované progresivní retinální atrofie (gPRA) – zasahují zejména fotoreceptory, téměř výlučně způsobují v konečném stádiu oslepnutí zvířete S ohledem na věk, ve kterém onemocnění u postižených jedinců propuká, generalizované progresivní retinální atrofie dále rozdělujeme na (Petersen – Jones, 1998): 1) časné formy - např. degenerace tyčinek a čípků typu 1 a 2 (rcd-1, rcd-2), dysplasie tyčinek, časná degenerace sítnice (erd) 2) střední formy – pohlavně vázaná gPRA (XLPRA) u sibiřských husky, PRA u tibetských terierů a dlouhosrstých trpasličích jezevčíků 3) pozdní formy - progresivní degenerace tyčinek a čípků (prcd) Clements et al. (1996) uvádějí, že k poškození fotoreceptorů může dojít jak před úplným dokončení postnatálního vývoje (dysplazie), tak až po dosažení jejich anatomické a fyziologické zralosti (degenerace). Do prvně uvedené skupiny spadá např. rcd-1, rcd-2, rcd-3, jako příklad degenerativních změn je možné uvést prcd. Ačkoli je rozeznáváno mnoho typů generalizovaných progresivních retinálních atrofií, jejich obecné klinické příznaky jsou velice podobné. Hlavním znakem většiny PRA je nyktalopie (zhoršené vidění za šera a v noci), která je postupně doprovázena hemeralopií (snížené vidění za denního světla) až do úplného oslepnutí zvířete. Při oftalmoskopickém vyšetření je možno pozorovat zeslabení neuroretiny, degeneraci axonů gangliových buněk, zeslabení povrchových cév sítnice spojené s omezením krevního zásobení a depigmentaci netapetální části fundu. Častým jevem je také atrofie těla optického nervu a zpomalení
22
pupilárního reflexu. Před nástupem vlastních oftalmologických změn je možno některé typy gPRA diagnostikovat na základě změny elektroretinogramu (ERG) při světelné stimulaci sítnice (Petersen – Jones, 1998). Příčinné mutace odpovědné za vznik PRA u některých plemen psů již byly objeveny (Tab. 2), u mnoha dalších však vynaložené úsilí doposud nepřineslo patřičné výsledky.
23
Tab. 1. Přehled jednotlivých typů progresivní retinální atrofie (Clements et al., 1996; Sargan, 2002 – 2005; Sidjanin et al., 2002, Zhang et al., 2002, Aguirre et Acland,1988) Onemocnění rcd-1 rcd-2 rcd-3 dysplasie tyčinek erd pd prcd prcd prcd prcd prcd prcd PRA (jako prcd) PRA (jako prcd) PRA (jako prcd) PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA PRA degenerace čípků degenerace čípků PRA PRA (jako rcd-1) PRA (ne rcd-1) XLPRA1 XLPRA1
Plemeno
Způsob Nyctalopia Změny Změny oč. dědičnosti ERG pozadí irský setr ar 6t 6t 3-4 m kolie ar 6t 6t 3-4 m Welsh Cordi Cardigan ar 8t norský losí pes ar 6t 6t 5m norský losí pes ar 6t 5-6 t 6m knírač malý ar 6–12 m 6-8 t < 2-5 r pudl (trp., toy, stand.) ar 3-5 r 9-10 m 3-5 r anglický kokršpaněl ar 4-8 r 18-24 m 4-8 r americký kokršpaněl ar 3-5 r 9m 3-5 r labrador retriever ar 4-6 r 12-15 m 4-6 r portugalský vodní pes ar Chesapeake Bay retriever ar eskymácký pes ar, k australský honácký pes par 3-5 r 3-5 r papillon ar ≤2r tibetský terier ar 1-2 r 10 m 12-18 m jezevčík dlouhosrstý trp. ar 6m 4m 5-7 m anglický setr 5-6 r <7r akita-inu ar 1-3 r 10 m 5-18 m tibetský španěl ar 4-5 r* 3-4 r welššpringršpaněl par zlatý retriever ar sloughi ar * irský vlkodav ar 2-3 r anglický mastif ad 4 m – 3r Nova Scotia Duck Toll. r. ar, k pekingský palác. psík ar * groenendael ar 8t 4t 11 t etlenbuchský salaš. pes ar 6-8 r* lapinkoira ar 3-6 r něm. ovčák par greyhound par 12 m bullmastif ad, jiná 4 m – 3r něm. ohař krátkosrstý ar aljašský malamut ar briard ar gordonsetr ar irský setr 8-11 r 6-11 r samojed g 3-5 r 16-24 m 2-4 r sibiřský husky g 18 m 6-12 m
Pozn.: časové údaje – t – týdny, m – měsíce, r - roky; rcd –1, 2, 3 – degenerace tyčinek a čípků typu 1, 2 resp. 3; erd – časná degenerace sítnice; pd - dysplasie fotoreceptorů; prcd – progresivní degenerace tyčinek a čípků; PRA – progresivní retinální atrofie; XLPRA – pohlavně vázaná PRA; způsob dědičnosti: ar – autosomálně recesivní, par – předpokládá se autosomálně recesivní dědičnost, ad- autosomálně dominantní, g – vázaná na pohlaví, k- kodominantní; * - nástup úplné slepoty
24
Tab 2. Dosud identifikované geny způsobující progresivní retinální atrofii u psů Onemocnění rcd-1
Plemeno irský setr
Gen PDE6B
rcd-3
Welsh Cordi Cardigan
PDE6A
PRA
sloughi
retinitis pigmentosa
anglický mastif
degenerace čípků
aljašský malamut
degenerace čípků
něm. ohař krátkosrstý
XLPRA1
samojed sibiřský husky kříženci
XLPRA2
Mutace substituce G→A delece 1 bp
PDE6B inzerce 8 bp
Literární odkaz Suber et al. (1993) Petersen – Jones et al. (1999) Dekomien et al. (2000) Kijas et al. (2002)
substituce C→G CNGB3 delece všech exonů CNGB3 substituce Sidjanin et al. (2002) G→A delece 5 bp RPGR Zhang et al. (2002) RPGR delece 2 bp RHO
2. 3. 2. 2. Progresivní degenerace tyčinek a čípků Progresivní degenerace tyčinek a čípků (prcd) je dědičné autosomálně recesivní onemocnění sítnice, které je řazeno mezi generalizované progresivní retinální atrofie s pozdním nástupem (Petersen – Jones, 1998). Dědičná degenerace sítnice odpovídající (či připomínající) svým klinickým obrazem prcd byla zaznamenána u devíti plemen psů (Tab. 1) (Sargan, 2002 - 2005). Avšak pouze v případě plemen trpasličí, toy a standardní pudl, anglický kokršpaněl, americký kokršpaněl, labrador retriever a portugalský vodní pes bylo experimentálně prokázáno, že se skutečně jedná o identické onemocnění determinované jedním lokusem (Aguirre et Acland, 1988; Aguirre et Acland, 1989; Aguire, 1996 nepublikováno, cit. Narfström et Ekesten, 1999). Průběh onemocnění je typický pro pozdní formy generalizované progresivní retinální atrofie. Postnatální vývoj fotoreceptorů probíhá u postižených jedinců normálně. Avšak již ve věku 15 týdnů dochází ke snížení obnovy zevního segmentu tyčinek a degenerativní proces postupně zasahuje také ostatní části buňky a v menší míře se též objevují strukturální změny čípků. Stupeň degenerace se v jednotlivých částech sítnice liší a postupuje z její centrální části k okrajům. Pro onemocnění specifické změny ERG je možno pozorovat ve věku 28 týdnů (Aguirre et al., 1982). Postupný rozvoj onemocnění má za následek ztenčení sítnice, zeslabovaní cév a atrofii optického nervu. Typickým
25
klinickým příznakem pokročilé prcd je nyktalopie, které se u postižených jedinců objevuje ve věku 3-5 let (Aguirre et Acland, 1988). Časový průběh onemocnění a závažnost poškození očních struktur vykazuje jistou variabilitu jak mezi jedinci, tak mezi plemeny (Tab. 1). Například u anglických kokršpanělů se ve srovnání s pudly onemocnění projevuje ve vyšším věku, rozvíjí se pomaleji a je méně destruktivní. Možným vysvětlením je odlišné genetické pozadí nebo výskyt různých recesivních kausálních mutací u každého z plemen (Aguirre et Acland, 1988). Zajímavé zjištění uvádějí Acland et al. (1990). Při páření postižených psů a heterozygotních fen bylo ve vrzích zaznamenáno nižší zastoupení postižených jedinců, které neodpovídalo mendelistickým pravidlům dědičnosti autosomálně recesivního znaku. Tento stav nelze vysvětlit vyšší pre– nebo postnatální úmrtností postižených štěňat, protože početnost a přežitelnost štěňat v uvedených vrzích byla stejná jako u ostatních typů páření. Kausální gen v prcd lokusu či jiný gen, který je s ním ve vazbě, tedy pravděpodobně ovlivňují fitness gamet či zygot v reprodukčním ústrojí heterozygotních fen. Na základě studií, které poukazovaly na nižší hladinu docosahexaenové kyseliny (DHA, hlavní mastná kyselina fotoreceptorů) v krevní plasmě postižených pudlů (Anderson et al., 1991), byla uvažována možná souvislost mezi poruchami metabolismu polynenasycených mastných kyselin a klinickým projevem prcd. Aguirre et al. (1996) navíc upozornili na kosegregaci nízké hladiny docosahexaenové kyseliny s klinickým stavem prcd a autosomálně recesivní způsob dědičnosti tohoto jevu, ačkoli jiní autoři k podobným závěrům nedošli (McColl et al., 1990). Hypotézu také podporovaly známé údaje o poškození zraku u opic Macacus rhesus krmených krmnou dávkou s nízkým obsahem prekursorů docosahexaenové kyseliny (Neuringer et al., 1984). Mezi zdravými a prcd-pozitivními jedinci však nebyly nalezeny žádné rozdíly ve schopnosti syntézy a uvolňování DHA (Alvarez et al., 1994; Chen et al., 1999) a úrovni jejího začlenění do fosfolipidů v sítnici oka (Wetzel et al., 1990), i když existují důkazy o proporcionálně nižším množství proteinu vázajícího docosahexaenovou kyselinu (DHABP) v sítnici a mozkové tkáni postižených zvířat (Jiao et al., 1994). Zvýšenou dotací docosahexaenové kyseliny v krmné dávce se podařilo zdvihnout její hladinu v krevní plazmě nemocných jedinců nikoli však v jejich fotoreceptorech. Příčina nízké hladiny DHA tedy může být způsobena poruchami její absorpce, transportu či ukládání v buňkách sítnice oka (Aguirre
26
et al., 1997). Přes vynaložené úsilí zůstává předpokládaná souvislost mezi metabolismem DHA a progresivní degenerací tyčinek a čípků u psů dosud neobjasněna. 2. 3. 2. 3. Mapování prcd lokusu a snahy o identifikaci kausálního genu Lokus pro prcd byl zmapován do centromerické části psího chromosomu 9 (CFA9), přičemž jako nejbližší marker byl identifikován gen GALK1 (Acland et al., 1998). Tato oblast CFA9 je homologní s lidským chromosomem 17q (Werner et al., 1997), ale pořadí genů vzhledem k centromeře je u psa opačné (Werner et al., 1999b). Gu et al. (1998) identifikovali RAPD marker, který je ve vazbě s prcd a s jeho pomocí potvrdili lokalizaci prcd lokusu ve vazbové skupině na CFA9 (Acland et al., 1998). Později bylo prokázáno, že část CFA9 zahrnující prcd lokus odpovídá HSA17q25 (Obr. 3). Podrobnou analýzou sekvencí bylo z uvedené části lidského chromosomu vybráno 49 pozičních kandidátních genů pro prcd. Jako nejbližší markery k prcd lokusu byly určeny geny GALK1 a GRB2 (Sidjanin et al., 2003). Na základě komparativního mapování odpovídajících chromosomálních oblastí psa a člověka bylo původně uvažováno, že progresivní degenerace tyčinek a čípků u psů a retinitis pigmentosa 17 (RP17) u člověka mohou být způsobeny mutacemi v orthologních genech (Acland et al., 1998). Po upřesnění homologie mezi regionem zahrnujícím prcd lokus a HSA17q25 (Sidjanin et al., 2003) a po detailním zmapování lokusu RP17 na lidský chromosom 17q22 (Bardien et al., 1997) je možno tento předpoklad s největší pravděpodobností považovat za mylný. Dosud byly na základě molekulární analýzy jako příčinné pro prcd vyloučeny následující kandidátní geny – RHO (Gould et al., 1995; Wang et al., 1995), PDE6B (Acland et al., 1995), PDE6D a PDE6G (Dekomien et Epplen, 2003), RDS (Wang et al., 1995), ROM-1 (Gould et al., 1997), GANAT1 (Ray et al., 1997), APOH (Gu et al., 1999), GRLF1 (Zangerl et al., 2002), RCV1 (Dekomien et Epplen, 2002a), PDC (Dekomien et Epplen, 2002b) a ABCA4 (Kijas et al., 2004).
27
Obr. 3. Homologní úseky centromerické části CFA9 a HSA17q. Převzato ze Sidjanin et al. (2003).
28
2. 3. 3. Retinitis pigmentosa Progresivní retinální atrofie u psů je homologním onemocněním k retinitis pigmentosa (RP) postihujícím lidskou populaci, se kterým sdílí podobné klinické příznaky a průběh patologických procesů (Lin et al., 2002). U člověka bylo dosud identifikováno celkem 26 kausálních genů pro retinitis pigmentosa. Z tohoto počtu 13 genů způsobuje autosomálně dominantní formu RP, 11 autosomálně recesivní a projev dvou genů je vázaný na pohlaví (Daiger et al., 1996-2005). Popsán však byl také mitochondriální a polygenní způsob dědičnosti (Himms et al., 2003). Pozoruhodná je pak zejména obrovská heterogenita molekulárních funkcí proteinů exprimovaných těmito geny. Příčinné mutace byly objeveny v genu rodopsinu, genech kódujících strukturální proteiny fotoreceptorů, transkripční faktory, proteiny podílející se na sestřihu pre-mRNAs a enzymy katalyzující syntézu purinů, ale kupodivu i v genech, které nejsou v sítnici oka pravděpodobně vůbec exprimovány (Kennan et al., 2005).
29
2. 4. Genetická analýza dědičných onemocnění a genetické testy 2. 4. 1. Genetická analýza dědičných onemocnění Pro odhalení genetické příčiny dědičných onemocnění je možno využít jeden ze tří základních metodických přístupů – metodu kandidátních genů, vazbovou analýzu nebo analýzu vazbové nerovnováhy (Greer et al., 2003). 2. 4. 1. 1. Metoda kandidátních genů Metoda kandidátních genů je využívána zejména v případě, kdy nejsou dostupné vhodné rodiny zvířat nebo jsou neúplné. Její výhodou je skutečnost, že analýzy je možno provádět na souboru doslova několika postižených a zdravých jedinců (Lin et al., 2002). Kandidátní geny jsou pro studie voleny s ohledem na známé asociace orthologních genů s obdobnými dědičnými onemocněními u ostatních organismů, na základě fyziologické funkce jejich exprimovaných produktů či jako poziční kandidátní geny z chromosomových oblastí identifikovaných vazbovou analýzou nebo analýzou vazbové nerovnováhy (Greer et al., 2003; Goddard, 2003). Významným kriteriem je také exprese genu v určité tkáni resp. linii buněk. Například v případě progresivní retinální atrofie jsou silnými kandidátními geny ty, které jsou exprimované ve fotoreceptorech sítnice (Lin et al., 2002). Je porovnávána struktura kandidátních genů u zdravých a postižených jedinců s cílem nalézt mutaci, která je odpovědná za vznik daného onemocnění. Po identifikaci strukturních rozdílů je nezbytné zjistit, zda se jedná skutečně o příčinou mutaci či pouze o polymorfismus, který je s neznámou kausální mutací v genetické vazbě (ať již úplné či neúplné). Pro příčinné mutace je typické, že v populacích segregují striktně v souladu se známým způsobem dědičnosti příslušného onemocnění a s ohledem na jejich molekulární podstatu je možno předpokládat změnu struktury vytvářeného proteinu či úrovně jeho exprese (Lin et al., 2002). Příkladem úspěšně provedené analýzy kandidátního genu završené identifikací kausální mutace je odhalení substituční mutace v genu rhodopsinu (RHO) jako genetické příčiny vzniku retinitis pigmentosa u anglických mastifů (Kijas et al., 2002).
30
2. 4. 1. 2. Vazbová analýza Pro určitá onemocnění se složitou etiologií je obtížné omezit velký počet potenciálních kandidátních genů. V uvedeném případě je vhodné použít vazbovou analýzu v rodinách zahrnujících jak klinicky zdravé, tak postižené jedince, které jsou v populacích psů (na rozdíl např. od člověka) poměrně snadno dostupné. Výhodou je také minimální heterogenita genetických příčin onemocnění u psů, která je způsobena nízkou genetickou variabilitou uvnitř plemen, neboť ta pochází z malých populací s výrazným „efektem zakladatele“ (Greer et al., 2003). Principem vazbového mapování je nalezení vztahu mezi alelami markeru a alelami neznámého příčinného genu v určité rodině (Goddard, 2003), která vychází z páření dvou heterozygotních jedinců (přenašečů) nebo heterozygotního a postiženého jedince (Hyun et al., 2003). Nalezená korelace však platí právě pouze pro danou rodinu, protože v jiné se může vyskytovat odlišná vazbová fáze mezi oběma alelami. Pokud tedy v celé populaci existuje vazbová rovnováha, nelze v ní nalézt žádný vztah mezi alelami markeru a alelami příčinného genu (Goddard, 2003). Pomocí vazbové analýzy byl například zmapován lokus pro anomálii oka u kolií (CEA) na CFA37 (Lowe et al., 2003). 2. 4. 1. 3. Analýza vazbové nerovnováhy Cílem analýzy je identifikovat vazbu mezi alelami markeru a příčinného genu. Děje se tak na základě detekované společné segregace příslušných alel markeru a genu, která se vyskytuje častěji, než by se dalo předpokládat při platnosti pravidla volné kombinovatelnosti. Tento stav se nazývá vazebnou nerovnováhou (LD - linkage disequilibrium) a lze ho očekávat v populacích založených na společném předkovi. Jak již bylo uvedeno v předchozí kapitole, je tento předpoklad u čistokrevných plemen psů naplněn. Narozdíl od vazbového mapování však není korelace mezi alelami hledána uvnitř jednotlivých rodin, ale napříč celou populací. Společný předek tedy neleží uvnitř analyzované rodiny, ale mimo ni (Greer et al., 2003; Goddard, 2003). Metoda LD mapování je tedy použitelná i v případě, kdy není k dispozici rodina odvozená od heterozygotního zakladatele (Hyun et al., 2003). Vhodnost genetické struktury psích plemen pro LD mapování potvrdili Sutter et al. (2004). Při porovnání pěti plemen zjistili velmi rozsáhlou vazebnou nerovnováhu, která mnohonásobně převyšovala úroveň LD v lidských populacích a nízkou variabilitu
31
haplotypů v chromosomálních oblastech s vysokou LD. Významný je také poznatek o výrazné odlišnosti úrovně LD mezi jednotlivými plemeny psů (400 kb-3,2 Mb). Hyun et al. (2003) upozorňují na možnost využití LD mapování v celogenomových analýzách. Počet markerů potřebných pro uvedené aplikace se oproti původním předpokladům pohybuje spíše v řádech stovek než stovek tisíc. Pro celogenomové analýzy byl sestaven tzv. minimální screeningový set 1 (MSS-1) zahrnující 172 mikrosatelitních markerů. Bylo odhadnuto, že 44% genomu je v rozmezí do 5 cM od nejméně jednoho z markerů a 77% v rozmezí 10 cM (Richman et al., 2001). Z celkového počtu je možno 155 mikrosatelitů genotypovat v 48 multiplexních reakcích (Cargill et al., 2002). Guyon et al. (2003) konstruovali minimální screeningový set 2 (MSS-2) sestávající se z 325 mikrosatelitů s průměrnou vzdáleností 90 Mb mezi markery. Později bylo na základě MSS-2 vytvořeno 69 chromosomově specifických setů (1,73 panelu na chromosom) (Clark et al., 2004). Přínos analýzy LD pro výzkum dědičných chorob lze názorně demonstrovat na případu toxikózy způsobené mědí u bedlington terierů (van de Sluis et al., 2002). 2. 4. 2. Genetické testy Primárním cílem výzkumu monogenních dědičných chorob u psů je odhalit gen resp. mutaci, která je příčinou vzniku onemocnění a vyvinout metodu, pomocí níž by bylo možné provádět rutinní testování. V zásadě se rozlišují dva druhy genetických (DNA) testů – vazbové a mutační (Patterson, 2000). Vazbové genetické testy jsou využívány v případě, kdy nebyla kausální mutace dosud identifikována. K predikci genotypu neznámého příčinného genu je využíváno markeru, který je s ním v genetické vazbě. Nezbytným předpokladem je, aby vazbový marker vykazoval v populaci resp. sledované rodině dostatečnou míru polymorfismu a bylo tedy pomocí něho možno vysledovat přenos mutantní alely mezi generacemi. Nedostatkem vazbových genetických testů je jejich časová a finanční nákladnost, protože je pro zajištění hodnověrnosti výsledků často nezbytné genotypovat jak rodiče, tak generaci potomků. V případě neúplně vázaných markerů může navíc docházet k chybám z důvodu rekombinací. Výhodou naopak je, že vazbové testy jsou nezřídka použitelné u více plemen, což u mutačních testů často neplatí (Patterson, 2000). Jako příklad vazbového genetického testu je možno uvést toxikózu způsobenou mědí u bedlington terierů, kde bylo pro odhalení nositelů mutantní alely využíváno jako
32
vazbového markeru mikrosatelitu C04107 (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1997). Pro názornou demonstraci slabin vazbových genetických testů dodejme, že po pozdější identifikaci kausální mutace v genu MURR1 (van de Sluis et al., 2002) byl potvrzen výskyt rekombinací mezi původním vazbovým markerem a příčinným genem (Hyun et al., 2004). Mutační genetické testy přímo detekují mutaci v sekvenci DNA, o které je známo, že podmiňuje vznik příslušného onemocnění. Jejich předností je absolutní přesnost. Častou nevýhodou naopak je, že v případě chorob postihujících více plemen, není příslušný test univerzálně použitelný, neboť molekulárně-genetický základ onemocnění se u jednotlivých plemen liší (Patterson, 2000). Mutačním genetickým testem je možno například určit predispozici k retinální dystrofii u plemene briard, která je způsobena delecí 4 bp v genu RPE65 (Veske et al., 1999). Pro úplnost je nezbytné uvést ještě skupinu testů, jejichž principem je detekce množství nebo funkce proteinů exprimovaných geny. I když se z formálního hlediska nejedná o genetické (DNA) testy, neboť analýza neprobíhá na úrovni deoxyribonukleové kyseliny, je možno je využít k identifikaci genotypů (Patterson, 2000).
33
2. 5. Studované kandidátní geny 2. 5. 1. Gen Usher syndromu typu 1 G (USH1G) Struktura genu USH1G byla dosud popsána u druhu Homo sapiens (International Human Genome Sequencing Consortium, 2003) a Mus musculus (Kikkawa et al., 2003) a předpovězena u Rattus norvegicus (EMBL/GenBank, XM 221106). Lidský USH1G gen je dlouhý 7,2 kb a cDNA zahrnuje 3559 bp. Ze tří exonů tohoto genu jsou pouze dva kódující. Podle otevřeného čtecího rámce s délkou 1380 bp je exprimováno 460 aminokyselin tzv. SANS proteinu, který zahrnuje tři ankyrinové domény, sterilní alfa motiv a PDZ1 – vázající motiv. SANS protein interaguje s proteinem harmoninem a je pravděpodobně spoluodpovědný za správnou strukturu stereocilií (Weil et al., 2003). U člověka byl lokus USH1G zmapován do oblasti 17q24-25 (Mustapha et al., 2002). Gen USH1G patří mezi geny odpovědné za vznik autosomálně recesivního onemocnění Usher syndromu typu I (USH1) u člověka (Weil et al., 2003), které se u postižených pacientů projevuje těžkou hluchotou a retinitis pigmentosa (Otterstede et al., 2001). V genu byly nalezeny čtyři různé mutace - delece 20 bp, delece 2 bp, inzerce guaninu a C → T tranzice, které jsou asociovány se vznikem onemocnění. Deleční mutace a inzerce způsobují posun čtecího rámce a expresi neúplného proteinu, tranzice má za následek záměnu aminokyselin v jedné z jeho funkčních domén (Weil et al., 2003). Quyang et al. (2005) popsali u některých pacientů s USH1 další polymorfismus spočívající v substituci G113A. Předpokládá se, že se jedná o novou kausální mutaci, neboť vytváří v kódující sekvenci genu předčasný stop kodon a zapříčiňuje ztrátu cca 90% proteinu. Tato domněnka však dosud nebyla exaktně potvrzena. U myší způsobuje recesivní mutace v genu USH1G hluchotu, poruchy chování (pobíhání do kruhu a kroucení hlavou) a degeneraci neuroepitelu vnitřního ucha (Kikkawa et al., 2003).
34
2. 5. 2. Gen retinálního fascinu 2 (FSCN2) Gen FSCN2 je řazen do rodiny fascinových genů, pro jejíž členy je typická tkánově specifická exprese. Gen FSCN1 je exprimován v tkáních mezenchymálního původu a v nervovém systému během embryonálního vývoje (De Arcangelis et al., 2004), gen FSCN2 ve fotoreceptorech sítnice (Tubb et al., 2000) a gen FSCN3 v prodlužujících se spermatidách (Tubb et al., 2002). Úplná či částečná struktura genu je známa u Homo sapiens (International Human Genome Sequencing Consortium, 2003), Mus musculus (Waterston et al., 2002), Bos taurus (Saishin et al., 1997), Pan troglodytes (Clark et al., 2003) a Rattus norvegicus (EMBL/GenBank, XM 221196). Tubb et al. (2000) lokalizovali lidský gen FSCN2 do oblasti HSA17q25 a v jeho struktuře popsali 5 exonů. Celková délka genu je více než 7 kb. Analýza promotorových oblastí odhalila vedle TATA boxu a GC-regionu také úseky, které zahrnují vazebná místa pro specifické retinální transkripční faktory - RARE (Retinoic Acid Response Element) a vazebná místa pro transkripční faktory CRX a NRL. U člověka dochází k alternativnmu sestřihu mRNA. Byly získány sekvence dvou cDNA lišících se délkou (1782 bp a 1710 bp) a zahrnujících otevřený čtecí rámec kódující proteiny o délce 516 resp. 492 aminokyselin (Saishin et al., 2000). Retinální fascin vykazuje schopnost vázat aktin a podílet se na jeho sestavování do složitých struktur typu filament. Immunohistochemicky byla zjištěna přítomnost tohoto proteinu výhradně ve fotoreceptorech sítnice, a proto se předpokládá, že hraje významnou specifickou roli při vývoji jejich struktury (Saishin et al., 2000). Wada et al. (2001) prokázali, že mutace 208delG lidského genu je příčinnou autosomálně dominantního typu retinitis pigmentosa vyskytujícího se v japonské populaci. Uvedená delece způsobuje posunutí čtecího rámce a vznik předčasného stop kodonu, čímž je znemožněna exprese funkčního proteinu. U linií myší, které nesly dvě různé mutace (208delG nebo knock-out exonu 1), byla v případě mutantních homozygotních jedinců zjištěná úplná absence exprese mRNA a heterozygotní jedinci vykazovali strukturální abnormality zevního segmentu fotoreceptorů (Yokokura et al., 2005).
35
3. CÍL PRÁCE Cílem předložené doktorské disertační práce bylo: 1. vybrat kandidátní geny (funkční a poziční) pro progresivní degeneraci tyčinek a čípků u psů 2. analyzovat strukturu kandidátních genů se zvláštním zřetelem na identifikaci různých polymorfních variant a provést jejich mapování na chromosomy 3. vyhodnotit vztah kandidátních genů k progresivní degeneraci tyčinek a čípků u psů
36
4. MATERIÁL A METODIKA 4. 1. Sledovaná populace zvířat Do sledované populace zvířat byli zařazeni jedinci plemen pudl, anglický kokršpaněl a americký kokršpaněl (Tab. 3-5). U všech jedinců bylo provedeno oftalmologické vyšetření a stanovena diagnóza – PRA-pozitivní nebo PRA-negativní. Klinické vyšetření jedinců zajišťovala MVDr. Pavla Trnková (Veterinární klinika a specializované oční pracoviště Brno-Lesná), která je „Posuzovatelem dědičných očních vad“ Komory veterinárních lékařů České republiky. Na základě stanovené diagnózy byla zvířata rozdělena do dvou kategorií – PRA-pozitivní a PRA-negativní. Do sledované populace byli ze skupiny PRA-negativní zařazeni pouze ti jedinci, u kterých bylo klinické vyšetření provedeno ve stáří 7 a více let. Tab. 3. Seznam jedinců plemene pudl zařazených do sledované populace Laboratorní číslo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Věk při klin. vyšetření 7 13 11 8 9 5 11 8 3 14
Klinická diagnóza PRA-IV st. PRA-IV st. PRA-IV st. PRA-IV st. PRA-III st. PRA-IV st. PRA-poz. PRA-III st. PRA-poz. PRA-neg.
Kategorie poz/neg poz poz poz poz poz poz poz poz poz neg
Tab. 4. Seznam jedinců plemene americký kokršpaněl zařazených do sledované populace Laboratorní číslo 1 2 3 4 5 7
Věk při klin. vyšetření 12 7 10 7 11 10
Klinická diagnóza PRA-III st. PRA-neg. PRA-III st. PRA-neg. PRA-neg. PRA-neg.
Kategorie poz/neg poz neg poz neg neg neg
37
Tab. 5. Seznam jedinců plemene anglický kokršpaněl zařazených do sledované populace Laboratorní číslo 1 3 4 5 6 7 8
Věk při klin. vyšetření 12 10 9 9 9 8 11
Klinická diagnóza PRA-I st. PRA-II st. PRA-neg. PRA-neg. PRA-neg. PRA-neg. PRA-neg.
Kategorie poz/neg poz poz neg neg neg neg neg
4. 2. Izolace DNA Genomická DNA byla z krve odebrané na K3EDTA izolována pomocí QIAamp® Blood Kit Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Bezprostředně po izolaci byla kvalita a kvantita izolované DNA kontrolována po elektroforéze na 1% agarosovém gelu (Agarose Serva for DNA Electrophoresis; Serva Electrophoresis GMBH, Heidelberg, Německo) při napětí 20 V/cm po dobu 20 - 30 min v 1x TAE pufru (InvitrogenTM, Carlsbad, California, USA). Při namátkovém fotometrickém měření se koncentrace vytěžené DNA pohybovala v rozmezí 20 – 35 ng/μl. Izolovaná DNA byla denaturována 7 min při 95 °C a dlouhodobě uchovávána při - 20 °C. 4. 3. Polymerázová řetězová reakce (PCR) 4. 3. 1. Výběr primerů Primery byly navrženy ze sekvencí orthologních genů u člověka, předpovězených sekvencí příslušných psích genů dostupných v elektronických databázích nebo z parciálních psích sekvencí získaných během řešení disertační práce. Výběr primerů byl prováděn pomocí software Oligo Ver 4.0, přičemž byla zohledňována teplota tání (Tm) vypočtená metodou termodynamických parametrů nejbližších sousedů při koncentraci templátu 250 pM a iontů 50 μM (Rychlik et al., 1990), délka primeru, obsah G+C, stabilita na 3´- konci, vnitřní a vzájemná komplementarita, unikátnost sekvence na 3´ konci a vnitřní energetická stabilita. Přehled všech primerů úspěšně použitých pro analýzu genů USH1G a FSCN2 je uveden v Tab. 6 resp. Tab. 7.
38
4. 3. 2. Složení reakční směsi pro PCR Pro PCR byla optimalizována tři různá složení reakčních směsí označovaná MM 1 – MM 3 (Tab. 8). PCR byly prováděny v celkovém reakčním objemu 25 μl s přibližně 100 ng templátové DNA. V kapitole Výsledky a diskuse nebude již složení reakčních směsí pro příslušné PCR konkrétně uváděno. Reakční směsi byly míchány na ledu a po přidání k templátové DNA byly vzorky umístěny do předehřátého cykleru (95 °C). Pro přípravu reakčních směsí byly použity následující chemikálie: LA DNA Polymerases Mix (5U / μl) - Top-Bio s.r.o., Praha, Česká republika 10x LA PCR buffer (500 mM Tris-HCl, pH 9,3, 150 mM (NH4)2SO4, 22,5 mM MgCl2, 1% Tween 20) - Top-Bio s.r.o., Praha, Česká republika DMSO - Top-Bio s.r.o., Praha, Česká republika dNTP mix – MBI Fermentas, Vilnius, Litva primery – InvitrogenTM, Carlsbad, California, USA 4. 3. 3. Teplotní a časový průběh PCR Teplotní a časový profil jednotlivých PCR je uveden v Tab. 9. PCR probíhaly na termálním cykleru PTC-100TM (MJ Research, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Kontrola kvality PCR-produktů byla prováděna po elektroforéze na 1-1,5% agarósovém gelu (Agarose Serva for DNA Electrophoresis; Serva Electrophoresis GMBH, Heidelberg, Německo) při napětí 20 V/cm po dobu 20 - 30 min
v 1x TAE pufru
(InvitrogenTM, Carlsbad, California, USA). Velikost PCR-produktů byla odhadována porovnáním s markery Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder a Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas Vilnius, Litva). PCR – produkty byly barveny ethidium bromidem (0,05 μg /ml gelu) a visualizovány pod UV-světlem.
Referenční sekvence H H C C C C C C
Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 2
Lokalizace
Sekvence
Délka
% G+C Tm (°C)
TGA CCC GGA CAA GTG TGA CAT CT 23 52,2 58,0 AGA GAG GCC AGG AAG GTC TCC A 22 59,1 58,0 GCT GGA CGT GAG GCT GGA GAA G 22 63,6 59,8 CTC CGA CGC GCT CAG CTT CT 20 65,0 59,3 GCC TGA GTC GGT GCT GAC CTC 21 66,7 58,4 CGA CGA CAG CCT GGG CAG TG 20 70,0 61,1 GTA GCG CAC GCA CTC CAT GTG 21 61,9 58,8 TTC CAA CGG CCA CCT GCA CT 20 60,0 59,9 Pozn.: H – lidská sekvence (EMBL/GenBank NM_173477 a NT_010641); C- psí sekvence (EMBL/GenBank AJ876618); Tm – teplota tání primeru byla počítána metodou termodynamických parametrů nejbližších sousedů při koncentraci templátu 250 pM a iontů 50 μM
SN2A SN2B SN4B SN5A SN5B SN1F SN1R SN6A
Primer
Tab. 6. Přehled primerů použitých pro strukturní analýzu genu USH1G
Stabilita 3´-konce - 6,6 - 8,2 - 6,7 - 6,7 - 7,6 - 6,7 - 6,6 - 7,9 39
Referenční sekvence H H C1 C1 C1 C4 C4 C1 C1 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C3
Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 3 Exon 4 Exon 4 Exon 5 Exon 1 Exon 1 Intron 1
Lokalizace
Sekvence
Délka
% G+C Tm (°C)
GAT CCA GTT TGG CCT CGT CAA C 22 54,5 57,2 GCA CAG AGA CGT AGC GGT GGT T 22 59,1 58,0 ACG CGC TCA TCA CCC TCA TCT T 22 54,5 59,6 CAG TCC TTG AAG GCC AGC TTG C 22 59,1 59,9 GAC AGG TAG CGG CCC AGG TG 20 70,0 59,0 CCA GCC TCA AGA GGA AGC AGA TGT 24 54,2 59,8 GCC TTG AAC TCG AGC GTG TAG CA 23 56,5 60,4 CCA CCT GGG CCG CTA CCT GT 20 70,0 60,7 CCG CCA TCT CGT CCT CCT GTG 21 66,7 61,3 GAT CCA GTT CGG CCT CGT CAA C 22 59,1 59,4 CTT GCC GCA CCG ACA CGT AG 20 65,0 58,8 GTC AGC CAA CCA GGA CGA AGA G 22 59,1 57,5 GCA CAC GTA GCG CCC GTT AC 20 65,0 57,9 CTC TGC CAA CAC CAT GTT TGA GG 23 52,2 58,2 CCG TCG CTG AAG CTC AGG TG 20 65,0 58,1 GCT CAT CAA CCG GCC CAT C 19 63,2 57,4 CCC CGG AAC TCG AAT AGG AAG T 23 54,5 57,3 GCC TGC TAC ACG CTC GAG TTC A 22 59,1 59,2 GGG CAA CCA GGG TCC AGT AGC 21 66,7 59,3 GGG TCT CTG CCT CTC TCC ATG TCT 24 58,3 58,8 Pozn.: H – lidská sekvence (EMBL/GenBank NT_024781, AF066062, AF066063, AF066064 a AF066065); C1- psí sekvence (EMBL/GenBank AM050719); C2- predikovaná sekvence mRNA psího genu FSCN2 (EMBL/GenBank XM_540481); C3- psí sekvence (EMBL/GenBank AM050720); C4 – částečná sekvence PCR – produktu amplifikovaného primery FS1A a FS1B; Tm – teplota tání primeru byla počítána metodou termodynamických parametrů nejbližších sousedů při koncentraci templátu 250 pM a iontů 50 μM
FS1A FS1B FS8A FS8B FS1R FS9A FS9B FS10A FS10B FS11A FS11B FS12A FS12B FS13A FS13B FS14A FS14B FS15A FS15B FS16B
Primer
Tab. 7. Přehled primerů použitých pro strukturní analýzu genu FSCN2 Stabilita 3´-konce - 6,7 - 8,2 - 6,6 - 8,5 - 7,9 - 6,3 - 7,6 - 7,9 - 6,7 - 6,7 -7,5 - 6,7 -5,5 - 8,2 -7,9 - 8,1 -6,4 - 6,7 - 7,0 - 6,4
40
1x 1x 1x
800 800 800
dNTP mix (mM) 3 3 3
DMSO (%)
Primery – Polymeráza (U) každý (pmol) 5 1 5 1,5 3 1
Úvodní denaturace t T (°C) 95 2´ 95 2´ 95 2´ 95 2´ 95 2´ 95 2´ 95 2´ 95 2´ 95 2´ 95 2´
Pozn.: T – teplota, t- čas
PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4 PCR 5 PCR 6 PCR 7 PCR 8 PCR 9 PCR 10
Označení
Denaturace t T (°C) 95 20´´ 95 30´´ 95 20´´ 95 20´´ 95 20´´ 95 20´´ 95 20´´ 95 30´´ 95 20´´ 95 20´´
Annealing t T (°C) 58 30´´ 60 30´´ 58 30´´ 60 30´´ 59 30´´ 60 30´´ 62 30´´ 66 30´´ 60 30´´ 61 30´´
Tab. 9. Přehled teplotních a časových profilů použitých pro jednotlivé PCR
MM 1 MM 2 MM 3
pufr
Tab. 8. Složení reakčních směsí pro PCR
Elongace t T (°C) 68 1´ 10´´ 68 2´ 68 50´´ 68 50´´ 68 30´ 68 30´´ 68 30´´ 68 2´ 68 1´ 10´´ 68 30´´
Závěrečná elongace t T (°C) 68 7´ 68 7´ 68 7´ 68 7´ 68 7´ 68 7´ 68 7´ 68 7´ 68 7´ 68 7´
Počet cyklů 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
41
42
4. 4. Sekvenování Určení sekvence analyzovaných genů a vyhledávání polymorfismů bylo prováděno přímým sekvenováním PCR – produktů pomocí Sangerovy terminační (dideoxidové) metody. Protože byl téměř celý postup prováděn pomocí komerčně dodávaných kitů a v plném souladu s doporučením jejich výrobců, bude metodika uvedena pouze přehledně. Sekvenování bylo prováděno na automatických sekvenátorech ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer nebo ABI PRISM® 3100 – Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Přečištění PCR-produktů bylo po jejich vizuelní kontrole na agarósovém gelu prováděno pomocí MinElute™ PCR Purification Kitu (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Následně byla provedena kvantifikace produktu na základě srovnání s markerem Gene Ruler™ 50bp DNA Ladder (MBI Fermentas, Vilnius, Litva). K přípravě sekvenační směsi byl používán Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvenační reakce probíhala na teplotním cykleru GeneAmp®PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Teplotní a časový profil reakce byl následující: 96 °C/1 min. a 25 cyklů - 96 °C/10 s, 50 °C/5 s, 60 °C/4 min.. K přečištění sekvenační směsi byl použit DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) a následně byly vzorky precipitovány etanolem: 1) smíchat 20 μl sekvenační směsi, 16 μl vody pro PCR a 64 μl 96% etanolu, směs vortexovat a nechat stát 15 min. při pokojové teplotě, poté centrifugovat 20 min./13 000 rpm a ihned odebrat supernatant 2) přidat
k peletě
250
μl
70%
etanolu,
vortexovat
a
centrifugovat
20 min./13 000 rpm, ihned odebrat supernatant 3) vzorky vysušit ve vakuové centrifuze při pokojové teplotě (cca 10 min.) a resuspendovat v 20 μl formamidu (Hi-Di Formamide; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 4) denaturovat 2 min. při 95 °C a poté zchladit na ledu minimálně po dobu 5 min..
43
4. 5. Analýza sekvenačních dat Surová sekvenační data byla vyhodnocována použitím Sequencing Analysis Software v3.7, který je součástí softwarového vybavení dodávaného výrobcem automatického sekvenátoru (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). K vyhledávání homologních sekvencí v databázích posloužil Basic Local Alingment Search Tool – BLAST (National Center for Biotechnology Information, 2005a). Nukleotidové nebo aminokyselinové sekvence byly vzájemně porovnávány v software ClustalW (European Bioinformatics Institute, 2005). Restrikční analýza sekvencí byla prováděna on-line pomocí software Webcutter 2.0 (Heiman, 1997). 4. 6. Detekce polymorfismu DNA - polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Pokud to bylo možné, byly pro rutinní genotypování nalezených polymorfismů optimalizovány metodiky založené na polymorfismu délky restrikčních fragmentů. Podmínky, které byly použity při štěpení PCR produktů restrikčnímy enzymy, jsou uvedeny v tabulce 10. Pro přípravu restrikční směsi bylo vždy použito standardních pufrů dodávaných výrobci endonukleáz: MBI Fermentas, Vilnius, Litva (MnlI, MvaI, PstI, Eco52I) a NEW ENGLAND BioLabs® Inc., Ipswitch, USA (EagI). Štěpené PCR-produkty byly elektroforeticky separovány na agarósovém gelu, který byl připravován v koncentraci 3,5 – 4% z Agarose Serva for DNA Electrophoresis (Serva Electrophoresis GMBH, Heidelberg, Německo) nebo Agarose 3:1 (Amresco Inc., Solon, Ohio, USA). Elektroforéza probíhala při napětí 20 – 25 V/cm po dobu 15 – 25 min v 1x TAE pufru (InvitrogenTM, Carlsbad, California, USA). Pro ověření velikosti fragmentů bylo využito jejich srovnání s markerem Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder (MBI Fermentas, Vilnius, Litva). Fragmenty byly barveny ethidium bromidem (0,05 μg/ml gelu) a visualizovány pod UV-světlem.
44
Tab. 10. Štěpení restrikčními endonukleásami - složení reakčních směsí a podmínky inkubace Gen USH1G
Gen FSCN2
Polymorfní místo
C189T
G237A
A525G
A1071G
Restrikční endonukleása
MnlI
PstI
EagI, Eco52I
MvaI
PCR – produkt (μl)
5
10
10
10
H2O (μl)
8,4
3,1
7,5
3,2
pufr (μl)
1,5
1,5
2
1,5
restr. endonukleása 10 U/μl (μl)
0,1
0,4
0,5
0,3
T (°C)
37
37
37
37
t (hod.)
12
12
12
12
Složení reakční směsi
Inkubace
4. 7. Radiační hybridní mapování Radiační hybridní mapování studovaných markerů probíhalo ve spolupráci s Dr. Catherine André, UMR 6061 CNRS, Génétique et Développement, Faculté de Médecine, Rennes Cédex, Francie. Na uvedeném pracovišti bylo prováděno jak laboratorní testování markerů, tak následné statistické vyhodnocení. Pro amplifikaci markerů bylo použito následujících primerů: 1) gen USH1G (referenční sekvence EMBL/GenBank AJ876618): USH1G-2L: 5’ TAA TTT GTT CAT CCC CAA CTC TG 3’ USH1G-2R: 5’ GGA GGG ACT CAG TAA GAG GAC AT 3’ 2) gen FSCN2 (referenční sekvence EMBL/GenBank AM050719): FSCN2-4L: 5’ GAT GTT CAG ATG TTG CCT TGG 3’ FSCN2-4R: 5’ AGT GAG TGC AGC AGG AAG AAG 3’ S použitím výše popsaných primerů byly získány specifické PCR – produkty, které byly detekovány v 118 liniích radiačního hybridního panelu RHDF5000-2 (Vignaux et al., 1999b). Získaná data byla vyhodnocena dvoubodovou analýzou ze softwarového balíčku Multimap (Matise et al., 1994) a pomocí Dog Map RH serveru (Hitte et al., 2004) byla včleněna do 3270-markerové radiační hybridní mapy psího genomu (Guyon et al., 2003).
45
5. VÝSLEDKY A DISKUSE 5. 1. Gen Usher syndromu typu 1 G (USH1G) 5. 1. 1. Strukturní analýza, detekce polymorfismu a mapování genu 5. 1. 1. 1. Strukturní analýza a detekce polymorfismu Primery SN2A a SN2B pro amplifikaci (Tab. 8 a 9; reakční směs MM 1, PCR profil - PCR 9) části exonu 2 psího genu USH1G byly navrženy podle lidské cDNA sekvence, která byla srovnána s lidskou genomickou sekvencí (Tab. 6). Identita amplifikovaného fragmentu o délce 1017 bp byla ověřena jeho přímým sekvenováním. V počátečním období experimentální práce, kdy bylo sekvenování prováděno na ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), nebylo možno jednorázově získat celou sekvenci amplikonu, a proto byly na základě prvotní neúplné sekvence navrženy další primery (Tab. 6, 8 a 9; SN5A a SN5B, MM 1, PCR 4), pomocí kterých byla sekvenována střední část původního PCR-produktu. K získání sekvence jeho konce resp. počátku byly navrženy primery SN1F a SN1R (Tab. 6). Úplná získaná sekvence (bez primerů SN2A a SN2B) byla uložena v databázi EMBL/GenBank (AJ876618). Porovnáním částečné sekvence exonu 2 s odpovídajícími částmi lidského a myšího genu (EMBL/GenBank NM_173477 resp. NM_176847) byla zjištěna shoda 93% resp. 91% (Obr. 4). Vedle ostatních diferencí chybí v sekvenci psího genu ve srovnání s myším a lidským protějškem 12 nukleotidů. Uvedená delece způsobuje absenci 4 aminokyselin v sekvenci psího proteinu (Obr. 5). Částečná odvozená aminokyselinová psí sekvence (EMBL/GenBank CAI45892) vykazuje v porovnání s lidským či myším proteinem (EMBL/GenBank NP_775748 resp. NP_789817) identitu shodně 95%. Porovnáním částečných sekvencí exonu 2 u plemen anglický kokršpaněl, americký kokršpaněl
a
pudl
byl
nalezen
substituční
polymorfismus
C189T.
Uvedený
polymorfismus ruší restrikční místo pro endonukleásu MnlI a způsobuje záměnu Leu → Phe v pozici 63 odvozeného psího proteinu. Pro amplifikaci fragmentu zahrnujícího polymorfní místo byly navrženy primery SN6A a SN4B (Tab. 6). PCR-produkt (Tab. 6, 8 a 9; MM 1, PCR 10) o délce 334 bp je enzymem MnlI štěpen na fragmenty (Obr. 6): alela C- 170 + 132 + 30 + 2 bp alela T- 200 + 132 + 2 bp
46
V polymorfním místě C189T byla u plemen pudl a americký kokršpaněl zjištěna vyšší frekvence alely T, naopak u anglických kokršpanělů byla častěji zastoupena alela C (Tab. 11). V lidském proteinu SANS byly identifikovány 3 ankyrinové domény, sterilní alfa motiv (SAM doména) a PDZ1 – vázající motiv (Weil et al., 2003). Ankyrinové domény jsou zodpovědné za vzájemné interakce mezi různými proteiny (Sedgwick et Smerdon, 1999). Porovnáním uvedených částí lidského proteinu s predikovanou aminokyselinovou sekvencí (EMBL/GenBank CAI45892) jsme schopni odhadnout lokalizaci těchto oblastí v psím proteinu. Z Obr. 5 je zřejmé, že se podařilo získat sekvence dvou ankyrinových domén (bez jedné aminokyseliny) a začátek SAM domény (7 z celkem 63 aminokyselin). Zároveň můžeme zjistit, že záměna Leu → Phe v pozici 63, která je zapříčiněná polymorfismem C189T, pravděpodobně spadá do konce třetí ankyrinové domény. U obou druhů savců, u kterých byla dosud popsána aminokyselinová struktura SANS proteinu, tedy jmenovitě u Homo sapiens (International Human Genome Sequencing Consortium, 2003) a Mus musculus (Kikkawa et al., 2003), se v tomto místě nachází aminokyselina leucin. Skutečnost, že je daná aminokyselina evolučně konzervována, by mohla napovídat o jejím významu pro správnou strukturu a funkci molekuly SANS proteinu. V případě popsané substituce leucinu za fenylalanin se však jedná o tzv. konzervativní záměnu aminokyselin, kdy je závažný dopad na strukturu a funkci výsledného proteinu nepravděpodobný.
47
Obr. 4. Srovnání částečné sekvence exonu 2 genu USH1G u psů (EMBL/GenBank AJ876618)
s odpovídajícími
úseky
lidského
a
myšího
genu
(EMBL/GenBank
NM_173477 resp. NM_176847) pes člověk myš
GGGGCAACACGCCCCTGCACCTGGCAGCTTCCAACGGCCACCTGCACTGCCTGTCCTTCC 60 GGGGCAACACACCCCTGCATCTGGCAGCTTCCAATGGCCACTTGCACTGCCTGTCCTTCC 60 GGGGAAACACACCCTTGCATCTGGCAGCTTCCAATGGTCACCTGCACTGCCTGTCCTTCC 60 **** ***** *** **** ************** ** *** ******************
pes člověk myš
TGGTGTCCTTCGGGGCCAACATCTGGTGCCTGGACAACGACTACCACACGCCGCTGGACA 120 TGGTGTCCTTCGGAGCCAACATCTGGTGCCTAGACAACGACTACCACACGCCGCTGGACA 120 TCGTCTCCTTCGGGGCCAACATCTGGTGCCTGGACAATGACTACCACACGCCACTGGACA 120 * ** ******** ***************** ***** ************** *******
pes člověk myš
TGGCCGCGATGAAGGGCCACATGGAGTGCGTGCGCTACCTGGACTCCATCGCCGCCAAGC 180 TGGCTGCCATGAAGGGCCACATGGAATGCGTGCGCTACCTGGACTCCATCGCGGCCAAGC 180 TGGCCGCTATGAAGGGCCACATGGAGTGCGTACGCTATCTGGATTCCATCGCGGCCAAGC 180 **** ** ***************** ***** ***** ***** ******** *******
pes člověk myš
AGAGCAGCCTCAACCCCAAGCTGGTGGGCAAGCTGAAGGACAAGGCCTTCCGCGAGGCCG 240 AGAGCAGCCTCAACCCCAAGCTGGTGGGTAAGCTGAAGGACAAGGCCTTCCGCGAGGCGG 240 AGAGCAGCCTCAACCCCAAGCTGGTGGGCAAGCTGAAGGACAAGGCCTTCCGCGAGGCAG 240 **************************** ***************************** *
pes člověk myš
AGCGGCGCATCCGCGAGTGCGCCAAGATGCAGCGCAAGCACCACGAGCGCATGGAGCGGC 300 AGCGGCGCATCCGCGAGTGCGCCAAGCTGCAGCGGAGGCACCACGAACGCATGGAGCGGC 300 AGCGGCGCATCCGCGAGTGCGCCAAGATGCAGCGCAAGCACCACGAGCGCATGGAGCGGC 300 ************************** ******* * ********* *************
pes člověk myš
GCTACCGCCGCGAGCGGGCCGAGCGCTCCGACGCGCTCAGCTTCTCCAGCCTCACGTCCA 360 GATACCGGCGCGAGCTGGCCGAGCGTTCCGACACCCTCAGCTTCTCCAGCCTCACGTCCA 360 GCTACCGGCGCGAGCTGGCCGAGCGCTCCGACACTCTCAGCTTCTCCAGCCTCACGTCCA 360 * ***** ******* ********* ****** * *************************
pes člověk myš
GCACCCTGAGCCGCCGGCTGCAGCACCTGGCGCTGGGCAGCCAGCTGCCCTACTCGCAGG 420 GCACCCTGAGCCGCCGGCTGCAGCATCTGGCGCTGGGCAGCCACCTGCCGTACTCTCAGG 420 GCACCCTGAGCCGACGGCTGCAGCACATGACGCTGGGCAGCCAGCTGCCCTACTCGCAGG 420 ************* *********** ** ************* ***** ***** ****
pes člověk myš
CCACGCTGCACGGCACGGCCAGGGGCAAGGGCAAGATCCAGCGGAAGCTGGAGCGGCGCA 480 CCACGCTGCACGGCACGGCCAGGGGCAAGACCAAGATGCAGAAGAAGCTGGAGCGGCGCA 480 CCACGCTGCACGGTACGGCCAAGGGCAAGGCCAAGATCCAGAAGAAGCTGGAGAGGCGCA 480 ************* ******* ******* ****** *** ********** ******
pes člověk myš
AGCAGGGCGGCGAGGGCACCTTCAAGATCTCCGAGGACGGCCGCAAGAGCGTGCGCTCGC 540 AGCAGGGCGGCGAAGGCACCTTCAAGGTCTCCGAGGATGGGCGCAAGAGCGCCCGCTCGC 540 AGCAGGGGGGCGAGGGCACCTTCAAGGTCTCTGAGGACGGGCGCAAAAGCGTCCGATCGC 540 ******* ***** ************ **** ***** ** ***** **** ** ****
pes člověk myš
TCTCGGGCCTGCAGCTGGGCAGCGACGTGATGTTCGTGCGCCAGGGCACCTACGCCAACC 600 TCTCGGGCCTGCAGCTGGGCAGCGACGTGATGTTCGTGCGCCAGGGCACCTACGCCAATC 600 TCTCCGGCCTGCAGTTGGGTAGTGATGTGATGTTTGTGCGCCAGGGCACCTACGCCAACC 600 **** ********* **** ** ** ******** *********************** *
pes člověk myš
CCAAGGAGTGGGGCCGCTCCCCGCTCCGGGACATGTTCCTCTCGGATGAGGACAGCGTCT 660 CCAAGGAGTGGGGCCGAGCCCCGCTCCGGGACATGTTCCTCTCGGACGAGGACAGCGTCT 660 CCAAGGAGTGGGGCCGTGCCCCACTCAGGGACATGTTCCTCTCGGACGAGGACAGCGTCT 660 **************** **** *** ******************* *************
pes člověk myš
CCCGTGCCACGCTGGCGGCCGAGCCTGCCCACTCGGAGGTCAGCACCGACTCAGGCCACG 720 CCCGTGCCACGCTGGCGGCCGAGCCTGCCCACTCGGAGGTCAGCACCGACTCAGGCCACG 720 CCCGTGCCACACTGGCTGCCGAGCCTGCTCACTCGGAGGTCAGCACCGACTCAGGCCACG 720 ********** ***** *********** *******************************
(pokračování na následující straně)
48
pes člověk myš
ACTCCCTGTTTACCCGCCCGGGCCTGGGCACCATGGTGTTCCGCAGGAACTACCTGAGCA 780 ACTCCCTGTTTACCCGCCCCGGCCTGGGCACCATGGTGTTCCGCAGAAATTACTTGAGCA 780 ACTCTTTGTTTACCCGCCCCGGCCTGGGTACCATGGTGTTTCGAAGGAACTATGTGAGCA 780 **** ************* ******** *********** ** ** ** ** ******
pes člověk myš
GCGGGCTGCACGGGCTGGGCCGCGAGGACGCCGA------------GGGCGCCCCGCGAG 828 GTGGGCTGCACGGACTGGGCCGCGAGGATGGGGGTCTGGATGGGGTGGGAGCGCCGCGGG 840 GCGGGTTGCACGGGCTGGGCCGAGAGGACGGGGGTTTGGATGGGGCAGGCACGCCGCGGG 840 * *** ******* ******** ***** * * ** * ***** *
pes člověk myš
GCCGGCTGCAGAGCTCCCCCAGCCTGGACGACGACAGCCTGGGCAGTGCCAACAGCCTGC 888 GTCGGCTGCAGAGCTCCCCCAGCCTGGACGATGACAGCCTGGGCAGTGCCAACAGCCTGC 900 GTCGGCTGCATAGTTCCCCCAGCCTGGACGACGACAGCCTAGGCAGTGCCAACAGCTTGC 900 * ******** ** ***************** ******** *************** ***
pes člověk myš
AGGACCGCAGCTGCGGGGAGGAGCTGCCCTGGGACGAGCTGGACTTGGGCCTGGATGAGG 948 AGGACCGCAGCTGTGGGGAGGAGCTGCCCTGGGATGAGCTCGATTTAGGCTTGGACGAGG 960 AGGACCGCAGTTGCGGGGAAGAGCTGCCCTGGGATGAGCTAGACTTGGGCTTGGATGAGG 960 ********** ** ***** ************** ***** ** ** *** **** ****
pes člověk myš
ACCTGGAGCCCGAGACCAGCCCCC 972 ACCTGGAGCCCGAGACTAGCCCGC 984 ACCTGGAGCCCGAGACCAGCCCCT 984 **************** *****
49
Obr. 5. Srovnání částečné odvozené sekvence proteinu SANS u psů (EMBL/GenBank CAI45892) s odpovídajícími úseky lidského a myšího proteinu (EMBL/GenBank NP_775748 resp. NP_789817) pes člověk myš
GNTPLHLAASNGHLHCLSFLVSFGANIWCLDNDYHTPLDMAAMKGHMECVRYLDSIAAKQ 60 GNTPLHLAASNGHLHCLSFLVSFGANIWCLDNDYHTPLDMAAMKGHMECVRYLDSIAAKQ 60 GNTPLHLAASNGHLHCLSFLVSFGANIWCLDNDYHTPLDMAAMKGHMECVRYLDSIAAKQ 60 ************************************************************
pes člověk myš
SSFNPKLVGKLKDKAFREAERRIRECAKMQRKHHERMERRYRRERAERSDALSFSSLTSS 120 SSLNPKLVGKLKDKAFREAERRIRECAKLQRRHHERMERRYRRELAERSDTLSFSSLTSS 120 SSLNPKLVGKLKDKAFREAERRIRECAKMQRKHHERMERRYRRELAERSDTLSFSSLTSS 120 **:*************************:**:************ *****:*********
pes člověk myš
TLSRRLQHLALGSQLPYSQATLHGTARGKGKIQRKLERRKQGGEGTFKISEDGRKSVRSL 180 TLSRRLQHLALGSHLPYSQATLHGTARGKTKMQKKLERRKQGGEGTFKVSEDGRKSARSL 180 TLSRRLQHMTLGSQLPYSQATLHGTAKGKAKIQKKLERRKQGGEGTFKVSEDGRKSVRSL 180 ********::***:************:** *:*:**************:*******.***
pes člověk myš
SGLQLGSDVMFVRQGTYANPKEWGRSPLRDMFLSDEDSVSRATLAAEPAHSEVSTDSGHD 240 SGLQLGSDVMFVRQGTYANPKEWGRAPLRDMFLSDEDSVSRATLAAEPAHSEVSTDSGHD 240 SGLQLGSDVMFVRQGTYANPKEWGRAPLRDMFLSDEDSVSRATLAAEPAHSEVSTDSGHD 240 *************************:**********************************
pes člověk myš
SLFTRPGLGTMVFRRNYLSSGLHGLGRED----AEGAPRGRLQSSPSLDDDSLGSANSLQ 296 SLFTRPGLGTMVFRRNYLSSGLHGLGREDGGLDGVGAPRGRLQSSPSLDDDSLGSANSLQ 300 SLFTRPGLGTMVFRRNYVSSGLHGLGREDGGLDGAGTPRGRLHSSPSLDDDSLGSANSLQ 300 *****************:*********** . *:*****:*****************
pes člověk myš
DRSCGEELPWDELDLGLDEDLEPETSP 323 DRSCGEELPWDELDLGLDEDLEPETSP 327 DRSCGEELPWDELDLGLDEDLEPETSP 327 ***************************
Pozn.: červené a zelené písmo – druhá a třetí ankyrinová doména v lidské sekvenci; modré písmo – počátek SAM domény v lidské sekvenci; žluté zvýraznění – pozice 63 predikované sekvence psího SANS proteinu (EMBL/GenBank CAI45892), ve které dochází k záměně Leu → Phe způsobené polymorfismem C189T
Obr. 6. Polymorfismus C189T genu USH1G u psů na 3,5% agarósovém gelu po štěpení restrikční endonukleásou MnlI. M - Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder (MBI Fermentas Vilnius, Litva); PCR – neštěpený PCR-produkt; TT, TC, CC – jednotlivé genotypy. M
PCR
TT
TC
CC
M
200 bp 170 bp 132 bp
50
Tab. 11. Frekvence genotypů a alel v polymorfním místě C189T genu USH1G u sledovaných plemen psů Frekvence genotypů
Frekvence alel
Plemeno
n
TT
TC
CC
T
C
pudl
10
0,800
0,200
0
0,900 ± 0,067
0,100 ± 0,067
amer. kokršpaněl
6
0,500
0,330
0,170
0,665 ± 0,136
0,335 ± 0,136
angl. kokršpaněl
7
0,143
0,000
0,857
0,143 ± 0,094
0,857± 0,094
5. 1. 1. 2. Mapování genu USH1G Chromosomální lokalizaci genu USH1G provedla Dr. Catherine André (UMR 6061 CNRS, Génétique et Développement, Faculté de Médecine, Université de Rennes 1, Francie) metodou radiačního hybridního mapování. Retenční frekvence markeru USH1G v radiačně hybridním panelu byla 78,8%. Gen USH1G byl zmapován do centromerické oblasti chromosomu 9, přičemž nejbližšími identifikovanými markery jsou GALK1 (LOD=12,91) a SRP68 (LOD=9,18) ve vzdálenosti 23 resp. 39 cR. Jednotka 1 cR odpovídá přibližně 100 kb. Stanovené pořadí genů vzhledem k centromeře je tedy následující: [cen – SRP68 – GALK1 – USH1G] Identifikovaná vzájemná pozice těchto genů u psa je v souladu s jejich známým pořadím u člověka (National Center for Biotechnology Information, 2005b), což potvrzuje vysokou homologii mezi oblastí HSA17q25 a centromerickou částí CFA9 (Werner et al., 1997; Acland et al., 1998).
51
5. 1. 2. Hodnocení asociací mezi genem USH1G a progresivní degenerací tyčinek a čípků (prcd) Na základě genotypů detekovaných u jedinců ve sledovaném souboru zvířat (Tab. 12) je možno polymorfismus C189T vyloučit jako příčinnou mutaci pro prcd u plemen pudl, americký a anglický kokršpaněl, neboť sestava genotypů zjištěná postižených a zdravých zvířat neodpovídá známému autosomálně recesivnímu způsobu dědičnosti tohoto onemocnění (Petersen – Jones, 1998). Protože však nebyl proveden screening polymorfismu v celém rozsahu kódujících částí genu USH1G ani v jeho regulačních sekvencích, není možné na podkladě výše uvedeného vyloučit existenci kausální mutace v některé z těchto oblastí. Zjištění, že alely polymorfismu C189T nejsou ve vazbové nerovnováze s klinickým stavem prcd, nám nedovoluje odmítnout jako příčinný samotný gen USH1G. Prvním důvodem je, že polymorfismus C189T mohl vzniknout časově nezávisle na příčinné mutaci či od ní mohl být později separován crossing – overem. Druhým pak skutečnost, že analýza nebyla prováděna v rodinách, ale v souborech nepříbuzných jedinců, u kterých se může vyskytovat odlišná vazbová fáze mezi alelami obou případných mutací. Výsledky mapování neumožňují jednoznačně vyloučit gen USH1G z příčinné souvislosti s prcd, protože byl pomocí radiačního hybridního mapování lokalizován do chromosomálního regionu zahrnujícího prcd lokus (Acland et al., 1998; Sidjanin et al., 2003). Protože je však tato oblast blízko genu TK, který byl použit jako selekční marker při konstrukci RH-panelu (Vignaux et al., 1999b), je obtížné jednoznačně stanovit pořádek genů v této oblasti pouze na základě RH-mapování (Sidjanin et al., 2003). Proto bude nezbytné k potvrzení lokalizace genu USH1G využít některou z dalších metod mapování.
52
Tab. 12. Genotypy v polymorfním místě C189T genu USH1G detekované u klinicky pozitivních a negativních jedinců ve sledované populaci
Pudl Kategorie poz/neg poz
neg
Amer. kokršpaněl
Angl. kokršpaněl
n 1 8
Genotyp CT CC
n 1 1
Genotyp TT CT
n 2
Genotyp CC
1
CT
2 1 1
TT CT CC
1 4
TT CC
53
5. 2. Gen retinálního fascinu 2 (FSCN2) 5. 2. 1. Strukturní analýza, detekce polymorfismu a mapování genu 5. 2. 1. 1. Strukturní analýza a detekce polymorfismu První pár primerů FS1A/FS1B pro amplifikaci části exonu 1 genu FSCN2 byl navržen na základě znalosti sekvence lidského orthologního genu a jeho exon-intronové organizace (Tab. 7). Amplifikovaný fragment o délce 789 bp (Tab. 8 a 9; MM 2, PCR 1) byl podroben přímé sekvenaci. Účinnost PCR byla velice nízká a pro získání adekvátního množství PCR-produktu nedostatečná. Proto musel být objem PCR-produktu používaného k přípravě templátu pro sekvenační reakci zvýšen na 40 μl (běžně pouze 20 μl). I přes popsané opatření se však podařilo získat kvalitní a hodnověrnou sekvenci pouze u některých z analyzovaných vzorků. Proto byly ze získané sekvence navrženy primery FS9A a FS9B (Tab. 7), pomocí nichž (Tab. 8 a 9; MM 1, PCR 3) byl získán PCR-produkt délky 535 bp zahrnující část exonu 1. Jeho identita byla ověřena přímou sekvenací a srovnáním s lidským homologním genem (EMBL/GenBank AF066062). K osekvenování počátku a konce uvedeného fragmentu byly navrženy primery FS1R resp. FS8A (Tab. 7). Ve snaze získat amplikony pokrývající exony 2 – 5 spolu s vmezeřenými introny byly navrženy další primery podle lidské sekvence genu, avšak žádný odpovídající PCR – produkt nebyl získán. V průběhu
řešení
experimentální
práce
byla
v databázi
EMBL/GenBank
zpřístupněna predikovaná sekvence mRNA psího genu FSCN2 (EMBL/GenBank XM_540481), která byla získána analýzou dat získaných v rámci projektu sekvenace psího genomu. Z uvedené sekvence byly navrženy následující páry primerů (Tab. 7): 1) FS11A a FS11B, MM 1 a PCR 9 (Tab. 7- 9), amplikon délky 794 bp (část exonu 1) 2) FS12A a FS12B, MM 1 a PCR 4 (Tab. 7- 9), amplikon délky 465 bp (části exonů 2 a 3, vmezeřený intron) 3) FS13A a FS13B, MM 1 a PCR 4 (Tab. 7- 9), amplikon délky 551 bp (části exonů 3 a 4, vmezeřený intron) 4) FS14A a FS14B, MM 1 a PCR 6 (Tab. 7- 9), amplikon délky 309 bp (části exonů 4 a 5, vmezeřený intron)
54
Primery byly navrženy tak, aby se PCR-produkty vzájemně „překrývaly“ a pokrývaly exony 2 – 5 spolu se všemi vmezeřenýni introny. Identita amplikonů byla ověřena přímým sekvenováním. Pomocí primerů FS15A a FS15B (Tab. 7) byl získán PCR-produkt dlouhý ≈ 2600 bp (Tab. 8 a 9; MM1, PCR 2) zahrnující konec exonu 1, začátek exonu 2 a vmezeřený intron. Původně bylo plánováno přístupem „gene-walking“ postupně získat celou sekvenci uvedeného segmentu genu. V intronu 1 se však vyskytují repetitivní sekvence, které znemožnily dokončení tohoto záměru. S využitím přímého primeru FS15A a zpětného FS15B byla získána sekvence začátku (pouze cca 400 bp) a konce zmíněného PCRproduktu, která se stala podkladem pro navržení nového zpětného primeru FS16B (Tab. 7). Amplikon FS15A/FS16B (Tab. 8 a 9; MM 3, PCR 8; délka ≈ 2 000 bp) byl následně sekvenován při použití primeru FS16B. Sekvenční data byla analyzována, spojena a sekvence (bez primerů FS11A a FS14B) byly uloženy v databázi EMBL/GenBank. Sekvence AM050719 zahrnuje část exonu 1 a počátek intronu 1 a sekvence AM050720 konec intronu 1, celé exony 2, 3, a 4 a neúplný exon 5 včetně příslušných vmezeřených intronů. Při srovnání získaných dat se známými sekvencemi homologních genů u dalších druhů savců byla částečně identifikována exon-intronová organizace genu retinálního fascinu 2 u psů a odhadnuty délky některých jeho částí (Tab.13). Hranice všech popsaných intronů jsou plně v souladu s GT – AG pravidlem. Kódující sekvence genu vykazují shodu 89, 90 a 83% k odpovídajícím segmentům genu FSCN2 u člověka, skotu resp. myši (Obr. 7). Kódující část experimentálně získané sekvence psího genu FSCN2 se od predikované
sekvence
mRNA
(EMBL/GenBank
XM_540481)
lišila
pouze
v identifikovaných polymorfních místech (Obr. 8). Odvozená částečná sekvence psího retinálního fascinu je v porovnání s proteinem člověka, skotu a myši identická z 90, 93 resp. 89% (Obr. 9).
55
Tab. 13. Částečná exon-intronová organizace genu FSCN2 u psů Genový segment
Délka (bp)
Získaná sekvence
exon 1
755
neúplná (celkově cca 961 bp)
intron 1
1010
neúplná (celkově cca 2,3 kb)
exon 2
157
úplná
intron 2
239
úplná
exon 3
122
úplná
intron 3
278
úplná
exon 4
168
úplná
intron 4
75
úplná
exon 5
91
neúplná (celkově cca 255 bp)
V genu FSCN2 u psů byly srovnáním sekvencí (EMBL/GenBank AM050719 a AM050720) u plemen anglický kokršpaněl, americký kokršpaněl a pudl identifikovány následující tři substituční polymorfismy: G237A – tento polymorfismus je lokalizován v kódující části exonu 1 (EMBL/GenBank AM050719) a způsobuje změnu sekvence aminokyselin v odvozeném proteinu – Arg → Gln. Detekci této mutace lze provést pomocí RFLP, neboť zasahuje do restrikčního místa pro endonuklásu PstI. Amplikon o délce 299 bp (Tab. 7- 9; primery FS10A a FS10B, MM 1, PCR 7) je štěpen na fragmenty (Obr. 10): alela G – 299 bp (neštěpený PCR – produkt) alela A – 180 a 119 bp Vyšší frekvence alely G byla shodně detekována u plemen americký a anglický kokršpaněl. Naproti tomu u pudlů byla výrazně častěji zastoupena alela A (Tab. 14). A525G – tato nukleotidová substituce se nachází opět v kódující části exonu 1 (EMBL/GenBank AM050719). Jedná se o „missense“ mutaci zapříčiňující v odvozeném proteinu záměnu His → Arg. Skutečnost, že polymorfismus vytváří restrikční místo pro endonukleásu EagI (popř. Eco52I), umožňuje jeho testování pomocí RFLP. PCR –
56
produkt amplifikovaný primery FS8A a FS8B (Tab. 7) má délku 157 bp (Tab. 8 a 9; MM 1, PCR 5) je štěpen na následující fragmenty (Obr. 11): alela A– 157 bp (neštěpený PCR – produkt) alela G – 80 a 77 bp U anglických kokršpanělů byla zjištěna zřetelně vyšší frekvence alely A, která převažovala (i když méně výrazně) i u plemene pudl. U plemene americký kokršpaněl bylo zastoupení obou alel poměrně vyrovnané (Tab. 15). A1071G – polymorfismus byl identifikován v intronu 1 (EMBL/GenBank AM050720) a je detekovatelný pomocí RFLP. Restrikčním štěpením 465 bp dlouhého PCR – produktu (Tab. 7- 9; primery FS12A a FS12B, MM 1, PCR 4) endonukeásou MvaI získáme níže uvedené fragmenty (Obr. 12): alela A – 337, 96, 21 a 11 bp alela G – 242, 96, 95, 21 a 11 bp V populaci plemene pudl je početnější alela A, naopak u plemen anglický a americký kokršpaněl byla častěji pozorována alela G (Tab. 16). Pro úplnost je nezbytné uvést další pravděpodobný polymorfismus v intronu 1 – G441A (EMBL/GenBank AM050720). Tato mutace byla přímým sekvenováním dvou odlišných PCR-produktů (Tab. 7- 9; primery FS15A a FS15B, MM 1, PCR 2 resp. primery FS15A a FS16B, MM 3, PCR 8) identifikována v heterozygotní sestavě u jednoho jedince plemene americký kokršpaněl. Dle analýzy sekvence mění restrikční místo pro endonukleásu TspRI. Bohužel se však nepodařilo amplifikovat vhodný PCR- produkt, který by uvedené polymorfní místo zahrnoval. Pravděpodobným důvodem nezdaru je přítomnost repetitivních sekvencí v intronu 1. Saishin et al. (1997) identifikovali v bovinním retinálním fascinu tři konservované segmenty, které charakterizují rodinu fascinů (Obr 9). Vyslovili domněnku, že právě tyto úseky tvoří klíčové strukturní a funkční oblasti fascinových proteinů a jako takové si zasluhují zvláštní pozornost. „Missense“ mutace G237A a A525G identifikované v exonu 1 psího genu FSCN2 zapříčiňují záměnu aminokyselin mimo uvedené konservované segmenty. Z Obr. 9 je zřejmé, že obě substituce mají konservativní povahu, což znamená, že při nich dochází k náhradě aminokyselin s podobnými vlastnostmi.
57
Při vzájemném porovnání aminokyselinové sekvence retinálního fascinu psa a dalších druhů savců zjistíme, že u psa v obou místech alternují aminokyseliny, které se v příslušné pozici vyskytují i u ostatních druhů. Z výše uvedeného můžeme usoudit, že záměny aminokyselin v proteinu retinálního fascinu u psa, které jsou způsobené polymorfismy G237A a A525G, s největší pravděpodobností významně neovlivňují jeho strukturu a funkci.
58
Obr. 7. Srovnání částečné kódující sekvence genu FSCN2 u psa (EMBL/GenBank AM050719 a AM050720) s odpovídajícími úseky genu člověka, skotu a myši (EMBL/GenBank AF030165, NM_176633 resp. NM_172802) pes člověk skot myš
GACCGCCGAGAGCTTCGGCTTCAAGGTCAACGCCTCGGCGCCCAGCCTCAAGAGGAAGCA GACAGCTGAGAGCTTCGGCTTCAAGGTCAATGCCTCGGCACCCAGCCTCAAGAGGAAGCA GACGGCCGAGAGCTTTGGCTTCAAGGTCAATGCCTCAGCACCCAGCCTCAAGCGGAAGCA GACTGCAGAGAGCTTTGGCTTCAAGGTCAACGCCTCCGCAGCCAGCCTCAAGAGGAAGCA *** ** ******** ************** ***** ** *********** *******
60 60 60 60
pes člověk skot myš
GATGTGGGTGCTGGAGCCGGACCCGGGCCAGGGCAGCGCCGTGCTGCTCCGCAGCAGCCA GACCTGGGTGCTGGAACCCGACCCAGGACAAGGCACGGCTGTGCTGCTCCGCAGCAGCCA GATGTGGGTGCTGGAGCCGGACCCAGGGGAGGGCACTGCCGTGCTGTTTCGCAGCAGCCA GATCTGGGTCCTGGAGCCTGACCCGGGGCAGGGCACTGCCGTGCTGTTCCGAAGCAGTCA ** ***** ***** ** ***** ** * **** ** ****** * ** ***** **
120 120 120 120
pes člověk skot myš
CCTGGGCCGCTACCTGTCCGCCGAGGAGGACGGGCGCGTGGCCTGCGAGGCCGAGCGGCC CCTGGGCCGCTACCTGTCGGCAGAAGAGGACGGGCGCGTGGCCTGTGAGGCAGAGCAGCC CCTGGGCCGTTACCTGTCGGCCGAGGAGGACGGGCGTGTGGCCTGCGAGGCGGAGCGGCC CCTAGGCCGCTACCTGTCAGCAGAAGAAGATGGACGTGTGGCCTGTGAGATGGATCAGCC *** ***** ******** ** ** ** ** ** ** ******** *** ** * ***
180 180 180 180
pes člověk skot myš
GGGCCGCGACTGCCGCTTCCTGGTCCTGCCGCAGCCCGACGGGCGCTGGGTGCTGCAGTC GGGCCGTGACTGCCGCTTCCTGGTCCTGCCGCAGCCAGATGGGCGCTGGGTGCTGCGGTC GGGTCGTGACTGCCGCTTCCTGGTCCTGCCGCAGCCCGATGGGCGCTGGGTGCTGCAGTC GGGCCGTGACTGCCGCTTCCTGGTCTTGCCGCAGCCTGATGGGCGCTGGGTGCTGCAGTC *** ** ****************** ********** ** **************** ***
240 240 240 240
pes člověk skot myš
CGAGCCGCACGGCCGCTTCTTCGGCGGCACCGAGGACCGGCTGTCCTGCTTCGCCACGGC CGAGCCGCACGGCCGCTTCTTCGGAGGCACCGAGGACCAGCTGTCCTGCTTCGCCACAGC GGAACCGCACGGCCGCTTCTTTGGTGGCACCGAGGACCAGCTGTCCTGCTTCGCCACGGC AGAGCCACACGGCCGCTTCTTCGGTGGCATTGAGGACCGACTGTCCTGCTTTGCCACGGC ** ** ************** ** **** ******* *********** ***** **
300 300 300 300
pes člověk skot myš
CATCTCCCCGGCCGAGCTGTGGACCGTGCACCTGGCCATCCACCCGCAGGCGCACCTGCT CGTTTCCCCGGCCGAGCTGTGGACCGTGCACCTGGCCATCCACCCGCAGGCCCACCTGCT CATCACCCCAGCCGAGCTGTGGACAGTGCACCTGGCCATCCACCCGCAGGCCCACCTGCT CATTTCCCCGGCAGAGCTGTGGACTGTGCACCTGGCCATCCACCCACAGGCTCATTTGCT * * **** ** *********** ******************** ***** ** ****
360 360 360 360
pes člověk skot myš
GAGCGTGAGCCGCCGGCGCTACGTGCACCTGTGCCCACAGGAGGACGAGATGGCGGCCGA GAGCGTGAGCCGGCGGCGCTACGTGCACCTGTGCCCGCGGGAGGACGAGATGGCCGCAGA GAGCGTGAGCCGGCGGCGCTACGCACACCTATGCCCGCAGGAAGATGAGATCGCAGCGGA GAGTGTGAGCCGTCGGCGCTACGTGCACCTGTGCCTTCAGGAAGATGAGATGGCAGCAGA *** ******** ********** ***** **** * *** ** ***** ** ** **
420 420 420 420
pes člověk skot myš
CAGCAACACCCCGTGGGGCGTGGACGCGCTCATCACCCTCATCTTCCAGAACCGCCAGTA CGGAGACAAGCCCTGGGGCGTGGACGCCCTCCTCACCCTCATCTTCCGGAGCCGACGGTA CAGCAATACGCCATGGGGTGTGGACGCGCTTGTCACGCTCATCTTCCAGAACCGGCAGTA CGGTGACATGCCATGGGGTGTGGACGCACTAGTCACCCTCATTTTCCAGAGCAGGCGGTA * * * * ** ***** ******** ** **** ***** **** ** * * * ***
480 480 480 480
pes člověk skot myš
CTGCCTCAAGTCCTGTGACAGCCGCTACCTGCGCAGCGACGGCCACCTGGTGTGGGAGCC CTGCCTCAAGTCCTGTGACAGCCGCTACCTGCGCAGCGACGGCCGTCTGGTCTGGGAGCC CTGCCTCAAGTCCTGTGACAGCCGCTACCTGCGCAGCGACGGCCGCCTCGTCTGGGAGCC CTGCCTCAAGTCTTATGACAGCCGCTACCTTCGCAGCGATGGCCGCCTTGTCTGGGAACC ************ * *************** ******** **** ** ** ***** **
540 540 540 540
(pokračování na následující straně)
59
pes člověk skot myš
CGAGGCCAGTGCCTGCTACACGCTCGAGTTCAAGGCGGGCAAGCTGGCCTTCAAGGACTG TGAGCCCCGTGCCTGCTACACGCTGGAGTTCAAGGCGGGCAAGCTGGCCTTCAAGGACTG CGAGGCTCGTGCCCGCTACACGCTTGAGTTCAAGGCGGGCAAGTTGGCCTTCAAGGACTG TGAAGCCCATGCCTGCTACACGCTGGAGTTCAAGGCAGGCAAGCTGGCCTTCAAGGACTG ** * **** ********** *********** ****** ****************
600 600 600 600
pes člověk skot myš
CGACGGCCGCTACCTGGCGCCCGCGGGGCCCGCAGGCTCGCTCAGGGCGGGGCGCAACAC CGACGGCCACTACCTGGCACCCGTGGGGCCCGCAGGCACCCTCAAGGCCGGCCGAAACAC CGATGGCCACTACCTGGCACCCGTGGGCCCCGCGGGCACGCTCAGGGCGGGCCGCAACAC TGACGGCCGGTACCTGGCACCTGTGGGGCCTGCTGGCACACTCAAGGCTGGTCGCAACAC ** **** ******** ** * *** ** ** *** * **** *** ** ** *****
660 660 660 660
pes člověk skot myš
GCGGCCGGGCAAGGACGAGCTCTTCGACCTGGAGGAGAGTCACCCGCAGGTGGTGCTGCT GCGACCTGGCAAGGATGAGCTCTTTGATCTGGAGGAGAGTCACCCACAGGTGGTGCTGGT ACGGCCTGGCAAGGACGAGCTCTTCGACCTGGAGGAGAGTCACCCACAGGTGGTGCTGGT GAGGCCCAGCAAGGATGAACTCTTCGACCTGGAGCAAAGTCACCCACAGGTGGTGCTGGT * ** ******* ** ***** ** ****** * ******** ************ *
720 720 720 720
pes člověk skot myš
GGCTGCCAACCGCCGCTACGTGTCGGTGCGGCAAGGGGTCAACGTGTCAGCCAACCAGGA GGCTGCCAACCACCGCTACGTCTCTGTGCGGCAAGGGGTCAACGTCTCAGCCAATCAGGA GGCCGCCAACCACCGCTACGTGTCCGTGCGGCAAGGGGTCAATGTCTCAGCCAACCAAGA AGCTGCCAACCGGCGCTACATCTCTGTGAGGCAAGGAATCAATGTCTCAGCCAATCAGGA ** ******* ****** * ** *** ******* **** ** ******** ** **
780 780 780 780
pes člověk skot myš
CGAAGAGCTGCACCACGAGACCTTCCTGATGCAGATTGACGGCGACACGGGGAAGTGCAC TGATGAACTAGACCACGAGACCTTCCTGATGCAAATTGACCAGGAGACAAAGAAGTGCAC TGAAGAACTGGATCACGAGACCTTCTTGATGCAAATTGACCAGGAGACAAAGAAGTGCAC TGAAGAACTGGGTCATGAGACATTCCTGATGCAAATCGACCAGGAGACAAAGAAGTGTAC ** ** ** ** ***** *** ******* ** *** ** ** ****** **
840 840 840 840
pes člověk skot myš
CTTCTATTCCAGCACAGGAGGCTACTGGACCCTGGTTGCCCACGGGGGCATCCAGGCCAC CTTCTATTCCAGCACTGGGGGCTACTGGACCCTGGTCACCCATGGGGGCATTCACGCCAC CTTCTATTCCAGCACTGGGGGCTACTGGACCCTGGTCACCCACGGGGGCATCCAGGCCAC TTTCTATTCCAGCACTGGGGGCTACTGGACCTTGGTCACCCATGGGGGCATTCAGGCCAC ************** ** ************ **** **** ******** ** *****
900 900 900 900
pes člověk skot myš
GGCCACGCAGGTCTCTGCCAACACCATGTTTGAGGTGGAGTGGCGCGGCCGGCGGGTGGC AGCCACACAAGTTTCTGCCAACACCATGTTTGAGATGGAGTGGCGTGGCCGGCGGGTAGC AGCTACACAAGTTTCTGAGAACACCATGTTTGAAATGGAGTGGCGGGGCCGACGGGTGGC AGCCACACAAGTCTCTGCCAACACCATGTTTGAAATAGAATGGCATGGCCGGCGGGTGGC ** ** ** ** **** ************** * ** **** ***** ***** **
960 960 960 960
pes člověk skot myš
CCTCAAGGCCAGTAACGGGCGCTACGTGTGCATGAAGAAGAACGGACAGCTGGCGGCCGT ACTCAAAGCCAGCAACGGGCGCTACGTGTGCATGAAGAAGAATGGGCAGCTGGCGGCTAT CCTCAAGGCCAGTAACGGGCGCTATGTGTGCATGAAGAAGAATGGGCAGCTGGCGGCCAT ACTTAAAGCCAGCAACGGGCGTTTTGTGTGCATGAAGAAAAACGGGCAGCTGGCCGCCAT ** ** ***** ******** * ************** ** ** ******** ** *
1020 1020 1020 1020
pes člověk skot myš
CAGTGATTTTGTGGGTGAGGACGAGGAGTTCATCCTCAAGCTCATCAACCGGCCCATCCT CAGCGATTTTGTCGGCAAGGACGAAGAGTTCACCCTCAAGCTCATCAACCGGCCCATCCT CAGCGATTTTGTGGGGGAGGACGAGGAGTTCACGCTCAAGCTTATCAACCGGCCCATCCT CAGCGACTTTGTGGGCGAGGACGAGCTATTTACCCTCAAGCTCATCAATCGACCCCTCCT *** ** ***** ** ******* ** * ******** ***** ** *** ****
1080 1080 1080 1080
pes člověk skot myš
CGTGCTCCGGGGCCTCGATGGCTTCGTCTGCCACCGCCGCGGCTCCAACCAGCTGGACAC GGTGCTGCGCGGCCTGGACGGCTTCGTCTGCCACCACCGCGGCTCCAACCAGCTGGACAC GGTCCTGCGCGGCCTGGACGGCTTCGTCTGCCACCGACGTGGCTCCAACCAGTTGGACAC GGTGCTGCGTGGCCTGGATGGCTTTGTGTGCCCCCGCCGGGGCTCCAACCAGCTGGACAC ** ** ** ***** ** ***** ** **** ** ** ************ *******
1140 1140 1140 1140
pes člověk skot myš
CAACCGCTCGGTCTACGACGTCTTCCACCTGAGCTTCAGCGACGGCGCCTACCAGATCCG CAACCGCTCCGTCTACGACGTCTTCCACCTGAGCTTCAGCGACGGCGCCTACCGGATCCG CAACCGCTCGGTTTACGACGTGTTCCACCTGAGCTTCAGCGACGGCGCCTACCAGATCCG CAACCGTTCCACTTACGACGTCTTCCACTTGAGCTTCAGGGATGGCGCCTATCAGATTAG ****** ** ******** ****** ********** ** ******** * *** *
1200 1200 1200 1200
(pokračování na následující straně)
60
pes člověk skot myš
AGGCCGCGGCGGCGGGTTCTGGAACACCGGCAGCCACGGCAGCGTGCGCAGCGACGGCGA AGGCCGCGACGGAGGGTTCTGGTACACGGGCAGCCACGGCAGCGTGTGCAGCGACGGCGA AGGCCGCGGCGGCGGGTTCTGGCACACCGGCAGCCACGGCAGCGTGTGCAGCGACGGCGA AGGCCGTGGAGGTGGGTTTTGGTACACAGGCAGCCATGGAAGCGTGTGCAGCGACGGTGA ****** * ** ***** *** **** ******** ** ****** ********** **
pes člověk skot myš
GCGCCCCGAGGACTTCCTATTCGAGTTCCGGGG ACGCGCCGAGGACTTCGTCTTCGAGTTCCGTGA GCGCGCCGAGGACTTCCTGTTCGAGTTCCGGGA CTTGGCGGAAGATTTCCTCTTTGAGTTCCGAGA * ** ** *** * ** ******** *
1293 1293 1293 1293
1260 1260 1260 1260
61
Obr. 8. Srovnání částečné kódující sekvence genu FSCN2 (EMBL/GenBank AM050719 a AM050720) s predikovanou kódující sekvencí genu FSCN2 u psa (EMBL/GenBank XM_540481) pes pes předp.
-----------------------------------------------------------ATGCCCACCAACGGGCTGCACCAGGTGCTGAAGATCCAGTTCGGCCTCGTCAACGACGCC 60
pes pes předp.
-----------GACCGCCGAGAGCTTCGGCTTCAAGGTCAACGCCTCGGCGCCCAGCCTC 49 GACCGCTACCTGACCGCCGAGAGCTTCGGCTTCAAGGTCAACGCCTCGGCGCCCAGCCTC 120 *************************************************
pes pes předp.
AAGAGGAAGCAGATGTGGGTGCTGGAGCCGGACCCGGGCCAGGGCAGCGCCGTGCTGCTC 109 AAGAGGAAGCAGATGTGGGTGCTGGAGCCGGACCCGGGCCAGGGCAGCGCCGTGCTGCTC 180 ************************************************************
pes pes předp.
CGCAGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGTCCGCCGAGGAGGACGGGCGCGTGGCCTGCGAG 169 CGCAGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGTCCGCCGAGGAGGACGGGCGCGTGGCCTGCGAG 240 ************************************************************
pes pes předp.
GCCGAGCGGCCGGGCCGCGACTGCCGCTTCCTGGTCCTGCCGCAGCCCGACGGGCGCTGG 229 GCCGAGCGGCCGGGCCGCGACTGCCGCTTCCTGGTCCTGCCGCAGCCCGACGGGCGCTGG 300 ************************************************************
pes pes předp.
GTGCTGCAGTCCGAGCCGCACGGCCGCTTCTTCGGCGGCACCGAGGACCGGCTGTCCTGC 289 GTGCTGCGGTCCGAGCCGCACGGCCGCTTCTTCGGCGGCACCGAGGACCGGCTGTCCTGC 360 ******* ****************************************************
pes pes předp.
TTCGCCACGGCCATCTCCCCGGCCGAGCTGTGGACCGTGCACCTGGCCATCCACCCGCAG 349 TTCGCCACGGCCATCTCCCCGGCCGAGCTGTGGACCGTGCACCTGGCCATCCACCCGCAG 420 ************************************************************
pes pes předp.
GCGCACCTGCTGAGCGTGAGCCGCCGGCGCTACGTGCACCTGTGCCCACAGGAGGACGAG 409 GCGCACCTGCTGAGCGTGAGCCGCCGGCGCTACGTGCACCTGTGCCCACAGGAGGACGAG 480 ************************************************************
pes pes předp.
ATGGCGGCCGACAGCAACACCCCGTGGGGCGTGGACGCGCTCATCACCCTCATCTTCCAG 469 ATGGCGGCCGACAGCAACACCCCGTGGGGCGTGGACGCGCTCATCACCCTCATCTTCCAG 540 ************************************************************
pes pes předp.
AACCGCCAGTACTGCCTCAAGTCCTGTGACAGCCGCTACCTGCGCAGCGACGGCCACCTG 529 AACCGCCAGTACTGCCTCAAGTCCTGTGACAGCCGCTACCTGCGCAGCGACGGCCGCCTG 600 ******************************************************* ****
pes pes předp.
GTGTGGGAGCCCGAGGCCAGTGCCTGCTACACGCTCGAGTTCAAGGCGGGCAAGCTGGCC 589 GTGTGGGAGCCCGAGGCCAGTGCCTGCTACACGCTCGAGTTCAAGGCGGGCAAGCTGGCC 660 ************************************************************
pes pes předp.
TTCAAGGACTGCGACGGCCGCTACCTGGCGCCCGCGGGGCCCGCAGGCTCGCTCAGGGCG 649 TTCAAGGACTGCGACGGCCGCTACCTGGCGCCCGCGGGGCCCGCAGGCTCGCTCAGGGCG 720 ************************************************************
pes pes předp.
GGGCGCAACACGCGGCCGGGCAAGGACGAGCTCTTCGACCTGGAGGAGAGTCACCCGCAG 709 GGGCGCAACACGCGGCCGGGCAAGGACGAGCTCTTCGACCTGGAGGAGAGTCACCCGCAG 780 ************************************************************
pes pes předp.
GTGGTGCTGCTGGCTGCCAACCGCCGCTACGTGTCGGTGCGGCAAGGGGTCAACGTGTCA 769 GTGGTGCTGCTGGCTGCCAACCGCCGCTACGTGTCGGTGCGGCAAGGGGTCAACGTGTCA 840 ************************************************************
(pokračování na následující straně)
62
pes pes předp.
GCCAACCAGGACGAAGAGCTGCACCACGAGACCTTCCTGATGCAGATTGACGGCGACACG 829 GCCAACCAGGACGAAGAGCTGCACCACGAGACCTTCCTGATGCAGATTGACGGCGACACG 900 ************************************************************
pes pes předp.
GGGAAGTGCACCTTCTATTCCAGCACAGGAGGCTACTGGACCCTGGTTGCCCACGGGGGC 889 GGGAAGTGCACCTTCTATTCCAGCACAGGAGGCTACTGGACCCTGGTTGCCCACGGGGGC 960 ************************************************************
pes pes předp.
ATCCAGGCCACGGCCACGCAGGTCTCTGCCAACACCATGTTTGAGGTGGAGTGGCGCGGC 949 ATCCAGGCCACGGCCACGCAGGTCTCTGCCAACACCATGTTTGAGGTGGAGTGGCGCGGC 1020 ************************************************************
pes pes předp.
CGGCGGGTGGCCCTCAAGGCCAGTAACGGGCGCTACGTGTGCATGAAGAAGAACGGACAG 1009 CGGCGGGTGGCCCTCAAGGCCAGTAACGGGCGCTACGTGTGCATGAAGAAGAACGGACAG 1080 ************************************************************
pes pes předp.
CTGGCGGCCGTCAGTGATTTTGTGGGTGAGGACGAGGAGTTCATCCTCAAGCTCATCAAC 1069 CTGGCGGCCGTCAGTGATTTTGTGGGTGAGGACGAGGAGTTCATCCTCAAGCTCATCAAC 1140 ************************************************************
pes pes předp.
CGGCCCATCCTCGTGCTCCGGGGCCTCGATGGCTTCGTCTGCCACCGCCGCGGCTCCAAC 1129 CGGCCCATCCTCGTGCTCCGGGGCCTCGATGGCTTCGTCTGCCACCGCCGCGGCTCCAAC 1200 ************************************************************
pes pes předp.
CAGCTGGACACCAACCGCTCGGTCTACGACGTCTTCCACCTGAGCTTCAGCGACGGCGCC 1189 CAGCTGGACACCAACCGCTCGGTCTACGACGTCTTCCACCTGAGCTTCAGCGACGGCGCC 1260 ************************************************************
pes pes předp.
TACCAGATCCGAGGCCGCGGCGGCGGGTTCTGGAACACCGGCAGCCACGGCAGCGTGCGC 1249 TACCAGATCCGAGGCCGCGGCGGCGGGTTCTGGAACACCGGCAGCCACGGCAGCGTGCGC 1320 ************************************************************
pes pes předp.
AGCGACGGCGAGCGCCCCGAGGACTTCCTATTCGAGTTCCGGGG---------------- 1293 AGCGACGGCGAGCGCCCCGAGGACTTCCTATTCGAGTTCCGGGGCCAGGGCCGCCTGGCC 1380 ********************************************
pes pes předp.
-----------------------------------------------------------ATCCGCGCCCGGGGCGGCAAGTACCTGCGCGGCGGCGCCTCGGGGCTGCTGCGGGCCGAC 1440
pes pes předp.
--------------------------------------GCCGACGCGCCCGTGGGGCTCGCGCTCTGGGAGTACTGA 1479
63
Obr. 9. Srovnání částečné odvozené sekvence retinálního fascinu 2 u psa (EMBL/GenBank CAJ 19278 a CAJ 19279) s odpovídajícími úseky proteinu člověka, skotu a myši (EMBL/GenBank NM_02418, resp. NP_788806 resp. NP_766390) pes člověk skot myš
TAESFGFKVNASAPSLKRKQMWVLEPDPGQGSAVLLRSSHLGRYLSAEEDGRVACEAERP TAESFGFKVNASAPSLKRKQTWVLEPDPGQGTAVLLRSSHLGRYLSAEEDGRVACEAEQP TAESFGFKVNASAPSLKRKQMWVLEPDPGEGTAVLFRSSHLGRYLSAEEDGRVACEAERP TAESFGFKVNASAASLKRKQIWVLEPDPGQGTAVLFRSSHLGRYLSAEEDGRVACEMDQP *************.****** ********:*:***:******************** ::*
60 60 60 60
pes člověk skot myš
GRDCRFLVLPQPDGRWVLQSEPHGRFFGGTEDRLSCFATAISPAELWTVHLAIHPQAHLL GRDCRFLVLPQPDGRWVLRSEPHGRFFGGTEDQLSCFATAVSPAELWTVHLAIHPQAHLL GRDCRFLVLPQPDGRWVLQSEPHGRFFGGTEDQLSCFATAITPAELWTVHLAIHPQAHLL GRDCRFLVLPQPDGRWVLQSEPHGRFFGGIEDRLSCFATAISPAELWTVHLAIHPQAHLL ******************:********** **:*******::******************
120 120 120 120
pes člověk skot myš
SVSRRRYVHLCPQEDEMAADSNTPWGVDALITLIFQNRQYCLKSCDSRYLRSDGHLVWEP SVSRRRYVHLCPREDEMAADGDKPWGVDALLTLIFRSRRYCLKSCDSRYLRSDGRLVWEP SVSRRRYAHLCPQEDEIAADSNTPWGVDALVTLIFQNRQYCLKSCDSRYLRSDGRLVWEP SVSRRRYVHLCLQEDEMAADGDMPWGVDALVTLIFQSRRYCLKSYDSRYLRSDGRLVWEP *******.*** :***:***.: *******:****:.*:***** *********:*****
180 180 180 180
pes člověk skot myš
EASACYTLEFKAGKLAFKDCDGRYLAPAGPAGSLRAGRNTRPGKDELFDLEESHPQVVLL EPRACYTLEFKAGKLAFKDCDGHYLAPVGPAGTLKAGRNTRPGKDELFDLEESHPQVVLV EARARYTLEFKAGKLAFKDCDGHYLAPVGPAGTLRAGRNTRPGKDELFDLEESHPQVVLV EAHACYTLEFKAGKLAFKDCDGRYLAPVGPAGTLKAGRNTRPSKDELFDLEQSHPQVVLV *. * *****************:****.****:*:*******.********:*******:
240 240 240 240
pes člověk skot myš
AANRRYVSVRQGVNVSANQDEELHHETFLMQIDGDTGKCTFYSSTGGYWTLVAHGGIQAT AANHRYVSVRQGVNVSANQDDELDHETFLMQIDQETKKCTFYSSTGGYWTLVTHGGIHAT AANHRYVSVRQGVNVSANQDEELDHETFLMQIDQETKKCTFYSSTGGYWTLVTHGGIQAT AANRRYISVRQGINVSANQDEELGHETFLMQIDQETKKCTFYSSTGGYWTLVTHGGIQAT ***:**:*****:*******:** ********* :* ***************:****:**
300 300 300 300
pes člověk skot myš
ATQVSANTMFEVEWRGRRVALKASNGRYVCMKKNGQLAAVSDFVGEDEEFILKLINRPIL ATQVSANTMFEMEWRGRRVALKASNGRYVCMKKNGQLAAISDFVGKDEEFTLKLINRPIL ATQVSENTMFEMEWRGRRVALKASNGRYVCMKKNGQLAAISDFVGEDEEFTLKLINRPIL ATQVSANTMFEIEWHGRRVALKASNGRFVCMKKNGQLAAISDFVGEDELFTLKLINRPLL ***** *****:**:************:***********:*****:** * *******:*
360 360 360 360
pes člověk skot myš
VLRGLDGFVCHRRGSNQLDTNRSVYDVFHLSFSDGAYQIRGRGGGFWNTGSHGSVRSDGE VLRGLDGFVCHHRGSNQLDTNRSVYDVFHLSFSDGAYRIRGRDGGFWYTGSHGSVCSDGE VLRGLDGFVCHRRGSNQLDTNRSVYDVFHLSFSDGAYQIRGRGGGFWHTGSHGSVCSDGE VLRGLDGFVCPRRGSNQLDTNRSTYDVFHLSFRDGAYQIRGRGGGFWYTGSHGSVCSDGD ********** :***********.******** ****:****.**** ******* ***:
420 420 420 420
pes člověk skot myš
RPEDFLFEFR RAEDFVFEFR RAEDFLFEFR LAEDFLFEFR .***:****
430 430 430 430
Pozn.: modré písmo – konservované segmenty; žluté zvýraznění – pozice 79 a 175 psího retinálního fascinu (EMBL/GenBank CAJ 19278), ve kterých dochází k záměně aminokyselin Arg → Gln a His → Arg
64
Obr. 10. Polymorfismus G237A genu FSCN2 u psů na 3,5% agarósovém gelu po štěpení restrikční endonukleásou PstI. M - Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder (MBI Fermentas Vilnius, Litva); PCR – neštěpený PCR-produkt; GG, GA, AA – jednotlivé genotypy. M
PCR
GG
GA
AA
M 299 bp 180 bp 119 bp
Obr. 11. Polymorfismus A525G genu FSCN2 u psů na 3,5% agarósovém gelu po štěpení restrikční endonukleásou EagI. M - Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder (MBI Fermentas Vilnius, Litva); PCR – neštěpený PCR-produkt; AA, AG, GG – jednotlivé genotypy. M
PCR
AA
AG
GG
M
Hjh 157 bp 80 a 77 bp
65
Obr. 12. Polymorfismus A1071G genu FSCN2 u psů na 3,5% agarósovém gelu po štěpení restrikční endonukleásou MvaI. M - Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder (MBI Fermentas Vilnius, Litva); PCR – neštěpený PCR-produkt; AA, AG, GG – jednotlivé genotypy. M
PCR
AA
AG
GG
M
337 bp 242 bp 96 a 95 bp
Tab. 14. Frekvence genotypů a alel v polymorfním místě G237A genu FSCN2 u sledovaných plemen psů Frekvence genotypů
Frekvence alel
Plemeno
n
GG
GA
AA
G
A
pudl
10
0,100
0,400
0,500
0,300 ± 0,102
0,700 ± 0,102
amer. kokršpaněl
6
0,670
0,330
0, 000
0,835 ± 0,107
0,165 ± 0,107
angl. kokršpaněl
7
0,714
0,286
0
0,857 ± 0,094
0,143 ± 0,094
Tab. 15. Frekvence genotypů a alel v polymorfním místě A525G genu FSCN2 u sledovaných plemen psů Frekvence genotypů
Frekvence alel
Plemeno
n
AA
AG
GG
A
G
pudl
10
0,500
0,300
0,200
0,650 ± 0,107
0,350 ± 0,107
amer. kokršpaněl
6
0,330
0,500
0,170
0,580 ± 0,142
0,420 ± 0,142
angl. kokršpaněl
7
0,857
0,143
0,000
0,928 ± 0,069
0,072 ± 0,069
66
Tab. 16. Frekvence genotypů a alel v polymorfním místě A1071G genu FSCN2 u sledovaných plemen psů Frekvence genotypů
Frekvence alel
Plemeno
n
AA
AG
GG
A
G
pudl
10
0,800
0,100
0,100
0,850 ± 0,080
0,150 ± 0,080
amer. kokršpaněl
6
0,000
0,330
0,670
0,165 ± 0,107
0,835 ± 0,107
angl. kokršpaněl
7
0,286
0,143
0,571
0,357 ± 0,128
0,643 ± 0,128
5. 2. 1. 2. Mapování genu FSCN2 Pro lokalizaci genu bylo využito radiačního hybridního a vazbového mapování a fluorescenční in situ hybridizace, ani jeden z těchto přístupů však nebyl úspěšný. Radiační hybridní mapování bylo prováděno Dr. Catherine André (UMR 6061 CNRS, Génétique et Développement, Faculté de Médecine, Université de Rennes 1, Francie). Retenční frekvence markeru byla velmi vysoká (89,9%) z důvodu jeho blízkosti ke genu thymidinkinásy (gen TK), který byl využit jako selekční marker při konstrukci radiačního hybridního panelu (Vignaux et al., 1999b). Proto nemohl být gen FSCN2 přesně lokalizován. Dalším krokem byl pokus o vazbové mapování markeru v referenčních DogMap-rodinách ve spolupráci s Dr. G. Dolfem (Institut für Genetik, Ernährung und Haltung von Haustieren, Vetsuise-Fakultät, Universität Bern, Švýcarsko). Bohužel se však ukázalo, že testovaný polymorfismus A525G (EagI) není v referenčních rodinách informativní. Pro fluorescenční in situ hybridizaci byly připraveny různé PCR – produkty, které zahrnovaly jak intronové, tak exonové části genu. Použité sondy však hybridizovaly výrazně nespecificky (převážně do centromerických oblastí), a proto nemohl být gen zmapován. Vlastní metodu FISH prováděli Prof. dr. hab. M. Switonski a Dr. I. Szczerbal, Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierzat, Wydzial Hodowli i Biologii Zwierzat, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskego w Poznaniu, Polsko. Ačkoli se tedy gen FSCN2 nepodařilo experimentálně zmapovat, je velmi pravděpodobné, že je lokalizován v centromerické části CFA9 v blízkosti genů TK a PDEG. Je tak možno usuzovat z výsledků screeningu radiačního panelu a ze známé
67
lokalizace genu u člověka do oblasti HSA17q25 (Tubb et al., 2000), která je vysoce homologní s centromerickou částí CFA9 (Werner et al., 1997; Acland et al., 1998). 5. 2. 2. Hodnocení asociací mezi genem FSCN2 a progresivní degenerací tyčinek a čípků (prcd) Analýza haplotypů v genu FSCN2, které byly detekovány u klinicky zdravých a postižených jedinců sledovaných plemen (Tab. 17), umožňuje odmítnout každý z identifikovaných polymorfismů G237A, A525G a A1071G jako kausální mutaci pro progresivní degeneraci tyčinek a čípků u plemen pudl, americký kokršpaněl a anglický kokršpaněl, protože segregace genotypů není ve sledované populaci v souladu s popsaným způsobem dědičnosti (autosomálně recesivní) (Petersen – Jones, 1998). Třebaže se nepodařilo gen FSCN2 exaktně experimentálně zmapovat, je na základě screeningu radiačního hybridního panelu téměř jisté, že leží mimo již dříve identifikovaný prcd lokus (Acland et al., 1998; Sidjanin et al., 2003). Tento lokus byl lokalizován do centromerické oblasti CFA9, přičemž jako nejbližší markery jsou uváděny geny GALK1 a GRB2 (Acland et al., 1998; Aguirre et al., nepublikováno, cit. Sidjanin et al., 2003). Za předpokladu správnosti predikce přítomnosti psího genu FSCN2 v těsné blízkosti genů TK a PDEG (pro názornost Obr. 3.) můžeme vyvodit, že nelze tento gen resp. jeho různé polymorfní varianty dávat do příčinné či vazebné souvislosti s prcd u všech plemen psů, u nichž byl příčinný gen lokalizován do prcd lokusu na CFA9 – pudl, americký kokršpaněl, anglický kokršpaněl, labrador retriever a portugalský vodní pes (Aguirre et Acland, 1988; Aguirre et Acland, 1989; Aguire, 1996 nepublikováno, cit. Narfström et Ekesten, 1999). Tento závěr je možno učinit, i když se nepodařilo získat sekvence celé kódující části genu ani jeho regulačních oblastí.
neg.
poz.
Kategorie poz/neg.
G237A AG AA GG
AG
3 5 1
1
n
GG
A525G AG AA GG
Haplotypy
Pudl
AG
A1071G AA AA GG 1 2 1
1 1
n
AG GG GG
G237A AG GG
AG AA GG
A525G AG AA
Haplotypy
Amer. kokršpaněl
AG GG GG
A1071G AG GG 1 2 1 1
2
n
GG AG GG GG
G237A GG
AA AA AA AG
A525G AA
Haplotypy
Angl. kokršpaněl
Tab. 17. Haplotypy genu FSCN2 detekované u klinicky pozitivních a negativních jedinců ve sledované populaci
GG AA AG AA
A1071G GG
68
69
6. SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ A ZÁVĚR Gen USH1G • byla získána neúplná sekvence exonu 2 o délce 972 bp • v exonu 2 byl nalezen substituční polymorfismus C189T způsobující konzervativní záměnu aminokyselin v exprimovaném proteinu • gen byl lokalizován na chromosom CFA9 do blízkosti genů GALK1 a SRP68, přičemž pořadí těchto markerů vzhledem k centromeře je následující
[cen – SRP68 – GALK1 –
USH1G] • na základě analýzy sledované populace nebyla mutace C189T potvrzena jako příčina vzniku progresivní degenerace tyčinek a čípků u plemen pudl, americký kokršpaněl a anglický kokršpaněl Získané výsledky neumožňují jednoznačně vyloučit gen USH1G z příčinné souvislosti s prcd, protože byl lokalizován do chromosomálního regionu zahrnujícího prcd lokus (Acland et al., 1998; Sidjanin et al., 2003) a nebyla prozkoumána jeho úplná kódující sekvence ani regulační oblasti. Za tímto účelem bude tedy nutno provést další studie. Jednou z cest je další zpřesnění lokalizace markerů v prcd lokusu. Předpokladem je získání referenčních rodin, které by vykazovaly dostatečnou úroveň rekombinace v rámci tohoto chromosomálního segmentu (Sidjanin et al., 2003). Možností je také identifikace polymorfních markerů v těsné blízkosti genu USH1G a provedení segregační analýzy haplotypů v rámci definované experimentální rodiny (Bannash et al., 2004). V neposlední řadě se také nabízí alternativa prozkoumání zbývajících nepopsaných segmentů genu – část kódujících sekvencí a regulační oblasti - s využitím např. BAC knihoven či výsledků projektů sekvenování psího genomu.
70
Gen FSCN2 • byla získána sekvence zahrnující část exonu 1 a intronu 1 (délka 929 bp) a sekvence pokrývající část intronu 1 a exony 2-4 spolu s vmezeřenými introny a část exonu 5 (délka 1965 bp) • částečně byla popsána exon-intronová organizace genu u psů • v analyzovaných částech genu byly identifikovány 3 substituční polymorfismy – G237A a A525G v exonu 1 a A1071G v intronu1 • obě mutace v exonu 1 mají za následek konzervativní záměnu aminokyselin v syntetizovaném proteinu • ačkoli se nepodařilo gen experimentálně zmapovat, je možno na základě výsledků usuzovat na jeho přítomnost v těsné blízkosti genů TK a PDEG v centromerické části CFA9 • na základě výsledků analýzy sledované populace je možno odmítnout identifikované substituční polymorfismy G237A, A525G a A1071G jako příčinné mutace pro progresivní degeneraci tyčinek a čípků u plemen pudl, americký kokršpaněl, anglický kokršpaněl • gen FSCN2 je možno vyloučit z příčinné souvislosti s prcd u plemen pudl, americký kokršpaněl, anglický kokršpaněl, labrador retriever a portugalský vodní pes (za předpokladu správnosti predikce přítomnosti genu v těsné blízkosti genů TK a PDEG) Gen FSCN2 je možno na základě presentovaných výsledků téměř s určitostí vyloučit jako příčinný gen pro prcd u výše jmenovaných plemen psů. Přesto si tento gen nadále zaslouží zvýšenou pozornost genetiků a veterinárních lékařů v souvislosti s dalšími dědičnými onemocněními sítnice u psů. Specifická exprese genu ve fotoreceptorech (Tubb et al., 2000) a význam retinálního fascinu pro správný vývoj jejich struktury (Saishin et al., 2000), stejně jako popsané fenotypové efekty mutací genu u člověka a myši (Wada et al. , 2001; Yokokura et al., 2005) jsou pro to více než zřetelným důvodem.
71
7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK BAC klon– klon z bakteriální knihovny genomu studovaného organismu BAC knihovna - bakteriální knihovna genomu studovaného organismu bp – páry bazí cDNA – komplementární DNA získaná zpětnou transkripcí mRNA cDNA knihovna – knihovna zahrnující cDNA, většinou tkáňově specifická CFA – autosomální chromosom psa cM – centimorgan, jednotka vzdálenosti mezi markery CPRA – centrální progresivní retinální atrofie cR – centirad, jednotka vzdálenosti mezi markery DHA – kyselina docosahexaenová DHABP – protein vázající DMSO – dimetyl sulfoxid dNTP mix- směs nukleotidů erd – časná degenerace sítnice EST – expressed sequence tag ERG - elektroretinogram FISH – fluorescenční hybridizace in situ Gb – 109 bazí gPRA – generalizovaná progresivní retinální atrofie HSA – autosomální chromosom člověka kb – 103 bazí LD – vazbová nerovnováha LD – mapování – mapování metodou vazbové nerovnováha LINE – long interspersed nuclear element LOD – dekadický logaritmus poměru pravděpodobností vazby mezi geny M- morgan, jednotka genomické vzdálenosti MM – reakční směs (master mix) Mb- 106 bazí MSS-1, MSS-2 – minimální screeningový set ORF – otevřený čtecí rámec PCR – polymerázová řetězová reakce pd- dysplasie fotoreceptorů
72
PRA – progresivní retinální atrofie prcd – progresivní degenerace tyčinek a čípků prcd lokus – lokus, ve kterém se předpokládá přítomnost kausálního genu pro prcd RAPD – marker – marker identifikovaný metodou RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RARE – retinoic acid response element rcd – 1, 2, 3 – degenerace tyčinek a čípků typu 1, 2, 3 RFLP – polymorfismus délky restrikčních fragmentů RH – mapa – mapa genomu sestavená metodou radiačního hybridního mapování RH-mapování – radiační hybridní mapování RH-¨marker – marker lokalizovaný radiačním hybridním mapováním metodou radiačního hybridního mapování RH-panel – radiační hybridní panel RH – skupina – skupina matrkerů identifikovaných RP – retinitis pigmentosa RPED – dystrofie retinálního epiteliálního pigmentu SAM – sterilní alfa motiv SINE - short interspersed nuclear element SNP – jednonukleotidový polymorfismus STS – Sequence Tagged Site TAE pufr – směs Tris-acetátu a EDTA Tm – teplota tání (primerů) USH1 – Usherův syndrom typu I WHGR – panel – celogenomový radiační hybridní panel XLPRA1, XLPRA2 – pohlavně vázaná progresivní retinální atrofie Zoo – FISH - fluorescenční hybridizace in situ s využitím mezidruhových DNA sond
73
8. LITERATURA Acland, G. M., Halloran-Blanton, S., Boughman, J. A., Aguirre, G. D. (1990). Segregation Distrortion in Inheritance of Progressive Rod Cone Degeneration (prcd) in Miniature Poodle Dogs. Am. J. Med. Genet. 35: 354-9. Acland, G. M., Ray, K., Aguirre, G. D. (1995). Exclusion of the cyclic GMP-PDE beta subunit gene as a candidate in the prcd-dog. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 36 (Suppl.): 4090. Acland, G. M., Ray, K., Mellersh, C. S., Gu. W., Langston. A. A., Rine, J., Ostrander, E. A., Aguirre, G. D. (1998). Linkage analysis and comparative mapping of the canine progressive rod- cone degeneration (prcd) establishes potential locus homology with retinitis pigmentosa (RP17) in humans. Proc. Natl. Acad Sci. USA 95: 304853. Aguirre, G., Alligood, J., O´Brien, P., Buyukmihci, N. (1982). Pathogeneis of progressive rod-cone degeneration in miniature poodles. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 23: 61030. Aguirre, G. D., Acland, G. M. (1988). Variation in retinal degeneration phenotype inherited at the prcd locus. Exp. Eye Res. 46: 663-87. Aguirre, G. D., Acland, G. M. (1989). Progressive retinal atrophy in the Labrador retriever is a of progressive rod-cone degeneration (PRCD). T. Am. College Vet. Oph. 20:150. Aguirre, G. D., Acland, G. M., Maude, M. B., Anderson, R. E. (1997). Diets enriched in docosahexaenoic acid fail to correct progressive rod-cone degeneration (prcd) phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38: 2387-2407. Aguire, G. D., Anderson, R. E., Maude, M., Acland, G. M. (1996). Heritability studies of low plasma docosahexaenoic acid in the prcd-dog. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37: 4800. Alvarez, R. A., Aguirre, G. D., Acland, G. M., Anderson, R. E. (1994). Docosapentaenoic acid is converted to docosahexaenoic acid in the retinas of normal and prcd.affected miniature-poodle dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35: 402-8. Anderson, R. E., Maude, M. B., Alvarez, R. A., Acland, G. M., Aguirre, G. D. (1991). Plasma Lipid Abnormalities in the Miniature Poodle with Progressive Rod-Cone Degeneration. Exp. Eye. Res. 52: 349-55.
74
Bannash, D. L., Ryun, D. R., Bannash, M. J., Shaible, R. H., Breen, M., Ling, G. (2004). Exclusion of galectin 9 as a candidate gene for hyperuricosuria in the Dalmatian dog. Anim. Genet. 34: 326-8. Bardien, S., Ramesar, R., Bhatacharya, S., Greenberg, J. (1997). Retinitis pigmentosa locus on 17q (RP17): fine localization to 17q22 and exclusion of the PDEG and TIMP2 genes. Hum. Genet. 101: 13-7. Bentolila, S., Bach, J. M., Kessler, J. L., Bordelais, I., Cruaud, C., Weissenbach, J., Panthier, J. J. (1999). Analysis of major repetitive DNA sequences in the dog (Canis familiaris) genome. Mamm. Genome 10: 699-705. Biltueva, L. S., Yang, F., Vorobieva, N. V., Graphodatsky, A. S. (2004). Comparative map between the domestic pig and dog. Mamm. Genome 15: 809-18. Brouillette, J. A., Andrew, J. R., Venta, P. J. (2000). Estimate of nucleotide diversity in dogs with pool-and-sequence method. Mamm. Genome 11: 1079-86. Breen, M., Thomas, R., Binns, M. M., Carter, N. P., Landford, C. F. (1999). Reciprocal chromosome painting reveals detailed regions of conserved synteny between the karyotypes of the domestic dog (Canis familiaris) and human. Genomics 61: 14555. Breen, M., Switonski, M., Binns, M. M. (2001a). Cytogenetics and Physical Chromosome maps. In: Ruvinsky, A., Dampson, J.: The Genetics of the dog. CAB International, Oxon, United Kingdom, 299-328. Breen, M., Jouquand, S., Renier, C., Mellersh, C. S., Hitte, C. et al. (2001b). ChromosomeSpecific Single-Locus FISH Probes Allow Anchorage of an 1800-Marker Integrated Radiation-Hybrid/Linkage Map of the Domestic Dog Genome to all Chromosomes. Genome Res. 11 (10): 1784-95. Breen M., Hitte, C. Lorentzen, T. D., Thomas, R., Cadieu, E. et al. (2004). An integrated 4249 marker FISH/RH map of the canine genome. BMC Genomics 5: Art. No. 65, http://www.biomedcentral.com/1471-2164/5/65 Cargill, E. J., Clark, L. A., Steiner, J. M., Murphy, K. E. (2002). Multiplexing of canine microsatellite markers for whole-genome screens. Genomics 80: 250-3. Chen, H. M., Ray, J., Scarpino, V., Acland, G. M., Aguirre, G. D., Anderson, R. E. (1999). Synthesis and release of docosahexaenoic acid by the RPE cells of prcd-affected dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40: 2418-22.
75
Clark,
A.G.,
Glanowski,S.,
Tanenbaum,D.M.,
Nielson,R.,
Civello,D.R.,
Thomas,P.,
Lu,F.,
Kejariwal,A.,
Murphy,B.,
Todd,M.A.,
Ferriera,S.,
Wang,G.,
Zheng,X.H., White,T.J., Sninsky,J.J., Adams,M.D., Cargill,M. (2003). Inferring nonneutral evolution from human-chimp-mouse orthologous gene trios. Science 302: 1960-1963. Clark, L. A., Tsai, K. L., Steiner, J. M., Williams, D. A., Guerra, T., Ostrander, E. A., Galibert, F., Murphy, K. E. (2004). Chromosome-specific microsatellite multiplex sets for linkage studies in the domestic dog. Genomics 84: 550-4. Clements, P. J. M., Sargan, D. R., Gould, D. J., Petersen – Jones, S. M. (1996). Recent advances in understanding the spectrum of canine generalised progressive retinal atrophy. J. Small Anim. Pract. 37: 155-62. Comstock, K. E., Lingaas, F., Kirkness, E. F., Hitte, C., Thomas, R., Breen, M., Galibert, F., Ostrander, E. A. (2004). A high-resolution comparative map of canine Chromosome 5q14.3-q33 constructed utilizing the 1.5x canine genome sequence. Mamm. Genome 15: 544-51. Crook, A., Hill, B., Dawson, S. (1998). CIDD - Canine Inherited Disorders Database. Sir James Dunn Animal Welfare Centre, Atlantic Veterinary College, University of Prince Edward Island, a Canadian Veterinary Medical Association, Ottawa, Kanada. [online], [cit. 2005-08-09],
Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne S. J. (1996-2005). RetNet – Retinal Information Network. The Hermann Eye Center, Memorial Hermann Hospital; Department of Ophthalomology and Visual Science a The Human Genetics Center, School of Public Health, The University of Texas – Houston Health Science Center, Houston, Texas,
USA.
[online],
[cit.
2005-09-12],
Das, M., Chu, L. L., Ghahremani, M., Abrams-Ogg, T., Roy, M. S., Housman, D., Pelletier, J. (1998).Characterization of an abubdant short interspersed nuclear element (SINE) present in Canis familiaris. Mamm. Genome 9: 64-9. De Arcangelis, A., Georges – Labouesse, E., Adams, J. C. (2004). Expression of fascin-1, he gene encoding the actin-binding protein fascin-1, during mouse embryogenesis. Gene. Expr. Patterns 4: 637-43.
76
Dekomien, G., Runte, M., Godde, R., Epplen, J. T. (2000). Generalized progressive retinal atrophy of Sloughi dogs is due to an 8-bp insertion in exon 21 of the PDE6B gene. Cytogenet. Cell Genet. 90: 261-7. Dekomien, G., Epplen, J. T. (2002a). The canine Recoverin (RCV1) gene: a candidate gene for generalized progressive retinal atrophy. Mol. Vis. 8: 436-41.. Dekomien, G., Epplen, J. T. (2002b). The canine Phodsucin gene: characterization of the exon-intron structure and axclusin as a candidate gene for generalized progressive retinal atrophy in 11 dog breeds. Mol. Vis. 8: 138 – 42. Dekomien, G., Epplen, J. T. (2003). Analysis of the PDE6D and PDE6g genes for generalised progressive retinal atrophy (gPRA) mutations in dogs. Genet. Sel. Evol. 35: 445-56. Deschenes, S. M., Puck, J. M., Dutra, A. S., Somberg, R. L., Felsburg, P. J., Henthorn, P. S. (1994). Comparative mapping of canine and human proximal Xq and geneticanalysis of canine X-linked severe combined immunodeficiency. Genomics 23: 628. Dolf, Batt, R., Bäumle, E., Binns, M., Brening, B. Bull, B. et al. (Dogmap Consortium) (1999). DogMap: An internal Collaboration Toward a Low-Resolution Canine Genetic Marker Map. J. Hered. 90 (1):3-6. European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) (2005). ClustalW. [online], [cit. průběžně], Everts, R. E., van Wolferen, M. E., Versteeg, S. A., Zijlstra, C., Engelen, J. J. M., Bosma, A. A., Rothuizen, J., van Oost, B. A. (2002). A radiation hybrid map of the Xchromosome of the dog (Canis familiaris). Cytogenet. Genome Res. 98: 86-92. Fanning, T. G. (1989). Molecular evolution of centromere-associated nucleotide sequences in two species of canids. Gene 85: (559-63). Francisco, L. V., Langston, A. A., Mellersh, C. S., Neal. C. L., Ostrander, E. A. (1996). A class of highly polymorphic tetranucleotide repeats for canine genetic mapping. Mamm. Genome 7: 359-62. Goddard, M. E. (2003). Animal breeding in the (post-) genomic era. Animal Science 76: 353-65. Gould, D. J., Petersen-Jones, S. M., Sohal, A., Barnett, K. C., Sargan, D. R. (1995). Investigation of the role of opsin gene poylmorphisms in generalised progressive retinal atrophies in dogs. Anim. Genet. 26: 261-7.
77
Gould, D. J., Petersen – Jones, S. M., Lin, C. T., Sargan. D. R. (1997). Cloning of the canine rom-1 and its investigation as a candiadate gene for generalized progressive retinal atrophies. Anim. Genet. 28: 391-6. Graphodatsky, A. S., Yang, F., O´Brien, P. C. M., Serdukova, N., Milne, B. S., Trifonov, V., Ferguson-Smith, M. A. (2000). A comparative chromosome map of the Arctic fox, red fox and dog defined by chromosome painting and high resolution Gbanding Chrom. Res. 8: 253-63. Graphodatsky, A. S., Yang, F., O´Brien, P. C. M., Perelman, P., Milne, B. S., Serdukova, N., Kawada, S. I., Ferguson-Smith, M. A. (2001). Phylogenetic implications of the 38 putative ancestral chromosome segments for four canid species. Cytogenet. Cell Genet. 92: 243-7. Greer, K. A., Cargill, E. J., Cox, M. L., Clark, L. A., Tsai, K. L. Credille, K. M., Dunstan, R. W., Venta, P. J., Murphy, K. E. (2003). Digging up the canine genome – a tale to wag about. Cytogenet. Genome Res. 102: 244-48. Gu, W., Acland, G. M., Langston, A. A, Ostrander, E. A., Aguirre. G. D., Ray, K. (1998). Identification of a RAPD marker linked to progressive rod-cone degeneration in dogs. Mamm. Genome. 9: 740-4. Gu, W. K., Ray, K., Pearce-Kelling, S., Baldwin, V. J., Langston, A. A., Ray, J., Ostrander, E. A., Acland, G. M., Aguirre, G. D. (1999). Evaluation of the APOH gene as a positional candidate for prcd in dogs. Invest. Ophthalmol. Visual. Sci. 40: 1229-37. Gustavsson, I., (1964). The chromosomes of the dog. Hereditas 51: 187-9. Guyon, R., Lorentzen, T. D., Hitte, C., Kim, L., Cadieu, E. Parker, H. G., Quignon, P., Lowe, J. K., Renier, C., Gelfenbeyn, B. et al. (2003). A 1-Mb resolution radiation hybrid map of the canine genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5296-301. Haworth, K. E., Islam, I., Breen, M., Putt, W., Makrinou, E., Binns, M., Hopkinson, D., Edwards, Y. (2001). Canine TCOF1; cloning, chromosome assignment and genetic analysis in dogs with different head types. Mamm. Genome 12: 622-9. Heiman,
M.
(1997).
Webcutter
2.0.
[online],
[cit.
průběžně],
Hims, M. M., Diager, S. P., Inglehearn, C. F. (2003). Retinitis pigmentosa: genes, proteins and prospects. Dev. Ophthalmol. 37: 109-25.
78
Hitte, C., Derrien, T., André, C., Ostrander, E. A., Galibert, F. (2004). CRH Server: an on line Comparative Radiation Hybrid Mapping Server for the canine genome. Bioinformatics 20: 3665-7. Hyun, C. B., Filipipich, L. J., Lea, R. A., Shepherd, G. Hughes, I. P., Griffiths, L. R. (2003). Prospects for whole genome linkage disequilibrium mapping in domestic dog breeds. Mamm. Genome 14: 640-49. Hyun, C., Lavulo, L. T., Filippich, L. J. (2004). Evaluation of haplotypes associated with copper toxicosis in Bedlington Terriers in Australia. Am. J. Vet. Res. 65: 1573-79. International Human Genome Sequencing Consortium (2003). The DNA sequence of Homo sapiens (nepublikováno). Jefreys, A. J., Morton, D. B. (1987). DNA fingerprints of dogs nad cats. Anim. Genet. 18:1-15. Jiao, X., Lee, J., Rodriguez De Turco, E. B., Bazan, N. G., Chader, G. J. (1994). Tissue distribution of docosahexaenoic acid binding proteins in poodles with progressive rod-cone degeneration (PRCD). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35: 1611. Jónasdóttir, T. J., Dolf, G., Sletten, M., Aarskaug, T., Schelling, C., Schläpfer, J., Jouquand, S., Priat, C., Holmes, N. G., Lingaas, F. (1999), Five new linkage groups in the canine linkage map. Anim. Genet. 30: 366-70. Jouquand, S., Priat, C., Hitte., C., Lachaume, C., André, C., Galibert, F. (2000). Identification and characterization of a set of 100 tri- and dinucleotide microsatellites in the canine genome. Anim. Genet. 31: 266-72. Joseph, S. S., Sampson, J. (1994). Identification, isolation and characterization of canine minisatelitte sequences. Anim. Genet. 25:307-12. Kennan, A., Aherne, A., Humphries, P. (2005). Light in retinitis pigmentosa. Trends Genet. 21: 103-110. Kijas, J. W., Cideciyan, A. V., Aleman, T. S., Pianta, M. J., Pearce-Kelling, S. E., Miller, B. J., Jacobson, S. G., Aguirre, G. D., Acland, G. M. (2002). Naturally occuring rhodopsin mutation in the dog causes retinal dysfunction and degeneration mimicking human dominant retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 30: 6328-33. Kijas, J. W., Zangerl, B., Miller, B., Nelson, J., Kirkness, E. F., Aguirre, G. D., Acland, G. M. (2004). Cloning of the canine ABCA4 gene and evaluation in canine cone-rod dystrophies and progressive retinal atrophies. Mol. Vis. 10: 223-32.
79
Kikkawa, Y., Shitara, H., Wakana, S., Kohara, S., Takada, T., Okamoto, M., Taya, C., Kamiya, K., Yoshikawa, Y., Tokano, H., Kitamura, K., Shimizu, K., Wakabayashi, Y., Shiroishi, T., Kominami, R., Yonekawa, H. (2003). Mutations in a new scaffold protein SANS cause deafness in Jackson shaker mice. Hum. Mol. Genet. 12: 453-61. Kim. K. S., Lee, S. E., Jeong, H. K., Ha, J. H. (1998). The Complete Nucleotidy Sequence of the Domestic Dog (Canis familiaris) Mitochondrial Genome. Mol. Phylogenet. Evol.. 10(2): 210-20. Kirkness, E. F., Bafna, V., Halpern, A. L., Levy, S., Remington, K., Rusch, D. B., Delcher, A. L., Pop, M., Wang, W., Fraser, C. M., Venter, J. C. (2003). The Dog Genome: Survey Sequencing and Comparative Analysis. Science. 301:1898-903. Klukowska-Rotzler, J., Szczerbal, I., Braunschweig, M., Switonski, M. Schelling, C., Dolf, G. (2005). Mapping and development of four microsatellite markers for the canine 5 '-hydroxytryptamine serotonin receptor 2A (HTR2A). Anim Genet. 36 (2): 173-5. Koskinen, M. T., Bredbacka, P. (2000). Assesment of the population structure of five Finnish dog breeds with microsatellites. Anim. Genet. 31: 310-7. Kruth, S. (1996). Canine models for gene therapy. Transfus. Sci. 17: 71-7. Langston, A. A., Mellersh, C. S., Neal, C. L., Ray, K., Acland, G., Gibbs, M., Aguirre, G. D., Fournier, R. E. K., Ostrander, E. A. (1997). Construction of a panel of CanineRodent Hybrid Cell Lines for Use in Partioning of the Canine Genome. Genomics 46: 317-25. Li, R., Mignot, E., Faraco, J., Kodata, H., Cantanese, J. J., Zhao, B. H., Lin, X., Hinton, L., Ostrander, E. A., Patterson, D. F., de Jong, P. (1999). Construction and characterization of an eight fold redundant dog genomic bacterial artificial chromosome library. Genomics 58: 9-17. Li, R., Faraco, J., Lin, L., Lin, X. Y., Hinton, L., Rogers, W., Lowe, J. K., Ostrander, E. A., Mignot, E. (2001). Physical and radiation hybrid mapping of canine chromosome 12, in a region corresponding to human chromosome 6p12-q12. Genomics 73: 299315. Lin, C. T., Gould, D. J., Petersen – Jones, S. M., Sargan, D. R. (2002). Canine inherited retinal degenerations: update on molecular genetics research and its clinical application. J. Small Anim. Pract. 43: 426-32.
80
Lindblad-Toh, K. (2004). Preliminary analysis of a high-quality draft sequence of the dog genome. Abstract book of the 2nd International Conference Advances in Canine and Feline Genomics, October 14-16, 2004, Utrecht, Netherlands. Lingaas, F., Sorensen, A., Juneja, R. K., Johansson, S., Fredholm, M., Wintero, A. K., Sampson, J., Mellersh, C., Curzon, A., Holmes, N. G., Binns, M. M., Dickens, H. F., Ryder, E. J., Gerlach, J., Bäumle, E., Dolf, G. (1997). Towards construction of a canine linkage map: establishment of 16 linkage groups. Mamm. Genome 8: 21821. Lingaas, F., aarskaug, T., Gerlach, J. A., Juneja, R. K., Fredholm, M., Sampson, S., Suter, N., Holmes, N. G., Binns, M. M., Ryder, E. J., van Haeringen, W. A., Venta, P. J., Brouillette, J. A., Yuzbasiyan-Gurkan, V., Wilton, A. N., Bredbacka, P., Koskinen, M., Dunner, S., Parra, D., Schmutz, S., Schelling, C., Schläpfer, J., Dolf, G. (2001). J. Anim. Breed. Genet. 118: 3-19. Lowe, J. K., Kukekowa, A. V., Kirkness, E. F., Langlois, M. C., Aguirre, G. D., Acland, G. M., Ostrander, E. A. (2003). Linkage mapping of the primary disease locus for collie eye anomaly. Genomics 82: 86-95. Matise, T. C., Perlin, M., Chakravarti, A. (1994). Automated construction of genetic linkage maps using an expert system (MultiMap): a human genome linkage map. Nat Genet 6: 384 -90. McColl, A. J., Converse, C. A., Curtis, R., Willmott, N. J. (1990). Polyunsaturated fattyacid metabolism in miniature-poodles with an inherited retinal degeneration. Biochem. Soc. T. 18: 906-7. Mellersh, C. S., Langston, A. A., Acland, G. M., Fleming, M. A., Ray, K., Wiegand, N. A., Francisco, L. V. Gibbs, M., Aguirre, G. D., Ostrander, E. A. (1997). A linkage map of the Canine Genome. Genomics 46: 326-36. Mellersh, C. S., Hitte, C., Richman, M., Vignaux, F., Priat, C., Jouquand, S., Werner, P., André, C., DeRose, S., Patterson, D. F., Ostrander, E. A., Galibert, F. (2000). An integrated linkage-radiation hybrid map of the canine genome. Mamm. Genome 11: 120-30. Mustapha, M., Chouery, É., Torchard-pagnez, D., Nouaille, S., Khrais, A., Sayegh, F. N., Mégarbané, A., Loiselet, J., Lathrop, M., Petit, Ch, Weil, D. (2002). A novel locus for Usher syndrome type I, USH1G, maps to chromosome 17q24-25. Hum. Genet. 110: 348-50.
81
Narfström, K., Ekesten, B. (1999). Diseases of the canine ocular fundus. In: Gelatt, K. N.: Veterinary ophthalmology. Lippincott Williams &Wilkins, Baltimore, USA, 869933. National Center for Biotechnology Information (NCBI) (2005a). Basic Local Alingment Search Tool – BLAST. U.S. National Library
of Medicine. Rockville Pike,
Bethesda, USA. [online], [cit. průběžně], National Center for Biotechnology Information (NCBI) (2005b). NCBI Map viewer, Human Unigene Clusters map. U.S. National Library of Medicine. Rockville Pike, Bethesda,
USA.
[online],
[cit.
2005-01-25],
<
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/> Naylor, S. L. (1997). Construction and use of somatic cell hybrids. In: Dear, P. H.: Genome mapping – A practical approach. Oxford University Press Inc., New York, United States. Neff, M. W., Broman, K. W., Mellersh, C. S., Ray, K., Acland, G. M., Aguirre, G. D., Ziegle, J. S., Ostrander, E. A., Rine, J. (1999). A second generation Genetic Linkage Map of the Domestic Dog, Canis familiaris. Genetics 151: 803-20. Neuringer, M., mConnor, W. E., van Petten, C., Barstad, L. (1984). Dietary Omega-3 Fatty Acid Deficiency and Visual Loss in Infant Rhesus Monkeys. J. Clin. Invest. 73: 272-6. THE
NHGRI
Dog
Genome
Project
[online].
(2005),
[cit.
2005-07-29]
Nicholas, F. W. (2003). OMIA Database - Online Mendelian Inheritance in Animals Reprogen, Faculty of Veterinary Science, University of Sydney, Australia. [online], [cit. 2005-08-09], Nie, W. H., Wang, J. H. Perelman, P., Graphodatsky, A. S., Yang, F. T. (2003). Comparative chromosome painting defines the karyotypic relationships among the domestic dog, Chinese raccoon dog and Japanese raccoon dog. Chrom. Res. 11: 735-40. Ostrander, E. A., Galibert, F., Mellersh, C. S. (2001). Linkage and Radiation. In: Ruvinsky, A., Dampson, J.: The Genetics of the dog. CAB International, Oxon, United Kingdom, 329-69. Ostrander, E. A., Galibert, F., Patterson, D. F. (2000). Canine genetics comes of age. Trends Genet. 16: 117-24.
82
Otterstede, C. R., Spandau, U., Blankenagel, A., Kimberling, W. J., Reisser, C. (2001). A new clinical classification for Usher´s syndrome based on a new subtype of Usher´s syndrome type I. Laryngoscope 111: 84-6. Ouyang, X. M., Yan, D., Du, L. L. Hejtmancik, J. F., Jacobson, S. G., Nance, W. E. Li. A. R., Angeli, S., Kaiser, M., Newton, V., Brown, S. D. M., Balkany, T., Liu, X. Z. (2005). Characterization of usher syndrome type I gene mutations in an Usher syndrome patient population. Hum. Genet. 116: 292-9. Parker, H. G., Xiao, Y. H., Mellersh, C. S., Khan, S., Shibuya, H., Johnson, G. S., Ostrander, E. A. (2001). Meiotic linkage mapping of 52 genes onto the canine map does not identify significant levels of microrearrangement. Mamm. Genome 12: 713-18. Patterson, D. F., Haskins, M. E., Jezyk, P. F., Giger, U., Mayers-Wallen, V. N., Aguirre, G., Fyfe, J. C., Wolfe, J. H. (1988). Research on genetic diseases: Reciprocal benefits to animals and man. J. Am. Vet. Med. Assoc. 193: 1131-44. Patterson, D. F. (2000). Companion Animal Medicine in the Age of Animal Genetics. J. Vet. Intern. Med. 14: 1-9. Petersen – Jones, S. M. (1998). A Review of Research to Elucidate the Causes of the generalized Progressive Retinal Atrophies. Vet. J. 155: 5-18. Petersen – Jones, S. M., Entz, D. D., Sargan, D. R. (1999). CGMP phosphodiesterase-alpha mutation causes progressive retinal atrophy in the Cardigan Welsh corgi dog. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40: 1637-44. Priat, C., Hitte, C., Vignaux, F., Renier, C., Jiang, Z., Jouquand, S., Cheron, A., Andre, C., Galibert, F. (1998). A whole-genome radiation hybrid map of the dog genome. Genomics 54: 361-78. Ray, K., Baldwin, V. J., Zeiss. C., Acland, G. M., Aguirre. G. D. (1997). Canine rod transducin alpha-1: Cloning of the cDNA and evaluation of the gene as a canididate for progressive retinal atrophy. Curr. Eye Res. 16: 71-7. Reimann, N., Barnitzke, S., Bullerdiek, J., Schmitz, U., Rogallo, P., Nolte, I., Ronne, M. (1996). An extended nomenclature of the canine caryotype. Cytogenet. Cell Genet. 73 (1-2): 140-4. Richman, M., Mellersh, Andre, V., Galibert, F., Ostrander, E. A. (2001). Characterization of a minimal screening set of 172 microsatellite markers for genome-wide screens of the canine genome. J. Biochem. Biophys. Methods 47: 137-149.
83
Roberts, M. C., Hitte, C., Hendrickson, J. A., Hoffman, D. E., Flickinger, G. H., Rutherford, M. S., Guyon, R., Galibert, F., Mickelson, J. R. (2003). Characterization and radiation hybrid mapping of expressed sequence tags from the canine brain. Mamm. Genome 14: 203-13. Rothuizen, J., Wolfswinkel, J., Lenstra, J. A., Frants, R. R. (1994). The incidence of mini – and micro-satellite repetitive DNA in the canine genome. Theor. Appl. Genet. 89: 403-6. Rychlik, W., Spencer, W. J., Rhoads, R. E. (1990). Optimization of the anealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18: 6409-12. Sachidanandam, R., Weissman, D., Schmidt, S. C., Kakol, J. M., Stein, L. D. et al (2001). A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature 409: 928-933. Saishin,Y., Shimada,S., Morimura,H., Sato,K., Ishimoto,I., Tano,Y., Tohyama,M. (1997). Isolation of a cDNA encoding a photoreceptor cell-specific actin-bundling protein: retinal fascin. FEBS Lett. 414: 381-386 Saishin, Y., Ishikawa, R., Ugawa, S., Guo, W., Ueda, T., Morimura, H., Kohama, K., Shimizu, H., Tano, Y., Shimada, S. (2000). Retinal fascin: functional structure, subcellular distribution, and chromosomal localization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41: 2087-95. Sargan, D. R., Yang, F. T., Squire, M., Milne, B. S., O´Brien, P. C. M., Ferguson-Smith, M. A. (2000). Use of flow-sorted canine chromosomes in the assignment of canine linkage, radiation hybrid, and syntenic groups to chromosomes: Refinement and verification of the comparative chromosome map for dog and human. Genomics 69: 182-95. Sargan, D. R. (2002-5). Inherited Diseases in Dogs – IDID. Centre for Veterinary Science, Department of Cambridge,
Clinical Veterinary Medicine, University of Cambridge, Velká
Británie.
[online],
[cit.
2005-08-09],
Sargan, D. R. (2004). IDID: Inherited Diseases in Dogs: Web-based information for canine inherited disease genetics. Mamm. Genome 15: 503-6.
84
Schelling, C., Schläpfer, J., Billault, A., Guziewicz, K., Gmür, A., Katmann, I., Pineroli, B., Colomb, B., Rickli, O., Wittwer, C., Piasecka, A., Dolf, G. (2002). Construction of a canine bacterial artificial chromosome library for screening with PCR. J. Anim. Breed. Genet. 119: 400-1. Schelling, C., Billault, A., Colomb, B., Pineroli, B., Guziewicz, K., Piasecka, A., Gmür, A., Klukowska, J., Gaillard, C., Stranzinger, G., Dolf, G. (2004). Characterization and applications of an expanded canine BAC library with fourfold genome coverage. J. Anim. Breed. Genet. 121: 345-9. Sedgwick, S. G., Smerdon, S. J. (1999). The ankyrin repeat: a diversity of interactions on a common structural framework. Trends Biochem. Sci. 24: 311-6. Sidjanin, D. J., Lowe, J. K., McElwee, J., Milne, B. S., Phippen, T. M., Sargan, D. R., Aguirre, G. D., Acland, G. M., Ostrander, E. A. (2002). Canine CNGB3 mutations establish cone degeneration as orthologous to the human achromatopsia locus ACHM3. Hum. Mol. Genet. 11: 1823-33. Sidjanin, D. J., Miller, B., Kijas, J., McElwee, J., Pillardy, J., Malek, J., Pai, G., Feldblyum, T., Fraser, C., Acland, G., Aguirre, G. (2003). Radiation hybrid map, physical map, and low-pass sequence of the canine prcd region on CFA9 and comparative mepping with the syntenic region on human chromosome 17. Genomics 81:138-48. van de Sluis, B., Rothuizen, J., Pearson, P. L., van Oost, B. A., Wijmenga, C. (2002). Identification of a new copper metabolism gene by positional cloning in a purebred dog population. Hum. Mol. Genet. 11: 165-73. Stabej, P., Imholz, S., Versteeg, S. A., Zijlstra, C., Stokhof, A. A., Dornanjko-Petric, A., Leeggwater, P. A., van Oost, B. A. (2004). Characterization of the canine desmin (DES), gene and evaluation as a candidate gene for dilated cardiomyopathy in the Dobermann. Gene 340 (2): 241-249. Suber, M. L., Pittler, S. J., Qin, N., Wright, G. C., Holcombe, V., Lee, R. H., Craft, C. M., Lolley, R. N., Baehr, W., Hurwitz, R. L. (1993). Irish-setter dogs affected with rod cone dysplasia contain a nonsense mutation in the rod cGMP phosphodiesterase beta-subunit gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3968-72. Sutter, N. B., Eberle, M. A., Parker, H. G., Pullar, B. J., Kirkness, E. F., Kruglyak, L., Ostrander, E. A. (2004). Extensive and breed-specific linkage disequilibrium in Canis familiaris. Genome Res. 14: 2388-96.
85
Switonski, M., Reimann, N., Bosma, A. A. Long, S., Bartnitzke, S., Peńkowska, A., Moreno-Milan, M. M., Fischer, P. (1996). Reporton progress of standardization of the G-banded canine (Canis familiaris) karyotype. Chrom. Res. 4:306-9. Switonski, M., Szczerbal, I., Nowacka, J. (2004). The dog genome and its use in mammalian comparative genomics. J. Appl. Genet. 45: 195-214. Switonski, M. (2004), ústní sdělení, prosinec 2004. Tang, L., Sampson, C., Dreitz, M J., McCall, C. (2001). Cloning and characterization of cDNAs encoding four different canine immunoglobulin gamma chains. Vet. Immunol. Immunop. 80: 259-70. Thomas, R., Breen, M., Deloukas, P., Holmes, N. G., Binns, M. M. (2001). An integrated cytogenetic, radiation-hybrid, and comparative map of dog Chromosome 5. Mamm. Genome 12: 371-5. Tubb, B. E., Bardien – Kruger, S., Kashork, C. D., Shaffer, L. G., Ramagli, L. S., Xu, J., Siciliano, M. J. Bryan, J. (2000). Characterization of human retinal fascin gene (FSCN2) at 17q25: Close physical linkage of fascin and cytoplasmatic actin genes. Genomics 35: 146-56. Tubb, B., Mulholland, D. J., Vogl, W., Lan, Z. J., Niederberger, C., Cooney, A., Bryan, J. (2002). Testis fascin (FSCN3): A novel paralog of the actin-bundling protein fascin expressed specifically in the elongate spermatid head. Exp. Cell. Res. 275: 92-109. UMR 6061 – CNRS [online]. (2005a). [cit. 2005-07-29], UMR 6061 – CNRS, Rennes, Francie, UMR 6061 – CNRS [online]. (2005b). The canine radiation hybrid project. UMR 6061 – CNRS,
Rennes,
Francie,
[cit.
2005-08-03],
rennes1.fr/doggy.html> Vassetzky, N. S., Kramerov, D. A. (2002). CAN-a pan-carnivore SINE family. Mamm. Genome 13: 50-7. Venter, J. C., Adams, M. D., Myers, E. W., Li, P. V., Mural, R. J., et al. (2001). The sequence of human genome. Science 291:1304-51. Veske, A., Nilsson, S. E. G., Narfstrom, K., Gal, A. (1999).Retinal dystrophy of Swedish briard and briard-beagle dogs is due to a 4-bp deletion in RPE65. Genomics 57: 5761. Vignaux, F., Priat, C., Jouquand, S., Hitte, C., Jiang, Z., Cheron, A., Renier, C., Andre, C., Galibert, F. (1999a).Toward a dog radiation hybrid map. J. Hered. 90 (1): 62-7.
86
Vignaux, F., Hitte, C., Priat, C., Chuat, J.-C., Andre, C., Galibert, F. (1999b). Construction and optimization of a dog whole-genome radiatin hybrid panel. Mamm. Genome 10: 888-94. Wada, Y., Abe, Toshiaky, Takeshita, T., Sato, H., Yanashima, K., Tamai, M. (2001). Mutation of Human Retinal Fascin Gene (FSCN2) Causes Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa. Invest. Opththalmol. Vis. Sci. 42: 2395-400. Wang, G. M., Acland, G. M., Aguirre, G. D., Ray, K. (1995). Exclusion of rhodopsin, and probably exclusion of rds/peripherin, as candidate genes for canine progressive rod cone degeneration. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 36 (Suppl.): 3570. Waterston, R.H., Lindblad-Toh, K., Birney,E., Rogers,J., Abril, J.F., Agarwal, P., Agarwala, R., Ainscough, R., Alexandersson, M., An, P. et al. (2002). Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520-562. Weil, D., El-Amraoui, A., Masmoudi, S., Mustapha, M., Kikkawa, Y., Lainé, S., Delmaghani, S., Adato, A., Nadifi, S., Zina, Z. B., Hamel. C., Gal, A., Ayadi, H. Yonekawa, H. Petit, C. (2003). Usher syndrome type I G (USHiG) is caused by mutations in the gene encoding SANS, a protin that associates with the USH1C protein, harmonin. Hum. Mol. Genet. 12: 463-71. Werner, P., Raducha, M. G., Prociuk, U., Henthorn, P. S., Patterson, D. F. (1997). Physical and Linkage Mapping of Human Chromosome 17 loci to Dog Chromosomes 9 and 5. Genomics 42: 74-82. Werner, P., Mellersh, C. S., Raducha, M. G., DeRose, S., Acland, G. M., Prociuk, U., Wiegand, N., Aguirre, G. D., Henthorn, P. S., Patterson, D. F., Ostrander, E. A. (1999a). Anchoring of a canine linkage groups with chromosome-specific markers. Mamm. Genome 10: 814-23. Werner, P., Raducha, M. G., Prociuk, U., Henthorn, P. S., Patterson, D. F. (1999b). A Comparative Approach to physical and Linkage Mapping of Genes on Canine Chromosomes Using Gene-Associated Simple sequence Repeat Polymorphisms Illustrated by Studies of Dog Chromosome 9. J. Hered. 90: 39-42. Wetzel, M. G., Fahlman, C., O´Brien, P. J., Aguirre, G. D. (1990). Metabolic labeling of rod outer segment phospholipids in miniature-poodles with progressive rod-cone degeneration. Exp. Eye Res. 50: 89-97.
87
Yang, F., O´Brien, P. C. M., Milne, B. S., Graphodatsky, A. S., Solanky, N., Trifonov, V., Rens, W., Sargan, D., Ferguson-Smith, M. A. (1999). A complete comparative chromosome map for the dog, red fox, and human and its integration with canine genetic maps. Genomics 62: 189-202. Yang, F., Graphodatsky, A. S., O´Brien, P. C. M., Colabella, A., Solanky, N., Squire, M., Sargan, D. R., Ferguson-Smith, M. A. (2000). Reciprocal chromosome painting illuminates the history of genome evolution of the domestic cat, dog and human. Chrom. Res. 8: 393-404. Yokokura, S., Wada, Y., Nakai, S., Sato, H., Yao, R., Yamanaka, H., Ito, S., Sagara, Y., Takahashi, M., Nakamura, Y., Tamai, M., Noda, T. (2005). Targeted disruption of FSCN2 gene induces retinopathy in mice. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 46: 290515. Yuzbasiyan-Gurkan, V., Blanton, S. H., Cao, Y. Y., Ferguson, P., Li, J. P., Venta, P. J., Brewer, G. J. (1997). Linkage of a microsatellite marker to the canine copper toxicosis locus in Bedlington Terriers. Am. J. Vet. Res. 58: 23-7. Zajc, I., Mellersh, C. S., Sampson, J. (1997). Variability of canine microsatellites within and between different dog breeds. Mamm. Genome 8: 182-5. Zangerl, B., Zhang, Q., Pearce – Kelling, S. E., Aguirre, G. D. (2002). Molecular cloning, characterization and mapping of the canine glucocorticoid receptor DNA binding factor 1 (GRLF1). Gene 294: 167-76. Zhang, Q., Pearce-Kelling, S., Acland, G. M., Aguirre, G. D., Ray, K. (1997). Canine rod photoreceptor cGMP-gated channel protein alpha-subunit: Studies on the expression of the gene and characterization of the cDNA. Exp. Eye Res. 65: 301-9. Zhang, Q., Acland, G. M., Wu, W. X., Johnson, J. L., Pearce-Kelling, S., Tulloch, B., Vervoort, R., Wright, A. F., Aguirre, G. D. (2002). Different RPGR exon ORF15 mutations in Canids provide insights into photoreceptor cell degeneration. Hum. Mol. Genet. 11: 993-1003.
88
9. SEZNAM PUBLIKOVANÝCH PRACÍ Původní vědecké práce Horák, P., Knoll, A., André, C., Cadieu, É., Dvořák, J. (2005): Polymorphism analysis and RH mapping of the canine Usher syndrome 1G (USH1G) gene to CFA9. Anim. Genet. 36 (3): 270-271. Horák, P., Urban, T., Dvořák, J. (2005): The FUT1 and ESR genes – their variability and associations with reproduction in Přeštice Black-Pied sows. J. Anim. Breed. Genet. 122 (3): 210-213. Horák, P., Urban, T., Dvořák, J. (2004): Genetic variability of the CRC and MYF4 genes in genetic resource, Přeštice Black –Pied pig. Archiv für Tierzucht 47 (3): 231-238. Dvořák, J., Filistowitz, A., Hruška, D., Horák, P., Vrtková, I., Kúbek, A., Szulc, T., Pomichal, Š. (2002): The polymorphism of MSTN, PRNP and CSN3 genes in Charolais cattle. Animal Science Papers and Reports, Institute of Genetics and Animal Breeding, Jastrzebiec, Poland, 20: 19 –23. Horák, P., Miková, G., Urban, T., Knoll, A., Dvořák, J. (2001): Association of polymorphism in the IGF2 gene with litter size in Black Pied Prestice pigs. Czech J. Anim. Sci. 46 (11): 505-508. Články ve sbornících z konferencí Horák, P., Knoll, A., André, C., Cadieu, É., Dvořák, J. (2005): Polymorphism analysis and RH mapping of the canine Usher syndrome 1G (USH1G) gene to CFA9. Anim. Genet. 36 (3): 270-271. Horák, P., Urban, T., Dvořák, J. (2005): The FUT1 and ESR genes – their variability and associations with reproduction in Přeštice Black-Pied sows. J. Anim. Breed. Genet., 122 (3): 210-213. Horák, P., Urban, T., Dvořák, J. (2004): Genetic variability of the CRC and MYF4 genes in genetic resource, Přeštice Black –Pied pig. Archiv für Tierzucht, 47 (3): 231-238. Dvořák, J., Filistowitz, A., Hruška, D., Horák, P., Vrtková, I., Kúbek, A., Szulc, T., Pomichal, Š. (2002): The polymorphism of MSTN, PRNP and CSN3 genes in Charolais cattle. Animal Science Papers and Reports, Institute of Genetics and Animal Breeding, Jastrzebiec, Poland, 20: 19 –23.
89
Horák, P., Miková, G., Urban, T., Knoll, A., Dvořák, J. (2001): Association of polymorphism in the IGF2 gene with litter size in Black Pied Prestice pigs. Czech J. Anim. Sci., 46 (11): 505-508. Nováková, J., Králová, P., Matoušek, V., Horák, P., : Vliv polymorfismu genu myogeninu na užitkové vlastnosti prasnic plemene Přeštické černostrakaté. Sborník příspěvků z II. mezinárodní vědecké konference doktorandů, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 2001, ISBN 80-7040-485-X, s.53 Horák, P., Vrtková, I. : Variabilita lokusu estrogenového receptoru u kanců BU a L v České republice. IV. odborný seminář doktorandů a studentů "Genetika a šlechtění zvířat", 14.září 2001, Přerov, ISBN 80-7157-532-1, s.50-51 Hruška, D., Horák, P.: Polymorfismus genu myostatinu u skotu v ČR. IV. odborný seminář doktorandů a studentů "Genetika a šlechtění zvířat", 14.září 2001, Přerov, ISBN 80-7157-532-1, s.89-91 Nováková, J., Králová, P., Matoušek, V., Horák, P.: Asociace genu RYR1 a genu myogeninu na ukazatele vlastní užitkovosti prasniček Přeštické černostrakaté. IV. odborný seminář doktorandů a studentů "Genetika a šlechtění zvířat", 14.září 2001, Přerov, ISBN 80-7157-532-1, s. 30-32 Nováková, J., Králová, P., Matoušek, V., Horák, P.: Analýza vlivů genotypů ESR1 a ESR2 na reprodukční znaky plemene přeštické černostrakaté. IV. odborný seminář doktorandů a studentů "Genetika a šlechtění zvířat", 14.září 2001, Přerov, ISBN 80-7157-532-1, s. 53-55 Horák, P., Miková, G., Vrtková, I., Dvořák, J.: Black Pied Prestice-gene reserve of pigs in the Czech Republic. III konferencja Naukowa "Praca genetyczno-hodowlane nad swiniami ras rodzimych", AR im. A.Cieszkowskiego w Poznaniu, 28.-29.11. 2001, Scripta Medica 74 (6), s. 418. Horák, P., Vrtková, I. : Polymorfismus genu transferrinu (TF) u Přeštického černostrakatého prasete. III. mezinárodní konference doktorandů a studentů „Genetika a šlechtění zvířat„, Přerov 14.5. 1999, s. 45-47
90
Abstrakta ve sbornících z konferencí Horák, P., Dvořák, J.: Perspektiva využití SNPs pro ověřování původu u psů. X. medzinárodná vedecká konferencia študentov a doktorandov (Zborník abstraktov), SPU Nitra, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov. 22. 4. 2004, s. 101-102. Horák, P., Dvořák, J., Putnová, L.: Parentage verification and identification of individuals in dogs in the Czech Republic. In: Abstract of the XXI Genetic Days (CD-ROM), 1-3 September, AR Wroclaw, Poland, ISBN 83-89189-39-9 Horák, P., Dvořák, J., Urban, T., Knoll, A., Hampl, A., Putnová, L.: New opportunity for education of PhD. students at Mendel University of Agriculture and Forestry Brno – project of the Czech Science Foundation n. 523/03/H076. In: Abstract of the XXI Genetic Days (CD-ROM), 1-3 September, AR Wroclaw, Poland, ISBN 83-8918939-9 Horák, P., Dvořák, J.: Variability of the FUT1 gene in five pig breeds in the Czech Republic. In: Abstract of the XXI Genetic Days (CD-ROM), 1-3 September, AR Wroclaw, Poland, ISBN 83-89189-39-9. Horák, P., Dvořák., J.: Variabilita vybraných SNPs u psů. IX. vedecká konferencia študentov a doktorandov, Slovenská poĺnohospodárska univerzita v Nitre, 10. 4. 2003, ISBN 80-8069-181-9, s. 116-117. Hruška, D., Horák, P., Dvořák, J.: The detection of the polymorphism of the MSTN gene in cattle by Multiplex-PCR based test. VII Miedzynarodowa konferencja studenckich kól naukowych i XIX Sejmik SKN, Akademia rolnicza we Wroclawiu, 2002, ISBN 83-87299-86-3, s. 44. Horák, P., Kunstová J., Knoll, A.: The polymorphism in the FUT1 gene in Black Pied Prestice pigs. VII Miedzynarodowa konferencja studenckich kól naukowych i XIX Sejmik SKN, Akademia rolnicza we Wroclawiu, 2002, ISBN 83-87299-86-3, s. 45. Horák, P., Kunstová J., Knoll, A.: Variabilita genu fucosyltransferázy 1 (FUT1 ) u genetického zdroje prasat v ČR. VIII. vedecká konferencia študentov a doktorandov, Slovenská poĺnohospodárska univerzita v Nitre, 18.4. 2002, ISBN 808069-009-X, s. 40-42.
91
Hruška, D., Horák, P., Dvořák, J.: Využití Multiplex – PCR pro stanovení polymorfismu v genu myostatinu (MSTN) u skotu. . VIII. vedecká konferencia študentov a doktorandov, Slovenská poĺnohospodárska univerzita v Nitre, 18.4. 2002, ISBN 808069-009-X, s.168-170. Horák, P., Miková, G.,Vrtková, I., Dvořák, J.. The significance of Black Pied Prestice pigs as the gene resource in the Czech Republic. In Sb.: Current Problems of Breeding, Health and production of pigs, České Budějovice, 19.-20.2. 2002, ISBN 80-8564544-0, s.31 Horák, P., Hruška, D., Dvořák, J., : Polymorfismus genu myostatinu u skotu. VII. vedecká konferencia študentov a doktorandov, Slovenská poĺnohospodárska univerzita v Nitre, s.79-80 Nováková, J., Králová, P., Matoušek, V., Horák, P.: The molecular genetic markers in gene resource of breed Přeštice Black Pied (Pc). Sborník přednášek 10. mezinárodního sympozia "Biotechnologie", České Budějovice, 25.-26- září 2001, ISBN 80-8564543-2, s.95 Hruška, D., Horák, P. : Myostatin as a candidate gene for meat production traits in cattle. Sborník přednášek 10. mezinárodního sympozia "Biotechnologie", České Budějovice, 25.-26- září 2001, ISBN 80-85645-43-2, s.97 Miková, G., Horák, P.: Association IGF-2 gene with litter size in Black Pied Prestice. Sborník přednášek 10. mezinárodního sympozia "Biotechnologie", České Budějovice, 25.-26- září 2001, ISBN 80-85645-43-2, s.99. Horák, P.: Molekulárně genetická charakteristika genové rezervy – Přeštické černostrakaté prase. Česká biologická společnost Gregora Mendela, Brno 5.12.2001, Scripta Medica 74 (6), s. 418. Horák, P., Salavec, L., Vrtková, I. : Polymorfismus estrogenového receptoru u genové rezervy prasat plemene Přeštické černostrakaté. VI. vedecká konferencia študentov a doktorandov, Slovenská poĺnohospodárska univerzita v Nitre, 13.4. 2000, s.41 Horák, P., Salavec, L., Vrtková, I. : Genofond Přeštického černostrakatého prasete charakterizovaný čtyřmi lokusy. Acta fytotechnica et zootechnica, roč. 3. 2000 , XIX. Dni genetiky, Slovenská poĺnohospodárska univerzita v Nitre, 5.-7.9. 2000, ISBN 80-7137-748-1, s. 58-56
92
Horák, P., Vrtková, I., Mlynek, J., : Genetická variabilita v lokusu MYF-4 u Přeštického černostrakatého prasete. V. vedecká konferencia študentov a doktorandov, Slovenská poĺnohospodárska univerzita v Nitre, 22.4.1999, Horák, P., Vrtková, I., Knoll,A. : Genetic variability of the MYF-4 and MYF-3 locus in pigs. IV Miedzynarodowa konferencja studenckich kól naukowych i XVI Sejmik SKN, Akademia rolnicza we Wroclawiu, 19.-20.5. 1999, s.24 Články a materiály pro studenty a odbornou veřejnost Horák, P., Bílek, K. (2005). Doktorské projekty očima studentů. Aula. 3: (in press) Dvořák, J., Horák, P. (2002). „Dvojí osvalení“ u skotu = chyby v genu. Agro magazín, 5: 68-69. Horák, P., Dvořák, J.: Genetický zdroj prasat v ČR – plemeno Přeštické černostrakaté. In: Dvořák, J.: Genetika skotu a prasat pro akademický rok 2002/2003. (CD-ROM), 2002
93
10. ŽIVOTOPIS Jméno: Pavel Horák Datum narození: 5. 10. 1977 Místo narození: Mělník Národnost: česká Státní občanství: Česká republika Stav: svobodný Adresa: Nedomice 63, 277 14 Dřísy Vzdělání: 2002 – dosud: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Agronomická fakulta, doktorský studijní program, obor Molekulární biologie a genetika živočichů téma doktorské disertační práce: Analýza kandidátních genů USH1G a FSCN2 pro progresivní degeneraci tyčinek a čípků u psů studium přerušeno od srpna 2005 1997- 2002: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Agronomická fakulta, magisterský studijní program, obor Zootechnika téma diplomové práce: Molekulárně-genetická charakteristika genové rezervy prasat plemene Přeštické černostrakaté 1995-1997: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Fakulta veterinárního lékařství, obor Veterinární lékařství – 4 semestry, nedokončeno 1991-1995: Gymnázium v Brandýse nad Labem – Staré Boleslavi Zaměstnání: září 2005 – dosud: Ústav živočišné fyziologie a genetiky Akademie věd České republiky, Liběchov, Laboratoř genomiky živočichů, doktorand březen 2003 – leden 2004: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Ústav genetiky, inženýrsko - technický pracovník (vědecko - výzkumná činnost)
94
11. PŘÍLOHY
Příloha č. 1 LOCUS 2005 DEFINITION
AJ876618
972 bp
DNA
linear
MAM 06-JUN-
Canis familiaris partial ush1G gene for usher syndrome 1G homologue, exon 2. ACCESSION AJ876618 VERSION AJ876618.1 GI:62750832 KEYWORDS SANS; ush1G gene; usher syndrome 1G homologue. SOURCE Canis familiaris (dog) ORGANISM Canis familiaris Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Carnivora; Fissipedia; Canidae; Canis. REFERENCE 1 AUTHORS Horak,P., Knoll,A., Andre,C., Cadieu,E. and Dvorak,J. TITLE Polymorphism analysis and RH mapping of the canine Usher syndrome 1G (USH1G) gene to CFA9 JOURNAL Anim. Genet. 36 (3), 270-271 (2005) PUBMED 15932419 REFERENCE 2 (bases 1 to 972) AUTHORS Horak,P. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-JAN-2005) Horak P., Dept Morphol Physiol & Genet, Mendel Univ Agr & Forestry, Zemedelska 1, Brno, 613 00, CZECH REPUBLIC FEATURES Location/Qualifiers source 1..972 /organism="Canis familiaris" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9615" /note="breedpoodle" gene <1..>972 /gene="ush1G" CDS <1..>972 /gene="ush1G" /note="SANS" /codon_start=3 /product="usher syndrome 1G homologue" /protein_id="CAI45892.1" /db_xref="GI:62750833" /db_xref="UniProtKB/TrEMBL:Q53I76" /translation="GNTPLHLAASNGHLHCLSFLVSFGANIWCLDNDYHTPLDMAAMK GHMECVRYLDSIAAKQSSLNPKLVGKLKDKAFREAERRIRECAKMQRKHHERMERRYR RERAERSDALSFSSLTSSTLSRRLQHLALGSQLPYSQATLHGTARGKGKIQRKLERRK QGGEGTFKISEDGRKSVRSLSGLQLGSDVMFVRQGTYANPKEWGRSPLRDMFLSDEDS VSRATLAAEPAHSEVSTDSGHDSLFTRPGLGTMVFRRNYLSSGLHGLGREDAEGAPRG RLQSSPSLDDDSLGSANSLQDRSCGEELPWDELDLGLDEDLEPETSP" exon <1..>972 /gene="ush1G" /number=2 ORIGIN
//
1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961
ggggcaacac tggtgtcctt tggccgcgat agagcagcct agcggcgcat gctaccgccg gcaccctgag ccacgctgca agcagggcgg tctcgggcct ccaaggagtg cccgtgccac actccctgtt gcgggctgca gctcccccag gcggggagga agaccagccc
gcccctgcac cggggccaac gaagggccac caaccccaag ccgcgagtgc cgagcgggcc ccgccggctg cggcacggcc cgagggcacc gcagctgggc gggccgctcc gctggcggcc tacccgcccg cgggctgggc cctggacgac gctgccctgg cc
ctggcagctt atctggtgcc atggagtgcg ctggtgggca gccaagatgc gagcgctccg cagcacctgg aggggcaagg ttcaagatct agcgacgtga ccgctccggg gagcctgccc ggcctgggca cgcgaggacg gacagcctgg gacgagctgg
ccaacggcca tggacaacga tgcgctacct agctgaagga agcgcaagca acgcgctcag cgctgggcag gcaagatcca ccgaggacgg tgttcgtgcg acatgttcct actcggaggt ccatggtgtt ccgagggcgc gcagtgccaa acttgggcct
cctgcactgc ctaccacacg ggactccatc caaggccttc ccacgagcgc cttctccagc ccagctgccc gcggaagctg ccgcaagagc ccagggcacc ctcggatgag cagcaccgac ccgcaggaac cccgcgaggc cagcctgcag ggatgaggac
ctgtccttcc ccgctggaca gccgccaagc cgcgaggccg atggagcggc ctcacgtcca tactcgcagg gagcggcgca gtgcgctcgc tacgccaacc gacagcgtct tcaggccacg tacctgagca cggctgcaga gaccgcagct ctggagcccg
Příloha č. 2 Accession#: AM050719 Status: confidential until 30-MAR-2006 Description: Canis familiaris partial fscn2 gene for fascin 2, exon 1 ID AM050719 standard; genomic DNA; MAM; 929 BP. XX HD * confidential 30-MAR-2006 XX AC AM050719; XX SV AM050719.1 XX DT 25-JUL-2005 (Rel. 84, Created) DT 25-JUL-2005 (Rel. 84, Last updated, Version 0) XX DE Canis familiaris partial fscn2 gene for fascin 2, exon 1 XX KW fascin 2; fscn2 gene. XX OS Canis familiaris (dog) OC Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; OC Eutheria; Laurasiatheria; Carnivora; Fissipedia; Canidae; Canis. XX RN [1] RP 1-929 RA Horak P.; RT ; RL Submitted (22-JUL-2005) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. RL Horak P., Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel RL University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, 613 00, Brno, CZECH RL REPUBLIC. XX RN [2] RA Horak P., Knoll A.; RT "Polymorphism analysis of the canine retinal fascin 2 gene (FSCN2)"; RL Unpublished. XX FH Key Location/Qualifiers FH FT source 1..929 FT /db_xref="taxon:9615" FT /mol_type="genomic DNA" FT /organism="Canis familiaris" FT exon <1..755 FT /number=1 FT /gene="fscn2" FT CDS <1..>755 FT /codon_start=2 FT /gene="fscn2" FT /product="fascin 2" FT /protein_id="CAJ19278.1" FT /translation="TAESFGFKVNASAPSLKRKQMWVLEPDPGQGSAVLLRSSHLGRYL FT SAEEDGRVACEAERPGRDCRFLVLPQPDGRWVLQSEPHGRFFGGTEDRLSCFATAISPA FT ELWTVHLAIHPQAHLLSVSRRRYVHLCPQEDEMAADSNTPWGVDALITLIFQNRQYCLK FT SCDSRYLRSDGHLVWEPEASACYTLEFKAGKLAFKDCDGRYLAPAGPAGSLRAGRNTRP FT GKDELFDLEESHPQVVLLAANRRYVSVRQ" XX
SQ Sequence 929 BP; 128 A; 332 C; 352 G; 117 T; 0 other; gaccgccgag agcttcggct tcaaggtcaa cgcctcggcg cccagcctca agaggaagca gatgtgggtg ctggagccgg acccgggcca gggcagcgcc gtgctgctcc gcagcagcca cctgggccgc tacctgtccg ccgaggagga cgggcgcgtg gcctgcgagg ccgagcggcc gggccgcgac tgccgcttcc tggtcctgcc gcagcccgac gggcgctggg tgctgcagtc cgagccgcac ggccgcttct tcggcggcac cgaggaccgg ctgtcctgct tcgccacggc catctccccg gccgagctgt ggaccgtgca cctggccatc cacccgcagg cgcacctgct gagcgtgagc cgccggcgct acgtgcacct gtgcccacag gaggacgaga tggcggccga cagcaacacc ccgtggggcg tggacgcgct catcaccctc atcttccaga accgccagta ctgcctcaag tcctgtgaca gccgctacct gcgcagcgac ggccacctgg tgtgggagcc cgaggccagt gcctgctaca cgctcgagtt caaggcgggc aagctggcct tcaaggactg cgacggccgc tacctggcgc ccgcggggcc cgcaggctcg ctcagggcgg ggcgcaacac gcggccgggc aaggacgagc tcttcgacct ggaggagagt cacccgcagg tggtgctgct ggctgccaac cgccgctacg tgtcggtgcg gcaaggtacc gggggccctg cgtgcggggg cgccctcagg ggtcacgggg cccggcggtg gggggcagtg cacggtgcag gcggctgagg cggcggctcc atctgacgcc ccgagccctg ggcctgctgg acggacggcg gcgccctggg ggaggcgggc gaggccgggg ccgccacgg /
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 929
Příloha č. 3 Accession#: AM050720 Status: confidential until 30-MAR-2006 Description: Canis familiaris partial fscn2 gene for fascin 2, exons 2-5 ID AM050720 standard; genomic DNA; MAM; 1965 BP. XX HD * confidential 30-MAR-2006 XX AC AM050720; XX SV AM050720.1 XX DT 25-JUL-2005 (Rel. 84, Created) DT 25-JUL-2005 (Rel. 84, Last updated, Version 0) XX DE Canis familiaris partial fscn2 gene for fascin 2, exons 2-5 XX KW fascin 2; fscn2 gene. XX OS Canis familiaris (dog) OC Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; OC Eutheria; Laurasiatheria; Carnivora; Fissipedia; Canidae; Canis. XX RN [1] RP 1-1965 RA Horak P.; RT ; RL Submitted (22-JUL-2005) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. RL Horak P., Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel RL University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, 613 00, Brno, CZECH RL REPUBLIC. XX RN [2] RA Horak P., Knoll A.; RT "Polymorphism analysis of the canine retinal fascin 2 gene (FSCN2)"; RL Unpublished. XX FH Key Location/Qualifiers FH FT source 1..1965 FT /db_xref="taxon:9615" FT /mol_type="genomic DNA" FT /organism="Canis familiaris" FT CDS join(<836..992,1232..1353,1632..1799,1875..>1965) FT /codon_start=3 FT /gene="fscn2" FT /product="fascin 2" FT /protein_id="CAJ19279.1" FT /translation="VNVSANQDEELHHETFLMQIDGDTGKCTFYSSTGGYWTLVAHGGI FT QATATQVSANTMFEVEWRGRRVALKASNGRYVCMKKNGQLAAVSDFVGEDEEFILKLIN FT RPILVLRGLDGFVCHRRGSNQLDTNRSVYDVFHLSFSDGAYQIRGRGGGFWNTGSHGSV FT RSDGERPEDFLFEFRG" FT exon <836..992 FT /number=2 FT /gene="fscn2" FT intron 993..1231
FT /number=2 FT /gene="fscn2" FT exon 1232..1353 FT /number=3 FT /gene="fscn2" FT intron 1354..1631 FT /number=3 FT /gene="fscn2" FT exon 1632..1799 FT /number=4 FT /gene="fscn2" FT intron 1800..1874 FT /number=4 FT /gene="fscn2" FT exon 1875..>1965 FT /number=5 FT /gene="fscn2" XX SQ Sequence 1965 BP; 324 A; 674 C; 669 G; 298 T; 0 other; aagcatcaca gctgctgatg ggacggtggg gatggcgctg ccccgggccg ggaggagcag cctcaggcgc tggtggagga cggcagggct cacccctccg gtgcaggctg ccctgccctc ctggggaccc tcgggccccc tttcctcccg ctctgccatc tgcacacaag aggagggcag ggaggtgacg acgggcctgg gagtgaaccc caggccccag ctgtgccctg ggccgtgggt gggggaagac gagggagccc gctgtgccca cccagcagct ttggaggggg gttataaata gaggctggtg tgggtcctgg ggcgccaggg cagcagcagg cagattacct gatgattagc acagtggggg atttgctggc accgcggggc ctggctcctg ggctgcgggg ggtcaggccg aggcccacag ggaacgcagt gtcgcggcct gcagtgtggc cacccggccg cgcggctcct gcctccgagg agcgccttct agatcttaac tccaaagggt ttgttttctt tttaaagtat tttatgtatt tattcatgag agacatggag agaggcagag acccaggcag agggagaggc aggtccgtgc agggagcctg atgcaggact tgatcccggg accccggggt catgtcctgg gccaaaggca gatgctcaac ggcagagccc cccgggcgcc ccttaactcc aaaaggctct ggaggaggcc cctctgccgg caggtgcccc aagagcctgc tttccccatc ttcctggccc ccgcccccgc ccccgcccag ggagaggcgt gaggggctcc tgtctcctcc cgcaggggtc aacgtgtcag ccaaccagga cgaagagctg caccacgaga ccttcctgat gcagattgac ggcgacacgg ggaagtgcac cttctattcc agcacaggag gctactggac cctggttgcc cacgggggca tccaggccac ggccacgcag gtgtgagtgt cccccccccg tcctccacct gcacccccac ctccccccgc ccccaaggac cgcagcagca gtccagccag aaaagaaccc ccactggggc gaggggggct ctgaatggtg gtgcgtggtg cgggccagcg gaaggctggg ctcggtgctg gacccgaggg ggagaggaaa gcttggccct cagctcccga caccctgctg ccctgagggg acctcaccct gaccttccca gctctgccaa caccatgttt gaggtggagt ggcgcggccg gcgggtggcc ctcaaggcca gtaacgggcg ctacgtgtgc atgaagaaga acggacagct ggcggccgtc agtgattttg tgggtgagca gtcgccacgt gtcctgggga cccggggccg ggcctctccc gggggacggc acctgcccac accccgcctc taagagctgg tccctccgcc ggcaagtgcc ccgacctcac cgctggaggt aactgctccc gacggcgagg agccggagcc ctgggcacct accgccacat agaggcacct gggcttgtgt caccggcggc tgcggccttt tgtgccccgg ggccccaccg cccaccctaa ccccgccggc ggcccgaccc cgacccccca ggtgaggacg aggagttcat cctcaagctc atcaaccggc ccatcctcgt gctccggggc ctcgatggct tcgtctgcca ccgccgcggc tccaaccagc tggacaccaa ccgctcggtc tacgacgtct tccacctgag cttcagcgac ggcgcctacc agatccgagg tgggccccgg ggtggcgggg gagcgcaggg tggggggcca cccggtgccc ctgccgaccc gccctcgccc ccaggccgcg gcggcgggtt ctggaacacc ggcagccacg gcagcgtgcg cagcgacggc gagcgccccg aggacttcct attcgagttc cgggg //
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1965
270
Brief notes doi:10.1111/j.1365-2052.2005.01278.x
Polymorphism analysis and RH mapping of the canine Usher syndrome 1G (USH1G ) gene to CFA9 P. Hora´k*, A. Knoll*, C. Andre´†, E. Cadieu† and J. Dvorˇa´k* *Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University of Agriculture and Forestry Brno, Zemeˇdeˇlska´ 1, 613 00 Brno, Czech Republic. †UMR 6061 CNRS Ge´ne´tique et De´veloppement, Faculte´ de Me´decine, Universite´ de Rennes I, Rennes, France Accepted for publication 4 March 2005
Source/description: To amplify a fragment of the USH1G gene encompassing a part of exon 2, primers (F1 and R1) were designed from human cDNA sequence (GenBank accession no. NM_173477) aligned with human genomic DNA sequence (International Human Genome Sequencing Consortium, 2003, unpublished data) (accession no. NT_010641). Identity of the amplicon (1017 bp) was verified by direct sequencing. The obtained sequence data (without primers) were deposited in the EMBL database (accession no. AJ_876618). The canine sequence corresponded to the human (accession no. NM_173477) and mouse (accession no. NM_176847) cDNA sequences with an identity of 93 and 91% respectively. The deduced canine amino acid sequence showed identities of 95% both to human (accession no. NP_775748) and to mouse (accession no. NP_789817) protein sequences. Compared with human and mouse DNA sequences, there were several differences including a deletion of 12 nucleotides in the canine genomic DNA sequence. That deletion resulted in the absence of four amino acids in deduced canine protein. Primer sequences: F1: 5¢-TGA CCC GGA CAA GTG TGA CAT CT-3¢ R1: 5¢-AGA GAG GCC AGG AAG GTC TCC A-3¢ F2: 5¢-TTC CAA CGG CCA CCT GCA CT-3¢ R2: 5¢-GCT GGA CGT GAG GCT GGA GAA G-3¢ PCR conditions: The PCR-1 (using F1 and R1 primers) was carried out in a total volume of 25 ll containing 100 ng canine genomic DNA, 1x LA PCR buffer (500 mM Tris–HCl, pH 9.3, 150 mM (NH4)2SO4, 22.5 mM MgCl2, 1% Tween 20), 800 lM dNTP, 5 pmol of each primer, 3% DMSO and 1 U LA DNA Polymerases Mix (Top-Bio s.r.o., Prague, Czech Republic). After
M
PCR
TT
TC
CC
initial denaturation for 2 min at 95 C, PCR-1 continued for 20 s at 95 C, 30 s at 60 C and 70 s at 68 C (30 cycles in total), and the last extension for 7 min at 68 C. To detect the MnlI polymorphic site, primers for PCR-2 (F2 and R2) were designed on the basis of obtained canine DNA sequence. PCR-2 was performed in 25 ll reactions using the same mixture as in PCR-1 and its thermal profile included: initial denaturation for 2 min at 95 C followed by 30 cycles for 20 s at 95 C, 30 s at 61 C and 30 s at 68 C, and the final extension for 7 min at 68 C. Polymorphism and allele frequencies: The MnlI polymorphism (C fi T substitution) at nucleotide position 189 of sequence AJ_876618 was found by comparison of three breeds: Poodle, American Cocker Spaniel and English Cocker Spaniel. This polymorphism causes an amino acid substitution (Leu fi Phe) in the deduced canine protein. When digested with MnlI endonuclease, the 334 bp long PCR product (obtained with primers F2 and R2) is cut into the following fragments (Fig. 1): 170 + 132 + 30 + 2 bp (allele C) or 200 + 132 + 2 bp (allele T). The observed frequencies of allele T were 0.090, 0.750 and 0.071 in Poodle, American Cocker Spaniel and English Cocker Spaniel breeds respectively. Radiation hybrid mapping: The USH1G gene was typed on the radiation hybrid panel RHDF5000-21 and data were incorporated into the 3270-marker version of the RH map2 using the two-point analysis of the Multimap package3 and the ÔComparative and Radiation Hybrid ServerÕ for the canine genome.4 The gene was localized on CFA9, close to the GALK1 (LOD ¼12.91) and SRP68 (LOD ¼ 9.18) markers at distances of 23 and 39 cR respectively (1 cR is the RH unit and corresponds to 100 kb). The human orthologue of USH1G was mapped on HSA17q255 at position 70.4 Mb (NCBI build 35), which coresponds to the expected conservation of that segment and the centromeric part of CFA9.6,7 Moreover, the order and distances of these three genes are highly conserved in dog and human. Comments: In human, the USH1G gene (the human orthologue of the mouse SANS gene) encodes the SANS protein containing three ankyrin domains, a class I PDZ-binding motif and a sterile alpha motif. The mutation in this gene causes outbreak of the Usher syndrome type 1 G (deafness, constant vestibular dysfunction and retinitis pigmentosa) in some human families.8 Similarly, the mutation in the SANS gene is associated with deafness in Jackson shaker mice.9
M
200 bp 170 bp 132 bp
Figure 1 The MnlI polymorphism in the canine USH1G gene electrophoresed on a 3.5% agarose gel. The genotypes are indicated at the top of each line. M, 100 bp DNA Ladder GeneRulerTM (Fermentas, Vilnius, Lithuania); PCR, undigested PCR product.
2005 International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 36, 258–286
Brief notes Acknowledgements: The authors thank Mgr Zuzana Vykoukalova´ for technical assistance and MVDr Pavla Trnkova´ (Veterinary clinic Brno-Lesna´) for collection of blood samples. The research was supported by Czech Science Foundation (project no. 523/03/H076). References 1 Vignaux F. et al. (1999) Mamm Genome 10, 888–94. 2 Guyon R. et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 5296– 301. 3 Matise T. C. et al. (1994) Nat Genet 6, 384–90. 4 Hitte C. et al. (2004) Bioinformatics 20, 3665–7. 5 Mustapha M. et al. (2002) Hum Genet 110, 348–50. 6 Werner P. et al. (1997) Genomics 42, 74–82. 7 Acland G. M. et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 3048– 53. 8 Weil D. et al. (2003) Hum Mol Genet 12, 463–71. 9 Kikkava Y. et al. (2003) Hum Mol Genet 12, 453–61. Correspondence: P. Hora´k ([email protected])
doi:10.1111/j.1365-2052.2005.01285.x
Mapping TERT to chromosome 16 in swine D. S. Zhao*†, Y. H. Zhao*‡ and N. Li* *State Key Laboratory for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing, China. †Institute of Space Medico-Engineering, Beijing, China. ‡Faculty of Life Science, Liaoning University, Shenyang, China Accepted for publication 8 March 2005
Source/description: The enzyme telomerase plays a crucial role in cellular proliferation and tumorigenesis. By adding hexameric repeats to chromosome ends, it prevents telomeric loss and, thus, entry into senescence. Telomerase is an RNA-directed DNA polymerase composed minimally of an RNA subunit (TR) and a catalytic protein component [telomerase reverse transcriptase (TERT)]. The TERT component of telomerase is thought to be the primary determinant for enzyme activity as expression of TERT is largely limited to cells with telomerase activity.1 PCR primers: In order to obtain a pig TERT DNA fragment, PCR amplification was performed using the following set of primers: pTERTF: 5¢-GC[T/C]GCAGAGCACCGTCTG-3¢ and pTERTR: 5¢-CGGTAGAA[G/A] AAGAGCCTGTTCTT-3¢. Primers were designed according to the published human (GenBank accession no. AF018167) and mouse (accession no. AF051911) TERT sequences and amplified a 140-bp fragment. PCR conditions: The PCRs were performed in 15 ll using 100 ng of genomic DNA, PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 200 lM each dNTP, 10 pmol each primer and 1 U Taq DNA polymerase. Cycling conditions were 94 C for 30 s, 52 C for 30 s and 72 C for 30 s for 35 cycles. The PCR products were cloned and sequenced. Analysis using the BLAST program of GenBank indicated that the sequences of porcine TERT gene has signifi-
Figure 1 Chromosomal assignment of the porcine TERT gene by FISH analysis. A specific signal is observed on chromosome 16q subtelomeric band (arrow).
cant identity compared with the TERT genes of human, mouse and dog (88, 82 and 85% respectively). Screening of a porcine BAC library: Primers P1 (5¢-GTCTGAGAGAGGCCATTC-3¢) and P2 (5¢-GCCTGTTCTTCTGAAACG-3¢) were designed according to the porcine TERT sequence and amplified a 114-bp fragment. Using this pair of primers, a porcine BAC library was screened by PCR and a positive BAC clone containing the porcine TERT gene was identified. Partial sequence analysis of the BAC clone (PB274G11) confirmed the presence of TERT sequences (accession no. AY864927). The BAC library was created in our laboratory from the genomic DNA of a Taihu pig (unpublished data). Fluorescence in situ hybridization: Fluorescence in situ hybridization (FISH) was carried out on pig chromosome preparations, as described previously by Yerle et al.2 The BAC clone PB274G11 containing the porcine TERT gene was used as a probe. FISH was performed using 1 lg of digoxingenin-labelled BAC DNA. Radiation hybrid mapping: To confirm the cytogenetic localization obtained by FISH, the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid panel (IMpRH)3 was analysed. Primers and PCR conditions for RH mapping were the same as those used for screening the BAC library. Chromosomal location: The chromosomal location of the porcine TERT gene on the subtelomeric band of chromosome 16 was determined by FISH of porcine BAC clone PB274G11 (Fig. 1). The precise localization was confirmed by analysis of the porcine IMpRH radiation hybrid panel. These results indicate that the porcine TERT gene is localized on chromosome 16q23
2005 International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 36, 258–286
271
