Mendelova zemědělská a lesnická universita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Určování paternity u psů Bakalářská práce
Brno 2006
Vedoucí bakalářské práce:
Vypracovala:
Prof. Ing. Josef Dvořák, CSc.
Michaela Škrobánková
2
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma „Určování paternity u psů“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické university v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně, dne …………………… Podpis: ………………………..
3
Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala vedoucímu mé bakalářské práce panu Prof. Ing. Josefu Dvořákovi, CSc. a Ing. Kateřině Svobodové za cenné rady při zpracování bakalářské práce. Srdečně také děkuji svým rodičům a svému příteli za podporu při studiu a hlavně v životě.
4
ANNOTATION Man considers dog behind the best friend.Therefore ours aim is také care of dog to the nines and keep in purity breed with reference to their health. For this purpose very well serves paternity determination. Earlier have been using blood groups to determination paternity in dogs. Disadvantage blood groups was exacting testing and preparation specific reagent. Therefore verification paternity began pursue by the help of biochemical polymorphic markers like albumin, transferrin, leucine aminopeptidase, acid phosphatase and tetrazolium oxidase. Determination paternity by the help of these markers is still doing in some dog breed, for example Hovawart. Continuous development molecular genetics brought new, simpler and less expensive method such as determination paternity by the help of microsatellites. Advantage microsatellites is their high polymorphism, thanks to which are very suitable for verification origin. Today there isn't yet uniform and legitimate microsatellite panel for dogs, most laboratories derive benefit from American Kennel Club panel or ISAG panel (International Society of Animal Genetics). Into the future supposes usage Single Nucleotide Polymorphism of DNA (SNPS).
ANOTACE Člověk považuje psa za nejlepšího přítele. Proto naším cílem je starat se o psa co nejlépe a uchovávat čistokrevnost plemen s ohledem na jejich zdraví. K tomuto účelu velmi dobře slouží určování otcovství (paternity). Dříve se určovalo otcovství pomocí krevních skupin. Nevýhodou krevních skupin bylo náročné testování a příprava specifických
reagentů.
Proto
se
ověřování
otcovství
začalo
provádět
pomocí
biochemických polymorfních znaků. Určování pomocí těchto znaků se stále ještě provádí např. u plemene hovawart. Neustálý rozvoj molekulární genetiky přinesl nové, jednodušší a méně nákladné metody jako je určování paternity pomocí mikrosatelitů. Výhodou těchto mikrosatelitů je jejich vysoký polymorfismus, díky kterému jsou velmi vhodné pro ověřování původu. Dnes stále ještě není jednotný a všeobecně uznávaný panel mikrosatelitů pro psy, většina laboratoří proto využívá panelu American kennel clubu nebo panelu ISAG (International Society of Animal Genetics). Do budoucnosti se předpokládá využití jednonukleotidových polymorfismů DNA (SNPs).
5
OBSAH 1. Úvod 1.1 Pes domácí 1.1.1 Evidence původu psů 1.1.2 Ověřování původu u psů 1.1.3 Určování paternity u psů
2. Tradiční metody ověřování původu 2.1 Historický pohled na ověřování původu 2.2 Ověřování původu pomocí krevních skupin 2.2.1 Krevní skupiny 2.2.2 Krevní skupiny u psů
2.3 Ověřování původu pomocí biochemických polymorfních znaků 2.3.1 Praktické využití polymorfních znaků při ověřování původu 2.3.2 Polymorfní znaky v erytrocytech u psů 2.3.3 Polymorfní znaky v krevním séru a v krevní plazmě u psů 2.3.4 Současné využití biochemických polymorfních znaků
3. Metody genomiky v ověřování původu 3.1 Genetický polymorfismus 3.1.1 Polymorfismus DNA
3.2 Genetické markery 3.2.1 Minisatelity 3.2.2 Mikrosatelity 3.2.3 Jednonukleotidový polymorfismus (SNP)
3.3 Ověřování původu pomocí mikrosatelitů 3.4 Ověřování původu pomocí jednonukleotidových polymorfismů 3.5 Způsoby získávání biologických vzorků 4. Ověřování původu psů v ČR 4.1 Podklady k ověřování původu psů v ČR 4.2 Laboratoře v ČR provádějící testy 5. Závěr 6. Seznam použité literatury
6
SEZNAM TABULEK Tab. 1. Krevní skupiny u psů podle Saison a Coling (1979) Tab. 2. Přehled polymorfních znaků (Dostál, 1995) Tab. 3. Panely mikrosatelitů ISAG (2002) Tab. 4. Panel pro ověřování rodičovství ISAG (2005) Tab. 5. Panel American Kennel Clubu (2006)
7
1. Úvod 1.1 Pes domácí Pes domácí (Canis familiaris) je dnes nejvíce doma chovaným zvířetem na celém světě. V lidské společnosti zaujímá zcela zvláštní postavení. Člověk používal psy nejrůznějším způsobem jako strážce, průvodce, lovce, bojovníky, jako hubitele hlodavců, tažná zvířata i pro zahřívání nohou. Právě tak sloužil pes jako zdroj srsti či masa. Dnes je chován hlavně jako společník. Rozvíjí se také jeho úloha jako asistenta nebo v oborech humánní medicíny jako je canisterapie.
1.1.1 Evidence původu psů
Evidence psů se provádí prostřednictvím ČMKU (Českomoravská kynologická unie), která vede příslušné plemenné knihy daného plemene uznané FCI (Federation Cynologique Internationale), ve kterých je jedinec zapsán. Plemenné knihy evidují vržená štěňata a vystavují pro ně průkazy původu a zapisují i dovezené jedince. Pro každé plemeno je vedena vlastní číselná řada a vše je pod přísnou kontrolou. Při zápisu štěňat do plemenné knihy se vychází z předpisů jednotlivých chovatelských klubů. Pro všechny však platí povinnost přihlásit vrh k zápisu celý najednou a to nejpozději do 28 dnů stáří štěňat. V souladu s platným chovatelským řádem musí jména štěňat začínat od jednoho písmene a vrhy musí být řazeny abecedně za sebou. Průkaz původu je prvotní dokument, kterým plemenná kniha potvrzuje z pověření FCI, že daný jedinec je toho kterého plemene, pochází z rodičů, kteří splnili všechny náležitosti chovných jedinců, a že tento jedinec pochází z chovu uvedeného chovatele, který je toho všeho právní zárukou. Obsahuje: název a značku FCI, plemeno, pohlaví, jméno včetně názvu chovné stanice, datum narození, značku plemenné knihy (která jej vydala), číslo zápisu, tetovací číslo nebo kód čipu, zbarvení, druh srsti, jméno chovatele, adresu chovatele, podpis chovatele, potvrzení plemenné knihy, výsledky výstav, změny majitelů, výsledky zkoušek, vysvětlivky, poznámky a čtyři generace předků (rodokmen). (DOSTÁL et al., 1997) Průkaz původu je vystaven na formuláři uznaném FCI a označeném znakem FCI a ČMKU. Pro každého jedince je vystaven jen jeden průkaz původu., který je příslušenstvím
8
tohoto jedince. Chovatel je povinen předat průkaz původu nabyvateli tohoto jedince bez zbytečného odkladu po té, co jej obdržel z plemenné knihy ČMKU, kterou byl průkaz původu vystaven. Zápisy do rodokmenu smí provádět pouze plemenná kniha ČMKU. Podle chovatelského a zápisního řádu ČMKU je chovatelem držitel chovné feny v době vrhu, jehož chovatelská stanice byla řádně zaregistrována. Plemeno psů ve smyslu řádu ČMKU tvoří čistokrevní psi a feny s platným průkazem původu, odpovídající plemennému standartu FCI. Čistokrevný pes nebo fena je chovný jedinec, který je zapsán do plemenné knihy uznané FCI. Chovatelé,
majitelé,
držitelé
a
příznivci
jednotlivých
plemen
se
sdružují
v chovatelských klubech. Chovatelský klub je samotný právní subjekt. Tyto kluby se dále mohou sdružovat ve větší celky, které se pak stávají členy střešní kynologické organizace v ČR a to Českomoravské kynologické unie (ČMKU). Ta pak zastupuje všechny v ní sdružené kynology v mezinárodní kynologické organizaci Federation Cynologique Internationale (FCI). Cílem CMKU je chov čistokrevných plemen psů při zachování biologického zdraví každého jedince a charakteristických vloh pro jednotlivá plemena. Základní chovatelskou normou je plemenný standart FCI v plném rozsahu. Chovatelský řád CMKU se zabývá zápisy psů do plemenné knihy a vystavování průkazu původu.
1.1.2 Ověřování původu psů
Ověřování původu se provádí, jestliže si nejsme jisti zda daná štěňata jsou opravdu potomky uvedených rodičů. Provádí se také u některých chovatelských klubů při každém zařazení čistokrevných jedinců do chovu. A to z důvodu jednak zabezpečení čistokrevnosti chovu a za druhé omezení rozšiřování dědičně podmíněných chorob psů. Dnes je cena čistokrevných psů velmi vysoká, proto by každý budoucí majitel psa chtěl mít jistotu, že předci uvedení v průkazu původu psa jsou opravdu také jeho rodiče. Pro ověření identity chovných jedinců a jejich odchovů je výbor chovatelského klubu oprávněn nařídit krevní zkoušku. Podle výsledku nese náklady chovatel nebo chovatelský klub. Tyto zkoušky není potřeba provádět v případech, kdy se ve vrhu štěňat objeví štěně takového zbarvení, které není geneticky možné (DOSTÁL, 2006). V některých případech jsou však nutné. DOSTÁL (2006) uvádí příklad z praxe, kdy nezkušený chovatel byl s fenou českého fouska u krytí psa rovněž málo zkušeného majitele. Pes fenu kryl, ale nesvázali se spolu. Majitel psa poradil chovateli, aby to zkusil u jiného psa, protože se domníval, že
9
z takového krytí nemohou být štěňata. Chovatel teda nechal ještě týž den nakrýt fenu jiným psem. Opět nedošlo ke svázání. K překvapení všech fena porodila typická štěňata českého fouska. Potvrzení o krytí neměl ani od jednoho majitele psa, proto bylo zapotřebí provést určení původu. Po ověření bylo zjištěno, že ve vrhu je jedno štěně s prokazatelným původem po jednom ze psů. Ostatní štěňata mají genotyp odpovídající genotypům obou psů. Vrh byl zapsán, ale štěňata s neověřeným původem byla ponechána mimo chov.
1.3.1 Určování paternity u psů
Termín určování paternity (otcovství), jako ověření původu, pochází z oboru soudního lékařství, kdy se předpokládalo, že matka je vždy jistá, zato otec nejistý. Mnoho chovatelů psů a chovatelských klubů stále tento termín používá v souvislosti s ověřování původu u psů. Dnes je pomalu termín určování paternity nahrazován výstižnějším termínem a to určování parentity (rodičovství). Aby má práce byla jasná pro všechny, používám ve své bakalářské práci pojem ověřování původu, do nějž lze určování paternity zahrnout, neboť metody pro ověřování původu jsou shodné s metodami určování paternity. Cílem mé bakalářské práce je vyhledat v literatuře a dostupných zdrojích informace o metodách určování paternity, zpracovat tyto metody, seznámit se s nimi a v budoucnu využít těchto poznatků pro další studium. Dané téma jsem si vybrala kvůli své velké lásce ke psům a také proto, abych lépe pochopila genetické problémy v dané oblasti a mohla svých nabytých zkušeností využít např. ve vlastním chovu.
10
2. Tradiční metody ověřování původu
2.1 Historický pohled na ověřování původu Šedesátá a sedmdesátá léta dvacátého století byla ve znamení úspěšného rozvoje nových odvětví genetiky, jako je imunogenetika nebo biochemická genetika. U psů byly úspěšně rozpracovány nové metody určování krevních skupin, které patří mezi imunogenetické znaky, jakož i metody biochemických polymorfních znaků, které jsou předmětem studia biochemické genetiky. Praktické využití těchto unikátních genetických znaků spatřuje FCI zaprvé v tom, že charakterizují jedince jako samostatné individuum. Genotyp jedince, jak již víme, je neměnný od narození do jeho smrti, a proto mohou tyto znaky sloužit jako nezaměnitelný identifikační znak. A druhým, neméně důležitým aspektem rozvoje těchto odvětví genetiky je možnost ověřování původu u psů. Snahou všech poctivých chovatelů na celém světě je zakládat chov jen na pravých jedincích, u nichž je záruka původu. Jen takoví jedinci mohou sloužit ke studiu dalších genetických vztahů a závislostí, jen takoví jedinci jsou základem dalšího zušlechťování plemene a rozvoje jeho chovu. (DOSTÁL, 1977)
2.2 Ověřování původu pomocí krevních skupin 2.2.1 Krevní skupiny
Pojem krevní skupiny se používá na označení individuálních rozdílů ve zvláštnostech červených krvinek lidí a zvířat. Tento pojem se dá rozšířit i na individuální rozdíly v leukocytech, krevních destičkách, sérových antigenech a typech hemoglobinů. Prvním důkazem o existenci krevních skupin bylo Landsteinerovo zjištění, že krevní sérum některých lidí má schopnost shlukovat krvinky některých jiných osob. Tento jev se pozoroval již koncem 19. století. V tom čase ho však vysvětlovali jako projev patologických změn v krvi. O něco později, v roce 1901, Landsteiner zjistil, že i červené krvinky (erytrocyty) celkem zdravých lidí jsou aglutinované krevním sérem jiných osob. Na základě těchto nálezů Landsteiner rozdělil krvinky lidí na 3 skupiny: A, B, C. Skupinu
11
C později označil jako 0. O rok později byla objevena skupina AB. Současně se dokázalo, že tyto krevní skupiny jsou podmíněně dědičné. Nález individuálních rozdílů v erytrocytech lidí dal podmět k výzkumu stejného směru i u zvířat. Systematický vývoj této problematiky začíná ve čtyřicátých a padesátých letech dvacátého století, kdy pan Irwin dává podmět k výzkumu krevních skupin u hovězího dobytka, ovcí, drůbeže a holubů, a který také zavedl pojem imunogenetika, na označení vědy, která se zabývá dědičností krevních skupin a je založená na imunologické technice. Od té doby se ve výzkumu krevních skupin u různých druhů zvířat dosáhl značný pokrok. Zjišťují se nové způsoby identifikace krevních skupin a podrobně se rozpracovává otázka jejich dědičnosti, vývinu v průběhu ontogeneze a jejich vztahů k určitým ukazatelům produkce atd. Termín krevní skupiny označuje individuální zvláštnosti červených krvinek. Tyto zvláštnosti jsou podmíněné přítomností určitých substancí, rozmístěných na povrchu červených krvinek, a nazýváme je antigeny. Antigen se zpravidla definuje jako substance, která se vyznačuje dvěma vlastnostmi: A. při parentální zavedení do jiného jedince stimulují tvorbu protilátek a za B se zodpovídající protilátkou je schopný reagovat určitým způsobem, který může být detekovaný pomocí vhodného imunologického testu. Přítomnost jednotlivých antigenních faktorů je dědičně podmíněná. Erytrocytární antigeny A, B, 0 v systému člověka a pravděpodobně i v některých systémech krevních skupin u jiných druhů zvířat jsou ve své chemické podstatě mukopolysacharidy. Jejich chemická povaha faktoru A a B byla u lidí velmi pečlivě prozkoumána. Cizí antigen zavedený parenterálně do organismu podněcuje tvorbu protilátek. Protilátky vůči erytrocytárním antigenům jsou v podstatě gamafrakcemi sériových globulinů. Jsou specifické, tj. reagují jenom s těmi antigeny, které se použily na stimulaci jejich tvorby. Jsou různé typy reakcí antigen – protilátka. Při určování krevních skupin se nejčastěji používají reakce aglutinace a hemolýzy, které sledujeme in vitro ve zkumavce a nebo na podložním sklíčku. Přítomnost nebo nepřítomnost antigenu se dokazuje na základě jeho reakce (a nebo chybění jeho reakce) s příslušnou protilátkou. Protilátky můžeme rozdělit na základě jejich původu na dvě velké skupiny, a to normální, čili přirozené, a imunní. Normální protilátky se vyskytují v séru bez předchozí imunizace a jsou schopné reagovat s krvinkami jiných jedinců. Příkladem normálních protilátek jsou anti-A a anti-B protilátky v séru člověka skupiny 0. U zvířat se normálně protilátky tohoto typu vyskytují zřídka.
12
Imunní protilátky vznikají jako důsledek imunizace jednoho jedince druhým. Když se uskuteční imunizace mezi jedinci stejného druhu (izoimunizace), vzniklé protilátky nazýváme izoimunní. Jestliže dárce a příjemce patří ke dvěma různým druhům, vznikající protilátky se nazývají heteroimunní. (KARAKOZA et al., 1964)
2.2.2 Krevní skupiny u psů
První zprávy o studiu krevních skupin u psů podává YOUNG et al. (1950). Popsal výskyt pěti erytrocytárních izoantigenů u psů. Na jeho práci navazuje SWISHER et al. (1961), který nalezl již osm antigenů a prostudoval jejich genetickou kontrolu. V roce 1973 bylo navrženo označovat erytrocytární antigeny u psů symboly CEA 1, CEA 2 atd.. jako Canine Erythrocyte Antigens (VRIESENDORP et al., 1973). Toto označení však neodpovídá mezinárodním potřebám, poněvadž zkratkou CEA jsou označeny karcinogenní embryonální antigeny. Proto SAISON a COLLING (1979) navrhují označení DEA – Dog Erythrocyte Antigens.
Tab. 1: Krevní skupiny u psů podle Saison a Colling (1979)
Lokus
Faktory
Alely
Genotypy
Fenotypy
(neznámý antigen) A
a1 a
Aaa1 Aa A-
Aaa1Aaa1, Aaa1Aa, Aaa1AAaAa, AaAA-A-
A (aa1) A (a) A (-)
B
a
Ba B-
BaBa, BaBB-B-
B (a) B (-)
C
a
Ca C-
CaCa, CaCC-C-
C (a) C (-)
D
a
DaDa, DaDD-D-
D (a) D (-)
F
a
Da DFa F-
F (a) F (-)
Tr
tr o
FaFa, FaFF-FTrtrTrtr, TrtrTro, TrtrTrTroTro, TroTrTr-Tr-
Trtr Tro Tr-
Tr (tr) Tr (o) Tr (-)
13
Nevýhodou krevních skupin u psů pro ověřování původu je náročné testování a příprava specifických reagentů. Mimo to systémy krevních skupin u psů nejsou tak zvaně uzavřené, to znamená, že fenotypické vyjádření např. homozygota DaDa je stejné jako vyjádření heterozygota DaD-. Tato skutečnost dovoluje jen velmi omezené využití krevních skupin u psů pro ověřování původu.(DOSTÁL, 1995) V souvislosti s pojednáním o krevních skupinách u psů nelze opomenout studie DUNGERNA a HIRSCHFELDA (1910), kteří popsali u psů přítomnost podobných antigenů, jako je AB0 systém u člověka. Později ZWEIBAUM et al. (1966) prokázali, že tyto antigeny jsou přítomny v sekretu mukózních buněk trávicího traktu u psů a že jsou velmi podobné systému antigenů označovaných Tr, později CEA 7 a dnes opět Tr. Tento přirozený systém u psů je tříalelový (A,X,Y), jak popsal ZWEIBAUM a STENDLER (1969). Pro dosti složité testování není ani tento systém využíván jako identifikační znak nebo znak vhodný pro ověřování původu u psů (DOSTÁL, 1995).
2.3 Ověřování původu pomocí biochemických polymorfních znaků 2.3.1 Praktické využití polymorfních znaků při ověřování paternity a původu psů
Pro ověřování původu jsou vhodné jen ty polymorfní znaky (systémy), u nichž jsou alely v kodominantním genetickém vztahu, jejich fenotyp se nemění během života jedince a dají se snadno testovat bez ohrožení životních funkcí jedince. Pro ověřování původu se tedy nehodí genetické znaky testované ve tkáních vnitřních orgánů těla psa a nevhodné jsou také genetické znaky mléka, semenné plazmy, případně dalších tekutin, které jsou produktem pouze jednoho pohlaví. Pro ověření původu nelze zatím využít hemoglobin, který nebyl nalezen u našich plemen polymorfní. Mohou být snadno využity následující systémy polymorfních znaků: ♦ Kyselá fosfatáza ♦ Tetrazolium oxidáza ♦ Albumin ♦ Transferin ♦ Leucinaminopeptidáza
14
Jejich vhodnost se však poněkud mění podle plemene a podle individuálních podmínek každého případu. Proto nelze při ověřování původu žádný z uvedených znaků vynechat. Z dalších známých polymorfních systémů mohou být perspektivně využity ještě peptidáza D (Pep D) a glukózofosfátizomeráza (GPI). U hospodářských zvířat jsou polymorfní znaky využívány jako doplněk krevních skupin. Poněvadž krevní skupiny u psů nejsou pro tento účel vhodné, jsou polymorfní znaky jedinými využitelnými znaky pro kontrolu plemenářské práce v chovu psů. (DOSTÁL, 1995)
Tab. 2: Přehled polymorfních znaků (Dostál, 1995)
Systém kyselá fosfatáza (AP) tetralium oxidáza (TO) albumin (Alb) transferin (Tf) leucinaminopeptidáza (Lap)
Zdroj erytrocyty erytrocyty krevní sérum krevní sérum
krevní sérum
Alela F S A B F S A B C A B
f. ČF 0,13 0,87 0,93 0,07 0,42 0,58 0,02 0,48 0,5 0,88 0,12
f. KO 0,1 0,9 0,83 0,17 0,41 0,59 x 0,4 0,6 0,87 0,13
f. NF 0,08 0,92 1 x 0,44 0,56 0,06 0,52 0,42 0,93 0,07
Vysvětlivky: f – frekvence, ČF – český fousek, KO – krátkosrstý ohař, NF – novofundlandský pes
2.3.2 Polymorfní znaky v erytrocytech u psů ♦ Kyselá fosfatáza První zprávy o polymorfismu kyselé fosfatázy u psů podává HEIDEL (1968). Jako dvoualelový kodominantní systém kyselé fosfatázy, řízený z jednoho autozomálního loku, popsali v hemolytázu erytrocytů u psů BRAEND a AUSTAD (1973). Autoři jej nazvali systém kyselé fosfatázy, protože tento polymorfní enzym štěpí v kyselém prostředí fenolftalein difosfát na fenolftalein. Rychleji putující frakci ve škrobovém gelu označují Pac F a pomaleji putující Pac S. U popsané skupiny psů plemene labrador retviever byly nalezeny frekvence Pac F = 0,13 a Pac S = 0,87. WEIDEN et al. (1974) popsali výskyt pouze jedné varianty kyselé fosfatázy. DOSTÁL (1981) popsal polymorfismus kyselé
15
fosfatázy u našich ušlechtilých plemen psů, s podobně nižší frekvencí Pac F, než uvádí původní autoři. ♦ Tetrazolium oxidáza Dvoualelový systém tetrazolium oxidázy v hemolyzátu erytrocytů psů popsali BAUR a SCHOOR (1969). Autoři zjistili, že jde o kodominantní autozomální řízení tohoto polymorfního systému z jednoho loku. U většiny plemen je popsána frekvence tetrazolium oxidázy TO A = 0,94 a TO B = 0,06. U německých ovčáků byla frekvence alel významně odlišná (TO A = 0,8 a TO B = 0,20). Elektroforetický obraz psí TO A je velmi podobný lidskému obrazu tetrazolium oxidázy. Hemolyzát lidských erytrocytů proto může sloužit jako standart při studiu tetrazolium oxidázy u psů. Podobné výsledky uvádí též KHAN et al. (1973), WEIDEN et al. (1974), SIMONSEN (1976) a DOSTÁL (1981). ♦ Peptidáza D Škrobovou elektroforézou popsala SAISON (1972) polymorfismus peptidázy D v hemolyzátu erytrocytů u psů. Studiem rodin prokázala, že jde o dvoualelový kodominantní autozomální systém s frekvencí alel Pep-Da = 0,76 a Pep-Db = 0,24 u testované skupiny psů. Tyto výsledky rovněž potvrdila KHAN et al. (1973). ♦ Glukózofosfátizomeráza Genetický polymorfismus glukózofosfátizomerázy (GPI) popsali TANABE et al. (1977) v hemolyzátu erytrocytů šesti plemen psů chovaných v Japonsku. GPI je kontrolována dvěma kodominantními alelami z jednoho autozomálního loku. Frekvence GPI A = 0,962 a frekvence GPI B = 0, 038.
2.3.3 Polymorfní znaky v krevním séru a v krevní plazmě u psů ♦ Albumin DAY et al. (1971) popsali polymorfismus sérového albuminu psů pomocí elektroforézy ve škrobovém gelu. Sérový albumin u psů je kontrolován dvěma kodominantními alelami (Alb F a Alb S) z jednoho autozomálního loku. Distribuce albuminu je charakterizována frekvencemi alel Alb F = 0,57 a Alb S = 0,43. Tyto výsledky potvrdil také MGHENI et al. (1979).
16
TOWENSLEY et al. (1972) navrhují označení rychlejší frakce Alb A a pomalejší frakce Alb B. Popsali frekvence Alb A = 0,435 a Alb B = 0,565. Výsledky analýzy rodin uvádí VRIESENDORP et al. (1973). Naproti tomu SIMONSEN (1976) nalezl v populaci 197 psů jen jednoho heterozygota, i když ke studiu používal popsané metody škrobové elektroforézy podle DAEY et al. (1971). Stejnou metodou elektroforézy ve škrobovém gelu byl pozorován a popsán polymorfismus albuminu u našich plemen psů (DOSTÁL, 1981). ♦ Transferin BRAEND (1966) podobně jako STEVENS a TOWNSLEY (1970) popsal polymorfismus sérového transferinu u psů. Tato bílkovina je kontrolována třemi kodominantními alelami Tf A, Tf B a Tf C z jednoho autozomálního loku. Ke studiu transferinu u psů doporučuje používat jednodušší metodu elektroforézy v agarozovém gelu. Tato metoda dává lepší výsledky než metoda elektroforézy ve škrobovém gelu. STEVENS
a
TOWNSLEY
(1970)
pozorovali
menší
výskyt
homozygotů
v transferinovém typu při páření heterozygotů mezi sebou. Rovněž tak VRIESENDORP et al. (1973) pozorovali menší výskyt homozygotů Tf AA při páření heterozygotů mezi sebou a při páření jedinců genotypu Tf AA x Tf AB. Počet těchto páření však nebyl natolik velký, aby stačil k seriózním genetickým závěrům. Ve studované populaci byly frekvence Tf A = 0,611, Tf B = 0,373, Tf C = 0,016 a byly v souladu s frekvencemi předpokládanými. Elektroforézou ve škrobovém gelu popsal REETZ et al. (1976) u psů výskyt dvou odlišných transferinů, které označil jako Tf M1 a Tf M2. Analýzou rodin prokázal, že tu jde o dvě kodominantní alely jednoho autozomálního loku. Vyslovuje domněnku, že se mu touto technikou podařilo rozlišit mezi BRAENDEM (1966) popsanými alelami Tf F, Tf M a Tf S ještě další. K mezinárodnímu porovnání nomenklatury však nedošlo. Polymorfismus sérového transferinu u psů potvrdili další autoři, jako VRIESENDORP et al. (1973), KNAPP a HUNTER (1975), SIMONSEN (1976), REETZ et al. (1980), DOSTÁL (1981) a JUNEJA et al. (1981).
17
♦ Leucinaminopeptidáza Genetický polymorfismus leucinaminopeptidázy v krevní plazmě u psů popsali TANABE et al. (1974). Analýza rodin ukázala, že jde o dvoualelový systém kodominantních alel Lap A a Lap B, řízených z jednoho loku. U většiny studovaných plemen psů v Japonsku byly frekvence Lap A = 0,97 a Lap B = 0,03. SIMONSEN (1976) tento polymorfismus nepozoroval. Byla vyslovena domněnka, že jde o charakteristický znak japonských plemen psů. Polymorfismus Lap však byl potvrzen u plemene český fousek, německý krátkosrstý ohař a novofundlandský pes (DOSTÁL, 1981), čímž byla domněnka o charakteristickém znaku vyvrácena.
2.3.4 Současné využití biochemických polymorfních znaků
Dnes tyto polymorfní znaky využívá hlavně Hovawart klub České republiky, který má v chovatelském řádu ujednán povinnou kontrolu původu chovných jedinců po bonitaci. Tato kontrola a doplňování databanky je prováděno na bázi polymorfních znaků jako je albumin krevní plazmy, transferin krevní plazmy, leucinaminopeptidáza, alkalická fosfatáza a superoxide dismutase (tetrazolium oxidáza). Stačí jedna nesrovnalost při komparaci výsledků analýz rodičů a potomek (celý vrh) je nesouhlasný.
18
3. Metody genomiky v ověřování původu K ověřování paternity, ale i ověřování původu (parentity), se využívá také polymorfismu DNA, který je o několik řádů vyšší než polymorfismus proteinů. Dříve se paternita u psů určovala jen pomocí biochemických polymorfních znaků, dnes se tato metoda využívá jen u plemene hovawart. Rozvoj molekulární genetiky přinesl nové, jednodušší a méně nákladné metody jako je určování paternity pomocí mikrosatelitů a dnes velmi diskutovaná metoda detekce jednonukleotidových polymorfismů DNA (SNP). Na rozdíl od dříve používaných proteinových znaků, které mají při kontrole hodnotu jen vylučovací (krevní skupiny u zvířat), DNA polymorfismus poskytuje nesčetné varianty, takže jeho hodnota je i identifikační (HRUBAN a MAJZLÍK, 2000). Strukturální studie DNA psů pomohly popsat další množství polymorfních oblastí vhodných pro dokonalou identifikaci jedince a ověření jeho původu. Dnes je popsáno více než 150 000 tzv. mikrosatelitních úseků DNA, markerů dvou, tří a čtyřalelových, které dávají již nevypočitatelné množství kombinací. To znamená, že je již možné najít skutečné rodiče psa mezi desítkami tisíc jedinců. Samozřejmě je to jen otázkou výběru metod a nákladů na takovou analýzu. (DOSTÁL, 2006)
3.1 Genetický polymorfismus Jako polymorfismus označujeme v populaci současnou existenci dvou nebo více mutantních alel genu umístěného v příslušném lokusu na chromozomu. Lokusy, v nichž se takový gen nachází, se označují jako polymorfní. (ROSYPAL et al., 2002) Polymorfismus (řec. polys = mnohý, morfe = tvar) lze prvotně pozorovat na úrovni DNA (vznikající záměnami nukleotidů nebo vznikem nukleotidových repetic). Polymorfismus DNA se zčásti může (nadbytečnost kódu aj.) projevit v molekulárním polymorfismu proteinů (záměna aminokyselin). Polymorfní mohou být také jednodušeji dědičné viditelné znaky (např. zbarvení, morfologické charakteristiky), ale protože je jich málo, genetickým polymorfismem rozumíme především dědičnou mnohotvárnost ve struktuře DNA a proteinů. (HRUBAN a MAJZLÍK, 2000)
19
3.1.1 Polymorfismus DNA
U nukleových kyselin jde zpravidla buď o bodovou variabilitu v sekvenci nukleotidů nebo o různé počty opakování nukleotidových motivů. Protože v sekvenci každých 50 – 200 nukleotidů je v populaci pozorována mutace (např. substituce) a průměrně velký strukturní gen má 1000 – 3000 párů bází, v podstatě ve všech strukturních genech, ale i v anonymních sekvencích existuje polymorfismus. Na úrovni DNA lze proto považovat za polymorfní gen, lokus, DNA sekvenci, ve kterých lze v populaci nalézt jakoukoliv strukturní alternativu (prvotně danou substitucí báze v DNA). (HRUBAN a MAJZLÍK, 2000) Při mapování genomu se využívá polymorfních genetických znaků – markerů.
HRUBAN a MAJZLÍK (2000) dělí polymorfismus podle podstaty strukturních změn v DNA na: ♦ Bodový polymorfismus Principem jsou rozdíly mezi jedinci dané záměnou báze v homologním místě DNA. Vznikl bodovými mutacemi. Protože u eukaryotů v rámci druhu je v každé délce 50 – 500 nukleotidů jedna záměna, prakticky v každém genu lze nalézt polymorfismus. Bodový polymorfismus je většinou dvoualelový, avšak pokud bychom štěpili stejnou DNA sekvenci (gen) různými restrikčními endonukleázami (rozpoznávající jiná restrikční místa) polymorfismus jednoho lokusu může být polyalelický. ♦ Repetitivní polymorfismus Podstatou tohoto polymorfismu je existence variabilních a hypervariabilních opakujících se sekvencí v genomu. Jedinci se od sebe liší počtem opakování určitých sekvencí tak, jak jdou tandemově za sebou. Obvykle se rozlišuje tzv. polymorfismus minisatelitní a mikrosatelitní DNA. Repetitivní sekvence nekódují proteiny a jejich polymorfismus vykazuje převážně mnohočetný alelizmus. Polymorfismus minisatelitní DNA V případě minisatelitní DNA jde o motivy v sekvenci dlouhé 209 – 60 nukleotidů, které se v genomu opakují 1000 – 100 000 krát. Pro mapování nejsou příliš vhodné, neboť jsou umístěné převážně v koncových částech chromozomů – telomérách.
20
Polymorfismus mikrosatelitní DNA Podstata tohoto polymorfismu je podobná, ale jde o opakování jednoduchých motivů v sekvenci, přičemž jedinci se liší podobně jako u minisatelitní DNA počtem opakování. Jsou velmi užitečné pro mapování, protože jsou pravidelně roztroušené v genomu.
3.2 Genetické markery Genetický marker je vysoce polymorfní znak, který vykazuje mendelistickou kodominantní
dědičnost,
je
snadno
a
jednoznačně
detekovatelný
(KNOLL
a
VYKOUKALOVÁ, 2002). Markery jsou tvořeny sekvencemi bází na specifickém fyzickém místě genomu (lokusu), tyto sekvence jsou variabilní mezi jedinci. Lze u nich zachytit nejvyšší stupeň genetické variability. (KNOLL a URBAN, 2002). Molekulárně genetických markerů využívá obor DNA diagnostika, který detekuje nejrůznější typy polymorfismů, které slouží k určování rodičovství u zvířat.
Molekulárně genetické markery mají tyto výhody: ♦ Jsou početné a relativně snadno identifikovatelné ♦ Jsou vysoce informativní ♦ Mohou být typovány z malého množství tkáně v libovolném věku jedince ♦ DNA může být dlouhodobě archivována ♦ Lze se k analýze opakovaně vracet (KNOLL a VYKOUKALOVÁ, 2002) Většina autorů rozděluje genetické markery do tří typů:
I.
typ – jsou to kódující exprimované geny. Využívají se v srovnávacím mapování. Díky své nízké hladině polymorfismu jsou málo použitelné pro studie diversity rodin a populací.
II.
typ – jsou to vysoce variabilní sekvence DNA. Využívá se především minisatelitů a mikrosatelitů. U mikrosatelitů je vysoký stupeň polymorfismu, díky tomu jsou vysoce informativní při určování rodičovství. Někdy bývají mikrosatelitní sekvence označovány jako STRs (Short Tandem Repeats).
21
III.
typ – jsou to jednonukleotidové polymorfismy označované jako SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Nacházejí se uvnitř kódujících genů, ale i v intronech nebo v mezigenových částech DNA. Vyskytují se v genomu přibližně každých 500–1000 bp (KNOLL a URBAN, 2002).
Dělení markerů podle charakteru svého polymorfismu:
1) Polymorfismus délky restrikčních fragmentů - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2) Polymorfismus v délce sekvence - SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism). Zde patří mikrosatelity, minisatelity a vzácně se vyskytující delece nebo inzerce v intronové části. 3) Polymorfismus jednotlivých nukleotidů - SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
3.2.1 Minisatelity
Minisatelity neboli VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) patří mezi satelitní prvky DNA. Satelitní DNA je tvořena z tisíce opakujících se jednotek v rozsahu 10010.000 bp (párů bází), kde v koordinaci s několika bílkovinnými faktory, se podílí na struktuře centroméry. Jestliže jsou opakující se jednotky v rozsahu od 10 do 100 bp, nazývají se minisatelity. Polymorfismy minisatelitních sekvencí se většinou analyzují pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) nebo pomocí Southernova blotu. (VAIMAN, 2005) Podle ROSYPAL et al. (2001) jsou minisatelity tandemové repetice, jejichž jednotka má délku 9-24 bp a četnost 60 na chromozomu. Protože mezi nepříbuznými jedinci nelze nalézt identický typ opakování, tyto vzory rozštěpené minisatelitní DNA jsou svou složitostí podobné otiskům papilárních linií a jsou proto označovány jako DNA finger-printy (HRUBAN a MAJZLÍK, 2000). Jako DNA fingerprint nazývají minisatelity také GRIFFITHS et al. (2000). Minisatelity se většinou využívaly ve forenzní medicíně, dnes jsou však prakticky minisatelity vytěsněny používáním mikrosatelitů.
22
3.2.2 Mikrosatelity
Mikrosatelity (syn. STR – short tandem repeats, SSR – simple sequence repeat) jsou krátké tandemové repetice složené z mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidových motivů. Vyskytují se ve všech eukaryotických genomech, ale jejich funkce je stále diskutabilní. Významnou vlastností je vysoký stupeň polymorfismu způsobený variabilním počtem tandemových repetic (obvykle 10-30). (KNOLL a VYKOUKALOVÁ, 2002) Délka základních mikrosatelitních elementů se pohybuje od 1 do 6 bp (VAIMAN, 2005). Nejčastěji se vyskytující repeticí u savců je motiv (AC)a, který je v genomu zvířat přítomen v 50-100 000 kopií. ROSYPAL et al. (2001) označuje mikrosatelity jako tandemové repetice o délce 2-6 bp s četností max. 60. Mikrosatelity
byly nejvíce užitečné
v poskytování celé řady molekulárních markerů pro mapování lidského genomu (GRIFFITHS et al., 2000). Polymorfismus mikrosatelitů může být rychle a spolehlivě testován pomocí PCR a PAGE a automatizován pomocí fluorescenční kapilární elektroforézy. Proto jsou mikrosatelity vhodnými markery pro vazbové mapování genů a studium diversity včetně určování otcovství (paternity) a rodičovství (parentity). (KNOLL a URBAN, 2002) U psů byly nejčastěji zjištěny repetice (CA)n x (GT)n, které se vyskytovaly přibližně každých 43 kb. Naopak vzdálenost mezi mikrosatelity tri- nebo tetranukleotidovými byla průměrně kolem 320 kb. Jako silně polymorfní byla u psa zjištěna GAAA tetranukleotidová repetice (FRANCISCO et al., 1996). Tetranukleotidové repetice byly v psím genomu přítomny asi jedenkrát každých 100-200 kb (ZAJC et al., 1997). Mikrosatelity jsou užitečné genetické markery, protože délka repetice může být snadno zjištěna metodou PCR. Vyšetření na základě mikrosatelitů je relativně jednoduché a levné, proto se využívá v DNA diagnostice i pro forenzní účely v humánní medicíně.
3.2.3 Jednonukleotidový polymorfismus (SNP)
Jednonukleotidový polymorfismus neboli SNP je bodová mutace, která vznikla změnou jednotlivého nukleotidu (A,T,C nebo G). Mohla být způsobena záměnou jedné DNA báze jinou, ztrátou jedné báze, přehozením po sobě následujících bází nebo vložením další báze do stávající sekvence. Bodová mutace se v genomu vyskytují přibližně jednou
23
na každých 50-500 bp (HORÁK a DVOŘÁK, 2003). Aby byla mutace považována za SNP, musí se vyskytovat alespoň u 1 % populace (HUMAN GENOME PROJECT, 2004). U lidí tvoří SNP kolem 90 % z celkového polymorfismu DNA a vyskytují se každou 100-300 bází v průběhu tří miliard bází lidského genomu. (HUMAN GENOME PROJECT, 2004)
3.3 Ověřování původu pomocí mikrosatelitů V České republice je u většiny plemen prováděno ověřování původu na základě testace mikrosatelitů. Dnes stále ještě není žádný obecně a široce uznávaný panel mikrosatelitů pro ověřování u psů. Na 28. konferenci International Society of Animal Genetics ISAG konané 11.-15. srpna 2002 v Gottingenu (Německo) bylo zvoleno 23 markerů jako mezinárodně uznaný test původu u psů. Těchto 23 markerů bylo začleněno do dvou prvních panelů mikrosatelitů (viz tab. 3). Tyto mikrosatelitní markery byly poprvé testovány v srovnávacím testu ISAG 2001/02. Některé rozpory byly mezi laboratořemi pozorovány, částečně kvůli laboratornímu vybavení. Vývoj na mikrosatelitech stále pokračuje. ISAG (2002) uváděl ještě třetí panel mikrosatelitů, který obsahuje dalších šest markerů (viz tab. 3). ISAG (2005) uvádí další panel pro ověřování původu u psů (viz tab. 4), který obsahuje 24 lokusů ve čtyřech částech panelu.
Tab. 3. Panely mikrosatelitů ISAG (2002)
Panel 1 AHT 121 AHTh 171 AHTk 253 FH 2001 FH 2054 FH 2164 FH 2247 FH 2289 FH 2611 INRA 21 PEZ 08 C 22.279
Panel 2 AHTk 211 LEI 2D2 FH 2326 FH 2361 FH 2305 FH 2328 PEZ 03 PEZ 10 PEZ 11 PEZ 12 PEZ 22
Panel 3 FH 2148 FH 2161 FH 2165 FH 2200 FH 2293 FH 2324
24
Tab. 4. Panel pro ověřování rodičovství ISAG (2005)
Lokusy ISAG-1-A AHTk253 ISAG-1-B REN54P11 ISAG-2-A REN105L03 FH2848 ISAG-2-B INU005
AHT121 REN162C04 AHTH130 AHT137 INU030
FH2054 CXX279 INRA21 AHTk211 AHTh260 AHTh171 REN169O18 Amelomegin REN64E19 REN169D01 REN247M28 INU055
Další společností, která se ve světě zabývá ověřováním původu u psů, je American Kennel Club (AKC). AKC používá genetickou strukturu DNA pro ověřování původu jedinců u AKC registrovaných a také u jejich vrhů. Toto se realizuje dvěma programy a to: DNA certifikační program a Ověřovací program. Od října roku 1998 existuje u American Kennel Clubu povinnost testovat DNA všech psů, od nichž se odebírá sperma, nebo jejichž sperma je do USA dováženo. Vyšetřují se také celé chovné stanice, toto vyšetření provádí inspektoři AKC. Představenstvo AKC upevňuje svou vedoucí úlohu ve světě čistokrevných psů tím, že vyžadují DNA profily všech plemeníků, kteří mají často štěňata. Po 1. červenci 2000 se této certifikaci musejí podrobit všichni plemeníci, kteří měli 7 nebo více krytí ve svém životě, nebo 3 krytí během kalendářního roku. Tyto DNA profily budou použity pro genetickou identitu a pro ověření původu. (ČECHOVÁ, 2002) AKC používá pro určení genetické identity a ověření původu SuperPlex-G panel, který obsahuje 14 markerů (viz tab. 5). Je zde zahrnut i marker, který určuje pohlaví, aby poskytl ke kvalitnějšímu ověření původu. (American Kennel Club, 2006) Dříve American Kennel Club používal dva panely, které obsahovaly 17 mikrosatelitů. Pouze šest z nich bylo zároveň doporučováno i ISAGem (DeNISE et al., 2004). V laboratoři Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelovy zemědělské a lesnické university v Brně je pro ověřování rodičovství používán StockMarks for Dogs Genotyping Kit Canine (Applied biosystems), který laboratořím dodává firma Applera. Tento test obsahuje deset primerů, které odpovídají prvním deseti mikrosatelitům doporučovaných AKC (viz tab. 5).
25
Tab. 5. Panel American Kennel Clubu (2006)
Markery PEZO1 PEZ03 PEZ05 PEZ06 PEZ08 PEZ12 PEZ20 UCB2010 UCB2054 UCB2079
PEZ16 PEZ17 PEZ21 GEN
3.4 Ověřování původu pomocí jednonukleotidových polymorfismů HORÁK a DVOŘÁK (2003) uvádí, že nevýhodou využívání mikrosatelitů pro ověřování rodičovství je mimo jiné poměrně vysoká mutační rychlost těchto markerů. Proto je do budoucna předpokládáno nahrazení mikrosatelitů jednonukleotidovými polymorfismy (SNPs). Pro testování rodičovství a identifikaci jedince se plánuje sestavení panelu cca 40 – 60 SNPs, které budou genotypovány pomocí automatických metod. Při sestavování panelu je nutné zohlednit několik hledisek, např. selekční neutralitu. Dále pak umístění SNPs na odlišných chromozomech, četnost jednotlivých alel v populaci a variabilitu markerů v různých populacích (HORÁK a DVOŘÁK, 2003). Nevýhodou SNPs je omezené množství alel v populaci. V populaci mohou být až čtyři alely na SNP, většinou jsou pouze dvě. Informativnost jednoho SNPs je relativně malá. Výtěžnost se ovšem dá zlepšit paralelním zpracováním více SNPs. Je tedy potřeba více SNPs k získání té samé informace jako poskytuje jeden mikrosatelit, ale paralelní zpracování SNPs je daleko snazší. Pro detekci SNP se využívá metod DNA array (DNA chips, biochips). Jsou to nejnovější biotechnologické techniky využívající dvou základních strukturních vlastností dvoušroubovice DNA a to: sekvenční komplementarity a složení ze dvou řetězců (KNOLL a URBAN, 2003). Tato technika je postavena na principech hybridizace značeného vzorku DNA k DNA o známe frekvenci, která je umístěna ve formě teček na pevném povrchu, fóliích nebo sklíčkách. V místě, kde došlo k hybridizaci je lokalizována fluorescence, která je zaznamenána pomocí kamer a je analyzována pomocí počítačového programu. Tuto hybridizaci lze provádět na stovky až tisíce různých známých DNA a testovat tak
26
velké množství genů obsažených ve vzorku (KNOLL a URBAN, 2003). Podle velikosti se rozlišují na makro a microarray. Používá se metoda microarray, kdy se čip použije jen 1 krát, má vysokou denzitu a je možné je použít i pro detekci nových SNPs. Největší výhodou techniky microarray je její minituarizace, tedy že jsou aplikována velmi malá množství biologického materiálu, a její automatizace (KREJSEK, 2004) Využitím SNP pro ověřování rodičovství u psů se zabývali HORÁK a DVOŘÁK (2003). Ověřovali tyto SNPs: gen opsinu, který je lokalizován na chromozomu CFA20, gen von Willerbrandova faktoru (VWF), který je mapován na chromosom CFA16, a gen beta A3/A1 crystalinu (CRYB). Tyto SNPs ověřovali u plemen: německý ovčák, jezevčík, pudl, labrador retviever a anglický kokršpaněl. SVOBODOVÁ et al. (2005) zkoumali
vhodné SNPs do panelu pro určování
rodičovství na základě literárního přehledu a ověřovali variabilitu těchto SNPs u plemen psů: americký kokršpaněl, anglický kokršpaněl, pudl, německý ovčák a jezevčík. Zkoumanými SPNs byly: a) gen beta A3/A1 crystallinu (CRYB) – na 9. chromozomu. b) gen KIT ligand (KITLG) – na 15. chromozomu. c) gen transducinu-γ (GNGT1) – umístění je u psů neznámé. d) gen tyrosine-related proteinu 1 (TYRP1) – je umístěn na 11. chromozomu. Zjistili, že v genu CRYB se vyskytovaly všechny genotypy u plemen americký kokršpaněl, pudl a anglický kokršpaněl. U jezevčíka, německého ovčáka a anglického kokršpaněla převládala alela G, u pudla a amerického kokršpaněla alela T. Celkem bylo ve sledované populaci zjištěno 41 % alely G a 59 % alely T. V genu KITLG byly všechny tři možné genotypy nalezeny pouze u plemene pudl. Frekvence alely A byla v celé populaci 0,33 a alely G 0,67. V genu GNGT1 se u žádného z testovaných plemen se nevyskytl genotyp BB. U všech plemen výrazně převládala alela A, které bylo v celé populaci 95 %. Nejnižší meziplemenná variabilita v rozložení četnosti genotypů a alel byla zjištěna v genu TYRP1. Jediný zjištěný heterozygot byl plemene anglický kokršpaněl. Všichni ostatní jedinci byli monomorfní pro alelu N, četnost této alely tedy byla 0,99. Pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče (PE) je u genů KITLG, GNGT1 a TYRP1 nízká. Nejvyšší hodnoty byly pro všechny statistické charakteristiky vypočteny u genu CRYB. Z těchto výsledků vyvodili, že kromě CRYB tyto SNP nejsou vhodné pro využití při ověřování rodičovství a individuální identifikaci jedince. Zařazení genu CRYB do panelu pro testování rodičovství a individuální identifikaci jedince se zatím zvažuje.
27
3.5 Získávání biologických vzorků Genomová DNA se dá izolovat z krevních vzorků, z tkání, ze slin, ze spermatu nebo z chlupových cibulek psí srsti. K izolaci genomové DNA je vyvinuta řada metodik, jejich výběr a použití závisí na druhu získaného biologického vzorku. Laboratoř LAMGenu na MZLU v Brně používá většinou vzorky psí krve, ale už izolovala genomovou DNA z chlupových cibulek i slin psů. Ve světě je nejrozšířenější způsob izolace DNA ze stěru z bukální sliznice psů.
28
4. Ověřování původu psů v ČR 4.1 Podklady k ověřování původu psů v ČR Ověřování paternity u psů není nařízeno žádným zákonem, provádí se většinou pouze v případě nejasného původu psa. Např. když fenotyp potomků neodpovídá fenotypu otce ani matky. Žádost o ověření paternity nebo parentity může podat chovatel psa, budoucí majitel psa nebo ho může nařídit chovatelský klub daného plemene. U některých klubů v České republice je přímo povinností mít ověřený původ psa, jako např. u plemene hovawart, kvůli zajištění chovu jen čistokrevných jedinců, kteří nepřenáší geneticky dědičné choroby a vady. Hovawart club ČR provádí odběr krve po bonitaci nově uchovněným psům a fenám, který je pak rozdělen do dvou vzorků. První pro doplňování databanky pro automatické ověřování původu všech jedinců zařazovaných do chovu na bázi polymorfních znaků. Druhý pro analýzu DNA. Také v chovatelském řádu Beagl Clubu se od 1.1. 2006 uvádí povinné provedení testu paternity u vrhu štěňat majitelem chovné feny v případě, že se vyskytnou odůvodněné pochybnosti o tom, zda tato štěňata pocházejí po rodičích uvedených v doporučení ke krytí. Tyto pochybnosti jsou oprávněny vznést: majitel chovné feny, majitel chovného psa, poradce chovu a dále prostřednictvím poradce chovu i třetí osoba (pochybnost třetí osoby podléhá projednání výborem Beagl Clubu). Náklady na odběr vzorků a provedení testu paternity hradí majitel feny. V případě, že výsledky testu prokážou, že rodiče uvedeni v „Doporučení ke krytí“ jsou biologickými rodiči celého vrhu štěňat, budou tyto náklady majiteli feny uhrazeny Beagl Clubem ČR v plné výši. Odmítnutí provedení testu paternity může mít za následek pozastavení vydání průkazů původu pro celý vrh štěňat. Provedení testu paternity není možno vyžadovat v případě zahraničního krytí. Organizační výbor je oprávněn vydat k realizaci tohoto ustanovení potřebné formuláře a sestavit mechanismus jeho realizace. Organizační výbor musí návrh schválit jednomyslně.
29
4.2 Laboratoře v ČR provádějící testy Zde bych chtěla uvést některé firmy v České republice, které provádí určování původu u psů. ♦ GENSERVICE, s.r.o. ČIA akreditovaná laboratoř molekulární genetiky a cytogenetiky, která na svých internetových stránkách uvádí, že provádí určování paternity, maternity, určování individuálních identifikací, výběr nejvhodnějších jedinců k plemenitbě, určování pohlaví u ptáků, druhovou identifikaci, DNA banku, DNA identifikaci původců onemocnění a v humánní medicíně určování rodičovství. ♦ DNA test. CZ Tato firma na svých internetových stránkách uvádí, že zprostředkovává určování otcovství nejen u lidí, ale i u zvířat jako jsou psi, kočky koně a některá další domácí zvířata. ♦ LAMGen Laboratoř Aplikované Molekulární Genetiky na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, MZLU v Brně. ♦ Českomoravská společnost chovatelů, a.s. (ČMSCH) Laboratoř IG
Všechny tyto laboratoře provádí určování původu i u hospodářských zvířat, ověřování je však stanoveno zákonem. Zákon 154/2000Sb. přikazuje stanovovat genetický typ a ověřovat původ některých kategorií hospodářských zvířat. Výsledek ověření původu nebo stanovení genetického typu se vyjadřuje podle par. 29, odstavce (2), vyhlášky č. 471/2000Sb. Toto testování mohou provádět jen laboratoře schválené Ministerstvem zemědělství ČR.
30
5. Závěr Určování paternity u zvířat všeobecně je velice zajímavé téma. Dnešní moderní genetické metody nám dávají mnoho příležitostí jak paternitu rychle a bezpečně určit. V mé bakalářské práci jsem se snažila shrnout problematiku určování paternity psů. Vycházela jsem z nepřeberného množství zdrojů, které sem se snažila důkladně nastudovat a roztřídit. Pokusila jsem se co nejvýstižněji a nejpřehledněji vypsat metody ověřování původu u psů. Podle základního rozdělení můžeme metody rozdělit na tradiční a metody genomiky. Mezi tradiční metody patří ověřování pomocí krevních skupin, od kterých už se upustilo, a pomocí polymorfních znaků, které se ještě stále používají při ověřování původů určitých plemen. Avšak v dnešní době i tato technika zastarává v důsledku náročnosti a zdlouhavosti testu. Do metod genomiky lze zařadit DNA testy. Tyto testy se v současnosti využívají nejvíce, protože jsou nejvýhodnější z hlediska přesnosti a rychlosti. Vyspělost těchto testů DNA testů se stále zvyšuje. Stále se hledají nové nejvhodnější markery, které by vedly k urychlení a zjednodušení určování paternity. Je jen otázkou rychlosti vývoje, kdy se podaří tyto markery nalézt. Dnes se pro ověřování původu nejvíce využívá markerů II. typu - mikrosatelitů. Avšak mnoho výzkumných laboratoří už pracuje na nových panelech, které by obsahovaly markery III. typu – tzv. jednonukleotidové polymorfismy DNA (SNPs). Pes zaujímá od počátku lidstva nemalou roli v životě člověka, proto je důležité se podrobně a hlavně se zaujetím věnovat této tematice. V dnešní době probíhá neustálá degenerace všech druhů. U psů díky přešlechťování dochází k zhoršování jejich zdravotního stavu. Je jen na zodpovědných majitelích psů, aby si hlídali čistokrevnost plemene svého miláčka a jeho zdraví, které by předával na své potomky. Proto se musí tento vědní obor dále rozvíjet. A v celkovém dopadu nejde samozřejmě jen o psy, ale o všechna zvířata na celém světě. A proto by se chovatelé měli genetice zvířat více věnovat a také přispívat k jejímu rozvoji.
31
6. Seznam použité literatury BAUR, E. W., SCHOOR, R. T. (1969): Genetic polymorphism of tetrazolium oxidase in dogs. Science 166, s. 1524-1525 BRAEND, M. (1966): Serum transferrins of dog. Proc. 10th Europe Conferencion Animal Blood Grps. biochem. Polymorphism, s. 319-322 BRAEND, M., AUSTAD, R. (1973): Polymorphism of red cell acid phosphatase in dogs. Animal Blood Grps. biochem. Genetics 4, s. 189-192 Beagl Club (on-line): Chovatelské podmínky pro plemeno bígl.(cit. 2006-03-20) Dostupné na (http://www.beagleclub.cz/) ČECHOVÁ, K.(2002): DNA a American kennel club [on-line] (uveřejněno 2002-11-29), (cit. 2006-04-13). Dostupné na (http://www.schnauzer.cz/clanek.php?id=11) DAY, M. E., KRAAY, G. J., STEVENS, R. W. C. (1971): Polymorphism of canine serum albumin. Animal Blood Grps. biochem. Genetics 2, s. 195-199 DeNISE, S., JOHNSTON, E., HALVERSON, J., MARSHALL, K., ROSENFELD, D., McKENNA, S., SHARP, T., EDWARDS, J. (2004): Power of exclusion for parentage verification and prohability of match for identity in American kennel club breeds using 17 canine mikrosatellite markers. Animal Genetics 35, s. 14-17 DOSTÁL, J. (1977): Ověřování původu u psů. Myslivost 7, s.152-153 DOSTÁL, J. (1981): Paternity Control in Dogs by Polymorphic Markers. Mezinárodní konference na Světové výstavě myslivosti a rybářství, Plovdiv. Sborník, s. 455-460 DOSTÁL, J. (1995): Chov psů – genetika v kynologické praxi. Dona, České Budějovice, s. 151-167, 206 s., ISBN 80-85463-58-X DOSTÁL, J.: Psi a genetika. Svět psů. 01/2006. s. 58-59, ISSN1211-2976 DOSTÁL, J., HARTL, K., HŘEBÍKOVÁ, M., NĚMEC, J., TICHÁ, V.: Kynologická příručka pro rozhodčí, chovatele a vystavovatele. Dona, 1997, ISBN 80-85463-65-2 DUNGERN, J., HIRSCHFELD, D. (1910): Ubergruppenspezifische Structuren des Blutes. III. Immunitatsf., 256 FRANCISCO, L. V., LANGSTON, A. A., MELLERSH, C. S., NEAL, C. L., OSTRANDER, E. A. (1996): A class of highly polymorphic tetranucleotide repeats for canine genetics mapping. Mammalian Genome 7, s. 359-362 GRIFFITHS, A. J. F., MILLER, J. H., SUZUKI, D. T., LEWONTIN, R. C., GELBART, W. M.: An Introduction to Genetic Analysis. 2000, 860 s., ISBN 0-7167-3520-2
32
HEIDEL, G. (1968): Polymorphism of erythrocyte acid phosphatase in dogs. Deutsch. Gesundh. 23, s. 2197-2198 HORÁK, P., DVOŔÁK, J.: Detekce jednonukleotidových polymorfismů DNA u psů. In: V. mezinárodní konference doktorantů a pregraduálních studentů „Genetika a šlechtění zvířat“. MZLU v Brně, 2003, s. 84-87, ISBN 80-7157-662-X Hovawart Klub ČR (on-line): Kontrola původu chovných jedinců a izolace DNA (cit. 200603-20) Dostupné na (http://www.hovawart.cz) HRUBAN, V., MAJZLÍK, I.: Obecná genetika (Skriptum). ČZU Praha, 2000, 316 s., ISBN 80-213-0600-9 HUMAN GENOME PROJECT (2004): SNP Fact Sheet. In: Humane Genome Project Information
ISAG 2005 [on-line]: Panels of markers (cit. 2006- 05-01). Dostupné na (http://www.isag.org.uk/journal/comparisonguide.asp) ISAG 2002 [on-line]: Canine Applied Genetics Workshop (cit. 2006-05-01). Dostupné na (http://www.vgl.ucdavis.edu/research/canine/ISAG/index.html) ISAG 2005 [on-line]: ISAG Canine Panel for parentage verification. (cit. 2006-05-01). Dostupné na (http://www.isag.org.uk/ISAG/all/2005ISAGPanelDOG.pdf) JUNEJA, R., K., CHRISTENSEN, K., ANDRESEN, E., GAHNE, B. (1981): Frequencis of transferrin types in various breeds of domestic dog. Animal Blood Grps. biochem. Genetics 12, s. 79-88 KARAKOZA, A. a kol.: Genetika hospodárských zvierat. SVLP Bratislava, 1964, s. 7879, 377 s. KHAN, M. P., LOSS, W. R. T., VON DER DOES, J. A., EPSTEIN, R. B. (1973): Isoenzyme markers in dog blood cells. Transplantation 15, s. 624-628 KNAPP, K. K., HUNTER, R. L. (1975): Serum proteins of the Beagle dog: twodimensional electrophoretic study. Am. J. Vet. Res. 36, s. 193-195 KNOLL, A., URBAN, T.: Aktuální metody používané v molekulární genetice zvířat. In: XX. Genetické dny Brno 2002. Sborník referátů z mezinárodní vědecké konference. Brno 2002, s. 31-36, ISBN 80-7157-607-7 KNOLL, A., VYKOUKALOVÁ, Z.: Molekulární genetika zvířat (Skriptum). MZLU Brno 2002, 100 s., ISBN 80-7157-616-6 KREJSEK, J. (2004): Komentář k technice microarray
33
MGHENI, M., CHRISTENSEN, K., ANDRESEN, E. (1979): Albumin polymorphism in domestic dog breeds. Hereditas 91, s. 307-308 Multimediální učebnice lékařské biologie a genetiky [on-line]: Aktuální genetika,Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN, 2005, (cit. 2006-03-012). Dostupné na (http://biol.lf1.cuni.cz/učebnice/geneticka_kartografie.htm) REETZ, J., GELDERMANN, H., KIEL, S. (1980): Biochemical polymorphism in German dog breeds. Animal Blood Grps. biochem. Genetics 11, s. 61 REETZ, J., SCHNEIDER, P., GIESE, W. (1976): Das Serum-Transferrin-Systém beim Hund. Tierarzth. Wschr. 83, s. 377-379 ROSYPAL, S., DOŠKAŘ, J., PETRZIK, K., RŮŽIČKOVÁ, V.: Úvod do molekulární biologie. Rosypal, Brno 2002, s. 101, ISBN 80-902562-4-4 ROSYPAL, S., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., KAILEROVÁ, J.: Terminologie molekulární biologie. Rosypal Brno, 2001, 281 s., ISBN 80-902562-3-6 SAISON, R. (1972): Red cell peptidase in dogs, mink, pigs and cattle. Abstract, Animal Blood Groups 42 SAISON, R., COLLING, D. (1979): A proposed nomenclature for canine red blood cells groups. Proc. XVIth International Conference on Animal Blood Grps. and Biochemical Polymorphism, Vol. III, s. 225-228 SIMONSEN, V. (1976): Electrophoretic studies on the blood proteins of domestic dogs and other Canidae. Hereditas 82, s. 7-18 STEVENS, R. W. C., TOWNSLEY, M. E. (1970): Canine serum transferrins. Hereditas 61, s. 71-73 SVOBODOVÁ, K., HORÁK, P., DVOŘÁK, J.: Analýza variability vybraných SNPs u psů. In MendelNet'05 Agro. Brno: MZLU v Brně, 2005, s. 1-19. ISBN 80-7157-905-X SWISHER, S. N., YOUNG, L. E. (1961): The blood group systems of dogs.Physiol. Rev. 41, s. 495-520 TANABE, Y., OMI, T., OTA, K. (1977): Genetic variants of Glukose phosphate isomerase in canine erythrocytes. Animal Blood Grps. biochem. Genetics 8, s. 191-195 TANABE, Y., SUGIURA, S., ASANOMA, M., OTA, K. (1974): Genetic polymorphism of leucine aminopeptidase in canine plasma. Animal Blood Grps. biochem. Genetics 5, s. 225-230 TAYLOR, D.: Velká kniha o psech. Gemini Bratislava, 1993, ISBN 80-7161-013-5
34
TOWENSLEY, M. E., KRAAY, G., STEVENS, R. W. C. (1972): Polymorphism of canine serum albumin. Animal Blood Grps. biochem. Genetics 2, s. 195-199 VRIESENDORP, H. M., WESTBROEK, D. L., D´ÁMARO, V., VAN DER DOES, J. A., VAN DER STEEN, G. J., VAN ROOD, J. J., ALBERT, E., BERNINI, L., BULL, R. W., CABASSON, J., EBSTEIN, R. B., ERICSON, V., FELTKAMP, T. E. W., FLAD, H. D., HAMMER, C., LANG, R., LARGIADER, F., VON LORINGBOVEN, K., LOS, W., KHAN, P. M., SAISON, R., SERRON, B., SCHNAPPAUF, H., SWISHER, S. N., TEMPLETON, J. W., UHLSCHMIDT, G., ZWEIBAUM, A. (1973): Joint of 1st International Workshop on Canine Immunogenetics. Tissue Antigens 3, s. 145-172 THE AMERICAN KENNEL CLUB [on-line]: Understanding Your AKC Profile.(cit. 2006-04-20). Dostupné na (http://www.akc.org/dna/parentage_evaluation.cfm) TICHÁ, V.: Malá škola pro chovatele psů. Nakladatelství Dona, 2000, s. 6-20, ISBN 80-86136-84-1 VAIMAN, D.: DNA Sequence of Human and Other Mammalian Genomes. Mammalian Genomics, edited by Ruvinsky, R. and Graves, J.M., CAB International 2005, s. 99, 600 s., ISBN 0-85199-910-7 WEIDEN, A. S., STORB, R., KOLB, H. J., GRAHAM, T., ANDERSON, J., GIBLETT, E. (1974): Genetic variation of red blood cell enzymes in the dog. Transplantation 17, s. 115120 YOUNG, L. E., CHRISTIAN, R. M., ERVIN, D. M., SWISHER, S. N., O´BRIEN, W. A., STEWART, W. B., YUILE, C. L. (1950): Erythrocyte isoantibody reactions in dogs.Proc. Int. Soc. Hematol., s. 226-233 ZAJC, I., MELLERSH, C., SAMPSON, J. (1997): Variability of canine mikrosatellites within and between different dog breeds.Mammalian Genome 8, s. 182-185 ZWEIBAUM, A., OUDEA, P., HALPERN, B., VEYRE, C. (1966): Presence in colic grandular cells of various mammalian species of an antigen, cross reacting with human blood group A substance. Nature London, 209:159 ZWEIBAUM, A., STENDLER, V. (1969): Présence chez le chien d´un systéme d´isoanticorps naturels spécifiques d´antigénes de groupe des sécrétions digestives. Ann. Past., 177:839-854
