MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, pada bulan April hingga Agustus 2011. Materi Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah, isolat indigenus bakteri asam laktat dari daging sapi lokal Indonesia, yaitu Lactobacillus plantarum 2C12, 1A5, 1B1, dan 2B2, bakteri indikator (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus, Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028, dan Escherichia coli ATCC 25922). Selain itu digunakan media De Man Rogosa and Sharpe broth (MRSB), Mueller Hinton agar (MHA), yeast extract (YE) 3%, NaCl 1%, NaOH 1 N, amonium sulfat, buffer potassium phosphate, resin SP sepharose –Fast flow, enzim protease tripsin (Sigma Life Science, activity ≥ 10000 BAEE units/ mg protein), tris hydrochloride 0,05 M, kristal violet, lugol, safranin, alkohol, akuades dan larutan Mc. Farlan no. 0,5. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas antara lain tabung reaksi, labu erlenmeyer, botol schott, cawan petri, gelas ukur, pipet pasteur, pipet tetes, gelas objek, dan cover glass. Selain itu digunakan alat-alat seperti ose, membran saring sartorius, mikro pipet, spoit, sentrifuse, incubator, refrigerator, magnetic stirrer, hot plate, spektrofotometer UV-Vis, mikroskop, membran dialisis, alumunium foil, kapas, oven, otoklaf, timbangan analitik, bunsen, laminar air flow, vortex, cork borer, pH meter, jangka sorong, dan kamera digital. Prosedur Pewarnaan Gram (Waluyo, 2008) Sampel bakteri dari koloni yang homogen diambil menggunakan ose steril. Sebanyak satu ose sampel bakteri dioleskan secara merata pada kaca objek kemudian difiksasi panas. Olesan bakteri kemudian ditetesi dengan kristal violet, diratakan kemudian didiamkan selama satu menit. Setelah satu menit, preparat dibilas
18
menggunakan akuades dan dikeringkan. Tahap selanjutnya, olesan bakteri ditetesi logul dan diratakan kembali, dikeringkan selama satu menit, kemudian dibilas kembali dengan akuades lalu dikeringkan. Preparat dicuci dengan pemucat warna yaitu etanol 95%, tetes demi tetes selama 30 detik, kemudian dicuci segera dengan akuades dan ditiriskan. Preparat selanjutnya ditetesi safranin dan didiamkan selama 30 detik, kemudian dibilas dengan akuades dan ditiriskan. Preparat bakteri ditetesi minyak imersi, dan diamati dibawah mikroskop pembesaran 100x untuk mengetahui hasil dari pewarnaan Gram serta mengamati morfologinya. Bakteri yang termasuk dalam kelompok Gram positif akan menunjukkan warna ungu atau gelap sedangkan kelompok bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah. Uji Antagonistik Supernatan Bebas Sel Netral Lactobacillus plantarum Kultur Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 masing-masing diinokulasi ke dalam media de Man Ragosa Sharp Broth (MRSB) dan diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam. Supernatan bebas sel diperoleh melalui sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4
o
C selama 20 menit dan disaring
menggunakan membrane saring sartorius. Supernatan bebas sel dinetralkan pH nya menjadi 5,8 – 6,2 dengan penambahan NaOH 1 N. Supernatan bebas sel netral siap diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri indikator dengan metode difusi sumur. Purifikasi Plantaricin Purifikasi plantaricin untuk mendapatkan plantaricin murni meliputi beberapa tahap, dan dijelaskan sebagai berikut. Purifikasi Parsial dengan Menggunakan Presipitasi Amonium Sulfat. Sebanyak 500 ml media MRS – broth ditambah Yeast ekstrak 3% dan NaCl 1% diinokulasi dengan 10% (v/v) kultur Lactobacillus plantarum. Terdapat empat galur Lactobacillus plantarum yang digunakan untuk diperoleh bakteriosinnya
yaitu
Lactobacillus plantarum 2C12, 1A5, 1B1, dan 2B2 yang telah disegarkan, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 jam dan setelah itu disimpan pada refrigerator suhu 4oC selama dua jam. Tahap selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC untuk mendapatkan supernatan. Sebelum memasuki tahap penyaringan, supernatan diukur pH nya menggunakan pH meter. Supernatan disaring dengan menggunakan membran saring
19
Tabel 2. Penggunaan Padatan Amonium Sulfat (% Penjenuhan) Awal % 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
20 106 79 53 26 0
25 134 108 81 54 27 0
30 164 137 109 82 55 27 0
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
Konsentrasi Akhir dari Padatan Amonium Sulfat (gram) / 1000 ml 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 112 141 172 204 237 271 306 343 381 420 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 56 86 115 146 179 211 245 280 317 355 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 0 29 57 87 118 151 184 218 258 296 0 29 58 89 120 153 187 222 263 0 30 59 90 123 156 190 226 0 30 60 92 125 159 190 0 31 61 93 127 161 0 31 62 95 129 0 32 63 97 0 32 65 0 33 0
85
90
95
100
559 526 493 460 427 395 362 329 296 263 235 201 168 132 99 66 34 0
603 570 536 503 469 436 402 369 335 302 268 235 201 168 134 101 67 34 0
650 615 581 547 512 478 445 410 376 342 308 273 239 205 171 137 103 68 34 0
697 662 627 592 557 522 488 453 418 383 348 312 279 244 209 174 139 105 70 35 0
Sumber: Doonan, 2004.
20
sartorius diameter 0,22 µm dan selanjutnya supernatan bebas sel dari setiap galur Lactobacillus plantarum dinetralkan pH nya menjadi 5,8 – 6,2 dengan menggunakan NaOH 1N diikuti dengan pengukuran pH menggunakan pH meter. Seluruh tahap ini dilakukan pada suhu dingin. Setiap supernatan antimikrob yang telah disaring steril diberi penambahan serbuk amonium sulfat hingga 80% penjenuhan secara bertahap (20%, 40%, 60%, dan 80%) untuk menghasilkan endapan protein, kemudian dihomogenkan secara perlahan pada suhu 4 oC selama 2 jam. Tabel penggunaan padatan amonium sulfat ditampilkan secara lengkap pada Tabel 1. Supernatan selanjutnya dipisahkan dan didapatkan presipitat bakteriosin. Presipitat dikoleksi pada labu erlenmeyer steril. Pengecekan protein bakteriosin hasil purifikasi diamati menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada λ= 280 nm. Dialisis. Presipitat bakteriosin yang masih bercampur dengan ammonium sulfat didialisis dengan menggunakan membran dialisis berdiamater 20 µm dan buffer yang digunakan adalah potassium phosphate selama 12 jam, selanjutnya dilakukan penggantian buffer sebanyak dua kali di awal proses (2 jam dan 4 jam) pada suhu 4oC sehingga akan didapat ekstrak kasar bakteriosin yang berasal dari Lactobacillus plantarum selanjutnya disebut plantaricin. Pengecekan protein plantaricin hasil dialisis diamati menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada λ= 280 nm. Purifikasi dengan Menggunakan Kromatografi Pertukaran Kation. Kolom terlebih dahulu diisi dengan resin SP Sepahrose-fast flow. Kolom dipasang penjepit bunsen kemudian buffer potassium phosphate pH 6,8 dituangkan ke dalam kolom. Buffer dibuang secara perlahan. Resin SP Sepahrose dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan-lahan dengan menggunakan pipet pasteur dan dijaga agar tidak ada udara (gas) yang masuk ke dalam kolom. Resin akan menjadi gel. Diatas resin diberikan buffer dan kolom disimpan pada suhu dingin sampai siap untuk digunakan. Plantaricin hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan-lahan, dan dibawah kolom diberikan tabung penampung eluat yang keluar dari kolom. Eluat pertama adalah buffer, sedangkan yang berikutnya adalah sampel plantarcin murni. Kecepatan alir yang diberikan adalah 0,8 ml/menit. Setelah selesai pencucian dilakukan dengan buffer kembali dan ditampung untuk mengambil eluat yang terikat pada gel (resin). Semua dilakukan di ruang dingin. Setelah selesai dalam beberapa
21
tabung koleksi didapatkan eluat yang berisikan plantaricin murni. Plantaricin murni disimpan pada suhu dingin (4oC) dan selanjutnya siap untuk dianalisis sifat dan karakteristiknya serta dilakukan pengecekan protein plantaricin hasil kromatografi kolom dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ= 280 nm (Hata, 2010). Karakterisasi Plantaricin Sensitivitas terhadap Enzim Tripsin. Karakterisasi plantaricin dilakukan melalui uji sensitivitas plantaricin terhadap enzim tripsin. Enzim dan buffernya yang digunakan yaitu tripsin dalam 0,05 M Tris Hydrochloride (pH 7,0). Sampel-sampel plantaricin sebanyak 1 ml dihomogenkan dengan enzim tripsin (0,5 mg/ml). kemudian diinkubasi pada suhu 25 oC selama 60 menit. (Savadogo et al., 2004). Keberadaan protein plantaricin setelah mendapat perlakuan enzim proteolitik diukur absorbansinya pada λ= 280 nm. Uji Antagonistik Plantaricin terhadap Bakteri Indikator. Bakteri indikator (patogen dan pembusuk makanan) sebanyak 107 cfu/ml yang berumur 24 jam diinokulasikan ke dalam cawan, selanjutnya dituangkan media konfrontasi yaitu Mueller Hinton agar. Setelah agar mengeras dan dingin, dibuat sumur pada cawan dengan diameter 5 mm. Sebanyak 50 l plantaricin murni (sebagai kontrol) dituangkan kedalam sumur dengan menggunakan mikro pipet, begitu pula plantaricin yang telah mendapat perlakuan enzim tripsin, kemudian cawan disimpan dalam refrigerator selama 2 jam untuk memberikan kesempatan plantaricin berdifusi ke dalam agar. Setelah itu cawan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam (Savadogo et al., 2006). Zona bening yang terbentuk di sekitar area sumur menandakan bahwa plantaricin mampu menghambat bakteri indikator. Selanjutnya dilakukan pengukuran diameter zona bening (mm) dengan menggunakan jangka sorong. Diameter dari masing-masing zona hambat diukur sebanyak tiga kali di daerah yang berbeda yang kemudian hasilnya dirata-ratakan (Gambar 6). Hasil diameter zona bening diolah secara statistik setelah dikurangi dengan diameter sumur. Zona bening atau zona hambat dapat diekspresikan sebagai aktivitas unit bakteriosin. Unit aktivitas bakteriosin didefinisikan sebagai AU (activity unit), 1 AU
22
merupakan luas daerah hambatan per satuan volum contoh bakteriosin yang diuji (mm2/ml). Aktivitas bakteriosin dapat dihitung menggunakan persamaan berikut :
Keterangan : Lz
= Luas zona bening (mm2)
Ls
= Luas sumur (mm2)
V
= Volume contoh (ml)
Keterangan : C B A
A
= Luang sumur (5mm)
B
= Zona hambat / zona bening yang terbentuk
C
= Cawan petri (MHA dan bakteri indikator)
Garis = Pengukuran diameter zona hambat pada 3 posisi yang berbeda Gambar 6. Metode Pengukuran Zona Hambat Rancangan dan Analisis Data Rancangan dan analisis data meliputi rancangan atau metode statistik yang digunakan pada penelitian ini, perlakuan, model statistik yang digunakan, peubah yang diamati, dan analisis data yang digunakan. Rancangan dan analisis data pada penelitian ini meliputi produksi plantaricin, sensitivitas plantaricin murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap enzim tripsin, dan uji antagonistik plantaricin murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap bakteri indikator. Produksi Plantaricin Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan ulangan sebanyak tiga kali. Faktor perlakuan adalah galur Lactobacillus plantarum, dengan empat taraf perlakuan (galur 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Analisis data dilakukan secara deskriptif. Peubah yang diamati adalah nilai pH supernatan bebas sel, zona hambat hasil uji antagonistik supernatan bebas sel netral Lactobacillus plantarum, serta absorbansi dan konsentrasi protein plantaricin. Model statistik rancangan acak lengkap (RAL) adalah sebagai berikut.
23
Yij = µ + Pi + €ij Keterangan : Yij
= Variabel respon akibat pengaruh galur Lactobacillus plantraum ke-i pada ulangan ke-j.
µ
= Nilai tengah umum.
Pi
= Pengaruh perlakuan galur lactobacillus plantarum ke-i (i = 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12).
€ij
= Pengaruh galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j (j = 1, 2, 3).
Sensitivitas Plantaricin Murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap Enzim Tripsin Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan ulangan sebanyak tiga kali. Faktor perlakuan adalah galur Lactobacillus plantarum, dengan empat taraf perlakuan (galur 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Peubah yang diamati adalah persentase penurunan konsentrasi protein plantaricin. Model statistik rancangan acak lengkap (RAL) adalah sebagai berikut. Yij = µ + Pi + €ij Keterangan : Yij
= Variabel respon akibat pengaruh galur Lactobacillus plantraum ke-i pada ulangan ke-j.
µ
= Nilai tengah umum.
Pi
= Pengaruh perlakuan galur lactobacillus plantarum ke-i (i = 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12).
€ij
= Pengaruh galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j (j = 1, 2, 3). Data yang persentase penurunan konsentrasi protein plantaricin diuji asumsi,
apabila hasilnya memenuhi uji asumsi maka data dianalisis dengan analisis ragam (anova). Bila hasil yang diperoleh nyata maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Mattjik dan Sumertajaya, 2002). Uji Antagonistik Plantaricin Murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap Bakteri Indikator Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial (RAL faktorial) dengan pola 2 x 4. Faktor perlakuan yang pertama adalah pemberian enzim tripsin dengan dua taraf perlakuan (tanpa trispin dan tripsin). Faktor perlakuan kedua 24
adalah plantaricin asal galur Lactobacillus plantarum, dengan empat taraf perlakuan (galur 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Ulangan dilakukan sebanyak tiga kali. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat hasil uji antagonistik plantaricin murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap bakteri indikator. Model statistik rancangan acak lengkap faktorial adalah sebagai berikut. Yijk = µ + Pi + Yj + PYij + €ijk Keterangan : Yijk
= Variabel respon akibat pengaruh enzim tripsin ke-i dan galur Lactobacillus plantarum ke- j pada ulangan ke-k.
µ
= Nilai tengah umum.
Pi
= Pengaruh perlakuan enzim proteolitik ke-i (i = tanpa tripsin, tripsin).
Yj
= Pengaruh perlakuan galur Lactobacillus plantarum ke-j (j = 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12).
PYij
= Pengaruh interaksi antara enzim proteolitik ke-i dengan galur Lactobacillus plantarum ke-j.
€ij
= Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ke-j, terhadap ulangan ke-k, k = 1, 2, 3. Data yang zona hambat diuji asumsi, apabila hasilnya memenuhi uji asumsi
maka data dianalisis dengan analisis ragam (anova). Bila hasil yang diperoleh nyata maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Mattjik dan Sumertajaya, 2002).
25
