12
MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret–Juni 2010 di Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (DIPTP), Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Identifikasi tanaman herbal dilaksanakan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor. Materi Tanaman Herbal Dua jenis tanaman herbal (Mentha spicata L dan Ocimum americanum L) yang digunakan dalam penelitian ini digunakan dalam bentuk kering. Tanaman herbal dikeringkan dan digiling dengan ketebalan 1 mm dan disimpan dalam tempat yang kering dan terhindar dari sinar matahari langsung Kultur Starter Kultur starter dadih (Lactococcus lactis RM-01), kultur starter bulk kefir dan bakteri probiotik (Lactobacillus plantarum RM-01 dan Bifidobacterium longum). Perbandingan untuk masing-masing kultur starter susu fermentasi dengan probiotik untuk dadih 4:1:1; dan kefir 4:1:1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain mikropipet, gelas ukur, labu erlenmeyer, vorteks, sentrifuge, waterbath, ampul, freezer, kontainer dan spektrofotometer. Metode Ekstraksi Herbal Bubuk herbal dilarutkan dengan air destilasi (dH 2 O) dengan rasio1:10. Campuran kemudian diinkubasi selama 24 jam di waterbath (70oC) diikuti dengan sentrifugasi (15 menit, 2000 rpm pada 4oC). Supernatan digunakan dalam penelitian ini.
13
Persiapan Kultur Starter Susu sapi segar pasteurisasi (1 liter) dipanaskan (37oC) dan sejumlah volume susu hangat (100 ml) ditempatkan ke kontainer. Kultur starter ditambahkan ke susu dan diinkubasi selama 24 jam. Susu fermentasi disimpan pada suhu 4oC dan digunakan sebagai kultur starter. Pembuatan Susu Fermentasi Ekstrak herbal (10 ml) ditambahkan ke 85 ml susu diikuti dengan penambahan 5 ml kultur starter. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, untuk susu fermentasi tanpa ekstrak herbal, dH 2 O ditambahkan menggantikan ekstrak herbal. Semua susu fermentasi diinkubasi pada suhu 37oC dan disimpan saat pH mencapai 4.5. pH dan Total Asam Tertitrasi (TAT) Perubahan pH selama fermentasi dievaluasi setiap satu jam hingga pH mencapai 4.5. Total asam tertitrasi (TAT) diukur dengan titrasi menggunakan 0.1 N NaOH. Sampel (1 ml) dituang ke dalam tabung erlenmeyer berisi 9 ml dH 2 O. Beberapa tetes NaOH (0.1 N) dititrasi ke larutan hingga larutan berwarna merah muda. Jumlah asam yang diproduksi selama fermentasi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Persentase asam laktat = faktor pengenceran×V NaOH×0.1N×0.009×100% Pembuatan Ekstrak Susu Fermentasi Susu fermentasi tanpa penambahan herbal
(plain)
atau dengan
penambahan herbal dihomogenkan dengan 2.5 ml aquades steril. pH susu fermentasi diukur, kemudian diturunkan pHnya hingga mencapai 4.0 dengan HCl (0.1 M). Susu kemudian dipanaskan dengan waterbath (45oC) selama 10 menit diikuti dengan sentrifugasi (5000 g, 10 menit 4oC). NaOH (0.1 M) ditambahkan hingga pH mencapai 7.0. Supernatan disentrifugasi lagi (5000 g, 10 menit 4oC), endapan yang terbentuk dipisahkan dan supernatan yang diperoleh disimpan pada suhu -20oC hingga dibutuhkan untuk analisis.
14
Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Pengujian Penghambatan Radikal 1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl (DPPH) (Apostolidis et al. 2006) Ekstrak susu (250 µl) ditambahkan ke dalam 60 mM DPPH dalam etanol. Penurunan absorbansi
diamati pada 517 nm hingga pembacaan konstan.
Pembacaan dibandingkan dengan kontrol yang berisi 250 µl dH 2 O menggantikan ekstrak. Persentase penghambatan dihitung dengan rumus:
Uji Total Fenol Uji total fenol dihitung menggunakan metode Shetty et al. (2005). Ekstrak susu sebanyak 1 ml ditransfer ke dalam tabung dan dicampur dengan 1 ml 95% etanol dan 5 ml dH 2 O. Reagen Folin-Ciocalteu (50% v/v; 0.5 ml) ditambahkan ke setiap sampel kemudian dihomogenkan dengan vorteks. Setelah 5 menit, 1 ml Na 2 CO 3 ditambahkan dan didiamkan selama 60 menit pada suhu ruang. Absorbansi dibaca pada 725 nm. Nilai absorbansi dikonversi ke total fenol dan diekspresikan dalam mikrogram setara dengan asam galat per mililiter (ml) dari sampel. Uji O-Pthaldialdehyda (OPA) Kandungan protein dalam susu fermentasi diukur menggunakan metode OPA (Goodno et al. 1981). Pembuatan
Reagen
OPA.
Larutan
OPA
dibuat
dengan
mengkombinasikan reagen berikut: 25 ml sodium tetraborat (100 mM), 2.5 ml (wt/wt) sodium dodecyl-sulfat (SDS) 20%, OPA (40 mg yang dilarutkan dengan 1 ml metanol) dan 100 µl β-mercaptoethanol. Volume akhir dibuat hingga 50 ml mengunakan dH 2 O. Reagen OPA sensitif terhadap cahaya, sehingga harus dijaga dari sumber cahaya selama penyiapan dan pengujian. Reagen ini disiapkan dalam bentuk segar dan digunakan selama dua jam persiapan. Uji OPA. Pengujian proteolisis menggunakan protein susu sebagai substrat. Sejumlah aliquot dari ekstrak susu fermentasi (umumnya 10 sampai 50 µl yang mengandung 5 sampai 100 µg protein) ditambahkan secara langsung ke 10 ml reagen OPA di cuvette 1.5 ml. Larutan dicampurkan secara cepat dengan
15
pembalikan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 324 nm. Konsentrasi peptida diestimasikan terhadap kurva standar tripton. Kurva Standar Tripton. Kurva standar konsentrasi peptida disiapkan menggunakan tripton. Konsenrasi standar tripton yang bervariasi (0.25, 0.5, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50 mg/ml) disiapkan dari stok larutan. Standar tripton disiapkan dan diberikan perlakuan dalam pembuatan sampel dari tiap pengujian OPA. Pengujian Penghambatan Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Persiapan Ekstrak Paru-paru Kelinci. Paru-paru kelinci segar dibekukan secara cepat pada suhu -20oC dilanjutkan dengan penumbukan dengan alat penumbuk dan mortar dan sesudah itu dihomogenkan dengan bufer potassium posfat 0.05 M dingin yang mempunyai pH 8.3. Paru-paru kelinci yang telah dihomogenkankan kemudian disentrifugasi selama 60 menit pada gravitasi 2000 g. Supernatan yang berwarna bening memiliki aktivitas ACE yang tinggi dan didistribusikan ke dalam ampul berukuran 0.1 ml, lalu disimpan pada freezer 20oC hingga dibutuhkan untuk analisis. Persiapan Reagen ACE. Reagen ACE disiapkan sebagaimana dijelaskan oleh Vermeissen et al. (2002). Sodium klorida (NaCl 2.34 g) dilarutkan pada 80 ml dH 2 O dan volumenya dibuat menjadi 100 ml dalam labu volumetrik. Larutan A dibuat dengan cara mencampurkan 0.607 g Tris dalam 50 ml dH 2 O. pH ditentukan hingga 8.3 dan volume dibuat hingga 100 ml. Furanacryloyl-Phe-Gly-Gly (FAPGG: 25 mg) dicampur dalam 62.6 ml larutan A, setelah itu larutan FAPGG (reagen ACE) dialiquotasikan (500 µl) pada ampul-ampul dan disimpan pada suhu -20oC hingga dibutuhkan untuk analisis. Pengukuran Aktivitas ACE pada Paru-paru Kelinci. Metode untuk menentukan aktivitas ACE diadaptasi dari Vermeirssen et al. (2002). Bahan pereaksi ACE (500 µl) ditambahkan 300 µl pada dH 2 O (blanko) dalam tabung reaksi. Campuran dicampur sepenuhnya dan diinkubasi pada waterbath (37oC) selama 2 menit. Campuran tersebut kemudian diangkat dari waterbath dan 300µl ekstrak paru-paru kelinci ditambahkan dan dicampur dengan baik. Reaksi
16
enzimatik terjadi di waterbath (37oC) selama 20 menit. Tabung reaksi dikeluarkan secara singkat setiap 5 menit dan dibaca nilai absorbansinya pada 340 nm. Pengukuran Aktivitas Anti-ACE Ekstrak Susu Fermentasi. Pengujian dilakukan sesuai dengan uraian pada pengukuran aktivitas ACE pada paru-paru kelinci. Pada kontrol, kecuali 300 µl ekstrak cairan disiapkan dari susu fermentasi digunakan sebagai ganti 300 µl dH 2 O. Perhitungan Penghambatan Aktivitas ACE. Aktivitas ACE (unit/min) diperhitungkan dengan membagi selisih absorbansi (unit) antara inkubasi ke 5 menit dan 20 menit dengan 15 menit: Aktivitas ACE (unit/min)=(Abs 20’-5’)/15 min Rata-rata pengurangan aktivitas penghambatan ACE dikalkulasikan sebagai berikut: Jika dalam perbandingan untuk mengontrol aktivitas ACE (blank) Aktivitas penghambatan ACE = aktivitas ACE (kontrol) – aktivitas ACE (ekstrak susu fermentasi) X 100 Aktivitas ACE (kontrol) Pengujian Penghambatan α-Amilase Larutan Enzim α-Amilase. Porcine pancreatic α-amilase (EC 3.2.1.1) diperoleh dari Sigma chemical Co. Berdasarkan penjelasan deskripsi produk, satu unit enzim akan membebaskan 1.0 mg maltosa dari pati per menit pada pH 7.0 pada suhu 20oC. Konsentrasi enzim digunakan dalam pengujian sebanyak 0.5 mg/ml (Apostolidis et al. 2006). Bubuk enzim dilarutkan dalam bufer sodium posphate 0.02 M yang telah didinginkan, sodium klorida 0.006 M dengan pH 6.9, menghasilkan larutan yang bening sampai buram. Hal ini disebabkan tekanan dari pembawa enzim yaitu laktosa yang larut secara perlahan-lahan dalam bufer dingin. Larutan enzim disiapkan dalam bentuk segar dan disimpan sebelumnya pada suhu dibawah 4oC untuk pengujian. Bufer Na Phosphate (0.02 M), pH 6.9 dengan NaCl (0.006 M). Tiga larutan berikut disiapkan secara terpisah. 200 ml dH 2 O ditambahkan ke 1.582 g Na 2 HPO 4 200 ml dH 2 O ditambahkan ke 1.062 g Na 2 PO 4
17
100 ml dH 2 O ditambahkan ke 0.3506 g NaCl Ketiga larutan tersebut dkemudian dicampur dengan baik diikuti dengan penambahan 400 ml dH 2 O untuk mendapatkan pH yang diinginkan yaitu 6.9. Jika pH menyimpang dari 6.9, pH diatur kembali dengan penambahan Na 2 HPO 4 sebagai basa atau NaH 2 PO 4 sebagai asam. Selanjutnya larutan dilengkapi hingga mencapai volume akhir sebesar 1000 ml dalam labu ukur. Bufer yang telah disiapkan disimpan pada suhu 25oC dan harus digunakan tidak lebih dari 2 minggu. Bahan Pereaksi Asam Dinitrosalisyclic (DNSA). Bahan reaksi DNSA asli yang dikembangkan oleh Summer dan Sisler (1921) mengandung 0.63% DNSA, 18% titrat, 0.5% fenol, 0.5% natrium bisulfit dan 14% NaOH. Bahan pereaksi DNSA yang telah dimodifikasi yang digunakan dalam penelitian ini disiapkan dengan melarutkan (dengan pengadukan konstan) 2% w/v kalium natrium tartrat, dikenal juga dengan garam Rochelle, disiapkan secara terpisah menggunakan dH 2 O. Bahan pereaksi disiapkan segar untuk analisa. Kehati-hatian harus dilakukan karena CO 2 mempunyai kecenderungan berinterfensi terhadap stabilitas pereaksi. Bahan reaksi ini harus dilindungi dari semua sumber cahaya. Larutan Pati 1%. Pati terlarut (1 g) dilarutkan dalam 100 ml bufer NaPO 4 . Pengadukan secara konstan pada suhu 90oC dapat membantu dalam melarutkan pati di dalam bufer. Larutan pati kemudian didinginkan dan disimpan pada suhu 4oC. Larutan pati sebelumnya diinkubasi terlebih dahulu pada suhu 25oC selama 5 menit sebelum pengujian. Analisis Penghambatan α-Amilase. Analisis penghambatan α-amilase diadaptasi dari Shetty et al. (2006). Ekstrak susu fermentasi (500 µl) dicampurkan dalam 500 µl bufer NaPO 4 (0.02 M), pH 6.9 dengan kandungan 0.5 mg/ml natrium klorida (0.006 M). larutan α-amilase diinkubasi pada suhu 25oC selama 10 menit. Setelah inkubasi awal, 500 µl dari larutan pati 1% dalam bufer NaPO 4 0.02 M, pH 6.9 dengan NaCl 0.006 M ditambahkan pada setiap tabung dengan selang waktu yang telah ditentukan sebelumnya. Campuran reaksi tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 25oC selama 10 menit. Reaksi yang terjadi dihentikan dengan 1.0 ml bahan pewarna asam dinitrosalicyclic (DNSA). Tabung-
18
tabung yang akan diujikan kemudian diinkubasi dalam waterbath mendidih selama 7 menit. Selanjutnya, 1.0 ml larutan tartrate 18.2% ditambahkan ke dalam setiap tabung setelah perebusan dalam waterbath sebelum didinginkan menjadi suhu ruang. Campuran reaksi kemudian diencerkan setelah penambahan 10 ml dH 2 O. Absorbansi diukur pada 540 nm. Rumus yang digunakan untuk perhitungan penghambatan enzim dinyatakan sebagai berikut:
Pengujian Penghambatan α-Glukosidase Larutan Enzim α-Glukosidase. Sebanyak 1000 U α-glukosidase dilarutkan sempurna dalam 396 µl (3.96 ml) dari 0.1 M bufer K 2 HPO 4 (pH 6.90) dan didistribusikan pada 33 ampul dan disimpan pada suhu -20oC. Setiap ampul terdiri atas 30 U/120 µl larutan enzim α-glukosidase. Bufer Potassium Phosphate (0.1 M; pH 6.90). Kedua larutan ini dibuat secara terpisah: 200 ml dH 2 O ditambahkan ke dalam 9.11 g K 2 HPO 4 200 ml dH 2 O ditambahkan ke dalam 6.49 g KH 2 PO 4 Kedua
larutan
kemudian
dicampurkan
sempurna
diikuti
dengan
penambahan 400 ml dH 2 O untuk memperoleh pH yang diinginkan yaitu 6.90. jika mendapatkan pH yang menyimpang dari pH 6.90, dilakukan penambahan larutan dengan K 2 HPO 4 sebagai basa atau KH 2 PO 4 sebagai asam. Volume akhir dari larutan tersebut dilengkapi hingga sebanyak 1000 ml di dalam labu ukur. Larutan penyangga yang telah disiapkan lalu disimpan pada suhu 25oC dan digunakan dalam 2 minggu. Larutan Substrat p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 5 mM. Larutan penyangga KH 2 PO 4 (0.1 M pH 6.90) ditambahkan secara bertahap ke dalam pnitrophenyl-α-D-glucopyranoside (5 mM) hinga keseluruhannya larut. Larutan disiapkan tepat sebelum pengujian α-glukosidase. Pengujian Penghambatan α-Glukosidase. Pengujian penghambatan αglukosidase secara prinsip dijelaskan Apostolidis et al. (2006) dengan beberapa modifikasi. Reaksi campuran mengandung 500 µl ekstrak sampel dan 1 ml 0.1 M
19
bufer KH 2 PO 4 (pH 6.90) berisi larutan α-glukosidase (1.0 U/ml) dan diinkubasi pada waterbath pada suhu 25oC selama 10 menit. Setelah 10 menit, 500 µl dari larutan p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (5mM) dalam potassium phosphate bufer 0.1M (pH 6.90) ditambahkan ke setiap tabung sesuai interval waktu yang ditentukan. Campuran reaksi selanjutnya diinkubasi pada suhu 25oC selama 25 menit. Pembacaan nilai absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 405 nm dilakukan sebelum dan sesudah inkubasi. Pembacaan nilai absorbansi dibandingkan dengan kontrol yang merupakan 500 µl bufer pengencer sebagai ganti ekstrak sampel. Aktivitas penghambatan α-glukosidase ditunjukkan dengan persentase hambatan sebagai berikut:
Rancangan Percobaan Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap dengan 3 perlakuan masing-masing dengan 3 ulangan. Model matematik yang digunakan adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie 1995). Yij = µ + αi + βj + εij Keterangan : Yij: µ :
nilai pengamatan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j nilai rataan umum dari pengamatan
αi :
pengaruh perlakuan ke-i
βj :
pengaruh ulangan ke-j
εij :
galat dari perlakuan ke-i pada ulangan ke-j
Data yang diperoleh dianalisis dengan Sidik Ragam (ANOVA), setiap analisis yang memberikan hasil beda nyata dilanjutkan dengan uji Duncan.
