MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika dan Molekuler Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan selama tujuh bulan, mulai Oktober 2010 sampai Mei 2011. Materi Sampel Ternak Sebanyak 70 sampel darah sapi berasal dari tiga Kecamatan di daerah aliran sungai Katingan, Kalimantan Tengah yaitu Kelurahan Pendahara (Kecamatan Tewah Sanggalang Garing), Desa Buntut Bali (Kecamatan Pulau Malan) dan Desa Tumbang Lahang (Kecamatan Katingan Tengah) digunakan dalam penelitian ini. Selain sapi Katingan, sampel darah sapi Bali, PO, Limousin dan Madura juga digunakan dalam penelitian ini (Tabel 1). Tabel 1. Jumlah Sampel Darah Sapi yang Digunakan dari Kabupaten Katingan, Kalimantan Tengah Jenis/Bangsa Sapi Sapi Katingan
Populasi Buntut Bali Pendahara Tumbang Lahang
Jumlah Sampel 18 21 31
Sapi Bali
Tumbang Lahang Palangka Raya
1 10
Sapi PO
Tumbang Lahang
6
Sapi Limousin
Palangka Raya
3
Sapi Madura
Palangka Raya
1
Total Sampel
91
Sumber : Utomo (2011)
Lokasi pengambilan sampel sapi Katingan dapat dilihat pada Gambar 4. Kelurahan Pendahara (Kecamatan Tewah Sanggalang Garing) terletak pada 113°08’ BT-113°30’ BT dan 1°35’ LS-1°53’LS pada ketinggian 32 m DPL. Desa Buntut Bali (Kecamatan Pulau Malan) terletak pada 113°00’ BT-113°28’ BT dan 1°26’ LS-1°50’
13
LS pada ketinggian 27 m DPL. Desa Tumbang Lahang (Kecamatan Katingan Tengah) terletak pada 112°44’ BT-113°19’ BT dan 1°07’ LS-1°43’ LS pada ketinggian 30 m DPL. Sungai Katingan memiliki panjang 650 km yang melalui ketiga lokasi penelitian.
Sumber : Bhermana (2010)
Gambar 4. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Sapi Katingan Bahan-bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini, adalah : 1) Bahan-bahan untuk pengambilan sampel, yaitu sampel darah, kapas, dan alkohol 96%. 2) Bahan-bahan untuk isolasi dan pemurnian DNA, yaitu SDS (sodium dosesil sulfat), proteinase-K, STE (Sodium Tris-EDTA), CIAA (Chloroform Iso Amil
1412
Alkohol), larutan phenol, ethanol absolut, NaCl, TE (Tris EDTA) dan DW (destilated water). 3) Bahan-bahan untuk amplifikasi DNA, yaitu campuran destilated water (DW), primer, dNTP, MgCl2, buffer dan taq DNA polimerase. 4) Bahan-bahan untuk elektroforesis, yaitu larutan akrilamid, TEMED (N,N,N’,N’tetramethylethylenediamine),
DW
(destilated
water),
APS
(ammonium
peroxodisulfat) 10%, marker 20 bp dan larutan 5x TBE (tris boric acid-EDTA). 5) Bahan-bahan untuk silver staining (pewarnaan perak), yaitu DW, AgNO3, NaOH, formaldehid, asam asetat dan amonia. 6) Primer yang digunakan, yaitu ILSTS028, ILSTS052 dan ILSTS056. Alat-alat Alat-alat
yang
digunakan
dalam
penelitian
ini
dilihat
dari
cara
penggunaannya, yaitu : 1) Alat-alat untuk pengambilan sampel seperti tabung venoject, spoit, rak tabung; alat yang umum digunakan seperti timbangan analitik, gelas ukur, gelas piala, freezer, pengaduk kaca, pipet ukur, autoclave, pisau atau silet dan sarung tangan. 2) Alat untuk ekstraksi dan pemurnian DNA seperti tabung Eppendorf, rak tabung Eppendorf, pipet mikro, tip, vortex, centrifuge, inkubator dan sarung tangan. 3) Alat-alat untuk PCR seperti tabung Eppendorf 0,2 µl, rak
tabung, vortex,
centrifuge, mesin PCR dan sarung tangan. 4) Alat-alat elektroforesis seperti mesin elektroforesis, spiser, gelas ukur, pipet ukur, bulp, gelas Erlenmeyer, waterbath dan sarung tangan. Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel Pengambilan sampel darah sapi Katingan menggunakan disposible syringe 10 ml dari masing-masing sebanyak lima ml dari vena jugularis. Darah dimasukkan ke dalam tube test 12 ml yang telah diisi alkohol 96% sebanyak lima ml dan diberi label. Ketika darah ditambahkan alkohol, tabung segera dikocok dengan kuat agar darah benar-benar bercampur dengan alkohol dan tidak menggumpal, kemudian disimpan di dalam box plastik sampai darah akan diisolasi.
1513
Ekstraksi dan Purifikasi DNA Genom Ekstraksi dan purifikasi DNA dilakukan dengan metode Sambrook et al. (1989), yaitu : sebanyak 200 µl sampel darah dalam EtOH dipindahkan ke tabung 1,5 µl kemudian ditambahkan 1.000 µl DW/TE. Larutan dikocok kuat atau vortex dan didiamkan sekitar lima menit lalu disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama sekitar lima menit. Bagian supernatan dibuang, kemudian diulangi lagi tahapan tersebut sampai bagian supernatan yang kedua dibuang. Setelah itu sebanyak 40 µl SDS 10%, 10 µl proteinase-K 5 mg/ml, dan 1 x STE sampai 400 µl ditambahkan setelahnya. Larutan dikocok dalam inkubator pada suhu 55 ºC selama dua jam, kemudian tambahkan 400 µl larutan phenol, 400 µl kloroform iso amil alkohol (CIAA), dan DNA diendapkan dengan 40 µl 5 m NaCl. Larutan dikocok pelan pada suhu ruang selama satu jam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama lima menit. Bagian DNA (bening) dipindahkan dengan menggunakan pipet ke tabung 1,5 µl baru sebanyak 400 µl, kemudian ditambahkan 800 µl EtOH absolute dan 40 µl 5 M NaCl. Larutan dibekukan selama semalam. Endapan yang dihasilkan setelah proses pembekuan dilanjutkan dengan menambahkan 400 μl 70 % etanol dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama lima menit. Etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa vakum, selanjutnya DNA dilarutkan dengan 80 μl 80% buffer TE. Amplifikasi DNA Mikrosatelit Primer yang digunakan untuk menganalisis keragaman DNA mikrosatelit sapi Katingan adalah ILSTS028, ILSTS052 dan ILSTS056 (Tabel 2). Tabel 2. Informasi tentang Tiga Pasang Primer Pengapit DNA Mikrosatelit Lokus
Sekuen Primer
ILSTS028 F-5′ tccagattttgtaccagacc 3′ R-5′ gtcatgtcatacctttgagc 3′ ILSTS052 F-5′ ctgtcctttaagaacaaacc 3′ R-5′ tgcaacttaggctattgacg 3′ ILSTS056 F-5′ gctactgagtgatggtaggg 3′ R-5′ aatatagccctggaggatgg 3′
Suhu Annealing
Motif Ulangan
Lokasi dikromosom
55
(CA)7
11
55
(CA)12
21
55
(CA)11
12
Keterangan : F=Forward primer; R=Reverse Sumber : Kathiravan et al. (2009)
16 14
Campuran PCR terdiri atas sampel darah 1 µl dengan tiga primer yaitu ILSTS028, ILSTS052 dan ILSTS056 sebanyak 0,05 µl; dNTP sebanyak 0,1 µl; MgCl2 sebanyak 0,25 µl; 10 kali buffer sebanyak 1,25 µl; DW sebanyak 9,3 µl dan taq DNA sebanyak 0,05 µl. Tabung Eppendorf yang berisi campuran sampel dan bahan PCR tersebut kemudian diputar dengan mesin vortex, lalu dimasukkan ke dalam mesin PCR. Mesin PCR kemudian dioperasikan dengan program perubahan suhu sebagai berikut : siklus pertama adalah denaturasi awal pada 94 ºC selama lima menit, diikuti dengan 35 siklus yang masing-masing terdiri atas denaturasi (94 ºC selama 20 detik), penempelan primer (55-60 ºC selama 30 detik), pemanjangan (72 ºC selama 45 detik), dan diakhiri dengan satu siklus berikutnya yaitu pemanjangan pada 72 ºC selama lima menit. Setelah siklus terakhir selesai, mesin PCR dimatikan dan tabung Eppendorf diambil untuk disimpan pada suhu ruang atau pada suhu 4 ºC atau dapat dianalisis lebih lanjut. Elektroforesis Gel Poliakrilamida Vertikal (Vertical PAGE) Alat dan bahan dalam pembuatan gel dipersiapkan. Elektroforesis gel akrilamid dikerjakan dengan menggunakan vertical electrophoresis apparatus. Poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) yang digunakan 6%. Komponen-komponen berikut dicampurkan dalam satu gelas ukur,: 30% Akrilamida sebanyak 5 ml, 5 kali TBE sebanyak 2,5 ml, DW 17,3 ml, Temed sebanyak 15 µl dan 10% APS sebanyak 150 µl. Semua larutan tersebut dicampur dengan menggoyang-goyangkan hingga homogen (menggunakan sarung tangan). Larutan tersebut segera dituangkan ke dalam cetakan gel kemudian ditutupi larutan gel dengan tutup cetakan yang telah disediakan. Sisir dipasang untuk membuat lubang tempat sampel (sumur) dan dibiarkan pada suhu ruangan sehingga gel membeku. Elektroforesis akrilamid dijalankan pada tegangan 100 volt selama lebih kurang dua jam. Setiap sumur pada gel diisi dengan produk PCR sebanyak dua µl yang dicampur dengan 0,25 µl larutan pemberat (loading dye). Satu sumur gel terakhir diisi dengan 1 µl DNA marker 20 bp sebagai ukuran standar pita-pita DNA hasil amplifikasi, setelah elektroforesis selesai dilakukan pewarnaan perak (silver staining). Pewarnaan perak menggunakan empat larutan yaitu larutan A (DW 200 ml; AgNO3 0,2 g; 10 N NaOH 80 µl dan ammonia 800 µl), DW sebanyak 200 ml, larutan B (DW 200 ml, NaOH 6 g, formaldehid 200 µl) dan larutan C (DW 100 µl, 17 15
100 µl asetat). Gel kemudian dimasukkan ke dalam larutan A dan didiamkan selama lebih kurang delapan menit, kemudian gel dicuci dengan DW selama dua menit. Larutan B dipanaskan terlebih dahulu di dalam waterbath pada suhu 60-65 ºC sampai siap digunakan. Selanjutnya gel direndam dan digoyang-goyangkan perlahan dalam larutan B sampai muncul pita. Setelah pita muncul, gel dicuci dengan larutan C. Selesai mencuci dengan larutan C kemudian gel dibungkus dengan plastik mika dan diberi nomor pada setiap sampel. Penentuan Posisi Pita DNA Penentuan genotipe dilakukan dengan cara memperhatikan dan menghitung jumlah pita pada gel elektroforesis. Heterozigot ditunjukkan dengan dua pita, sedangkan homozigot satu pita. Penentuan pita yang paling bawah diberi sandi A, B, C dan seterusnya sampai pita paling atas. Pita yang memiliki laju sama merupakan alel yang homolog (Sumantri et al. 2008). Analisis Data Analisis data dilakukan dengan mempelajari pola pita (alel) yang terdapat pada sapi Katingan, sapi Bali, PO, Madura dan Limousin. Analisis data DNA mikrosatelit menggunakan software POPGENE Versi 32 antara lain adalah frekuensi alel, frekuensi genotipe dan derajat heterozigositas. Frekuensi Alel Frekuensi alel lokus ILSTS028, ILSTS052 dan ILSTS056 dihitung dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000):
Keterangan : j ≠ 1 xi
= frekuensi alel ke-i
nij
= jumlah individu untuk genotip ij
nii
= jumlah individu untuk genotip ii
N
= jumlah sampel
18 16
Frekuensi Genotipe Frekuensi genotipe ditentukan dengan cara membagi jumlah sampel sapi Katingan yang memiliki genotipe tipe tertentu dengan seluruh jumlah sapi yang diamati dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000):
Keterangan : xi
= frekuensi genotipe ke-i
ni
= jumlah individu bergenotipe i
N
= jumlah individu sampel
Derajat Heterozigositas Derajat heterozigositas ditentukan dengan menggunakan rumus Nei dan Kumar (2000):
Keterangan : ĥ
= nilai heterozigositas
xi
= frekuensi alel ke-i
n
= jumlah individu Rataan heterozigositas pada setiap lokus dihitung dengan menggunakan
rumus Nei dan Kumar (2000): Ĥ Keterangan : Ĥ
= rataan heterozigositas semua lokus
hj
= heterozigositas lokus ke-j
r
= jumlah lokus
19 17
