MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juni 2012. Lokasi penelitian bertempat di Laboratorium Kimia Analisis dan Mikrobiologi, UPT. Balai Pengembangan Proses dan Teknologi Kimia (BPPTK) Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Gunungkidul, Daerah Istimewa Yogyakarta. Materi Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut: a.
Uji fisik kualitas pakan Uji fisik kualitas pakan membutuhkan alat-alat yaitu: kontainer plastik, box plastik, plastik, Erlenmeyer, gelas ukur, bunzen, sarung tangan, autoclave, timbangan, oven 105°C, tanur 550°C, gelas ukur 100 ml, pipet volumetrik, pengaduk, tissue, spatula, cawan porselen, termometer. Bahan yang digunakan untuk uji kualitas fisik adalah dedak padi, gaplek, inokulum yeast (Saccharomyces cereviceae), mineral mikro Fe (FeCl2), Mn (MnCl2), Cu (CuSO4), Co (CoCl2), Zn (ZnSO4), I (KI) dan aquadestilata.
b.
Proses pengambilan cairan rumen Proses pengambilan cairan rumen menggunakan aspirator dan spuit berselang untuk menyedot cairan rumen melalui fistula sapi, termos, kain saring, corong dan labu ukur.
c.
Gas test Analisis gas test menggunakan alat-alat yaitu: syringe, waterbath, timbangan analitik, spatula, kain saring, dispenser, tabung reaksi, sentrifuge, vortex, micropipet, gelas ukur, oven, labu ukur, pH meter, botol film dan corong. Bahan yang digunakan pada gas test adalah cairan rumen, daun Pennisetum hybrid, Azadirachta indica, monensin, buffer + media (larutan makromineral, mikromineral, resazurin, dan reducing.
Metode Pembuatan Inokulum Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae yang digunakan berasal dari dua sumber yaitu tape untuk fermentasi pertama dan ATCC (American Type Culture Collection) untuk fermentasi kedua. Keduanya diperbanyak terlebih dahulu ke dalam Malt Extract Broth (MEB) selama 24 jam kemudian diperbanyak kembali ke dalam Malt Extract Agar (MEA) selama 24 jam dan dihitung populasinya. Formulasi Mineral Formulasi mineral dihitung berdasarkan kebutuhan ternak sapi per ekor per hari dan kadar mineral yang terkandung di dalam pakan dedak dan gaplek yang sudah difermentasi. Jumlah mineral yang akan diinokulasi ke dalam pakan ternak ditimbang kemudian dihomogenkan ke dalam aquadestilata yang sudah steril. Pembuatan Mineral Organik Mineral organik dibuat dengan metode fermentasi menggunakan inokulum S. cerevisiae yang diisolasi dari tape singkong (Manihot sp). Bahan pakan dedak dan gaplek, aquades, mineral anorganik (Fe=17,74 mg; Mn=27,84 mg; Cu=25,46; Co=0,60; Zn=47,33; I=3,81 mg) yang sudah dilarutkan dengan aquades, disterilkan menggunakan autoclave dengan suhu 121°C selama 15 menit. Semua bahan yang sudah steril kemudian dicampur hingga homogen dengan suasana yang dikondisikan steril. Bahan-bahan yang sudah dicampur hingga homogen disimpan di dalam box plastik yang disusun sesuai dengan perlakuan dan dimasukkan ke dalam kontainer plastik. Kondisi dibuat sedikit terbuka karena S. cerevisiae adalah mikroorganisme anaerob fakultatif. Pakan fermentasi yang digunakan untuk gas tes adalah pakan yang sudah disterilisasi dengan penambahan mineral dan inokulum S. cerevisiae ATCC. Pakan disimpan di dalam kotak plastik dengan ditutup rapat untuk memperkecil tingkat kontaminasi. Lama inkubasi proses fermentasi selama 7 hari, kemudian dikeringkan dengan oven 50-60°C dan digiling.
Pembuatan Mineral Anorganik Proses pembuatan mineral anorganik memakai bahan baku pakan gaplek yang ditambahkan dengan mineral anorganik (Fe, Mn, Cu, Co, Zn, dan I) kemudian dikeringkan dengan oven 50-60°C. Berbeda dengan pembuatan mineral organik, pembuatan mineral anorganik ini tidak mengalami proses fermentasi dengan inokulasi S. cerevisiae. Pengamatan Pengamatan bahan yang difermentasi dilakukan setiap hari dengan mencacat suhu ruang dan di dalam kontainer, embun yang timbul dan perkembangan jamur. Pengambilan Cairan Rumen Pengambilan cairan rumen menggunakan alat aspirator kemudian cairan rumen tersebut dimasukkan ke dalam termos yang suhunya telah disesuaikan. Cairan rumen berasal dari satu ekor sapi PO (Peranakan Ongole) berfistula. Pengambilan cairan rumen dilakukan sebelum sapi diberi pakan pada pukul enam pagi, kemudian cairan rumen dibawa ke laboratorium, disaring dengan menggunakan 3 lapis kain kasa dan ditampung. Penghitungan Kecernaan in Vitro Inkubasi 48 jam menghasilkan residu bahan pakan dalam syringe yang kemudian disaring menggunakan glass wool sehingga residu bahan pakan tertahan untuk selanjutnya diukur bahan kering dan bahan organik. Pengukuran bahan kering dilakukan dengan memanaskan residu pakan di dalam oven suhu 105 °C selama 24 jam, sedangkan pengukuran bahan organik dilakukan dengan memanaskan residu dalam tanur suhu 550 °C selama 5 jam. Perhitungan kecernaan bahan kering dan bahan organik berdasarkan metode yang dilakukan Blümmel et al., (1997) seperti yang dilakukan Sofyan (2011). % KcBK =
BK sampel – BK residu x 100% BK sampel
% KcBO =
BO sampel − (BK residu – BA residu) x 100% BO sampel
Keterangan: KcBK = Kecernaan Bahan Kering (%) KcBO = Kecernaan Bahan Organik (%) BK sampel = Berat bahan kering sampel (mg) BK residu = Berat bahan kering residu (mg) BO sampel = Berat bahan organik sampel (mg) BA residu = Berat abu residu (mg)
Penghitungan Populasi Protozoa Jumlah populasi protozoa yang ada di cairan rumen dihitung dengan menggunakan hemocytometer dengan pewarnaan menggunakan MFS (Methylgreen Formalin Salin) solution (Ogimoto & Imai, 1981). Komponen MFS solution terdiri dari 35% formaldehid solution 100 ml, aquades 900 ml, Methylgreen 0,6 g dan NaCl 8,0 g. Dari 1 ml sampel cairan rumen ditambahkan 5 ml MFS Solution. Cairan rumen sebanyak 1 ml dihitung jumlah protozoa dengan cara sampling yaitu 4 kotak, sedangkan setiap tepi masing-masing berjumlah 16 kotak kecil pada hemocytometer. Jumlah protozoa per ml (N) adalah N x 104 x faktor pengenceran (Ogimoto & Imai, 1981). Penghitungan Produksi Amonia Konsentrasi amonia diukur menggunakan spektrofotometri (Broderick & Kang, 1980) seperti yang dilakukan Sofyan (2011). Sampel cairan rumen-buffer diambil setelah inkubasi 48 jam sebanyak 0,4 ml ditambah 0,2 ml larutan A (10% sodium tungstat) dan 0,2 ml larutan B (H2SO4 1 N) disentrifugasi pada 3000 x g selama 15 menit dilanjutkan sentrifugasi pada 10.000 x g selama 10 menit. Sebanyak 10 µl supernatan diencerkan dengan 10 µl akuades, ditambah 2,5 ml larutan C (larutan fenol) dan 2,5 ml larutan D (sodium hypochlorida 5%). Larutan campuran dipanaskan pada suhu 40 °C selama 30 menit kemudian absorbansi sampel dibaca dengan spektofotometri dengan panjang gelombang (λ) 630 nm. Perhitungan kadar NH3 dihitung dengan persamaan kurva standar sebagai berikut: Y = 0,030X + 0,170 (R2=0,884) Keterangan:
Y = Absorbansi sampel X = Kadar NH3 (mg/100ml)
Penghitungan Konsentrasi Gas Metana Konsentrasi gas metana didapat dalam persentase gas metana dalam 10 ml gas yang dihasilkan saat release gas yaitu dalam jam 18 waktu inkubasi. Sampel
dianalisis dengan metode gas kromatografi menggunakan alat GC-14 Shimadzu dilengkapi dengan Proparak Q Column (50°C) dan detektor flame ionization detektor (150°C) (Petersen & Ambus, 2006). Penghitungan Nilai Asam Lemak Terbang (VFA) Pengukuran VFA dilakukan dengan metode gas chromatography (Frigens et al. (1998) seperti yang dilakukan oleh Sofyan (2011). Cairan rumen yang sudah disentrifuge dengan 3000 RPM selama 10 menit dari setiap perlakuan diambil sebanyak 0,5 ml kemudian ditambahkan 0,1 ml metaphospat. Sampel sebanyak 1µl diinjeksi ke dalam packed column tipe GP10% SP-1200/1% H3PO4 on 80/100 Chromosorb WAW (Supelco, Bellefonte, PA) pada GC (Shimadzu 8-A) yang dilengkapi dengan detector FID (Flame Ionization Detector). Hasil kurva yang tercatat pada kromatogram dianalisis untuk perhitungan konsentrasi VFA individual (asetat, propionat, butirat) dengan rumus sebagai berikut: Vi (mM) = Keterangan :
LAs LAst
x KVst (mM) Vi = Kadar VFA individual (mM) LAs = Luas area sampel pada kromatogram Last = Luas area standar dari VFA individual KVs = Konsentrasi VFA standar terdiri dari: asetat (40mM), propionat (10mM) dan butirat (10mM)
Gas Test Pakan yang dipakai untuk gas tes hanya pakan gaplek fermentasi dengan inokulum S. cerevisiae karena sudah diketahui kualitas fisik dan kimianya merupakan yang terbaik dibandingkan dengan pakan dedak. Sebelum diuji gas test terlebih dahulu dilakukan persiapan pembuatan reagen berupa buffer + media yang terdiri dari larutan makromineral, mikromineral, buffer, resazurin, dan reducing yang dicampur ke dalam aquades. Bahan kering pakan gaplek fermentasi dan yang bukan fermentasi terlebih dahulu disamakan. Pengukuran produksi gas berdasarkan metode Menke & Steingass (1988). Sampel pakan yang digunakan sebagai substrat dimasukkan ke dalam syringe dan diinkubasi pada suhu 39°C agar kondisinya sama seperti di dalam rumen. Medium fermentasi dibuat dengan mencampur cairan rumen dengan larutan buffer + media. Bahan tersebut dihomogenkan dalam labu Erlenmeyer sambil dialiri gas CO2, kemudian cairan rumen ditambahkan ke dalam labu Erlenmeyer tersebut. Larutan
yang berwarna kebiru-biruan akan berubah menjadi kemerah-merahan sampai tidak berwarna yang menunjukkan kondisi sudah anaerob. Larutan medium dimasukkan ke dalam syringe yang telah berisi substrat. Gas CO2 dialirkan beberapa saat untuk menjaga agar kondisinya tetap anaerob, selanjutnya ditutup dengan piston dan klip pada pipa syringe ditutup. Volume awal dibaca pada skala yang terdapat pada syringe dan dicatat sebagai V0, selanjutnya diinkubasi pada suhu 39°C. Blanko dibuat untuk koreksi dengan cara seperti di atas, namun tanpa penambahan bahan pakan. Kenaikan volume gas dicatat setelah inkubasi selama 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, dan 48 jam. Pada saat tertentu bila volume gas sudah maksimum gas dikeluarkan dengan membuka klip dan volume dikembalikan ke posisi V0. Kinetika produksi gas dianalisis dengan menggunakan persamaan eksponensial yang dibuat oleh Ørskov & McDonald (1979) berikut: p = a+b (1 – e-ct) Nilai p (ml) adalah produksi gas kumulatif pada waktu t jam, sedangkan a, b, c merupakan konstanta dari persamaan eksponensial tersebut. Konstanta diartikan sebagai produksi gas dari fraksi yang mudah larut (a), produksi gas dari fraksi yang tidak larut namun dapat difermentasikan (b) dan laju reaksi pembentukan gas (c). Penghitungan konstanta dilakukan dengan menggunakan curve fitting program pada Microsoft Excel menggunakan metode Neway (Chen, 1994). Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 7 perlakuan dan 3 ulangan. Perlakuan yang diujikan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 4. Peubah yang diamati pada penelitian ini adalah kualitas pakan fermentasi, kecernaan in vitro, jumlah protozoa, konsentrasi amonia (NH3), konsentrasi gas metana (CH4), nilai VFA, dan produksi gas. Data kualitas pakan fermentasi dianalisis secara deskriptif. Data kecernaan in vitro, jumlah protozoa, konsentrasi amonia, konsentrasi gas metana, nilai VFA dan produksi gas yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) dan jika antar perlakuan menunjukkan berbeda nyata pada level P<0,05 dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan (Steel and Torrie, 1981).
Tabel 4. Perlakuan pada Percobaan Produksi Gas Perlakuan P PO POA PM PMA PA PMO
Total BK (mg) 380,00 391,45 399,17 391,17 398,14 380,01 387,72
Keterangan: P = Pennisetum hybrid PO = Pennisetum hybrid dan Mineral organik (3%) POA = Pennisetum hybrid, Mineral organik (3%) dan Azadirachta indica (2%) PM = Pennisetum hybrid dan Mineral anorganik (3%) PMA = Pennisetum hybrid, Mineral anorganik (3%) dan Azadirachta indica (2%) PA = Pennisetum hybrid dan Azadirachta indica (2%) PMO = Pennisetum hybrid dan Monensin (40 ppm)
