MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan mulai Mei sampai dengan Agustus 2011 di Laboratorium Terpadu dan Laboratorium Industri Pakan, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Materi Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain: bungkil inti sawit (BIS). Enzim mannan komersial dan enzim cairan rumen, dan bahan-bahan untuk analisis laboratorium. Alat yang digunakan antara lain Rika moisture meter, Hammer mill, Gelas ukur 500 ml, sudip, penggaris, jangka sorong, Shaker water bath, timbangan digital, tabung sentrifuse, vortex mixer, kertas saring, oven 105°C, pH meter, baki plastik, sentrifuge, tabung reaksi, Erlenmeyer, labu ukur, gelas piala, pipet mikro, pipet volumetrik, wiseclean dan spektrofotometer. Prosedur Persiapan Bungkil Inti Sawit dan Pengayakan Bungkil inti sawit yang digunakan dalam uji fisik digiling terlebih dahulu menggunakan Hammer mill 2 mm. Bungkil inti sawit hasil gilingan diayak menggunakan Rika Moisture Meter (Gambar 4). Pengayakan dilakukan dengan cara digetarkan sampai bungkil tersaring habis sesuai ukuran.
Gambar 4. Rika Moisture Meter Hasil pengayakan diperoleh pada mesh 16, 30, 50 dan 100. Bungkil inti sawit hasil ayakan dengan masing-masing ukuran dilakukan uji fisik (sudut tumpukan, kerapatan tumpukan, kerapatan pemadatan tumpukan, daya ambang, berat jenis, derajat keasaman, kelarutan total dan tingkat kehalusan) masing-masing tiga kali ulangan.
14
Prosedur Pengukuran Berat Jenis (Spesific Grafity) Berat jenis diukur dengan menggunakan metode Khalil (1999). Bahan dimasukan ke dalam galas ukur 100 ml dengan menggunakan sendok teh secara perlahan sampai volume 30 ml. Gelas ukur yang sudah berisi bahan ditimbang. Aquades sebanyak 50 ml dimasukan ke dalam gelas ukur. Pengadukan menggunakan pengaduk mika dilakukan untuk menghilangkan udara antar partikel. Sisa bahan yang menempel pada pengaduk dimasukan dengan menyemprotkan aquades dan ditambahkan kedalam volume awal. Pembacaan volume akhir dilakukan setelah konstan. Perubahan volume aquades merupakan volume bahan sesungguhnya. Berat jenis dapat dihitung dengan rumus di bawah ini : Bobot bahan pakan (g) BJ =
Perubahan volume akuades (ml)
Prosedur Pengukuran Kerapatan Tumpukan (Bulk density) Kerapatan tumpukan diukur dengan menggunakan metode Khalil (1999). Bahan dicurahkan ke dalam gelas ukur dengan menggunakan corong dan sendok teh sampai volume 100 ml. Gelas ukur yang telah berisi bahan ditimbang. Adapun perhitungan kerapatan tumpukan adalah dengan cara membagi berat bahan dengan volume ruang yang ditempati. Prosedur Pengukuran Kerapatan Pemadatan Tumpukan (Compacted Bulk Density) Kerapatan pemadatan tumpukan diukur dengan menggunakan metode khalil (1999). Pengukuran hampir sama dengan pengukuran kerapatan tumpukan, namun volume bahan dibaca setelah dilakukan pemadatan dengan cara menggoyanggoyangkan gelas ukur dengan tangan selama 10 menit. Prosedur Pengukuran Daya Ambang (Floating Rate) Daya ambang diukur dengan cara menjatuhkan 10 gram partikel bahan pada ketinggian 2 meter dari dasar lantai, kemudian diukur lamanya waktu (detik) yang dibutuhkan sampai mencapai lantai dengan menggunakan
stopwatch (Khalil,
1999). Lantai tempat jatuhnya bahan diberi alas dengan alumunium foil untuk memudahkan pengamatan saat bahan jatuh. Diupayakan pengaruh udara diperkecil yaitu dengan menutup setiap lubang yang memungkinkan angin masuk (ventilasi,
15
jendela, pintu). Daya ambang dihitung dengan cara membagi jarak jatuh (meter) dengan lamanya waktu yang dibutuhkan (detik). Prosedur Pengukuran Sudut Tumpukan (Angle of Respose) Pengukuran sudut tumpukan dilakukan menggunakan metode Khalil (1999) dengan cara menjatuhkan bahan pada ketinggian 15 cm melalui corong pada bidang datar. Ketinggian tumpukan bahan harus selalu berada di bawah corong. Untuk mengurangi pengaruh tekanan dan kecepatan laju aliran bahan, pengukuran bahan dilakukan dengan volume tertentu (100 ml) dan dicurahkan perlahan-lahan pada dinding corong dengan bantuan sendok pada posisi corong tetap sehingga diusahakan jatuhnya bahan selalu konstan. Sudut tumpukan bahan ditentukan dengan mengukur diameter dasar (d) dan tinggi (t) tumpukan. Besarnya sudut tumpukan dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : tg α =
t 0,5d
=
2t d
Prosedur Pengukuran Tingkat Kehalusan (Modulus of Fineness) Tingkat kehalusan diukur mengacu pada metode Khalil (1999) dengan cara memasukan bahan sebanyak 300 gr kedalam alat yang terdiri dari susunan rantang yang memiliki lubang sesuai dengan besarnya ukuran mesh. Besarnya sampel yang lolos pada setiap mesh didapat dari perhitungan Berat sampel pada mesh tertentu (g) % sampel =
X 100 Total bahan (g)
Setelah diketahui persentase (%) sampel pada setiap mesh, dapat dihitung nilai konversi dengan cara : Nilai konversi = % sampel x no. perjanjian Nomor perjanjian adalah besarnya nomor yang diberikan pada setiap rantang yaitu berurutan dari 1 hingga 7 (dari mesh terkecil hingga mesh terbesar). Jumlah total nilai konversi dibagi seratus merupakan besarnya tingkat kehalusan (MF/ Modulus of fineness). MF = Total nilai konversi / 100
16
Prosedur Pengukuran Uji Kelarutan total (Total solubility) Uji kelarutan dilakukan dengan cara mencampurkan 0,25 gram tepung BIS dengan 25 ml akuades. Selanjutnya, larutan di sentrifuse sehingga diperoleh padatan dan cairan. Jumlah padatan dikeringkan (oven 105°C) dan ditimbang (Stefanon et al., 1996). Perhitungan dalam uji kelarutan yaitu sebagai berikut: Kelarutan = (x-y) x 100% x Keterangan : x = bobot awal (gram) y = bobot setelah di oven (gram) Prosedur Pengukuran Pengukuran pH (Acidity) Derajat keasaman bahan diukur dengan cara melarutkan sampel kedalam aquades dengan perbandingan 1:5 selama 15 menit selanjutnya diukur pHnya (Apriyantono et al., 2000). Persiapan Enzim Cairan Rumen Isi rumen sapi diambil dari sapi yang dipotong di RPH Elders, IPB Bogor. Pengambilan sampel isi rumen dari masing-masing sapi dilakukan pada pagi hari, dalam dua kali ulangan dan setiap ulangan diambil dari sampel yang berasal dari 3-5 ekor sapi. Cairan rumen diambil dari isi rumen sapi dengan cara filtrasi dibawah kondisi dingin. Cairan hasil filtrasi disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan supernatan dari isi sel mikroba (Lee et al., 2000). Supernatan kemudian diambil sebagai sumber enzim kasar (Murni, 2003). Pengukuran Kandungan Gula Pereduksi Pemberian Enzim dan Proses Ekstraksi. Bungkil inti sawit mesh 30 (hasil ayakan terbanyak) diberi enzim komersil dan enzim cairan rumen. Penambahan enzim pada bungkil inti sawit dilakukan dengan cara disemprotkan secara merata. Bungkil inti sawit yang telah tercampur dengan enzim kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam dan dihasilkan sampel yang digunakan untuk uji gula pereduksi. Pemberian enzim pada bungkil inti sawit hasil ayakan adalah sebanyak 0,1ml/gram BIS (setara dengan 919,27x106 U/liter enzim mannanase komersial dan 0,013x106 U/liter enzim cairan rumen).
17
Enzim yang diberikan pada bungkil inti sawit hasil ayakan terlebih dahulu diukur aktivitasnya. Proses ekstraksi sampel dilakukan dengan cara menimbang sampel 5 gram, sampel yang telah ditimbang dicampur dengan 30 ml ethanol 80%. Sampel dishaker selama 30 menit kemudian disaring untuk mendapatkan endapannya dan filtratnya ditampung. Setelah selesai, endapan yang terdapat dikertas saring diambil dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. Hasil endapan yang diambil dari kertas saring dicampur dengan 30 ml ethanol 80% dan di shaker selama 30 menit. Hasil sampel yang telah dishaker disaring, filtrat ditampung di tempat tampungan awal. Endapan dari Erlenmeyer disaring dan endapan dicuci menggunakan akuades sampai tiga kali. Hasil filtrat seluruhnya disimpan di Erlenmeyer kemudian ditambah CaCO 3 sebanyak 5 sendok makan. Hasil campuran filtrat dengan CaCO 3 dipanaskan pada penangas air 80 °C selama 30 menit untuk membunuh enzim atau menghentikan aktivitas enzim. Pemanasan yang dilakukan tidak boleh sampai kering, oleh karena itu harus ditambahkan akuades jika filtrat yang dipanaskan mulai berkurang, pemanasan dilakukan sampai alkohol hilang (dengan penciuman) dan dilakukan kurang lebih 2 jam. Pb asetat jenuh ditambahkan satu kali ambil pipet atau 1 ml setelah alkohol dalam filtrat hilang, dihomogenkan dan disaring langsung ke labu ukur 100 ml kemudian dicuci terus dengan akuades. Labu ukur ditera dan ditambahkan Natrium Oksalat/ Kalium Oksalat 1-1,5 gram, larutan dihomogenkan dengan pengocokan. Hasil dari pengocokan disaring dengan menggunakan Whatman 42. Preparasi HPLC menggunakan saringan filter 0,45μ. Analisis Gula Pereduksi. Analisis dilakukan menggunakan metode DNS (Miller, 1959) dengan membuat pereaksi DNS terlebih dahulu. Asam 3,5-dinitrosalisilat sebanyak 10,6 gram dilarutkan dengan 19,8 gram NaOH ke dalam 1416 ml air. Kemudian ditambahkan 306 gram NaK-Tartrat, 7,6 ml fenol (dicairkan pada suhu 50 °C) dan 8,3 gram Na-metabisulfit dihomogenkan. Titrasi 3 ml pereaksi DNS dengan HCL 0,1 N dan indikator fenolftalein. Larutan gula standar 0,2-5,0 mg/ml. Sampel harus dalam bentuk cairan jernih, jika tidak jernih atau banyak mengandung komponen lain maka harus diperlakukan dulu seperti pada prosedur persiapan sampel. Masukkan 1 ml sampel ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Tempatkan dalam air mendidih selama 5 menit
18
dan dinginkan di suhu ruang. Sampel diencerkan sampai dapat terukur pada kisaran 20%-80% T pada panjang gelombang 550 nm. Air digunakan sebagai blanko. Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan glukosa standar dengan kisaran 0,2-5 mg/ml. Pereaksi DNS 3 ml bereaksi dengan ± 10 mg glukosa. Sampel diencerkan sampai mengandung kurang dari 5 mg glukosa. Skema Penelitian Penelitian dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama terdiri atas uji fisik dan uji kimia bungkil inti sawit (Gambar 5). Tahap kedua terdiri dari uji kandungan gula pereduksi bungkil inti sawit dengan penambahan enzim mannanase (Gambar 6). Bungkil Inti Sawit
Digiling menggunakan Hammer Mill Bungkil Inti Sawit Hasil Gilingan
Diayak
menggunakan
Rika
Moisture
Meter**
BIS Mesh 16
BIS Mesh 30
BIS Mesh 50
BIS Mesh 100
Uji Fisik masing-masing tiga ulangan
**: Jumlah Hasil Ayakan Terbanyak yang Digunakan dalam Penelitian Tahap II
Gambar 5. Skema Tahap I. Uji Fisik dan Kimia Bungkil Inti Sawit
19
BIS Hasil Ayakan Terbanyak Penambahan Enzim (disemprot, inkubasi 24 jam)
BIS + 0,1ml/gram BIS
BIS + 0,1ml/gram BIS
Enzim Komersial
Enzim Cairan Rumen
Uji Jumlah Gula Pereduksi (Metode DNS) Masing-Masing Tiga Ulangan
Diperoleh hasil analisis total gula pereduksi
Gambar 6. Tahap II. Uji Kandungan Gula Pereduksi Bungkil Inti Sawit dengan Penambahan Enzim Mannanase Rancangan dan Analisis Data Perlakuan Penelitian terdiri atas empat perlakuan pada uji fisik yaitu uji fisik pada bungkil inti sawit hasil ayakan ukuran mesh 16, ukuran mesh 30, ukuran mesh 50 dan ukuran mesh 100. Penelitian
penambahan enzim terdapat dua perlakuan yaitu
enzim mannan komersial (setara dengan 919,27x106 U/liter) dan enzim cairan rumen, masing-masing sebanyak 0,1 ml mannanase /gram BIS (0,013x106 U/liter enzim cairan rumen) dan kontrol yang digunakan adalah enzim 0 ml/gram BIS. Model Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan model matematika yang digunakan dapat dilihat di bawah ini: Yij = μ + τi + εij
20
Keterangan: Y ij µ τi ε ij i j
= = = = = =
nilai unit percobaan pada perlakuan uji ke-i, ulangan ke-j rataan umum pengaruh uji ke-i pengaruh galat percobaan perlakuan ulangan (1, 2, 3)
Peubah yang Diamati Peubah yang diamati dalam penelitian berupa berat jenis, kerapatan tumpukan, kerapatan pemadatan tumpukan, daya ambang, tingkat kehalusan, sudut tumpukan, pH, kelarutan total dan jumlah gula pereduksi. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis ragam (ANOVA). Jika terdapat perbedaan yang nyata dilakukan uji lanjut Duncan (Steel and Torrie,1995).
21
