MATERI DAN METODE Lokasi dan waktu Penelitian dilakukan selama 8 bulan di Laboratorium Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dimulai pada bulan April sampai dengan November 2011. Materi Bahan yang digunakan untuk memproduksi bakteriosin adalah L. plantarum 2C12 (asal daging sapi, koleksi Lab. Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan IPB), media De Man Rogosa and Sharpe broth (MRSB), yeast extract (YE) 3%, NaCl 1%, NaOH 0,1 N, ammonium sulfat, buffer kalium fospat dan membran diálisis.Bahan-bahan yang diperlukan untuk pembuatan bakso adalah daging sapi, tepung tapioka, STPP, garam, es batu, bawang putih, nitrit dan merica. Bahan untuk uji proksimat adalah K2SO4, Se, hidrogen peroksida, asam salwin yang terbuat dari HClO4 (60%) dan asam asetat glasial dengan perbandingan 1:1, dan akuades. Alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya tabung reaksi, rak tabung reaksi, Ose, cawan petri, membran saring Sartorius, gelas ukur, pipet volumetrik, mikro pipet, pipet Pasteur, sentrifuse, incubator, refrigerator, membran dialisis, alumunium foil, kapas, oven, otoklaf, vortex, pH meter, botol Schott, bunsen. Alat-alat untuk pembuatan bakso adalah food processor, peralatan dapur, timbangan digital. Alat untuk analisis fisik bakso yaitu texture analyzer TA-XT2i, dan pH meter. Alat untuk uji proksimat adalah labu Kjeldahl, tabung van Gulik, labu ukur, Kjeltec Auto 1030 analyzer, dan water bath. Prosedur Peubah yang Diamati Penelitian tahap konfirmasi aktivitas antimikrob bakteriosin dari L. plantarum, peubah yang diamati adalah diameter zona hambat. Sebelum dilakukan penelitian aplikasi bakteriosin L. plantarum, daging sapi sebagai bahan baku dianalisis kualitasnya meliputi pH, aw, total mikroba, E. coli dan salmonella sp.
19
Analisis dilakukan secara komposit. Data dibandingkan dengan SNI untuk kualitas daging sapi. Konfirmasi Aktivitas Antimikrob Bakteriosin dari L. plantarum 2C12 Produksi Bakteriosin Kasar. Sebanyak 1 liter media MRS – broth ditambah yeast extract 3% dan NaCl 1%, kemudian diinokulasi dengan 10% (v/v) kultur Lactobacillus plantarum 2C12, setelah itu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 20 jam (Ogunbawo et al., 2003), kemudian disimpan pada refrigerator suhu 4 oC selama 2 jam. Dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 o
C, dan dilakukan penyaringan dengan menggunakan membran saring Sartorius,
selanjutnya supernatan bebas sel dinetralkan pH-nya menjadi pH 6 dengan menggunakan 0,1 N NaOH. Serbuk ammonium sulfat ditambahkan sebanyak 80% secara bertahap ke dalam supernatan antimikroba yang telah disaring steril untuk menghasilkan endapan protein, kemudian dihomogenkan menggunakan stirer secara perlahan pada suhu 4 oC selama 2 jam. Supernatan selanjutnya dibuang dan didapatkan presipitat bakteriosin. Presipitat dikoleksi pada satu tabung Falcon ukuran 50 ml. Presipitat bakteriosin tersebut didialisis dengan menggunakan membran dialisis berdiamater 2 cm dan buffer yang digunakan adalah kalium fospat selama 12 jam, selanjutnya dilakukan penggantian buffer sebanyak dua kali pada 2 dan 4 jam dengan suhu 4oC sehingga akan didapatkan ekstrak bakteriosin kasar (Hata et al, 2010). Uji Kemampuan Antagonistik Bakteriosin pada Berbagai Mikroba dengan Metode Difusi Sumur (Savadogo et al., 2006). Ekstrak bakteriosin kasar hasil dialisis dipersiapkan. Metode yang digunakan adalah difusi sumur (Savadogo et al., 2006). Kultur bakteri indikator (patogen dan pembusuk makanan) sebanyak 107 cfu/ml yang berumur 24 jam dipipet ke dalam cawan petri dan ditambahkan media konfrontasi muller hinton medium agar sebanyak ±20 ml. Setelah agar dalam cawan mengeras, ditengah-tengah agar dibuat lubang sumur dengan menggunakan cork borer berdiameter 5 mm. Bakteriosin kasar kemudian dipipet ke dalam lubang sumur sebanyak 50 µl kemudian disimpan dalam refrigerator (suhu 4 °C) untuk memberikan kesempatan bakteriosin meresap ke
20
dalam agar selama lebih kurang dua jam. Selanjutnya agar diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Penghambatan berupa zona bening di sekeliling sumur yang dihasilkan diamati. Zona bening yang terbentuk di sekitar area sumur menandakan bahwa bakteriosin kasar mampu menghambat bakteri indikator. Diameter zona penghambatan diukur dengan menggunakan jangka sorong. Tiap areal bening diukur diameternya sebanyak tiga kali di tempat yang berbeda dan hasilnya dirata-ratakan. Penelitian Aplikasi Bakteriosin Kasar dari L. plantarum 2C12 pada Bakso Pembuatan Bakso. Daging segar dipotong-potong. Daging kemudian digiling dalam food proccessor bersama garam, STTP, ½ bagian es batu dan ditambah 0,3% bakteriosin. Bumbu-bumbu seperti merica, bawang putih, tepung tapioka, penyedap dan sisa ½ bagian es ditambahkan ke dalam adonan. Adonan kembali digiling sampai tercampur rata dan menjadi legit. Adonan tersebut lalu dibentuk bulat-bulat dan dimasukkan ke dalam air hangat. Bakso direbus sampai matang (kurang lebih 10-15 menit) pada suhu 80 ºC hingga mengambang kemudian direbus kembali pada suhu 100 ºC (kurang lebih 10-15 menit). Formulasi pembuatan bakso pada penelitian ini adalah:
Daging segar (62,5%), tepung tapioka (20%-30%), STPP (0,5%-0,8%),
garam (3%-3,5%), es batu (35%), bawang putih (0,75%), merica (0,75%), dan penyedap rasa (0,5%). Diagram alir proses pembuatan bakso dapat dilihat pada Gambar 2. Pengukuran Peubah. Peubah yang diukur meliputi nilai gizi, kualitas fisik dan mikrobiologi. Pengambilan sampel pada uji nilai gizi bakso dilakukan secara komposit hanya pada hari ke-0 (sebelum disimpan). Data yang diperoleh dibandingkan dengan kualitas SNI untuk menentukan mutu bakso. Nilai gizi yang dianalisis adalah kadar air, kadar protein, kadar lemak, kadar abu dan kadar karbohidrat. Peubah yang diamati pada Analisis kualitas fisik bakso adalah nilai pH bakso, aw bakso dan daya serap air bakso. Analisis kualitas mikrobiologi dilakukan dengan peubah TPC/ total mikroba, total E. coli dan total salmonella. Peubah yang diamati pada analisis kualitas fisik dan mikrobiologi bakso dilakukan pada sebelum penyimpanan (H-0) dan saat penyimpanan (H-3 dan H-6).
21
daging Dipotong-potong
Garam, STPP, ½ bagian es
Penggilingan dengan food processor
Penggilingan kembali
Merica, bawang putih, tepung tapioka, dan sisa ½ bagian es
Adonan ditempatkan dalam wadah Pencetakan
Dimasukkan dalam air bersuhu 50-60 °C selama 10 menit Perebusan (air bersuhu 100 °C selama 10 menit)
Bakso matang Bakso Ditiriskan dan langsung uji kimia, mikrobiologi , fisik dan organoleptik (hari ke- 0) Penyimpanan suhu refrigerator selama 6 hari Analisis kualitas mikrobiologi, fisik, dan organoleptik (hari ke- 3,dan 6 hari)
Catatan: 1. Bakteriosin dimasukkan bersamaan dengan garam, STPP dan ½ bagian es batu 2. Nitrit dimasukkan bersamaan dengan bumbu-bumbu dan sisa ½ bagian es batu Gambar 2. Diagram Alir Proses Pembuatan Bakso
22
Pengujian Kadar Air (AOAC, 1995). Sebanyak 5 g sampel bakso ditempatkan dalam cawan porselin yang berat kering totalnya sudah diketahui. Cawan beserta isinya dipanaskan dalam oven dengan suhu 105 oC (selama 20 jam) hingga beratnya konstan. Sampel didinginkan ke dalam desikator. Sampel dan cawan ditimbang dan kadar air dihitung dengan rumus:
Kadar air =
Berat awal - berat akhir (g) 100 % Berat awal (g)
Pengujian Kadar Protein (AOAC, 1995). Kadar protein ditetapkan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel bakso sebanyak 250 mg dimasukkan secara kuantitatif ke dalam tabung pencerna dan ditambah satu sendok kecil katalisator spesial 5-35 g dengan komposisi 3,5 g K2SO4 + 0,0035 g Se. Campuran kemudian ditambahkan asam sulfat pekat 2,5 ml dan dipanaskan pada sistem pencerna. Hidrogen peroksida sebanyak lima tetes ditambahkan melalui sisi tabung. Larutan yang sudah jernih kemudian ditambah dengan 25 ml akuades. Distilasi dan titrasi dilakukan secara otomatis pada Kjeltec Auto 1030 analyzer. Blangko ditentukan dengan cara sama tanpa menambah contoh. Titik akhir dicapai pada saat larutan berwarna merah muda. Kadar protein =
14,01 N F 100 2
(A
B)
Ket : 14,01 = Berat atom nitrogen F = Faktor konversi (6,25) N = Konsetrasi HCl B = Volume titran blanko (ml) A = Volume titran contoh Pengujian Kadar Lemak (AOAC, 1995). Kadar lemak diukur dengan menggunakan metode Soxhlet yaitu sebanyak 5 g sampel dimasukkan ke dalam selongsong kemudian ditutup dengan kapas dan di streples. Selongsong penyaring yang berisi sampel dimasukkan ke dalam alat soxhlet. Pelarut lemak (kloroform) dimasukkan sebanyak 100-200 ml ke dalam labu didihnya, kemudian dilakukan ekstraksi selama 6 jam, setelah itu, sampel yang telah diekstraksi dan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 oC. Sampel yang sudah dikeringkan
23
dimasukkan ke dalam eksikator selama 15 menit. Lemak yang tinggal di dalam wadah dihitung beratnya. Pengujian Kadar Abu (AOAC, 1995). Sebanyak 5 g sampel bakso ditempatkan dalam cawan porselen yang berat kering totalnya sudah diketahui. Wadah beserta isinya dimasukkan dalam tanur (500 oC) selama 5 jam sehingga diperoleh abu. Abu yang dihasilkan dititrasi dengan mengunakan larutan AgNO3 0,1 N. Kadar abu diperoleh dari kadar NaCl yang tertitrasi yang dihitung dengan rumus: Kadar abu =
x 100%
Penghitungan Kadar Karbohidrat (AOAC, 1995). Kadar karbohidrat dapat dihitung dengan rumus: Karbohidrat (%) = 100% - % kadar air - % kadar lemak - % kadar protein - % kadar abu Pengujian Nilai pH Bakso. Sampel bakso diukur dengan menggunakan pHmeter merek Shott. Instrument dikalibrasi dengan larutan buffer dengan nilai pH 4 dan 7. Sampel bakso ditimbang 5 gram dan dihancurkan, kemudian ditambah akuades 45 ml lalu campuran tersebut dihomogenkan, sampel dipindahkan ke dalam gelas ukur, pH-meter dicelupkan ke dalam sampel kira-kira 2-4 cm. Nilai pH diperoleh dengan membaca skala yang tertera pada alat tersebut (AOAC, 1995). Analisis Aktivitas Air (aw). Pengukuran aw dilakukan dengan menggunakan alat Novasina ms1 set-aw. Sebanyak 1 g sampel bakso ditempatkan dalam wadah kemudian dimasukan ke dalam alat yang sebelumnya sudah dikalibrasi dengan Novasina SAL-T & Sensor-Check SC nomor 75. Nilai aw adalah nilai pertama terlihat ketika tanda segitiga di bagian bawah mencapai empat buah. Analisis Daya Serap Air (Fardiaz, 1992). Sampel bakso sebanyak 1 g disiapkan dalam bentuk halus, kemudian sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 10 ml air dan selanjutkan dikocok menggunakan vortex. Sampel didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit. Setelah 30 menit, tabung reaksi disentrifuse selama 30 menit dengan kecepatan 3500 rpm, kemudian jumlah supernatan yang terbentuk diukur menggunakan gelas ukur.
24
Daya Serap Air (g/ml) = Jumlah air yang ditambahkan – Jumlah supernatan yang dibentuk Total Mikroba (Dewan Standardisasi Nasional, 1995). Sebanyak 5 g sampel bakso dimasukkan ke dalam plastik steril lalu ditambahkan 45 ml NaCl 0,85% steril, kemudian dikocok diremas-remas hingga diperoleh campuran yang homogen. Sampel ini kemudian diencerkan dengan NaCl 0,85% hingga pengenceran kelima (10-5 ). Sampel dipipet secara aseptik pada pengenceran 10-3 sampai 10-5 dan sebanyak 1 ml dipipet ke dalam cawan petri steril dan tuang media plate count agar (PCA). Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 oC. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan formula penentuan jumlah koloni pada setiap perlakuan dengan jumlah koloni antara 25-250 cfu/g adalah: N=
xd
Analisis Kuantitatif Escherichia coli. Sebanyak 5 gram sampel bakso dimasukkan ke dalam plastik steril lalu ditambahkan 45 ml NaCl 0,85% steril, kemudian dikocok diremas-remas hingga diperoleh campuran yang homogen. Sampel ini kemudian diencerkan dengan NaCl 0,85% hingga pengenceran kelima (105). Sampel dipipet secara aseptik pada pengenceran 10-1 sampai 10-3 dan sebanyak 1 ml dipipet ke dalam cawan petri steril dan tuang media eosyn methylen blue agar (EMBA). Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 oC, koloni E coli yang tumbuh berwarna biru keunguan. Analisis Kualitatif Salmonella sp. Sampel bakso ditimbang sebanyak 5 g secara aseptis ke plastik berisi Lactose Broth 45 ml dan sampel diremas-remas dan dihomogenkan, lalu sampel diinkubasi pada suhu 37 oC, selama 24 jam. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ml campuran dipindahkan ke 9 ml media RappaportVassiliadis dan tetrathionate broth, lalu diinkubasi. Suspensi diambil dengan jarum ose dari masing-masing RV dan TTB yang telah diinkubasi dan diinokulasikan ke media bismuth sulfite agar, xilose lysine desoxycholate agar, dan hektoen enteric agar kemudian diinkubasi. Uji koloni yang muncul pada cawan yang dimungkinkan Salmonella ke media agar miring triple sugar ron agar (TSIA) dan lysine iron agar (LIA).
25
Identifikasi dilakukan dengan mengambil koloni yang diduga sebagai Salmonella dari ketiga media tersebut dan diinokulasikan koloni ke TSIA dan LIA dengan cara menggores pada permukaan agar miring, selanjutnya menusuk kedalam bagian tegak agar miring dan diinkubasi. Koloni spesifik Salmonella spp. diamati dengan merujuk pada hasil reaksi seperti tercantum pada Tabel 3. Tabel 3. Hasil Uji Salmonella spp. pada TSIA dan LIA Media
Agar Miring
Dasar Agar
H2S
Gas
TSIA
Alkalin/K
Asam/A
Positif
Negatif
(merah)
(kuning)
(hitam)
Positif
Alkalin/K
Asam/A
Positif
Negatif
(ungu)
(ungu)
(hitam)
Positif
LIA
Uji Kualitas Organoleptik. Uji organoleptik yang dilakukan adalah uji hedonik yang diamati pada hari ke-0 hingga hari ke-6 selama penyimpanan. Uji hedonik menggunakan skala 1 sampai 5. Pengujian melibatkan 30 orang panelis. Uji hedonik yang dilakukan meliputi karakteristik warna, kekenyalan, tekstur dan aroma, dengan nilai 1= sangat suka; 2= suka; 3= agak suka; 4= tidak suka; dan 5= sangat tidak suka Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian konfirmasi aktivitas antimikrob bakteriosin dari L. plantarum 2C12 adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan dengan menggunakan bakteri indikator yang berbeda (E. coli, S. aureus, Salmonella sp, dan Pseodomonas aerogenosa ). Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam (analysis of variance = ANOVA). Jika pada analisis ragam perlakuan menunjukkan pengaruh yang nyata, maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Steel dan Torrie, 1995). Model statistika yang digunakan sebagai berikut: Yijk = µ + αi + εij
26
Keterangan: Yijk
= Peubah respon ke-k karena pengaruh bersama taraf ke-i faktor bakteri indikator pada ulangan ke-k (k = 1,2,3)
µ
= Pengaruh rata-rata bakteri indikator
αi
= Pengaruh perlakuan bakteri indikator ke-i (i = 1, 2, 3, 4, 5)
εij
= Galat percobaan dari nilai respon ke-j dari perlakuan pada taraf ke-i
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian aplikasi bakteriosin pada produk bakso adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial dengan pola 3 x 3 dengan dua faktor dan tiga kali ulangan. Faktor pertama adalah pemberian pengawet (0%, bakteriosin 0,3% dan nitrit 0,3%). Faktor kedua adalah lama penyimpanan 0, 3, dan 6 hari pada suhu refrigerator (4 °C). Model Matematika yang digunakan pada penelitian ini adalah : Yijk = µ + Pi + Yj + PYij + €ijk Keterangan : Yijk = Variabel respon akibat pengaruh bakteriosin ke-i dan lama penyimpanan ke- j pada ulangan ke-k. μ
= nilai tengah umum
Pi
= Pengaruh perlakuan pengawet ke-i
Yj
= Pengaruh perlakuan lama penyimpanan ke-j
PYij
= Pengaruh interaksi antara bakteriosin ke-i dengan lama penyimpanan ke-j
€ij
= Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ke-j, terhadap ulangan ke-k, k = 1, 2, 3 Data diolah dengan analisis ragam (analysis of variance = ANOVA). Jika
pada analisis ragam perlakuan menunjukkan pengaruh yang nyata, maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Steel dan Torrie, 1995). Analisis data uji nilai gizi bakso menggunakan analisis secara deskriptif. Analisis data nilai pH dan a w bakso menggunakan uji Kruskal-Wallis. Analisis data uji kualitas mikrobiologis, analisis data dilakukan dengan menggunakan analisis deskriptif, kecuali data total mikroba dianalisis dengan uji Kruskal-Wallis. Uji organoleptik dilakukan dengan uji hedonik untuk melihat tingkat kesukaan konsumen. Hasil penilaian oganoleptik dianalisis dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan dengan menggunakan bahan
27
pengawet yang berbeda terhadap karakteristik warna, kekenyalan, tekstur dan aroma bakso. Model statistika yang digunakan sebagai berikut: Yijk = µ + αi + εij Keterangan: Yijk
= Peubah respon ke-k karena pengaruh bersama taraf ke-i faktor bahan pengwaet pada ulangan ke-k (k = 1,2,3)
µ
= Pengaruh rata-rata bahan pengawet
αi
= Pengaruh perlakuan bahan pengawet ke-i (i = 1, 2, 3, 4, 5)
εij
= Galat percobaan dari nilai respon ke-j dari perlakuan pada taraf ke-i
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam (analysis of variance = ANOVA). Jika pada analisis ragam perlakuan menunjukkan pengaruh yang nyata, maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Steel dan Torrie, 1995).
28
