96
Lampiran 1. Surat Keterangan Identifikasi Spons
97
98
Lampiran 2. Pembuatan Larutan untuk Uji Toksisitas terhadap Larva Artemia salina Leach
A.
Membuat Larutan Stok Diambil 20 mg sampel kemudian dilarutkan dalam pelarut hingga volumnya 2 mL untuk membuat larutan stok (induk). Perhitungan: Mstok
=
20 mg
=
=
2 ml 20 mg ×1000 2L 10 mg ×1000 1L
= 10000 mg/L = 10000 ppm
Jadi larutan stok yang tersedia mempunyai konsentrasi 10000 ppm dalam volum 2 mL = 2000 µL
B.
Membuat Larutan 1000 ppm Digunakan rumus pengenceran: Vlarutan x Mlarutan = Vstok x Mstok
Vstok =
V larutan x M larutan M stok
99
Dibuat larutan 1000 ppm dalam volum 5 mL, sehingga:
Vstok =
5 mL x 1000 ppm 10000 ppm
= 0,5 mL = 500 µL
Jadi, larutan stok yang diambil sebanyak 500 µL C.
Membuat Larutan 100 ppm Dibuat larutan 100 ppm dalam volum 5 mL, sehingga:
Vstok =
5 mL x 100 ppm 10000 ppm
= 0,05 mL = 50 µL
Jadi, larutan stok yang diambil sebanyak 50 µL
D.
Membuat Larutan 10 ppm Dibuat larutan 10 ppm dalam volum 5 mL, sehingga:
Vstok =
5 mL x 10 ppm 10000 ppm
= 0,005 mL = 5 µL
Jadi, larutan stok yang diambil sebanyak 5 µL
100
Lampiran 3. Perhitungan LC50 Ekstrak Etanol dan Metanol Spons Genus Haliclona Grant, 1836
A.
Ekstrak Etanol
1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak
Ulangan
Ekstrak kasar etanol
1 2 3
Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 3 6 1 8 2 7 20 70
1000 ppm 10 10 10 100
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 20 70 100 190
x2
y2
xy
1 4 9 14
400 4900 10000 15300
20 140 300 460
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
3)
Perhitungan gradien (m) xy − n1 ( x y )
m=
m
2
x − n1 ( x)
2
460 − 31 (6 ×190) = 14 − 13 (6)2
m= m=
460 − 380 14 − 12 80 2
= 40
101
4)
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (190 − 40 × 6) b = 13 190 − 240 b = 13 – 50 b = – 16, 66 5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 40x – 16,66 Grafik garis lurus, y = 40x – 16,66 Grafik Log Konsentrasi Ekstrak Etanol vs % Mortalitas Larva 120 % Mortalitas
6)
y = 40x - 16.66 R² = 0.979
100 80 60 40 20 0 0
0.5
1
1.5
2
Log Konsentrasi Ekstrak
2.5
3
3.5
102
7)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−16,66) 40 50 +16,66 40
=
66,66 40
= 1,67
LC50 = inv log 1,67 = 101,67 = 46,77 (Ekstrak etanol spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
B. Ekstrak Metanol 1)
Hasil Uji Larva Ekstrak
Ulangan
Ekstrak kasar metanol
1 2 3
Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 3 8 2 9 2 8 23,33 83,33
1000 ppm 10 10 10 100
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (C) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% mortalitas (y) 23,33 83,33 100 206,66
x2
y2
xy
1 4 9 14
544,29 6943,89 10000 17488,18
23,33 166,66 300 489,99
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
103
3)
Perhitungan gradien (m) m=
m=
m= m=
4)
xy − n1 ( x y ) 2
x − n1 ( x)
2
489,99 − 31 (6 ×206,66) 14 − 13 (6)2
489,99 −413,32 14 − 12 76,67 2
= 38,34
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (206,66 − 38,34 × 6) b = 13 206,66 − 230,04 b = 13 – 23,38 b = – 7, 79
5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 38,34x – 7,79
104
6) Grafik garis lurus, y = 38,34x – 7,79
Grafik Log Konsentrasi Ekstrak Metanol vs % Mortalitas Larva 120 y = 38.34x - 7.79 R² = 0.903
% Mortalitas
100 80 60 40 20 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Log Konsentrasi Ekstrak Metanol
7) Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−7,79) 38,34 50 +7,79 38,34
57,79
= 38,34 = 1,51
LC50 = inv log 1,51 = 101,51 = 32,36 (Ekstrak metanol spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
105
Lampiran 4. Perhitungan LC50 Hasil Partisi Ekstrak Metanol Spons Genus Haliclona Grant, 1836
A.
Ekstrak n-heksana
1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak
Ulangan 1 2 3
Ekstrak n-heksana Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 0 2 1 2 0 0 3,33 13,33
1000 ppm 8 8 5 70
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 3,33 13,33 70 86,66
x2
y2
xy
1 4 9 14
11,09 177,69 4900 15300
3,33 26,66 210 239,99
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
3)
Perhitungan gradien (m) m=
m=
m= m=
xy − n1 ( x y ) 2
x − n1 ( x)
2
239,99 − 31 (6 ×86,66) 14 − 13 (6)2
239,99 – 173,32 14 − 12 66,67 2
= 33,34
106
4)
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (86,66 − 33,34 × 6) b = 13 86,66 − 200,04 b = 13 – 113,38 b = – 37,79 Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 33,34x – 37,79 Grafik garis lurus, y = 33,34x – 37,79
Grafik Log Konsentrasi Ekstrak Partisi n-heksana vs % Mortalitas Larva 120
% Mortalitas
5)
y = 33.34x - 37.79 R² = 0.859
100 80 60 40 20 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
Log Konsentrasi Ekstrak n-Heksana
3
3.5
107
6)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−37,79) 33,34 50 +37,79 33,34
87,79
= 33,34 = 2, 63
LC50 = inv log 2,63 = 102,63 = 426,58 ppm (Ekstrak partisi n-heksana spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
B. Ekstrak kloroform 1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak Ekstrak kloroform Persen mortalitas
Ulangan 1 2 3
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 0 7 1 8 1 8 6,67 76,67
1000 ppm 8 10 9 90
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
108
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 6,67 76,67 90 173,34
x2
y2
xy
1 4 9 14
44,49 5878,29 8100 14022,78
6,67 153,34 270 430,01
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
3)
Perhitungan gradien (m) m=
m=
m= m=
4)
xy − n1 ( x y ) 2
x − n1 ( x)
2
430,01 − 31 (6 ×173,34) 14 − 13 (6)2
430,01 – 346,68 14 − 12 83,33 2
= 41,67
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (173,34 − 41,67 × 6) b = 13 173,34 − 250,02 b = 13 −76,68 b = – 25,56
109
5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 41,67x – 25,56
6)
Grafik garis lurus, y = 41,67x – 25,56 Grafik Log Konsentrasi Ekstrak Partisi Kloroform vs % Mortalitas Larva
% Mortalitas
120 y = 41.67x - 25.56 R² = 0.866
100 80 60 40 20 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Log Konsentrasi Ekstrak Kloroform
7)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−25,56) 41,67 50 +25,56 41,67
75,56
= 41,67 = 1,81
LC50 = inv log 1,81 = 101,81 = 64,57 (Ekstrak partisi kloroform spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
110
C.
Ekstrak air
1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak
Ulangan 1 2 3
Ekstrak air Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 0 4 1 3 1 7 6,67 46,67
1000 ppm 9 9 9 90
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 6,67 46,67 90 143,34
x2
y2
xy
1 4 9 14
44,49 2178,09 8100 10322,58
6,67 93,34 270 370,01
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
3)
Perhitungan gradien (m) m=
m=
m= m=
xy − n1 ( x y ) 2
x − n1 ( x)
2
370,01 − 31 (6 ×143,34) 14 − 13 (6)2
370,01 – 286,68 14 − 12 83,33 2
= 41,67
111
4)
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (143,34 − 41,67 × 6) b = 13 143,34 − 250,02 b = 13 −106,68 b = – 35,56 5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 41,67x – 35,56 Grafik garis lurus, y = 41,67x – 35,56 Grafik Log Konsentrasi Ekstrak Partisi Air vs % Mortalitas Larva 100
% Mortalitas
6)
y = 41.67x - 35.56 R² = 0.999
80 60 40 20 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
Log Konsentrasi Ekstrak Air
3
3.5
112
7)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−35,56) 41,67 50 +35,56 41,67
85,56
= 41,67 = 2,05
LC50 = inv log 2,05 = 102,05 = 112,20 (Ekstrak partisi air spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
113
Lampiran 5. Kromatogram Hasil Kromatografi Lapis Tipis dengan Berbagai Fase Gerak
A.
Eluen etil asetat : n-heksana
B. Eluen etanol : etil asetat
Keterangan:
Keterangan:
(1) Etil asetat : n-heksana (1 : 9)
(1) Etanol : etil asetat (7 : 3)
(2) Etil asetat : n-heksana (2 : 8)
(2) Etanol : etil asetat (8 : 2)
(3) Etil asetat : n-heksana (3 : 7) (4) Etil asetat : n-heksana (8 : 2) (5) Etil asetat : n-heksana (9 : 1)
114
C.
Eluen etil asetat : kloroform Keterangan: (1) Etil asetat : kloroform (2 : 8) (2) Etil asetat : kloroform (3 : 7) (3) Etil asetat : kloroform (5 : 5) (4) Etil asetat : kloroform (6 : 4) (5) Etil asetat : kloroform (7 : 3) (6) Etil asetat : kloroform (8 : 2) (7) Etil asetat : kloroform (9 : 1)
D.
Eluen Kloroform : n-heksana Keterangan: (1) Kloroform : n-heksana (5 : 5) (2) Kloroform : n-heksana (6 : 4) (3) Kloroform : n-heksana (7 : 3) (4) Kloroform : n-heksana (8 : 2) (5) Kloroform : n-heksana (9 : 1) Etil asetat : kloroform (7 : 3)
115
Lampiran 6. Perhitungan Harga Rf Hasil KLT Ekstrak Kental Kloroform dengan Berbagai Campuran Eluen
Retardation Faktor (Rf) Rf =
Jarak yang ditempuh oleh masing −masing komponen Jarak yang ditempuh oleh fase gerak
A.
Perhitungan Rf dengan eluen etil asetat : n-heksana
1)
Perbandingan 1 : 9 (4 noda)
2)
2
0,3
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,035
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,235
0,5
3,8
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,059
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,447 4,4
0,8
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,094
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,518 4,9
1,3
Noda 4: Rf = 8,5 = 0,153 3)
Perbandingan 3 : 7 (4 noda) 0,4
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,047 3,7
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,435 4,8
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,565 5,6
Noda 4: Rf = 8,5 = 0,659 5)
Perbandingan 9 : 1 (2 noda) 7,6
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,894 Noda 2: Rf =
8,2 8,5
= 0,965
Perbandingan 2 : 8 (4 noda)
Noda 4: Rf = 8,5 = 0,576 4)
Perbandingan 8 : 2 (2 noda) 7,2
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,847 8,1
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,953
116
B.
Perhitungan Rf dengan eluen etanol : etil asetat
1)
Perbandingan 7 : 3 (1 noda)
2)
8,0
Perbandingan 8 : 2 (1 noda) 7,7
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,941
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,906
C.
Perhitungan Rf dengan eluen etil asetat : kloroform
1)
Perbandingan 2 : 8 (3 noda)
2)
1,5
Perbandingan 3 : 7 (2 noda) 1,5
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,176
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,176
5,2
5,5
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,612
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,647
5,7
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,671 3)
Perbandingan 5 : 5 (2 noda)
4)
7,2
5,3
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,847
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,624
8,2
7,9
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,965 5)
Perbandingan 7 : 3 (3 noda) 5,2
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,612 6,2
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,729 8
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,941 7)
Perbandingan 9 : 1 (2 noda) 6,5
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,765 8,0
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,941
Perbandingan 6 : 4 (2 noda)
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,929 6)
Perbandingan 8 : 2 (2 noda) 0,9
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,106 8,3
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,946
117
D.
Perhitungan Rf dengan eluen kloroform : n-heksana
1)
Perbandingan 5 : 5 (3 noda)
2)
0,5
Perbandingan 6 : 4 (2 noda) 1,2
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,059
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,141
1,6
3,0
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,188
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,353
3,5
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,412 3)
Perbandingan 7 : 3 (3 noda) 0,2
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,024 1,7
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,200 2,8
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,329
4)
Perbandingan 8 : 2 (4 noda) 0,4
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,047 2,2
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,259 2,7
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,318 3,3
Noda 4: Rf = 8,5 = 0,388 5)
Perbandingan 9 : 1 (4 noda) 0,4
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,047 1,7
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,200 2,4
Noda 3: Rf = 8,5 = 0,282 3,0
Noda 4: Rf = 8,5 = 0,353
118
Lampiran 7. Kromatogram Hasil KLT Penggabungan dengan Fase Gerak Etil Asetat : n-Heksana (2 : 8)
F1 F2
F3 F4
F5
119
Lampiran 8. Perhitungan Harga Rf Hasil KLT Penggabungan Kromatografi Kolom Ekstrak Kental Kloroform
Retardation Faktor (Rf) Rf =
A.
Jarak yang ditempuh oleh masing −masing komponen Jarak yang ditempuh oleh fase gerak
Perhitungan Rf Fraksi 1 (1 noda) 4,3
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,506 B.
Perhitungan Rf Fraksi 2 (1 noda) 3,8
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,447 C.
Perhitungan Rf Fraksi 3 (1 noda) 2,5
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,294 D.
Perhitungan Rf Fraksi 4 (2 noda) 2,0
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,235 1,5
Noda 2: Rf = 8,5 = 0,176 E.
Perhitungan Rf Fraksi 5 (1 noda) 0,8
Noda 1: Rf = 8,5 = 0,090
120
Lampiran 9. Perhitungan LC50 Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
A.
Fraksi 1
1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak
Ulangan 1 2 3
Fraksi 1 Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 2 6 2 6 2 7 20 63,33
1000 ppm 8 8 8 80
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 20 63,33 80 163,33
x2
y2
xy
1 4 9 14
400 4010,69 6400 10810,69
20 126,66 240 386,66
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
3)
Perhitungan gradien (m) xy − n1 ( x y )
m=
m=
m= m=
2
x − n1 ( x)
2
386,66 − 31 (6 ×163,33) 14 − 13 (6)2
386,66 – 326,66 14 − 12 60 2
= 30
121
4)
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (163,33 − 30 × 6) b = 13 163,33 − 180 b = 13 – 16,67 b = – 5,56 5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 30x – 5,56 Grafik garis lurus, y = 30x – 5,56 Grafik Log Konsentrasi Fraksi 1 vs % Mortalitas Larva
% Mortalitas
6)
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
y = 30x - 5.56 R² = 0.938
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Log Konsentrasi Fraksi 1
3
3.5
122
7)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−5,56) 30 50 +5,56 30
=
55,56 30
= 1,85
LC50 = inv log 1,85 = 101,85 = 70,79 ppm (Ekstrak Fraksi 1 spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
B. Fraksi 2 1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak
Ulangan 1 2 3
Fraksi 2 Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 0 4 1 3 1 6 6,67 43,33
1000 ppm 9 8 9 86,67
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 6,67 43,33 86,67 136,67
x2
y2
xy
1 4 9 14
44,49 1877,49 7511,69 9433,67
6,67 86,66 260,01 353,34
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
123
3)
Perhitungan gradien (m) xy − n1 ( x y )
m=
m=
m= m=
4)
2
x − n1 ( x)
2
353,34 − 31 (6 ×136,67) 14 − 13 (6)2
353,34 – 273,34 14 − 12 80 2
= 40
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (136,67 − 40 × 6) b = 13 136,67 − 240 b = 13 – 103,33 b = – 34,44 5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 40x – 34,44
124
6)
Grafik garis lurus, y = 40x – 34,44 Grafik Log Konsentrasi Fraksi 2 vs % Mortalitas Larva
% Mortalitas
100 y = 40x - 34.44 R² = 0.997
80 60 40 20 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Log Konsentrasi Fraksi 2
7)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−34,44) 40 50 +34,44 40
=
84,44 40
= 2,11
LC50 = inv log 2,11 = 102,11 = 128,82 ppm (Ekstrak Fraksi 2 spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
125
C.
Fraksi 3
1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak
Ulangan 1 2 3
Fraksi 3 Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 0 3 1 4 1 4 6,67 36,67
1000 ppm 8 7 7 73,33
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 6,67 36,67 73,33 116,67
x2
y2
xy
1 4 9 14
44,49 1344,69 5377,29 6766,47
6,67 73,34 219,99 300
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
3)
Perhitungan gradien (m) m=
m
xy − n1 ( x y ) 2
x − n1 ( x)
2
300 − 31 (6 ×116,67) = 14 − 13 (6)2
m= m=
300 – 233,34 14 − 12 66,66 2
= 33,33
126
4)
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (116,67 − 33,33 × 6) b = 13 116,67 − 199,98 b = 13 – 83,31 b = – 27,77 5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 33,33x – 27,77
6)
Grafik garis lurus, y = 33,33x – 27,77
% Mortalitas
Grafik Log Konsentrasi Fraksi 3 vs % Mortalitas Larva 80 70 60 50 40 30 20 10 0
y = 33.33x - 27.77 R² = 0.996
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Log Konsentrasi Fraksi 3
7)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi:
127
x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−27,77) 33,33 50 +27,77 33,33
77,77
= 33,33 = 2,33
LC50 = inv log 2,33 = 102,33 = 213,79 ppm (Ekstrak Fraksi 3 spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
D.
Fraksi 4
1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak
Ulangan 1 2 3
Fraksi 4 Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 0 2 1 2 0 2 3,33 20
1000 ppm 6 8 8 73,33
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 3,33 20 73,33 96,66
x2
y2
xy
1 4 9 14
11,09 400 5377,29 5788,38
3,33 40 219,99 263,32
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
128
3)
Perhitungan gradien (m) xy − n1 ( x y )
m=
m=
m= m=
4)
2
x − n1 ( x)
2
263,32 − 31 (6 ×96,66) 14 − 13 (6)2
263,32 – 193,32 14 − 12 70 2
= 35
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (96,66 − 35 × 6) b = 13 96,66 − 210 b = 13 – 113,34 b = – 37,78 5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 35x – 37,78
129
6)
Grafik garis lurus, y = 35x – 37,78
% Mortalitas
Grafik Log Konsentrasi Fraksi 4 vs % Mortalitas Larva 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 0
y = 35x - 37.78 R² = 0.916
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Log Konsentrasi Fraksi 4 7)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−37,78) 35 50 +37,78 35
=
87,78 35
= 2,51
LC50 = inv log 2,51 = 102,51 = 323,59 ppm (Ekstrak Fraksi 4 spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
130
E.
Fraksi 5
1)
Hasil Uji Larva
Ekstrak
Ulangan 1 2 3
Fraksi 5 Persen mortalitas
0 ppm 0 0 0 0
Jumlah Larva yang Mati 10 ppm 100 ppm 2 2 1 2 1 1 13,33 16,67
1000 ppm 6 6 7 63,33
Keterangan : Jumlah larva tiap konsentrasi 10 ekor (total larva pada tiga konsentrasi adalah 30 ekor)
2)
Tabel Pembantu Perhitungan LC50
Konsentrasi (ppm) 10 100 1000 Jumlah
Log C (x) 1 2 3 6
% Mortalitas (y) 13,33 16,67 63,33 93,33
x2
y2
xy
1 4 9 14
177,69 277,89 4010,69 4466,27
13,33 33,34 189,99 236,66
Keterangan : % Mortalitas adalah tingkat kematian larva Artemia salina L. yang dihitung dengan cara menjumlahkan larva yang mati pada tiap konsentrasi dibagi total larva dikalikan 100 %
3)
Perhitungan gradien (m) xy − n1 ( x y )
m=
m=
m= m=
2
x − n1 ( x)
2
236,66 − 31 (6 ×93,33) 14 − 13 (6)2
236,66 – 186,66 14 − 12 50 2
= 25
131
4)
Perhitungan konstanta (b) b = 𝑛1 ( 𝑦 – 𝑚
𝑥)
b = 31 (93,33 − 25 × 6) b = 13 93,33 − 150 b = 13 – 56,67 b = – 18,89 5)
Persamaan garis lurus Persamaan garis lurus menjadi: y = 25x – 18,89 Grafik garis lurus, y = 25x – 18,89 Grafik Log Konsentrasi Fraksi 5 vs % Mortalitas Larva 70 60
% Mortalitas
6)
y = 25x - 18.89 R² = 0.799
50 40 30 20 10 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
Log Konsentrasi Fraksi 5
3
3.5
132
7)
Menghitung LC50 Nilai LC50 diperoleh dari anti log x, dengan x merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 50, sehingga menjadi: x= x= x=
50 −𝑏 𝑚 50 –(−18,89) 25 50 +18,89 25
=
68,89 25
= 2,76
LC50 = inv log 2,76 = 102,76 = 575,44 ppm (Ekstrak Fraksi 5 spons genus Haliclona Grant, 1836 tergolong toksik)
133
Lampiran 10. Kromatogram Lapis Tipis Uji Kemurnian Fraksi 1
Keterangan: A.
Fase gerak etil asetat : n-heksana (7 : 3)
B.
Fase gerak etil asetat : n-heksana (1 : 9)
C.
Fase gerak kloroform : n-heksana (1 : 1)
D.
Fase gerak etanol : n-heksana (7 : 3)
134
Lampiran 11. Perhitungan Harga Rf Uji Kemurnian Fraksi 1 Retardation Faktor (Rf) Rf =
A.
Jarak yang ditempuh oleh masing −masing komponen Jarak yang ditempuh oleh fase gerak
Perhitungan Rf dengan eluen etil asetat : n-heksana (7 : 3) 7,0
Rf = 8,5 = 0,824 B.
Perhitungan Rf dengan eluen etil asetat : n-heksana (1 : 9) 3,5
Rf = 8,5 = 0,412 C.
Perhitungan Rf dengan eluen kloroform : n-heksana (1 : 1) 3,0
Rf = 8,5 = 0,353 D.
Perhitungan Rf dengan eluen etanol : n-heksana (7 : 3) 7,8
Rf = 8,5 = 0,918
135
Lampiran 12. Prosedur Pembuatan Pereaksi Pendeteksi 1.
Pereaksi Pendeteksi Flavonoid
Pereaksi H2SO4 50 % Sebanyak 50 mL asam sulfat pekat dipipet dengan pipet volum, kemudian dituangkan ke dalam labu ukur 100 mL yang telah berisi sedikit aquades. Selanjutnya, aquades ditambahkan ke dalam labu ukur sampai tanda batas.
2.
Pereaksi Pendeteksi Alkaloid
Pereaksi Mayer Larutan A : sebanyak 1,36 g HgCl2 dilarutkan dalam 60 mL aquades. Larutan B : sebanyak 0,5 g KI dilarutkan dalam 10 mL aquades Larutan A dan B dicampur dan diencerkan dengan aquades dalam labu ukur 100 mL sampai tanda batas, disimpan dalam botol coklat.
Pereaksi Dragendroff Larutan A: sebanyak 0,85 g bismuth nitrat ditambahkan 2 mL asam klorida pekat dan 10 mL aquades. Larutan B: sebanyak 8 g kalium iodida ditambahkan 10 mL aquades. Larutan A dicampur dengan larutan B dengan perbandingan 1 : 1 dan disimpan dalam botol. Jika akan digunakan, 5 mL larutan stok ditambahkan 7 mL asam klorida pekat ke dalam 5 mL aquades.
136
3.
Pereaksi Pendeteksi Triterpenoid
Pereaksi Lieberman Burchard Sebanyak 5 mL asam asetat anhidrat dicampur dengan asam sulfat pekat sambil didinginkan, kemudian campuran tersebut ditambahkan ke dalam 50 mL etanol dalam keadaan dingin.
4.
Pereaksi Pendeteksi Tanin/Polifenol
Pereaksi FeCl3 1 % Sebanyak 1 gram besi (III) klorida ditimbang dalam gelas beker, kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan ini kemudian dituang ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan akuades sampai tanda batas.
137
Lampiran 13. Hasil Uji Fraksi 1 Terhadap Sel Hela
138
Sampel µg/ml 1000 500 250 125 62,5 39.01 31,25 19,53 15,52 7,81 3,90 1,95 Kontrol Sel
ODI 0,246 0,328 0,314 0,281 0,316 0,287 0,319 0,284 0,333 0,314 0,338 0,322 0,376
Ulangan ODII 0,249 0,275 0,292 0,302 0,310 0,299 0,303 0,314 0,280 0,319 0,357 0,31 0,378
ODIII 0,281 0,288 0,327 0,316 0,295 0,315 0,312 0,300 0,294 0,356 0,340 0,350 0,379
Rerata
% Inhibisi
0,259 0,297 0,311 0,300 0,307 0,300 0,311 0,299 0,302 0,330 0,345 0,327 0,378
31,51 21,36 17,65 20,65 18,71 20,48 17,56 20,74 19,95 12.71 8,65 13.33 0,00
139
Lampiran 14. Perhitungan IC50 Fraksi 1 Terhadap Sel Hela
Daya Hambat terhadap Sel HeLa % Daya hambat
35 y = 0.016x + 15.00 R² = 0.703
30 25 20
Ukan 15 10 5 0 0
200
400
600
800
1000
1200
Konsentrasi F1 (µg/ml)
Berdasarkan grafik dapat ditentukan nilai IC50, dengan perhitungan sebagai berikut. y = 0,016x + 15,00 Jika y = 50, maka
x=
50 −15,00 0,016
= 2187,5 ppm
Jadi, IC50 Fraksi 1 adalah 2187,5 ppm.
140
Lampiran 15. Kromatogram Fraksi 1 Spons Genus Haliclona Grant, 1836
Puncak
M+
1 2 3 4
214 270 320 278
Waktu Retensi (menit) 11,901 16,414 17,419 21,929
% Area
Senyawa yang diduga
3,91 2,60 6,85 26,67
Metil dodekanoat Metil heksadekanoat Dekil metil ptalat Mono(2-etilheksil)-1,2Benzenadikarboksilat
141
Lampiran 16. Hasil Spektroskopi Massa Senyawa-senyawa Fraksi 1 Ekstrak Kloroform Spons Genus Haliclona Grant, 1836
Puncak 1
142
Puncak 2
143
Puncak 3
144
Puncak 4
