9 II. MATERI DAN METODE PENELITIAN
1.Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
1.1 Materi Penelitian 1.1.1 Alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf (Hirayama), autoklaf konvensional, kompor gas, tabung reaksi, jarum ose, erlenmeyer, gelas ukur, pinset, bunsen, skalpel, shaker,tabung eppendorf, tabung conical, botol duran, cawan petri, plate well 96 steril, plate well 24 steril, tissue culture flask (TCF), mikropipet, blue tip, yellow tip, white tip, pipet tetes, mikroskop, pH meter, label, alumunium foil, plastik wrapping, tissue. 1.1.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah miselium jamur Ganoderma sp. isolat Banyumas 2, medium Potato Dextrose Agar (PDA), alkohol 70%, pelarut ekstrak (n-heksan), medium Potato Dextrose Yeast Broth (PDYB), aquades, kertas saring Whatman no.41, penisilin-streptomisin, Fetal Bovine Serum (FBS), medium Rosewell Park Memorial Institute (RPMI), cell line HeLa, Dimethyl Sulfoxide (DMSO), reagen MTT
{3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-
tetrazolium bromide}, reagen stopper. 1.2. Lokasi Dan Waktu penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto dan Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Waktu pelaksanaan penelitian ini yaitu bulan Juni - September 2013.
10 2. Metode Penelitian 2.1.
Metode Penelitian Metode yang dilakukan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental,
meliputi uji aktivitas antikanker atau uji sitotoksik. Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 yang telah diremajakan akan ditumbuhkan pada medium cair PDYB dengan lama inkubasi yang berbeda, yaitu 14 dan 28 hari. Selanjutnya diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan. Uji aktivitas antikanker dilakukan dengan metode MTT menggunakan cell line HeLa (sel epitel kanker serviks). Ekstrak miselium diuji potensinya sebagai antikanker, dan diujikan terhadap sel HeLa dengan konsentrasi bertingkat, yaitu 31,25; 62,5; 125; 250; 500 dan 1000 µg/mL sebanyak tiga kali ulangan. Hal tersebut bertujuan untuk mengetahui efek signifikan penambahan konsentrasi konsumsi dengan efek penghambatan viabilitas sel kanker serviks. Hasil perlakuan tersebut akan dibaca di ELISA reader untuk perhitungan persentase penghambatan sel, data tersebut akan digunakan untuk perhitungan IC50. Menurut kriteria National Cancer Institute (NCI) suatu zat dikatakan aktif bersifat sitotoksik apabila memiliki nilai IC50 kurang dari 20 μg/mL (Benzivin et al., 2003), sedangkan kriteria senyawa sebagai kemopreventif memiliki IC50 ≤ 100 µg/mL (Meiyanto et al., 2008). Variabel yang digunakan dalam penelitian ini adalah variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalah lama inkubasi. Variabel tergantung adalah nilai IC50 dan jumlah sel kanker serviks yang hidup. Parameter utamanya adalah jumlah kematian sel kanker, dan parameter pendukungnya adalah Bobot miselium basah, miselium kering, dan bobot ekstrak.
11 2.2 Cara Kerja 2.2.1 Karakterisasi Makromorfologi dan Mikromorfologi Ganoderma sp. isolat Banyumas 2. Hasil peremajaan Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 pada cawan petri diamati warnanya pada permukaan koloni dan sebalik koloni. Miselium Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 diambil satu ose, dan diletakkan di object glass dan diamati dibawah mikroskop bentuk hifanya pada perbesaran 10 x 10
2.2.2. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA) (Gunawan, 2006) Kentang dikupas sampai bersih dan dicuci, kemudian ditimbang sebanyak 200 g. Kentang tersebut dipotong dadu ± 1 cm, kemudian direbus dengan 500 mL aquades hingga melunak ± 15 menit. Sebanyak 15 g agar dicampur dengan 250 mL aquades dan dididihkan kemudian dicampur dengan air rebusan kentang dan dekstrosa sebanyak 20 g. Campuran medium ditambahkan aquades sampai volume 1000 mL. Setelah mendidih campuran tersebut kemudian diangkat dan dituangkan ke dalam erlemeyer. Kemudian PDA tersebut dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilisasi selama 15 menit pada suhu 121 oC dengan tekanan 2 atm.
2.2.3. Peremajaan isolat Ganoderma spp. isolat Banyumas 2 (Agustin, 2006). Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 diinokulasikan pada medium PDA yang tersedia, kemudian diinkubasi selama 9 hari pada suhu ruang. Akhir inkubasi ditandai dengan tumbuhnya miselium G. lucidum yang memenuhi cawan petri.
2.2.4. Pembuatan medium PDYB (modifikasi) (Stamets, 2000) Miselium diuji pertumbuhannya menggunakan medium cair PDYB (Stamets, 2000). Komposisi medium PDYB, untuk sediaan 1 liter medium, terdiri atas 200 gram kentang yang diambil ekstraknya, dekstrosa 20 gram, yeast 20 gram. Medium
12 tersebut dipanaskan dan menjadi homogen, kemudian dituang ke dalam erlenmeyer berukuran 250 mL sebanyak 100 mL dan disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 °C tekanan 2 atm. 2.2.5. Kultivasi Miselium ke Medium Cair PDYB (Stamets, 2000) Medium PDYB yang telah dipersiapkan masing-masing diinokulasi dengan potongan koloni isolat Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 dengan ukuran ± 5 mm. Medium yang telah diinokulasi tersebut kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 14 dan 28 hari menggunakan shaker. Miselium yang diperoleh siap digunakan untuk pembuatan ekstrak miselium.
2.2.6. Pembuatan ekstrak miselium jamur G.lucidum (Harborne, 1987) Kultur miselium Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 yang sudah berumur 14 dan 28 hari dipanen, dan dipisahkan dari filtrat kultur. Miselium kemudian disaring dengan kertas saring Whatman no.41 untuk mendapatkan filtrat, untuk mempercepat penyaringan digunakan pompa vakum. Selanjutnya miselium dikeringkan pada suhu 60 °C dalam oven dan di blender, kemudian ditimbang berat keringnya. Sebanyak 500 g miselium Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 ditimbang, selanjutnya dimaserasi (direndam) selama 3 x 24 jam menggunakan pelarut n-heksan. Ekstrak disaring kemudian diuapkan dengan evaporator hingga didapatkan ekstrak bebas pelarut, kemudian ekstrak tersebut ditimbang. 2.2.7. Persiapan Larutan Ekstrak Uji (CCRC, 2009) Ekstrak miselium jamur Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 yang kental ditimbang sebanyak yang diperlukan (sesuai konsentrasi yang telah ditetapkan, yaitu 0 µg/mL sampai dengan 1000 µg/mL), lalu dilarutkan dalam larutan DMSO.
13 2.2.8. Persiapan Larutan MTT (CCRC, 2009) Reagen MTT
[3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil-tetrazolium bromida]
(5mg/mL) ditimbang, dengan cara menimbang 50 mg serbuk MTT, dan dilarutkan dalam 10 mL Phospat Buffer Saline (PBS) (dengan bantuan vortex). Reagen MTT untuk perlakuan (0,5 mg/mL) disiapkan dengan cara mengambil 1 mL stok MTT dalam PBS (5mg/mL), kemudian diencerkan dengan medium kultur (MK) ad 10 mL (untuk 1 buah 96 well plate). 2.2.9. Uji sitotoksik dengan metode MTT (CCRC, 2009) Sel dengan konsentrasi 5 x 103 sel/100 μl didistribusikan ke dalam sumuran (menggunakan 96-well plate) sebanyak 100 μl pada tiap sumuran dan diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator CO2 5% agar sel beradaptasi dan menempel di sumuran. Selanjutnya pada tiap sumuran ditambahkan larutan ekstrak uji dengan konsentrasi bervariasi, yaitu 31,25; 62,5; 125; 250; 500 dan 1000 µg/mL, lalu diinkubasi kembali selama 24 jam. Sebagai kontrol digunakan larutan DMSO 1,25%. Di akhir inkubasi, media kultur dibuang dengan jalan disedot hati-hati dan sel dicuci dengan 100 μl PBS (Phosphat Buffer Saline). Ke dalam masing-masing sumuran, kemudian ditambahkan 100 μL media kultur dan 10 μL larutan MTT 5 mg/mL. Sel diinkubasi kembali selama 6 jam dalam inkubator CO2 5%, 37 ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk formazan yang berwarna ungu-biru tua. Reaksi MTT dihentikan dengan stopper reagent (Sodium dodesil sulfat), lalu plate digoyang di atas shaker selama 10 menit, kemudian diinkubasi pada suhu kamar dalam ruang gelap selama semalam. Selanjutnya, absorbansi tiap sumuran dibaca dengan ELISA reader (Bencmark Bio Rad) pada panjang gelombang 595 nm. Data absorbansi yang diperoleh dikonversi ke dalam rumus persentase sel hidup. Nilai IC50 dihitung dengan analisis regresi.
14 2.3. Metode Analisis Data yang diperoleh berupa hasil absorbansi, yang berguna untuk menghitung prosentase kehidupan sel HeLa. Perhitungan dilakukan dengan rumus viabilitas sel. Jika absorbansi kontrol pelarut sama dengan kontrol sel, maka perhitungan digunakan rumus berikut : Persentase sel hidup :
X100 %.
Jika absorbansi kontrol pelarut lebih rendah dari absorbansi kontrol sel, maka perhitungan menggunakan rumus berikut :
Persentase sel hidup :
X100 %
Hasil analisis persentase kehidupan sel kemudian dibuat kurva dan dibuat persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear ini digunakan untuk menentukan nilai IC50. Kriteria senyawa yang memiliki potensi antikanker memiliki IC 50 ≤ 30 µg/mL (Cho, 1998), sedangkan kriteria senyawa sebagai kemopreventif memiliki IC50 ≤ 100 µg/mL (Meiyanto et al., 2008).
