III.
METODE PENELITIAN
A. Materi, Waktu dan Lokasi Penelitian 1. Materi 1.1 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tempe dage, medium Potato Dextrose Agar (PDA), Starch Agar (SA), Skim Milk Agar (SMA), Rhodamine Agar (RA), gram’s iodine, olive oil, kapas, akuades steril, alumunium foil, wrapper, alkohol 70 %, chloramphenicol, spirtus (Lampiran 1.). 1.2 Alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cawan petri, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, cover glass, object glass, mikroskop binokuler, mikrometer obyektif, mikrometer okuler, Laminar Air Flow (LAF), jarum ose, bunsen, beaker glass, hot platestirer, sprayer, kompor, timbangan analitik, pestel & mortar, pipet ukur (Lampiran 1.). 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai bulan Juni sampai dengan November 2014. Pengambilan sampel dilakukan di Pasar Sokaraja, Karanglewas dan Ajibarang Kabupaten Banyumas.Karakterisasidan uji potensi enzimatis diLaboratoriumMikologi/Fitopatologi
Fakultas
Biologi,
dilakukan
Unsoed.
Kadar
karbohidrat, lemak, dan protein dianalisiskan di Laboratorium Kimia Organik, Fakultas Sains dan Teknik, Unsoed. B. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan metode surveiuntuk pengambilan sampel dan uji enzimatis serta eksperimentaluntuk analisis kandungan gizi. Perlakuan terdiri atas pemberian jenis inokulum yang berbeda yaitu A1,A2,A3, B1, C1, C2 dan C3.Masing-masing inokulum sebanyak 20gram. C. Variabel dan Parameter Penelitian
bio.unsoed.ac.id
Variabel bebas untuk metode survei adalah tempe dage, variabel tergantungnya adalah jenis isolat. Parameter yang diukur adalah diameter koloni dan sel kapang. Variabel bebas untuk metode eksperimental yaitu jenis isolat, sedangkan variabel tergantungnya adalah kemampuan enzimatis dan kandungan gizi. Parameter yangdiukur adalah zona jernih, kadar karbohidrat, protein, dan lemak. D. Cara Kerja 6
1. Sterilisasi Alat dan Medium (Davet & Rouxel, 1997) Alat yang digunakan (labu Erlenmeyer 250 ml, tabung reaksi, cawan petri, objectglass dan cover glass) dan semua medium yang akan digunakan (PDA, SA, SMA, dan RA) disterilkan pada suhu 121 0C dengantekanan 2 atm selama 20 menit. Jarum ose dan scalpel disterilisasi dengan cara disemprot alkohol 70% kemudian dibakar langsung pada api lampu spirtus saat akan digunakan. Medium yang digunakan untuk isolasi adalah medium PDA (Lampiran 9.a.). Medium untuk uji proteolitik, amilolitik dan lipolitik adalah SMA, SA dan RA (Lampiran 9.b.). 2. Pengambilan Sampel Dage (Nasution, 2003) Pengambilan sampel dilakukan secara purposiverandom sampling. Sampel diambil dari pasar Sokaraja, Karanglewas dan Ajibarang. Tiap pasar diambil sampel dage dari pengrajin yang berbeda. Ajibarang (A) : A1, A2, A3; Karanglewas (B) : B1; Sokaraja (C) : C1,C2,C3. A1= Isolat Asal Pasar Ajibarang, Pengrajin Ciberung A2= Isolat Asal Pasar Ajibarang, Pengrajin Tambakan A3= Isolat Asal Pasar Ajibarang, Pengrajin Tokko B 1= Isolat Asal Pasar Karanglewas C1 = Isolat Asal Pasar Sokaraja, Pengrajin Kalikidang C 2= Isolat Asal Pasar Sokaraja, Pengrajin Wiradadi 1 C 3 = Isolat Asal Pasar Sokaraja, Pengrajin Wiradadi 2 3. Isolasidan Pemurnian Kapang Dage (Gandjar et al., 2006) Sampel dage 5 g dihancurkan dalam mortar dan pestle, dimasukkan dalam tabung reaksi, diisi akuades steril, dikocok menggunakan vortex mixer. Suspensi diambil 0,2 ml menggunakan pipet ukur kemudian diteteskan ke medium PDA pada
bio.unsoed.ac.id
cawan petri, diinkubasi 3 hari kemudian koloni kapang yang tumbuh terpisah atau tunggal segera diisolasi ke medium baru. Pemindahan isolat (pemurnian) diulang sebanyak 4 kali sampai isolat benar-benar murni, kemudian isolat yang sudah benarbenar murni disimpan pada PDA miring. Tiap isolat diberi nomor identitas sesuai dengan identitas pada label saat isolasi dari kapang. 4. Karakterisasi 7
Karakterisasi dilakukan dengan cara menginokulasikan biakan murni ke medium PDA di cawan petri kemudian diinkubasi 3 hari. Pengamatan makroskopis dilakukan langsung pada cawan petri sedangkan pengamatan mikroskopis diamati pada slide kultur menggunakan mikroskop binokuler dengan bantuan mikrometer. Cara pembuatan slide kultur (Fardiaz, 1989) : 1. Cawan petri yang bagian bawah telah dialasi dengan kapas lembab disterilisasi menggunakan autoklaf. 2. Object glass steril diletakkan pada kapas lembab di cawan petri. 3. Object glassditetesi medium PDA kemudian spora kapang diinokulasi menggunakan jarum ose, lalu ditutup dengan cover glass 4. Diinkubasi 1-2 hari kemudian diamati di bawah mikroskop untuk identifikasi. Pengamatan makroskopis dilakukan dengan mengamati secara langsung warna koloni, warna sebalik koloni, dan diameter koloni. Pengamatan morfologi sel kapang meliputi ada tidaknya rhizoid, panjang sporangiofor, bentuk sporangium, ukuran kolumela,
bentuk
kolumela,
bentuk
sporangiospora,
diameter
sporangiospora(Gandjar et al., 1999 serta Domsch et al., 1993). 5. Uji Kemampuan Enzimatis (Zahidah dan Maya, 2013 serta Ekowati et al., 2014) Uji amilolitik dilakukan dengan cara isolat kapang diinokulasikan pada medium SA. Isolat diinkubasi selama 3 hari pada suhu 370C lalu diteteskan beberapa tetes Gram’s iodine pada biakan kapang , dan diamati zona jernih yang terbentuk di sekeliling koloni. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih di daerah sekitar koloni, sebaliknya hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya zona jernih di sekitar koloni. Pengujian potensi proteolitik dilakukan dengan cara isolat ditumbuhkan pada
bio.unsoed.ac.id
medium SMA. Setelah diinkubasi 3 hari pada suhu 370C, di sekitar isolat kapang yang memiliki aktivitas protease terlihat zona jernih, sebaliknya hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya zona jernih di sekitar koloni. Uji lipolitik dilakukan dengan cara isolat ditumbuhkan pada medium RA yang mengandung oil, diinkubasi 24 jam pada suhu 370C. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih di sekitar koloni sedangkan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak adanya zona jernih di sekitar koloni (Hou& Johnston, 1992). 8
Indeks amilolitik, proteolitik dan lipolitik diukur dengan cara berikut (Lim et al., 1987) : IA , IP, IL = Keterangan : IA = Indeks Amilolitik IP = Indeks Proteolitik IL = Indeks Amilolitik X1 = Rata-rata diameter zona jernih X2 = Rata-rata diameter koloni 6. Pembuatan Dage 6.1. Persiapan Substrat Bungkil kelapa diayak, dicuci, dan direndam dalam air bersih selama 1518 jam, diperas dengan kain untuk mengurangi sebagian besar kandungan airnya. Selanjutnya dikukus selama 60 menit setelah itu ditiriskan dan didinginkan pada suhu kamar. 6.2. Persiapan Suspensi Spora Sebagai pengganti ragi, maka dibuat suspensi spora dengan cara masingmasing isolat yang didapat ditumbuhkan pada medium PDA miring dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar. Selanjutnya ditambahkan 10 ml akuades steril dan dikocok-kocok sehingga spora kapang terlepas ke dalam akuades. Suspensi spora siap digunakan. 6.3.Pembuatan Inokulum Inokulum dalam bentuk tepung dibuat dengan bahan baku
beras dan
ditambahkan suspensi spora dari masing-masing isolat. Sebanyak 30 gram beras dimasukkan ke dalam plastik dan ditambahkan air 30 ml kemudian ditanak selama 15 menit. Selanjutnya diinokulasikan suspensi spora sebanyak 5 ml menggunakan pipet ukur. Plastik diberi lubang
bio.unsoed.ac.id
menggunakan lidi bambu yang sudah disteril dengan jarak lubang 1 cm. Setelah itu diperam selama 3 hari pada suhu ruang. Nasi yang penuh kapang dan sporanya berwarna abu-abu sampai hitam dikeringkan dengan oven dengan suhu 40oC setelah itu diblender sehingga menjadi tepung ragi tempe. 6.4.Inokulasi dan Inkubasi Substrat
9
Substrat sebanyak 500 g dicampur dengan 20 g inokulum dan 110 cc air bersih, diaduk menggunakan tangan. Setelah semua bahan tercampur rata kemudian dibentuk padatan persegi panjang di atas meja yang diberi alas plastik bersih kemudian diinkubasi 2 hari pada suhu ruang hingga terbentuk dage dengan padatan kompak tertutup miselium kapang. Pembuatan dage ini dilakukan menggunakan inokulum dari masingmasing isolat yang berbeda.Masing-masing dage yang dihasilkan diamati pertumbuhan kapang, penggimbalan, aroma, dan tekstur. 7. Analisis Proksimat Analisis proksimat yang dilakukan yaitu uji kadar protein, lemak, dan karbohidrat. 7.1.Uji Kadar Protein (Metode Kjeldahl) Bahan ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjedahl 100 ml. Ditambahkan kurang lebih 1 g campuran selenium dan 10 ml H2SO4pekat kemudian dihomogenkan. Didestruksi dalam lemari asam sampai jernih. Bahan dibiarkan dingin, kemudian dibuang ke dalam labu ukur 100 ml sambil dibilas dengan akuades. Dibiarkan dingin kemudian ditambahkan akuades sampai
tanda tera. Disiapkan penampung yang
terdiri dari 10 ml H2BO3 2% ditambahkan 4 tetes larutan indikator dalam Erlenmeyer 100 ml. Dipipet 5 ml NaOH 30%
dan 100 ml akuades,
disuling hingga volume penampung menjadi kurang lebih 50 ml. Dibilas ujung penyuling dengan akuades kemudian ditampung bersama isinya. Dititrasi dengan larutan HCl atau H2SO4 0,02 N. Perhitungan kadar protein dilakukan sebagai berikut :
x 100 %
% Protein =
bio.unsoed.ac.id
Keterangan : V1 = Volume titrasi contoh N = Normalitas larutan HCl atau H2SO4 0,02 N P = Faktor pengenceran
7.2. Uji Kadar Lemak (Sudarmadji et al., 1997) 10
Ditimbang 1 gr sampel, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi berskala 10 ml, ditambahkan kloroform mendekati skala. Kemudian ditutup rapat, dikocok dan dibiarkan semalam. Himpitkan dengan tanda skala 10 ml dengan pelarut lemak yang sama menggunakan pipet, lalu dikocok hingga homogen kemudian disaring dengan kertas saring dalam tabung reaksi. Dipipet 5 cc ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya (a gram) lalu dioven suhu 100ºC selama 3 jam. Dimasukkan ke dalam desikator ±30 menit kemudian ditimbang (b gram). Dihitung kadar lemak dengan rumus sebagai berikut : (
% Lemak =
)
x 100 %
P = Pengenceran = 10/5 =2 7.3. Uji Kadar Karbohidrat (Sudarmadji et al., 1984) Sampel (5 g) dihaluskan dengan menggunakan mortar, dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer ukuran 250 ml dan ditambahkan 50 ml etanol, kemudian
ditempatkan
pada
shaker
waterbath
selama
1
jam.
Suspensidisaring menggunakan kertas saring Whatman untuk memisahkan residu dengan filtrat. Residudicuci dengan akuades hingga volume titrat mencapai 250 ml. Filtrat dibuang dan residu yang ada pada kertas saring dicuci dengan eter sebanyak 2ml, eter dibiarkan menguap. Residu dipindahkan ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan akuades sebanyak 200 ml dan HCl encer sebanyak 20 ml, kemudian ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan diatas pemanas air selama 2,5 jam. Setelah itu didinginkan, kemudian ditambahkan NaOH. Penambahan NaOH sedikit demi sedikit sampai terbentuk warna biru pada kertas lakmus, kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume 500 ml. Selanjutnya disaring
bio.unsoed.ac.id
dengan kertas saring Whatman dan dihasilkan filtrat yang siap diuji. Filtrat (1 ml) dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan reagen Nelson, dipanaskan dalam air mendidih kemudian didinginkan, lalu ditambahkan
reagen
arsenomolibdat
selanjutnya
divortex.Sampel
dimasukkan ke dalam kuvet dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm pada alat spektrofotometer. Karbohidrat dalam bentuk gula reduksi dan pati dihitung dengan rumus : 11
Kadar gula pereduksi =
(
)
x 100 %
Kadar Pati = kadar gula pereduksi x 0,9 Keterangan : 0,9 : faktor konfersi, dimana diperoleh dari perbandingan berat molekul pati dengan berat molekul gula reduksi yang dihasilkan. E. Metode Analisis Data yang diperoleh dari hasil identifikasi kapang dianalisis secara deskriptif. Deteksikemampuan enzimatis dianalisis secara kualitatif.Kadar karbohidrat, protein, dan lemak dianalisis secara kuantitatif menggunakan analisis varian satu jalur, kemudian untuk mengetahui jenis inokulum mana yang menghasilkan kadar karbohidrat, protein, dan lemak tertinggi maka dilakukanuji beda nyata terkecil (BNT) pada taraf signifikasi 0,05.
bio.unsoed.ac.id
12
