III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, pipet tetes, mikropipet dan tip, labu Erlenmeyer, gelas ukur, Beaker glass, pembakar spirtus, sprayer alkohol, rak tabung, jarum inokulum, object glass, cover glass, optilab, kamera, alat tulis, bor gabus ukuran 5 mm, corong, pH meter, timbangan analitik, refrigerated centrifuge, kulkas,soxhlet extractor, kompor listrik, microwave, mikroskop cahaya, mikroskop stereo, autoklaf, oven, hotplate dan stirrer, inkubator, desikator, rotary evaporator, shaker incubator, dan spektrofotometer. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat aktinomisetes berpigmen yaitu isolat K-4B dan U3-3B yang diisolasi dari tanah rawa Segara Anakan Cilacap, medium agar Starch Casein Nitrat (SCN), medium cair Starch Casein Nitrat (SCN), medium Yeast Extract Malt Extract Broth, medium Oatmeal Broth, medium Starch Agar (SA), medium Urea Broth (UB), medium Protease Agar (PA), medium mineral+lemak, medium Sulfide Indole Motility (SIM) , medium Trypton Soya Broth (TSB), KNO3, larutan A (asam sulfanilat), larutan B (alfanaftilamin), serbuk Zn, medium basal, galaktosa, xylosa, arabinosa, mannitol, sukrosa, dan raffinosa, NaOH, HCl, antifungi nystatin, reagen lugol’s iodine, kertas Whatman No.1, pelarut etanol 96%, akuades, alkohol 70%, wrapper, alumunium foil, buku Bergey’s manual of Determinative Bacteriology, Munsell Colour Chart Book, kassa dan kapas. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi,
bio.unsoed.ac.id
Laboratorium riset, dan Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Jenderal Soedirman selama bulan Juni-Desember 2014. B. Metode Penelitian 1. Metode Percobaan Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan tahapan peremajaan isolat aktinomisetes hasil isolasi dari Segara Anakan Cilacap yang menghasilkan pigmen, identifikasi isolat aktinomisetes (meliputi pengamatan 9
makromorfologi, mikromorfologi, dan uji biokimiawi), produksi pigmen aktinomisetes pada tiga medium pertumbuhan, ekstraksi pigmen ekstraseluler dan intraseluler aktinomisetes, perbandingan warna dari ekstrak pigmen dengan standar warna universal, dan karakterisasi pigmen aktinomisetes dengan metode UV-vis. 2. Cara Kerja 2.1 Peremajaan Isolat Aktinomisetes Isolat aktinomisetes yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat K-4B dan U3-3B yang diisolasi dari lahan mangrove, tepatnya di tanah rawa kawasan Segara Anakan Cilacap. Dilakukan peremajaan kedua isolat aktinomisetes dengan cara goresan kuadran pada medium Starch Casein Nitrat (SCN) dan diinkubasi selama 14 hari pada suhu 30oC. Setelah tumbuh, diamati warna koloni baik dari bagian atas maupun bawah, serta diamati pula ada atau tidaknya warna yang berdifusi ke medium. 2.2 Identifikasi Genus Aktinomisetes 2.2.1 Pengamatan Morfologi Koloni Karakter
makromorfologi
isolat
aktinomisetes
diamati
menggunakan mikroskop stereo meliputi bentuk koloni, permukaan koloni, ukuran, pigmentasi, margin koloni, miselium substrat, miselium aerial, dan elevasi. Karakter yang diamati kemudian dibandingkan dengan buku Bergey’s manual of Determinative Bacteriology. 2.2.2 Pengamatan Morfologi Hifa dengan Pembuatan Preparat Heinrich Slide Culture (Buchanan & Gibbons, 1974) Disiapkan object dan cover glass, kemudian pada bagian tengah object glass ditetesi dengan medium SCN. Setelah medium padat, isolat aktinomisetes diulas pada medium dengan jarum inokulum lurus
bio.unsoed.ac.id
kemudian ditutup dengan cover glass. Preparat diinkubasi di dalam cawan petri steril berisi kapas lembab pada suhu 30oC selama 8 hari. Morfologi hifa aktinomisetes diamati menggunakan mikroskop cahaya.
2.2.3 Uji Biokimiawi Isolat Aktinomisetes (Sunatmo, 2009) Uji biokimiawi yang dilakukan meliputi uji enzimatis (urease, amilase, lipase, dan protease), uji reduksi nitrat, uji hidrogen sulfida 10
(H2S), dan uji penggunaan karbohidrat (galaktosa, xylosa, arabinosa, mannitol, sukrosa, dan raffinosa). 2.2.3.1 Uji Hidrolisis Amilum Isolat aktinomisetes diinokulasikan ke medium yang mengandung amilum atau Starch Agar dengan cara goresan. Setelah diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30oC, ditetesi reagen lugol’s iodine. Interpretasi positif jika ada zona jernih disekitar koloni. 2.2.3.2 Uji Hidrolisis Kasein Isolat aktinomisetes diinokulasikan ke medium Protease Agar (PA). Setelah diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30oC, adanya zona jernih disekitar koloni menunjukkan hasil positif. 2.2.3.3 Uji Hidrolisis Lipid Isolat aktinomisetes diinokulasikan ke medium MM+lemak dengan cara goresan, kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30oC. Interpretasi positif ditandai dengan perubahan warna medium menjadi kuning dan bintik merah di bawah koloni. 2.2.3.4 Uji Hidrolisis Urea Isolat aktinomisetes diinokulasikan ke medium Urea Broth dan diinkubasi 3 hari pada suhu 30oC. Interpretasi positif ditandai dengan adanya perubahan warna medium menjadi merah muda pekat. 2.2.3.5 Uji Reduksi Nitrat Isolat aktinomisetes diinokulasikan ke medium TSB semisolid yang telah ditambahkan dengan 0,1% KNO3. Setelah inkubasi selama 7 hari pada suhu 30oC, kultur kaldu nitrat ditambahkan 5 tetes larutan A dan 5 tetes larutan B. Kemudian diamati adanya perubahan warna
bio.unsoed.ac.id
menjadi merah yang menunjukkan hasil positif. Kultur yang tidak berubah warna ditambahkan sedikit serbuk Zn dan diamati adanya perubahan warna yang terjadi. Timbulnya warna merah pada kultur mengindikasikan hasil negatif, dan apabila tidak terbentuk warna merah maka hasilnya adalah positif.
11
2.2.3.6 Uji H2S Isolat aktinomisetes diinokulasikan dengan stab inoculation pada medium SIM. Inkubasi dilakukan selama 7 hari pada suhu 30oC. Interpretasi positif ditunjukan dengan adanya endapan hitam sepanjang arah inokulasi. 2.2.3.7 Uji Penggunaan Karbohidrat Isolat yang akan diuji diinokulasikan pada medium basal dengan penambahan masing-masing 1% galaktosa, 1% xylosa, 1% arabinosa, 1% mannitol, 1% sukrosa, dan 1 % raffinosa. Kemudian diinkubasi 7 hari pada suhu 30oC. Interpretasi positif ditandai dengan adanya pertumbuhan pada medium. 2.3 Produksi Pigmen Aktinomisetes pada 3 Medium Pertumbuhan Isolat aktinomisetes diperbanyak secara goresan kontinu pada medium cawan SCN dan diinkubasi pada suhu 30oC selama 8 hari sebagai kultur induk.Kultur induk aktinomisetes diambilmenggunakan bor gabus ukuran 5 mm. Kemudian produksi pigmen dilakukan dengan cara menginokulasikan masing-masing 5 plug kultur induk ke dalam 100 mL medium cair SCN, YEME, dan oatmeal. Proses produksi dilakukan dengan fermentasi diam selama 21 hari pada suhu ruang. Bobot awal dan akhir aktinomisetes dihitung dengan cara menyaring kultur induk dan medium pertumbuhan hasil inkubasi menggunakan kertas saring Whatman No. 1. Kertas saring dikeringkan di oven selama 90 menit pada suhu 70oC. Setelah itu, distabilkan dalam desikator dan ditimbang berat keringnya. 2.4 Ekstraksi Pigmen Aktinomisetes 2.4.1 Ekstraksi Pigmen Intraseluler
bio.unsoed.ac.id
Miselium dicuci dengan cara ditambahkan dengan akuades steril kemudian dikeringkan di oven pada suhu 70oC dan ditimbang berat keringnya. Miselium diekstraksi menggunakan etanol 96% dengan metode sokletasi selama 4 jam, kemudian ekstrak pigmen dipekatkan dengan rotary evaporator. Sisa miselium setelah ekstraksi ditimbang lagi berat keringnya untuk mengetahui bobot pigmen intraseluler.
12
2.4.2 Ekstraksi Pigmen Ekstraseluler (Palanichamy et al., 2011) Kultur cair hasil produksi pigmen diatur pH mediumnya hingga 12 menggunakan NaOH dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Bagian supernatan diambil dan pH diatur kembali hingga 2 menggunakan HCl kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Endapan diambil dan dikeringkan pada suhu 70oC dan ditimbang berat keringnya. Endapan diekstraksi menggunakan etanol 96% dengan pemanasan pada suhu 80oC, kemudian ekstrak pigmen dipekatkan dengan rotary evaporator. Sisa endapan setelah ekstraksi ditimbang berat keringnya untuk mengetahui bobot pigmen ekstraseluler. 2.5 Perbandingan Warna dari Ekstrak Pigmen dengan Standar Warna Universal (Ahmad et al., 2012) Ekstrak pigmen diuji stabilitasnya pada berbagai kondisi pH, mulai dari pH asam (pH 4), netral (pH 7), hingga basa (pH 10). Kemudian warna yang dihasilkan pada masing-masing kondisi pH dibandingkan dengan standar warna universal (Munsell Colour Chart Book). 2.6 Karakterisasi Pigmen dengan Metode Ultraviolet-Visible Spectrophotometry (UV-Vis) (Ahmad et al., 2012) Ekstrak pigmen dianalisis menggunakan UV-vis untuk mengetahui spektrum penyerapan dari warna yang dihasilkan. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 350-800 nm. Puncak serapan maksimum masing-masing pigmen dideteksi untuk mengetahui
maksdan
dibandingkan dengan pigmen lain.
C. Metode Analisis Hasil yang didapatkan dianalisis menggunakan metode deskriptif dengan cara membandingkan hasil yang didapatkan dengan hasil dari penelitian-
bio.unsoed.ac.id
penelitian sebelumnya yang berkaitan. Identifikasi genus aktinomisetes hasil penelitian dibandingkan dengan buku Bergey’s manual of Determinative Bacteriology.
13
D. Bagan Alir Penelitian Peremajaan Isolat Aktinomisetes Hasil Isolasi Berdasarkan Warna Dua Isolat Aktinomisetes
Produksi Pigmen Aktinomisetes pada 3 Medium Pertumbuhan
Identifikasi Aktinomisetes
Karakterisasi makromorfologi Karakterisasi mikromorfologi Uji biokimiawi
Ekstraksi pigmen intraseluler
Genus aktinomisetes
Ekstraksi pigmen ekstraseluler
Perbandingan ekstrak pigmen dengan standar warna universal Karakterisasi pigmen dengan UV-vis
Panjang gelombang maksimum pigmen
bio.unsoed.ac.id
14
