29
MATERI DAN METODE Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2009 sampai dengan Mei 2010 di Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) Institut Pertanian Bogor setelah mendapatkan persetujuan dari Animal Care and Use Committee (ACUC) nomor P.10-08-IR tanggal 20 Oktober 2008. Sebagian pemeriksaan laboratorium yaitu pemeriksaan kadar peroksida lipid dan glutation jaringan mukosa lambung dilakukan di laboratorium Departemen Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Materi Hewan Model Penelitian ini menggunakan delapan ekor beruk (Macaca nemestrina) jantan dewasa, berumur antara 4-6 tahun dengan bobot badan 5,5-7,5 kg (dengan rerata 6,625±0,83 kg), yang berasal dari penangkaran PT. Wanara Satwa Loka. Hewan model tersebut menjalani masa adaptasi dan dipelihara dalam kandang individu. Pakan yang disediakan adalah monkey chow (dengan kandungan protein, lemak, mineral, serat, karbohidrat, kalsium dan fosfat) serta buah-buahan, sedangkan air minum disediakan secukupnya.
Bahan dan Alat-alat Penelitian Untuk keperluan penelitian diperlukan berbagai peralatan sebagai berikut ini: 1. Peralatan laboratorium dan bahan reagen yang dipergunakan untuk pemeriksaan biokimia darah yang meliputi pemeriksaan protein total (Ptot)/albumin (Alb)/globulin (Glob), bilirubin total (BT)/bilirubin direk (BD)/bilirubin indirek (BI), serum glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT)/ serum glutamic pyruvic transaminase (SGPT), fosfatase alkali (ALP), gamma glutamyl transpeptidase (GGT), kolinesterase (CHE), profil lemak darah yang meliputi kolesterol total (KT) dan trigliserida (TG), hemostasis yaitu pemeriksaan prothrombin time, kadar peroksida lipid mukosa lambung dan kadar glutation mukosa lambung.
30 2. Endoskopi saluran cerna merek Olympus tipe Excera 160 beserta asesorinya yang terdiri dari light source, video monitor, printer, suction pump dan forsep biopsi. 3. Satu set peralatan bedah laparotomi lengkap dengan operating lamp, infusion pump, pulse oxymeter, dan obat-obat anastesi yang terdiri dari ketamin dan propofol, serta obat analgetik fentanil transdermal. 4. Cairan ivelip 20% yang merupakan cairan lipid esensial sebagai sumber PUFA. Komposisi ivelip terdiri dari soybean oil, egg lecithins, gliserol dan natrium oleat. Kandungan PUFA di dalam cairan ivelip 20% adalah asam linoleat (54%) dan asam linolenat (8%), serta sisanya berupa mono-unsaturated fatty acids (MUFA) yaitu asam oleat (26%) dan saturated fatty acids berupa asam palmitat (9%) dan asam stearat (3%) (Consumer medicine information 2002).
Metode Adaptasi Hewan model dikondisikan dengan makanan standar serta air minum yang selalu tersedia di dalam kandang individu. Setelah masa adaptasi dua minggu, dilakukan pemeriksaan sampel darah perifer untuk pemeriksaan biokimiawi dan dilakukan evaluasi makroskopik mukosa lambung dengan pemeriksaan endoskopi saluran cerna bagian atas sekaligus mengambil sampel biopsi mukosa lambung untuk pemeriksaan
peroksida
lipid
dan
glutation.
Selanjutnya
hewan
model
dikelompokkan menjadi 2 kelompok secara acak, masing-masing terdiri dari 4 ekor. Pemeriksaan Endoskopi Saluran Cerna Bagian Atas Pemeriksaan endoskopi saluran cerna bagian atas (SCBA) dilakukan dengan memasukan (insersi) alat gastroskop melalui mulut, esofagus, lambung sampai dengan duodenum, setelah beruk disuntik obat anestesi ketamin intramuskular dengan dosis 10-30 mg/kg bobot badan dan propofol secara intravena dengan dosis inisiasi 2,5-10 mg/kg bobot badan yang dilanjutkan dengan dosis maintenance 0,3-0,6 mg/kg bobot badan/menit. Selama tindakan endoskopi, dilakukan observasi secara makroskopik mukosa lambung disertai dengan pengambilan sampel biopsi di korpus dan antrum lambung dengan menggunakan
31 alat forsep biopsi. Dilakukan pemotretan gambar mukosa lambung untuk selanjutnya dicetak sebagai dokumentasi. Pemeriksaan endoskopi SCBA ini diulang setiap 2 minggu sampai 8 minggu dengan prosedur pemeriksaan yang sama.
Ligasi Duktus Koledokus Setelah menjalani pemeriksaan endoskopi SCBA yang pertama dilanjutkan dengan tindakan bedah laparotomi dengan anestesi yang sama yaitu ketamin intramuskular dengan dosis 10-30 mg/kg bobot badan dan propofol secara intravena dengan dosis inisiasi 2,5-10 mg/kg bobot badan yang dilanjutkan dengan dosis maintenance 0,3-0,6 mg/kg bobot badan/menit. Dilakukan bedah laparotomi melalui linea mediana dinding perut lapis demi lapis sampai ke dalam rongga peritoneum. Setelah duktus koledokus diidentifikasi, dilakukan ligasi duktus koledokus dengan lokasi distal dari duktus sistikus namun proksimal dari duktus pankreatikus dengan menggunakan benang sutra. Dilakukan ligasi pada dua titik dengan jarak kira-kira 1 cm, setelah itu dilakukan pemotongan di antara kedua ikatan. Setelah diyakini tidak ada perdarahan, dilakukan penutupan dinding perut lapis demi lapis. Tindakan bedah laparotomi ini dilakukan oleh sejawat dokter hewan yang ahli dibidangnya dibantu oleh anggota tim yang lain.
Perlakuan Kelompok I merupakan kelompok model ligasi duktus koledokus yang diberi PUFA 4 minggu sesudah dilakukan ligasi duktus koledokus. Setelah dilakukan pembiusan, dilanjutkan dengan pengambilan sampel darah sebanyak ± 25 ml dari pembuluh darah vena iliaka untuk pemeriksaan biokimiawi yang meliputi Ptot, Alb, Glob, BT, BD, BI, SGOT, SGPT, ALP, GGT, CHE, KT, TG dan prothrombine time. Kemudian dilakukan pemeriksaan endoskopi SCBA untuk evaluasi makroskopik mukosa lambung terhadap ada tidaknya erosi atau ulkus sekaligus pengambilan sampel biopsi dua di korpus dan dua di antrum untuk pemeriksaan peroksida lipid dan glutation. Setelah itu dilakukan bedah laparotomi untuk pengikatan (ligasi) duktus koledokus (common bile duct), pada posisi distal dari muara duktus sistikus namun proksimal dari muara duktus pankreatikus.
32 Pemeriksaan biokimiawi fungsi hati dan profil lemak darah (Ptot, Alb, Glob, BT, BD, BI, SGOT, SGPT, ALP, GGT, CHE, KT, TG) dilakukan dengan menggunakan teknik spektrofotometri, sedangkan pemeriksaan prothrombine time menggunakan teknik foto optikal. Pemeriksaan kadar peroksida lipid mukosa lambung
(dalam
hal
ini
dilakukan
dengan
memeriksa
kadar
malondialdehyde/MDA yang merupakan produk akhir dari peroksida lipid) dan pemeriksaan kadar glutation mukosa lambung dilakukan dengan menggunakan teknik spektrofotometri. Selain dilakukan pengamatan harian terhadap hewan model, dilakukan pengamatan berkala setiap 2 minggu yang meliputi pemeriksaan bobot badan dan endoskopi SCBA untuk pengamatan makroskopik mukosa lambung dan pengambilan sampel biopsi di korpus dan di antrum untuk pemeriksaan peroksida lipid dan glutation serta pemeriksaan laboratorium biokimiawi darah. Setelah pengamatan berkala yang kedua (4 minggu pasca ligasi duktus koledokus) diberikan PUFA intravena 2 g/hari setiap hari. Pengamatan berkala setiap 2 minggu dilanjutkan sampai 8 minggu pasca ligasi
duktus
koledokus. Selanjutnya dilakukan eutanasia pada semua hewan model. Kelompok II merupakan kelompok model ligasi duktus koledokus yang diberi PUFA sejak awal dilakukan ligasi duktus koledokus. Setelah dilakukan pengambilan sampel darah untuk pemeriksaan biokimiawi yang meliputi Ptot, Alb, Glob, BT, BD, BI, SGOT, SGPT, ALP, GGT, CHE, KT, TG dan prothrombine time, kemudian dilakukan pemeriksaan endoskopi saluran cerna bagian atas (SCBA) untuk evaluasi makroskopik mukosa lambung terhadap ada tidaknya erosi atau ulkus sekaligus pengambilan sampel biopsi dua di korpus dan dua di antrum untuk pemeriksaan peroksida lipid dan glutation. Setelah itu dilakukan bedah laparotomi untuk ligasi duktus koledokus, pada posisi distal dari muara duktus sistikus namun proksimal dari muara duktus pankreatikus. Sejak dilakukan ligasi duktus koledokus, diberikan PUFA intravena setiap hari dengan dosis 2 g/hari. Selain dilakukan pengamatan harian terhadap hewan model, dilakukan pengamatan berkala setiap 2 minggu yang meliputi pemeriksaan bobot badan dan endoskopi SCBA untuk pengamatan makroskopik mukosa lambung dan pengambilan sampel biopsi di korpus dan di antrum untuk pemeriksaan peroksida lipid dan glutation serta pemeriksaan laboratorium biokimiawi darah sampai 8
33 minggu pasca ligasi duktus koledokus. Selanjutnya dilakukan eutanasia pada semua hewan model.
Analisis Data Peubah-peubah yang diamati terdiri dari nilai biokimiawi fungsi hati (Ptot, Alb, Glob, BT, BD, BI, SGOT, SGPT, ALP, GGT, CHE), KT, TG, prothrombine time, peroksida lipid dan glutation mukosa lambung serta evaluasi makroskopik mukosa lambung berupa ada tidaknya erosi atau ulkus dengan pemeriksaan endokopi SBCA pada hewan model sejak sebelum dilakukan ligasi duktus koledokus sampai 8 minggu setelah ligasi duktus koledokus. Data yang didapat dianalisis statistik secara deskriptif dan analisis ragam (ANOVA) tersarang (nested). Interpretasi didasarkan pula pada nilai rerata dan koefisien keragaman. Apabila hasil analisis ragam menunjukan perbedaan yang bermakna (P<0,05 atau P<0,01) maka dilanjutkan dengan uji jarak pada periode pengamatan (uji Tukey). Persamaan yang digunakan untuk analisis deskriptif dan uji keragaman adalah: Rerata ( )
Simpangan Baku ( ) –
Koefisien Keragaman (
Derajat bebas (DB)
)
34 Jumlah kuadrat (JK)
Dengan
= rerata pengamatan ke = rerata semua pengamatan = nilai pengamatan ke dan faktor ke
Kuadrat tengah (KT)
F hitung
Uji Tukey
Dengan:
= rerata pengamatan faktor ke = rerata pengamatan faktor ke = jumlah pengamatan ke = jumlah pengamatan ke = jumlah level = simpangan baku = persentil dengan distribusi
dan derajat bebas
