MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pengolahan Susu, Laboratorium Ilmu Produksi Ternak Perah, Laboratorium Pengolahan Pangan Hasil Ternak, Laboratorium Uji Organoleptik, Laboratorium Terpadu Departemen IPTPFakultas Peternakan IPB, Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan (ITP) Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan IPB, Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia FMIPA IPB, Laboratorium Pilot Plant SEAFAST IPB, Laboratorium Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI)-Bogor dan Laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obatdan Aromatik (Balittro)-Bogor, sedangkan sampel herbal dan susu kambing masing-masing diperoleh dari Agropolitan, Cipanas-Pacet Kabupaten Cianjur dan Gunung Menyan Cemplang, Bogor. Penelitian ini berlangsung dari Februari 2011 hingga Februari 2012. Materi Bahan-bahan utama yang digunakan dalam pembuatan keju adalah susu kambing, daun mint, daun dill, daun kemangi, kultur bakteri koleksi Bagian Teknologi Hasil Ternak meliputi Lb. acidophilus RRM-01 dan Lc. lactis RRM01,renetkomersial dan CaCl2. Bahan-bahan yang digunakan dalam uji organoleptik adalah roti tawar, susu evaporasi, keju oles (cheeses pread) plain komersial 78 gram, air minum dalam kemasan, mentimun dan bubuk kopi. Media dan bahan kimia yang digunakan adalah plate count agar (PCA), de Man’s Rogosa sharpe broth (MRSB), de Man’s Rogosa sharpe agar (MRSA), buffer peptone water (BPW), kristal violet, amonium oksalat, safranin, etanol 95%, H2O2, akuades, akuabides, fenolftalein 0,1%, NaOH (0,1 N), HCl (0,1 M), NaOH (0,1 M), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), reagen Folin-Ciocalteu dan Na2CO3. Bahan-bahan yang digunakan dalam pengujian aktivitas penghambatan enzim α-amilase adalah Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl, kristal NaOH, DNS (asam 3,5-dinitrosalisiklik), NaK-tartrat, Na-metabisulfit, pati yang mudah larut dan porcine pancreatic α-amylase (EC 3.2.1.1) Sigma Chemical Co. Peralatan utama yang digunakan adalah oven, blender, waterbath, centrifuger dingin, milk rapid flow filter, evaporator vakum, jarum ose, gelas objek, mikroskop, perangkat lunak OPMIAS 1 OPTIKA, autoklaf, tabung ulir, tip 1 ml, pipet man,
19
botol Scott, gelas ukur, neraca OHAUS digital, cawan petri, pemanas bunsen, vortex, magnetic stirrer, kompor, panci stainless steel, pengaduk kayu, inkubator, termometer air raksa, kain kasa, pisau stainless steel, laminar air flow, plastik HDPE, pH meter, spektrofotometer, tabung ependorf dan labu Erlenmeyer. Peralatan yang digunakan dalam uji organoleptik adalah piring porselen, gelas, sendok oles, nampan, tisu, alat tulis, label dan lembar kuesioner. Prosedur Penelitian Pendahuluan Uji Kualitas Susu Kambing Segar (BSN, 1998) dan Susu Evaporasi. Uji kualitas susu kambing segar meliputi uji alkohol, pengukuran berat jenis, pengukuran pH dan total asam tertitrasi, uji protein dengan metode titrasi formol, kadar lemak dengan metode Gerber, penghitungan kadar bahan kering tanpa lemak (BKTL) dengan rumus Fleischmann dan penghitungan total mikrob. Susu kambing yang dievaporasi juga diuji kualitasnya seperti pada pengujian kualitas susu segar, namun tanpa uji alkohol. Uji Determinasi Taksonomi Herbal. Daun mint, dill, dan kemangi yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dalam bentuk segar berumur 2,5 sampai tiga bulan. Pengujian dilakukan di Laboratorium Herbarium Bogoriensis LIPI Bogor. Ekstraksi Herbal (Kwon et al., 2006). Herbal segar dipisahkan bagian daun dari batangnya. Daun segar kemudian dikeringudarakan selama 48 jam dan selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 60 oC selama 24 jam. Masing-masing herbal dihaluskan hingga menjadi tepung dengan menggunakan blender, disaring dan disimpan dalam botol gelap steril. Botol dihindarkan dari sinar matahari langsung. Tepung herbal diekstraksi dengan akuabides dan diinkubasi pada suhu 70 oC selama 24 jam. Perbandingan antara tepung herbal dan akuabides adalah 1:10. Ekstrak herbal diperoleh dengan proses sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC. Ekstrak disaring dengan milk rapid flow filter dan disimpan dalam tabung ulir. Ekstrak herbal dievaporasi vakum pada suhu 60 oC dan disimpan dalam suhu 4 oC sebelum digunakan.
20
Uji Fitokimia Ekstrak Herbal. Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan zat aktif pada ekstrak daun herbal sebelum dan sesudah dievaporasi. Pengujian dilakukan secara kualitatif di Laboratorium Balittro Bogor. Penyegaran Kultur Starter Bakteri. Penyegaran kultur starter bakteri bertujuan kultur starter segar dengan umur 24 jam. Sebanyak 1 ml bakteri stok dibiakkan ke dalam tabung berisi 9 ml media MRSB dan diinkubasi selama 24 jam (suhu 37oC). Penyegaran bakteri dilakukan sebanyak dua kali. Bakteri hasil penyegaran kedua selanjutnya diperiksa untuk meyakinkan tidak terdapat kontaminasi. Pemeriksaan Karakteristik Kultur Starter (Pelczar dan Chan, 2008). Kultur starter yang digunakan diperoleh dari koleksi Bagian Teknologi Hasil Ternak meliputi Lb. acidophilus RRM-01 dan Lc. lactis RRM-01, diperiksa sifat morfologi dan biokimianya untuk mengetahui kemurniannya. Pengamatan morfologi kultur starter dengan bantuan pewarnaan Gram dan mikroskop pada perbesaran 10 x 100 serta pengamatan karakteristik biokimia dengan uji katalase. Pewarnaan Gram. Kultur bakteri yang digunakan adalah kultur umur 24 jam. Kultur bakteri dioleskan pada gelas objek dengan jarum ose yang sebelumnya telah dibakar di atas api bunsen untuk sterilisasi. Preparat bakteri difiksasi. Kristal violet diteteskan di atas preparat dan didiamkan selama 1 menit. Preparat dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Preparat ditetesi dengan larutan lugol iodin, dibilas dengan akuades, kemudian ditetesi dengan etanol 95% selama lima detik dan selanjutnya dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Preparat ditetesi dengan safranin selama 30 detik kemudian dibilas dengan akuades. Preparat
dikeringkan, ditetesi minyak
imersi dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 100. Pengujian Sifat Katalase. Sebanyak satu ose preparat bakteri dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi dengan satu tetes H2O2. Jika dihasilkan gelembung gas O2 maka bakteri yang diuji termasuk kelompok bakteri katalase positif.Sebaliknya, jika tidak dihasilkan gelembung gas O2 maka bakteri tersebut termasuk kelompok bakteri katalase negatif.
21
Perbanyakan Kultur Starter. Kultur yang telah diperiksa kemurniannya ditumbuhkan untuk mendapatkan kultur induk, kultur antara dan kultur kerja. Kultur induk merupakan hasil inokulasi dari 1 ml kultur stok ke dalam 9 ml susu skim steril. Inkubasi dilakukan selama 24 jam. Kultur antara diperoleh melalui inokulasi 1 ml kultur induk dalam 9 ml susu skim steril dan diinkubasi selama 24 jam. Kultur kerja diperoleh cara inokulasi 20 ml kultur antara ke dalam 180 ml susu skim steril dan diinkubasi sampai diperoleh umur bakteri pada fase logaritmik. Fase logaritmik La. acidophilus RRM-01 dan Lc. lactis RRM-01 secara berturut-turut adalah 15 dan 14 jam (Abdurrokhman, 2010). Penelitian Utama Pembuatan Keju dari Susu Kambing (Nasution, 2010). Susu kambing terlebih dahulu dievaporasikan secara vakum. Berikut adalah bagan alir proses pembuatan keju dalam penelitian ini. Susu evaporasi (80% terhadap volume total adonan keju) Penambahan 0,02% CaCl2 terhadap volume susu (b/v) Pemanasan susu(T= 90 oC; t= 15 detik) Pendinginan susu (suhu 40 oC) Penambahan kultur starter campuran (La:Ll = 1:1) dan ekstrak herbal yang dievaporasi (akuades steril untuk kontrol) masing-masing 5% terhadap volume total adonan keju Inkubasi pada suhu 40 oC hingga mencapai pH 6,3 Penambahan 0,06‰ renet terhadap volume susu (v/v) (dikondisikan pada suhu 37 oC) Penyaringan dan penirisan curd Whey Keju segar
Gambar 11. Diagram Alir Proses Pembuatan Keju Sumber: Nasution (2010)
22
Uji Fisik Keju Segar Susu Kambing (AOAC, 2007). Uji fisik keju yang dilakukan meliputi penghitungan waktu koagulasi awal dan rendemen keju (b/b). Penghitungan rendemen dilakukan menggunakan metode berikut. Waktu Koagulasi Awal. Waktu awal koagulasi (t) adalah waktu yang dibutuhkan masing-masing perlakuan untuk mulai membentuk curd. Waktu koagulasi dihitung dari selisih waktu terjadinya koagulasi (t 1) dengan waktu awal penambahan kultur campuran, herbal atau akuades steril dan renet (t0). Penentuan waktu awal koagulasi secara matematis adalah sebagai berikut: Waktu awal koagulasi (t) = t1- t0 Keterangan: t1 =waktu terjadinya koagulasi t0 = waktu awal penambahan kultur campuran, herbal atau akuades steril dan renet
Rendemen. Besar rendemen dihitung berdasarkan persentase berat keju yang dihasilkan terhadap berat susu evaporasi yang digunakan. Rumus yang digunakan adalah sebagai berikut.
Uji Kimia Keju Segar Susu Kambing. Uji kimia yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri atas analisis proksimat keju, uji total fenol dan pengukuran aktivitas antioksidan dengan pengujian penghambatan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Analisis proksimat yang dilakukan meliputi pengukuran kadar air, abu, protein, lemak, serat kasar dan bahan ekstrak tanpa nitrogen (Beta-N). Ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan methanol (MeOH) 100% sebagai bahan pengekstraksinya. Sebanyak 1 gram keju ditambahkan 2,5 ml MeOH dan dibiarkan pada suhu ruang selama 24 jam. Ekstrak dipisahkan melalui sentrifugasi dan residu diekstraksi kembali dengan MeOH selama 24 jam pada suhu ruang. Ekstrak yang diperoleh ditambahkan dengan metanol 100% hingga mencapai volume 10 ml. Ekstrak disentrifuse pada suhu 4 oC selama 20 menit dan disaring dengan kertas saring Whatman No 40. Ekstrak disimpan pada suhu -20 oC sampai digunakan untuk analisis. Uji Total Fenol (Shetty et al., 2005). Sebanyak 1 ml ekstrak dicampur dengan 1 ml etanol (EtOH) 95% dan 5 ml akuades. Reagen Folin-Ciocalteu 23
(50% v/v; 0,5 ml) ditambahkan ke setiap sampel kemudian dihomogenkan. Setelah 5 menit, sebanyak 1 ml Na 2CO3 ditambahkan ke dalam larutan campuran dan didiamkan selama 60 menit pada suhu ruang. Absorbansi dibaca pada spektrofotometer (λ = 725 nm). Nilai absorbansi dikonversi ke total fenol dan diekspresikan dalam mikrogram setara dengan asam galat per mililiter sampel. Kurva standar dibuat dengan mengukur absorbansi larutan asam galat (5-60 μg/ml) dalam metanol (Gambar 12).
Gambar 12. Kurva Standar Asam Galat untuk Memperkirakan Total Fenol Keju dan Ekstrak Herbal Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Pengujian Penghambatan DPPH (Apostolidis et al., 2006). Sebanyak 250 µl ekstrak keju dalam MeOH ditambahkan ke dalam 3 ml DPPH 60 μM dalam metanol 100%. Absorbansi dibaca pada spektrofotometer (λ = 517 nm). Pembacaan dibandingkan dengan blanko yang berisi 250 µl MeOH menggantikan ekstrak. Persentase penghambatan dihitung dengan rumus:
Uji Penghambatan Enzim α-amilase (Kwon et al., 2006). Persiapan pengujian diawali dengan pembuatan buffer natrium fosfat 0,02 M (pH 6,9 dengan NaCl 0,006 M), larutan asam dinitrosalisiklik dan larutan enzim. Masing-masing larutan disiapkan dalam bentuk segar. Pembuatan Buffer Natrium Fosfat. Ketiga larutan berikut disiapkan secara terpisah: 1) 1,582 g Na2HPO4 dalam 200 ml akuades, 2) 1,062
24
g NaH2PO4 dalam 200 ml akuades dan 3) 0,3506 g NaCl dalam 100 ml akuades. Ketiga larutan dicampur dan dihomogenkan, diikuti dengan penambahan 400 ml akuades. Nilai pH larutan diukur dengan pH meter. Jika pH menyimpang dari 6,9 maka disesuaikan dengan penambahan Na2HPO4 sebagai basa dan NaH2PO4 sebagai asam. Larutan dilengkapi hingga mencapai volume akhir sebesar 1.000 ml dalam labu takar. Buffer Na-fosfat disimpan pada suhu 25 oC dan digunakan sebelum dua minggu dari waktu pembuatan. Pembuatan Larutan Asam Dinitrosalisiklik. Sebanyak 16 g NaOH dalam 200 ml akuades, kemudian ditambahkan 10 g larutan DNS (asam 3,5-dinitrosalisiklik) dan dihomogenkan. Sebanyak 30 g NaKtartrat dan 8 g Na-metabisulfit dicampur dan dilarutkan kedalam 500 ml akuades. Kedua larutan dicampur dan ditambahkan akuades hingga diperoleh volume akhir larutan sebesar 1.000 ml. Larutan dilindungi dari cahaya selama pembuatan dan penyimpanan. Pembuatan Larutan 1% pati. Pati yang mudah larut digunakan dalam penelitian ini. Sebanyak 1 g pati dilarutkan dalam 100 ml buffer natrium fosfat yang telah disiapkan sebelumnya. Larutan dihomogenkan dengan pengadukan konstan pada suhu 90 oC. Larutan pati didinginkan dan disimpan pada suhu 4 oC. Larutan pati diinkubasi terlebih dahulu pada suhu 25 oC selama 5 menit sebelum digunakan dalam pengujian. Pembuatan Larutan Enzim α-amilase. Konsentrasi larutan porcine pancreatic α-amylase yang digunakan dalam pengujian adalah 0,5 mg/ml. Bubuk enzim dilarutkan dalam buffer natrium fosfat yang telah disiapkan sebelumnya. Buffer fosfat yang digunakan terlebih dahulu didinginkan untuk mempermudah kelarutan laktosa dalam enzim. Larutan enzim disiapkan segar dan disimpan pada suhu 4 oC sebelum digunakan. Analisis Penghambatan Enzim α-amilase. Sebanyak 500 μl ekstrak ditambahkan 500 μl larutan enzim α-amilase. Larutan diinkubasi pada
25
suhu 25 oC selama 10 menit. Sebanyak 500 μl larutan 1% pati ditambahkan ke dalam larutan campuran dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 25
o
C. Sebanyak 1 ml larutan asam DNS
ditambahkan ke dalam larutan campuran dan diinkubasi selama 5 menit dalam air mendidih. Larutan didinginkan hingga mencapai suhu 25 oC dan ditambahkan 10 ml akuades. Nilai absorbansi larutan diamati pada spektrofotometer (λ = 540 nm).
Uji Mikrobiologis Keju Segar Susu Kambing. Uji mikrobiologis keju dilakukan untuk penentuan populasi BAL yang ada dalam keju. Bakteri yang digunakan sebagai kultur starter keju merupakan bakteri probiotik, sehingga diasumsikan bahwa populasi BAL dalam keju mencerminkan populasi bakteri probiotik dalam keju. Penentuan Standar Populasi Bakteri Asam Laktat (Bacteriological Analytical Manual, 2001). Sebanyak 5 g sampel keju yang sudah homogen diambil dengan spatula steril, dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer berisi 45 ml larutan BPW, sehingga terbentuk pengenceran 10 -1. Sebanyak 1 ml larutan dari pengenceran 10-1dimasukkan ke dalam tabung ulir berisi 9 ml larutan BPW, sehingga terbentuk pengenceran 10 -2. Pengenceran dilakukan sampai pada pengenceran 10-7. Sebanyak 1 ml sampel dari pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7 dipindahkan ke dalam cawan petri steril. Sebanyak 15 ml media MRSA ditambahkan ke dalam cawan petri dan dihomogenkan.Cawan diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37 C selama 24-48 jam. Koloni BAL yang terbentuk dihitung berdasarkan rumus berikut:
Keterangan : n1= Jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung (25-250 koloni) n2= Jumlah cawan kedua yang koloninya dapat dihitung (25-250 koloni) N = Faktor pengenceran
Uji Organoleptik Keju Segar Susu Kambing. Uji organoleptik dilakukan dalam ruangan uji organoleptik yang terlebih dahulu dikondisikan dalam keadaan nyaman 26
dan bersih. Ruangan uji organoleptik mempunyai pencahayaan yang cukup dan bersuhu sekitar 24 oC. Uji organoleptik yang dilakukan meliputi uji hedonik dan mutu hedonik. Sampel disajikan di atas piring porselen dengan ukuran dan warna yang seragam. Panelis terdiri atas 21 orang mahasiswa untuk uji mutu hedonik dan 33 orang mahasiswa untuk uji hedonik. Panelis yang dipilih adalah panelis yang memiliki kesediaan untuk menjadi panelis tanpa paksaan,tidak alergi dengan produk yang disajikan dalam uji organoleptik dan memiliki waktu yang cukup untuk melakukan uji organoleptik dan pelatihan khusus Panelis diinstruksikan untuk minum dan berkumur-kumur sebelum melakukan uji organoleptik. Uji Hedonik. Atribut yang dinilai adalah meliputi kesukaan terhadap penampilan umum, warna, aroma, dan rasa. Sebanyak 10 gram keju lunak disajikan bersama dengan roti tawar dengan cara dioleskan ke seluruh permukaan roti ukuran 4 cm x 4 cm. Roti yang dipilih adalah roti tawar kupas. Sampel disajikan satu per satu. Mentimun diberikan sebagai penetral rasa dan bubuk kopi hitam sebagai penetral aroma. Form uji hedonik diberikan bersamaan dengan penyajian sampel. Panelis diberikan penekanan informasi bahwa masing-masing sampel harus dinilai objektif dan tidak dilakukan pembandingan antar sampel. Uji Mutu Hedonik. Atribut mutu yang dinilai adalah aroma prengus dan daya oles. Susu kambing evaporasi yang digunakan dalam penelitian ini disajikan sebagai bahan standar untuk menyatakan skor 4dalam penilaian atribut aroma prengus. Aroma ekstrak mint, dill dan kemangi yang telah dievaporasi diperkenalkan kepada panelis. Hal ini dilakukan untuk menghindari kekeliruan dalam memberikan penilaian aroma prengus, membedakan antara aroma ekstrak dengan aroma prengus. Roti tawar dengan ukuran 4 cm x 4 cm. Cheese spread plain komersial (78 gram) digunakan sebagai standar untuk menyatakan “mudah dioleskan” dalam penilaian daya oles. Tisu digunakan untuk membersihkan sendok oles sebelum digunakan untuk mengoles keju dari sampel berikutnya.
27
Bagan Alir Penelitian Penelitian ini terdiri atas dua bagian utama, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Alur kerja penelitian secara keseluruhan disajikan pada Gambar 13.
Stok kultur bakteri: La dan Ll
Susu kambing segar
Identifikasi: pewarnaan Gram dan uji katalase
Uji kualitas susu segar sesuai SNI 01-2782-1998
Daun mint, dill dan kemangi
Identifikasi taksonomi Bakteri murni
Bakteri terkontaminasi
Susu kambing segar lolos uji SNI
Susu kambing segar tidak lolos uji SNI
Ekstraksi herbal dengan akuabides
Evaporasi secara vakum
Uji Fitokimia
Uji kualitas susu sesuai SNI 012782-1998
Evaporasi secara vakum
Susu evaporasi terstandar
Uji fitokimia
Keju lunak
Ekstrak herbal hasil evaporasi yang telah diuji fitokimia
Uji mutu: fisik, kimia, mikrobiologis dan organoleptik keju lunak
Gambar 13.Alur Kerja Penelitian Rancangan dan Analisis Data Rancangan Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan empat perlakuan dan masing-masing dengan tiga kali pengulangan. Data yang diperoleh selanjutnya diolah dengan Microsoft Excel 2007 untuk memperoleh nilai rataan untuk memperoleh nilai rataan dan standar deviasi. Data yang memiliki galat pada batasan
28
yang ditoleransi kemudian dikelompokkan ke dalam jenis data parametrik atau nonparametrik.
Analisis Data Pengujian data parametrik diawali dengan pengujian asumsi. Apabila data memenuhi uji asumsi, maka data dianalisis ragam dengan ANOVA. Apabila data masih tidak memenuhi uji asumsi, maka data ditransformasi terlebih dahulu dan apabila masih tidak memenuhi uji asumsi, maka akan dianalisis dengan uji Kruskal Wallis. Jika pada analisis ragam didapatkan hasil yang berbeda nyata, maka analisis data dilanjutkan dengan uji Tukey (Steel dan Torrie, 1995). Model matematik yang digunakan untuk RAL sesuai dengan Steel dan Torrie (1995): Yij= µ + Pi + εij Keterangan: Yij = variabel respon akibat pengaruh perlakuan ke-i (1 = keju tanpa ekstrak herbal atau kontrol; 2 = keju dengan 5% ekstrak mint; 3 = keju dengan 5% ekstrak dill; dan 4 = keju dengan 5% ekstrak kemangi) dan ulangan ke-j (1, 2, dan 3) µ = nilai rataan umum (rendemen keju, total fenol, persentase penghambatan DPPH, persentase penghambatan enzim α-amilase, dan populasi BAL dalam keju) Pi = pengaruh perlakuan ke-i Εij = galat dari perlakuan ke-i pada ulangan ke-j
sedangkan model matematik yang digunakan untuk Kruskal Wallis menurut Casella (2008) adalah sebagai berikut:
Keterangan: ni = jumlah pengamatan dalam sampel ke-i (i = 1, 2, ..., k) n = ∑ni Ri = jumlah dari ranking untuk sampel ke-i
Analisis regresi linier digunakan untuk menentukan pengaruh total fenol terhadap aktivitas antioksidan, penghambatan enzim α-amilase secara in vitro dan total BAL keju serta kombinasinya. Korelasi antar variabel juga ditentukan. Data tersebut dianalisis menggunakan perangkat lunak Statistix 9.0.
29
