METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilakukan di Bagian Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor sebagai tempat perlakuan dan pemeliharaan hewan percobaan; analisis proksimat dilakukan di Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor; dan analisis profil lemak darah dan kolesterol hewan percobaan dilakukan di Laboratorium Klinik Prodia Bogor Penelitian ini dilakukan selama 3 bulan, yaitu dari bulan Nopember 2007 sampai Januari 2008. Materi Produk Olahan Daging Bahan dasar yang digunakan dalam pembuatan gulai daging sapi adalah daging sapi berlemak dan jeroan (paru, hati, limpa, usus) yang berasal dari sapi jenis brahman cross berumur 3 tahun. Daging yang digunakan terdiri atas daging bagian paha belakang bagian knuckle sebanyak 5 kg dan jeroan sebanyak 2,5 kg. Bahan tambahan lain yang diperlukan dalam pembuatan gulai diantaranya yaitu air, bumbu gulai instan (non santan) merk Bamboe dan santan kelapa instan Sun Kara. Alat yang digunakan dalam pembuatan produk olahan daging yaitu diantaranya timbangan digital, pisau, talenan dan peralatan memasak. Percobaan in Vivo dan Analisis Darah Tikus Hewan yang digunakan dalam percobaan in vivo adalah tikus putih jantan albino Rattus norvegicus (norway rats) galur wistar yang diperoleh dari SEAMEO Universitas Indonesia Salemba, Jakarta sebanyak 14 ekor. Tikus tersebut dibagi menjadi 2 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri atas 7 ekor tikus percobaan. Kelompok pertama (P0), yaitu kelompok yang diberi ransum mengandung protein kasein, sedangkan kelompok kedua (P1) merupakan kelompok yang diberi ransum mengandung gulai daging sapi dan jeroan. Tikus yang digunakan berumur 5 minggu. Tikus tersebut memiliki bobot badan berkisar antara 50-65 g dengan perbedaan bobot badan masing-masing kurang lebih 15 g. Alat yang digunakan dalam pemeliharaan adalah kandang individu sebanyak 14 buah terbuat dari kotak plastik dengan tutup berupa kawat kasa, tempat pakan dari plastik dan
tempat minum dari botol gelas sirop. Alat lain yang digunakan selama pemeliharaan adalah termometer digital yang digunakan untuk mengukur suhu tubuh tikus, timbangan digital untuk mengukur bobot badan tikus, stop watch, serta alat pendukung lingkungan pemeliharaan seperti RH meter digital dan alat pengatur kelembaban ruangan merk Daisap Swallow. Kandang pemeliharaan dibersihkan setiap hari dan dilakukan penggantian sekam setiap seminggu sekali, namun bila sekam cepat kotor, maka dilakukan penggantian hari itu juga. Alat dan bahan untuk pengambilan sampel darah antara lain syringe 2,5 ml, vacuum tainer 10 ml yang telah mengandung antikoagulan lithium heparin, toples kaca sebagai tempat pemingsanan hewan percobaan, termos es, dan bahan anestesi. Analisis darah menggunakan Alat yang digunakan untuk analisis darah yaitu automated clinical analyzer TRX – 7010 Version 1.70. Prosedur Penelitian profil lemak, kolesterol darah dan respon fisiologis tikus wistar yang diberi ransum mengandung gulai daging sapi dan jeroan ini dibagi ke dalam lima tahap. Kelima tahap tersebut dilakukan secara dapat dilihat pada Gambar 4 berikut. Pemotongan daging dan jeroan daging sapi + pembuatan produk olahan daging (gulai daging sapi dan jeroan) Analisis komposisi kimia (analisis proksimat dan analisis kadar kolesterol) gulai daging sapi dan jeroan Penyusunan ransum mengandung gulai daging sapi dan jeroan Percobaan ransum perlakuan secara in vivo dan pengamatan respon fisiologis tikus percobaan selama masa perlakuan Pengambilan sampel darah, pengujian kadar kolesterol, trigliserida, kolesterol HDL, dan kolesterol LDL serta indeks atherogenik Gambar 4. Tahapan Penelitian
24
Proses pengolahan tahap pertama ( Gambar 4), yaitu pengolahan daging sapi menjadi gulai daging sapi dan jeroan. Tahap kedua menganalisis komposisi kimia gulai daging sapi melalui metode analisis proksimat serta analisis kadar kolesterol total olahan gulai daging sapi dan jeroan. Tahap ketiga meliputi penyusunan ransum berdasarkan data analisis proksimat gulai daging sapi dan jeroan sebagai sumber protein. Tahap keempat yaitu pengujian secara in vivo ransum yang mengandung gulai daging sapi dan jeroan terhadap tikus sebagai hewan percobaan serta pengamatan respon fisiologis selama masa perlakuan meliputi laju pernafasan, denyut jantung dan suhu tubuh. Tahap kelima yaitu dilakukan pengambilan sampel darah yang dilanjutkan dengan pengujian kadar kolesterol total, kolesterol HDL, trigliserida, dan kolesterol LDL. Pembuatan Gulai Daging Sapi dan Jeroan Gulai daging sapi berlemak dan jeroan dipotong sebesar ibu jari, selanjutnya dimasukkan ke dalam panci berisi air mendidih, kemudian direbus di atas kompor hingga volume air menjadi 2/3 bagian. Seluruh bumbu gulai instan dimasukkan bersama ½ bagian santan instan yang diencerkan dengan air hingga mendidih. Santan kental ½ bagian (tidak diencerkan) dimasukkan ke dalam adonan gulai dan dimasak hingga matang sambil diaduk, hingga volume air menjadi 1/8 volume awal. Proses pembuatan gulai daging sapi berlemak ditambah jeroan dapat dilihat pada Gambar 5 di bawah ini. Daging sapi berlemak (bagian knuckle) + jeroan (paru, hati, limpa, usus) dipotong-potong dan dibersihkan dibawah air mengalir direbus dalam panci/wajan berisi air volume air rebusan menjadi 2/3 bagian Santan kental (½ bagian)
Bumbu gulai instan dan ½ bagian santan
mendidih instan yang
gulai daging sapi berlemak + jeroan (volume air menjadi 1/8 bagian) Gambar 5. Tahapan Proses Pembuatan Gulai Daging Sapi dan Jeroan
25
Penyusunan dan Pembuatan Ransum Hewan Percobaan Tahap penyusunan dan pembuatan ransum hewan percobaan dapat dilihat pada Lampiran 17. Tahap ini dilakukan setelah komponen kimiawi gulai daging sapi hasil analisis proksimat diketahui. Penyusunan komposisi ransum kontrol maupun perlakuan disesuaikan dengan kebutuhan tikus percobaan berdasarkan kebutuhan harian (Lampiran 17). Komposisi ransum kontrol (ransum kasein sebagai sumber protein) dan ransum kontrol (gulai daging sapi dan jeroan) dapat diketahui setelah melalui analisis komposisi kimia (Lampiran 1). Kandungan nutrisi ransum masingmasing perlakuan yang mengacu pada komposisi bahan makanan (Lampiran 5) dari Departemen Kesehatan RI (2001). Tabel di bawah ini menjelaskan komposisi nutrisi harian tikus kontrol (Tabel 7) dan tikus perlakuan (Tabel 8) berdasarkan kebutuhan nutrisi yang harus terpenuhi dari setiap ekor tikus. Tabel 7. Kandungan Nutrisi Ransum Kontrol Sumber Protein Kasein Bahan makanan
Protein (%) 7,82
Lemak (%) 0,18
Gross Energy
Kasein
Bahan Kering (%) 9
Minyak Nabati Campuran Mineral
7,77 4,48
-
7,77 -
70,0854 kal -
Selulosa Pati Jagung
1 76,82
4,24
0,077
263,4926 kal
Vitamin
1
-
-
-
Jumlah
100
12,06
8.03
333,5807 kal
0,0027 kal
Tabel 8. Kandungan Nutrisi Ransum Perlakuan Sumber Protein Daging Sapi dan Jeroan Bahan Kering Protein Lemak Bahan makanan Gross Energy (%) (%) (%) Daging sapi
26
11,91
8,69
53,82 kal
Minyak nabati
7,77
-
7,77
69,454 kal
Campuran mineral
4,48
-
-
-
Selulosa
1
-
-
-
Pati Jagung
59,75
0,18
-
204,9425 kal
Vitamin
1
-
-
-
100
12,09
8,46
328,2165 kal
Jumlah
26
Percobaan inVivo Ransum Perlakuan Tikus sebelum pemberian perlakuan diaklimatisasikan terlebih dahulu yaitu diberi waktu untuk beradaptasi selama 5 hari untuk membiasakan tikus pada lingkungan laboratorium yang digunakan. Selama masa adaptasi, tikus diberi ransum kontrol (sumber protein kasein) dan konsumsi air minum disediakan ad libitum. Langkah selanjutnya adalah penimbangan bobot badan tikus tiap dua hari sekali dan konsumsi ransum setiap hari. Setelah masa adaptasi aklimatisasi diberikan ransum perlakuan selama 20 hari dan air minum juga diberikan ad libitum. Pengambilan Sampel Darah Tahap ini dilakukan setelah habis masa perlakuan, tikus percobaan kemudian dipuasakan selama satu hari dan dilakukan pengambilan sampel darah. Tikus sebelumnya dipingsankan dengan pemberian anestesi, kemudian pengambilan darah dilakukan dengan cara menyedot darah langsung dari jantung tikus menggunakan syringe 2,5 ml. Darah diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung vacuum tainer. kapasitas 10 ml yang sudah mengandung antikoagulan lithium heparin. Sampel darah yang telah terkumpul kemudian diletakkan dalam termos es. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Penelitian ini menggunakan dua rancangan, yaitu rancangan acak lengkap (RAL) untuk peubah analisis darah yang meliputi kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL, dan kolesterol LDL dan indeks atherogenik. Rancangan kedua adalah rancangan acak lengkap dengan metode penarikan anak contoh (subsampling) untuk peubah respon fisiologis, yang meliputi laju pernafasan, denyut jantung dan suhu tubuh. Perlakuan yang diberikan yaitu pemberian ransum dengan sumber protein yang berbeda, antara kasein (kontrol) dan gulai daging sapi dan jeroan. Ulangan yang digunakan yaitu tikus percobaan sebanyak 7 ekor. Model matematika rancangan acak lengkap (RAL) tahap pertama, rancangannya adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie, 1991) :
27
Yij = µ +
i + ij
Keterangan : Yij
= Perubahan respon ulangan ke-j karena pengaruh ransum perlakuan ke-i
µ
= Rataan umum i
ij
= Pengaruh taraf perlakuan ransum ke-i = Galat percobaan perlakuan ransum ke-i dan ulangan ke-j Rancangan kedua yaitu menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan
penarikan anak contoh (subsampling) untuk menganalisis data pengukuran respon fisiologis. Peubah yang diukur meliputi laju pernafasan, suhu tubuh, dan detak jantung tikus percobaan. Rancangan ini meliputi dua perlakuan yaitu perlakuan ransum kontrol (ransum kasein) dan ransum perlakuan (gulai daging sapi dan jeroan), dengan masing-masing perlakuan memiliki tujuh sampel tikus percobaan, dan delapan kali pengulangan (pengukuran respon fisiologis). Model matematikanya adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie, 1991) : Yijk = µ + τi + ij + ijk Keterangan : Yijk
= Perubahan ulangan respon fisiologis ke-k dalam sampel tikus ke-j yang memperoleh perlakuan ransum ke-i
µ
= Rataan umum
τi
= Pengaruh perlakuan ransum ke-i
ij
= Pengaruh galat sampel tikus ke-j yang memperoleh perlakuan ransum ke-i
ijk
= Pengaruh galat dari ulangan respon fisiologis ke-k dalam sampel tikus ke-j yang memperoleh perlakuan ransum ke-i Analisis data yang digunakan untuk rancangan percobaan pertama, yaitu
Rancangan acak lengkap (RAL) menggunakan ANOVA (Steel dan Torrie, 1991), yang diolah dalam program komputer Minitab 14. Rancangan kedua, yaitu RAL dengan penarikan anak contoh (subsampling), data dianalisis menggunakan ANOVA (Steel dan Torrie, 1991), yang diolah dalam program komputer Microsoft Excel.
28
Peubah yang Diamati Peubah yang diukur dalam penelitian ini terbagi atas tiga bagian, yaitu : (1) analisis kimia produk olahan daging, terdiri dari kadar air, kadar protein, kadar lemak, kadar abu, dan kadar kolesterol; (2) analisis profil lemak dan kolesterol darah, yang terdiri dari kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL, kolesterol LDL, dan indeks atherogenik; serta peubah (3) meliputi respon fisiologis, yaitu laju pernafasan denyut jantung, dan suhu tubuh. Kadar Air Penentuan kadar air dilakukan dengan menggunakan metode oven (AOAC, 1984). Sebanyak 5 g sampel gulai daging sapi dan jeroan ditimbang dalam cawan logam yang berat keringnya telah diketahui sebelumnya. Cawan beserta isinya dipanaskan dalam oven dengan suhu 105ºC selama 12 jam. Sampel kemudian didinginkan hingga beratnya konstan. Kadar air dihitung dengan persamaan : Berat cawan a (g) – Berat cawan b (g) Kadar air % =
X 100% Berat cawan a (g)
Keterangan : (1) berat cawan a = berat cawan + sampel awal (2) berat cawan b = berat cawan + sampel yang dikeringkan Kadar Protein Kadar protein diukur dengan menggunakan metode Kjeldahl (AOAC, 1984). Sampel gulai daging sapi ditambah jeroan sebanyak 0,3 g (X) dimasukkan ke dalam labu Kjehdal, kemudian ditambahkan katalis dan H2SO4 pekat 25 ml. Campuran dipanaskan di atas bunsen, kemudian didekstruksi hingga jernih dan berwarna hijau kekuningan. Labu dekstruksi didinginkan dan larutan dimasukkan dalam labu penyulingan serta diencerkan dengan 300 ml air yang bebas N, kemudian ditambah batu didih dan NaOH 33%. Labu penyuling dipasang dengan sangat cepat pada alat penyuling hingga 2/3 cairan dalam labu penyuling menguap dan ditangkap oleh larutan H2SO4 berindikator dalam labu Erlenmeyer. Kelebihan H2SO4 dalam labu Erlenmeyer dititar dengan NaOH 0,3 N (Z ml) sampai terjadi perubahan warna menjadi biru kehijauan lalu dibandingkan dengan titar blanko (Y ml). Kadar protein dihitung dengan rumus :
29
(Y-Z) x 0,014 x titar NaOH x 6,25 Kadar protein kasar =
x 100% X
Kadar Lemak Kadar lemak ditentukan dengan metode Soxhlet (AOAC, 1984). Labu yang akan digunakan dikeringkan dalam oven, kemudian didinginkan dalam indikator dan ditimbang beratnya. Gulai daging sebanyak 5 g sapi ditambah jeroan dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi Soxhlet. Alat kondenser diletakkan di bawahnya. Pelarut heksana dimasukkan ke dalam labu lemak secukupnya. Pelarut lemak didestilasi dan ditampung kembali. Abu lemak yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105ºC hingga beratnya konstan, dan didinginkan dalam desikator. Labu beserta lemaknya ditimbang, kadar lemak dapat dihitung dengan rumus : Berat lemak (g) Kadar lemak (% BB) =
x 100% Berat sampel (g)
Kadar Abu Sampel gulai daging sapi sebanyak 5 g ditempatkan dalam cawan porselin yang telah diketahui beratnya, kemudian diangkat dan dipijarkan pada suhu 600ºC selama 4 jam, hingga beratnya konstan. Kadar abu dihitung dengan persamaan : Berat abu (g) Kadar abu (%BB) =
x 100% Berat sampel (g)
Kadar Kolesterol (Metode Lieberman – Buchards) Analisis kadar kolesterol daging gulai menggunakan metode Lieberman– Buchards (Herpandi, 2005). Sebanyak 0,1 g sampel gulai daging sapi dimasukkan dalam tabung sentrifuse dan ditambahkan 8 ml alkohol : heksan (8:1) lalu aduk sampai homogen. Pengaduk dibilas dengan 2 ml larutan alkohol : heksan (2:1) kemudian di sentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan dituangkan kedalam gelas piala untuk diuapkan di penangas air. Residu yang tersisa diuapkan dengan kloroform sedikit demi sedikit sambil dituangkan dalam tabung berskala sampai volume 5 ml, kemudian ditambahkan 2 ml acetic anhidrid, 0,2 ml H2S04 pekat, lalu di kocok dengan alat vorteks dan dibiarkan ditempat gelap selama
30
25 menit, kemudian dibaca absorbansinya pada
550 nm. Perhitungan kadar
kolesterol dilakukan dengan rumus : Absorbansi contoh x konsentrasi standar Absorbansi standar Kadar kolesterol (mg/dl) = Bobot sampel Pengamatan Respon Fisiologis Pengamatan respon fiologis dilakukan setelah hewan percobaan makan atau pada waktu pagi hari. Peubah yang diamati dalam pengamatan respon fisiologis (Gambar 6), meliputi: laju pernafasan, detak jantung, dan suhu tubuh. Pengamatan laju pernafasan dan detak jantung dilakukan dengan menempelkan jari tangan masing-masing pada diafragma dan dada sebelah kiri. Suhu tubuh diukur dengan memasukkan termometer digital pada bagian rektal tikus, angka yang terlihat selanjutnya pada termometer menunjukkan suhu tubuh hewan percobaan.
(a)
(b)
(c)
Keterangan : (a) Pengukuran Laju Pernafasan (b) Pengukuran Detak Jantung (c) Pengukuran Suhu Tubuh Gambar 6. Pengamatan Respon Fisiologis Tikus Percobaan Analisis Profil Lemak dan Kolesterol Darah Analisis kadar kolesterol, HDL, LDL dan trigliserida darah menggunakan alat automated clinical analyzer TRX-7010. Alat tersebut menganalisis sampel secara otomatis, data analisis akan keluar dalam data print out. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan mencampurkan reagen dengan sampel lalu dibaca absorbansinya. Alat ini bekerja mulai dari persiapan sampai akhir perhitungan secara otomatis menggunakan
31
program komputer. Prinsip dasar analisis trigliserida, kolesterol, HDL dan LDL darah pada alat automated clinical analyzer TRX-7010 sama seperti yang dilakukan Sihombing (2003). Darah disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit. Plasma yang terpisah dari serum diambil dengan menggunakan pipet dan dimasukkan kedalam tabung Evendorf lalu ditutup. Kadar Kolesterol Total (Rodriguez et al., 2000). Metode pengukuran dilakukan dengan cholesterol oxidase phenol amino phenazone (CHOD-PAP). Sebanyak 10 µl sampel plasma darah dimasukkan ke dalam tabung dan ditambahkan 1 ml larutan reagen. Reagen yang digunakan berasal dari cholesterol assay kit, DiaLINE diagnostic systems. Larutan buffer pH 6.7, chloro-4-phenol 5 mmol/l, dan beberapa enzim yang terdiri atas cholesterol oxydase 50 U/l, peroxidase 3 kU/l, cholesterol esterase 200 U/l, dan 4-aminophenazone 0,3 mmol/l. Sebagai blanko juga digunakan 1,00 ml larutan reagen. Larutan campuran lalu divorteks, dan diinkubasi selama 20 menit (20-25 °C) atau 10 menit (37°C). Absorbansi larutan dibaca pada
546 nm.
Penghitungan dilakukan melalui rumus dibawah ini: Konsentrasi (mg/dl) = 900 ×
A sampel
Kadar Trigliserida (Rodriguez et al., 2000). Metode pengukuran dilakukan dengan enzymatic colorimetric test GPO-PAP. Sebanyak 10 µl sampel plasma dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan dengan 1,00 ml larutan reagen, lalu divorteks. Reagen yang digunakan berasal dari triglycerides assay kit, DiaLINE diagnostic system. Reagen tersebut terdiri dari larutan glycerol phosphate oxidase(GPO), buffer Ph 7.2, 4-chlorophenol 4 mmol/l, enzim glycerol kinase (GK) 9,5 kU/l, peroxidase 2 kU/l, lipoprotein lipase 2 kU/l, dan 4-aminophenazone 0,5 mmol/l. Sebagia blanko digunakan 1,00 ml reagen. Larutan diinkubasi selama 20 menit (20-25 °C) atau 10 menit (37°C). Absorbansi larutan dibaca pada
546 nm.
Penghitungan dilakukan melalui rumus dibawah ini: Konsentrasi (mg/dl) = 1150 ×
A sampel
Kadar Kolesterol HDL (Rodriguez et al., 2000). Metode pengukuran dilakukan menggunakan HDL test kit (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd) menurut. Sebanyak 3,0 µl sampel plasma dimasukkan kedalam tabung dan ditambahkan 300 µl larutan reagen lalu divorteks. Reagen tersebut terdiri atas DSBmT (N,N-bis (4-sulfobutyl)-
32
m-garam toluidine disodium) 0,5 mmol/l, cholesterol oxidase 1,0 IU/l, dan 4aminoantipyrine 1,0 mmol/l. Sebagian blanko digunakan 1,00 ml reagen. Larutan diinkubasi selama 5 menit (37°C). Absorbansi larutan dibaca pada 600 nm. Kadar Kolesterol LDL (Matsubara et al., 2002). Kadar kolesterol LDL (k-LDL) dihitung secara langsung menggunakan persamaan Friedwald : k-LDL (mg/dl) = kolesterol total (mg/dl) – k-HDL (mg/dl) -
trigliserida (mg/dl)
5 Indeks Atherogenik (Matsubara et al., 2002). Perhitungan indeks atherogenik (IA) dilakukan dengan menggunakan persamaan : Indeks Aterogenik (IA) = (Kolesterol Total – Kolesterol HDL) / Kolesterol HDL
33
