MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Fakultas Peternakan IPB pada bulan Desember 2009 hingga Februari 2010 dan dilanjutkan di Laboratorium Bakteriologi Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor pada April 2010 hingga Juli 2010. Sampel telur, feses dan ayam petelur diambil dari dua peternakan yang berada di Desa Curug Kecamatan Gunung Sindur Kabupaten Bogor dengan populasi ± 60000 ekor untuk peternakan A dan ± 64000 untuk peternakan B. Materi Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah usus kecil dan digesta dari saluran pencernaan, isi (kuning dan albumin) dan kerabang telur serta feses ayam petelur. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah Lactose Broth (LB), Nutrient Broth, Tetrahionate Broth (TTB), Rappaport-Vassilidis (RV), Semi Solid Agar, Triple Sugar Iron (TSI) Agar, Lysine Iron Agar (LIA), Simmon’s Citrate, Indole, Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar, Hektoen Enteric Agar (HEA), Bismuth Sulfith Agar (BSA), BRG Agar, Salmonella-Shigella (SS) Agar, dan Nutrient Agar (NA). Bahan kimia yang digunakan adalah, Methile Red Voges Proskoner (MRVP), gula-gula (adonitol, arabinose, cellobiose, dulcitol, glycerol, inositol, lactose, maltose, mannitol, raffinose, rhamnose, salicin, sorbitol, sucrose, trehalose, xylose), dan aquadest serta bahan tambahan lain yaitu alkohol untuk mensterilkan alat. Peralatan Alat-alat utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah jarum ose, tabung reaksi, tip, cawan petri, autoclave, pipet, alumunium foil, jangka sorong, kapas, karet, tisu dan bunsen.
57
Prosedur Pengambilan Sampel dari Peternakan Pengambilan sampel dilakukan secara acak. Data peternakan yang diperoleh dari Dinas Peternakan dan Perikanan (Disnakan) Kabupaten Bogor kemudian dipilih secara acak untuk menentukan lokasi pengambilan sampel. Setelah lokasi ditentukan, surat pengantar dari Disnakan dibuat untuk izin pengambilan sampel. Pengambilan sampel ayam, telur, dan feses dilakukan dengan metode yang sama yaitu secara acak. Sampel yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah usus kecil dan digesta dari saluran pencernaan ayam petelur, isi telur (kuning dan albumin) dan kerabang telur serta feses ayam petelur. Ayam, feses, dan telur diambil dari 2 peternakan di Desa Curug, Kecamatan Gunung Sindur, Kabupaten Bogor. Tiaptiap peternakan diambil 3 sampel ayam yang diambil saluran pencernaan (usus dan digesta), 11 sampel feses serta 6 butir telur. Ayam yang digunakan sebagai sampel diambil dari peternakan A dan B masing-masing 3 ekor. Ayam dibawa ke labolatorium untuk disembelih dan diambil saluran pencernaannya yaitu usus halus dan isi dari usus halus tersebut (digesta). Usus halus yang akan digunakan kemudian dibersihkan dengan air steril. Usus dan digesta masing-masing dimasukkan ke dalam plastik steril dan diberi nama sampel. Telur yang digunakan sebagai sampel diambil dari peternakan A dan B masing-masing 3 telur. Telur diambil dari ayam yang baru bertelur kemudian dibungkus plastik steril untuk dibawa ke labolatorium. Telur kemudian dipisahkan antara isi (kuning dan albumin) dan kerabangnya, setelah itu masing-masing dimasukkan ke dalam plastik steril dan diberi nama. Feses yang digunakan sebagai sampel diambil dari peternakan A dan B masing-masing 11 sampel. Feses diambil dari ayam yang baru mengeluarkan feses dengan alat cotton buds steril kemudian dimaukkan ke dalam plastik steril dan dibawa ke labolatorium.
58
Isolasi Salmonella enteritidis Prosedur isolasi yang digunakan berdasarkan Andrews dan Hammack, USFDA Bacteriologial Analitycal Method (BAM) 8thEdition revisi Desember tahun 2007 yang secara konvensional meliputi tahap pengkayaan, pengkayaan selektif, agar selektif, uji biokimia awal. Setiap tahapan isolasi dilakukan secara berurutan. Sampel yang menunjukkan reaksi positif kemungkinan adanya Salmonella pada media yang telah diinokulasi pada setiap tahapan akan dilanjutkan ke tahapan selanjutnya, sedangkan reaksi negatif yang didapatkan akan menyebabkan proses isolasi dihentikan karena tidak didapatkan tanda-tanda keberadaan Salmonella. Pengkayaan Saluran pencernaan diambil usus halus dan digestanya, sedangkan telur segar diambil isi (kuning dan albumin) telur dan kerabang telurnya ditimbang sebanyak 25 gram dan dimasukkan ke dalam kantong plastik steril 500 ml. kedalam plastik tersebut lalu dimasukkan 225 Lactose Broth (LB) steril dan dihomogenkan dengan cara dikocok-kocok dan diremas-remas dengan perlahan hingga sampel homogen. Sampel yang telah dihomogenkan kemudian diinkubasi selama 24 ± 2 jam. Sebanyak 1 ml sampel yang telah diinkubasi di dalam media LB diambil dan diinokulasi kedalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB). TTB diinkubasi pada suhu 37 ± 2 °C dalam inkubator selama 24 ± 2 jam. Agar Selektif Sampel yang telah diinkubasi pada masing-masing media selektif diambil satu ose dan digoreskan secara kuadran pada media Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar, Hektoen Eteric Agar (HEA), SS Agar, BRG Agar dan Bismuth Sulfite Agar (BSA). Kelima media selektif tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 35 ± 2 °C selama 24 ± 2 jam. Setelah inkubasi dilihat apakah ada koloni tipikal yang tumbuh pada masing-masing agar. Apabila terdapat koloni tipikal yang tumbuh, maka analisa dilanjutkan dengan uji biokimia awal dengan menggunakan Triple sugar Iron (TSI) Agar miring dan Lysine Iron Agar (LIA) miring.
59
Uji Biokimia Awal Koloni tipikal yang tumbuh pada ketiga media spesifik XLD Agar, HE Agar, SS Agar, BRG Agar dan BS Agar masing-masing diinokulasikan menggunakan jarum ose steril pada TSI agar dan LIA agar. Inokulasi pada media TSI Agar miring dilakukan terlebih dahulu dengan jarum ose digores dan ditusuk dalam inkubator 35 ± 2 °C. Inokulasi pada LIA agar miring dilakukan setelah melihat apakah ada tanda pada TSI Agar menghasilkan warna hitam. Inokulasi pada LIA dilakukan dengan cara jarum ose ditusuk dan digores. Reaksi positif indikasi adanya Salmonella dapat dilihat pada perubahan warna media. TSI Agar dan LIA menunjukkan perubahan warna menjadi hitam searah dengan tusukan. Reaksi spesifik Salmonella pada TSI agar miring adalah: bagian permukaan miring (slant) berwarna merah/alkaline (reaksi basa), memproduksi H2S (kehitaman pada agar kadang hingga menutupi warna agar dasar, dengan atau tanpa memproduksi gas). Reaksi spesifik Salmonella pada LIA agar miring adalah: bagian permukaan miring (slant) berwarna ungu/alkaline (reaksi basa), bagian agar dasar/butt atau agar tusuk berwarna ungu/alkaline (reaksi, memproduksi H2S (kehitaman pada agar kadang hingga menutupi warna agar dasar, dengan atau tanpa memproduksi gas). Uji Biokimia Lanjut Koloni yang memperlihatkan reaksi spesifik pada kedua agar atau salah satu agar miring tersebut diambil untuk analisa menggunakan media Simmon’s Citrate, urease, Methile Red Voges Proskoner (MRVP), gula-gula (adonitol, arabinose, cellobiose, dulcitol, glycerol, inositol, lactose, maltose, mannitol, raffinose, rhamnose, salicin, sorbitol, sucrose, trehalose, xylose) dan uji serologi. Uji Serologi Uji serologi dilakukan jika reaksi biokimia menunjukkan ada Salmonella sp. Satu ose dari biakan NA diambil dan dioleskan pada gelas sediaan. Kemudian antisera grup O diteteskan di samping biakan. Dengan menggunakan ose, tetesan antisera O dan biakan dicampur lalu akan dapat diketahui Salmonella tersebut masuk pada grup tertentu. Setelah itu, antisera grup H dan biakan dari sumber
60
yang sama dicampur yang akan menghasilkan Salmonella pada grup tertentu pula. Gabungan ini akan
menunjukkan adanya Salmonella dengan serotipe yang
berbeda (Kauffman, 1972).
Rancangan dan Analisis Data Pengambilan sampel yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan metode Simple Random Sampling (Scheaffer et al., 1990) mulai dari data pemilihan peternakan, pemilihan sampel ayam, telur, dan feses. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.
61
