MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian menggunakan data sekunder di Laboratorium Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang, Bandung, Jawa Barat. Data penelitian yang digunakan adalah data sekunder produksi semen November-Desember 2010. Materi Sapi-sapi pejantan yang digunakan sudah diseleksi dan mempunyai kualitas unggul. Jumlah sapi yang digunakan adalah 24 sapi jantan yang terdiri atas 8 ekor sapi Simmental, 8 ekor sapi Limousin dan 8 ekor sapi FH berumur sekitar 4 tahun, dengan kisaran bobot badan sapi FH 800±43,4 kg; Limousin 850±40,38 kg dan Simmental 900±50,85 kg. Materi yang diperoleh pada penelitian ini berupa data semen segar yaitu warna, volume, konsistensi, konsentrasi, pH, gerakan massa, motilitas, before freezing, post thawing motility dan longivitas. Prosedur Data yang ditabulasikan adalah : 1.
Semen segar (warna, volume, konsistensi, pH, gerakan massa, motilitas spermatozoa)
2.
Before freezing
3.
Post thawing motility (PTM)
4.
Recovery rate
5.
Longivitas (water incubator test)
1. Pemeriksaan Molitilitas Spermatozoa Semen Segar a. Secara Makroskopis Melihat dan mencatat: -
Volume
-
Warna dengan kriteria penilaian (susu, krem, kuning)
-
Konsistensi dengan kriteria penilaian (encer, sedang, kental)
-
Pemeriksaan pH dengan cara : a. Nyalakan pH meter b. Cuci elektroda dengan aquabidest lalu keringkan
c. Kalibrasi pH meter dengan merendam elektroda pada larutan pH 4, pH 7, dan pH 9 lalu tekan tanda “ cal “. Sebelum dan sesudahnya elektroda harus dalam keadaan bersih d. Standar deviasi kalibrasi sekitar 0,02 e. kalibrasi berhenti sampai keluar tanda A f. pH meter siap digunakan g. Celupkan elektroda pada semen yang akan diuji lalu tekan “ read” tunggu sampai keluar tanda A h. Baca nilai pH I. Matikan pH meter J. Masukkan elektroda yang sudah bersih pada karet pelindung yang telah berisa KCL 3 mol/1. b. Secara Mikroskopis (Gerakan massa) - Menggunakan mikroskop elektrik dengan pembesaran 4x10 - Memasang kabel fiting ke stop kontak - Menyiapkan air hangat dalam beaker glass, stick glass, object glass, cover glass dan tisu - Meletakan object glass, cover glass diatas warmer slide dan meneteskan semen yang diperiksa dengan menggunakan stick glass - Melihat dibawah mikroskop sambil mengatur jarak lensa dengan objek yang dilihat sehingga terlihat gerakan massa semen, dengan penilaian sebagai berikut: 0
: Tidak ada gerakan spermatozoa maupun gerakan massa spermatozoa
+
: Gerakan massa spermatozoa lemah berupa gelombang-gelombang tipis dan jarang
++ : Gerakan massa spermatozoa berupa gelombang-gelombang tebal, gelap dan cepat +++ : Gerakan massa spermatozoa berupa gelombang-gelombang tebal, gelap dan sangat cepat Semen segar yang layak diproses adalah semen dengan nilai gerakan massa minimal (++) dan Motilitas spermatozoa minimal 70 %.
Pemeriksaan Konsentrasi - Menggunakan spektrofotometer - Semen diambil dengan pipet scoret sebanyak 0,05 ml dimasukkan ke dalam larutan NaCl 2% 9,95 ml lalu dicampur - campuran semen dimasukkan ke dalam tabung spektrofotometer yang terlebih dahulu sudah distandarkan dengan NaCl 2 %, lalu jarum petunjuk menunjukkan angka yang kemudian harus dikonversikan pada tabel konsentrasi spermatozoa. Pembuatan bahan pengencer a. Bahan dan peralatan -
Susu skim
- Aquabidest
- Antibiotika
-
Kuning telur
- Glukosa
- gliserol
-
measuring cylinder
- pompa penghisap
- pipet
-
beaker glass
- tisu
- pinset
-
filter paper
- timbangan analitik - elektrothermal
-
stick glass
-
glass
- thermometer
b. prosedur -
membuat buffer untuk 1000 cc : susu skim 100 g dan aquabidest 960 cc buffer dipanaskan sampai suhu 90 oC lalu didiamkan selama 12 menit dan disaring, setelah dingin disimpan di dalam refrigerator
-
setelah dingin ditambahkan antibiotika dengan perbandingan 100:1 antibiotika yang digunakan adalah penicillin 3 juta IU dan Streptomycin 3 gram di campur lalu ditambahkan aquabidest sampai volumenya 30 cc
A. membuat bahan pengencer part A (untuk 1000 cc): buffer antibiotika 950 cc ditambahkan kuning telur 50 cc B. membuat bahan pengencer part B (untuk 1000 cc) buffer antibiotika : 770 cc ditambahkan gliserol : 160 cc, kuning telur : 50 cc dan glukosa : 20 gr masing-masing dihomogenkan.
Proses Pengenceran A. Bahan dan Peralatan -
Incubator
- Cool top
-
Timer
- Bahan pengencer A dan B
-
Measuring cylinder
- Label
- Beaker glass
- Air Hangat
Cara kerja -
Semen yang akan diproses dicampur dengan part A yang telah disimpan di dalam incubator (dalam water jacket) suhu 37 oC dan diberi label (nomor bull), kemudian disimpan dalam cool top yang bersuhu 4 oC selama 35 menit, setelah 35 menit water jacket dilepaskan.
-
50 menit kemudian dilakukan dengan part A yang telah disiapkan sebelumnya di dalam cool top
-
Pencampuran part B dilakukan sebanyak 4 kali setiap 15 menit di dalam cool top (proses glycerolisasi)
-
Pencampuran ini akan diikuti dengan proses pengisian/filling dan sealing ke dalam straw yang telah diberi label, pelaksanaan ini dilakukan 2,5 jam setelah pencampuran dengan part B terakhir
Proses Pembekuan Cara kerja : Straw yang sudah berisi semen disusun di rak pembekuan dan hitung jumlahnya, kemudian dibekukan diatas permukaan uap N2 cair di dalam storage container dengan temperatur -110 °C sampai dengan -120 °C selama 5 menit. Setelah 5 menit straw dimasukkan ke dalam goblet dengan kapasitas disesuaikan dengan jumlah straw, lalu disimpan di dalam container yang terendam N2 cair dengan temperatur -196 °C. Penyimpanan Semen Beku Cara Kerja : a. Semen beku disimpan pada storage container yang di dalamnya terdapat beberapa canister, dimana setiap canister terdapat 2 - 3 goblet dan setiap goblet dapat berisi 550 - 750 dosis. Setiap storage container dapat
menyimpan sekitar 150,000 - 350,000 dosis mini straw dalam rendaman 210 - 800 liter nitrogen cair b. Untuk menjaga volume N2 yang hilang karena penguapan, maka setiap hari ditambahkan 30 liter N2 untuk setiap storage container Pengujian Before freezing Setelah equilibrasi dalam cool top, sebelum dibekukan sample straw dievaluasi motilitasnya. Straw dihangatkan kemudian digunting dikedua sumbatnya dan semen dikeluarkan ke dalam tabung tes 1 tetes semen di simpan kedalam object glass kemudian ditutup dengan cover glass dan dilihat dibawah mikroskop pembesaran 400 X Pengujian Post Thawing Motility a. Meyiapkan tabung tes dan simpan di dalam dry/water incubator dengan temperatur 37 °C. b. Ambil 2 dosis straw semen beku, thawing pada air hangat dengan temperatur 37 °C selama 15 detik, keringkan dengan kertas tisu kemudian potong kedua ujung straw dengan gunting straw. c. Meneteskan semen yang telah cair ke dalam tabung yang telah disiapkan, ditutup dengan penutup karet dan telah diberi nomor. d. Dengan menggunakan stick glass homogenkan kemudian teteskan semen ke atas object glass yang telah disiapkan di atas warmer stage lalu ditutup dengan cover glass. e. Dilihat dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 40 f. Persentase spermatozoa yang motil progresif dinilai dari lima lapang pandang penilaian antara 0 -100 %. g. Melihat gerakan individu spermatozoa, dengan nilai sebagai berikut : 0 : Tidak ada gerakan individu spermatozoa 1 : Gerakan individu spermatozoa lambat 2 : Gerakan indivdu spermatozoa sedang 3 : Gerakan individu spermatozoa cepat 4 : Gerakan individu spermatozoa sangat cepat
Longivitas (Water Incubator Test) a. Setelah 4 jam ambil tabung dari dalam water/dry incubator dan buka sumbatnya b. Dengan menggunakan stick glass homogenkan kemudian teteskan semen ke atas object glass yang telah disiapkan diatas warmer stage lalu tutup dengan cover glass c. Melihat gerakan individu spermatozoa dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 10 dan menentukan motilitasnya dan gerakan individu spermatozoa. Standar minimal 5-10 % gerakan individu 1.
Recovery Rate (RR)
Motilitas spermatozoa setelah thawing RR =
x 100% Motilitas spermatozoa pada semen segar (Garner dan Hafez, 2000) Rancangan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan
Acak Lengkap (RAL) dengan tiga perlakuan (bangsa sapi yang berbeda) dan empat kali ulangan pada masing-masing bangsa sapi. Seluruh data yang diproleh diolah menggunakan software Statistix 8, data disajikan dalam bentuk rataan dan simpangan baku. Pengaruh perlakuan yang nyata pada penelitian ini dilanjutkan dengan uji lanjut yaitu uji Tukey (Steel dan Torrie, 1991). Model matematisnya adalah: Yij = µ+Pi+ℇij Keterangan: Yij
= Nilai motilitas spermatozoa dari sapi ke-i yang mendapat nilai perlakuan ke-j
µ
= Nilai rata-rata umum
Pi
= Pengaruh perlakuan ke-i
ℇij
= Pengaruh galat percobaan pada sapi ke-i yang mendapat perlakuan ke-j
