9
II. MATERI DAN METODE PENELITIAN
1.Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1.1. Materi Penelitian 1.1.1. Alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, autoklaf Hirayama, pinset, shaker, gelas ukur, hot plate, jarum ose,object glass, cover glass, labu erlenmeyer, pembakar bunsen, skalpel, tabung eppendorf, cawan petri, plate well 96 steril, plate well 24 steril, tissue culture flask, blue tip, yellow tip, white tip, pH universal, kertas label, alumunium foil, plastik wrapping, tissue, pipet tetes, kertas saring Whatman,Laminar Air Flow (LAF), pembakar spirtus, haemocytometer dan hand counter, inkubator CO2, sentrifuge dan ELISA reader (BioRad-Mikroplate Reader Benchmark). 1.1.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kultur murni Ganoderma sp. isolat Banyumas 1, medium Potato Dextrose Aga (PDA), medium Potato Dextrose Yeast Broth (PDYB), streptomisin, aquades, spirtus, medium kultur Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2. 5 diphenyl tetrazoliumbromide (reagen MTT), alkohol 70%, pelarut (n-heksan), Cell MCF-7, doksorubisin, DMSO, reagen stopper, FBS 20%, Phosphat Buffer Saline (PBS), trypsin 0,25%, dan SDS 10% dalam HCl 0,01 N. 1.2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini telah dilakukan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto dan Laboratorium
10
Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Waktu penelitian adalah bulan Juni- September 2013. 2. Metode Penelitian 2.1. Metode Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental. Perlakuan yang dicobakan adalah lama inkubasi miselium 14 dan 28 hari pada medium PDYB. Miselium disaring, dikeringkan kemudian di ekstrak menggunakan pelarut n-heksan. Ekstrak diuji sitotoksik terhadap sel kanker payudara (MCF-7) dengan menggunakan merode MTT dengan pemberian konsentrasi yang berbeda (31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000; 2000 µg/mL) masing-masing diulang sebanyak 3 kali (triplo). Hasil sel uji dianalisis dengan menggunakan analisis regresi linear. Variabel yang diamati adalah variabel bebas berupa lama inkubasi dan kosentrasi ekstrak, sedangkan variabel tergantung berupa jumlah sel hidup. Parameter yang diamati yaitu persentase viabilitas sel MCF-7 dan nilai IC50, sedangkan parameter pendukung yang diamati adalah bobot basah miselium, bobot kering miselium, bobot ekstrak. 2.2. Cara Kerja 2.2.1. Pembuatan medium Potato Dextrose Agar (PDA) (Fardiaz, 1993). Kentang dipotong kecil-kecil sebanyak 200 g dan direbus di dalam 500 ml akuades dalam beaker glass hingga kentang lunak. Ekstrak kentang disaring dan dimasukkan ke dalam beaker glass ukuran 1000 ml, ditambahkan 15 g agar selanjutnya ditambahkan larutan agar dan 20 g dekstrosa kemudian dihomogenkan menggunakan hot plate. Medium tersebut dimasukkan ke dalam beberapa tabung
11
erlenmeyer 250 ml dengan volume medium 100 ml dan disterilisasi menggunakan autoklaf. 2.2.2. Karakterisasi makromorfologi dan mikromorfologi Ganoderma sp isolat Banyumas 1. Biakan Ganoderma sp isolat Banyumas 1 pada cawan petri dilihat warna koloni dan warna sebalik koloni. Miselium sebanyak 1 ose diletakkan pada object glass, kemudian tutup dengan cover glass, diamati bentuk hifanya dengan menggunakan mikroskop perbesaran 10x40. 2.2.3. Penyediaan inokulum Ganoderma sp isolat Banyumas 1 Miselium Ganoderma sp isolat Banyumas 1 diambil menggunakan ose sebanyak satu ose yang kemudian ditanam pada cawan petri yang berisi medium PDA. Diinkubasi selama 14 hari pada suhu ruang. 2.2.4. Pembuatan medium Potato Dextrose Yeast Broth (PDYB) (Stamets, 2000) Sebanyak 200 g kentang yang diambil ekstraknya ditambahkan 20 g dextrose dan 20 g yeast. Ekstrak dipanaskan hingga homogen, kemudian dituang ke dalam labu erlenmeyer berukuran 250 ml dengan volume 100 ml disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 0C dengan tekanan 2 atm. 2.2.5. Perbanyakan miselium pada medium PDYB (Stamets, 2000). Potongan koloni isolat Ganoderma sp. isolat Banyumas 1 diinokulasikan ke dalam medium PDYB, sebanyak 4 potong dengan diameter
5 mm. Kemudian
medium yang telah diinokulasi tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 14 dan 28 hari dan homogenkan menggunakan shakker dengan kecepatan 80 rpm. Setelah itu miselium yang diperoleh siap dipanen untuk diambil ekstraknya
.
12
2.2.6. Pembuatan ekstrak miselium Ganoderma sp. Isolat Banyumas 1 (Chasanah et al., 2010) Kultur miselium Ganoderma sp. isolat Banyumas 1 yang sudah berumur 14 dan 28 hari dipanen, kemudian miselium tersebut disaring menggunakan kertas saring Whatman no.41, dan untuk mempercepat penyaringan digunakan pompa vakum. Miselium yang telah tersaring kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 60 °C sampai diperoleh bobot yang konstan, kemudian ditimbang. Miselium tersebut diekstraksi menggunakan metode maserasi. Caranya adalah ekstrak kering dituangkan ke dalam labu erlenmeyer ukuran 250 ml, kemudian ditambahkan pelarut n-heksan dengan perbandingan 1:9 setelah itu diinkubasi selama 24 jam, dilakukan sebanyak 2 kali ulangan. 2.2.7. Pembuatan seri konsentrasi ekstrak miselium Ganoderma sp isolat Banyumas 1 (CCRC, 2009) Ekstrak miselium Ganoderma sp. isolat Banyumas 1 yang kental ditimbang sebanyak 10 mg, lalu dilarutkan dalam larutan DMSO sebanyak 100 µl kemudian dihomogenkan. Kemudian disaring dengan filter 0,2 µm, dimasukkan dalam conical steril, ditutup dengan parafilm, dan disimpan dalam lemari es,. kemudian dibuat seri kadar ekstrak (31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000; 2000 µg/ml) dari larutan stok dalam medium DMEM 1640. Pembuatan seri kosentrasi larutan uji dilakukan di dalam Laminar Air Flaw. 2.2.8. Uji sitotoksik dengan menggunakan metode MTT (Dai, 2003) Dibuat kontrol sel pada medium kultur yang mengandung 1x 104 sel/100 µl. Sebanyak 100 µl suspensi yang berisi sel kanker MCF-7 dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran mikroplate 96 well dengan konsentrasi ekstrak (31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000; 2000 µg/ml) dengan masing- masing 3 ulangan dengan kontrol sel dan kontrol medium. Mikroplate diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370 C, 5%
13
CO2. Medium kultur dibuang dan dicuci dengan menggunakan PBS. Ditambahkan 110 µl larutan MTT ke dalam setiap well plate dan mikroplate diinkubasikan pada suhu 370 C, 5% CO2 selama 4 jam. Setelah diinkubasi selama 4 jam ditambahkan 100 µ reagen stopper SDS 10% ke dalam setiap well plate dan diinkubasi selama 24 jam. Kemudian absorbansi dibaca dengan menggunakan ELISA reader pada = 595 nm. Analisis hasil absorbansi digunakan untuk menghitung viabilitas sel. 2.2.9. Pengamatan apoptosis dengan pengecatan DNA Sel MCF-7 ditanam pada Cover slip yang dituangkan dalam plate 24 sampai 50% konfluen. Medium dibuang dan sel diberi perlakuan ekstrak pada nilai IC 50 dan kontrol sel, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2. Pada akhir inkubasi, media kultur diambil, dicuci dengan PBS. Kemudian cover slip diangkat dari sumuran dan diletakkan di atas object gllas lalu ditetesi dengan akridin oranye/etidium bromida, sel segara diamati. Pengamatan morfologi sel dilakukan dengan mikroskop fluoresens (Zeiss MC 80).Sel hidup berflouresensi hijau dan sel yang mati berfluoresensi oranye. 3.
Metode Analisis Data yang diperoleh berupa hasil absorbansi. Data ini digunakan untuk
menghitung persentase penghambatan pertumbuhan sel MCF-7. Perhitungan dilakukan dengan rumus viabilitas sel ( Basmal dkk. 2009) viabilitas sel (%) : Keterangan :
(A−D)− (B−C)
(A−D)
X100 %
A = Absorbansi kontrol sel B= Absorbansi sampel C= Absorbansi kontrol sampel D= Absorbansi kontrol media Kontrol sel = 100 mL sel + 100 mL media Kontrol media = 100 mL media Kontrol sampel = 100 mL sampel + 100 mL media Perlakuan sampel = 100 mL sampel + 100 mL sel
14
Hasil yang diperoleh kemudian dilanjutkan ke analisis statistik dengan analisis regresi. Nilai regresi (50 % sel hidup) dimasukkan ke dalam rumus sehingga diperoleh harga IC50.
