MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler, Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini telah dilaksanakan pada September 2011 sampai dengan Februari 2012. Materi Ternak Sampel darah sapi lokal Indonesia yang digunakan sebanyak 283 sampel yang terdiri dari sampel sapi bali, sapi madura, sapi aceh, sapi pesisir, dan sapi katingan. Jumlah sampel dari masing-masing sapi lokal Indonesia yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Jumlah Sampel Ternak Sapi Indonesia Ternak Sapi
n
Tahun Koleksi
Asal
Sapi Pesisir
50
2006
Kab. Pesisir Selatan
Sapi Aceh
15
2010
Kab. Aceh Besar
Sapi Bali
100
2010
Balai Pembibitan Ternak Unggul Sapi Bali
Sapi Katingan
50
2010
Daerah Aliran Sungai Katingan
Sapi Madura
68
2011
Pulau Kangean
Total
283
Keterangan: n = jumlah individu
Alat dan Bahan Pengambilan sampel darah dilakukan menggunakan bahan dan alat antara lain alkohol, es, dan kapas, jarum vacutainer, tabung vacum 10 ml dan termos es. Bahan dan alat yang digunakan dalam proses amplifikasi DNA adalah sampel DNA yang telah diekstraksi dari darah sebelumnya, primer (forward dan reverse), taq polymerase, buffer, MgCl2, dan dNTP, Pipet mikro, tabung 0,5 ml dan 1,5 ml, serta mesin Applied Biosystem PCR thermalcycler.
Bahan dan alat yang digunakan pada tahap elektroforesis dan genotyping antara lain produk PCR, gel agarose 1,5%, loading dye, buffer, dan enzim restriksi (MspI), elektroforesis tray vertikal, inkubator, serta UV-Transilluminator. Prosedur Pengambilan Sampel Darah Sampel darah diambil dari sapi bali, sapi madura, sapi aceh, sapi katingan dan sapi pesisir melalui vena jugularis dan ditambahkan alkohol absolut selanjutnya dibawa ke Laboratorium Genetika Molekuler Ternak. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan dari sampel darah dengan menggunakan Genomic DNA mini kit Geneaid (Lampiran 1) yang dimodifikasi untuk penggunaan sampel darah yang disimpan dalam alkohol. Amplifikasi Gen Calpastatin Sekuen primer yang digunakan berdasarkan Palmer et al. (1998), yaitu primer forward 5’ TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG 3’ yang terletak di ekson 1C dan primer reverse 5’ GGTGGAGCAGCAC TTCTGATCACC 3’ yang terletak di ekson 1D (Gambar 3), dengan panjang produk PCR 624 pb. 1
3’ tggggcccaa tgatgccatc gatgccttgt catccgactt cacctgcagt
tcccctacag
61
ctgatgcaaa gaaaactgag aaagaggtat ggtttttaat gcccttaggg
aagcttgtta
121
gaaactacct cccactttaa gacaacaact tttttttaaa cttcattttt
cacttcactg
181
cgtcttcatt gctgtgttcg ggctttctct agttggggca agcgaggcct
gttctctatt
241
tgcaattttt aggcttctgc agggggctcc tcttgttgct gggc|cggggc tctaggtgca
301
caggcttcat ttgttgtggc tcgagggctc taaaccacag gctcattggt
cttggcgcac
361
gggcatggtt accccaatgc atttgggatc tcccctggcc agggagcaaa
cctgtttccc
421
ctgcattgca aggcggcctc ttaaccgctg gccaccaggg aagccccaaa
atgccaaggc
481
tttttacttc tggttcttac cgtttggttc atatttttcc ttcatctgcc
agtcaaacct
541
tcttctgtat tttattttcc agaaatctac agaagaggct ttaaaagctc
agtcagctgg
601
ggtgatcaga agtgctgctc cacc 5’
Keterangan: : Primer forward : Primer reverse Ccgghhhhhh : Situs pemotongan
Gambar 3. Tempat Penempelan Primer dan Situs Pemotongan MspI. Nomor akses GenBank: AF117813.
12
Amplifikasi gen calpastatin dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan mesin Applied Biosystem PCR thermalcycler. Amplifikasi gen calpastatin ini menggunakan campuran yang terdiri dari sampel DNA yang telah diekstraksi dari darah, primer (forward dan reverse), taq polymerase, buffer, MgCl2, dan dNTPs. Proses amplifikasi terjadi dalam empat tahap di dalam mesin Applied Biosystem PCR thermalcycler. Kondisi PCR yang digunakan berdasarkan Palmer et al., (1998) yaitu denaturasi pada suhu 95 ºC selama satu menit, penempelan pada suhu 62 ºC selama satu menit, serta pemanjangan molekul DNA yang terjadi pada suhu 72 ºC selama dua menit sebanyak 35 siklus. Elektroforesis Produk PCR Elektroforesis produk PCR dilakukan menggunakan 5 µl produk PCR pada gel agarose 1,5% dengan tegangan sebesar 100 volt yang dilakukan selama 60 menit. Pembuatan gel yaitu dengan mencampurkan agarose 0,45 g, 0,5 TBE 30 ml, dan 2,5 µl EtBr. Produk PCR sebanyak 5 µl dicampur dengan loading sebanyak 1 µl. Gel agarose setelah dielektroforesis dilihat panjang pita DNA dengan menggunakan UVTransilluminator. Genotyping Produk PCR sebanyak 5 µl didistribusikan ke dalam Eppendorf 0,5 ml lalu ditambahkan 0,3 µl enzim restriksi MspI, dan 0,7 µl buffer tango. Sampel DNA setelah dipotong dengan enzim restriksi MspI kemudian dielektroforesis pada agarose 2% dengan tegangan 100 volt selama 60 menit. Selanjutnya dilakukan visualisasi di bawah mesin UV-Transilluminator. Pita DNA yang muncul pada tahap ini dibandingkan dengan marker untuk mengetahui panjang pita tersebut. Genotipe gen calpastatin ditentukan berdasarkan panjang pita DNA yang muncul (Gambar 4). Penentuan genotipe gen calpastatin berdasarkan beberapa penelitian yang telah dilakukan dapat dilihat pada Tabel 3.
13
Gambar 4. Penentuan Genotipe Gen Calpastatin (Palmer et al., 1998). M = marker; 1, 3, 5 = Pemotongan dengan enzim MspI; 2, 4, 6 = Pemotongan dengan enzim NcoI. Tabel 3. Penentuan Genotipe pada Gen CAST Menurut Beberapa Penelitian Ternak Domba Dorset
Metode RFLP-MspI
Genotyping Panjang produk PCR : 622pb MM : 336 dan 286 pb
Sumber Palmer et al. (1998)
MN : 622, 336, dan 286 pb NN : 622 pb Domba Lokal
RFLP-MspI
Indonesia
Panjang produk PCR : 622 pb MN : 622, 336, 286 pb
Sumantri et al. (2008)
NN : 622 pb Domba Karakul
RFLP-MspI
Panjang produk PCR : 622 pb MM : 336 dan 286 pb
Shahroudi et al. (2006)
MN : 622, 336, dan 286 pb NN : 622 pb
14
Rancangan dan Analisis Data Keragaman gen calpastatin setiap bangsa sapi lokal Indonesia dianalisis menggunakan pendekatan nilai frekuensi alel, frekuensi genotipe, dan nilai heterozigositas. Frekuensi alel gen calpastatin dihitung berdasarkan rumus (Nei dan Kumar, 2000) : Xi = Frekuensi genotipe dihitung berdasarkan rumus (Nei dan Kumar, 2000) : Xii = Keterangan : xii = frekuensi genotipe ke-ii xi = frekuensi alel ke-i nii = jumlah individu bergenotipe ii nij = jumlah individu bergenotipe ij N = jumlah individu sampel Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dihitung menggunakan rumus (Weir, 1996) :
Keterangan : = heterozigositas pengamatan (populasi) Ho nij = jumlah individu heterozigot N = jumlah individu yang diamati Nilai heterozigositas harapan (He) dihitung dengan menggunakan rumus (Weir, 1996) :
Keterangan : = nilai heterozigositas harapan He P1i = frekuensi alel ke-I pada lokus I n = jumlah alel pada lokus ke-I
15
