30
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Luas Ovarium Pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam terhadap organ reproduksi betina diawali dengan pengamatan patologi anatomi (PA) dari ovarium dan uterus. Pengamatan dilakukan untuk melihat konsistensi organ, ukuran, serta ada atau tidaknya lesio dari masing-masing organ tersebut. Kemudian pengamatan dilanjutkan dengan pengamatan histopatologi (HP) ovarium dan uterus secara umum. Pengamatan ini tidak menunjukkan adanya kelainan yang spesifik pada ovarium maupun uterus. Selanjutnya dilakukan pengamatan terhadap masingmasing organ berdasarkan paramater yang diperlukan. Berdasarkan hasil pengamatan, luas ovarium dan folikel tersier dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8 Rata-rata luas ovarium dan folikel tersier (mm2) mencit yang diberi jintan hitam Perlakuan Kontrol negatif HS Preventif HS Kuratif HS Madu
Ovarium
Folikel Tersier
1,70±0,18a 1,47±1,27a 1,40±0,38a 2,09±0,87a
0,022±0,016a 0,018±0,011a 0,017±0,008a 0,028±0,018a
Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05) antar kelompok perlakuan.
Berdasarkan tabel di atas dapat dilihat luas ovarium dan folikel tersier antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol tidak mengalami perbedaan yang nyata (p>0,05) secara statistik. Namun dapat dilihat dari hasil perhitungan mencit yang diberi kombinasi jintan hitam dengan madu mempunyai luas yang terbesar. Luas ovarium menunjukkan seberapa luas permukaan untuk menghitung jumlah folikel-folikel yang terdapat pada masing-masing kelompok. Sedangkan luas folikel tersier menunjukkan seberapa cepat folikel tersebut dapat mengalami kematangan dan siap melakukan ovulasi. Luas ovarium yang tidak terpengaruh secara nyata setelah diberikan perlakuan jintan hitam, hal ini menggambarkan bahwa jintan hitam tidak mempengaruhi secara nyata ukuran ovarium. Kolibianakis et al. (2005) dalam penelitiannya mengatakan perubahan perkembangan ovarium dapat dipengaruhi
31
oleh jumlah sirkulasi hormon seperti luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), dan growth hormone (GH). Selain itu, perkembangan ovarium ini juga dipengaruhi asupan nutrisi dan kondisi fisik individu. Luas yang tidak dipengaruhi secara nyata ini kemungkinan terjadi karena jumlah hormonhormon tersebut yang dipengaruhi oleh jintan hitam belum cukup untuk memberi pengaruh terhadap perkembangan ovarium. Luas ovarium masing-masing kelompok perlakuan akibat pemberian ekstrak minyak jintan hitam dapat dilihat pada Gambar 11.
A
B
C
D
Gambar 11 Permukaan ovarium dengan pewarnaan HE (A) kontrol negatif; (B) HS preventif; (C) HS kuratif; (D) HS madu.
Meskipun dengan uji statistik tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05), tetapi dari hasil perhitungan tampak adanya kecenderungan bahwa luas ovarium mencit kelompok kombinasi habbatussauda dengan madu lebih besar dibandingkan dengan luas ovarium kelompok habbatussauda preventif, kuratif, dan kontrol negatif. Demikian pula dengan luas folikel teriser. Madu dapat menyebabkan ovarium lebih luas karena selain mengandung fruktosa, glukosa,
32
dan sukrosa yang merupakan komponen utama, madu juga mengandung mineral dan protein (Mohammed dan Babiker 2009). Zat-zat tersebut turut serta membentuk sel secara keseluruhan yang disebut protoplasma (Guyton dan Hall 2008). Protein juga berperan dalam perkembangan serta regenerasi sel dan jaringan. 4.2 Jumlah Folikel-folikel Ovari Pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam terhadap jumlah folikelfolikel ovari dalam luas ovarium 0,6 mm2 dan korpus luteum dalam 1 mm2 dapat dilihat pada Tabel 9. Tabel 9 Rata-rata jumlah dan jenis folikel ovari dalam 0,6 mm2 dan korpus luteum dalam 1 mm2 luas ovarium mencit akibat pemberian jintan hitam Perlakuan Kontrol negatif HS Preventif HS Kuratif HS Madu
Folikel primer 0,38±0,32a 0,86±0,63a 0,69±0,39a 0,41±0,37a
Folikel sekunder 0,43±0,35a 0,95±0,74b 0,56±0,41ab 0,43±0,32a
Folikel tersier 0,26±0,22a 0,42±0,12a 0,31±0,26a 0,28±0,22a
Korpus luteum 3,41±3,28a 5,18±2,73a 4,48±2,43a 3,51±1,74a
Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05) antar kelompok perlakuan.
Berdasarkan data pengaruh pemberian jintan hitam terhadap jumlah folikel yang terdapat pada ovarium setelah dianalisis secara statistik menunjukkan adanya peningkatan jumlah folikel sekunder secara nyata (p<0,05), namun tidak terdapat perbedaan yang nyata (p>0,05) pada jumlah folikel primer, tersier, dan korpus luteum yang dihasilkan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Menurut Guyton dan Hall (2008) betina dilahirkan dengan memiliki folikel primordial, setelah pubertas seluruh ovarium beserta folikelnya akan mulai tumbuh. Tahap pertama pertumbuhan folikel berupa perkembangan ovum yang diikuti dengan pertumbuhan lapisan sel-sel granulosa di dalam beberapa folikel, folikel-folikel ini dikenal sebagai folikel primer. Karena folikel ini yang sudah ada sebelum hewan coba diberikan perlakuan, maka jumlah folikel primer tidak terpengaruh secara nyata. Sedangkan untuk folikel sekunder terlihat adanya perbedaan yang nyata (p<0,05) antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan habbatussauda preventif dan kuratif. Folikel-folikel ovarium kelompok
33
kontrol dan perlakuan akibat pemberian ekstrak minyak jintan hitam dapat dilihat pada Gambar 12.
d a
A
B
b
e
c C
D
Gambar 12 Folikel-folikel ovarium dengan pewarnaan HE (A) Kontrol; (B) HS preventif; (C) HS kuratif; (D) HS madu; (a) folikel primer; (b) folikel sekunder; (c) folikel tersier; (d) korpus luteum (e) folikel atresia.
Jintan hitam memiliki kandungan sterol yang merupakan salah satu zat bermanfaat terhadap organ reproduksi betina karena mampu meningkatkan sintesa dan bioaktivitas hormon-hormon dalam tubuh termasuk hormon reproduksi (Junaedi et al. 2011). Sterol terdiri dari sterol hewani (zoosterol) dan sterol nabati (fitosterol). Stigmasterol dan β-sitosterol merupakan senyawa kandungan fitosterol yang berasal dari jintan hitam. Menurut Montgomery et al. (1993), senyawa-senyawa tersebut memiliki kemiripan struktur dengan kolesterol yang merupakan prekursor pembentuk hormon reproduksi, salah satunya hormon estrogen. Hormon estrogen inilah yang berperan terhadap siklus reproduksi betina.
34
Adanya perbedaan rata-rata jumlah folikel yang dihasilkan dari tiap dosis pemberian ekstrak minyak jintan hitam membuktikan jumlah hormon estrogen yang teraktivasi oleh sterol yang jumlahnya berbeda-beda pula antar kelompok perlakuan. Folikel sekunder yang jumlahnya meningkat secara nyata pada kelompok perlakuan menggambarkan kandungan fitosterol dalam jintan hitam dapat meningkatkan kinerja ovarium pada fase awal perkembangan folikel. Menurut Kolibianakis et al. (2005) tahap awal perkembangan folikel dipengaruhi oleh estrogen. Jumlah rata-rata folikel yang lebih sedikit setelah dipengaruhi pemberian kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu kemungkinan menunjukkan adanya zat aktif madu yaitu saponin yang dapat mengikat sterol dari jintan hitam, sehingga sterol tidak mempengaruhi perkembangan folikel setelah mengalami reaksi saponifikasi (penyabunan) yang menyebabkan reaksi menjadi netral. Meskipun jumlah folikel tersier dan korpus luteum setelah diuji statistik tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05), namun dari hasil perhitungan tampak jumlah folikel tersier dan korpus luteum kelompok perlakuan lebih banyak dibandingkan dengan jumlah folikel tersier dan korpus luteum pada kelompok kontrol negatif. Hasil ini menggambarkan bahwa pemberian jintan hitam mampu membuat folikel yang siap untuk melakukan ovulasi dan sel telur yang telah diovulasikan lebih banyak apabila dibandingkan dengan kelompok kontrol pada umur hewan percobaan yang sama. Pada kelompok perlakuan dapat menggambarkan bahwa kadar hormon FSH dan LH dalam ovari cukup untuk melakukan perkembangan folikel. Folikel yang sedang berkembang ini akan memproduksi estrogen. Semakin besar folikel maka kadar estrogen yang diproduksi juga semakin tinggi (Ganong 2003). Pada level estrogen tertinggi, folikel de Graaf akan memberikan feed back positive terhadap hipotalamus dan hipofise sehingga LH pre-ovulatori dapat disekresikan dan terjadilah ovulasi. Setelah ovulasi terjadi, folikel pecah dan terjadi kolaps karena tekanan intrafolikel hilang. LH berinteraksi dengan sel-sel reseptor dari dinding folikel yang sobek sehingga proses luteinisasi (kekuningan) dan sekresi progesteron dimulai. Jintan hitam yang mengandung sterol mampu menstimulasi
35
pembentukan hormon estrogen sehingga sel-sel telur yang diovulasi lebih banyak begitu pula dengan korpus luteum yang terbentuk juga akan lebih banyak. Selain
itu
disekresikan
pula
hormon
luteotropik
(LTH)
untuk
mempertahankan CL lalu mensekresikan progesteron (Dellmann dan Brown 1988). Kemudian CL berinvolusi dan akhirnya kehilangan fungsi sekresi juga warna kekuningannya, lalu berubah menjadi korpus albikans jika tidak terjadi pembuahan pada oosit (Guyton dan Hall 2008). Menurut Dellman dan Brown (1988), karena hanya sedikit persentase dari oosit potensial yang dilepas pada proses ovulasi, sebagian besar folikel surut dalam perkembangannya. Proses surut (regresi) ini disebut atresia. Tanda-tanda penting untuk atresia pada sel-sel dinding folikel adalah inti sel menjadi piknotik. Selama mengalami atresia, membran basal lapis granulosa dapat melipat, menebal, dan mengalami hialinisasi. Menurut Guyton dan Hall (2008) perubahan ovarium yang terjadi selama siklus seksual bergantung seluruhnya pada hormon-hormon gonadotropik, FSH, dan LH yang disekresi oleh kelenjar hipofisis anterior. Estrogen memiliki fungsi primer untuk menimbulkan proliferasi sel dan pertumbuhan jaringan organ-organ kelamin dan jaringan lain yang berkaitan dengan reproduksi. Sedangkan progesteron memiliki fungsi utama dalam persiapan uterus untuk menerima kebuntingan dan persiapan kelenjar
mamae untuk laktasi. Progesteron
disekresikan oleh CL dalam jumlah yang cukup banyak selama separuh akhir dari setiap siklus ovarium. 4.3 Endometrium Regenerasi epitel permukaan uterus merupakan salah satu paramater yang diamati untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam pada penelitian kali ini. Regenerasi diamati berdasarkan adanya proliferasi epitel pada permukaan uterus. Persentase permukaan uterus yang mengalami re-epitelisasi dapat dilihat pada Tabel 10.
36
Tabel 10 Rata-rata epitel permukaan uterus mencit yang mengalami re-epitelisasi (%) akibat pemberian jintan hitam Perlakuan Kontrol negatif HS Preventif HS Kuratif HS Madu
Persentase re-epitelisasi permukaan uterus 30,51±18,38a 41,21±35,57ab 42,22±26,84ab 57,09±19,99b
Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05) antar kelompok perlakuan.
Adanya bahan iritan juga dapat menyebabkan terjadinya proliferasi epitel. Bahan iritan dapat meningkatkan terjadinya pengelupasan sel epitel permukaan. Selain itu, pada kondisi iritasi, epitel yang lebih tahan terhadap iritasi adalah epitel pipih, sehingga epitel silindris diganti menjadi epitel pipih (Lestari 2009). Gambaran histopatologi epitel permukaan uterus dapat dilihat pada Gambar 13.
A
B
C
D
Gambar 13 Gambaran epitel permukaan uterus dengan pewarnaan HE (A) kontrol; (B) HS preventif; (C) HS kuratif; (D) HS madu.
37
Berdasarkan data yang telah dianalisis secara statistik menunjukkan ratarata epitel permukaan uterus yang mengalami re-epitelisasi antara kelompok perlakuan memiliki perbedaan yang nyata (p<0,05) apabila dibandingkan dengan kelompok kontrol. Re-epitelisasi tertinggi dapat dilihat terjadi pada kelompok kombinasi habbatussauda dengan madu. Adanya kandungan antioksidan baik dalam jintan hitam maupun madu mampu mempengaruhi homeostasis uterus dengan meningkatkan re-epitelisasi. Regenerasi lapisan epitel merupakan serangkaian peristiwa yang terkoordinasi dan terstruktur. Peristiwa ini diperantarai oleh berbagai zat kimia yang disebut faktor pertumbuhan dan dapat bertindak dari jarak jauh seperti hormon (Spector dan Spector 1993). Menurut Nergiz dan Ötles (1993) minyak jintan hitam mengandung senyawa aktif dalam kadar tinggi diantaranya karoten, β-karoten, tokoferol, asam lemak, dan sterol yang dapat mempengaruhi aktivitas sel uterus. Senyawa tersebut diabsorbsi mulai di lambung, usus halus, dan usus besar. Namun, absorbsi utama terjadi di usus halus karena permukaannya yang luas dan lapisan dinding mukosanya lebih permeable. Setelah masuk ke dalam sirkulasi, senyawa tersebut didistribusikan ke dalam jaringan tubuh. Distribusi tergantung pada rata-rata aliran darah pada organ target dan massa dari organ target (Setiawati et al. 2003). Senyawa-senyawa tersebut mempengaruhi kompleks estrogen dan reseptor alfa (REα) untuk selanjutnya berdifusi ke dalam inti sel dan melekat pada DNA. Ikatan kompleks estrogen-reseptor dengan DNA menginduksi sintesis dan ekspresi mRNA untuk mensintesis protein sehingga meningkatkan aktivitas sel target yang digambarkan dengan terjadinya proliferasi sel (Ganong 2003). Menurut Maslachah et al. (2004) senyawa antioksidan yang mampu menangkal radikal bebas dan biasa untuk dikonsumsi adalah α-tokoferol dan βkaroten. Kedua senyawa tersebut terkandung dalam jintan hitam. Antioksidan adalah senyawa yang memiliki struktur molekul yang dapat memberikan elektronnya kepada molekul radikal bebas tanpa terganggu sama sekali dan dapat memutus reaksi berantai dari radikal bebas. Antioksidan banyak ditemukan dalam makanan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan (Yuliarti 2008).
38
Selain itu, senyawa antioksidan lain yang terkandung dalam jintan hitam yaitu timokuinon dan carvacrol. Carvacrol merupakan senyawa penenang saraf yang berfungsi membuat jaringan otot menjadi rileks. Menurut Sayyid (2008) jintan hitam dapat membantu menambah kekuatan tubuh dengan cara meningkatkan kemampuan dan konsentrasi protein yang dibutuhkan manusia. Selain antioksidan yang terkandung dalam jintan hitam, madu juga mengandung banyak senyawa yang berguna sebagai senyawa antioksidan, salah satunya adalah asam L-askorbat. Asam L-askorbat adalah antioksidan fase cair yang paling efektif dalam plasma darah manusia yang berfungsi sebagai antioksidan fisiologis penting untuk perlindungan terhadap penyakit dan proses degeneratif yang disebabkan oleh stress oksidatif (Kesic et al. 2009). Lapisan endometrium uterus merupakan lapisan yang dipengaruhi perubahan hormon reproduksi. Lapisan ini mengalami perubahan yang bervariasi sepanjang siklus birahi (estrus) karena adanya fluktuasi hormon estrogen dan progesteron yang secara luas berpengaruh pada perubahan endometrium (Dellman dan Brown 1988). Fase folikular ditandai dengan pertumbuhan dan perkembangan endometrium. Pada fase ini aktivitas mitotik sel-sel di dalam lamina propia dan dari sisa kelenjar uterus pada stratum basale ditingkatkan. Pertumbuhan endometrium selama fase folikular bersamaan dengan pertumbuhan folikel ovarium dan peningkatan sekresi estrogen (Eroschenko dan Victor 2003). Pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa) terhadap jumlah kelenjar uterus dalam 1,2 mm2 atau lima lapang pandang pengamatan dapat dilihat pada Tabel 11. Tabel 11 Rata-rata jumlah kelenjar uterus mencit akibat pemberian jintan hitam dalam 1,2 mm2 Perlakuan Kontrol negatif HS Preventif HS Kuratif HS Madu
Kelenjar uterus 9,40±5,15a 11,62±6,46a 12,75±4,18a 13,13±7,10a
Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05) antar kelompok perlakuan.
39
Berdasarkan hasil analisis data secara statistik menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang nyata (p>0,05) antara kelompok perlakuan apabila dibandingkan dengan kelompok kontrol, namun dapat dilihat bahwa jumlah kelenjar uterus terbanyak terdapat pada kelompok kombinasi antara habbatussauda dengan madu, disusul dengan kelompok kuratif dan preventif. Kelenjar yang terdapat dalam uterus adalah kelenjar eksokrin, yaitu kumpulan sel-sel atau kelenjar yang memiliki ujung kelenjar dengan kemampuan menghasilkan sekreta yang mengandung enzim. Kelenjar uterus menghasilkan beberapa produk diantaranya mukus, lipid, dan glikogen. Produk sekresi dari kelenjar uterus dan plasma darah merupakan campuran cairan yang mengisi lumen uterus (Hafez 2000). Pada fase folikular kelenjar uterus mengalami proliferasi, memanjang, dan mulai berhimpitan, sedangkan pada fase luteal kelenjar uterus mengalami hipertrofi, menjadi berkelok, dan lumennya mulai terisi produk sekresi yang kaya nutrien khususnya glikogen (Eroschenko dan Victor 2003). Sekreta dari kelenjar uterus pada mencit yang lebih banyak setelah diberi perlakuan memiliki dua fungsi penting yaitu menyediakan lingkungan yang baik untuk kapasitasi sperma dan memberikan nutrisi untuk preimplantasi blastokist (Dellmann dan Brown 1988). 4.4 Jumlah Sel Goblet Selain menghitung jumlah kelenjar uterus dalam 1,2 mm2, jumlah sel Goblet yang terdapat pada epitel permukaan uterus juga dihitung dengan menggunakan faktor konversi sebesar 1 mm. Sel Goblet yang diamati pada penelitian kali ini dilakukan dengan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS). Menurut Hammersen dan Sobotta (1985) pewarnaan PAS secara selektif mewarnai glikogen, glikoprotein serta beberapa glukosa minoglikan dalam warna keunguan (terlihat jelas di dalam sel acinus yang mensekresi mukus). Pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam terhadap jumlah sel Goblet dapat dilihat pada Tabel 12.
40
Tabel 12 Rata-rata jumlah sel Goblet/mm Perlakuan Kontrol negatif HS Preventif HS Kuratif HS Madu
Sel Goblet 0,00±0,00a 0,00±0,00a 0,00±0,00a 0,02±0,15a
Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05) antar kelompok perlakuan.
Sel Goblet pada hasil penelitian kali ini hanya terlihat pada kelompok perlakuan kombinasi habbatussauda dengan madu. Sel goblet (sel cangkir) yang dapat diamati pada Gambar 14 adalah sel yang mengeluarkan mukus (lendir) dan terletak pada dinding kelenjar beserta salurannya yang dilapisi sel silinder. Sel ini bekerja sebagai kelenjar yang mengeluarkan lendir dan terdapat dalam jumlah besar menutupi permukaan (Dellman dan Brown 1988). Meningkatnya jumlah sel Goblet pada kelompok perlakuan kombinasi habbatussauda dengan madu menunjukkan sedikit peningkatan produksi mukus. Mukus pada uterus berperan sebagai barrier penghalang atau perlindungan dari masuknya agen penyakit.
Gambar 14 Mukosa uterus dengan pewarnaan PAS, tanda panah menunjukkan sel Goblet.
Radikal bebas adalah atom atau senyawa yang kehilangan pasangan elektronnya. Proses metabolisme sehari-hari yang merupakan proses biokimiawi akan menyebabkan terbentuknya radikal bebas yang bersifat sementara karena dengan cepat akan diubah menjadi senyawa yang tidak berbahaya bagi tubuh.
41
Namun, bila terjadi reaksi yang berlebihan di dalam tubuh maka akan terjadi perampasan elektron oksigen sehingga menjadi tidak berpasangan dan atom oksigen akan menjadi radikal bebas yang berusaha mengambil elektron dari senyawa lain sehingga terjadilah reaksi berantai. Radikal bebas dapat masuk ke dalam tubuh melalui pernafasan, kondisi lingkungan yang tidak sehat seperti banyaknya polusi udara akibat asap kendaraan bermotor maupun lingkungan yang penuh dengan asap rokok. Selain itu, makanan berlemak juga akan memacu terbentuknya radikal bebas (Yuliarti 2008). Salah satu cara untuk menangkal radikal bebas ini dapat dilakukan dengan memberikan senyawa antioksidan. Adanya perbedaan yang nyata maupun tidak nyata pada paramater yang diamati dari masing-masing kelompok perlakuan pada penelitian kali ini diduga terjadi akibat penggunaan dosis yang berbeda. Besarnya efek tergantung pada konsentrasi zat dan dengan demikian juga tergantung pada dosis (Ariens et al. 1985). Menurut Duryatmo (2003) beberapa tanaman mempunyai ambang batas dosis yang memberikan khasiat. Maksudnya, dengan mengonsumsi dosis tertentu, memang tanaman obat tersebut mampu mengatasi keluhan. Namun, bukan berarti jika dosis ditambah, secara otomatis juga berdampak positif. Beberapa penelitian justru menunjukkan khasiat sebaliknya. Perlu diingat, batas antara obat dan racun sangat tipis. Tanaman obat dapat menjadi racun yang justru menurunkan kesehatan tubuh orang yang mengonsumsinya, sehingga ketepatan dosis sangat penting. Pada penelitiaan ini menunjukkan tidak adanya perbedaan yang nyata dari penggunaan dosis 0,1 dan 0,2 ml/ekor ekstrak minyak jintan hitam terhadap luas ovarium, luas folikel tersier, jumlah kelenjar uterus, dan jumlah sel Goblet. Namun penggunaan dosis 0,1 ml/ekor lebih efektif untuk meningkatkan jumlah folikel-folikel ovarium dan korpus luteum. Jika dibandingkan dengan dosis-dosis di atas, dosis 0,3 ml/ekor kombinasi jintan hitam dengan madu memberikan efek yang lebih baik terhadap luas ovarium, luas folikel tersier, dan regenerasi epitel permukaan uterus yang diamati dalam penelitian ini.
