UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra antropologie a genetiky člověka
DISERTAČNÍ PRÁCE Méně běžné metabolity hormonálních steroidů ve fyziologii a patofyziologii člověka
Vypracovala: Mgr. Ludmila Máčová roz. Zamrazilová Vedoucí práce: Prof. RNDr. Richard Hampl, DrSc.
Praha 2010
1
Prohlašuji, ţe jsem disertační práci vypracovala samostatně s vyznačením všech pouţitých pramenů a spoluautorství. Souhlasím se zveřejněním disertační práce podle zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. Byla jsem seznámena s tím, ţe se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, ve znění pozdějších předpisů. Zároveň prohlašuji, ţe jsem nepředloţila práci k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze 28.6.2010
Ludmila Máčová 2
Tato práce byla vypracována na Oddělení steroidních hormonů Endokrinologického ústavu v Praze v období let 2006–2010. Ráda bych vyuţila této příleţitosti a vyjádřila svou upřímnou vděčnost všem, kdo se na vzniku práce jakýmkoliv způsobem podíleli. Můj velký dík patří zejména vedoucímu práce, Prof. Richardu Hamplovi, za jeho vedení během celého studia, trpělivost a především za cenné rady a připomínky. Doktorce Marii Bičíkové děkuji za snahu o vytvoření přátelského a tvůrčího prostředí v našem pracovním týmu a Ing. Martinu Hillovi za provedení GC-MS analýz uvedených v této práci. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat všem současným i bývalým kolegům z Oddělení steroidních hormonů. Bylo velice milé a inspirující pracovat v tomto řešitelském týmu. Své rodině a blízkým přátelům děkuji za jejich podporu během celého studia. Práce vznikla v rámci grantových projektů IGA MZ ČR č. 7815-3, 7815-5, 9146-3 a 9831-4.
3
Seznam použitých zkratek
7α-OH-DHEA
7α-hydroxy-dedydroepiandrosteron
7β-OH-DHEA
7β-hydroxy-dedydroepiandrosteron
7-oxo-DHEA
7-oxo-dehydroepiandrosteron
16α-OH-DHEA
16α-hydroxy-dedydroepiandrosteron
17-OH-P
17-hydroxy-progesteron
AD
androstendion
Ag
antigen
Ag*
značený antigen
bp
pár bazí
BSA
hovězí sérový albumin, bovine serum albumin
CAH
vrozená adrenální hyperplázie, congenital adrenal hyperplasia
CBG
transkortin, corticosteroid-binding globulin
cDNA
komplementární deoxyribonukleová kyselina
CMO
karboxymetyloxim
CNS
centrální nervová soustava
CRH
kortikoliberin, cortocotrophin-releasing hormone
CV
variační koeficient
CYP
cytochrom P450
DHEA
dehydroepiandrosteron
DHEAS
dehydroepiandrosteron sulfát
4
DHT
5α-dihydrotestosteron
DNA
deoxyribonukleová kyselina
E2
17β-estradiol
Epi 5-diol
5-androsten-3β,17α-diol
EpiT
epitestosteron, 17α-hydroxy epimer testosteronu
ER
estrogenový receptor
FSH
folitropin, folikuly stimulující hormon
FTe
volný testosteron, free testosterone
GABA
γ-aminomáselná kyselina
GC
glukokortikoid
GC-MS
plynová chromatografie spojená s hmotnostní detekcí
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie, high-performance liquid chromatography
HSA
lidský sérový albumin, human serum albumin
HSD
hydroxysteroidní dehydrogenáza
IL
interleukin
IGF-1
inzulínu podobný růstový faktor typu 1
LH
lutropin, luteinizační hormon
mRNA
informační ribonukleová kyselina, messenger ribonuleic acid
NAD+
nikotinamid adenin dinukleotid (oxidovaná forma)
NADP+
nikotinamid adenin dinukleotid fosfát (oxidovaná forma)
NADPH
nikotinamid adenin dinukleotid fosfát (redukovaná forma)
5
NMDA
N-metyl-D-aspartát
PCOS
syndrom polycystických vaječníků
RIA
radioimunoanalýza
RT-PCR
kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase, real-time polymerase chain reaction
SD
směrodatná odchylka, standard deviation
SHBG
pohlavní hormony vázající protein, sex-hormone binding globulin
STS
steroidní sulfatáza
SULT
steroidní sulfotransferáza
Te
testosteron
TTe
celkový testosteron, total testosterone
TLC
chromatografie na tenké vrstvě, thin layer chromatography
TME
tyrosin metyl ester
6
OBSAH Seznam pouţitých zkratek ..................................................................................................... 4 ÚVOD .................................................................................................................................... 9 1.1.
Endokrinní systém a jeho regulace ......................................................................... 9
1.2.
Steroidní hormony................................................................................................... 9
1.3.
Transport steroidních hormonů ............................................................................. 10
1.4.
Hlavní účinky steroidních hormonů ...................................................................... 11
1.5.
Méně známé účinky steroidních hormonů ............................................................ 12
1.6.
DHEA a jeho sulfát ............................................................................................... 13
1.6.1.
Antiglukokortikoidní účinky DHEA ............................................................. 14
1.6.2.
Metabolismus DHEA ..................................................................................... 15
1.7.
Metabolity DHEA ................................................................................................. 21
1.7.1.
Imunomodulační účinky 7-OH-DHEA .......................................................... 21
1.7.2.
Termoregulační účinky 7-oxo-DHEA ........................................................... 23
1.7.3.
Anti-imunoprotektivní účinky 16-OH-DHEA ............................................... 25
1.8.
Další méně běţné hormony ................................................................................... 26
1.8.1.
Anti-androgenní účinky epitestosteronu ........................................................ 26
1.8.2.
SHBG ............................................................................................................. 30
2.
CÍLE PRÁCE ............................................................................................................... 31
3.
MATERIÁL A METODY ........................................................................................... 32 3.1.
Biologický materiál ............................................................................................... 32
3.2.
HPLC..................................................................................................................... 32
7
4.
3.3.
GC-MS .................................................................................................................. 33
3.4.
RIA ........................................................................................................................ 33
VÝSLEDKY................................................................................................................. 34 4.1.
Nová radioimunoanalýza 16α-hydroxy-dehydroepiandrosteronu a jeho
fyziologické hodnoty........................................................................................................ 34 4.2.
Nová radioimunoanalýza 7-oxo-dehydroepiandrosteronu a jeho fyziologické
hodnoty............................................................................................................................. 43 4.3.
SHBG u pacientů s vrozenou adrenální hyperplazií ............................................. 55
4.4.
Koncentrace předních pohlavních steroidů ve varlatech u lidí ............................. 63
4.5.
Steroidní metabolom v tělních tekutinách plodu a matky ve 3. trimestru
těhotenství ........................................................................................................................ 71 5.
DISKUZE ..................................................................................................................... 92
6.
ZÁVĚR ......................................................................................................................... 97
7.
SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY .......................................................................... 99
8.
SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ ........................................................................ 116
9.
PREZENTACE VÝSTUPŮ ....................................................................................... 117 9.1.
Publikační činnost ............................................................................................... 117
9.2.
Vědecká symposia a semináře ............................................................................ 118
8
ÚVOD
1.1. Endokrinní systém a jeho regulace Lidské tělo je tvořeno miliardami buněk, které většinou mají své specializované funkce. Aby tyto buňky mohly fungovat jako celek, je potřeba zajistit jejich vzájemnou komunikaci. Pro komunikaci mezi velkým počtem buněk na různých místech organismu se vyvinul endokrinní systém, který zajišťuje kontrolu základních procesů v organismu, jakými jsou metabolismus, růst, zrání, reprodukce a chování. Přenos signálu mezi buňkami můţe být zprostředkován jednoduchými molekulami odvozenými od aminokyselin či mastných kyselin nebo sloţitějšími sloučeninami jako jsou proteiny, peptidy nebo steroidy. Obecně se tyto látky označují jako hormony a jejich účinek se můţe projevit na buňce, která je vyprodukovala, na okolních buňkách nebo na buňkách vzdálených. Mezi hlavní endokrinní ţlázy patří hypofýza, štítná ţláza, příštítná tělíska, Langerhansovy ostrůvky pankreatu, nadledviny a gonády. Endokrinní charakter však vykazují také orgány, které mají v organismu zcela odlišnou funkci, např. srdce, mozek, tuková tkáň nebo placenta. Endokrinní systém doplňuje systém nervový a jejich rozdíly se s novými poznatky stále více stírají. Není bez zajímavosti, ţe např. buňky dřeně nadledvin produkují noradrenalin, který funguje jako hormon a zároveň jako neurotransmiter, přičemţ noradrenalinové receptory nerozeznávají, zda je noradrenalin nervového či nadledvinového původu.
1.2. Steroidní hormony Struktura všech steroidních látek se odvozuje od tetracyklického uhlovodíku cyklopentanoperhydrofenantrenu a jejich biosyntéza vychází z cholesterolu (Obr. 1.). Steroidy s 21 uhlíky (kortikoidy a progestiny) se tvoří v kůře nadledvin (kortizol, kortizon, kortikosteron a aldosteron), ovariích a placentě (progesteron). V lidském organismu se tyto hormony účastní stresové odpovědi, metabolismu, imunitních a
9
protizánětlivých reakcí, udrţení extracelulárního objemu, ovlivnění psychických stavů a celé řady dějů spojených s reprodukcí. Steroidy s 19 uhlíky (androgeny) se tvoří především v Leydigových buňkách varlat, ale také v ovariích a kůře nadledvin. Hlavními androgeny jsou testosteron, 5αdihydrotestosteron, dehydroepiandrosteron a androstendion. Hlavní funkcí těchto hormonů je stimulace růstu, vývoje a funkce muţského genitálu, stimulace spermatogeneze, stimulace tělesného růstu a uzavření epifýz, regulace chování. Steroidy s 18 uhlíky (estrogeny) vznikají v granulózových buňkách ovarií a placentě. Hlavními estrogeny jsou estron a 17β-estradiol. Zdrojem pro jejich tvorbu jsou androgeny, zejména dehydroepiandrosteron, který je produkován thekálními buňkami ovária, bezprostředními prekurzory pak androstendion a testosteron. Estrogeny se významně podílejí procesech spojených se ţenskou reprodukcí. Kromě ovulace, tvorby ţlutého tělíska a chování ovlivňují také růst kostí, metabolismus tuků a cukrů.
Cholesterol O
CH3
CH3
O
DHEA
CH3
Pregnenolon
Progesteron
CH3
CH3
O
HO
Androstendion
CH 3 CH 3
Estron
OH
Testosteron
Kortizol
Aldosteron
O
DHT
Estradiol
Obr. 1. Schéma biosyntézy steroidních hormonů. V obrázku nejsou uvedeny všechny meziprodukty, pouze ty nejdůleţitější pro lidský organismus. DHEA = dehydroepiandrosteron, DHT = 5α-dihydrotestosteron.
1.3. Transport steroidních hormonů Steroidní hormony jsou nepolární hydrofobní sloučeniny, jsou rozpustné v tucích a v nekonjugované formě prochází do buňky skrze plasmatickou membránu prostou difuzí.
10
Naproti tomu hormony konjugované s kyselinou sírovou (sulfáty) či glukuronovou (glukosiduronáty) jsou polární, prochází do buňky velice obtíţně, a proto zůstávají v krevním oběhu. Vzhledem ke své polaritě jsou konjugované steroidy dobře rozpustné v krvi, zatímco ve volné podobě je většina navázána na bílkovinné nosiče, které usnadňují jejich transport krví. Hlavními proteinovými nosiči steroidních hormonů jsou pohlavní hormony vázající protein, kortikosteroidy vázající protein a nespecifický lidský sérový albumin.
1.4. Hlavní účinky steroidních hormonů Rozmanité účinky steroidních hormonů lze rozdělit podle úrovně, na které působí. Účinky na úrovni organismu zahrnují např. regulaci vodní bilance a elektrolytů. Mineralokortokoidy zajišťují udrţení extracelulárního objemu a regulují vylučování sodíku potem a močí. Glukokortikoidy mají hyperglykemické a slabé lipolytické účinky a regulují tak energetickou rovnováhu. Steroidní hormony také pomáhají při reakcích organismu na změny vnějšího prostředí jako tzv. stresové hormony a ovlivňují změny nálad a chování (GC, androgeny, estrogeny i progestiny). Důleţitou skupinou účinků je vliv steroidů na růst, vývoj a reprodukci (androgeny, estrogeny a progestiny). Na
buněčné
úrovni
působí
steroidní
hormony
rozmanitým
způsobem.
Např. působením aldosteronu na distální nefron dochází ke zvýšené re-absorpci sodíkových kationtů. Glukokortikoidy a některé metabolity androgenů působí na buňky CNS. Působením kortizolu na hepatocyty dochází ke zvýšenému výdeji glukózy játry, zatímco u pojivové tkáně kortizol inhibuje proliferaci buněk a u kostních buněk stimuluje resorpci kosti. Mezi další účinky GC patří protizánětlivé a imunosupresivní účinky na úrovni T lymfocytů a leukocytů, takţe při vysokých dávkách glukokortikoidů je inhibována řada obranných mechanismů proti infekci. Androgeny i estrogeny působí na většinu
buněk
anabolicky,
avšak
jejich
hlavní
úloha
spočívá
v účincích
na specializované cílové buňky lidského reprodukčního systému. Účinky steroidních hormonů na molekulární úrovni jsou zprostředkovány dvěma základními mechanismy:
11
Genomové účinky Aţ do 80. let 20. století se předpokládal výhradně tento mechanismus působení steroidních hormonů. Princip spočívá ve vytvoření aktivního komplexu, který má schopnost regulovat genovou expresi. Vazba hormonu na nitrobuněčný receptor umoţní
vznik
takové
konformace
komplexu,
která
má
vysokou
afinitu
k promotorovým oblastem regulovaného genu (tzv. hormone responsing elements). Po navázání aktivního komplexu na odpovídající elementy DNA regulovaného genu se za přítomnosti dalších transkripčních faktorů spustí (nebo naopak znemoţní) transkripce mRNA. Výsledkem je změna mnoţství specifické mRNA, které slouţí jako nositel informace pro translaci v cytoplazmě. Steroidní hormony tímto mechanismem regulují transkripci genů kódujících enzymy, receptory, transkripční faktory, proteohormony, membránové proteiny a jiné. Negenomové účinky Schéma mechanismu tohoto účinku předpokládá vazbu hormonu na membránový receptor, čímţ se spustí kaskáda událostí vedoucí k aktivaci nejrůznějších systémů. Funkční spojení mezi membránovými receptory a nitrem buňky je realizováno pomocí membránových G-proteinů. Tyto heteromerní komplexy jsou zodpovědné za uvolnění tzv. druhých poslů, pomocí kterých se signál přenáší na nitrobuněčné enzymy proteinkinázy, jejichţ aktivací dochází k fosforylaci popř. defosforylaci proteinů. Tímto způsobem dochází k ovlivnění aktivity některých enzymů i transkripčních faktorů. Steroidy interagují také s membránovými receptory s vlastní enzymatickou aktivitou (tyrozin-kinázový systém) nebo iontovými kanály (kalcium-kalmodulinový systém). Příkladem negenomových účinků je modulace GABA a NMDA receptorů v mozku (Bičíková a Hampl, 2004). Dalším příkladem moţných negenomových účinků steroidů je modulace imunitního systému glukokortikoidy nebo klíčová role progesteronu při akrosomální reakci (Brucker a Lipford, 1995).
1.5. Méně známé účinky steroidních hormonů Některé prekurzory a metabolity steroidů mají své vlastní účinky na lidský organismus. Podle výše zmíněného rozdělení působí především negenomovými účinky a
12
obecně lze říci, ţe modulují účinky „hlavních“ steroidů. Následující řádky popisují některé z účinků méně známých steroidních hormonů a jejich metabolitů.
1.6. DHEA a jeho sulfát Dlouhou dobu se předpokládalo, ţe dehydroepiandrosteron je pouze biologicky neaktivní prekurzor některých steroidních hormonů, avšak v posledních desetiletích je tento steroid úzce spojován s převáţně pozitivními účinky na lidský organismus. V podobě sulfátu je po cholesterolu vůbec nejhojněji cirkulující steroid. Konjugovaný DHEAS představuje transportní molekulu a zároveň zásobní pool pro DHEA. Pro udrţení vzájemného poměru DHEA/DHEAS jsou klíčové dva enzymy, STS a SULT. STS je enzym zodpovědný za hydrolýzu sulfatovaných steroidů na jejich nekonjugovanou podobu. Jeho přítomnost byla prokázána v mnoha tkáních lidského těla (Munroe a Chang, 1987) a účastní se jak fyziologických tak patologických procesů v organismu (Reed et al., 2005). Enzym SULT katalyzuje přenos sulfonátové skupiny z molekuly donoru na molekulu steroidu a tím reguluje tvorbu DHEAS (Falany, 1997). Ačkoli tyto enzymy pravděpodobně nemají na patologické stavy organismu přímý vliv, působí prostřednictvím změn koncentrací DHEA/DHEAS a tím modulují účinky těchto hormonů (Stanway et al., 2007; Kříţ et al., 2008). DHEA je steroid typický pro člověka, neboť koncentrace v krvi ostatních primátů jsou řádově niţší a u hlodavců dokonce nepatrné (Hampl a Stárka, 1998). Místem jeho vzniku je především kůra nadledvin, v menší míře potom gonády, placenta, ale i neurony v mozku. DHEA je prekurzorem testosteronu a estrogenů a zároveň slabým androgenem. Dehydroepiandrosteron nemá vlastní receptory a ani se neváţe na receptory ostatních steroidních hormonů (Mohan a Cleary, 1992). Z tohoto hlediska jsou jeho účinky negenomové a nejedná se tedy o hormon v plném slova smyslu. Mezi známé biologické účinky připisované DHEA patří účinky antikancerogenní, antisklerotické, antidiabetické, imunostimulační a v neposlední řadě účinky na CNS vyvolávající celkový pocit pohody (Hampl et al., 2004).
13
1.6.1. Antiglukokortikoidní účinky DHEA Vedle účinků na CNS jsou nejzajímavější a v posledních dvou dekádách intenzivně studované účinky DHEA jako antagonisty glukokortikoidů. Těmito antiglukokortikoidními účinky je moţné vysvětlit celou řadu rozmanitých účinků DHEA. Mezi nejvýraznější patří imunoprotektivní účinky. První práce, která se touto problematikou zabývá, je studie publikovaná v roce 1988 (Loria et al., 1988). Autoři zde prokázali, ţe u myší, kterým byl podáván DHEA a které byly infikovány letální dávkou viru Coxackie B a Herpes viru typu 2, došlo ke statisticky významnému prodlouţení doby přeţití. V následujících letech byly imunoprotektivní účinky pozorovány nejen v různých tkáních laboratorních zvířat, ale také u člověka. Navzdory intenzivním výzkumům není molekulární podstata těchto dějů dosud známa. Některé z dosud známých výsledků jsou uvedeny na následujících řádcích. Dřívější
studie
prokázaly,
ţe
podávání
syntetického
GC
dexametazonu
při hyperandrogenemii vedle ke sníţení plasmatických koncentrací DHEA, DHEAS i testosteronu (Taubert a Dericks-Tan, 1990). Tento efekt lze vysvětlit regulací negativní zpětnou vazbou v ose hypotalamus-hypofýza-nadledvina. Navzdory svým protichůdným účinkům hladiny DHEA a GC vzájemně nekorelují. Zatímco u glukokortikoidu kortizolu nedochází ke sniţování koncentrací s narůstajícím věkem, jako tomu je u DHEA, tak naopak DHEA nevykazuje cirkadiální kolísání hladin, jako tomu je u kortizolu. Ačkoli jsou kortizol i DHEA produkovány nadledvinou, na změny koncentrací ACTH reaguje pouze první z nich (Hampl a Stárka, 2000a). Někteří autoři (Kalimi et al., 1994) naznačují moţnou modulaci glukokortikoidních receptorů pomocí DHEA. Bylo prokázáno, ţe podávání DHEA vedlo ke sníţení počtu glukokortikoidních receptorů v játrech krys, čímţ by rovněţ bylo moţné vysvětlit antiglukokortikoidní působení DHEA. Jiná studie zaměřená na imunomodulační účinky dehydroepiandrosteronu prokázala, ţe DHEA působí proti glukokortikoidům na úrovni interleukinů. Zatímco působením glukokortikoidů na T lymfocyty byla pozorována sníţená produkce IL2 a zvýšená produkce IL4, při podávání DHEA byl efekt opačný (Daynes et al., 1990). Antiglukokortikoidní účinek dehydroepiandrosteronu je pravděpodobně téţ na úrovni kompetice s glukokortikoidy, nikoliv ale na receptorech. Na zvířecím modelu bylo prokázáno, ţe DHEA funguje vůči glukokortikoidům jako kompetitivní inhibitor enzymu 14
glukóza-6-fosfát dehydrogenázy. Bylo pozorováno, ţe podávání DHEA vedlo ke sníţení mnoţství jaterního tuku a ke sníţení aktivity glukóza-6-fosfát dehydrogenázy v porovnání s kontrolami (McIntosh a Berdanier, 1988). 1.6.2. Metabolismus DHEA DHEA v organismu podléhá četným metabolickým pochodům. Tento steroid je znám především jako prekurzor pohlavních hormonů a proto nejlépe prozkoumaným jsou procesy vedoucí k nejznámějším produktům, testosteronu a estradiolu (Labrie et al., 1997; Labrie et al., 1998). Tato práce se však zabývá metabolickými pochody, které vedou k méně běţným metabolitům. Výsledné mnoţství produktů závisí na aktivitě enzymů, které příslušné reakce katalyzují. Následující obrázek popisuje nejdůleţitější enzymy, které se na těchto reakcích podílejí (Obr. 2.).
Obr. 2. Schéma metabolických drah DHEA. Nad šipkami jsou uvedeny enzymy, které příslušné reakce katalyzují. Androstendion = 4-androsten-3,17-dion, Epi 5-diol = 5-androsten-3β,17α-diol, DHEA(S) = dehydroepiandrosteron (sulfát), HSD = hydroxysteroidní dehydrogenáza, STS = steroidní sulfatáza, SULT = steroidní sulfotransferáza.
Enzym P450 7B1 (CYP7B1) Jednou z moţných metabolických cest DHEA je hydroxylace v poloze 7. Enzym zodpovědný za tuto reakci patří do skupiny cytochromů P450 rodiny 7 a gen, který tento enzym kóduje je označován jako CYP7b1 (Nelson et al., 1996). U lidí byl CYP7B1 15
lokalizován na chromozomu 8q21.3 (Setchell et al., 1998). Vůbec poprvé byl odhalen v podobě cDNA v transkriptu hippokampu u krys a byla pozorována jeho 39 % shoda se sekvencí jiţ známé cholesterol 7α-hydroxylázy (Stapleton et al. 1995). O dva roky později byla popsána schopnost enzymu katalyzovat 7α-hydroxylaci u DHEA, pregnenolonu a v menší míře také u 25-hydroxycholesterolu, 17β-estradiolu a 5α-androstan-3β,17β-diolu. Tato reakce probíhá za přítomnosti NADPH jako kofaktoru a jejími produkty jsou příslušné 7α-hydroxylované metabolity (Rose et al., 1997). Na buněčné úrovni byl enzym lokalizován v membráně endoplazmatického retikula a je předpokládán také v mitochondriích. Na úrovni organismu byla jeho přítomnost prokázána v tkáních mozku, jater, brzlíku a sleziny (Doostzadeh a Morfin, 1996). Aktivita CYP7B1 vykazuje tkáňovou specificitu. Podáváním dexametazonu, melatoninu a dalších látek došlo ke zvýšení aktivity tohoto enzymu v játrech, nikoli však v mozku (Attal-Khémis et al., 1998). Nové genetické přístupy umoţnily vnést rekombinantní úsek CYP7B1 do kvasinkových buněk a po kultivaci buněk na médiu a izolaci mikrozomů sledovat aktivitu vzniklého enzymu. Kromě převaţující 7αhydroxylázové aktivity byla pozorována i minoritní aktivita vedoucí k 7β-OH metabolitům. Bylo zároveň prokázáno, ţe vysoké hladiny estrogenů mohou mít inhibiční vliv na CYP7B1 (Kim et al., 2004). Porovnáním exprese CYP7B1 v různých tkání lidského těla byla prokázána tkáňová specificita a věková závislost exprese tohoto genu. Výsledky ukázaly vyšší hladiny mRNA genu v téměř všech fetálních tkáních v porovnání s příslušnými
tkáněmi
dospělých.
Studie
také
odhalila,
ţe
testosteron,
5α-
dihydrotestosteron ani progesteron nevykazují signifikantní účinky na aktivitu vlastního CYP7B1, zatímco přidání 17β-estradiolu aktivitu enzymu sniţovala. Za přítomnosti estrogenových receptorů však byly účinky E2 opačné. Bylo prokázáno, ţe v přítomnosti estrogenových receptorů je E2 schopen přímé stimulace transkripce CYP7B1 mechanismem změny aktivity promotoru genu (Tang et al., 2006) (Obr. 3.).
16
Obr. 3. Předpokládaný mechanismus regulace DHEA v cílových buňkách pro estrogeny. Estrogeny zpětnovazebně regulují koncentraci DHEA zvýšením aktivity enzymu P450 7B1 (podle Tang et al., 2006). DHEA = dehydroepiandrosteron, ER = estrogenový receptor.
Enzym 11β-hydroxysteroidní dehydrogenáza Tento enzym je znám jiţ z 50. let 20. století, kdy byly jeho účinky poprvé popsány (Schneider, 1952). V následujících letech byla prokázána jeho substrátová specificita a vůbec poprvé pouţito označení „11β-hydroxy-dehydrogenáza“ (Hubener et al., 1956). Enzym 11β-HSD
je známým regulátorem metabolismu GC a je přítomný
v endoplazmatickém retikulu i v dalších membránových organelách. Na úrovni organismu byl enzym pozorován v různých tkáních lidského těla, např. v játrech, ledvinách, mozku či placentě, kde také vykazuje odlišné účinky (White et al., 1997). Do současnosti byly popsány tři izoenzymy, které se liší svou lokací i mechanismem působení. Prvním z izoenzymů je 11β-HSD1, která vykazuje reverzibilní dehydrogenázovou i reduktázovou aktivitu. Aktivita enzymu je tkáňově specifická a závisí na přítomnosti kofaktoru NADP+ resp. NADPH (Seckl a Walker, 2001). Enzym v přítomnosti NADP+ působí jako dehydrogenáza a katalyzuje přeměnu aktivního kortizolu na neaktivní kortizon, zatímco v přítomnosti NADPH převaţuje reduktázová aktivita a z neaktivního kortizonu vzniká kortizol. Typ 11β-HSD2 vykazuje ireverzibilní na NAD+ závislou dehydrogenázovou aktivitu. U lidí byl tento enzym lokalizován pomocí konfokální laserové mikroskopie nejen v mikrozomálních, ale i v jaderných frakcích buněk ledvin, tlustého střeva a slinných ţláz a také v Leydigových buňkách testes (Shimojo et al., 1997). Vzhledem k dehydrogenázové
17
aktivitě, která převádí aktivní formy GC na jejich neaktivní formy, chrání tento enzym mineralokortikoiní receptory před nadměrným působením GC. Posledním
typem
je
11β-HSD3, která byla popsána v buňkách ledvin
v membránách mitochondrií a Golgiho aparátu. Tento enzym vykazuje dehydrogenázovou aktivitu za přítomnosti NADP+ jako kofaktoru (Gomez-Sanchez et al., 1997). Následující studie prokázaly schopnost lidské 11β-HSD oxidovat cholesterol (Song et al., 1998) a 7α-OH-DHEA (Fitzpatrick et al., 2001) za vzniku jejich 7-oxo metabolitů. Při zkoumání různých subcelulárních frakcí z tkání zvířat i člověka bylo zjištěno, ţe se oxidace 7α-OH-DHEA účastní všechny tři typy 11β-HSD (Robinzon et al., 2003). Zcela nový pohled na metabolické děje DHEA umoţnilo zjištění, ţe lidská 11β-HSD1 působí jako steroidní oxidoreduktáza, která je zodpovědná za reverzibilní oxidaci jak 7α-OHDHEA tak i 7β-OH-DHEA za vzniku biologicky aktivního 7-oxo-DHEA. Zatímco oxidace obou hydroxylovaných epimerů vykazovala stejnou účinnost, katalytická účinnost redukční reakce vykazovala vyšší hodnoty ve směru k produktu 7β-OH-DHEA neţ k 7αOH-DHEA (Muller et al., 2006a). Stejně jako v případě oxidoredukčních přeměn GC, je i v tomto případě 11β-HSD1 závislá na kofaktoru NADP+/NADPH. Oxidace obou 7-OHDHEA probíhá za přítomnosti NADP+, zatímco redukce 7-oxo-DHEA je závislá na NADPH. Aktivita enzymu je tedy ovlivněna dvěma hlavními faktory. Prvním z nich je mnoţství dostupných 7-hydroxylovaných metabolitů
DHEA a tím druhým je poměr
NADP+/NADPH uvnitř buňky. Mechanismus působení enzymu 11β-HSD1 ukazuje Obr. 4. Hypotéza, která předpokládala konkurenční působení GC a 7-OH-DHEA na úrovni celého organismu, musela být zamítnuta. V současnosti se předpokládá parakrinní mechanismus působení hydroxylovaných metabolitů DHEA (Muller et al., 2006b). Nejnovější studie ukazují, ţe také 7-hydroxylované deriváty dalších steroidů mohou být substrátem pro lidskou 11β-HSD1 (Hennebert et al., 2007a,b). Byla prokázána epimerázová aktivita 11β-HSD1, která přímo převádí 7α-hydroxylované metabolity epiandrosteronu a 5α-androstan-3β,17β-diolu na jejich 7β-OH-metabolity, aniţ by vznikaly jejich 7-oxo-meziprodukty (Hennebert et al., 2009).
18
Obr. 4. Schéma působení 11β-hydroxysteroidní dehydrogenázy typu 1 (11β-HSD1). Neaktivní kortizon je redukován na biologicky aktivní kortizol, který se váţe na glukokortikoidní receptor. Dehydroepiandrosteron (DHEA) je nejprve hydroxylován enzymem P450 7B1, produkt reakce 7α-OH-DHEA je substrátem pro 11β-HSD1, coţ můţe mít za následek sníţení aktivity enzymu ve směru přeměny kortizonu na kortizol.
Enzymy rodiny P450 3A (CYP3A) Mezi enzymy, které se podílejí na metabolismu DHEA, patří také enzymy skupiny cytochromu P450 rodiny 3, kódované genem CYP3. Společně tvoří nejhojnější rodinu enzymů P450, která se podílí na oxidaci mnohých endogenních i exogenních látek. Z početné rodiny enzymů jsou pro metabolismus DHEA nejdůleţitější tři z nich: CYP3A4, CYP3A5 a CYP3A7. Tyto enzymy vykazují strukturální homologii, přičemţ pořadí aminokyselin je shodné ve více neţ 80 % (Schuetz et al., 1989, Komori et al, 1989). CYP3A4 je hlavním typem těchto enzymů u dospělých. Většinou je exprimován v játrech a v menší míře také v tenkém střevě a jiných tkáních (Paine et al., 1997). V nízkých koncentracích byl gen enzymu detekován pomocí metody RT-PCR také v játrech fétu (Hakkola et al., 1994).
19
CYP3A5 se u dospělých vyskytuje přednostně v ledvinách, v plicích a v leukocytech (Kuehl et al., 2001). Enzym byl detekován také ve fetálních játrech, avšak pouze v jednom případě z deseti (Wrighton et al., 1990). CYP3A7 představuje hlavní izoenzym P450 exprimovaný ve fetálních játrech (Komori et al., 1990), avšak jeho exprese byla prokázána také v endometriu těhotných ţen a v placentě (Schuetz et al., 1993). V malé míře byl gen pro tento enzym zachycen i v játrech dospělých (Hakkola et al., 1994) a ve vyšších koncentracích v buňkách hepatoblastomu (Kitada et al. 1989). Zdá se, ţe enzym CYP3A7 hraje klíčovou roli při ochraně plodu před teratogenními účinky (Maruyama et al., 2007). Tato skupina enzymů obecně katalyzuje oxidoredukční přeměny různých exogenních i endogenních látek, např. mastných kyselin, steroidních hormonů, drog nebo karcinogenů. V metabolismu dehydroepiandrosteronu jsou enzymy CYP3A4 a CYP3A5 zodpovědné za hydroxylaci DHEA za vzniku metabolitů 7α-OH-DHEA, 16α-OH-DHEA a 7β-OH-DHEA, naproti tomu CYP3A7 vykazuje enzymovou aktivitu pouze ve směru 16α-OH-DHEA a 7β-OH-DHEA (Miller et al., 2004). CYP3A4 katalyzuje především vznik 7β-OH-DHEA. Aktivita enzymu je 34 krát vyšší v porovnání s CYP3A7, u kterého naopak převaţuje aktivita ve směru k 16α-OH-DHEA. Aktivita CYP3A5 vykazovala pouze zanedbatelné účinky při tvorbě metabolitů DHEA (Stevens et al., 2003). Sledování exprese enzymů v játrech v různých stádiích ontogeneze prokázalo, ţe v průběhu fetálního vývoje mnoţství CYP3A7 stoupá, dosahuje maxima v prvním týdnu po narození a potom prudce klesá. Hladiny CYP3A4 se naopak v průběhu šesti měsíců po narození postupně zvyšují (Lacroix et al., 1997). Hladiny CYP3A5 byly na věku nezávislé (Stevens et al., 2003). Geny CYP3A jsou tedy transkripovány jak u plodu tak i dospělých, liší se však mírou transkripce. Gen CYP3A5 je vysoce polymorfní a jeho mutace většinou sniţují syntézu funkčního proteinu. Naproti tomu jsou geny CYP3A4 a CYP3A7 vzhledem ke své nezastupitelné roli v metabolismu endogenních látek velmi konzervativní. Katalytická aktivita CYP3A7 vykazuje ve fetálních játrech nízkou variabilitu (Leeder et al., 2005). Během nitroděloţního vývoje hraje enzym CYP3A7 klíčovou roli v metabolismu steroidů, zejména při biosyntéze estriolu, dále při odbourávání kyseliny retinové a dalších škodlivých látek, které se do fetálního organismu dostávají z matčina těla. Variabilita
20
v expresi CYP3A7 potom můţe vést rozdílné náchylnosti vůči emryotoxickým a teratogenním vlivům (Ingelman-Sundberg et al., 2007). Pro porozumění významu enzymu CYP3A7 se jeví jedna varianta jeho genu jako obzvláště zajímavá. Je označovaná jako CYP3A7*1C a u této varianty byl úsek promotoru dlouhý přibliţně 60 bp nahrazen odpovídající sekvencí promotoru CYP3A4. Tato záměna vedla tomu, ţe se exprese genu po narození nesniţuje, ale přetrvává i v dospělosti (Kuehl et al., 2001). Enzym CYP3A7 katalyzuje především 16α-hydroxylaci DHEA a DHEAS, tím moduluje mnoţství těchto androgenů, ale i dalších hormonů např. testosteronu. Nedávné studie naznačily souvislost polymorfismu CYP3A7*1C se sníţeným rizikem výskytu syndromu polycystických ovarií. U pacientek s PCOS vykazovaly nositelky CYP3A7*1C sníţené hladiny DHEAS i celkového testosteronu, zatímco v kontrolní skupině s CYP3A7*1C byly pozorovány sníţené hodnoty u DHEAS a nikoli však u testosteronu (Goodarzi et al., 2008). Jiní autoři (Bácsi et al., 2007) zkoumali vliv CYP3A7*1C na kostní denzitu u postmenopauzálních ţen. Byla prokázána souvislost genotypu CYP3A7*1C se sníţením hustoty obratlů v bederní oblasti. Tento efekt byl vysvětlován sníţením koncentrací estronu, estradiolu, androstendionu a testosteronu, které všechny mají pozitivní vliv na tvorbu a ochranu kostí. Při hodnocení výsledků je nutné pamatovat na rozdílné hladiny DHEAS a DHEA u ţen a u muţů. Také různá exprese CYP3A7 byla pozorována v tkáních ţenského a muţského reprodukčního systému. Vyšší exprese mRNA CYP3A7 byla pozorována v tkáních prostat, zatímco v děloze a varlatech byla velmi nízká (Koch et al., 2002; Nishimura et al., 2003). Z výše uvedeného lze usuzovat, ţe vliv enzymu CYP3A7 na koncentrace sérového DHEAS a DHEA je vyšší u muţů neţ u ţen.
1.7. Metabolity DHEA 1.7.1. Imunomodulační účinky 7-OH-DHEA Jedněmi ze známých metabolitů DHEA jsou deriváty hydroxylované v poloze 7, především 7α-OH-DHEA a jeho epimer 7β-OH-DHEA. Hlavním místem vzniku těchto metabolitů jsou játra, ale tvoří se také v řadě dalších tkání včetně mozku.
21
Tyto deriváty DHEA, jsou známé jiţ od 60. let minulého století (Stárka a Kutová, 1962). Dlouhou dobu byly 7α-OH-DHEA i jeho epimer 7β-OH-DHEA povaţovány pouze za degradační produkty, biologicky neúčinné. Společně s dalšími 7-hydroxylovanými metabolity androgenů a estrogenů představovaly skupinu koncových metabolitů odsouzených k vyloučení z organismu. Předpokládala se jejich klíčová role při regulaci jejich příbuzných hormonálně aktivnějších steroidů, bylo však zaráţející, ţe k hydroxylaci v poloze 7 dochází také v tkáních, které nejsou cílovými tkáněmi pro estrogeny a androgeny. Počátkem
80.
let
byla
pozorována
zvýšená
aktivita
7-hydroxylace
v nádorových tkáních prsu a tito autoři naznačovali pouţití koncentrace cirkulujícího 7αOH-DHEA jako moţného ukazatele pro předpověď dalšího průběhu onemocnění. Tyto výsledky však nebyly příliš přesvědčivé (Skinner et al., 1980). Zájem o 7-hydroxylované metabolity DHEA opět vzrostl s objevem jejich vlivu na regulaci imunitní odpovědi (Morfin a Courchay, 1994). Tato práce prokázala, ţe 7hydroxylované
metabolity
DHEA
(společně
s
7-hydroxylovanými
metabolity
pregnenolonu) vyvolávají na lokální úrovni imunoprotektivní reakce dosud připisované nekonjugovanému DHEA. V některých případech byl téţ pozorován dokonce silnější účinek konjugovaných metabolitů neţ vlastního DHEA. Při porovnání účinků u obou epimerů vyšlo najevo, ţe k vyvolání stejné imunitní reakce stačí několikrát niţší dávka 7αOH-DHEA neţ dávka 7β-OH-DHEA, z čehoţ vyplývají silnější imunomodulační účinky 7α-OH-DHEA . Obdobně jako u DHEA byly i u jeho 7-hydroxylovaných metabolitů prokázány antiglukokortikoidní účinky (Chmielewski et al., 2000). Glukokortikoidy vyvolávají apoptózu buněk sleziny a brzlíku. Pozorováním primární imunitní odpovědi v tkáňových kulturách brzlíku myší bylo zjištěno, ţe podávání 7β-OH-DHEA, nikoli však DHEA a 7αOH-DHEA, vede k potlačení imunosupresivních procesů vyvolaných syntetickým GC dexametazonem (Šterzl et al., 1999). Naopak v buňkách lidské tukové tkáně stimulovalo podávání dexametazonu vznik 7α-OH-DHEA z DHEA (Khalil et al., 1994). Oba steroidy jsou v oběhu člověka přítomny pouze v nanomolárních koncentracích, coţ je v porovnání s koncentracemi volného DHEA přibliţně desetkrát méně (Hampl et al., 1997). Pomocí vysoce specifických radioimunoanalytických metod (Lapčík et al, 1998,
22
1999) byly stanoveny hladiny obou epimerů v krvi u reprezentativního vzorku zdravých osob. Bylo pozorováno, ţe hladiny obou 7-OH-DHEA v průběhu ţivota klesají a tento pokles má u ţen i muţů odlišný průběh. Rovněţ byla prokázána korelace mezi hladinami měřených steroidů a poklesem hladin nekonjugovaného DHEA (Hampl et al., 2001a). Podstata účinků 7-OH-DHEA není dosud plně objasněna. Podobně jako DHEA nemají ani jeho 7-hydroxylované deriváty své vlastní receptory a ani nesoutěţí o vazebná místa na receptorech jiných hormonů. Bylo zjištěno, ţe za přítomnosti 7-OH-DHEA dochází ke sníţení počtu aktivovaných receptorů GC v jádře. Dlouho zůstávala nezodpovězená otázka, jakým mechanismem se tak děje. Na základě provedených studií bylo moţné vyloučit vazbu 7-OH-DHEA na komplex aktivovaného receptoru GC. Bylo zároveň prokázáno, ţe 7-hydroxylované metabolity DHEA nemají vliv na transport aktivovaných glukokortikoidních receptorů v rámci buňky (Muller et al., 2004). Také moţnost působení metabolitů DHEA proti glukokortikoidům na úrovni celého organismu byla zamítnuta, neboť systémové koncentrace jsou téměř o tři řády niţší, neţ by bylo potřeba k aktivaci buněk pomocí 7α-OH-DHEA. Moţným je tedy parakrinní mechanismus působení, který spočívá ve změnách koncentrací metabolitů na lokální úrovni (Morfin, 2002) a ve změnách aktivity enzymů, které jsou zapojeny jak do metabolismu DHEA tak i GC, zejména enzymu 11β-HSD1 (Muller et al., 2006b). 1.7.2. Termoregulační účinky 7-oxo-DHEA Tento metabolit byl poprvé izolován a popsán jako odpadní produkt v moči zdravých i nemocných osob. Ve vyšším mnoţství byl vylučován u pacientů s adrenálními poruchami (Fukushima et al, 1954). Jiţ koncem 60. let minulého století byla v krysích hepatocytech pozorována vzájemná přeměna 7-hydroxylovaných metabolitů DHEA za vzniku jejich 7-oxo-meziproduktu (Hampl a Stárka, 1969). 7-oxo-DHEA byl pozorován v také v lidské plazmě, kde se jeho koncentrace pohybují v řádech nanogramů (Matsuzaki et al., 2004). Do popředí zájmu se tento metabolit opět dostal po objevení termogenních vlastností jeho prekurzoru DHEA. Podávání DHEA vedlo u modelových organismů ke zvýšení syntézy mitochondriálních enzymů, které se podílejí na termoregulaci (Su a Lardy, 1991). Následující studie odhalily, ţe 7-oxo-DHEA ovlivňuje termoregulaci dokonce účinněji neţ jeho nekonjugovaný prekurzor nebo 7-hydroxylované metabolity.
23
Vzhledem k účinkům na energetický metabolismus se pro 7-oxygenované metabolity vţilo označení „ergosteroidy“ (Lardy et al., 1995). Termoregulační efekt 7-oxo-DHEA spočívá ve sníţení metabolické účinnosti. Dochází k posunu od oxidativního metabolismu ve směru k zvýšené produkci tepla. Podávání 7-oxo-DHEA vedlo u krys ke sníţení tělesné hmotnosti, ke zvýšení objemu jater a ke zvýšení mitochondriálního dýchání. Účinky tohoto ergosteroidu jsou podobné účinkům hormonů štítné ţlázy. Při pokusech na zvířatech s odoperovanou štítnou ţlázou bylo pozorováno, ţe některé metabolické účinky hormonů štítné ţlázy lze nahradit podáváním 7-oxo-DHEA (Bobyleva et al., 1997). Přesný mechanismus účinků DHEA a jeho 7-oxo-metabolitu na termoregulaci není dosud plně objasněn. Oba steroidy působí na
negenomové
úrovni
jako
modulátory klíčových
enzymů
mitochondriálního
a cytoplasmatického oxidativního metabolismu. V této souvislosti jsou nejčastěji zmiňovány dva enzymy – mitochondriální sn-glycerol-3-fosfát dehydrogenáza (EC 1.1.99.5) a cytosolická malátdehydrogenáza (EC 1.1.1.40) (Bobyleva et al., 1993; Lardy et al., 1995, 1998). Studie prokázaly, ţe biologickou aktivitu nese D-kruh steroidní molekuly 7-oxo-DHEA (Reich et al., 1998, 2002). V některých zemích je 7-oxo-DHEA komerčně dostupný v podobě preparátu pod označením 7-keto-DHEA a patří do skupiny steroidních potravinových doplňků pouţívaných ve sportu (Delbeke et al., 2002). Tento přirozený metabolit DHEA, při podávání nevykazuje androgenní efekt, nemůţe být metabolizován na biologicky aktivní testosteron ani na estrogeny (Lardy et al., 1995). V podobě 3-acetyl-7-oxo-DHEA byl podáván 22 zdravým muţům v narůstajících dávkách po dobu 7 a 28 dnů. Biochemické analýzy neprokázaly významné změny hormonálního spektra u probandů, coţ vedlo k závěru, ţe podávání tohoto metabolitu není zdraví škodlivé a i ve vysokých dávkách je bezpečné (Davidson et al., 2000). Také skupina kolegů z Endokrinologického ústavu studovala vliv koţního podání tohoto metabolitu na změny hormonálních a lipidových parametrů u zdravých jedinců. Nejvýraznější změny byly pozorovány v poklesu aterogenního indexu, v menší míře potom v poklesu hladin testosteronu a estradiolu. Studie naznačila, ţe podání 7-oxo-DHEA v podobě gelu je vyhovující pro zlepšení hormonálních a lipidových parametrů u starších osob (Šulcová et al., 2001).
24
Vzhledem ke skutečnosti, ţe 7-oxo-DHEA není na rozdíl od DHEA prekurzorem biologicky aktivních androgenů a estrogenu, jeho podávání nezvyšuje riziko rakoviny prostaty nebo ţenských reprodukčních orgánů. Z tohoto důvodu je na tento metabolit nahlíţeno jako na zajímavý endogenní steroid, který by mohl nahradit vlastní nekonjugovaný DHEA při hormonální substituční terapii. 1.7.3. Anti-imunoprotektivní účinky 16-OH-DHEA Konkurenční reakcí k 7-hydroxylaci DHEA je hydroxylace na šestnáctém uhlíku za vzniku 16α- nebo 16β-OH-DHEA (Baulieu, 1996). Tyto metabolity známé jiţ z 50. let minulého století byly poprvé detekovány v pupečníkové krvi novorozenců a v moči dospělých (Fotherby et al., 1957). V následujících letech se objevila řada prací, které popisovaly hladiny 16α- a 16β-hydroxylovaných steroidů u dětí i dospělých, u zdravých i s různými endokrinopatiemi. Literatura zabývající se tímto tématem je přehledně zpracována v souhrnném článku autorů Hampla a Stárky (2000b). Z fyziologického hlediska je hydroxylace steroidů v poloze 16 nezbytná pro tvorbu 16-hydroxylovaných estrogenů, z nichţ nejdůleţitějším je estriol, hlavní estrogen v těhotenství. Schéma biosyntézy fetálních estrogenů zahrnuje také enzymatickou aktivitu feto-placentální jednotky. DHEA, který je ve formě sulfátu nejčastější steroid v krevním oběhu, je nejprve ve fetálních játrech hydroxylován v poloze 16α, následuje průchod přes feto-placentální bariéru, kde v placentě dochází hydrolýze v přítomnosti steroidní sulfatázy a aromatizaci v přítomnosti aromatázy (Goodyer a Branchaud, 1981). Nedostatečná produkce placentálních estrogenů můţe vést k patologickému vývoji plodu, přičemţ tvorba těchto steroidů můţe být blokována na různých úrovních. Nízké hladiny estrogenů mohou být způsobeny nedostatkem výchozího DHEAS, poruchou 16α-hydroxylace nebo nedostatkem enzymu sulfatázy či aromatázy. Například v případě těhotenství s Downovým syndromem jsou nízké hladiny estriolu způsobené nízkými hladinami DHEAS, zatímco enzymatická aktivita steroidní sulfatázy zůstává zachována (Newby et al., 2000). Ani přes četné studie není fyziologická role 16α-OH-DHEA dosud úplně známa. Odborné práce, které se zabývají 16-hydroxylovanými steroidy, jsou většinou spojeny s prenatálním či perinatálním obdobím nebo u ţen v období kolem porodu. Vzhledem ke skutečnosti, ţe se jedná o prekurzory fetálních estrogenů, tak nejčastěji zpracovaným materiálem pro stanovení těchto steroidů je pupečníková krev, kde se byly detekovány
25
v relativně vysokých koncentracích v řádech desítek nanomolů. Patrně dosud jedinou studií, která se zabývá hladinami 16-hydroxylovaných metabolitů DHEA v průběhu ţivota, je práce ze sedmdesátých let (Sekihara et al., 1976). Autoři zde sledovali hladiny epimeru 16β-OH-DHEA v plazmě zdravých lidí i u pacientů s některými endokrinopatiemi. Daleko větší počet odborných prací se věnuje funkci 16α-hydroxylovaných estrogenů při fyziologických i patofyziologických stavech organismu. Část autorů se zabývá vzájemnou závislostí 16α-hydroxylace estrogenů a výskytu rakoviny u ţen. Například na myších modelech byla prokázána pozitivní korelace mezi hydroxylací estradiolu v poloze 16α a výskytem rakoviny prsu (Bradlow et al., 1986). Druhou oblastí výzkumu 16α-hydroxylovaných estrogenů je jejich vztah k autoimunitním chorobám. Signifikantně vyšší hladiny 16α-hydroxylovaných estrogenů byly pozorovány u pacientů s typickými autoimunitními chorobami, jako je systémový lupus erythematosus a revmatická arthritida (Merril et al., 1996). Dalších literárních zdroje k tomuto tématu uvádí Hampl a Stárka (2000b). Také vyšší hladiny 16α-OH-DHEA bývají zmiňovány v souvislosti se zvýšeným rizikem výskytu rakoviny prsu u lidí (Raju et al., 1989). Zároveň 16α-hydroxylace DHEA představuje konkurenční enzymatickou reakci k hydroxylaci v poloze 7. Z těchto důvodů je pravděpodobné, ţe metabolity 16α-OH-DHEA vyvolávají opačné imunitní reakce neţ imunoprotektivní 7α- a 7β-OH-DHEA. Lze předpokládat, ţe následující studie týkající se 16-hydroxylovaných metabolitů DHEA budou zaměřeny především na odhalení jejich mechanismu účinku při nádorových a autoimunitních onemocněních.
1.8. Další méně běžné hormony 1.8.1. Anti-androgenní účinky epitestosteronu Epitestosteron je 17α-hydroxy epimer testosteronu. Tento metabolit je znám jiţ od 40. let minulého století, kdy byl pod označením cis-testosteron detekován jako produkt in vitro reakcí testosteronu a androstendionu (Clark a Kochakian, 1947; Clark et al., 1947). V pozdějších letech byl EpiT izolován z krve a moči zvířat i lidí (např. Lindner, 1961; Korenman et al., 1964; Shackelton, 1986).
26
Jiţ Korenmanova studie naznačila, ţe tento metabolit není primárním produktem periferního metabolismu AD nebo Te. Biosyntéza EpiT probíhá jinou cestou neţ biosyntéza testosteronu (Weusten et al., 1989), a proto je mnoţství močí vylučovaného EpiT nezávislé na mnoţství vylučovaného testosteronu. Na základě toho v roce 1982 Donike se svými spolupracovníky navrhli pouţití močového poměru Te/EpiT jako účinného nástroje pro odhalení zneuţívání testosteronových preparátů ve sportu. O rok později byla práce publikována (Donike et al., 1983) a v témţe roce také Mezinárodní olympijský výbor přijal poměr Te/EpiT vyšší neţ 6 jako důkaz dopingu testosteronem. S narůstajícím počtem naměřených dat vyšlo najevo, ţe poměr Te/EpiT vykazuje mezi jednotlivci relativně vysokou variabilitu (Bowers, 2008), proto bylo navrhnuto dlouhodobé sledování Te/EpiT poměru u jednotlivých sportovců a následně individuální přístup k naměřeným výsledkům. V roce 2005 Světová anti-dopingová agentura sníţila hranici pro povolený poměr Te/EpiT na 4. Ani České republice se nevyhnulo zneuţívání testosteronových preparátů ve sportu. Kolegové z Endokrinologického ústavu proto ve spolupráci s Laboratoří pro kontrolu dopingu vyvinuli originální radioimunoanalytickou metodu pro stanovení EpiT v moči i v krevní plazmě a pomocí této metody stanovili hladiny metabolitu ve vzorcích zdravých jedinců. Výsledky ukázaly, ţe zatímco v moči jsou koncentrace EpiT blízké koncentracím vylučovaného Te, tak plazmatické koncentrace EpiT jsou niţší neţ koncentrace Te (Bílek et al., 1987). Hladiny plazmatického epitestosteronu byly stanoveny u rozsáhlého souboru muţů a ţen různých věkových skupin (Lapčík et al., 1995; Havlíková, 2002). Bylo zjištěno, ţe u chlapců před pubertou převládá koncentrace EpiT nad Te, následně dochází k nárůstu koncentrace Te a tím také poměru Te/EpiT. Nejvyšší sérové koncentrace EpiT u ţen byly pozorovány kolem 20. roku věku, následoval postupný pokles aţ do období menopauzy a pokračoval opětovným vzestupem koncentrací u postmenopauzálních ţen. Navzdory četným studiím nebylo dlouhou dobu známo, ţe by epitestosteron měl nějakou biologickou úlohu. V sedmdesátých letech bylo prokázáno, ţe EpiT působí jako kompetitivní inhibitor 5α-reduktázy, enzymu zodpovědného za přeměnu testosteronu na v cílových buňkách účinnější 5α-dihydrotestosteron (Voigt et al., 1970; Monsalve a Blanquier, 1977). Teprve aţ koncem 80. let studie na bočních orgánech zlatých křečků naznačila, ţe EpiT můţe působit nejen jako inhibitor 5α-reduktázy, ale i jako kompetitivní inhibitor androgenních receptorů (Nuck a Lucky, 1987).
27
Série následných biochemických studií prokázaly, ţe epitestosteron účinkuje na různých úrovních jako skutečný antiandrogen. Podařilo se prokázat specifickou vazbu EpiT na androgenní receptor (Stárka et al., 1989) a dále inhibiční efekt tohoto hormonu na další enzymy nezbytné pro biosyntézu steroidních hormonů, konkrétně testikulární 17αhydroxylázu/C17-20-lyasu (Bičíková et al., 1992, 1993a) nebo renální a testikulární 11βHSD (Bičíková et al., 1997). Při zkoumání negativního zpětnovazebného efektu EpiT na myších samcích bylo odhaleno, ţe podávání epitestosteronu sniţuje sekreci nadřazených hypofyzárních gonadotropinů LH a FSH (Stárka et al., 1991). U krysích samic vykazovala antigonadotropní aktivita EpiT zajímavý dvojfázový efekt, který byl mnohem zřetelnější u sekrece LH neţ u FSH (Bičíková et al., 1993b). V další práci byla zjištěna vysoce významná negativní korelace (p < 0,001) mezi hladinami epitestosteronu a hmotností krysích prostat, coţ naznačovalo moţnou ochrannou funkci EpiT vůči androgenům při onemocnění benigní hyperplasií prostaty (Lapčík et al., 1994). Toto onemocnění je dobře známé, neboť postihuje velkou část muţské populace po pátém deceniu, je přímo závislé na hladinách androgenů, jejichţ koncentrace se s věkem mění. V lidských hyperplastických tkáních prostat byly naměřené koncentrace EpiT přibliţně dvakrát vyšší neţ koncentrace Te, srovnatelné s koncentracemi AD a zhruba poloviční v porovnání s koncentracemi DHT. Navíc bylo prokázáno, ţe EpiT dosahuje jak v krvi, tak i v prostatické tkáni takových hladin, které jsou dostatečné pro kompetici
s testosteronem
resp.
jeho
periferně
účinným
metabolitem
5α-
dihydrotestosteronem (Hill et al., 1996; Stárka et al., 1997). Také prsní cystické tekutině byly naměřeny několikanásobně vyšší koncentrace EpiT v porovnání s koncentracemi v krevním oběhu (Bičíková et al., 2001). Význam tohoto fenoménu však zůstává neobjasněn. Jennifer Hammond s kolegy (Hammond et al., 2001) studovala, zda muţské hormony vykazují při fyziologických hladinách neuroprotektivní účinky podobně jako estrogeny. Práce ukázala, ţe epitestosteron působí na nervové buňky protektivně, nikoliv však stejným mechanismem jako testosteron. Jak jiţ bylo zmíněno dříve, biosyntéza EpiT probíhá jinou cestou, neţ biosyntéza Te. U lidí je vzájemná přeměna testosteronu a epitestosteronu zanedbatelným jevem. Na druhé straně bylo prokázáno, ţe podávání androstendionu zdravým muţům vede
28
ke zvýšení vylučování EpiT močí (Catlin et al., 2002). Pomocí molekulárně genetických přístupů bylo odhaleno, ţe za přeměnu androstendionu na EpiT je zodpovědný enzym 17αhydroxysteroidní dehydrogenáza (Bellemare et al., 2005). Tento specifický enzym vykazuje 17-ketoreduktázovou aktivitu za vzniku příslušných 17α-hydroxysteroidů. Kromě přeměny androstendionu na EpiT katalyzuje 17α-HSD např. také přeměnu DHEA na 5androsten-3α,17α-diol, coţ naznačuje dvě moţné cesty vzniku EpiT (Obr. 5.).
CH3
O
CH3
CH3
OH
CH3
17 -HSD
HO
HO
DHEA
epi5-diol
3 -HSD CH3 CH3
3 -HSD O
CH3
OH
CH3
17 -HSD
O
O
Androstendion
epiT
Obr. 5. Schéma dvou moţných přeměn dehydroepiandrosteronu (DHEA) na 17α-epimer testosteronu (epiT). Epi5-diol = 5-androsten-3β,17α-diol, HSD = hydroxysteroidní dehydrogenáza. Tučným písmem jsou vyznačeny převládající enzymatické dráhy.
Výše uvedené, ale i další skutečnosti potvrzují, ţe epitestosteron je skutečným endogenním antiandrogenem zapojeným různými způsoby do endokrinních regulací (Stárka, 2003). Z medicínského hlediska bude patrně nejzajímavější studovat význam tohoto steroidu při dějích v organismu, které jsou na androgenech závislé, jako např. při vzniku a rozvoji hyperplasie prostaty, při distribuci tělesného ochlupení nebo
29
při hyperandogenních stavech u ţen. Studium úlohy epitestosteronu v endokrinních regulacích není dosud zdaleka ukončeno. 1.8.2. SHBG Ačkoliv SHBG (sex hormone-binding globulin) není hormon v pravém slova smyslu, svými účinky se hormonům podobá a ovlivňuje je. Z chemického hlediska se jedná o glykoprotein, který specificky váţe pohlavní hormony Te, DHT a E2. Vazbou na bílkovinný nosič je inhibována biologická aktivita hormonu, jeho schopnost vstoupit do buňky a aktivovat příslušné receptory. Z tohoto hlediska je SHBG regulátorem biologické dostupnosti pohlavních hormonů. SHBG se tvoří především v játrech, odkud je uvolňován do krevního oběhu. Dalšími místy vzniku jsou mozek, děloha, varlata a placenta. Gen, který kóduje bílkovinnou strukturu SHBG je umístěn na 17. chromozomu. Hladina SHBG je regulována citlivým mechanismem spouštěcích a inhibičních faktorů. Při vysokých koncentracích androgenů, transkortinu, inzulínu a IGF-1 dochází ke sníţení hladin SHBG, zatímco vysoké koncentrace růstového hormonu, estrogenu a tyroxinu hladiny SHBG zvyšují. SHBG lze chápat jako důleţitý spojovací článek mezi minimálně třemi hormonálními systémy, mezi osou hypotalamus – hypofýza – gonády, osou inzulín – růstový hormon – IGF-1 a hormonálním systémem spojeným se štítnou ţlázou (Hampl a Stárka, 1996; Brenta et al., 1999). Studie dokazují, ţe SHBG představuje citlivý a nezávislý biochemický ukazatel hormonální léčby při různých patologických stavech např. u akromegalie nebo Turnerova syndromu (Hampl et al., 2001b).
30
2. CÍLE PRÁCE
Práce má za cíl podat přehled o dosud publikovaných poznatcích, které se týkají biologické úlohy vybraných méně běţných metabolitů steroidních hormonů, do nedávné doby povaţovaných pouze za neaktivní meziprodukty nebo degradační produkty metabolických drah známých hormonálně aktivních steroidů. Pro studium látek, které se v organismu vyskytují v nízkých koncentracích, je klíčová vhodná analytická metoda. V případech, kde taková metoda nebyla dostupná, bylo hlavním cílem vyvinout metodický přístup, který by byl dostatečně citlivý a odpovídal by poţadavkům pozdějšího moţného rutinního pouţití. Dalším cílem bylo stanovit vybrané steroidní hormony u vzorku zdravé lidské populace, čímţ byly získány intervaly fyziologických hodnot. Nejzajímavějším úkolem bylo sledování vybraných hormonální parametrů u pacientů s konkrétním onemocněním a pomocí pozorovaných změn se pokusit objasnit mechanismus působení méně běţných hormonů při různých patofyziologických stavech organismu. Cíle dílčích studií byly voleny takovým způsobem, aby pomohly objasnit alespoň některé z chybějících mezičlánků ve sloţitém mechanismu účinků steroidních hormonů na lidský organismus.
31
3.
MATERIÁL A METODY
Vzhledem ke skutečnosti, ţe metodický postup včetně původu pouţitých chemikálií je podrobně popsán v jednotlivých podkapitolách v části Výsledky, jsou v této kapitole uvedeny pouze zdroje biologického materiálu a základní informace o pouţitých technikách.
3.1. Biologický materiál Pro stanovení fyziologických hladin studovaných steroidů (podkapitola 4.1 a 4.2) byla pouţita zbytková séra nasbíraná během skríninku jodové deficience, který byl organizován Endokrinologickým ústavem mezi lety 2003-2005. Data od pacientů s vrozenou adrenální hyperplazií (podkapitola 4.3) byla sesbírána v průběhu substituční léčby těchto pacientů, která probíhala pod dohledem lékařů z Endokrinologického ústavu. Vzorky tkání varlat pacientů s azoospermií (podkapitola 4.4) byly získány z Urologického oddělení 3. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze. Vzorky tělních tekutin odebraných při porodu (podkapitola 4.5) byly získány na Gynekologicko-porodnické klinice 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. Pouţití biologického materiálu resp. informovaného souhlasu bylo konzultováno a schváleno etickými komisemi příslušných institucí.
3.2. HPLC Pro separaci steroidů byla pouţita vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Princip metody HPLC spočívá v rozdílné afinitě dělených látek ke stacionární a mobilní fázi. V analýzách byla pouţita gradientová eluce, mobilní fázi tvořila směs metanolacetonitril-voda. Separace byla provedena na koloně MACHEREY-NAGEL (Düren, Germany) se stacionární reverzní fází NUCLEOSIL® 100-5 C18. Pouţitý systém Dionex Softron (Germering, Germany) se skládal z HPLC čerpadla P680 vybaveného automatickou kontrolou průtoku, autosamplerem ASI-100, termostatem kolon TCC-100, „Diode Array“ detektorem PDA-100 a sběračem frakcí Foxy Jr. 32
(Teledyne ISCO, Lincoln, NE). Aby se předešlo znečištění kolony, byla do systému zařazena předkolona Phenomenex SecurityGuard (Phenomenex, Torrance, CA).
3.3. GC-MS Plynová chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií kombinuje vysokou separační schopnost kapilární plynové chromatografie s detekcí vysoce specifickou pro daný analyt a zároveň umoţňuje získání informace o struktuře neznámých látek. GC-MS systém od Shimadzu (Kyoto, Japan) se skládal z plynového chromatografu GC-17A a hmotnostního detektoru QP 5050A. Pro separaci byla pouţita středně polární kapilární kolona ZEBRON ZB-50 od firmy Phenomenex (Torrance, CA).
3.4. RIA Pro stanovení koncentrací hormonů byla pouţita kompetitivní radioimunoanalýza, která je velice citlivá a s její pomocí lze detekovat látky přítomné v biologických materiálech ve stopovém mnoţství. Princip této metody je zaloţen na soutěţení neznačeného (stanovovaného) a značeného antigenu obsahujícího identickou nebo alespoň podobnou část molekuly charakteristickou pro rozpoznávání odpovídající protilátkou. Protilátka je v reakci v limitovaném mnoţství a oba antigeny se na ni váţí ve stejném poměru, ve kterém jsou zastoupeny na začátku reakce. Během inkubace vznikají imunokomplexy AgAb
a Ag*Ab a vzhledem k limitovanému mnoţství protilátky
zůstanou v roztoku také volné molekuly Ag a Ag*. Po odstranění Ag a Ag* pomocí aktivního uhlí se změří radioaktivita imunokomplexu Ag*Ab. Naměřená radioaktivita je nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného analytu. Příprava konkrétní metody zahrnovala syntézu haptenů, přípravu imunogenů (konjugaci haptenu s BSA), imunizaci králíků, získání a charakterizaci antiséra, syntézu radioaktivního antigenu a provedení vlastní imunoanalýzy. Měření γ-záření bylo provedeno na dvanáctikanálovém γ-analyzátoru BERTHOLD (Wildbad, Germany).
33
4.
VÝSLEDKY
4.1. Nová
radioimunoanalýza
16α-hydroxy-dehydroepiandrosteronu
a
jeho
fyziologické hodnoty (Zamrazilová et al., 2007) Tato studie byla zaměřena na vývoj nové metody pro stanovení koncentrací 16αOH-DHEA s ohledem na její další moţné rutinní pouţití. Pro přípravu imunogenů byly pouţity dva hapteny odvozené od 16α-OH-DHEA, s vazebným mostem v pozici 7 a 19. Jako vazebný most byla vybrána a pouţita skupina CMO. Syntéza haptenů byla provedena podle jiţ dříve pouţité metody (Pouzar et al., 2003) a jejím výsledným produktem byly 16α-OH-DHEA-7-CMO a 16α-OH-DHEA-19-CMO. Pro konjugaci haptenů s BSA bylo vyuţito dvou odlišných metod. První z nich byla tzv. metoda micelární (Yatsimirskaya et al., 1993) a druhá tzv. metoda smíšeného anhydridu (Cook a Beastall, 1987). Samice králíků byly imunizovány 100 µg dávkami imunogenů v třítýdenních intervalech. Po třetí imunizaci bylo sérum odebráno z ušní ţíly a lyofilizováno. Syntéza radioaktivního antigenu vyţadovala několik kroků. V první fázi byly připraveny TME konjugáty obou haptenů podle modifikované N-hydroxysukcinimidové metody (Lapčík et al., 1996). V následujícím kroku byl ke konjugátům přidán radioaktivní Na[125I] a v roli oxidačního činidla chloramin T. Konjugáty a značené antigeny byly odděleny pomocí TLC. Vlastnímu provedení radioimunoanalýzy předcházela extrakce 2 ml dietyl éteru. Specificita antiséra byla proměřena pomocí tzv. zkříţených reakcí. Antisérum připravené via 19-CMO metodou smíšeného anhydridu vykazovalo nejlepší specificitu, a proto bylo pouţito v další práci. Metoda byla validována a analytická kritéria metody splňovala podmínky spolehlivosti. Test opakovatelnosti metody (intraassay) a test reprodukovatelnosti (interassay) byl proveden 10 paralelními měřeními resp. 8 sadami měření provedenými v různých dnech. Průměrné intra- a inter-assay variační koeficienty byly 8,2 a 11,4 %. Citlivost metody byla 0,017 pmol (5,7pg)/zkumavku. Analytická výtěţnost (recovery) se pohybovala v intervalu od 92,3 do 139 %. Test nezávislosti na ředění byl proveden ve vzorku směsného lidského séra ředěného fyziologickým roztokem. Naměřené koncentrace vztaţené k výchozímu ředění nebyly na ředění závislé.
34
Celkem 18 náhodně vybraných vzorků sér bylo analyzováno pomocí nové RIA metody a současně pomocí jiţ dříve publikované techniky GC-MS (Heřt et al., 2004). Lineární regresí byla při 95 % intervalu spolehlivosti zjištěna vysoce signifikantní závislost dat. S vyuţitím nové metody byla sledována věková závislost hladin 16α-OH-DHEA u muţského a ţenského pohlaví včetně dětí. Bylo změřeno celkem 316 vzorků (od 184 muţů a 132 ţen) a naměřená data byla rozdělena do 9 věkových skupin počínaje dětmi pod 10 let aţ po dospělé nad 60 let. Hodnoty se pohybovaly v intervalu od 0 po 1,864 nmol/l u muţů a od 0 po 1,438 nmol/l u ţen. Data
nevykazovala
normální
rozdělení.
Pouţitím
Kruskall-Wallisova
mnohočetného srovnávacího testu bylo prokázáno, ţe koncentrace 16α-OH-DHEA nezávisí na pohlaví, avšak koncentrace je závislá na věku.
35
Zamrazilová L, Kazihnitková H, Lapčík O, Hill M, Hampl R. 2007. A novel radioimmunoassay
of
16alpha-hydroxy-dehydroepiandrosterone
and
its
physiological levels. J Steroid Biochem Mol Biol 104:130–135.
36
37
38
39
40
41
42
4.2. Nová radioimunoanalýza 7-oxo-dehydroepiandrosteronu a jeho fyziologické hodnoty (Kazihnitková et al., 2007) V této studii jsme se s kolegy zaměřili na vývoj imunoanalytické metody pro stanovení dalšího metabolitu DHEA v lidském séru, konkrétně nekonjugovaného 7oxo-DHEA. Můj vlastní přínos jako spoluautorky spočíval v přípravě některých vzorků lidských sér, provedení vlastní RIA a vyhodnocení naměřených dat. Syntéza haptenu 7-oxo-DHEA-19-CMO vycházela z jiţ dříve publikované metody pro přípravu (19E)-3β-acetoxy-5-androsten-17,19-dion-19-O-metoxy-CMO (Pouzar et al., 2003). Pro zabudování oxo skupiny do steroidní molekuly byl pouţit komplex oxidu chromového s 3,5-dimetylpyrazolem (Salmond et al., 1978). Při přípravě imunogenů byla pro konjugaci haptenu s BSA pouţita micelární metoda podle Yatsimirské (Yatsimirskaya et al., 1993). Získaným imunogenem bylo standardním postupem (Cook a Beastall, 1987) imunizováno šest samic králíků v dávce 100 µg v třítýdenních intervalech. Po třetí imunizaci byla séra odebrána z ušní ţíly a lyofilizována. Radioaktivní antigen, konkrétně pozičně homologní [125I] jodovaný TME konjugát s haptenem, byl připraven pomocí metody vyuţívající chloramin T (Cook a Beastall, 1987). Vlastní konjugát byl připraven pomocí modifikované N-hydroxysukcinimidové metody (Lapčík et al., 1996). Produkt radiojodace byl oddělen pomocí TLC a jeho specifická radioaktivita určena pomocí Chiangovy lineární metody (Chiang et al., 1987). Příprava vzorků pro radioimunoanalýzu vyţadovala dvojitou extrakci dietyl éterem (2 ml). Vodná fáze byla vymraţena v suchém ledu a spojené éterové extrakty odpařeny při 37 °C. Odparky byly následně podrobeny vlastní RIA. Podrobný postup stanovení 7oxo-DHEA v lidském séru uvádíme v práci Kazihnitková et al. (2007). Uvedený postup specifikuje rozsah kalibrační řady, ředění protilátky a radioaktivního antigenu, dávkování roztoků, provedení a dobu inkubace, měření a výpočet neznámých koncentrací pomocí loglogitové transformace. Byly provedeny zkříţené reakce dvou polyklonálních králičích antisér (pracovní označení č. 1 a 4) s 11 chemicky příbuznými steroidy vyskytujícími se v lidském séru. Antisérum č. 4 s niţší zkříţenou reaktivitou bylo vybráno pro další analýzy. Přesnost měření byla stanovena opakovaným proměřením vzorků lidského směsného séra. Intraa inter-assay variační koeficienty získané opakovaným měřením byly 4,1 % a 8,3 %. 43
Citlivost metody byla 0,06 pmol (18 pg)/zkumavku, coţ odpovídá koncentraci 0,12 nmol/l. Hodnoty recovery byly získány z pěti opakovaných měření a pohybovaly se v intervalu od 78,8 do 112 %. Testem nezávislosti na ředění bylo prokázáno, ţe měření nejsou na ředění závislá. Bylo provedeno srovnávací měření tří směsných vzorků ţenských, muţských a dětských sér (< 16 let) pomocí nové RIA metody a pomocí metody GC-MS. Srovnání obou metod přineslo uspokojivé výsledky. Fyziologické hladiny byly proměřeny u 215 subjektů (91 muţů a 124 ţen) bez zjevných endokrinních poruch. Mnoţina zahrnovala široké věkové rozpětí od 5 do 71 let, průměr všech naměřených hodnot ± SD činil 0,280 ± 0,039 a medián byl 0,239 nmol/l. Rozdíly mezi jednotlivými věkovými skupinami byly hodnoceny pomocí KruskalWallisova mnohočetného srovnávacího testu. Signifikantně niţší hladiny byly pozorovány u chlapců mladších 10 let a u děvčat mladších 16 let.
44
Kazihnitková H, Zamrazilová L, Hill M, Lapčík O, Pouzar V, Hampl R. 2007. A novel radioimmunoassay of 7-oxo-DHEA and its physiological levels. Steroids 72:342– 350.
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
4.3. SHBG u pacientů s vrozenou adrenální hyperplazií (Zamrazilová et al., 2010) Tato studie je zaměřena na sledování hladin SHBG, volného testosteronu a dalších laboratorních parametrů u pacientů s CAH, neboť při tomto onemocnění dochází k poruše stejných hormonálních systémů (pohlavního, inzulínového a tyreoidálního), které se uplatňují při biosyntéze SHBG. Bylo zpracováno a statisticky zhodnoceno celkem 300 měření od chlapců a muţů a 456 měření od dívek a ţen s diagnózou CAH a léčených standardní substituční léčbou. Fyziologické hladiny sledovaných hormonů se výrazně mění v závislosti na věku a pohlaví a sledování hladin v absolutních hodnotách bylo z toho důvodu nevhodné. Rozdělení do skupin odráţí, zda se naměřená data pohybují v intervalu fyziologických hodnot nebo nad/pod tímto intervalem. Hodnoty volného testosteronu byly vypočítány z koncentrací celkového testosteronu a SHBG. Do výpočtu byla zahrnuta také asociační konstanta testosteronu s SHBG a s albuminem (Vermeulen a Kaufman, 2002). Hladiny SHBG, TTe a FTe jsme rozdělili do skupin nízkých, normálních a vysokých hodnot v souladu s fyziologickými hladinami v jednotlivých věkových skupinách. Porovnáním procentuálního zastoupení v jednotlivých skupinách bylo pozorováno téměř Gaussovské rozdělení u muţů, zatímco data od ţen vykazovala významný posun SHBG ve směru k nízkým hodnotám a posun FTe k hodnotám vysokým. Stejný princip rozdělení byl pouţit pro hodnoty 17-OH-P a AD, které jsou nejčastěji pouţívanými laboratorními parametry pro sledování efektivnosti substituční terapie u pacientů s CAH. U muţů více neţ 75 % měření 17-OH-P a 50 % AD spadalo do kategorie vysokých hodnot, zatímco u ţen bylo procentuální zastoupení ve skupině vysokých hodnot v obou případech niţší neţ 50 %. K porovnání vztahů mezi naměřenými parametry jsme pouţili vzájemných korelací. Byla vzájemně korelována všechna laboratorní data od muţů i ţen a zvláštní pozornost jsme věnovali vztahu mezi SHBG a 17-OH-P. Podle očekávání byla pozorována silná korelace mezi hodnotami celkového (resp. volného) testosteronu, AD a 17-OH-P, coţ odráţí skutečnost, ţe se jedná o meziprodukty navazujících reakcí při biosyntéze steroidů. Na druhé straně nebyla pozorována ţádná korelace mezi SHBG a 17-OH-P a ani mezi SHBG a celkovým testosteronem.
55
Zamrazilová L, Dvořáková M, Lisá L, Stárka L, Hampl R. 2010. Sex hormone-binding globulin in congenital adrenal hyperplasia. Horm Mol Biol Clin Invest 1:89–93.
56
57
58
59
60
61
62
4.4. Koncentrace předních pohlavních steroidů ve varlatech u lidí Uvedená studie (Zamrazilová et al., unpublished) se zabývá stanovením koncentrací čtyř nejdůleţitějších pohlavních hormonů, konkrétně Te, jeho prekurzoru AD, DHT a E2 v tkáni varlat. Zároveň byly stanoveny koncentrace EpiT, známého svými antiandrogenními účinky. Tkáně pacientů byly získány při biopsii varlat 16 muţů s azoospermií. Pacienti podepsali informovaný souhlas s vyuţitím části odebraného materiálu pro výzkumné účely. Příprava vzorků zahrnovala homogenizaci tkáně, opakovanou extrakci a spojené extrakty byly odpařeny do sucha. Pro účely rozdělení a stanovení všech pěti steroidů z jediného vzorku tkáně byla vyvinuta nová varianta HPLC metody se sběrem frakcí. Odpařené extrakty byly rozděleny pomocí výše zmíněné HPLC metody. Nasbírané frakce se steroidy byly nejprve odpařeny a poté analyzovány pomocí RIA (AD, DHT, EpiT) a pomocí komerčně dostupných kitů (Te, E2). Naměřené hladiny hormonů byly přepočteny na hmotnost nativní testikulární tkáně s ohledem na ztráty, ke kterým dochází při přípravě a vlastním stanovení vzorků. Výsledné koncentrace jednotlivých steroidů se pohybovaly relativně širokém intervalu, pro T od 0,044 do 3,603 nmol/g (medián 0,280), pro DHT od 0,046 do 3,567 nmol/g (medián 0,220), pro AD od 0,007 do 0,104 nmol/g (medián 0,029), pro E2 v rozmezí od 0,001 do 0,356 nmol/g (medián 0,014) a pro EpiT od 0,004 do 0,185 nmol/g (medián 0,037).
63
Zamrazilová L, Heráček J, Hampl R. The content of five sex steroids in human testis. Physiol Res (manuskript poslán spoluautorovi prof. Heráčkovi k posouzení).
64
65
66
67
68
69
70
4.5. Steroidní metabolom v tělních tekutinách plodu a matky ve 3. trimestru těhotenství (Hill et al., 2010a) V poslední studii jsme se zaměřili na úlohu steroidních hormonů při udrţení těhotenství a vyvolání porodu, ale především na prediktivní hodnotu steroidů při předpovědi blíţícího se porodu. Práce má charakter přehledného článku a informace získané v odborné literatuře jsme doplnili vlastními, dosud nepublikovanými výsledky. Na problematiku steroidního metabolomu jsme nahlíţeli z hlediska enzymatického aparátu, který je naprosto nezbytný pro steroidogenezi a metabolismus steroidních hormonů. Poznatky jsme pro lepší přehlednost hodnotili podle orgánů, které se podílejí na biosyntéze a metabolismu steroidů během těhotenství, tj. nadledviny plodu a matky, játra plodu a matky, placenta. Vlastní výsledky zahrnovaly data od ţen, které porodily mezi 28. a 41. týdnem těhotenství. Soubor byl rozdělen na skupinu ţen, které porodily v řádném termínu (po 38. týdnu těhotenství, n = 18) a na skupinu ţen, které porodily předčasně z jiného důvodu neţ v důsledku endokrinopatologie (n = 38). Ve všech případech byly při porodu odebrány vzorky venózní krve matky, pupečníkové vény a arterie a plodové vody. Ve všech těchto tekutinách byl stanoven steroidní metabolický profil, který zahrnoval celkem 69 steroidů a jejich metabolitů. Data byla statisticky zhodnocena vícerozměrnou regresí. Nejlepší výpovědní hodnotu při predikci blíţícího se porodu měla vyšetření naměřená z pupečníkové vény následovaná měřením z pupečníkové arterie, krve matky a relativně nejniţší míru predikce vykazovala vyšetření z plodové vody. Můj přínos jako spoluautorky spočíval ve zpracování části vzorků plodové vody, mateční i pupečníkové krve. Pomocí HPLC jsem v těchto tělních tekutinách stanovila koncentrace glukokortikoidů kortizolu a kortizonu, které odráţí aktivitu enzymu 11β-HSD. Dále jsem se podílela na vyhodnocení vzorků naměřených pomocí metody GC-MS.
71
Hill M, Pařízek A, Cibula D, Kancheva R, Jirásek JE, Jirkovská M, Velíková M, Kubátová J, Klímková M, Pašková A, Ziţka Z, Kancheva L, Kazihnitková H, Zamrazilová L, Stárka L. 2010a. Steroid metabolome in fetal and maternal body fluids in human late pregnancy. J Steroid Biochem Mol Biol (E-pub ahead of print).
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
5. DISKUZE
Méně běţné steroidy byly dlouhou dobu neprávem opomíjené patrně proto, ţe porucha v jejich metabolismu většinou nevede k fatálním změnám organismu. V disertační práci jsem se zaměřila na vybrané dosud neřešené otázky týkající se problematiky méně běţných metabolitů steroidních hormonů. Na tomto místě je vhodné uvést, ţe výzkum jednotlivých metabolitů se nenachází vţdy na stejné úrovni. V některých případech (např. u metabolitů DHEA) je výzkum v počátcích, poznatky v odborné literatuře útrţkovité, a proto bylo vzhledem k absenci vhodného metodického přístupu potřebné vyvinout citlivou metodu a stanovit fyziologické rozpětí v krvi člověka. V jiných případech (např. u epitestosteronu či SHBG) probíhá jiţ několik desetiletí intenzivní výzkum těchto metabolitů, některé jsou dokonce v klinické praxi stanovovány rutinně, a proto bylo moţné se zaměřit na objasnění hlubších souvislostí mezi vybranými metabolity a některými onemocněními. Ačkoliv jsou 16-hydroxylované metabolity DHEA známé jiţ z padesátých let dvacátého století (Fotherby et al., 1957), existuje pouze hrstka studií, které se zabývají tímto tématem (např. Shackleton et al., 1968). Stanovení hladin 16α-OH-DHEA slouţilo především ke sledování funkce fetoplacentální jednotky v průběhu těhotenství a pro tyto účely byla pouţívána technika GC-MS. Metoda plynové chromatografie byla pouţita také kolegy z Endokrinologického ústavu (Heřt et al., 2004) pro sledování hladin tohoto metabolitu v lidském ejakulátu. Dosud jediná úspěšná RIA byla vyvinuta v sedmdesátých letech minulého století (Furuya et al., 1976). Studie se opět týkala těhotenství a rovněţ zahrnovala měření hladin 16α-OH-DHEA v pupečníkové krvi. Nevýhodou této RIA byla nízká specificita. Uvedená práce (Zamrazilová et al., 2007) představuje rychlou, citlivou a zároveň specifickou imunoanalýzu 16α-OH-DHEA, která vyhovuje účelům plošného screeningu. Porovnáním koncentrací naměřených novou RIA metodou s dříve jiţ zmíněnou metodou GC-MS (Heřt et al., 2004) byla prokázána signifikantní závislost, avšak technikou GC-MS byly naměřeny vyšší hladiny tohoto steroidu v porovnání s RIA. Jednalo se především o případy s celkově niţšími koncentracemi sledovaného hormonu. Tento jev můţe být
92
připisován niţší citlivosti techniky GC-MS, která vyţaduje desetkrát větší objem (1 ml) zpracovávaného séra v porovnání s RIA (100 μl). U reprezentativního vzorku zdravé lidské populace byly změřeny hladiny 16α-OHDHEA a naměřená data byla porovnána s dosud jedinou dostupnou studií zabývající se touto problematikou (Furuya et al., 1976). Námi naměřené koncentrace byly podle očekávání niţší neţ koncentrace naměřené japonskými autory, jejichţ data pocházela z pupečníkové krve a od ţen mezi 38. - 40. týdnem těhotenství. Hladiny 16αhydroxylovaných metabolitů byly srovnatelné s fyziologickými hladinami produktů konkurenční metabolické dráhy, která vede k 7-hydroxylovaným metabolitům DHEA (Hampl et al., 2001). Změny hladin 16α-OH-DHEA v závislosti na věku připomínají změny hladin vlastního DHEA, avšak v případě hydroxylovaného metabolitu byly nejvyšší koncentrace zjištěny u obou pohlaví o téměř 10 let později neţ u jeho prekurzoru DHEA (Šulcová et al., 1997). Vyšší hladiny 16α-OH-DHEA bývají skloňovány v souvislosti s některými onemocněními, např. rakovinou prsu (Raju et al., 1989). Současně 16α-hydroxylace DHEA představuje konkurenční enzymatickou reakci k 7-hydroxylaci a lze tudíţ předpokládat, ţe účinky 16α-OH-DHEA budou opačné vůči 7-hydroxylovaným metabolitům DHEA. Pomocí předkládané metody bychom rádi ověřili hypotézu, zda se 16-hydroxylované DHEA nenacházejí ve zvýšených sérových koncentracích u pacientů s onkologickými onemocněními štítné ţlázy a s endokrinními a autoimunitními chorobami, zejména tyreopatiemi.
Přestoţe bylo popsáno jiţ mnoho studií zabývajících se metabolismem DHEA, pouze dvě práce se týkají 7-oxo-DHEA v krvi u lidí (Marwah et al., 1999; Matsuzaki et al., 2004). První zmíněná je HPLC metoda pro stanovení sulfátu 7-oxo-DHEA, která však vykazovala nedostatečnou citlivost. Druhou je opět chromatografická metoda, tentokrát GC-MS, která slouţila ke stanovení nekonjugovaného 7-oxo-DHEA, jeho prekurzoru a dalších 7-oxidovaných metabolitů v lidské krvi, avšak v této studii se výsledky pohybovaly v příliš širokém rozpětí hodnot. Naše práce (Kazihnitková et al., 2007) představuje ekonomicky nenáročnou a jednoduchou radioimunoanalytickou variantu pro stanovení 7-oxo-DHEA v lidském séru. 93
Relativně vysoká specificita byla dosaţena pouţitím antiséra získaného pomocí haptenu konjugovaného s BSA přes 19-oxo-skupinu na steroidní molekule. Analytická kritéria metody přesnost, citlivost a správnost měření byla uspokojivá. Výsledky byly porovnány s technikou GC-MS. Námi pouţitá GC-MS vykazovala niţší citlivost v porovnání s metodou uvedenou v literatuře (Matsuzaki et al., 2004) a tudíţ bylo nutné pouţít větší objem materiálu do analýzy. Pomocí RIA jsme naměřili průměrně vyšší hodnoty 7-oxoDHEA v porovnání s hodnotami naměřenými pomocí GC-MS, coţ mohlo být způsobeno zkříţenou reaktivitou antiséra s DHEA. Ačkoliv zkříţené reakce s DHEA byly pouze 0,45 %, jejich vliv není zanedbatelný, vezmeme-li v úvahu, ţe DHEA se v lidském oběhu vyskytuje v koncentracích v řádech jednotek aţ desítek nmol (Šulcová et al., 1997). Metoda byla podobně jako v případě 16α-OH-DHEA dále vyuţita pro sledování fyziologických hladin v séru lidí. Bylo to vůbec poprvé, kdy byl proměřen takto velký soubor zdravých osob (n = 215). Závislost koncentrace 7-oxo-DHEA na věku se lišila od trendu pozorovaného u samotného DHEA i obou jeho 7-hydroxylovaných metabolitů (Šulcová et al., 1997; Hampl et al., 2001). Podobnost s DHEA a jeho 7-hydroxylovanými metabolity jsme nalezli ve velmi nízkých koncentracích v časném dětství následovaných jejich nárůstem od puberty. Překvapivé bylo naměření nejniţších hodnot 7-oxo-DHEA u obou pohlaví ve věkové skupině mezi 36-50 lety. Vývoj nenákladné a časově nenáročné metody pro stanovení 7-oxo-DHEA a určení jeho fyziologických koncentrací v lidské krvi byl prvním krokem ke studiu tohoto metabolitu při patologických stavech organismu. V navazujících studiích jsme se zaměřili na sledování tohoto steroidu u pacientů s poruchami štítné ţlázy, které jak známo ovlivňují termoregulační procesy v organismu.
Další studie se týká hladin SHBG u pacientů s vrozenou adrenální hyperplazií (Zamrazilová et al., 2010). Toto váţné onemocnění je charakterizované nadprodukcí adrenálních androgenů spojenou se zhoršenou citlivostí k inzulinu, hyperinzulinemií a často také hypotyreoidismem. Dochází tedy k poruše stejných hormonálních systémů, jaké se podílejí na biosyntéze SHBG, tedy pohlavního, inzulínového a tyreoidálního. Existuje pouze několik prací, které zmiňují SHBG u pacientů s CAH, avšak ţádná z nich není zaměřena přímo na stanovení a sledování hladin SHBG (Montalto et al., 1990; 94
Savage et al., 2002). Nejdůleţitějším výstupem naší studie bylo zjištění, ţe u ţen dochází k statisticky významnému posunu hladin SHBG směrem k niţším hodnotám a v důsledku toho k posunu volného testosteronu k hodnotám vyšším. U muţů posun pozorován nebyl a rozdělení hodnot bylo téměř Gaussovské. Vysvětit toto pozorování lze tím, ţe SHBG, jak jiţ bylo uvedeno dříve, je zapojen minimálně ve třech endokrinních osách: gonadální, inzulární a tyreoidální. Obecně vyšší hladiny androgenů sniţují koncentrace SHBG. U ţen s CAH je na rozdíl od muţů značný podíl androgenů nadledvinového původu, coţ můţe způsobovat rozdíly v hladinách testosteronu a následně i SHBG. Hyperinzulinémie byla také popsána u pacientů s CAH (Pugeat et al., 2000; Charmandari et al., 2002). Vyšší koncentrace FTe a sníţené koncentrace SHBG jsou spojovány se zvýšenými hladinami glukózy v krvi, s hyperinzulinémií a zvýšenou inzulínovou rezistencí (Haffner, 1996). Ukázalo se, ţe v případě onemocnění hyperinzulinémií a inzulínovou rezistencí můţe SHBG slouţit jako doplňkový marker těchto onemocnění (Nestler, 1993). Bylo zároveň zjištěno, ţe inzulínová rezistence s hyperinzulinémií a v důsledku toho sníţení SHBG mohou být vyvolané léčbou glukokortikoidy (Wallace et al., 2003; Vihinen et al., 2008). Inzulínová rezistence a hyperandrogenémie jsou doprovázeny sníţenými hladinami SHBG a ukazují na podobnost mezi CAH a syndromem polycystických ovarií navzdory skutečnosti, ţe současná přítomnost obou poruch je velmi vzácná (Gordon, 1999; Fanta et al., 2008). V souvislosti s tyreoidální osou SHBG pozitivně koreluje s biologicky aktivními volnými hormony štítné ţlázy (Hampl et al., 2003). Onemocnění CAH je často spojeno s vrozeným hypotyreoidismem a současná přítomnost obou onemocnění patří mezi nejčastější kombinace vrozených endokrinních poruch (Zaffanello et al., 2005). Informace o hladinách hormonů štítné ţlázy u našich CAH pacientů nebyly bohuţel dostupné, a proto o vlivu tyreoidálních hormonů na hladiny SHBG můţeme pouze spekulovat. Skutečnost, ţe nebyla pozorována ţádná korelace mezi SHBG a 17-OH-P, naznačuje, ţe SHBG je relativně nezávislou proměnnou. Je moţné předpokládat, ţe zatímco 17-OH-P a AD odráţejí vliv substituční léčby pacientů s CAH, tak niţší hladiny SHBG spojené s těmito pacienty jsou na substituční léčbě nezávislé.
95
V předposlední studii (Zamrazilová et al., unpublished), ve které jsme sledovali koncentrace pohlavních hormonů v lidské testikulární tkáni, jsme naměřili niţší koncentrace testosteronu v porovnání s Levalleho studií (Levalle et al., 1994), autoři však nepouţili chromatografické dělení steroidů. Naměřené hodnoty E2 a AD řádově odpovídaly hodnotám naměřeným ve studiích jiných autorů (Takahashi et al., 1982; Levalle et al., 1994). Naše práce je první, která se zabývá současným stanovením všech pěti steroidů z jednoho vzorku tkáně, čehoţ bylo docíleno pomocí HPLC v kombinaci se sběrem a kvantitativním stanovením jednotlivých frakcí. Relativně nízký počet vzorků pacientů nám neumoţnil statistické zhodnocení závislosti naměřených dat se stavem pacientů, avšak metodu bude moţné pouţít při dalších studiích zaměřených na sledování pohlavních hormonů v tkáních.
V poslední studii (Hill et al., 2010a) jsme se pokusili vyluštit otázku týkající se biosyntézy hlavního hormonu těhotenství, progesteronu, ale i dalších méně běţných steroidů. Navzdory četným studiím v oblasti lidského prenatálního vývoje a porodu nebyla dosud otázka původu a funkce steroidů při těchto dějích dostatečně zodpovězena. Při hledání řešení jsme do úvah mimo jiné zahrnuli působení placentárního kortikoliberinu (CRH), tvorbu bioaktivních steroidů ve fetální nadledvině a přítomnost enzymů s oxidoredukční aktivitou v placentě. Poznatky získané v odborné literatuře podporují výsledky naměřené na našem pracovišti (Hill et al., 2009 a, b). Je zřejmé, ţe mechanismus působení a účinků méně běţných steroidů je komplexní a nesmírně sloţitý jev a jeho výzkum ještě zdaleka není u konce. V současné době naše pracoviště spolupracuje s Radioterapeuticko-onkologickým oddělením FN Motol, kde probíhá sběr materiálu u vytipovaných pacientů s rakovinou štítné ţlázy. U těchto pacientů zamýšlíme sledovat metabolické změny méně běţných steroidů. Zároveň probíhá vyhledávání pacientů Endokrinologického ústavu s prvotním záchytem hypo- a hypertyreóz, u kterých předpokládáme změny koncentrací 7-oxo-DHEA v souvislosti se změnami tyreoidálních hormonů.
96
6. ZÁVĚR
Předkládaná disertační práce v úvodu shrnuje nejdůleţitější poznatky o vybraných méně běţných hormonech, které byly do nedávné doby povaţované za pouhé meziprodukty nebo dokonce odpadní produkty metabolických drah známých hormonálně aktivních steroidů. Tyto metabolity nepůsobí jako klasické hormony na úrovni regulace exprese genů, ale o to zajímavější a rozmanitější je jejich působení. Méně běţné steroidní hormony působí tzv. negenomovými účinky, mají schopnost modulovat účinek „hlavních“ hormonů, regulují aktivitu enzymů, transkripčních faktorů, ale i propustnost iontových kanálů. Jejich vliv byl pozorován při stále častějších autoimunitních a onkologických onemocněních, termoregulačních dějích, poruchách štítné ţlázy, inzulinové rezistenci a dalších. V disertační práci jsem se zaměřila na vybrané, dosud neřešené otázky úlohy méně běţných steroidů a také SHBG, jakoţto spojovacího článku tří endokrinních systémů, jejichţ zodpovězení můţe pomoci porozumění sloţitému mechanismu působení těchto hormonů na lidský organismus. V případě metabolitů 16α-OH-DHEA a 7-oxo-DHEA byly práce (Zamrazilová et al., 2007; Kazihnitková et al., 2007) zaměřeny na vývoj vyhovujícího metodického přístupu, neboť do té doby pouţívané metody vykazovaly nízkou citlivost a specificitu. Podařilo se nám vyvinout a statisticky zhodnotit nové radioimunoanalytické metody, které pro svou rychlost, relativní ekonomickou nenáročnost a vyhovující statistická kritéria je moţné pouţít při dalších výzkumných činnostech i v rutinní praxi. Nové metody jsme zároveň vyuţili ke stanovení metabolitů u statisticky významného vzorku zdravé populace, čímţ se nám podařilo určit fyziologické rozpětí hodnot. V následující studii (Zamrazilová et al., 2010) jsme se zabývali vztahy vybraných steroidních metabolitů a SHBG u pacientů s CAH. Předpokládali jsme, ţe SHBG můţe vedle AD a 17-OH-P figurovat jako nesteroidní laboratorní ukazatel odráţející účinnost substituční léčby těchto pacientů. Náš předpoklad se však nepotvrdil. Pozorovali jsme niţší hladiny SHBG, které při nejmenším u ţen odráţejí spíše působení inzulínové či tyreoidální osy neţ účinnost vlastní léčby.
97
V předposlední studii (Zamrazilová et al., unpublished) jsme se zabývali stanovením pěti pohlavních hormonů v testikulární tkáni, neboť lokální koncentrace hormonů v tkáních odráţí daleko lépe stav daného orgánu neţ sérové koncentrace, které informují především o celkovém stavu organismu. Byl vypracován nový metodický přístup pro stanovení všech pěti steroidů z jednoho vzorku tkáně s vyuţitím separace hormonů pomocí HPLC. Data odpovídala hodnotám naměřeným jinou technikou. Poslední práce (Hill et al., 2010a) shrnuje dosavadní poznatky týkající se klíčové role progesteronu a méně běţných steroidů při udrţení těhotenství a iniciaci porodu. Byla pozorována zvýšená produkce a sníţený katabolismus progesteronu s blíţícím se porodem. Bylo dále potvrzeno, ţe dochází ke sníţené produkci těhotenství udrţujících 5βpregnanových steroidů zodpovědných za utlumení činnosti dělohy v pozdním těhotenství. Pozorovaná zvýšená sulfatace neuroinhibičních a těhotenství udrţujících steroidů vedla ke změně biologické aktivity příslušných steroidů. V neposlední řadě byl naznačen alternativní mechanismus biosyntézy progesteronu, který můţe souviset s přítomností enzymů s oxidoredukční aktivitou v placentě, které vedou ke změnám rovnováhy oxidovaných a redukovaných forem hormonů.
98
7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
Attal-Khémis S, Dalmeyda V, Morfin R. 1998. Change of 7alpha-hydroxydehydroepiandrosterone levels in serum of mice treated by cytochrome P450modifying agents. Life Sci 63:1543–1553. Bácsi K, Kósa JP, Borgulya G, Balla B, Lazáry A, Nagy Z, Horváth C, Speer G, Lakatos P. 2007. CYP3A7*1C polymorphism, serum dehydroepiandrosterone sulfate level, and bone mineral density in postmenopausal women. Calcif Tissue Int 80:154–159. Baulieu EE. 1996. Dehydroepiandrosterone (DHEA): a fountain of youth? J Clin Endocrinol Metab 81:3147–3151. Bellemare V, Faucher F, Breton R, Luu-The V. 2005. Characterization of 17alphahydroxysteroid dehydrogenase activity (17alpha-HSD) and its involvement in the biosynthesis of epitestosterone. BMC Biochem 6:12. Bičíková M, Hampl R, Stárka L. 1992. Epitestosterone-a potent competitive inhibitor of C21-steroid side chain cleavage in the testis. J Steroid Biochem Mol Biol 43:721– 724. Bičíková M, Hampl R, Hill M, Stárka L. 1993a. Inhibition of steroid 17 alpha-hydroxylase and C17,20-lyase in the human testis by epitestosterone. J Steroid Biochem Mol Biol 46:515–518. Bičíková M, Kanceva R, Lapčík O, Hill M, Stárka L. 1993b. The effect of epitestosterone on the plasma levels of LH and FSH in ovariectomized immature rats. J Steroid Biochem Mol Biol 45:321–324. Bičíková M, Hill M, Hampl R, Stárka L. 1997. Inhibition of rat renal and testicular 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase by some antihypertensive drugs, diuretics, and epitestosterone. Horm Metab Res 29:465–468. Bičíková M, Hampl R. 2004. Neurosteroidy – deriváty progesteronu. Psychiatrie 8:29–31.
99
Bílek R, Hampl R, Putz Z, Stárka L. 1987. Radioimmunoassay of epitestosterone: methodology, thermodynamic aspects and applications. J Steroid Biochem 28:723– 729. Bobyleva V, Kneer N, Bellei M, Battelli D, Lardy HA. 1993. Concerning the mechanism of increased thermogenesis in rats treated with dehydroepiandrosterone. J Bioenerg Biomembr 25:313–321. Bobyleva V, Bellei M, Kneer N, Lardy H. 1997. The effects of the ergosteroid 7-oxodehydroepiandrosterone
on
mitochondrial
membrane
potential:
possible
relationship to thermogenesis. Arch Biochem Biophys 341:122–128. Bowers LD. 2008. Testosterone doping: dealing with genetic differences in metabolism and excretion. J Clin Endocrinol Metab 93:2469–2471. Bradlow HL, Hershcopf R, Martucci C, Fishman J. 1986. 16 alpha-hydroxylation of estradiol: a possible risk marker for breast cancer. Ann N Y Acad Sci 464:138–151. Brenta G, Schnitman M, Gurfinkiel M, Damilano S, Pierini A, Sinay I, Pisarev MA. 1999. Variations of sex hormone-binding globulin in thyroid dysfunction. Thyroid 9:273– 277. Brucker C, Lipford GB. 1995. The human sperm acrosome reaction: physiology and regulatory mechanisms. An update. Hum Reprod Update 1:51–62. Catlin DH, Leder BZ, Ahrens BD, Hatton CK, Finkelstein JS. 2002. Effects of androstenedione administration on epitestosterone metabolism in men. Steroids 67:559–564. Clark LC Jr, Kochakian CD. 1947. The in vitro metabolism of testosterone to Delta 4androstenedione-3,17, cis-testosterone, and other steroids by rabbit liver slices. J Biol Chem 170:23–33. Clark LC Jr, Kochakian CD, Lobotsky J. 1947. The in vitro metabolism of Delta 4androstenedione-3,17 to testosterone, cis-testosterone, and several unidentified steroids. J Biol Chem 171:493–500. 100
Cook B, Beastall GH. 1987. Measurement of steroid hormone concentrations in blood, urine and tissues. In: Green B, Leake RE, editors. Steroid hormones, a Practical Approach. Oxford: IRL Press Limited. p 1–65. Davidson M, Marwah A, Sawchuk RJ, Maki K, Marwah P, Weeks C, Lardy H. 2000. Safety and pharmacokinetic study with escalating doses of 3-acetyl-7-oxodehydroepiandrosterone in healthy male volunteers. Clin Invest Med 23:300–310. Daynes RA, Araneo BA, Dowell TA, Huang K, Dudley D. 1990. Regulation of murine lymphokine production in vivo. III The Lymphoid Tissue microenvironment Exerts Regulatory Influences over T Helper Cell Function. J Exp Med 171:979–996. Delbeke FT, Van Eenoo P, Van Thuyne W, Desmet N. 2002. Prohormones and sport. J Steroid Biochem Mol Biol 83:245–251. Donike M, Barwald KR, Klostermann K, Schanzer W, Zimmermann J. 1983. Nachweis von exogenem testosterone (The detection of exogenous testosterone). In: Heck H, Hollmann H, Liesen H,Rost R, editors. Sport: Leistung und Gesundheit. Köln: Deutscher Ärzte Verlag. p 293–298. Doostzadeh J, Morfin R. 1996. Studies of the enzyme complex responsible for pregnenolone and dehydroepiandrosterone 7 alpha-hydroxylation in mouse tissues. Steroids 61:613–620. Falany CN. 1997. Enzymology of human cytosolic sulfotransferases. FASEB J 11:206– 216. Fanta M, Cibula D, Vrbíková J. 2008. Prevalence of nonclassic adrenal hyperplasia (NCAH) in hyperandrogenic women. Gynecol Endocrinol 24:154–157. Fitzpatrick JL, Ripp SL, Smith NB, Pierce WM Jr, Prough RA. 2001. Metabolism of DHEA by cytochromes P450 in rat and human liver microsomal fractions. Arch Biochem Biophys 389:278–287.
101
Fotherby K, Colas A, Atherden SM, Marrian GF. 1957. The isolation of 16alphahydroxydehydroepiandrosterone (3 beta:16 alpha-dihydroxyandrost-5-en-17-one) from the urine of normal men. Biochem J 66:664–669. Fukushima DK, Kemp AD, Schneider R, Stokem MB, Gallagher TF. 1954. Studies in steroid metabolism. XXV. Isolation and characterization of new urinary steroids. J Biol Chem 210:129–137. Furuya K, Yoshida T, Takagi S, Kanbegawa A, Yamashita H. 1976. Radioimmunoassay of 16alpha-hydroxy-dehydroepiandrosterone and its sulfate. Steroids 27:797–812. Gomez-Sanchez EP, Ganjam V, Chen YJ, Cox DL, Zhou MY, Thanigaraj S, GomezSanchez CE. 1997. The sheep kidney contains a novel unidirectional, high affinity NADP(+)-dependent 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase (11 beta-HSD-3). Steroids 62:444–450. Goodarzi MO, Xu N, Azziz R. 2008. Association of CYP3A7*1C and serum dehydroepiandrosterone sulfate levels in women with polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab 93:2909–2912. Goodyer CG, Branchaud CL. 1981. Regulation of hormone production in the human fetoplacental unit. Ciba Found Symp 86:89–123. Gordon CM. 1999. Menstrual disorders in adolescents. Excess androgens and the polycystic ovary syndrome. Pediatr Clin North Am 46:519–543. Haffner SM. 1996. Sex hormone-binding protein, hyperinsulinemia, insulin resistance and noninsulin-dependent diabetes. Horm Res 45:233–237. Hakkola J, Pasanen M, Purkunen R, Saarikoski S, Pelkonen O, Mäenpää J, Rane A, Raunio H. 1994. Expression of xenobiotic-metabolizing cytochrome P450 forms in human adult and fetal liver. Biochem Pharmacol 48:59–64. Hampl R, Stárka L. 1969. Epimerisation of naturally occuring C-19 steroid allylic alcohols by rat liver preparations. Europ J Steroids (later J Steroid Biochem) 1:47–56.
102
Hampl R, Stárka L. 1996. Sex hormone-binding globulin in endocrine regulation. (Minireview). Endocr Regul 30:57–65. Hampl
R,
Morfin
R,
Stárka
L.
1997.
7-Hydroxylated
derivatives
of
dehydroepiandrosterone: what are they good for? Endocrine Regul 31:211–218. Hampl R, Stárka L. 1998. Dehydroepiandrosteron "hormon mládí" ve světle současných poznatků. Čas Lék čes 137:8–12. Hampl R, Stárka L. 2000a. Hydroxylated Metabolites of Dehydroepiandrosterone – New Steroid Markers of Immune Function? Biomarkers and Environment 3:18–21. Hampl R, Stárka L. 2000b. Minireview: 16alpha-hydroxylated metabolites of dehydroepiandrosterone and their biological significance. Endocr Regul 34:161– 163. Hampl R, Hill M, Stárka L. 2001a. 7-Hydroxydehydroepiandrosterone epimers in the life span. J Steroid Biochem Mol Biol 78:367–372. Hampl R, Šnajderová M, Lébl J, Lisá L, Dvořáková M, Hill M, Šulcová J, Stárka L. 2001b. Sex hormone-binding globulin as a marker of the effect of hormonal treatment in Turner's syndrome. Endocr Regul 35:17–24. Hampl R, Kancheva R, Hill M, Bičíková M, Vondra K. 2003. Interpretation of sex hormone-binding globulin levels in thyroid disorders. Thyroid 13:755–760. Hampl R, Bičíková M, Stárka L. 2004. Neuroaktivní deriváty dehydroepiandrosteronu. Psychiatrie 8:24–28. Havlíková H, Hill M, Hampl R, Stárka L. 2002. Sex- and age-related changes in epitestosterone in relation to pregnenolone sulfate and testosterone in normal subjects. J Clin Endocrinol Metab 87:2225–2231. Hennebert O, Pernelle C, Ferroud C, Morfin R. 2007a. 7alpha- and 7beta-hydroxyepiandrosterone as substrates and inhibitors for the human 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1. J Steroid Biochem Mol Biol 105:159–165.
103
Hennebert O, Le Mée S, Pernelle C, Morfin R. 2007b. 5Alpha-androstane3beta,7alpha,17beta-triol
and
5alpha-androstane-3beta,7beta,17beta-triol
as
substrates for the human 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1. Steroids 72:855–864. Hennebert O, Montes M, Favre-Reguillon A, Chermette H, Ferroud C, Morfin R. 2009. Epimerase activity of the human 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 on 7hydroxylated C19-steroids. J Steroid Biochem Mol Biol 114:57–63. Heřt J, Hill M, Hampl R. 2004. Gas chromatographic-mass spectrometric identification of 16alpha-hydroxy-dehydroepiandrosterone in human seminal plasma. Steroids 69:773–777. Hill M, Hampl R, Petřík R, Stárka L. 1996. Concentration of the endogenous antiandrogen epitestosterone and androgenic C19-steroids in hyperplastic prostatic tissue. Prostate 28:347–351. Hill M, Pařízek A, Jirásek JE, Jirkovská M, Velíková M, Dušková M, Klímková M, Pašková A, Ţiţka Z, Germanová A, Koucký M, Kalousová M, Stárka L. 2009a. Is maternal progesterone actually independent of the fetal steroids? Physiol Res 59:211–224. Hill M, Pařízek A, Kancheva R, Dušková M, Velíková M, Kříţ L, Klímková M, Pašková A, Ţiţka Z, Matucha P, Meloun M, Stárka L. 2009b. Steroid metabolome in plasma from the umbilical artery, umbilical vein, maternal cubital vein and in amniotic fluid in normal and preterm labor. J Steroid Biochem Mol Biol 121:594– 610. Hill M, Pařízek A, Cibula D, Kancheva R, Jirásek JE, Jirkovská M, Velíková M, Kubátová J, Klímková M, Pašková A, Ziţka Z, Kancheva L, Kazihnitková H, Zamrazilová L, Stárka L. 2010a. Steroid metabolome in fetal and maternal body fluids in human late pregnancy. J Steroid Biochem Mol Biol (E-pub ahead of print). Hill M, Zárubová J, Marusič P, Vrbíková J, Velíková M, Kancheva R, Kancheva L, Kubátová J, Dušková M, Zamrazilová L, Kazihnitková H, Šimůnková K, Stárka L.
104
Effects of valproate and carbamazepine monotherapy on neuroactive steroids, their precursors and metabolites in adult men with epilepsy. 2010b. J Steroid Biochem Mol Biol (E-pub ahead of print). Hubener HJ, Fukushima DK, Gallagher TF. 1956. Substrate specificity of enzymes reducing the 11- and 20-keto groups of steroids. J Biol Chem 220:499–511. Charmandari E, Weise M, Bornstein SR, Eisenhofer G, Keil MF, Chrousos GP, Merke DP. 2002. Children with classic congenital adrenal hyperplasia have elevated serum leptin concentrations and insulin resistance: potential clinical implications. J Clin Endocrinol Metab 87:2114–2120. Chiang CS. 1987. A linear method for determining specific activity of tracers in radioimmunoassays. Clin Chem 33:1245–1247. Chmielewski V, Drupt F, Morfin R. 2000. Dexamethasone-induced apoptosis of mouse thymocytes: prevention by native 7alpha-hydroxysteroids. Immunol Cell Biol 78:238–246. Ingelman-Sundberg M, Sim SC, Gomez A, Rodriguez-Antona C. 2007. Influence of cytochrome
P450
polymorphisms
on
drug
therapies:
pharmacogenetic,
pharmacoepigenetic and clinical aspects. Pharmacol Ther 116:496–526. Kalimi M, Shafagoj Y, Loria R, Padgett D, Regelson W. 1994. Anti-glucocorticoid effects of dehydroepiandrosterone (DHEA). Mol Cell Biochem 131:99–104. Kazihnitková H, Zamrazilová L, Hill M, Lapčík O, Pouzar V, Hampl R. 2007. A novel radioimmunoassay of 7-oxo-DHEA and its physiological levels. Steroids 72:342– 350. Khalil MW, Strutt B, Vachon D, Killinger DW. 1994. Effect of dexamethasone and cytochrome
P450
inhibitors
on
the
formation
of
7
alpha-
hydroxydehydroepiandrosterone by human adipose stromal cells. J Steroid Biochem Mol Biol 48:545–552.
105
Kim SB, Chalbot S, Pompon D, Jo DH, Morfin R. 2004. The human cytochrome P4507B1: catalytic activity studies. J Steroid Biochem Mol Biol 92:383–389. Kitada M, Tsukidate K, Takeuchi J, Taneda M, Komori M, Ohi H, Itahashi K, Kamataki T. 1989. Immunochemical studies for the presence of P-450 HFLa, a form of cytochrome P-450 in human fetal livers in human hepatocellular carcinoma cells. J Pharmacobiodyn 12:341–344. Koch I, Weil R, Wolbold R, Brockmöller J, Hustert E, Burk O, Nuessler A, Neuhaus P, Eichelbaum M, Zanger U, Wojnowski L. 2002. Interindividual variability and tissue-specificity in the expression of cytochrome P450 3A mRNA. Drug Metab Dispos 30:1108–1114. Komori M, Nishio K, Kitada M, Shiramatsu K, Muroya K, Soma M, Nagashima K, Kamataki T. 1990. Fetus-specific expression of a form of cytochrome P-450 in human livers. Biochemistry 29:4430–4433. Korenman SG, Wilson H, Lipsett MB. 1964. Isolation of 17a-hydroxyandrost-4-en-3-one (epitestosterone) from human urine. J Biol Chem 239:1004–1006. Kříţ L, Bičíková M, Mohapl M, Hill M, Černý I, Hampl R. 2008. Steroid sulfatase and sulfuryl transferase activities in human brain tumors. J Steroid Biochem Mol Biol 109:31–39. Kuehl P, Zhang J, Lin Y, Lamba J, Assem M, Schuetz J, Watkins PB, Daly A, Wrighton SA, Hall SD, Maurel P, Relling M, Brimer C, Yasuda K, Venkataramanan R, Strom S, Thummel K, Boguski MS, Schuetz E. 2001. Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. Nat Genet 27:383–391. Labrie F, Bélanger A, Cusan L, Candas B. 1997. Physiological changes in dehydroepiandrosterone are not reflected by serum levels of active androgens and estrogens but of their metabolites: intracrinology. J Clin Endocrinol Metab 82:2403–2409.
106
Labrie F, Bélanger A, Luu-The V, Labrie C, Simard J, Cusan L, Gomez JL, Candas B. 1998. DHEA and the intracrine formation of androgens and estrogens in peripheral target tissues: its role during aging. Steroids 63:322–328. Lacroix D, Sonnier M, Moncion A, Cheron G, Cresteil T. 1997. Expression of CYP3A in the human liver – evidence that the shift between CYP3A7 and CYP3A4 occurs immediately after birth. Eur J Biochem 247:625–634. Lapčík O, Perheentupa A, Bičíková M, Huhtaniemi I, Hampl R, Stárka L. 1994. The effect of epitestosterone on gonadotrophin synthesis and secretion. J Endocrinol 143:353– 358. Lapčík O, Hampl R, Hill M, Stárka L. 1995. Plasma levels of epitestosterone from prepuberty to adult life. J Steroid Biochem Mol Biol 55:405–408. Lapčík O, Hampl R, Hill M, Stárka L, Kasal A, Pouzar V, Putz Z. 1996. Radioimmunological and chromatographic properties of tyrosine methyl ester conjugates with stereoisomeric steroid carboxy derivates. Coll Czech Chem Commun 61:779–807. Lapčík O, Hampl R, Hill M, Bičíková M, Stárka L. 1998. Immunoassay of 7hydroxysteroids: 1. Radioimmunoassay of 7beta-hydroxy dehydroepiandrosterone. J Steroid Biochem Mol Biol 67:439–445. Lapčík O, Hampl R, Hill M, Stárka L. 1999. Immunoassay of 7-hydroxysteroids: 2. Radioimmunoassay of 7alpha-hydroxy-dehydroepiandrosterone. J Steroid Biochem Mol Biol 71:231–237. Lardy H, Partridge B, Kneer N, Wei Y. 1995. Ergosteroids: induction of thermogenic enzymes in liver of rats treated with steroids derived from dehydroepiandrosterone. Proc Natl Acad Sci U S A 92:6617–6619. Lardy H, Kneer N, Wei Y, Partridge B, Marwah P. 1998. Ergosteroids. II: Biologically active metabolites and synthetic derivatives of dehydroepiandrosterone. Steroids 63:158–165.
107
Leeder JS, Gaedigk R, Marcucci KA, Gaedigk A, Vyhlidal CA, Schindel BP, Pearce RE. 2005. Variability of CYP3A7 expression in human fetal liver. J Pharmacol Exp Ther 314:626–635. Levalle OA, Zylbersztein C, Aszpis S, Mariani V, Ponzio R, Aranda C, Guitelman A, Scaglia HE. 1994. Serum luteinizing hormone pulsatility and intratesticular testosterone and oestradiol concentrations in idiopathic infertile men with high and normal follicle stimulating hormone serum concentrations.Hum Reprod 9:781–787. Lindner HR. 1961. Androgens and related compounds in the spermatic vein blood of domestic animals.
II. Species-linked differences in
the metabolism of
androstenedione in blood. J Endocrinol 23:161–166. Loria RM, Inge TH, Cook SS, Szakal AK, Regelson W. 1988. Protection against acute lethal viral infections with the native steroid dehydroepiandrosterone (DHEA). J Med Virol 26:301–314. Maruyama M, Matsunaga T, Harada E, Ohmori S. 2007. Comparison of basal gene expression and induction of CYP3As in HepG2 and human fetal liver cells. Biol Pharm Bull 30:2091–2097. Marwah A, Marwah P, Lardy H. 1999. Development and validation of a high-performance liquid chromatography assay for the quantitative determination of 7-oxodehydroepiandrosterone-3beta-sulfate in human plasma. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 721:197–205. Matsuzaki Y, Yoshida S, Honda A, Miyazaki T, Tanaka N, Takagiwa A, Fujimoto Y, Miyazaki H. 2004. Simultaneous determination of dehydroepiandrosterone and its 7-oxygenated metabolites in human serum by high-resolution gas chromatographymass spectrometry. Steroids 69:817–824. McIntosh MK, Berdanier CD. 1988. Differential effects of adrenalectomy and starvationrefeeding on hepatic lipogenic responses to dehydroepiandrosterone and glucocorticoid in BHE and Sprague-Dawley rats. J Nutr 118:1011–1017.
108
Merrill JT, Dinu AR, Lahita RG. 1996. Autoimmunity: The Female Connection. Medscape Womens Health 1:5. Miller KK, Cai J, Ripp SL, Pierce WM Jr, Rushmore TH, Prough RA. 2004. Stereo- and regioselectivity account for the diversity of dehydroepiandrosterone (DHEA) metabolites produced by liver microsomal cytochromes P450. Drug Metab Dispos 32:305–313. Mohan PF, Cleary MP. 1992. Studies on nuclear binding of dehydroepiandrosterone in hepatocytes. Steroids 57:244–247. Monsalve A, Blaquier JA. 1977. Partial characterization of epididymal 5 alpha reductase in the rat. Steroids 30:41–51. Montalto J, Funder JW, Yong AB, Whorwood CB, Connelly JF. 1990. Serum levels of 5androstene-3 beta,17 beta-diol sulphate, 5 alpha-androstane-3 alpha, 17beta-diol sulphate and glucuronide, in late onset 21-hydroxylase deficiency. J Steroid Biochem Mol Biol 37:593–598. Morfin R, Courchay G. 1994. Pregnenolone and dehydroepiandrosterone as precursors of native 7-hydroxylated metabolites which increase the immune response in mice. J Steroid Biochem Mol Biol 50:91–100. Morfin R. 2002. Involvement of steroids and cytochromes P(450) species in the triggering of immune defenses. J Steroid Biochem Mol Biol 80:273–290. Muller
C,
Cluzeaud
F,
Pinon
GM,
Rafestin-Oblin
ME,
Morfin
R.
2004.
Dehydroepiandrosterone and its 7-hydroxylated metabolites do not interfere with the transactivation and cellular trafficking of the glucocorticoid receptor. J Steroid Biochem Mol Biol 92:469–476. Muller C, Pompon D, Urban P, Morfin R. 2006a. Inter-conversion of 7alpha- and 7betahydroxy-dehydroepiandrosterone
by
the
human
11beta-hydroxysteroid
dehydrogenase type 1. J Steroid Biochem Mol Biol 99:215–522.
109
Muller C, Hennebert O, Morfin R. 2006b. The native anti-glucocorticoid paradigm. J Steroid Biochem Mol Biol 100:95–105. Munroe DG, Chang PL. 1987. Tissue-specific expression of human arylsulfatase-C isozymes and steroid sulfatase. Am J Hum Genet 40:102–114. Nelson DR, Koymans L, Kamataki T, Stegeman JJ, Feyereisen R, Waxman DJ, Waterman MR, Gotoh O, Coon MJ, Estabrook RW, Gunsalus IC, Nebert DW. 1996. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature. Pharmacogenetics 6:1–42. Nestler JE. 1993. Sex hormone-binding globulin: a marker for hyperinsulinemia and/or insulin resistance? J Clin Endocrinol Metab 76:273–274. Newby D, Aitken DA, Howatson AG, Connor JM. 2000. Placental synthesis of oestriol in Down's syndrome pregnancies. Placenta 21:263–267. Nishimura M, Yaguti H, Yoshitsugu H, Naito S, Satoh T. 2003. Tissue distribution of mRNA expression of human cytochrome P450 isoforms assessed by highsensitivity real-time reverse transcription PCR. Yakugaku Zasshi 123:369–375. Nuck BA, Lucky AW. 1987. Epitestosterone: a potential new antiandrogen. J Invest Dermatol 89:209–211. Paine MF, Khalighi M, Fisher JM, Shen DD, Kunze KL, Marsh CL, Perkins JD, Thummel KE. 1997. Characterization of interintestinal and intraintestinal variations in human CYP3A-dependent metabolism. J Pharmacol Exp Ther 283:1552–1562. Pouzar V, Cerný I, Lapčík O, Hill M, Hampl R. 2003. Synthesis of two new haptens of 16alpha-hydroxydehydroepiandrosterone
(3beta,16alpha-dihydroxyandrost-5-en-
17-one). Steroids 68:149–158. Pugeat M, Cousin P, Baret C, Lejeune H, Forest MG. 2000. Sex hormone-binding globulin during puberty in normal and hyperandrogenic girls. J Pediatr Endocrinol Metab 13 Suppl 5:1277–1279.
110
Raju U, Bradlow HL, Skidmore FD, Levitz M. 1989. The concentration of 16x-hydroxy androgens in serum and cyst fluid of women with gross cystic disease of the breast. Steroids 54:101–112. Reed MJ, Purohit A, Woo LW, Newman SP, Potter BV. 2005. Steroid sulfatase: molecular biology, regulation, and inhibition. Endocr Rev 26:171–202. Reich IL, Lardy H, Wei Y, Marwah P, Kneer N, Powell DR, Reich HJ. 1998. Ergosteroids III.
Syntheses
and
biological
activity
of
seco-steroids
related
to
dehydroepiandrosterone. Steroids 63:542–553. Reich IL, Reich HJ, Kneer N, Lardy H. 2002. Ergosteroids V: preparation and biological activity of various D-ring derivatives in the 7-oxo-dehydroepiandrosterone series. Steroids 67:221–233. Robinzon B, Michael KK, Ripp SL, Winters SJ, Prough RA. 2003. Glucocorticoids inhibit interconversion of 7-hydroxy and 7-oxo metabolites of dehydroepiandrosterone: a role for 11beta-hydroxysteroid dehydrogenases? Arch Biochem Biophys 412:251– 258. Rose KA, Stapleton G, Dott K, Kieny MP, Best R, Schwarz M, Russell DW, Björkhem I, Seckl J, Lathe R. 1997. Cyp7b, a novel brain cytochrome P450, catalyzes the synthesis of neurosteroids 7alpha-hydroxy dehydroepiandrosterone and 7alphahydroxy pregnenolone. Proc Natl Acad Sci U S A 94:4925–4930. Salmond WG, Barta MA, Havens JL. 1978. Allylic oxidation with 3,5-dimethylpyrazole chromium trioxide complex. Steroidal ?5-7-ketones. J Org Chem 43:2057–2059. Savage MO, Scommegna S, Carroll PV, Ho JT, Monson JP, Besser GM, Grossman AB. 2002. Growth in disorders of adrenal hyperfunction. Horm Res 58 Suppl 1:39–43. Seckl JR, Walker BR. 2001. Minireview: 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1- a tissue-specific amplifier of glucocorticoid action. Endocrinology 142:1371–1376.
111
Sekihara H, Sennett JA, Liddle GW, McKenna TJ, Yarbro LR. 1976. Plasma 16 betahydroxydehydroepiandrosterone in normal and pathological conditions in man. J Clin Endocrinol Metab 43:1078–1084. Setchell KD, Schwarz M, O'Connell NC, Lund EG, Davis DL, Lathe R, Thompson HR, Weslie Tyson R, Sokol RJ, Russell DW. 1998. Identification of a new inborn error in bile acid synthesis: mutation of the oxysterol 7alpha-hydroxylase gene causes severe neonatal liver disease. J Clin Invest 102:1690–1703. Shackleton CH, Kelly RW, Adhikary PM, Brooks CJ, Harkness RA, Sykes PJ, Mitchell FL. 1968. The identification and measurement of a new steroid 16 betahydroxydehydroepiandrosterone in infant urine. Steroids 12:705–716. Shackleton CH. 1986. Profiling steroid hormones and urinary steroids. J Chromatogr 379:91–156. Shimojo M, Ricketts ML, Petrelli MD, Moradi P, Johnson GD, Bradwell AR, Hewison M, Howie AJ, Stewart PM. 1997. Immunodetection of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 in human mineralocorticoid target tissues: evidence for nuclear localization. Endocrinology 138:1305–1311. Schneider JJ. 1952. Conversion of desoxycorticosterone to four allopregnane metabolites by rat liver in vitro. J Biol Chem 199:235–244. Schuetz JD, Molowa DT, Guzelian PS. 1989. Characterization of a cDNA encoding a new member of the glucocorticoid-responsive cytochromes P450 in human liver. Arch Biochem Biophys 274:355–365. Schuetz JD, Kauma S, Guzelian PS. 1993. Identification of the fetal liver cytochrome CYP3A7 in human endometrium and placenta. J Clin Invest 92:1018–1024. Skinner SJM, Couch RAF, Thambyah S. 1980. The relationship of plasma 7 alpha-hydroxy dehydroepiandrosterone to disease stage and adrenal androgens in breast cancer patients. Eur J Cancer 16:223–228.
112
Song W, Chen J, Dean WL, Redinger RN, Prough RA. 1998. Purification and characterization
of
hamster
liver
microsomal
7alpha-hydroxycholesterol
dehydrogenase. Similarity to type I 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase. J Biol Chem 273:16223–16228. Stanway SJ, Delavault P, Purohit A, Woo LW, Thurieau C, Potter BV, Reed MJ. 2007. Steroid sulfatase: a new target for the endocrine therapy of breast cancer. Oncologist 12:370–374. Stapleton G, Steel M, Richardson M, Mason JO, Rose KA, Morris RG, Lathe R. 1995. A novel cytochrome P450 expressed primarily in brain. J Biol Chem. 270:29739– 29745. Stárka L, Kutová J. 1962. 7-Hydroxylation of dehydroepiandrosterone by rat-liver homogenate. Biochim Biophys Acta 56:76–82. Stárka L, Bičíková M, Hampl R. 1989. Epitestosterone – an endogenous antiandrogen? J Steroid Biochem 33:1019–1021. Stárka L, Hampl R, Bičíková M, Jelínek R, Doskočil M. 1991. Observations on the biological activity of epitestosterone. Physiol Res 40:317–326. Stárka L, Hampl R, Hill M, Lapčík O, Bílek R, Petřik R. 1997. Epitestosterone in human blood and prostatic tissue. Eur J Clin Chem Clin Biochem 35:469–473. Stárka L. 2003. Epitestosterone. J Steroid Biochem Mol Biol 87:27–34. Stevens JC, Hines RN, Gu C, Koukouritaki SB, Manro JR, Tandler PJ, Zaya MJ. 2003. Developmental expression of the major human hepatic CYP3A enzymes. J Pharmacol Exp Ther 307:573–582. Su CY, Lardy H. 1991. Induction of hepatic mitochondrial glycerophosphate dehydrogenase in rats by dehydroepiandrosterone. J Biochem 110:207–213.
113
Šterzl I, Hampl R, Šterzl J, Votruba J, Stárka L. 1999. 7Beta-OH-DHEA counteracts dexamethasone induced suppression of primary immune response in murine spleenocytes. J Steroid Biochem Mol Biol 71:133–137. Šulcová J, Hill M, Hampl R, Stárka L. 1997. Age and sex related differences in serum levels of unconjugated dehydroepiandrosterone and its sulphate in normal subjects. J Endocrinol 154:57–62. Šulcová J, Hill M, Mašek Z, Ceska R, Nováček A, Hampl R, Stárka L. 2001. Effects of transdermal application of 7-oxo-DHEA on the levels of steroid hormones, gonadotropins and lipids in healthy men. Physiol Res 50:9–18. Takahashi J, Higashi Y, LaNasa JA, Winters SJ, Oshima H, Troen P. 1982. Studies of the human testis. XVII. Gonadotropin regulation of intratesticular testosterone and estradiol in infertile men. J Clin Endocrinol Metab 55:1073–1080. Tang W, Eggertsen G, Chiang JY, Norlin M. 2006. Estrogen-mediated regulation of CYP7B1: a possible role for controlling DHEA levels in human tissues. J Steroid Biochem Mol Biol 100:42–51. Taubert HD, Dericks-Tan JS. 1990. The ovary-suppression test in the evaluation of hyperandrogenemia. Gynecol Endocrinol 4:109–118. Vermeulen A, Kaufman JM. 2002. Diagnosis of hypogonadism in the aging male. Aging Male 5:170–176. Vihinen MK, Kolho KL, Ashorn M, Verkasalo M, Raivio T. 2008. Bone turnover and metabolism in paediatric patients with inflammatory bowel disease treated with systemic glucocorticoids. Eur J Endocrinol 159:693–698. Voigt W, Fernandez EP, Hsia SL. 1970. Transformation of testosterone into 17 betahydroxy-5 alpha-androstan-3-one by microsomal preparations of human skin. J Biol Chem 245:5594–5599.
114
Wallace AM, Tucker P, Williams DM, Hughes IA, Ahmed SF. 2003. Short-term effects of prednisolone and dexamethasone on circulating concentrations of leptin and sex hormone-binding globulin in children being treated for acute lymphoblastic leukaemia. Clin Endocrinol (Oxf) 58:770–776. Weusten JJ, Legemaat G, van der Wouw MP, Smals AG, Kloppenborg PW, Benraad T. 1989. The mechanism of the synthesis of 16-androstenes in human testicular homogenates. J Steroid Biochem 32:689–694. White PC, Mune T, Agarwal AK. 1997. 11 beta-Hydroxysteroid dehydrogenase and the syndrome of apparent mineralocorticoid excess. Endocr Rev 18:135–156. Wrighton SA, Brian WR, Sari MA, Iwasaki M, Guengerich FP, Raucy JL, Molowa DT, Vandenbranden M. 1990. Studies on the expression and metabolic capabilities of human liver cytochrome P450IIIA5 (HLp3). Mol Pharmacol 38:207–213. Yatsimirskaya EA, Gavrilova EM, Egorov AM, Levashov AV. 1993. Preparation of conjugates of progesterone with bovine serum albumin in the reversed micellar medium. Steroids 58:547–550. Zaffanello M, Maffeis C, Zamboni G. 2005. Multiple positive results during a neonatal screening program: a retrospective analysis of incidence, clinical implications and outcomes. J Perinat Med 33:246–251. Zamrazilová L, Kazihnitková H, Lapčík O, Hill M, Hampl R. 2007. A novel radioimmunoassay
of
16alpha-hydroxy-dehydroepiandrosterone
and
its
physiological levels. J Steroid Biochem Mol Biol 104:130–135. Zamrazilová L, Dvořáková M, Lisá L, Stárka L, Hampl R. 2010. Sex hormone-binding globulin in congenital adrenal hyperplasia. Horm Mol Biol Clin Invest 1:89–93. Zamrazilová L, Heráček J, Hampl R. The content of five sex steroids in human testis. Physiol Res (manuskript poslán spoluautorovi prof. Heráčkovi k posouzení).
115
8. SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ
Obr. 1. Schéma biosyntézy steroidních hormonů. Obr. 2. Schéma metabolických drah DHEA. Obr. 3. Předpokládaný mechanismus regulace DHEA v cílových buňkách pro estrogeny. Obr. 4. Schéma působení 11β-hydroxysteroidní dehydrogenázy typu 1 (11β-HSD1). Obr. 5. Schéma dvou moţných přeměn dehydroepiandrosteronu (DHEA) na 17α-epimer testosteronu (epiT).
116
9. PREZENTACE VÝSTUPŮ
9.1. Publikační činnost Zamrazilová L, Heráček J, Hampl R. The content of five sex steroids in human testis. Physiol Res (manuskript poslán spoluautorovi prof. Heráčkovi k posouzení).
Hill M, Pařízek A, Cibula D, Kancheva R, Jirásek JE, Jirkovská M, Velíková M, Kubátová J, Klímková M, Pašková A, Ziţka Z, Kancheva L, Kazihnitková H, Zamrazilová L, Stárka L. 2010a. Steroid metabolome in fetal and maternal body fluids in human late pregnancy. J Steroid Biochem Mol Biol (E-pub ahead of print).
Hill M, Zárubová J, Marusič P, Vrbíková J, Velíková M, Kancheva R, Kancheva L, Kubátová J, Dušková M, Zamrazilová L, Kazihnitková H, Šimůnková K, Stárka L. Effects of valproate and carbamazepine monotherapy on neuroactive steroids, their precursors and metabolites in adult men with epilepsy. 2010b. J Steroid Biochem Mol Biol (E-pub ahead of print).
Zamrazilová L, Dvořáková M, Lisá L, Stárka L, Hampl R. 2010. Sex hormone-binding globulin in congenital adrenal hyperplasia. Horm Mol Biol Clin Invest 1:89–93.
Zamrazilová L, Kazihnitková H, Lapčík O, Hill M, Hampl R. 2007. A novel radioimmunoassay
of
16alpha-hydroxy-dehydroepiandrosterone
and
its
physiological levels. J Steroid Biochem Mol Biol 104:130–135.
Kazihnitková H, Zamrazilová L, Hill M, Lapčík O, Pouzar V, Hampl R. 2007. A novel radioimmunoassay of 7-oxo-DHEA and its physiological levels. Steroids 72:342– 350.
117
9.2. Vědecká symposia a semináře 2010 86. Fyziologické dny, Praha 2009 7th Croatian Congress on Gynaecological Endocrinology, Human Reproduction and Menopause, Brijuni, Croatia 2008 seminář 1. LF UK Praha – Vybrané problémy endokrinologie a metabolismu 2007 XXX. Endokrinologické dny s mezinárodní účastí, Špindlerův Mlýn 2006 17th International Symposium of the Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, Seefeld, Austria
118
