anesthesiologie Nederlands tijdschrift voor volume 26, Februari 2013

Advertentie

Nederlands tijdschrift voor

anesthesiologie volume 26, Februari 2013

Dr. C. Boer, hoofdredacteur Dr. M. Klimek, plaatsvervangend hoofdredacteur Dr. E.G. Mik, gasthoofdredacteur

Officiële uitgave van de Nederlandse Vereniging voor Anesthesiologie

1

• Het meten van micro vasculaire en mitochondriale zuurstofspanning S.I.A. Bodmer, P.P. de Smalen, R.J. Stolker, E.G. Mik • Op weg naar een nieuwe monito ring techniek: In vivo meten van mitochondriale functie F.A. Harms, E.G. Mik • Hemodilutie, nieroxygenatie en nierfunctie: colloïd versus cristalloïd T. Johannes, R.J. Stolker, E.G. Mik • Zuurstof meten in de praktijk Y.T. Halabi, S.F. van den Heuvel, E.G. Mik • De rode bloedcel: zowel zuurstofdrager als zuurstofsensor N.J.H. Raat, E.G. Mik

1

nederlands tijdschrift voor anesthesiologie februari ’13

|

inhoud Nederlands tijdschrift voor

anesthesiologie Volume 26 Nummer 1 Februari 2013

editorial

Coverbeeld Dimitry de Bruin

2

Experimentele anesthesiologie: Rotterdam nieuwe stijl E.G. Mik

experimentele anesthesiologie

3

Het meten van microvasculaire en mitochondriale zuurstofspanning S.I.A. Bodmer, P.P. de Smalen, R.J. Stolker, E.G. Mik


7

Op weg naar een nieuwe monitoring techniek: In vivo meten van mitochondriale functie F.A. Harms, E.G. Mik


11

Hemodilutie, nieroxygenatie en nierfunctie: colloïd versus cristalloïd T. Johannes, R.J. Stolker, E.G. Mik


15

Zuurstof meten in de praktijk Y.T. Halabi, S.F. van den Heuvel, E.G. Mik


De rode bloedcel: zowel zuurstofdrager als zuurstofsensor N.J.H. Raat, E.G. Mik

18

februari ’13 nederlands tijdschrift voor anesthesiologie

2

|

colofon Het Nederlands Tijdschrift voor Anes thesiologie is het officiële orgaan van de Nederlandse Vereniging voor Anesthe siologie. Het stelt zich ten doel om door middel van publicatie van overzichts artikelen, klinische en laboratorium studies en casuïstiek, de verspreiding van kennis betreffende de anesthesi ologie en gerelateerde vakgebieden te bevorderen. REDACTIE

Kernredacteuren: Dr. C. Boer, Prof. Dr. A. Dahan, Dr. H. van Dongen, Dr. H.G.D. Hendriks, Dr. M. Klimek, Prof. Dr. J. Knape, Drs. M.D. Lancé, Prof. Dr. G. Scheffer. Ondersteunend redacteuren: Dr. J. Bijker, Dr. P. Bruins, Dr. J.P. Hering, Prof. Dr. M.W. Hollmann, Dr. A. Koopman, Dr. F. Van Lier, Prof. Dr. S.A. Loer, Dr. A. Pijl, Dr. S. Schiere, Dr. M. Stevens, Dr. B. in het Veld, Dr. K. Vissers, Prof. dr. A. van Zundert Voor informatie over adverteren en het reserveren van advertentieruimte in het Nederlands Tijdschrift voor Anesthesiologie: Drs. Thomas Eldering, T 023 525 9332 Email [email protected]

REDACTIE-ADRES

Nederlandse Vereniging voor Anesthesiologie Domus Medica, Mercatorlaan 1200, 3528 BL Utrecht; www.anesthesiologie.nl

INZENDEN VAN KOPIJ

Richtlijnen voor het inzenden van kopij vindt u op www.anesthesiologie.nl of kunt u opvragen bij de redactie of de uitgever: [email protected]

OPLAGE 2.500 exemplaren, 5x per jaar Het NTvA wordt uitsluitend toegezonden aan leden van de NVA. Adreswijzigingen: Nederlandse Vereniging voor Anesthesiologie, Postbus 20063, 3502 LB Utrecht, T 030-2823385, F 030-2823856, Email [email protected]

PRODUCTIE

Bladcoördinatie: Drs. Thomas Eldering (T 023-5259332) Ontwerp: Dimitry de Bruin Eindredactie: Monique de Mijttenaere

AUTEURSRECHT EN AANSPRAKELIJKHEID

© De Stichting tot Beheer van het Nederlands Tijdschrift voor Anesthesiologie 2009. Nederlands Tijdschrift voor Anesthesiologie® is een wettig gedeponeerd woordmerk van de Nederlandse Vereniging voor Anesthesiologie. Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijzen, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën, opnamen of enige andere manier, zonder voorafgaande schriftelijke toestemming.

editorial

Experimentele anesthesiologie Rotterdam nieuwe stijl

Dr. E.G. Mik Gasthoofdredacteur Erasmus MC, Rotterdam

G

eachte lezer,

Het laboratorium voor Experimentele Anesthesiologie van het Erasmus MC staat van oudsher bekend om haar baanbrekende onderzoek naar beademing. En dat ‘bekend’ kan gerust in hoofdletters geschreven worden. Het ‘open lung concept’ en bijpassende credo “Open the lungs, and keep the lungs open” van Burkhard Lachmann is wereldberoemd. Nog regelmatig merken mensen op hoe geweldig het moet zijn om bij zo’n invloedrijke onderzoeker te mogen werken. Jaren terug heb ik samen met professor Lachmann een aantal experimenten gedaan en dat was inderdaad een feest. Een zeer gedreven en innemende man die wetenschap hoog in het vaandel heeft staan. Enige maanden later ging hij met emeritaat, inmiddels ruim vijf jaar geleden. Vaak verdwijnt na het emeritaat van een hoogleraar de wind uit de zeilen van een onderzoekslijn. Voor een laboratorium is het dan van groot belang dat er niet alleen een frisse wind opsteekt, maar dat deze ook de kans krijgt om iets in beweging te zetten. Over dat laatste hebben we niets te klagen. Als ik mezelf al mag zien als klein fris windje op het lab dan wordt die in elk geval flink aangewakkerd door de afdelingsleiding. Al tijdens mijn opleidingstijd heb ik de kans ge-

kregen om aan een eigen onderzoekslijn te werken en sinds 1 juli 2011 mag ik de Experimentele Anesthesiologie onder mijn hoede nemen. De focus is verschoven van beademing naar weefseloxygenatie en zuurstofmetabolisme. Als jonge groep is het voor ons een grote eer dat we u in dit themanummer van het NTvA een kijkje in onze nieuwe keuken mogen geven. Sander Bodmer legt de principes van zuurstofmetingen op microvasculair en mitochondriaal niveau voor u uit. Floor Harms gaat een stapje verder en laat zien hoe we zuurstofconsumptie op weefselniveau kunnen meten. Dat het niet alleen om techniek draait demonstreert Tanja Johannes met haar onderzoek naar nieroxygenatie tijdens hemodilutie in een varkensmodel. En passant gooit ze nog wat olie op het vuur van de voortwoedende discussie rondom hydroxyethyl starches. Yskandar Halabi laat u zien hoe zuurstofmetingen in de praktijk worden gedaan aan de hand van een lopend onderzoeksprotocol. Als laatste legt Harold Raat u zijn hypothese uit die deels de negatieve uitkomsten van bloedtransfusie zou kunnen verklaren. Veel leesplezier, Bert Mik

3


|


Het meten van microvasculaire en mitochondriale zuurstofspanning

Afdeling Anesthesiologie, Laboratorium voor Experimentele Anesthesiologie, Erasmus MC Universitair Medisch Centrum Rotterdam contactinformatie S.I.A. Bodmer Afdeling Anesthesiologie Erasmus MC – Universitair Medisch Centrum Rotterdam ’s-Gravendijkwal 230 3015 CE Rotterdam T +31 (0)10 7040704 Email [email protected]

S.I.A. Bodmer, Drs. P.P. de Smalen, BSc. R.J. Stolker, Prof. Dr. E.G. Mik, Dr.

Inleiding Adequate zuurstofvoorziening aan weefselcellen is essentieel voor het goed functioneren van de energie producerende organellen van onze cellen, de mitochondriën. Diverse technieken zijn ontwikkeld om weefseloxygenatie in kaart te brengen met allemaal hun eigen voor- en nadelen [1]. Omdat diffusie van zuurstof naar mitochondriën van velerlei factoren afhangt is het van belang om simultaan te kunnen meten in verschillende weefselcompartimenten. Daarom hebben we een methode ontwikkeld waarmee we in staat zijn om simultaan microvasculaire zuurstofspanning (μPO2) en mitochondriale zuurstofspanning (mitoPO2) te meten. De meetmethode is gebaseerd op het principe van zuurstofafhankelijke uitdoving van luminescentie. Luminescentie is het licht dat wordt uitgezonden wanneer energierijke elektronen in een molecuul vanuit een aangeslagen toestand terugvallen naar de grondtoestand. Fluorescentie is de meest bekende vorm van luminescentie, en fosforescentie en chemoluminescentie zijn hier twee andere voorbeelden van.

Voor de μPO2 metingen maken we gebruik van de fosforescerende eigenschappen van de synthetische porfyrine Oxyphor G2 [2]. De mitoPO2 wordt gemeten met behulp van het lichaamseigen Protoporphyrine IX (PpIX) dat gesynthetiseerd wordt in de mitochondriën. PpIX bezit een soort van zuurstofafhankelijke fluorescentie, te weten vertraagde fluorescentie [3], welke zich goed laat combineren met Oxyphor G2 in simultane metingen [4]. Dit is mogelijk doordat beide stoffen met dezelfde kleur licht, ofwel laser golflengte, te exciteren zijn. De golflengtes van de op te vangen fosforescentie en fluorescentie signalen verschillen van elkaar zodat onderscheid gemaakt kan worden tussen beide weefselcompartimenten. In dit artikel gaan we in op de achtergrond van de meetmethode en geven we een korte beschrijving van de gebruikte meetopstelling. Verder demonstreren we de toepasbaarheid van de techniek aan de hand van experimenten gedaan op skeletspierweefsel van ratten. Bij deze experimenten werden de μPO2 en mitoPO2 metingen gecombineerd met meting van de lokale microcirculatoire bloedflow. De

resultaten dienen als basis voor verdere ontwikkeling van de techniek met als doel dat deze zal bijdragen aan een beter inzicht in weefseloxygenatie in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden.

Materialen & methoden Meetprincipe Reeds in 1987 introduceerde Jane Vanderkooi met haar onderzoeksgroep een meettechniek die gebaseerd was op zuurstofafhankelijke uitdoving van fosforescentie van metalloporfyrines [5]. Porfyrines komen van nature voor en behoren tot de meest voorkomende organische verbindingen op aarde. Derivaten van porfyrines spelen essentiële rollen in processen rondom het maken, transporteren en verbruiken van zuurstof. Een belangrijke eigenschap is dat ze complexen kunnen vormen met bijvoorbeeld ijzer (heem in hemoglobine) of magnesium (chlorofyl in bladgroenkorrels). Het opnemen van fotonen, dus het absorberen van energie, zorgt ervoor dat de porfyrines een hogere energetische waarde krijgen; meer fysisch omschreven een geëxciteerde triplet toestand. Deze triplet toestand kan spontaan


4

|

Figuur 1 Het principe van microvasculaire en mitochondriale zuurstofmetingen. A. toont het principe van zuurstofafhankelijke uitdoving van luminescentie. Naarmate er meer zuurstof is, is de uitdooftijd van het signaal korter. De Stern-Volmer vergelijking geeft kwantitatief de relatie tussen uitdooftijd (τ) en zuurstofspanning (PO2), waarbij de uitdoofconstante (kq) en de uitdooftijd in afwezigheid van zuurstof (τ0) de ijkconstanten zijn. B. toont schematisch de twee weefselcompartimenten waarin gemeten wordt. De microvasculaire zuurstofspanning wordt gemeten door middel van het fosforescerende Oxyphor G2. De mitochondriale zuurstofspanning wordt gemeten door middel van het fluorescerende protoporfyrine IX (PpIX). De intra-mitochondriale concentratie PpIX wordt verhoogd door toediening van 5-aminolevuline zuur (ALA). Figuren overgenomen en aangepast uit referentie [4].

relaxeren, oftewel terugvallen, naar de grondtoestand waarbij een foton wordt uitgezonden. Indien dit direct gebeurt heet het uitgezonden licht ‘fosforescentie’. Indien het verval indirect verloopt via een singlet toestand noemen we het uitgezonden licht ‘vertraagde fluorescentie’. De geëxciteerde triplet toestand van porfyrines interacteert sterk met moleculair zuurstof en kan bij botsing zijn energie overdragen naar deze zuurstofmoleculen. Door deze energieoverdracht gaat de triplet toestand van de porfyrine over in een singlet toestand zonder dat een foton wordt uitgezonden. Hoe meer zuurstof er is, des te meer botsingen plaatsvinden en des te sneller de triplet toestanden verdwijnen. Daardoor worden er minder fotonen uitgezonden en dat maakt fosforescentie en vertraagde fluorescentie qua intensiteit en uitdooftijd afhankelijk van zuurstof. De uitdooftijd van het gedetecteerde signaal na excitatie met een korte lichtflits is wat uiteindelijk gemeten wordt. De relatie tussen uitdooftijd en zuurstofspanning wordt gegeven door de vergelijking van Stern-Volmer (zie Figuur 1A). De uitdooftijd in afwezig-

heid van zuurstof (τ0) en de uitdovingsconstante kq zijn specifiek voor een bepaalde porfyrine. Naast deze ijkwaarden kunnen de porfyrines ook verschillen qua spectroscopische eigenschappen. De lasergolflengtes welke de porfyrines het beste exciteren en de uiteindelijk afgegeven golflengte licht na energieverval bepalen samen welke porfyrines simultaan gebruikt kunnen worden en of de signalen niet interfereren.

Oxyphor G2 & Protoporfyrine IX Een schematische weergave van het meetprincipe met verschillende zuurstofsensors in twee verschillende weefselcompartimenten is getoond in Figuur 1B. Voor de metingen van de μPO2 gebruiken we Oxyphor G2 [2]. Deze wateroplosbare porfyrine heeft twee absorptiemaxima (440 en 632 nm, blauw en rood) en een emissiemaximum rond de 790 nm (nabij infrarood). De zuurstofafhankelijke fosforescentie van Oxyphor G2 is al veelvuldig toegepast voor het meten van μPO2. Na inspuiten in de circulatie bindt deze stof aan albumine en blijft zodoende voor enige tijd in het vasculaire compartiment [6]. De ijk-

constanten bij pH 7.4 en 37 0C zijn kq = 270 mmHgs-1 en τ0 = 250 μs. Voor het meten van het mitochondriale compartiment maken we gebruik van Protoporfyrine IX (PpIX). Deze laatste precursor van heem wordt gesynthetiseerd in de mitochondriën [7]. Doordat de conversie van PpIX naar heem traag verloopt kan de mitochondriële PpIX concentratie worden verhoogd door enkele uren voor de in vivo metingen 5-aminolevulenic acid (ALA), de precursor van de heemsynthese, toe te dienen [8, 9]. In plaats van fosforescentie vertoont PpIX zuurstofafhankelijke vertraagde fluorescentie [3, 10]. Het absorptiespectrum van PpIX heeft maxima op 420 (blauw), 510 (groen) en 632 nm (rood) en de emissie ligt rond de 690 nm (rood). De ijkconstanten bij pH 7.4 en 37 0C zijn kq = 830 mmHgs-1 en τ0 = 0.8 ms. Het feit dat beide porfyrines een excitatiepiek rond de 632 nm hebben maakt dat ze simultaan geëxciteerd kunnen worden. De emissiespectra verschillen dermate dat met gebruik van de juiste filters de opgevangen signalen gescheiden kunnen worden. Hoewel er fysisch gezien bij PpIX sprake is van zuurstofafhankelijke ver-

5


|

Figuur 2 Effect van elektrostimulatie op bloedflow en oxygenatie in skeletspier. A. toont het verloop van de bloedflow in de linker a. femoralis tijdens het spiersimulatie van de m. quadriceps femoris. De rode stippellijnen geven de tijdstippen aan die corresponderen met de zuurstofmetingen die in B worden weergegeven. B. toont het verloop van de microvasculaire zuurstofspanning (μPO2) en de mitochondriale zuurstofspanning (mitoPO2) in de spier. Weergegeven zijn het gemiddelde ± standaard error van acht experimenten.

traagde fluorescentie en bij Oxyphor G2 van zuurstofafhankelijk fosforescentie maakt dit voor de techniek niet uit. In beide gevallen is de uitdooftijd van het uitgezonden zuurstofafhankelijke signaal in de orde van 10 tot enkele honderden microseconden. Meetopstelling Een zeer uitgebreide beschrijving van onze meetopstelling met alle componenten en technische details is eerder gepubliceerd [4]. Hier willen we volstaan met een korte beschrijving. Als lichtbron voor de excitatie van de porfyrines gebruiken we een PC gestuurde gepulste laser (Opolette 355-I, Opotek, Carslbad, CA, USA). De kleur van de laserpulsen is instelbaar van blauw tot rood (410-670 nm) met een duur van 4-10 ns bij 2-4 mJ per puls. In feite produceert de laser zeer korte en intense lichtflitsen op elke gewenste kleur van het zichtbare spectrum. De opgewekte laserpuls wordt door een glasfibersysteem naar het te meten weefsel geleid, waar de excitatie van Oxyphor G2 en PpIX plaatsvindt. Het uitgezonden zuurstofafhankelijke signaal wordt opgevangen door een

tweede glasfiber en naar het detectiesysteem geleid. Omdat de opgevangen luminescentie bestaat uit zowel het Oxyphor G2 als het PpIX signaal dient het signaal nog gesplitst te worden. Daarom splitst de detectiefiber zich om het licht naar twee detectoren te kunnen leiden. Als detectoren worden zeer lichtgevoelige fotomultiplicator buizen (photomultiplier, PMT) gebruikt. Voor elke PMT zit een specifiek filtersysteem dat slechts een van de twee signalen doorlaat. De PMT die het Oxyphor G2 signaal detecteert is uitgerust met een filtercombinatie bestaand uit een 715 nm longpassfilter en een 790 nm bandpassfilter. Hier wordt het PpIX signaal dus tegengehouden. Het PpIXkanaal bevat een filtercombinatie bestaande uit een 590 nm longpassfilter en een breedband 600-750 nm bandpassfilter. Hier is het Oxyphor G2 signaal dus weggefilterd. Het opgevangen lichtsignaal wordt door de PMTs omgezet in een zeer kleine stroom welke met speciale versterkers wordt omgezet naar een meetbare spanning. Door middel van data-acquisitie hardware wordt dit signaal in de computer

ingelezen en daarna kunnen de uitdooftijden worden bepaald en worden omgerekend naar zuurstofspanning. Experimentele opzet In een door de dierexperimentencommissie (DEC, ErasmusMC) goedgekeurd protocol hebben we in 8 mannelijke Wistar ratten (275-300 gram) de μPO2 en mitoPO2 gemeten tijdens gestimuleerde spiercontracties (vrijgeprepareerde m. quadriceps femoris links ). De proeven vonden plaats onder algehele anesthesie (ketamine 50 mg/kg/u geïnfundeerd via de v. jugularis) en met mechanische beademing via tracheotomie op geleide van end tidal CO2 (4.0-6.0 kPa) (Babylog, Dräger, Dräger Medical Nederland BV, Zoetermeer, Nederland). Door middel van een arteriële lijn in de a. carotis werd de bloeddruk geregistreerd en werden bloedgasanalyses gedaan. Bloedflow werd geregistreerd met een flow probe rond de a. femoralis. Via de v. jugularis werd 0.9% NaCl toegediend (6 ml/kg/u) en de lichaamstemperatuur werd gereguleerd middels een warmteplaat (± 37 0C). Voor stimulatie van PpIX synthese werd


6

|

drie uur voor de meting 5-aminolevulinezuur-creme (5% ALA) aangebracht op de spier. Deze werd afgedekt met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht. Oxyphor G2 (1.0 mg/kg opgelost fosfaat gebufferd zout) werd vijftien minuten voor de meting toegediend om een gelijkmatige intravasculaire verdeling te krijgen. De fysiologische metingen werden continu geregistreerd en opgeslagen in LabChart (AD Instruments, BellaVista, NSW, Australië). Elektrostimulatie van de spier vond plaats volgens een protocol waarbij na een baselineperiode van acht minuten twintig minuten lang gestimuleerd wordt met (2Hz, 30mA) door middel van een regelbare stimulator (Pajunk Vario). De μPO2 en mitoPO2 werden uitgevoerd voor stimulatie, aan het begin en eind van het stimulatieblok en wederom na twintig minuten rust.

Resultaten Hoofddoel van de proefopzet was om te kijken of het conceptueel mogelijk was om μPO2 en mitoPO2 te meten tijdens snel wisselend zuurstofverbruik. Dit omdat in voorgaande experimen ten vaak over langere tijdsperioden werd gemeten tijdens steady state zuurstofverbruik. Door middel van de spiercontracties werd een beroep gedaan op zowel de lokale aanvoer van zuurstof via de microcirculatie als het verbruik van zuurstof in de mitochondriën. De macrohemodynamische pa-

rameters voor stimulatie waren MAP = 87 ± 9 mmHg bij een hartfrequentie van 227 ± 16 slagen per minuut. De etCO2 was 4.4 ± 0.1 bij een lichaamstemperatuur van 37.2 ± 0.8 °C. Tijdens stimulatie waren er geen significante veranderingen in deze parameters. In Figuur 2A is het verloop van de bloedflow in de a. femoralis tijdens elektrische stimulatie weergegeven. Een duidelijke tijdelijke toename is te zien gedurende de elektrostimulatie. Kijken we naar de gemeten μPO2 en mitoPO2 (zie Figuur 2B), dan zien we hier ook duidelijke effecten. Direct na het begin van de stimulatie toonden zowel de μPO2 als de mitoPO2 een afname. De mitoPO2 herstelde gedurende de contracties tot op baseline niveau aan het einde van de stimulatieperiode, dus nog voordat de stimulaties gestopt waren. In tegenstelling tot de flow in de a. femoralis daalde de μPO2 gedurende de gehele stimulatie periode en herstelde zich pas aan het einde van het protocol. In tegenstelling tot de mitoPO2 bereikte de μPO2 niet de baseline van voor de stimulatie.

Discussie Met de beschreven techniek is het technisch mogelijk tegelijkertijd zowel in de microcirculatie als de mitochondriën de zuurstofspanning te meten. De combinatie van mitoPO2 met behulp van ALA-geïnduceerde PpIX en μPO2 metingen met gebruik van Oxyphor G2 is robuust, niet invasief

en kan gedaan worden in bewegende weefsels. Het simultaan exciteren met eenzelfde golflengte laserlicht en scheiden van de vertraagde fluorescentie en fosforescentie is met behulp van de juiste filters goed uitvoerbaar zonder interferentie van de signalen [4]. Uit de getoonde resultaten blijkt dat de techniek in staat is in dynamische omstandigheden de verwachte PO2 veranderingen te registeren. Het opwekken van spiercontracties en het toegenomen verbruik van zuurstof door mitochondriën wordt weerspiegeld in dalende microvasculaire en mitochondriële zuurstofspanning. De sterk toegenomen flow in de a. femoralis kan niet voorkomen dat de μPO2 afneemt. Het nut van meten in verschillende weefselcompartimenten blijkt uit het feit dat μPO2 en mitoPO2 aan het eind van de stimulatie een tegengesteld verloop laten zien. Hoewel μPO2 verder afneemt herstelt de mitoPO2 zich, waarschijnlijk door capillaire rekrutering die ervoor zorgt dat de diffusieafstand tussen haarvaten en mitochondriën kleiner wordt. De uiteindelijke bedoeling is om de beschreven technologie toe te passen op proefdiermodellen die situaties uit perioperatieve, spoedeisende en intensive zorg nabootsen. Daarnaast werken we aan een verbeterde methode om μPO2 te meten, die ervoor moet zorgen dat de Oxyphor G2 intravasaal blijft in situaties van verhoogde capillaire lekkage, zoals sepsis.

re f e renties 1. Springett R., Swartz H.M. Measurements of oxygen in vivo: overview and perspectives on methods to measure oxygen within cells and tissues. Antioxid Redox Signal 2007;9:1295-301. 2. Dunphy I., Vinogradov S.A., Wilson D.F. Oxyphor R2 and G2: phosphors for measuring oxygen by oxygendependent quenching of phosphorescence. Anal Biochem 2002; 310: 191-8. 3. Mik E.G., Stap J., Sinaasappel M., Beek J.F., Aten J.A., van Leeuwen T.G., Ince C. Mitochondrial PO2 measured by delayed fluorescence of

endogenous protoporphyrin IX. Nat Methods 2006; 3: 939-45. 4. Bodmer S.I., Balestra G.M., Harms F.A., Johannes T., Raat N.J., Stolker R.J., Mik E.G. Microvascular and mitochondrial PO2 simultaneously measured by oxygen-dependent delayed luminescence. J Biophotonics 2012; 5: 140-51. 5. Vanderkooi J.M., Maniara G., Green T.J., Wilson D.F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J Biol Chem 1987; 262: 5476-82.

6. Johannes T., Mik E.G., Ince C. Dual-wavelength phosphorimetry for determination of cortical and subcortical microvascular oxygenation in rat kidney. J Appl Physiol 2006;100:1301-10. 7. Poulson R. The enzymic conversion of protoporphyrinogen IX to protoporphyrin IX in mammalian mitochondria. J Biol Chem 1976; 251: 3730-3. 8. Fukuda H., Casas A., Batlle A. Aminolevulinic acid: from its unique biological function to its star role in photodynamic therapy. Int J Biochem Cell Biol 2005; 37: 272-6.

9. Harms F.A., de Boon W.M., Balestra G.M., Bodmer S.I., Johannes T., Stolker R.J., Mik E.G. Oxygendependent delayed fluorescence measured in skin after topical application of 5-aminolevulinic acid. J Biophotonics 2011; 4: 731-9. 10. Mik E.G., Johannes T., Zuurbier C.J., Heinen A., Houben-Weerts J.H., Balestra G.M., Stap J., Beek J.F., Ince C. In vivo mitochondrial oxygen tension measured by a delayed fluorescence lifetime technique. Biophys J 2008; 95: 3977-90.


|

7


Op weg naar een nieuwe monitoring techniek: In vivo meten van mitochondriale functie

Afdeling Anesthesiologie, Laboratorium voor Experimentele Anesthesiologie, Erasmus MC Universitair Medisch Centrum Rotterdam contactinformatie F.A. Harms Afdeling Anesthesiologie Erasmus MC – Universitair Medisch Centrum Rotterdam ’s-Gravendijkwal 230 3015 CE Rotterdam T +31 (0) 10 7040704 Email [email protected]

F.A. Harms, Drs. E.G. Mik, Dr.

Inleiding Een belangrijke taak in de dagelijkse praktijk van de anesthesioloog is het toedienen van zuurstof, met als doel het bewerkstelligen van een normale zuurstofspanning in de weefsels en een adequaat zuurstofmetabolisme in de mitochondriën. Het laatste decennium is duidelijk geworden dat alleen een adequate zuurstoftoevoer geen garantie geeft voor een efficiënt zuurstofmetabolisme. Vele aandoeningen zijn geassocieerd met een disfunctie van de mitochondriën zoals, cardiovasculaire [1] en neurodegeneratieve [2, 3] ziektes. Mitochondriale disfunctie speelt ook een belangrijke rol in de kritische zieke patiënt met sepsis en septische shock [4-7]. Ondanks dat mitochondriale disfunctie bij vele aandoeningen een bekend fenomeen is, blijft het in de klinische praktijk lastig om een onderscheid te maken tussen problemen in het zuurstofaanbod en problemen in het zuurstofverbruik veroorzaakt door het falen van de mitochondriën. Een meetmethode die direct inzicht geeft in de mitochondriale oxygenatie en zuurstofconsumptie zou van grote betekenis kunnen zijn in de behandeling van deze ziektes. De bestaande technieken voor het in vivo meten van de weefseloxygenatie brengen echter een aantal beperkingen met zich mee; zo zijn de meeste technieken invasief, semi-kwantitatief, indirect, in het verkeerde weefselcompartiment of

zijn ze niet te gebruiken in de kliniek vanwege hun toxiciteit. De recent ontwikkelde Protoporphyrin IX - Triplet State Lifetime Techniek (PpIX-TSLT) [8-10], zou een directe meting van de mitochondriale functie mogelijk kunnen maken. Deze meettechniek meet de zuurstofspanning in de mitochondriën door middel van de zuurstofafhankelijke optische eigenschappen van protoporfyrine IX (PpIX). PpIX is een endogene stof die een rol speelt in de synthese van heem. Door middel van de applicatie van 5-aminolevulinezuur (ALA) zal er een stijging plaatsvinden in de mitochondriale PpIX concentratie, wat PpIX een geschikte endogene mitochondriale zuurstof probe maakt. De methode voor het meten van mitoPO2 is geijkt voor in vivo gebruik voor hart, lever en huid [8, 9, 11, 12]. Naast een directe non-invasieve meting van mitoPO2 is het technisch ook mogelijk om met dezelfde techniek inzicht te krijgen over de functie van de mitochondriën, door meting van de mitochondriale zuurstofconsumptie (mitoVO2) en zuurstofaffiniteit (mitoP50) [13]. De PpIX-TSLT techniek zou zodoende tot een methode kunnen leiden voor het direct klinisch meten van cellulair zuurstofmetabolisme. In dit artikel zullen we de meettechniek beschrijven en zullen we aantonen dat het in principe mogelijk is om de meting te verrichten op de humane huid.

Methode MitoPO2 meting Voor het meten van de mitoPO2 maken we gebruik van de Protoporphyrin IX - Triplet State Lifetime Techniek (PpIX-TSLT) welke in detail beschreven is door Mik et al. [8-10]. Kort samengevat maakt deze optische meettechniek gebruik van de zuurstofafhankelijke uitdoving van de vertraagde fluorescentie van ALAgeïnduceerd PpIX. De achtergrond van deze techniek is elders in deze uitgave van het NTvA beschreven door Bodmer et al. Bij cutane applicatie zal ALA zal door de huid diffunderen en ter plaatse worden geconverteerd naar PpIX (zie Figuur 1). Hierdoor worden er meetbare mitochondriale protoporfyrine IX niveaus geïnduceerd [11]. De PpIX wordt geëxciteerd door laserpulsen met een duur van enkele nanoseconden en een energie van 250 μJ / puls bij een golflengte van 510 nm. Het laserlicht en het vertraagde fluorescentie signaal worden fiberoptisch respectievelijk naar en van de huid geleid. Het signaal wordt gedetecteerd door een fotomultiplier en een computer gestuurd data-acquisitie systeem. De uitdooftijd wordt met behulp van de Stern-Volmer vergelijking omgerekend naar de mitoPO2 in mmHg. MitoVO2 en mitoP50 meting Dynamisch meten van mitoPO2 maakt het mogelijk om mitochondriale zuur-

8


|

Figuur 1 Principe van meting in de huid. A. PpIX ophoping na topische applicatie van ALA-crème. ALA, 5-aminolevuline zuur; PBG, porfobilinogeen; UPIII, uroporfyrinogeen III; CPIII, coporporfyrinogeen III; PpGIX, protoporfyrinogeen IX en PpIX, protoporfyrine IX. B. Na excitatie door een puls groen (510 nm) licht, treedt er bij PpIX vertraagde fluorescentie op. De vertraagde fluorescentie levensduur is zuurstof-afhankelijk volgens het Stern-Volmer vergelijking. In deze vergelijking zijn τ de gemeten uitdooftijd, kq de uitdovingsconstante en τ0 de uitdooftijd in afwezigheid van zuurstof. Figuur overgenomen en aangepast uit referentie [13].

stofconsumptie (mitoVO2) en de mitochondriale zuurstofaffiniteit (mitoP50) te bepalen [13]. Het principe van zulke metingen is weergegeven in Figuur 2. Cutane mitoVO2 en mitoP50 metingen werden getest in acht mannelijke ratten. Voor PpIX inductie werd er gedurende drie uur een 2,5% - ALA-crème aangebracht op een kaalgeschoren en met ontharingscrème (Veet, Reckitt Benckiser Co., Slough, UK) behandeld stukje abdominale huid. De crème bestond uit een mix van Lanettecrème (Lanettecrème I FNA, Bipharma, Weesp, The Netherlands) en 2.5% 5-aminolevulinezuur (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Om de diffusie van zuurstof vanuit de omgeving te voorkomen werd de huid afgedekt met een Tegaderm pleister (IV 3000 Smith and Nephew Medical Ltd., Hull, UK). Metingen van de mitoVO2 en mitoPO50 vonden plaats door middel van een reeks kort opeenvolgende mitoPO2 metingen (één meting per seconde). Deze dynamische mitoPO2 metingen werden gedaan gedurende 90 seconden (10 seconden voor, 60 seconden tijdens en 20 seconden na een minuut durende compressieperiode). Tijdens de compressieperiode werd een blokkade van de microcirculatoire flow geïnduceerd door uitoefenen

van lokale druk op de huid met de meetfiber. Hierdoor is er geen zuurstof toevoer naar de mitochondriën meer mogelijk en door de persisterende zuurstof consumptie in de mitochondriën vertoont de mitoPO2 een afname in de tijd. Uit de kinetiek van mitoPO2 daling kunnen de mitoVO2 en de mitoP50 bepaald worden door fitten van de volgende vergelijking [13]:

Waarin Pn de mitoPO2 op het n-de meetpunt, V0 de zuurstof-onafhankelijke maximale zuurstofconsumptie, P50 de zuurstofspanning waarbij de zuurstofconsumptie is afgenomen tot de helft van maximaal, Z de zuurstofdiffusieconstante en P0 de initiële zuurstofspanning zijn. De laatste term van deze vergelijking corrigeert voor zuurstofinflux vanuit de omgeving tijdens de meting. Bij een aparte groep ratten (n = 3), werd dezelfde meting herhaald in een niet ademende huid, geïnduceerd door de applicatie van de mitochondriale blokker 2% kalium cyanide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gemengd in een hydrofiele Lanettecrème. De cyanide-ionen (CN-) uit deze crème binden met hoge affiniteit aan het mitochondriale cyto-

chroom c oxidase, waardoor de mitochondriale activiteit vrijwel volledig geblokkeerd wordt [14]. Dieren De in totaal elf gebruikte mannelijke Wistar ratten (Charles River, Wilmington, MA, USA, lichaamsgewicht 280-350 g) werden onder anesthesie gebracht met een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine 90 mg kg-1 (Alfasan, Woerden, Nederland), medetomidine 0,5 mg kg-1 (Sedator Eurovet Animal Health BV, Bladel, Nederland), en atropine 0,05 mg kg-1 (Centrofarm Services BV, Etten-Leur, Nederland). Mechanische ventilatie met een FiO2 van 40% werd uitgevoerd via tracheotomie. De ventilatie werd aangepast op end tidal PCO2. Een polyethyleen katheter (PE50, buitendiameter 0,9 mm) werd ingebracht in de rechter v. jugularis voor de intraveneuze toedienen van vloeistoffen. De arteriële bloeddruk en de hartslag werden gemonitord via een soortgelijke katheter in de linker a. femoralis. Elk uur werd er een arteriële bloedgas analyse gedaan en werd de cardiale output gemeten doormiddel van een thermodilutie thermistor ingebracht in de rechter a. carotis. Ketamine (50 mg kg-1 h-1) en een cristalloïde oplossing (Ringer’s


9

|

lactaat, 5 ml kg-1 h-1) werden intraveneus toegediend voor het handhaven van anesthesie en vochtbalans. De lichaamstemperatuur werd rectaal gemeten en door middel van een verwarmingselement op de 38 ± 0,5 °C gehouden. Humane pilot meting Tot slot is de methode getest in een pilot experiment op menselijke huid. Deze test werd vrijwillig uitgevoerd op het sternum van de hoofdonderzoeker (EGM). Een kleine hoeveelheid van 2,5% ALA- crème werd gedurende drie uur plaatselijk aangebracht en afgedekt met een zelfklevende folie en het stukje huid werd beschermd tegen de blootstelling van licht. Na het verwijderen van de crème kon de meting gestart worden.

Resultaten De topische applicatie van ALA veroorzaakte detecteerbare vertraagde fluorescentie in de buikhuid van de ratten. Het blokkeren van de microcirculatoire zuurstofaanvoer, door het uitvoeren van lokale druk op de huid, gaf een onmiddellijk afname van de mitoPO2 als gevolg van de persisterende zuurstofconsumptie door mitochondriën. Het na 60 seconden opheffen van de druk ging gepaard met een stijging van de mitoPO2. Doorgaans werd deze stijging gevolgd door een overshoot ten opzichte van de baseline waardes, waarschijnlijk veroorzaakt door een lokale hyperemische respons. Een voorbeeld van een meting is weergegeven in Figuur 3A. Baseline mitoPO2 was 60 ± 2 mmHg (mean ± SE, n = 8), mitoVO2 was 5.0 ± 0.3 mmHgs-1 en mitoP50 was 4.0 ± 0.2 mmHg. Het over een langere tijd herhaald uitvoeren van de zuurstofconsumptiemeting met een interval van 15 minuten gaf reproduceerbare resultaten, waaruit we kunnen concluderen dat er geen cellulaire schade optreedt ten gevolge van de lichtstraling en de uitgeoefende druk.

Figuur 2 Het principe van het meten van de mitochondriale functie in de huid. Het eerste paneel demonstreert de nulmeting. Het tweede paneel toont het principe van de druk geïnduceerde blokkade van microvasculaire doorbloeding. Vm is het meetvolume in de huid en het emissielicht is de door protoporfyrine IX uitgezonden vertraagde fluorescentie. Figuur overgenomen en aangepast uit referentie [13].

Blokkade van de mitochondriale ademhalingsketen door middel van cyanidecrème leidde tot het verdwijnen van de zuurstofconsumptie. Door het stilleggen van de zuurstofconsumptie verdween tevens de zuurstofgradiënt tussen het bloed en de mitochondriën en de mitoPO2 in de met cyanide behandelde huid werd vrijwel gelijk aan de arteriële PO2 (zie Figuur 3B). Doordat mitoPO2 metingen in de huid gedaan kunnen worden na lokale ALA toediening, is de beschreven techniek in principe eenvoudig in mensen toe te passen. Om te kijken of dynamische mitoPO2 metingen ook daadwerkelijk in humane huid gedaan kunnen worden werd een pilot experiment verricht. De resultaten hiervan zijn te zien in Figuur 3C.

Discussie Technieken voor het lokaal meten van zuurstofconsumptie werden reeds ontwikkeld in de jaren ‘70 en ‘80 van de vorige eeuw. Deze methoden waren gebaseerd op het continu meten van het zuurstofgehalte van bloed gedurende een blokkade van de zuurstoftoevoer. Deze laatste kwam tot stand door de macrohemodynamische bloedstroom naar organen te onderbinden. Zo werd bijvoorbeeld de zuurstofconsumptie in de hersenen bepaald gedurende een

ligatie van beide carotiden [15, 16]. Helaas hadden deze metingen zowel conceptuele als technische beperkingen. Zo veroorzaakte de occlusie van een groot bloedvat een pooling van het bloed in de weefsels, waardoor de metingen sterk afhankelijk waren van het hemoglobine gehalte. In dit werk presenteren we een nieuwe methode voor het monitoren van het lokale zuurstofverbruik in weefsels. De monitoring techniek is gebaseerd op het herhaaldelijk meten van de mitoPO2 gemeten in een klein weefsel volume en wordt gecombineerd met een lokale occlusie van de zuurstoftoevoer naar de mitochondriën. Aangezien de meting plaatsvindt in een klein weefselvolume kan de microvasculaire bloedstroom geblokkeerd worden door middel van lokale druk met de meetfiber. Dit maakt de meting vrijwel onafhankelijk van het aanwezige hemoglobine gehalte. Uit de kinetiek van de daling van de mitoPO2 kunnen vervolgens de mitoVO2 en mitoP50 bepaald worden [13]. In deze studie is de meetmethode getest op de huid en bleek reproduceerbare resultaten te geven in een serie ratten. Er is specifiek voor de huid gekozen vanwege de mogelijkheid om ALA topisch toe te dienen met de potentie om op die manier de techniek in

10


|

Figuur 3. Dynamische zuurstofmetingen in de huid. A. laat een voorbeeld zien van een dynamische meting van mitochondriale zuurstofspanning (mitoPO2) in rattenhuid. De grijze punten zijn meetwaarden, de doorgetrokken rode lijn is het resultaat van de fitprocedure voor bepaling van de uitgangszuurstofspanning (P0), de maximale zuurstofconsumptie (V0) en de zuurstofspanning waarbij de zuurstofconsumptie is gehalveerd (P50). B. laat zien dat cyanide crème de zuurstofconsumptie in de huid blokkeert (gemiddelde ± SE, n = 3). C. toont het resultaat van een pilot experiment in humane huid.

mensen te kunnen gebruiken. Een van de doelen die we voor ogen hebben is het ontwikkelen van een monitor voor het meten van mitochondriale (dis)functie in patiënten met ernstige sepsis. Dat de in de huid gemeten zuurstofconsumptie een indicator is voor mitochondriale respiratie is duidelijk door het effect van cyanide. Nadat er lokaal een cyanide houdende crème op de huid was aangebracht, werd er bij het uitvoeren van de lokale druk op de huid geen afname in de mitoPO2 waargenomen. Dit duidt op een te verwachten geblokkeerde mitochondriale respiratie. Het uitblijven

van de zuurstofconsumptie in geblokkeerde mitochondriën benadrukt de betrouwbaarheid van de meting en laat zien dat de meting zelf geen zuurstof consumeert.

Conclusie Onze resultaten tonen aan dat het mogelijk is om in de huid parameters van mitochondriale functie te monitoren door middel van het uitoefenen van lokale weefsel compressie tijdens het herhaaldelijk meten van de mitoPO2. Na het blokkeren van de zuurstoftoevoer naar de mitochondriën laat het zuurstofgehalte in de mitochondriën

een tijdsafhankelijke daling zien. Door middel van een relatief simpele analyse kan de techniek kwantitatieve en robuuste informatie geven over mitochondriale respiratie zoals mitoPO2, mitoVO2 en mitoP50 [13]. Wij verwachten dat klinische implementatie van de techniek sterk zal bijdragen aan het begrip over de mitochondriale functie en het zuurstofmetabolisme in de gezonde en ziekte patiënt. Zo kan deze techniek nuttig zijn voor de evaluatie van een systemische mitochondriale therapie en de monitoring van de mitochondriale functie bij kritisch zieke patiënten.

re f e renties 1. Ballinger S.W. Mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease. Free Radic Biol Med, 2005. 38: 127895. 2. Schapira A.H., Gegg M. Mitochondrial contribution to Parkinson’s disease pathogenesis. Parkinsons Dis, 2011: 159160. doi: 10.4061/2011/159160. 3. Schmitt K. et al. Insights into mitochondrial dysfunction: aging, amyloid-beta, and tau-A deleterious trio. Antioxid Redox Signal, 2012. 16: 1456-66. 4. Brealey D. et al. Mitochondrial dysfunction in a long-term rodent model of sepsis and organ failure. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2004. 286: R491-7.

5. Fink, M.P. Bench-to-bedside review: Cytopathic hypoxia. Crit Care, 2002. 6: 491-9. 6. Galley H.F. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in sepsis. Br J Anaesth, 2011. 107: 57-64. 7. Gellerich F.N. et al. Impaired energy metabolism in hearts of septic baboons: diminished activities of Complex I and Complex II of the mitochondrial respiratory chain. Shock, 1999. 11: 336-41. 8. Mik E.G. et al. Mitochondrial oxygen tension within the heart. J Mol Cell Cardiol, 2009. 46: 943-51. 9. Mik E.G. et al. In vivo mitochondrial oxygen tension measured by a

10.

11.

12.

13.

delayed fluorescence lifetime technique. Biophys J, 2008. 95: 3977-90. Mik E.G. et al. Mitochondrial PO2 measured by delayed fluorescence of endogenous protoporphyrin IX. Nat Methods, 2006. 3: 939-45. Harms F.A. et al. Oxygen-dependent delayed fluorescence measured in skin after topical application of 5-aminolevulinic acid. J Biophotonics, 2011. 4: 731-9. Harms F.A. et al. Validation of the protoporphyrin IX-triplet state lifetime technique for mitochondrial oxygen measurements in the skin. Opt Lett, 2012. 37: 2625-7. Harms F.A. et al. Cutaneous respirometry by dynamic measurement

of mitochondrial oxygen tension for monitoring mitochondrial function in vivo. Mitochondrion, 2012. [Epub ahead of print] 14. Clausen T. et al. Induced mitochondrial failure in the feline brain: implications for understanding acute post-traumatic metabolic events. Brain Res, 2001. 908: 35-48. 15. Leniger-Follert E. Direct determination of local oxygen consumption of the brain cortex in vivo. Adv Exp Med Biol, 1977. 94: 325-30. 16. Nair P.K., Buerk D.G., Halsey, J.H. Jr. Comparisons of oxygen metabolism and tissue PO2 in cortex and hippocampus of gerbil brain. Stroke, 1987. 18: 616-22.


11

|


Hemodilutie, nieroxygenatie en nierfunctie: colloïd versus cristalloïd

Afdeling Anesthesiologie, Laboratorium voor Experimentele Anesthesiologie, Erasmus MC Universitair Medisch Centrum Rotterdam contactinformatie T. Johannes Afdeling Anesthesiologie Erasmus MC – Universitair Medisch Centrum Rotterdam ’s-Gravendijkwal 230 3015 CE Rotterdam T +31 (0)10 7040704 Email [email protected]

T. Johannes, Dr. R.J. Stolker, Prof. Dr. E.G. Mik, Dr.

Inleiding Hemodilutie met cristalloïde of colloïdale oplossingen komt veel voor in de klinische praktijk. Zo is normovolemische hemodilutie een techniek om de behoefte aan allogene bloedtransfusies te verminderen [1]. Verder kan hemodilutie het gevolg zijn van bijvoorbeeld vloeistof resuscitatie in spoedsituaties [2] en volumetherapie in de dagelijkse routine. Recentelijk vroegen wij ons of wat voor effecten hemodilutie heeft op de oxygenatie en functie van de nier [3]. Hierbij vonden we, min of meer bij toeval, een aanzienlijk verschil tussen hemodilutie met een gebalanceerde cristalloïde (Sterofundin ISO) en met een colloïdale vloeistof (Volulyte). Het verdient de moeite, gezien de recente negatieve ontwikkelingen rondom hydroxyethyl starch (HES) producten, om de resultaten van deze studie nog eens vanuit een ander perspectief te bekijken. Colloïdale oplossingen lijken voor veel klinische situaties theoretische voordelen te hebben boven cristalloïden. Synthetische colloïden zoals HES staan 1:1 vervanging van bloedverlies toe en blijven langer in de intravasculaire ruimte dan cristalloïden [4]. Cristalloïden daarentegen extravaseren snel en moeten daarom in de verhouding 3:1 of 4:1 ten opzichte van bloedverlies gegeven worden. Sterker nog, recentelijk is in gezonde

vrijwilligers aangetoond dat het volume-effect van Ringer’s lactaat niet meer is dan een schamele 17% [5]. Meer dan 80% van het toegediende vocht verdwijnt dus in de interstitiële ruimte en veroorzaakt weefseloedeem, met mogelijke negatieve effecten als verstoorde capillaire perfusie en weefseloxygenatie [6]. Toediening van grote hoeveelheden cristalloïden is in traumapatiënten geassocieerd met een verhoogde mortaliteit [7]. Toch hebben HES producten altijd een zekere weerstand ondervonden, onder andere door de potentiële coagulopathie die in het bijzonder geassocieerd is met HES producten met middel tot hoog molecuulgewicht [4] en bezorgdheid om veiligheid voor wat betreft nierfunctie [8]. De meer recent geïntroduceerde laag moleculaire (130 kDa) HES producten hebben deze problemen minder en werden daarom gezien als beter geschikt voor algemeen klinisch gebruik. Echter, recente studies als de CHEST- [9] en 6S-studie [10], die een verhoogde incidentie van nierfalen en in het tweede geval zelfs mortaliteit laten zien bij gebruik van 130 kDa HES producten in sepsis, worden door sommigen gezien als nagel aan de doodskist [11]. Het blijft echter de vraag of de inzet van HES producten voor de indicaties waar het op basis van fysiologi-

sche principes voordelen zou hebben, bijvoorbeeld het opvangen van acuut bloedverlies en het stabiliseren van een hemodynamisch instabiele patiënt, werkelijk zo slecht is. Om even op de zaken vooruit te lopen, op basis van onze preklinische bevindingen kom je tot een andere conclusie. De door ons gebruikte 130 kDa gebalanceerde HES oplossing (Volulyte) deed macrohemodynamisch precies wat je ervan kon verwachten en op renaal niveau zeker een aantal dingen beter dan de gebalanceerde cristalloïde Sterofundin ISO.

Materialen en methoden Proefdieren, instrumentatie en protocol De experimenten werden uitgevoerd in 18 geanestheseerde en getracheotomeerde vrouwelijke biggen (Landrace x Yorkshire) met een gemiddeld gewicht van 30.5 ± 1 kg. Inductie van narcose werd verricht met ketamine (30 mg/kg) en midazolam (1 mg/kg) en onderhoud van de anesthesie met ketamine (17 mg/kg/ uur), midazolam (1.25 mg/kg/hr) en sufentanil (8 μg/kg/uur) met een eenmalige dosis pancuronium bromide (0.3 mg/kg). De biggen werden beademd met een FiO2 van 30% onder normocapnie. Lichaamstemperatuur was rond 38 °C en 15 ml/kg/uur Sterofundin (B. Braun, Melsungen, Duitsland) diende als onderhoudsdosering vocht.

12


De biggen werden opgelijnd met twee venflons, een druk katheter in de linker a. carotis en een Swan-Ganz thermodilutie katheter (Edwards 7 French, Baxter Healthcare Corp., Round Lake, IL, USA) via de rechter v. jugularis. De rechternier werd gemobiliseerd en in een fixatiehouder geplaats door middel van een mediane laparotomie. Katheters voor bloed en urine sampling werden geplaatst in de rechter v. renalis en ureter. Een flowprobe (4SB Transonic Systems Inc., Ihtaca, NY, USA) werd rond de rechter a. renalis geplaatst. De urine uit de blaas werd door middel van een Foley katheter verzameld. Optische fibers voor meting van de microvasculaire zuurstofspanning in de nier werden gepositioneerd (zie onder) en na instrumentatie werd de buik gesloten door middel van chirurgische clips. De dieren in de experimentele groepen werden gehemodilueerd van een hematocriet van ongeveer 30% naar een hematocriet van 15% in drie stappen van 5%. In zes dieren werd per stap 12 ml/kg bloed uitgewisseld met 1:1 Volulyte (HES 6% 130/0.4, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Duitsland). In zes dieren werd per stap 12 ml/kg bloed uitgewisseld met 1:3 Sterofundin ISO (gebalanceerde cristalloid oplossing, B. Braun, Melsungen, Duitsland). Indien nodig werd een additionele 2 ml/kg wisseltransfusie verricht en iedere stap inclusief 30 minuten stabilisatietijd nam ongeveer 45 minuten in beslag. De overige zes dieren dienden als controlegroep. De gemiddelde arteriële bloeddruk, hartfrequentie, cardiac output en renale bloedflow werden continu geregistreerd. Bloedsamples (0.5 ml) werden op vier verschillende tijdpunten afgenomen, na instrumentatie en

|

Figuur 1 Systemische hemodynamische parameters. Resultaten van metingen bij baseline hematocriet en na normovolemische hemodilutie tot een hematocriet van 15%. Weergegeven zijn de gemiddelde waardes ± standaard error. *P < 0.05 vs. baseline, #P < 0.05 vs. colloïd, +P < 0.05 vs. controle met ANOVA.

stabilisatie (baseline), en na de eerste, tweede en derde hemodilutie stap. Arteriële, centraal veneuze, gemengd veneuze en renaal veneuze samples werden afgenomen voor bloedgasanalyse, hematocriet en serum lactaat (ABL flex 800, Radiometer, Copenhagen, Denemarken) en voor bepaling van serum inuline concentraties. Urine uit de rechter nier werd in 20 minuten intervallen verzameld voor bepaling van urineproductie en inuline concentratie. Inuline klaring werd bepaald als index van glomerulaire filtratie ratio (GFR). Intrarenale microvasculaire zuurstof metingen De microvasculaire zuurstofspanning (μPO2) werd gemeten door middel van zuurstofafhankelijke uitdoving van fosforescentie (zie het artikel van Bodmer et al. elders in deze uitgave van het NTvA). De dieren kregen een infusie van 5 mg/kg albumine-

gebonden palladium-porfyrine (Pd-meso-tetra(4-carboxyphenyl) porphine, Porphyrin Products, Logan, UT, USA). Wanneer Pd-porfyrine wordt geëxciteerd met een korte puls groen laserlicht emitteert het rode fosforescentie waarvan de uitdooftijd zuurstofafhankelijk is. De relatie tussen gemeten uitdooftijd en de partiële zuurstofspanning is: μPO2 = (1/τ – 1/ τ0)/kq waarin τ de uitdooftijd, τ0 de uitdooftijd van spontane emissie in de afwezigheid van zuurstof en kq de uitdoofconstante zijn. Pd-porfyrine werd geëxciteerd via drie optische fibers (500 μm diameter, MT B500-0 L240, Perimed, Jarfalla, Sweden) die geïmplanteerd waren in de renale cortex, de buitenste en binnenste medulla. De detectiefiber was een vloeistoffiber (Model 77639, Newport, Irvine, CA, USA) die aan de buitenkant van de nier was gepositioneerd. Technische details van de opstelling zijn eerder gepubliceerd [3, 12].


13

|

Figuur 2 Renale parameters. Resultaten van metingen op het moment dat met isovolemische hemodilutie een hematocriet van 15% was bereikt. Hct: hemotocriet; RBF: renale bloedflow (ml/min); VO2ren: renale zuurstofconsumptie (ml/min); GFR: glomerulaire filtratiesnelheid (ml/min); HIF: Hypoxia Inducible Factor; De aangegeven PO2 waardes (in mmHg) zijn de resultaten van de microvasculaire zuurstofmetingen. Weergegeven zijn de gemiddelde waardes ± standaard error.

Renaal zuurstofaanbod en -consumptie Het arteriële zuurstofgehalte werd berekend als (1.31×Hb×SaO2)+(0.003×PaO2) waarin SaO2 en PaO2 respectievelijk de arteriële zuurstofsaturatie en partiële zuurstofspanning zijn. Het veneuze zuurstofgehalte werd berekend als (1.31×Hb×SrvO2)+(0.003×PrvO2) waarin SrvO2 en PrvO2 respectievelijk de zuurstofsaturatie en partiële zuurstofspanning in de vena renalis zijn. Het renale zuurstof aanbod (DO2ren in ml/min) werd berekend als DO2ren = RBF×arteriële zuurstofgehalte en de renale zuurstofconsumptie (VO2ren in ml/min) werd berekend als VO2ren = RBF×(arteriële - veneuze zuurstofgehalte). Histopathologie en HIF-1a immunostaining De rechter nier werd onmiddellijk aan het eind van het experiment uitgenomen en doorsnedes van cortex,

buitensten en binnenste medulla werden gefixeerd in 4% formaldehyde. Na inbedding in paraffine werden 5 μm dikke weefselcoupes gesneden. Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a) accumulatie werd bepaald door middel van immunohistochemische kleuring met HIF-1 alpha polyklonaal konijnenantilichaam (1:150 verdunning; Novus Biologicals, Littleton, Colorado, USA). Na deparaffinering en rehydratie werden de coupes vier minuten gekookt in citraat buffer (pH 6.0) voor antigeen retrieval, gevolgd door een nacht incubatie met antiHIF-1a anti bij 4 C. EnVision+Systemhorseradish peroxidase labelled anti-rabbit polymer (Dako, Glostrup, Denemarken) werd gebruikt voor detectie. De coupes werden gewassen en de immunoreactiviteit werd gevisualiseerd door middel van diaminobenzidine. Aanvullend werd een kernkleuring door middel van hematoxilin gedaan.

Resultaten De macrohemodynamische parameters bij baseline en na hemodilutie tot een hematocriet van 15% zijn weergegeven in Figuur 1. Normovolemische hemodilutie met zowel Volulyte als Sterofundin ISO had een effect of de bloeddruk, maar deze was bij Sterofundin ISO veel uitgesprokener. Daarnaast werden de biggen in de Sterofundin ISO groep tachycard en steeg het lactaat in die groep significant. Eerdere pogingen in pilot experimenten om de biggen in de cristalloïd groep hemodynamisch stabieler te houden door meer vocht te geven mislukten door de vorming van longoedeem en beademingsproblemen. De resultaten van de renale metingen en bepalingen zijn schematisch weergegeven in Figuur 2. De renale bloedflow en zuurstofconsumptie was niet verschillend tussen de groepen. Isovolemische hemodilutie tot een

14


|

hematocriet van 15% met Volulyte had geen nadelige gevolgen voor de renale microvasculaire oxygenatie. Hemodilutie met Sterofundin ISO daarentegen gaf een significante daling van de microvasculaire zuurstofspanning in alle anatomische zones en het meest uitgesproken in de renale cortex. In tegenstelling tot de Volulyte groep was de GFR significant verlaagd ten opzichte van baseline en controle en was microscopisch sprake van oedeemvorming en verhoogde HIF-1a expressie.

Discussie

In ons proefdiermodel deed de 130/0.4 HES oplossing Volulyte precies wat er volgens het boekje van viel te verwachten. De normovolemische hemodilutie verliep hemodynamisch stabieler dan met de cristalloïde Sterofundin ISO. Ondanks het 3:1 protocol leken de biggen in de cristalloïd groep ondervuld en dit is in lijn met de recente bevindingen in gezonde vrijwilligers dat van cristalloïden eerder 4:1 of zelfs 5:1 gegeven moet worden [5]. Dit laatste was in onze biggen niet mogelijk door de ontwikkeling van ernstig longoedeem. In tegenstelling tot de cristalloïd groep was er in de colloïd groep geen sprake van vorming van renaal oedeem tijdens de tijdspanne van het experiment. Waarschijnlijk is de slechte renale oxygenatie in de cristalloïd groep te

wijten aan de combinatie van relatieve ondervulling en weefseloedeem. In ieder geval lijkt de nier last te hebben van de verminderde oxygenatie want in de cristalloïd groep is sprake van een hypoxische stress response in de vorm van verhoogde HIF-1a expressie. Hoewel we het niet zeker weten, lijkt het aannemelijk dat de hypoxie ook de oorzaak is van de verminderde nierfunctie. Betekent het feit dat de gebruikte 130/0.4 HES oplossing doet wat er op fysiologische gronden van mag worden verwacht nu dat HES producten veilig zijn? Betekent het dat de grote klinische trials die laten zien dat 130/0.4 HES potentieel nierschade en verhoging van mortaliteit veroorzaken bij intensive care patiënten [9, 10] genegeerd moeten worden? Nee, natuurlijk niet! We moeten ons echter wel blijven afvragen of het zo verwonderlijk is dat HES producten, of colloïden in zijn algemeenheid, het zo slecht blijken te doen in sommige situaties. Het gebruik van HES bij hersentrauma stond al ter discussie [13] en nu dan ook het gebruik bij de kritisch zieke, meestal septische, patiënt. In beide gevallen is er echter sprake van endotheel disfunctie en verhoogde capillaire lekkage. Alleen op grond daarvan kan je eigenlijk al geen positieve resultaten met HES verwachten.

Dat het intraveneus toedienen van grote hoeveelheden lichaamsvreemd zetmeel vervolgens de balans naar de negatieve kant doet omslaan zal niemand verwonderen. De discussie over het gebruik van HES producten is al decennia oud maar om nu op basis van de recente trials in intensive care patiënten te stellen dat de discussie voor altijd is beslecht ten nadele van HES gaat deze auteurs op dit moment nog een stap te ver. Dat HES oplossingen geen algemene en in grote hoeveelheden gedurende langere tijd bruikbare resuscitatie- en onderhoudsvloeistoffen zijn willen we wel onderschrijven. Echter, op basis van de fysiologische werkingsprincipes zijn er gewoon ook voordelen te verwachten. Wij gaan in ieder geval met belangstelling uitkijken naar de resultaten van de diverse lopende klinische trials (zie onder andere www.clinicaltrials. gov). Zo loopt er bijvoorbeeld een trial die het effect van intraoperatief gebruik van cristalloïden versus colloïden tijdens abdominale chirurgie op postoperatieve complicaties onderzoekt [14]. Of wat dacht u van de nog te starten trial die gaat kijken naar de effecten van het gebruik van colloïden en cristalloïden voor pomp priming op de microcirculatie tijdens hartchirurgie [15]? Om maar een paar voorbeelden te noemen.…

re f e renties 1. Jarnagin W.R., Gonen M., Maithel S.K., Fong Y., D’Angelica M.I., Dematteo R.P., Grant F., Wuest D., Kundu K., Blumgart L.H., Fischer M. A prospective randomized trial of acute normovolemic hemodilution compared to standard intraoperative management in patients undergoing major hepatic resection. Ann Surg 2008; 248: 360-9. 2. Bruns B., Lindsey M., Rowe K., Brown S., Minei J.P., Gentilello L.M., Shafi S. Hemoglobin drops within minutes of injuries and predicts need for an intervention to stop hemorrhage. J Trauma 2007; 63: 312-5. 3. Konrad F.M., Mik E.G., Bodmer S.I.A., Ates N.B., Willems H.F.E.M., Klingel K., De Geus H.R.M., Stolker R.J., Johannes T. Anesthesiology (accepted for publication) 2012. 4. Mizzi A., Tran T., Karlnoski R., Anderson A., Mangar D., Camporesi E.M. Voluven, a new colloid solution. Anesthesiol Clin 2011; 29: 54755.

5. Jacob M., Chappell D., HofmannKiefer K., Helfen T., Schuelke A., Jacob B., Burges A., Conzen P., Rehm M. The intravascular volume effect of Ringer’s lactate is below 20%: a prospective study in humans. Crit Care 2012; 16: R86. 6. Funk W., Baldinger V. Microcirculatory perfusion during volume therapy. A comparative study using crystalloid or colloid in awake animals. Anesthesiology 1995; 82: 975-82. 7. Ley E.J., Clond M.A., Srour M.K., Barnajian M., Mirocha J., Margulies D.R., Salim A. Emergency department crystalloid resuscitation of 1.5 L or more is associated with increased mortality in elderly and nonelderly trauma patients. J Trauma 2011; 70: 398-400. 8. Dart A.B., Mutter T.C., Ruth C.A., Taback S.P. Hydroxyethyl starch (HES) versus other fluid therapies: effects on kidney function. Cochrane Database Syst Rev 2010: CD007594.

9. Myburgh J.A., Finfer S., Bellomo R., Billot L., Cass A., Gattas D., Glass P., Lipman J., Liu B., McArthur C., McGuinness S., Rajbhandari D., Taylor C.B., Webb S.A. Hydroxyethyl starch or saline for fluid resuscitation in intensive care. N Engl J Med 2012; 367: 1901-11. 10. Perner A., Haase N., Guttormsen A.B., Tenhunen J., Klemenzson G., Aneman A., Madsen K.R., Moller M.H., Elkjaer J.M., Poulsen L.M., Bendtsen A., Winding R., Steensen M., Berezowicz P., Soe-Jensen P., Bestle M., Strand K., Wiis J., White J.O., Thornberg K.J., Quist L., Nielsen J., Andersen L.H., Holst L.B., Thormar K., Kjaeldgaard A.L., Fabritius M.L., Mondrup F., Pott F.C., Moller T.P., Winkel P., Wetterslev J. Hydroxyethyl starch 130/0.42 versus Ringer’s acetate in severe sepsis. N Engl J Med 2012; 367: 124-34. 11. Murkin J.M. “Primum non nocere”: the role of hydroxyethyl starch 130/0.4 in cerebral resuscitation. Can J Anaesth 2012; 59: 1089-94.

12. Bodmer S.I., Balestra G.M., Harms F.A., Johannes T., Raat N.J., Stolker R.J., Mik E.G. Microvascular and mitochondrial PO(2) simultaneously measured by oxygen-dependent delayed luminescence. J Biophotonics 2012; 5: 140-51. 13. Reinhart K., Perner A., Sprung C.L., Jaeschke R., Schortgen F., Groeneveld A.B., Beale R., Hartog C.S. Unless high-quality clinical data show they are safe, synthetic colloids should not be used in patients with head injury. Intensive Care Med 2012; 38: 1563-4. 14. Effect of Goal-Directed Crystalloid Verus Colloid Administration on Major Postoperative Morbidity. Ongoing clinical trial 2010; NCT01195883. 15. Effects of Colloid and Crystalloid for Pump Priming on the Microcirculatory Alterations During Cardial Surgery. Clinical trial to be started 2012; NCT01713166.

15


|


Zuurstof meten in de praktijk Y.T. Halabi, Drs. S.F. van den Heuvel, Drs. E.G. Mik, Dr.

Inleiding In de publicaties in dit themanummer van het NTvA wordt volop gebruik gemaakt van optische technieken om mitochondriële zuurstofspanning en zuurstofconsumptie te meten. Wiskundige formules en uitgebreide apparatuur beschrijvingen vertroebelen vaak de praktische eenvoud van een techniek. In dit artikel willen we graag een beeld geven van hoe we zulke zuurstofmetingen in de praktijk toepassen. Dit doen we aan de hand van één van de proefdiermodellen die wij de afgelopen tijd hebben ontwikkeld in het laboratorium van de Experimentele Anesthesiologie. Eerdere proefdierexperimenten, uitgevoerd in ons laboratorium, waren vaak experimenten waarin de protoporphyrine IX (PpIX) technologie verder ontwikkeld en gevalideerd werd, maar waar niet direct een klinisch vraagstuk aan ten grondslag lag. De komende tijd willen we een stap verder gaan en klinische problemen als uitgangspunt nemen. Eén van onze doelen in de nabije toekomst is een studie naar de gevolgen van abdominale hypertensie voor de leveroxygenatie. Abdominale hypertensie wordt steeds meer erkend als een belangrijk probleem bij de kritisch zieke patiënt. De verhoogde intra-abdominale druk in combinatie met PEEP is een dubbele aanslag op de perfusie en microcirculatie van de abdominale organen. Meer inzicht in het zuurstofmetabolisme onder deze omstandigheden zou kunnen leiden tot betere herkenning en behandeling van deze aandoening. Proefdiermodellen

voor abdominale hypertensie zijn echter complex en zonder de juiste ervaring is de kans groot dat zulke experimenten mislukken. Daarom is besloten om te beginnen met een minder complex proefdiermodel waarin we alleen de invloed van PEEP op de mitochondriële oxygenatie in de lever meten. Groot voordeel is dat over PEEP al veel bekend is in de literatuur zodat we onze gegevens kunnen gaan vergelijken met eerder onderzoek (zie Kader 1). Gedurende de tweede helft van 2012 hebben wij inmiddels 26 experimenten uitgevoerd in biggen van circa 30 kg. Het doel was de effecten van PEEP op de weefseloxygenatie en zuurstofconsumptie van de lever te meten. Aan de hand van één van deze experimenten willen we een kijkje geven in de gang van zaken rondom de meting van mitochondriële zuurstofdruk (MitoPO2) en mitochondrieel zuurstofverbruik (MitoVO2) in een preklinische experiment. Hoe ons proefdiermodel er precies uitzag zullen we later toelichten. Eerst willen we kort in gaan op de meting van zuurstofdruk en -metabolisme in ons proefdiermodel.

Zuurstofmetabolisme Om het zuurstofmetabolisme in de lever te onderzoeken is in het verleden gebruik gemaakt van het principe van Fick. Hiermee kan het zuurstofverbruik van de lever berekend worden door de flow door de lever en de zuurstof content in de aan- en afvoerende

Afdeling Anesthesiologie, Laboratorium voor Experimentele Anesthesiologie, Erasmus MC Universitair Medisch Centrum Rotterdam contactinformatie S.F. van den Heuvel Afdeling Anesthesiologie Erasmus MC – Universitair Medisch Centrum Rotterdam ’s-Gravendijkwal 230 3015 CE Rotterdam T +31 (0) 10 7040704 Email [email protected]

vaten te combineren. Dit is een bewerkelijke methode waarbij er, in het geval van de lever, canules geplaatst moeten worden in de arteria hepatica, de vena portae en een vena hepatica en flow probes om de vena portae en de arteria hepatica geplaatst moeten worden. Vanwege de vele metingen heeft deze methode een aanzienlijke foutmarge. De PpIX meetmethode is in de uitvoering vele malen simpeler (zie het artikel van Harms et al. elders in deze uitgave van het NTvA) en in onze opzet kunnen we de twee methoden om zuurstofmetabolisme te kwantificeren met elkaar vergelijken. Een groot verschil tussen de twee methoden is dat middels het principe van Fick de totale zuurstof consumptie van het orgaan wordt bepaald, terwijl middels de PpIX meetmethode een klein stukje weefsel wordt onderzocht. Een van de doelen van dit experiment is het vinden van een correlatie tussen de twee meetmethodes. Los van het daadwerkelijke verbruik van zuurstof is ook het zuurstofaanbod en de daaraan gecorreleerde zuurstofspanning in het weefsel interessant. Eerder onderzoek heeft laten zien dat de weefseloxygenatie van de lever te lijden heeft onder een verminderde perfusie [7]. Zelfs het gebruik van een in onze ogen ‘fysiologische’ PEEP zou een voldoende hemodynamische invloed hebben die de leverperfusie doet dalen. De methodes die in het verleden zijn gebruikt om zuurstofdruk in weefsel te meten zijn verre van ideaal. Zo werd vaak gebruik


16

|

Figuur 1 Afbeeldingen ter illustratie van een biggenexperiment. Voor uitleg zie tekst.

gemaakt van Clark elektrodes om de PO2 in het weefsel te meten. Hierbij wordt een naaldelektrode in het weefsel geplaatst. Dit heeft als nadeel dat er weefselschade wordt veroorzaakt en dat er een gemiddelde PO2 wordt gemeten van de PO2’s in de microcirculatie, het interstitium en de cellen. De PpIX meetmethode meet voornamelijk de PO2 in de mitochondriën en zou dus een nauwkeuriger beeld moeten geven van de zuurstof voorziening van de cellen.

De uitvoering Nadat de big in de stal is gesedeerd middels intramusculair toegediende midazolam en ketamine, wordt ze naar ons laboratorium (zie Figuur 1A) gebracht. Daar aangekomen sluiten we

haar aan de monitor aan voor ECG, pulsoxymetrie en temperatuur meting. Voor de toediening van de anesthetica en vocht wordt een venflon ingebracht in een oorvene (zie Figuur 1B). Na verdiepen van de anesthesie en extra pijnstilling plaatsen we een canule in de arteria carotis voor bloeddrukmeting en in de vene jugularis interna om een Swan-Ganz catheter te kunnen inbrengen (zie Figuur 1C). Via een mediane laparotomie wordt de blaas gecatheteriseerd. Een ervaren leverchirurg prepareert vervolgens het ligamentum hepato-duodenale vrij. Hij plaatst flow probes rond de vena portae en arteria hepatica (zie Figuur 1D) en canuleert de vena portae. Wij canuleren daarna een hepatische vene middels een echogeleide punctie (zie

Figuur 1E en 1F). Voor de PpIX meting plaatsen we twee fibers loodrecht op het leveroppervlak. Om er voor te zorgen dat de fiber bij compressie van het weefsel niet het weefsel beschadigt, hebben we een kunststof voetje laten maken om de druk te verspreiden over het oppervlak (zie Figuur 1G en 1H). Eén van de fibers blijft het hele experiment los op de lever liggen. De andere fiber zit vast aan een klem waarmee het leverweefsel gecomprimeerd kan worden zodat we de zuurstofconsumptie kunnen meten. De buik sluiten we vervolgens met doekenklemmen. Eén uur voor de start van het experiment dienen we 5-aminolevulinezuur (ALA) toe zodat we de PpIX metingen kunnen uitvoeren. Dit is het eerste

17


|

proefdierprotocol waarin we de PpIX techniek toepassen in een big en we wisten op voorhand nog niet welke dosering van 5-ALA een bruikbaar signaal op zou leveren. Uiteindelijk hebben middels allometrie de dosering die we gebruikten in de rat omgerekend naar een dosering voor de big (60 mg/ kg). Op verschillende tijdstippen worden bloedsamples afgenomen en zuurstofmetingen uitgevoerd (zie Kader 2). In Figuur 1 zijn voorbeelden te zien van een MitoPO2 meting (zie Figuur 1J) en een MitoVO2 meting (zie Figuur 1K), tijdens één van de experimenten. Elke MitoPO2 meting bestaat uit een vooraf ingesteld aantal metingen (bijvoorbeeld 64) met een frequentie van 20 Hz. De gemeten vertraagde fluorescentie uitdooftijden worden gemiddeld waaruit vervolgens de MitoPO2 wordt berekend. Om de MitoVO2 te meten wordt vooraf een tijdsduur en frequentie ingesteld, in ons geval respectievelijk 20 seconden en 4 Hz. Gedurende deze 20 seconden worden dus 80 metingen gedaan. In dit protocol meten we gedurende 5 seconden een baseline PO2, waarna we de overige 15 seconden een constante druk uitoefenen op het weefsel onder de fiber. Op de monitor is direct te zien dat de MitoPO2 gaat dalen en dat ze na verloop van tijd een nieuw en lager stabiel niveau bereiken. Hieruit kunnen we de zuurstof verdwijningssnelheid berekenen, welke een maat is voor zuurstofverbruik.

Op basis van literatuur verwachtten we de volgende fysiologische mechanismes te kunnen observeren [1-6]: • Een verhoging van PEEP verhoogt de intrathoracale druk • Een verhoging van de intrathoracale druk vermindert de preload • Een verminderde preload verlaagt het hartminuutvolume • Een daling in het hartminuutvolume vermindert de flow naar en daarmee het zuurstof aanbod aan de lever • Een verminderd zuurstof aanbod aan de lever leidt tot een verhoogde extractie ratio • Zodra de maximale extractie ratio is bereikt zal een verder verminderd zuurstofaanbod leiden tot een daling van de zuurstofconsumptie. Dit is het moment dat het orgaan gaat falen • Vochttoediening herstelt de door PEEP geïnduceerde hartminuutvolume daling en herstelt hierdoor het zuurstofaanbod aan de lever

In het uiteindelijke protocol zijn de biggen gerandomiseerd in vier groepen: één controlegroep waarbij de PEEP gedurende het hele experiment 4 cmH2O blijft en geen extra vochtbolus wordt gegeven en drie interventiegroepen waarbij de PEEP naar 8, 12 of 16 cmH2O wordt verhoogd. Het protocol kent vier meetmomenten: T0: Nulmeting na een stabilisatie periode van 60 minuten T1: 30 minuten na verhogen PEEP T2: 30 minuten na herstel van hartminuutvolume door een vochtbolus T3: 30 minuten na het verlagen van de PEEP naar de uitgangswaarde Kader 2

Kader 1

Conclusie Proefdieronderzoek is een waardevol instrument waarmee basaal wetenschappelijke vraagstukken onderzocht kunnen worden. Het is ook een zeer intensief proces waarbij het uiteindelijke resultaat een gevolg is van vallen en opstaan. Zo waren, voordat wij de daadwerkelijke experimenten konden uitvoeren, meerdere pilot experimenten nodig om een goed reproduceerbaar protocol te kunnen schrijven. Natuurlijk kleven er haken en ogen aan proefdieronderzoek en de toepas-

baarheid van de resultaten op de mens is niet altijd vanzelfsprekend. Toch zouden wij de PpIX meetmethode nooit zo ver hebben kunnen ontwikkelen als wij niet de gelegenheid zouden krijgen de techniek toe te passen op proefdieren. In dit artikel hebben wij beschreven hoe de PpIX techniek te gebruiken is in preklinisch onderzoek. Bovendien hebben we een basis gelegd om complexere pathologie zoals abdominale hypertensie, maar ook sepsis, in de toekomst te kunnen bestuderen met de PpIX techniek.

re f e renties 1. Fujita, Y. Effects of PEEP on splanchnic hemodynamics and blood volume. Acta Anaesthesiologica Scandinavica 37, 427–431 (1993). 2. Matuschak, G. M., Pinsky, M. R., Rogers, R. M. Effects of positive end-expiratory pressure on hepatic blood flow and performance. J Appl Physiol 62, 1377–1383 (1987).

3. Brienza, N., Revelly, J. P., Ayuse, T., Robotham, J. L. Effects of PEEP on liver arterial and venous blood flows. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152, 504–510 (1995). 4. Putensen, C., Wrigge, H., Hering, R. The effects of mechanical ventilation on the gut and abdomen. Curr Opin Crit Care 12, 160–165 (2006).

5. Calzia, E., Radermacher, P. Mechanical Ventilation (Papadakos, P. J. & Lachmann, B.) 185–194. 6. Pinsky, M. R. Principles and Practice of Mechanical Ventilation (Tobin, M. J.) 729–758.

7. Kotzampassi, K., Paramythiotis, D., Eleftheriadis, E. Deterioration of visceral perfusion caused by intraabdominal hypertension in pigs ventilated with positive end-expiratory pressure. Surg. Today 30, 987–992 (2000).


|

18


De rode bloedcel: zowel zuurstofdrager als zuurstofsensor N.J.H. Raat, Dr. E.G. Mik, Dr.

Introductie We kennen hemoglobine als het zuurstofbindende eiwit dat rode bloedcellen hun karakteristieke kleur geeft. Onderzoek in de afgelopen jaren heeft laten zien dat hemoglobine in de rode bloedcel niet alleen een zuurstofdrager maar ook een zuurstofsensor is. Bij een verlaging van de hoeveelheid zuurstof in de vaten en weefsels (hypoxie) geeft de rode bloedcel namelijk niet alleen zuurstof, maar ook een aantal vaatverwijdende stoffen af. Deze vaatverwijders zorgen dat meer bloed naar de weefsels stroomt en de hoeveelheid zuurstof ter plekke weer herstelt. Tevens beïnvloeden deze vaatverwijders de zuurstofconsumptie van het weefsel. De rol van rode bloedcel in de zuurstofvoorziening is daarom veel dynamischer en regulerend dan voorheen werd gedacht. Deze nieuwe kennis zou praktische gevolgen kunnen hebben voor onder andere bloedtransfusie.

De eigenschappen van bloed veranderen tijdens bewaren Onderzoeken in de laatste twintig jaar suggereren dat transfusie van patiënten met bewaard bloed leidt tot meer ziekte en sterfte dan transfusie met vers bloed. Vooral kritisch zieke patiënten en patiënten met cardiovasculaire problemen lijken meer risico te lopen [1]. De meeste onderzoeken zijn echter retrospectief uitgevoerd. Daardoor is er geen controle mogelijk geweest van factoren die de uitkomsten beïnvloed kunnen hebben zoals

transfusie met bloedeenheden van verschillende leeftijden en de ernst van de ziekte. Het wachten is dan ook op een aantal prospectieve studies (ABLE, RECESS) die op het moment worden uitgevoerd [2, 3]. Toch zijn er ook vanuit fundamenteel onderzoek in proefdieren aanwijzingen dat bewaard bloed minder effectief is dan vers bloed [4-7]. Rode bloedcelconcentraten in de bloedbank worden bewaard in een speciale vloeistof, maar desondanks treden er veranderingen in de rode bloedcellen op. Hun huidige maximale bewaartijd is daarom beperkt tot vijf weken, gebaseerd op de eis dat 24 uur na transfusie minstens 75% van de rode bloedcellen in de circulatie aanwezig moet zijn. De veranderingen in de rode bloedcel tijdens bewaren worden in de Engelse literatuur wel aangeduid met de term ‘red cell storage lesion’. Hierbij gaat het om biochemische veranderingen zoals een daling in cellulaire pH, 2,3-difosfoglyceraat (2,3DPG) en de energiedrager adenosinetrifosfaat (ATP). Na transfusie normaliseren deze parameters weer, al lopen de schattingen van de benodigde tijdsduur uit een van enkele uren tot 24 uur. Ook treden er veranderingen in morfologie op. De rode bloedcellen worden minder vervormbaar en een verlaging in hun membraanstabiliteit zorgt voor afgifte van ‘microparticles’ en hemolyse. Deze ‘microparticles’ zijn kleine (50-100 nm) afsnoeringen van de rode bloedcel membraan die tevens hemoglobine bevatten.

Afdeling Anesthesiologie, Laboratorium voor Experimentele Anesthesiologie, Erasmus MC Universitair Medisch Centrum Rotterdam

contactinformatie Harold Raat Afdeling Anesthesiologie Laboratorium voor Experimentele Anesthesiologie Erasmus MC – Universitair Medisch Centrum Rotterdam Dr. Molewaterplein 50 3015 GE Rotterdam T +31 (0) 10 7043312 Email [email protected]

Het doel van bloedtransfusie is om de zuurstofconsumptie in het weefsel te herstellen Ernstig bloedverlies door trauma of bloedarmoede leiden tot hypoxie of een anaeroob metabolisme. Tijdens een zuurstoftekort is het belangrijkste doel van een bloedtransfusie om de zuurstofaanvoer en zuurstofconsumptie in het weefsel zo snel mogelijk weer te herstellen. Te traag herstel kan onomkeerbare weefselschade veroorzaken, gevolgd door orgaanfalen en uiteindelijk de dood. De rode bloedcellen moeten dus direct na transfusie hun functie als zuurstofdrager kunnen vervullen. Zowel het zuurstofniveau als de zuurstofconsumptie in weefsel zijn klinisch moeilijk te meten. Daarom blijft het verhogen van het hematocriet van de patiënt een van de primaire klinische doelen van een bloedtransfusie. Dit doel berust op de stilzwijgende aanname dat een verhoging van de zuurstofdragende capaciteit door een bloedtransfusie de oxygenatie in het weefsel zal herstellen. Echter, het is minstens zo belangrijk dat het weefsel in staat is om de toegevoerde zuurstof te gebruiken.

Rode bloedcellen als zuurstofsensor in de vaat verwijding na zuurstoftekort De hoeveelheid zuurstof in een weefsel is een balans tussen de aanvoer van zuurstof door de rode bloedcellen en consumptie van zuurstof door de cellen in het weefsel. Vaatverwijding na zuurstoftekort, speelt daarom een

19


|

Figuur 1 In dit schema is te zien dat het arteriële bloed in het weefsel behalve zuurstof ook de vaatverwijdende stoffen NO en ATP afgeeft die zorgen voor een balans tussen de aanvoer en consumptie van zuurstof. ATP zorgt op zijn beurt door binding aan receptoren op het endotheel voor afgifte van andere vaatverwijdende stoffen waaronder NO. EDHF: Endothelium-derived hyperpolarizing factor; PFI2: Prostaglandine I2 receptor; P2y: Purinergic receptor. Figuur overgenomen en aangepast van J. Gonzalez-Alonso [11].

belangrijke rol bij het in stand houden van deze balans. Het precieze mechanisme van deze zogenaamde hypoxische vasodilatatie is tot nu toe echter onvoldoende begrepen [8]. Behalve zuurstofsensoren in de cellen in het weefsel, blijken ook rode bloedcellen zelf als zuurstofsensor te kunnen optreden. Wanneer door zuurstoftekort de hemoglobinesaturatie in de rode bloedcel afneemt zorgt dit voor de afgifte van de vaatverwijder stikstofmonoxide [9, 10], beter bekend onder zijn Engelse naam nitric oxide en afgekort als NO. Tevens wordt tijdens zuurstoftekort ATP afgegeven dat vervolgens het endotheel stimuleert tot afgifte van vaatverwijders, waaronder NO [11] (zie Figuur 1). Met name acuut anemische patiënten en patiënten met hypoxie zijn afhankelijk van hypoxische vasodilatatie. Deze groep van patiënten zou daarom extra kwetsbaar kunnen zijn voor verlaging van NO in de vaten en weefsels.

NO vermindert de zuurstof consumptie in cellen Naast het effect op de bloedstroom en daarmee de zuurstofvoorziening in het weefsel, heeft NO ook een belangrijk effect op de zuurstofconsumptie van de mitochondriën in de cel. NO remt de mitochondriale ademhaling door een omkeerbare binding aan complex IV (cytochrome C oxidase) van de elektronen transport keten. De groep van Moncada heeft aangetoond dat de zuurstof verdeling van bloed naar het omliggende weefsel wordt gereguleerd door de basale en gestimuleerde afgifte van NO [12]. NO en zuurstof concureren om dezelfde bindingsplaats op complex IV. Hoewel NO veel sterker aan complex IV bindt dan zuurstof is de invloed van NO onder normale omstandigheden beperkt. Dit komt door de veel lagerer mitochondriale NO concentratie. Deze situatie verandert echter drastisch wanneer de mitochondriale zuurstof tijdens hypo-

xie sterk afneemt. NO wordt daarom tijdens hypoxie opeens een veel krachtigere remmer van de mitochondriale zuurstofconsumptie.

NO beïnvloedt de zuurstof verdeling in weefsel Cellen blijken een minimale hoeveelheid zuurstof nodig hebben om voldoende energie te produceren voor hun basale functies. In aanvulling daarop hebben cellen ook een reservecapaciteit waarbij zuurstof wordt geconsumeerd om ‘luxe’ processen van energie te voorzien. Deze reservecapaciteit blijkt tijdelijk verminderd te kunnen worden zonder dat dit in deze cellen tot een energietekort leidt [13]. Zowel zuurstof als NO hebben de hoogste concentratie in en rond de bloedvaten. Verder van de vaten nemen deze concentraties geleidelijk af door zuurstofconsumptie en opname en afbraak van NO door de weefselcellen. De hogere NO concentratie rond


20

|

Figuur 2 NO verhoogt de doordringdiepte van zuurstof van het bloedvat naar de weefselcellen door remming van de zuurstofconsumptie in de cellagen die direct aan het vat grenzen. Vrij hemoglobine breekt NO in het vat af. Daardoor neemt de zuurstofconsumptie in de direct aangrenzende cellagen toe en zorgt voor minder zuurstof en mogelijk hypoxie in dieper gelegen cellagen.

het bloedvat zal vooral tijdens hypoxie de zuurstofconsumptie remmen in cellen die dicht aan het bloedvat grenzen en de meeste zuurstof tot hun beschikking hebben. Doordat deze cellen minder zuurstof gaan consumeren blijft er meer zuurstof over voor de dieper gelegen cellagen [12] (zie Figuur 2). Tijdens hypoxie heeft NO dus niet alleen meer effect op de aanvoer en de consumptie van zuurstof, maar ook op een meer gelijkmatige verdeling van zuurstof in de weefsels dan onder normale omstandigheden. Hypothese: transfusie met bewaard bloed vermindert NO en verstoort zuurstofmetabolisme Onze hypothese is dat kritisch zieke patiënten extra gevoelig zijn voor een afname van NO in hun vaten en weefsels en dat transfusie met bewaarde rode bloedcellen hun hoeveelheid NO verder verlaagt. Hierdoor worden de processen van hypoxische dilatatie, zuurstofconsumptie en zuurstofverdeling ontregeld en blijft het weefsel langer hypoxisch. We denken dat hemoglobine dat vrijkomt door hemolyse en afscheiding van ‘microparticles’ tijdens bewaren een waarschijnlijke kandidaat voor de NO verlaging is. De eiwithoeveelheid van de rode bloedcel bestaat voor meer dan 98% uit hemoglobine dat, eenmaal vrijgekomen uit de cel, snel in staat is om NO te inactiveren.

Hemoglobine inactiveert NO NO speelt een belangrijke rol in de humane fysiologie. NO fungeert als neurotransmitter, remt de samenklontering van bloedplaatjes en de expressie van adhesiemoleculen voor

witte bloedcellen op het endotheel. Daarnaast is NO een antioxidant en een krachtige vaatverwijder [5]. NO wordt in kleine hoeveelheden (~ 0.4 μM) door het endotheel geproduceerd. Vervolgens diffundeert NO naar het vaatlumen en naar de aangrenzende gladde spierlaag in de vaatwand waar het zorgt voor ontspanning van de spiercellen [5]. NO kan net als zuurstof aan hemoglobine binden, maar NO wordt in de aanwezigheid van zuurstof binnen enkele microseconden geoxideerd tot nitraat (NO3-) dat geen directe vaatactiviteit heeft. Ondanks de zeer hoge concentratie hemoglobine (13 g/dl) die aanwezig is in de bloedvaten, is signaaltransductie in de vaten door NO toch mogelijk en reguleert NO circa 25% van de bloedstroom in rust. De diffusie van NO van de vaatwand naar het hemoglobine in de rode bloedcel wordt onder normale omstandigheden namelijk met ongeveer een factor duizend beperkt vergeleken met vrij hemoglobine. Ten eerste is er een zone zonder cellen tussen het endotheel en de rode bloedcellen die ontstaat door laminaire stroming van het bloed (‘plasma skimming’). Daarnaast beperken de membraan van de rode bloed zelf en een niet goed gemengde vloeistoflaag rondom de rode bloedcel, de diffusie van NO in de rode bloedcel. Deze drie effecten tezamen zorgen voor een levensduur voor NO van enkele seconden wat voldoende is voor de functie van NO als vaatverwijder. Maar al deze drie bovengenoemde barrières verdwijnen tijdens hemolyse van de rode bloed cel. Daardoor zal de NO concentratie in het vat dalen waardoor

vaatvernauwing, adhesie van witte bloedcellen en hemostase kunnen optreden. Een recente studie in proefdieren heeft laten zien dat de meeste hemolyse optreedt tijdens het rondcirculeren van het getransfundeerde bloed in het lichaam [6]. Er treedt 10% bloeddrukverhoging op door wegvangen van NO bij een vrije plasma hemoglobine concentratie van circa 130 mg/l (vergelijkbaar met transfusie van 3-4 units) in ratten [5]. Dit ondanks het feit dat de concentratie van het hemoglobine bindende eiwit haptoglobine in de rat 1 g/l is. Ook in een lam model zorgt 300 mg/l vrij plasma hemoglobine voor een 30% toename in de pulmonale arteriedruk [7]. Een verhoogde vrij plasma hemoglobine is tevens de huidige verklaring voor de hypertensie en andere bijwerkingen van hemoglobineoplossingen. De klinische introductie van deze potentiële vervangers van een bloedtransfusie is door deze bijwerkingen tot nu toe tegengehouden [14].

Hemoglobine wordt niet altijd door haptoglobine gebonden Tot nu toe nam men aan dat hapto globine alle vrije hemoglobine bindt en afvoert naar de lever. Het gevormde haptoglobine-hemoglobine complex is echter nog steeds in staat om NO af te breken [15]. Van de binding en opname van hemoglobine door andere cellen is veel minder bekend. Bovendien zijn de meeste experimenten uitgevoerd in gezonde proefpersonen. Tevens is onbekend of door klinische omstandigheden de binding en opname van hemoglobine in weefsel verandert. Te denken valt aan trauma,

21


|

een chirurgische ingreep, omstandigheden met verhoogde endotheelpermeabiliteit (hemorraghische of septische shock), acidose, hypoxie of een verhoogde oxidatieve stress. In een recente prospectieve klinische studie werd een verdubbeling in de hoeveelheid vrij hemoglobine in plasma gemeten na transfusie met twee units bewaard bloed [16]. Tevens werd een toename in NO consumptie in het plasma van de patiënt gemeten. Er was echter geen significante afname in de haptoglobine concentratie na transfusie. Dit onderzoek suggereert dat een lage concentratie vrij hemoglobine blijkbaar in staat is om aan de binding aan haptoglobine te ontsnappen. In een eerdere studie van dezelfde groep bleek hemolyse gerelateerd aan acuut nierfalen na een cardiopulmonale bypass operatie [17]. De vrije hemoglobine concentraties in plasma van patiënten met acuut nierfalen waren

twee keer zo hoog als in patiënten die geen nierfalen ontwikkelden (276 vs 130 mg/l). Er zijn verschillende mogelijkheden denkbaar waarop kleine hoeveelheden hemoglobine aan de binding door haptoglobine kunnen ontsnappen. Hemoglobine zou sneller dan voorheen gedacht aan het endotheel kunnen binden en door opname in de endotheel cel buiten bereik zijn van haptoglobine. Vooral het hemoglobine dat zich in ‘microparticles’ bevindt en onbereikbaar is voor haptoglobine zou met endotheelcellen kunnen fuseren en dieper in de vaatwand kunnen doordringen. Ter plekke zou het dan de hypoxie langer in stand kunnen houden. Enerzijds door de NO hoeveelheid in de cel te verminderen en de zuurstofconsumptie in de cellen grenzend aan het bloedvat te verhogen. Anderzijds door de verdeling van

zuurstof naar de cellen dieper in het weefsel te verminderen (zie Figuur 2).

Conclusie Hemoglobine dat vrijkomt na hemolyse tijdens het transfusieproces kan de hoeveelheid NO in de vaten tijdelijk verlagen. NO speelt een belangrijke rol bij de regulatie van de bloedstroom en zuurstofaanvoer naar het weefsel en de consumptie en verdeling van zuurstof in het weefsel. Juist kritisch zieke patiënten hebben NO nodig om het ontstane zuurstoftekort in hun weefsels door hypoxische vaatverwijding te compenseren. Middels een proefdiermodel dat de kritisch zieke patiënt nabootst en gebruik te maken van de zuurstofmetende technieken elders in dit tijdschrift beschreven hopen we vast te stellen of vrij hemoglobine het zuurstofmetabolisme in weefsel na transfusie nadelig beïnvloedt.

re f e renties 1. Tinmouth, A. et al. Clinical consequences of red cell storage in the critically ill. Transfusion, 2006. 46(11): p. 2014-27. 2. Lacroix, J. et al. The Age of Blood Evaluation (ABLE) randomized controlled trial: study design. Transfus Med Rev, 2011. 25(3): p. 197-205. 3. Steiner, M.E. et al. Addressing the question of the effect of RBC storage on clinical outcomes: the Red Cell Storage Duration Study (RECESS) (Section 7). Transfus Apher Sci, 2010. 43(1): p. 107-16. 4. Raat, N.J. et al. The effect of storage time of human red cells on intestinal microcirculatory oxygenation in a rat isovolemic exchange model. Crit Care Med., 2005. 33(1): p. 39-45. 5. Donadee, C. et al. Nitric oxide scavenging by red blood cell microparticles and cell-free hemoglobin as a

6.

7.

8.

9.

mechanism for the red cell storage lesion. Circulation, 2011. 124(4): p. 465-76. Baek, J.H. et al. Hemoglobin-driven pathophysiology is an in vivo consequence of the red blood cell storage lesion that can be attenuated in guinea pigs by haptoglobin therapy. J Clin Invest, 2012. 122(4): p. 1444-58. Baron, D.M. et al. Pulmonary Hypertension in Lambs Transfused with Stored Blood Is Prevented by Breathing Nitric Oxide. Anesthesiology, 2012. 116(3): p. 637-647. Allen, B.W., Stamler, J.S., Piantadosi, C.A. Hemoglobin, nitric oxide and molecular mechanisms of hypoxic vasodilation. Trends in Molecular Medicine, 2009. 15(10): p. 452-460. Cosby, K. et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin

10.

11.

12.

13.

14.

vasodilates the human circulation. Nat.Med., 2003. 9(12): p. 1498-1505. Jia, L. et al. S-nitrosohaemoglobin: a dynamic activity of blood involved in vascular control. Nature, 1996. 380(6571): p. 221-226. Gonzalez-Alonso J. A novel role for the red blood cell in the regulation of tissue O2 supply. J Physiol, 2012. 590(Pt 20): p. 4983-4. Victor, V.M. et al. Regulation of oxygen distribution in tissues by endothelial nitric oxide. Circ Res, 2009. 104(10): p. 1178-83. Sansbury, B.E. et al. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chem Biol Interact, 2011. 191(1-3): p. 288-95. Natanson, C. et al. Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial infarction and

death: a meta-analysis. JAMA, 2008. 299(19): p. 2304-12. 15. Jeffers, A., Gladwin M.T., Kim-Shapiro, D.B. Computation of plasma hemoglobin nitric oxide scavenging in hemolytic anemias. Free radical biology & medicine, 2006. 41(10): p. 1557-65. 16. Vermeulen Windsant, I.C. et al. Blood transfusions increase circulating plasma free hemoglobin levels and plasma nitric oxide consumption: a prospective observational pilot study. Crit Care, 2012. 16(3): p. R95. 17. Vermeulen Windsant, I.C. et al. Hemolysis is associated with acute kidney injury during major aortic surgery. Kidney Int, 2010. 77(10): p. 913-20.

anesthesiologie Nederlands tijdschrift voor volume 26, Februari 2013

Recommend Documents