MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini berlangsung selama tujuh bulan, yakni mulai dari bulan Februari sampai dengan bulan Agustus 2011. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Materi Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain isolat bakteri asam laktat yaitu L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2 yang berasal dari daging sapi Peranakan Ongole koleksi Laboratorium Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan IPB (Arief, 2011) dan bakteri patogen yakni S. Thypimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, B. cereus, dan S. aureus ATCC 25923. Media yang digunakan adalah deMan Rogosa and Sharpe broth (MRS broth), deMan Rogosa and Sharpe Agar (MRS agar), Nutrient broth (NB), Nutrient Agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA), BPW, yeast extract, aquadest, larutan NaOH 0,1 N dan 1 N, serbuk ammonium sulfat, dan buffer kalium fosfat (campuran KH2PO4 dan K2HPO4 dengan konsentrasi tertentu). Alat-alat yang digunakan antara lain tabung reaksi, cawan petri, ose, hot plate stirrer, gelas ukur, gelas piala, tabung erlenmeyer, timbangan digital, mikropipet, tip, pemanas bunsen, jangka sorong digital, pH meter, autoklaf, oven, buret, vortex, inkubator, refrigerator, sentrifuge, membran saring miliphore diameter 0,22 µm, spektrofotometer UV-Vis, dan membran dialisis diameter 20 µm. Prosedur Karakterisasi Isolat L. plantarum dan Bakteri Indikator L. plantarum yang telah diisolasi dari daging sapi pada penelitian sebelumnya dikonfirmasi kembali untuk memastikan kemurniannya. Konfirmasi dilakukan dengan cara menginokulasi isolat L. plantarum dari kultur induk sebanyak 0,25 ml ke dalam 4,75 ml media tumbuh deMan Rogosa Sharp Broth (MRS broth) lalu diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam, hasil inkubasi didapatkan kultur antara. Sebanyak 1 ml kultur antara diinokulasikan ke dalam 10 ml media MRS broth.
Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam dan hasilnya disebut kultur kerja. Kultur kerja ini yang digunakan untuk mengkonfirmasi kemurnian bakteri uji dan dilakukan melalui pewarnaan Gram. Inokulasi dilakukan dengan metode yang sama juga dilakukan pada bakteri indikator (bakteri patogen). Perbedaannya adalah pada media tumbuh yang digunakan, untuk menumbuhkan bakteri patogen media yang digunakan adalah media nutrient broth (NB). Pewarnaan Gram berdasarkan Waluyo (2008) dilakukan dengan cara membuat preparat ulas dari isolat bakteri baik BAL maupun bakteri patogen yang akan digunakan yang dihomogenkan terlebih dahulu dengan vortex kemudian diambil satu ose dan dioleskan pada kaca objek lalu difiksasi panas menggunakan api. Preparat ulas tersebut kemudian ditetesi dengan kristal violet selama satu menit lalu dimiringkan dengan tujuan untuk meratakan kristal violet. Selanjutnya preparat yang telah ditetesi kristal violet dibilas dengan akuades dan dikeringkan. Preparat ulas yang telah kering tersebut diberi iodium selama dua menit dan dimiringkan kembali, kemudian dibilas dengan akuades dan dibiarkan mengering. Preparat ulas dicuci dengan pemucat warna yaitu etanol 95%, tetes demi tetes selama 30 detik atau hingga zat warna kristal violet tidak terlihat lagi ataupun masih mengalir di atas kaca obyek, kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Preparat ulas selanjutnya ditetesi safranin selama 30 detik, dimiringkan, kemudian dibilas dengan akuades dan didiamkan hingga mengering. Preparat diamati dibawah mikroskop untuk melihat bentuk dan warna dinding sel dari masing-masing isolat. Preparat yang berwarna ungu kebiruan menunjukkan bahwa preparat tersebut termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif sedangkan preparat yang berwarna merah menunjukkan bahwa preparat tersebut termasuk kelompok bakteri Gram negatif. Analisis Kurva Pertumbuhan Isolat L. plantarum Analisis kurva pertumbuhan L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2 dilakukan untuk mengetahui waktu yang optimal dari keempat isolat tersebut dalam menghasilkan bakteriosin. Pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan dengan membuat kurva standar terlebih dahulu. Pembuatan kurva standar adalah sebagai berikut, media MRS broth yang telah diinokulasi dengan isolat L. plantarum, sebanyak 1 ml setiap satu jam sekali selama 24 jam diukur optical density (OD) nya menggunakan spektrofotometer pada λ = 600 nm. Isolat L. plantarum yang sama 17
sebanyak 1 ml diencerkan dengan MRS broth menjadi enam bagian pengenceran yang berbeda yakni 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 dan 1/32. Pengenceran dilakukan menggunakan mikropipet yakni dari masing-masing bagian pengenceran diambil 1 ml untuk diencerkan lagi ke dalam 9 ml media BPW, masing-masing sebanyak 9 kali untuk bagian pengenceran 1, 8 kali untuk bagian pengenceran 1/2, 7 kali untuk bagian pengenceran 1/4, 6 kali untuk bagian pengenceran 1/8, 5 kali untuk bagian pengenceran 1/16, dan 4 kali untuk bagian pengenceran 1/32. Masing-masing pengenceran dengan media BPW selanjutnya dihomogenkan, lalu tiga pengenceran terakhir dari masing-masing bagian pengenceran tersebut diinokulasikan ke dalam cawan sebanyak 1 ml kemudian dituangkan media MRS agar sekitar 15 ml untuk mendapatkan jumlah populasi bakteri. Nilai optical density (OD) dan jumlah populasi bakteri (cfu/ml) dari kultur yang sama (keenam pengenceran yang berbeda: 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 dan 1/32) akan didapatkan persamaan regresi linier: y = ax + b. Hasil pengukuran OD setiap 1 jam sekali merupakan nilai x, kemudian dimasukkan ke dalam rumus tersebut untuk mendapatkan nilai y yang merupakan jumlah populasi yang diinginkan untuk membuat kurva pertumbuhan dengan satuan cfu/ml. Aktivitas Antimikroba Supernatan Bebas Sel Isolat L. plantarum terhadap Bakteri Indikator selama 24 Jam Inkubasi Aktivitas antimikroba supernatan bebas sel dapat diketahui melalui uji antagonistik dengan suatu metode yakni metode difusi sumur agar. Metode tersebut dilakukan dengan mengkonfrontasikan bakteri indikator (patogen dan pembusuk makanan) dengan supernatan bebas sel dari masing-masing isolat L. plantarum di dalam sumur agar. Isolat L. plantarum yang berbeda diinokulasikan ke dalam media tumbuh MRS broth. Media hasil inokulasi isolat dipusingkan dengan sentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu 4 oC. Supernatan yang dihasilkan dari proses tersebut disebut supernatan bebas sel. Supernatan bebas sel kemudian diukur nilai pH menggunakan pH meter dan persentase Total Asam Tertitrasi (%TAT) dengan NaOH 0,1 N setiap 4 jam sekali selama 24 jam. Perhitungan %TAT menggunakan rumus berikut : 0,1 N × Volume NaOH yang digunakan (ml) × 90,08 Volume sampel (ml) ×1000
18
Sumur agar dibuat dengan bakteri indikator sebanyak 106 cfu/ml (disesuaikan dengan standar Mc Farland 0,5) yang berumur 24 jam diinokulasikan ke dalam cawan kemudian dituangkan media konfrontasi yakni Mueller Hinton Agar (MHA), ditunggu hingga dingin dan mengeras lalu dibuat lubang-lubang menyerupai sumur dengan diameter lubang 5 mm. Ke dalam sumur tersebut dimasukkan sebanyak 50 µl supernatan bebas sel. Cawan yang digunakan untuk uji konfrontasi tersebut kemudian disimpan ke dalam refrigerator selama kurang lebih 2 jam lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk di sekitar sumur menandakan adanya aktivitas penghambatan supernatan bebas sel terhadap bakteri patogen. Proses sentrifugasi, pengukuran pH dan %TAT hingga uji antagonistik tersebut dilakukan setiap 4 jam sekali selama 24 jam. Produksi Bakteriosin Kasar Isolat L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2 Produksi Supernatan Netral Isolat L. plantarum yang Berbeda. Sebanyak 1 liter media MRS broth ditambah dengan yeast extract 3% dan NaCl 1% diinokulasi dengan 10% (v/v) kultur L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 20 jam. Media hasil inkubasi disimpan pada refrigerator dengan suhu 4 oC selama 2 jam, kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC. Proses sentrifugasi menghasilkan cairan yang terpisah dengan endapan. Cairan tersebut kemudian dipisahkan (disebut supernatan bebas sel) dan disaring menggunakan membran saring miliphore berdiameter 0,22 µm. Supernatan bebas sel diukur pH nya lalu dinetralkan menjadi 6 menggunakan NaOH 1 N. Supernatan bebas sel yang telah dinetralkan disebut supernatan netral. Supernatan netral yang terbentuk selanjutnya diuji aktivitas antimikrobanya melalui uji antagonistik. Purifikasi Parsial Menggunakan Presipitasi Amonium Sulfat. Purifikasi parsial bakteriosin dilakukan pada supernatan antimikroba netral yang berasal dari L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2. Serbuk ammonium sulfat ditambahkan secara bertahap dengan konsentrasi berbeda sebanyak 40%, 60% dan 80% (Lampiran 18) ke dalam supernatan antimikroba netral untuk mendapatkan endapan protein, kemudian dihomogenkan secara perlahan menggunakan stirrer pada suhu 4 oC selama 2 jam. Supernatan dipisahkan dengan endapan protein yang melayang di atas supernatan 19
dan juga menempel pada dinding erlenmeyer. Endapan protein yang melayang dan menempel pada dinding erlenmeyer disebut prespitat bakteriosin kasar. Prespitat bakteriosin kasar tersebut kemudian dikoleksi ke dalam wadah kaca yang lain dan diukur konsentrasi protein serta aktivitas antimikrobanya melalui uji antagonistik. Dialisis. Dialisis dilakukan dengan tujuan untuk desalting atau menghilangkan garam amonium sulfat yang masih bercampur dengan prespitat bakteriosin kasar. Proses tersebut dilakukan dengan menggunakan buffer kalium fosfat. Buffer kalium fosfat dibuat dengan campuran KH2PO4 dan K2HPO4 dengan konsentrasi tertentu dan memiliki pH 6. Dialisis dilakukan dengan cara memasukkan membran dialisis berdiameter 20 µm yang telah diisi dengan presipitat bakteriosin kasar ke dalam buffer kalium fosfat dengan perbandingan 1:1000 (1 bagian prespitat dan 1000 bagian buffer). Proses tersebut dilakukan di atas stirrer selama kurang lebih 12 jam pada suhu 4 oC, dan selama 12 jam tersebut dilakukan penggantian buffer sebanyak 2 kali (jam ke 2 dan jam ke 4). Hasil dari proses tersebut kemudian didapatkan ekstrak kasar bakeriosin. Ekstrak kasar bakteriosin isolat L. plantarum tersebut selanjutnya disebut dengan bakteriosin kasar. Bakteriosin kasar selanjutnya diukur konsentrasi proteinnya dan dilakukan uji antagonistik. Pengukuran konsentrasi protein dilakukan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada λ = 280 nm. Pengukuran dilakukan berdasarkan penggunaan manual pada alat tersebut yakni dengan mengkalibrasi alat menggunakan blanko yakni buffer kalium fosfat. Apabila hasil yang tertera pada layar alat menunjukkan bahwa konsentransi protein lebih dari 2,5 µg/ml, artinya sampel terlalu pekat dan perlu dilakukan pengenceran dengan buffer kalium fosfat. Pembacaan nilai konsentrasi protein dilakukan sebanyak tiga kali. Hasil akhir yang merupakan konsentrasi protein sampel diperoleh dari hasil pembacaan dikalikan dengan faktor pengencer kemudian dihitung rata-ratanya. Aktivitas Senyawa Antimikroba terhadap Bakteri Indikator (Uji Antagonistik) Ketiga senyawa antimikroba yakni supernatan netral, presipitat bakteriosin kasar dan bakteriosin kasar yang dihasilkan dari tiap tahap produksi bakteriosin kasar disiapkan. Bakteri indikator (patogen dan pembusuk bahan pangan) sebanyak 106 cfu/ml (disesuaikan dengan standar Mc Farland 0,5) yang berumur 24 jam 20
diinokulasikan ke dalam cawan, selanjutnya dituangkan media konfrontasi MHA. Setelah agar mengeras dan dingin, dibuat sumur pada cawan dengan diameter 5 mm. Sebanyak 50 µl senyawa antimikroba hasil dari masing-masing proses produksi dimasukkan kedalam sumur dengan mikropipet. Cawan disimpan dalam refrigerator selama 2 jam untuk memberikan kesempatan bakteriosin berdifusi ke dalam agar. Setelah itu cawan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk di sekitar area sumur menandakan bahwa senyawa antimikroba yang dihasilkan dari masing-masing tahap produksi mampu menghambat bakteri indikator. Selanjutnya dilakukan pengukuran diameter zona bening (mm) menggunakan jangka sorong digital. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan dan analisis data terdiri dari perlakuan dan model rancangan penelitian. Rancangan percobaan dan analisis data yang digunakan pada penelitian ini meliputi analisis kurva pertumbuhan isolat L. plantarum (2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2), aktivitas antimikroba supernatan bebas sel isolat L. plantarum selama 24 jam inkubasi, serta produksi bakteriosin kasar yang terdiri dari tiga tahap yakni tahap produksi supernatan antimikroba netral isolat L. plantarum, purifikasi parsial menggunakan presipitasi amonium sulfat, dan dialisis. Analisis Kurva Pertumbuhan Isolat L. plantarum Analisis kurva pertumbuhan dilakukan untuk mengamati pertumbuhan isolat L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2) yang dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Peubah yang diamati adalah jumlah populasi keempat isolat L. plantarum yang berbeda. Data yang diperoleh kemudian diinterpretasikan secara deskriptif. Aktivitas Antimikroba Supernatan Bebas Sel Isolat L. plantarum terhadap Bakteri Indikator selama 24 Jam Inkubasi Aktivitas antimikroba dilakukan pada isolat L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2) terhadap jenis bakteri indikator (S. Thypimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, B. cereus, S. aureus ATCC 25923) sebanyak tiga kali ulangan. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat, nilai pH dan %TAT supernatan bebas sel keempat 21
isolat L. plantarum yang berbeda. Data yang diperoleh diinterpretasikan secara deskriptif. Produksi Bakteriosin Kasar Isolat L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2 Produksi bakteriosin kasar terdiri dari beberapa tahapan yakni produksi supernatan netral isolat L. plantarum, purifikasi parsial menggunakan presipitasi amonium sulfat dan dialisis. Ketiga tahapan tersebut menggunakan rancangan percobaan rancangan acak lengkap (RAL) pola Faktorial (5x4) dengan perlakuan isolat L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2) terhadap jenis bakteri indikator (S. Thypimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, B. cereus, S. aureus ATCC 25923) dengan tiga kali ulangan. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat dan konsentrasi protein senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh keempat isolat L. plantarum yang berbeda dari ketiga tahap produksi. Analisis data yang digunakan untuk diameter zona hambat senyawa antimikroba adalah analisis ragam, sedangkan analisis data yang digunakan untuk konsentrasi protein senyawa antimikroba adalah diinterpetasikan secara deskriptif. Model statistika yang digunakan menurut Steel and Torrie (1995) adalah sebagai berikut: Yijk = µ + Ai + Bj + (AB)ij + εijk Keterangan: Yijk
= diameter zona hambat isolat L. plantarum ke-i dan bakteri indikator ke-j pada ulangan ke-k (k = 1, 2, 3)
µ
= rataan diameter zona hambat L. plantarum
Ai
= pengaruh isolat L. plantarum ke-i (i = 2C12, 1A5, 1B1 dan 2B2)
Bj
= pengaruh bakteri indikator ke-j (j = S. Thypimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, B. cereus, S. aureus ATCC 25923)
(AB)ij = pengaruh interaksi isolat Lactobacillus plantarum ke-i dengan patogen ke-j εijk
= pengaruh galat percobaan dari isolat L. plantarum ke-i dan bakteri indikator ke-j pada ulangan ke-k
22
Data terlebih dahulu diuji asumsi, apabila data tersebut memenuhi uji asumsi maka selanjutnya data dianalisis dengan analisis ragam secara parametrik, dan apabila hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh nyata (P ≤ 0,05) maka dilanjutkan dengan uji banding Tukey. Analisis data diameter zona hambat pada setiap tahap proses produksi dibedakan berdasarkan isolat L. plantarum dan jenis bakteri indikator.
23
