MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Mechanizmy působení proteinů p53 v nádorové buňce Bakalářská práce
Robert Helma
Vedoucí práce: Mgr. Marie Brázdová, PhD.
Brno 2012
Bibliografický záznam
Autor:
Robert Helma Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Mechanizmy působení proteinů p53 v nádorové buňce
Studijní program:
Bakalářský
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
Mgr. Marie Brázdová, PhD.
Akademický rok:
2011/2012
Počet stran:
67
Klíčová slova:
wild-type p53, mutantní p53, transkripční aktivita, gain of function, regulace p53
Bibliographic Entry
Author:
Robert Helma Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
Mechanisms of p53 action in tumor cell
Degree Programme:
Bachelor's
Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
Mgr. Marie Brázdová, PhD.
Academic Year:
2011/2012
Number of Pages:
67
Keywords:
wild-type p53, mutant p53, transcriptional activity, gain of function, regulation of p53
Abstrakt Nádory mozku patří mezi vysoce invazivní typy nádorů. Inaktivace specifických genů spolu s bodovými mutacemi nádorového supresorového genu TP53 je spojena s nepříznivou prognózou. Mutantní formy p53 disponují celou řadou specifických vlastností spojených s agresivním charakterem nádorů např. inhibice apoptózy, chemorezistence, angiogeneze či zástava diferenciace prostřednictvím transkripční aktivace či represe řady cílových genů. Regulace cílových genů je předmětem intenzivního studia. Mezi mechanismy jejich regulace patří strukturně specifická vazba p53 na DNA, interakce mutantních proteinů p53 s transkripčními faktory (SP1, ETS1 aj.) a jinými proteiny (p63, p73 či TOP1). V rámci bakalářské práce byl studován vliv mutace TP53 na onkogenní chování glioblastomových linií a mechanismus působení mutantní p53. Pro analýzu byly použity jednak základní glioblastomové linie U87 (wtp53), Onda 11 (R273C), U251 (R273H), Onda 10 (G245S) a klony se sníženou expresí p53, odvozené od těchto linií (Usi 12, Usi 16, Osi 10, P1-37). V rámci naší studie byly selektovány stabilní klony odvozené od linie Onda 10 po transfekci shRNA-p53 (pSuper-p53, P1-37). Míra exprese p53 byla analyzována pomocí imunodetekce a úspěšnost integrace plazmidu pSuper-p53 do genomu linie Onda 10 byla ověřena pomocí PCR. Analýza exprese cílových genů mutp53 byla provedena na základě dat z DNA microarray analýz linií U251/Usi 12/Usi 16 a byly navrženy kandidátní geny pro další analýzy (FRMD5, JAK2, NRG1, PPARGC1A, TGFBR2 a VEGFA). Na závěr byl ověřen vliv exprese mutantního proteinu p53 na onkogenní chování, kdy bylo zjištěno, že u linií s potlačenou expresí p53 (Usi 12, Osi 10 a P1) dochází ke snížení jejich schopnosti tvořit kolonie na měkkém agaru.
Abstract Brain tumors belong among highly invasive types of tumors. Inactivation of specific genes along with point mutations of tumor suppressor gene TP53 is linked to poor prognosis. Mutant forms of p53 manage quite a number of specific abilities, associated with aggressive character of tumors e. g. inhibition of apoptosis, chemoresistance, angiogenesis or differentiation block, through transcriptional activation or repression of series of genes. Regulation of target genes is a subject of intensive studies. Into mechanisms of their regulation are involved a structure-specific DNA binding of p53, interaction of p53 mutants with transcriptional factors (SP, ETS1 et al.) and other proteins (p63, p73 or TOP1). In this thesis an influence of TP53 mutation and mutant p53 driven mechanism on oncogenic behaviour of glioblastoma cell lines was studied. Parental glioblastoma cell lines U87 (wtp53), Onda 11 (R273C), U251 (R273H), Onda 10 (G245S) and derived clones with reduced expression of p53 (Usi 12, Usi 16, Osi 10, P1-37) were used for analysis. Stable clones derived from Onda 10 cell line were selected after transfection of shRNA-p53 (pSuper-p53, P1-37). The amount of p53 expression on protein level was analysed by using immunodetection. Successful integration of plasmid pSuper-p53 into the genome of Onda 10 cell line was controlled by PCR. Analysis of mutp53 target genes expression was performed on the basis of DNA microarray data. We analyzed cell line system U251/Usi 12/Usi 16 and suggested couple of a mutp53 target genes, suitable for further analysis (FRMD5, JAK2, NRG1, PPARGC1A, TGFBR2, VEGFA). An influence of mutant p53 expression on oncogenic behaviour was detected by soft agar colony formation assay. The cell lines with repressed expression of mutp53 (Usi 12, Osi 10 and P1) were less able to form colonies in soft agar.
Poděkování Na
tomto
místě
bych
rád
poděkoval
své
vedoucí
bakalářské
práce
Mgr. Marii Brázdové, PhD. za cenné rady, připomínky a metodické vedení práce. Zároveň děkuji celému laboratornímu kolektivu za průběžnou pomoc. Tato práce byla podpořena z projektu r.č. P301/10/2370 "Úloha strukturně selektivní vazby proteinu p53 k DNA u nádorů mozku" Grantové agentury ČR.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 11. května 2012 Robert Helma
Obsah 1. Úvod ............................................................................................................................................... 1 1.1 Obecné znaky kancerogeneze ................................................................................................... 2 1.2 Protein p53 jako nádorový supresor ......................................................................................... 3 1.3 Gen TP53 a jeho mutace ........................................................................................................... 4 1.4 Obecná charakteristika struktury proteinu p53 ......................................................................... 6 1.5 Transkripční aktivita p53 .......................................................................................................... 7 1.5.1 Regulace p53 na úrovni mRNA ........................................................................................ 8 1.5.2 Buněčná lokalizace a regulace hladiny p53 ...................................................................... 9 1.5.3 Posttranslační modifikace wtp53 ................................................................................... 11 1.5.4 Interakce wtp53 s ostatními proteiny .............................................................................. 12 1.5.5 Přehled nejlépe charakterizovaných efektorových genů wtp53 ...................................... 13 1.6 Mutantní p53 a jeho regulace.................................................................................................. 16 1.7 Získání onkogenních vlastností mutp53 (gain of function) .................................................... 18 1.7.1 Interakce s p63 a p73 ...................................................................................................... 18 1.7.2 Vazba mutp53 na DNA a interakce s transkripčními faktory ......................................... 19 1.7.3 Ztráta funkce nádorového supresoru ( loss of function) ................................................. 21 1.8 Využití znalostí mutací TP53 v klinické praxi ....................................................................... 22 1.9 Cíle bakalářské práce .............................................................................................................. 23 2. Materiál ........................................................................................................................................ 24 2.1 Použité chemikálie .................................................................................................................. 24 2.2 Složení roztoků a pufrů ........................................................................................................... 24 2.3 Použité přístroje ...................................................................................................................... 25 2.4 Použité buněčné linie .............................................................................................................. 26 2.5 Použité plazmidy..................................................................................................................... 26 2.6 Použité primery při PCR ......................................................................................................... 27 3. Metody.......................................................................................................................................... 28 3.1 Transfekce plazmidů pSuper a pCI-neo .................................................................................. 28 3.2 Práce s tkáňovými kulturami .................................................................................................. 28 3.3 Příprava peletu savčích nádorových linií ................................................................................ 28 3.4 Izolace genomové DNA pomocí fenol-chloroformové extrakce ............................................ 29 3.5 Kontrola integrace plazmidů do genomové DNA pomocí PCR ............................................. 29 3.6 Elektroforéza DNA v agarózovém gelu .................................................................................. 30 3.7 Detekce DNA v agarózovém gelu .......................................................................................... 30 3.8 Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové ................................................................... 30
3.9 Dělení proteinů metodou SDS-PAGE .................................................................................... 31 3.10 Přenos proteinů na membránu ................................................................................................ 31 3.11 Imunodetekce proteinů na membráně..................................................................................... 32 3.12 Test tvorby kolonií v měkkém agaru ...................................................................................... 32 4. Výsledky ....................................................................................................................................... 33 4.1 Analýza exprese p53 v glioblastomových liniích ................................................................... 33 4.2 Příprava a analýza stabilních klonů ........................................................................................ 34 4.2.1 Analýza integrace plazmidů pSuper a pCI-neo do genomu klonů pomocí PCR ............ 36 4.3 Vliv exprese mutp53 na onkogenní chování vybraných glioblastomových linií .................... 38 4.4 Návrh cílových genů mutp53 pro expresní studie u vybraných glioblastomových linií......... 39 5. Diskuze ......................................................................................................................................... 41 6. Závěr ............................................................................................................................................ 45 7. Seznam použité literatury........................................................................................................... 46
Seznam použitých zkratek 11D3 Apaf-1 APC ASPP ATM ATR BAX BCL-2 CDKs CK1 CP-31398 DDB1/ DDB2 DMEM DNE DO-1 E1A Ets1 FRMD5 GADD45 GOF GPX HR HSP90/ HSP70 CHIP CHK1/ CHK2 JAK2 LFS MAPK MDM2 MDM4 (MDMX) MDR-1 miR-34 miR-34b\c MLH1 MMR MRE11 mTOR mutp53 mutp53 myc
monoklonální anti-p53 protilátka apoptotic protease activating factor 1 adenomatous Polyposis Coli apoptosis-stimulating protein of p53 ataxia telangiectasia mutated ataxia telangiectasia and Rad3 related BCL2-associated X protein B-cell CLL/lymphoma 2 cyklin dependentní kinázy casein kinase 1 cell permeable styrylquinazoline p53 modulator damage- DNA binding protein 1 / damage- DNA binding protein 2 Dulbecco's Modified Eagle Medium dominantně negativní efekt monoklonální protilátka proti proteinu p53 Early E1A 32 kDa protein transkripční faktor rodiny ETS (E-twenty six-1) FERM domain containing 5 growth arrest DNA damage-inducible gene 45 gain of function glutathione peroxidase homologní rekombinace heat-shock protein 90 / Heat-shock protein 70 carboxyl-terminus of Hsp70 Interacting Protein checkpoint kinase 1/checkpoint kinase 2, protein kinázy Janus kinase 2 Li-Fraumeniho syndrom mitogeny aktivovaná protein kináza human homolog of mouse double minute 2 human homolog of mouse double minute 4 multi drug resistance 1 microRNA 34a microRNA 34b\c human mutL homolog 1 mismatch repair meiotic recombination 11 mammalian Target Of Rapamycin mutantní p53 mutantní p53 protoonkogen kódující transkripční regulační faktory
MYST NER NES NF-Y NF-κB NLS NRG1 p21waf1 p300/CBP p53, p53β a p53γ p53AIP1 PAb421 PCAF PCNA PIG-3/PIG-6 PMS2 POX PPARGC1A PRIMA-1 PTEN PUMA PXXP Rad51 Ras RE ROS SAM ScFV SDS-PAGE SOD2 Sp1 SV40 T TGFBR2 TIGAR TIP60 TMEM108 TNFα TOP1 TP53, TP73, TP63 VDR VEGFA wtp53 XPC
MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2, and Tip60, rodina histon acetyltransferáz nucleotide excision repair nuclear export signal transkripční faktor Y nuclear factor- κB nuclear localization signal neuregulin 1 gen kódující protein p21 komplex transkripčních koaktivátorů CBP (CREB binding protein) a p300 izoformy proteinu p53 p53-regulated Apoptosis-Inducing Protein 1 monoklonální protilátka proti proteinu p53 P300/CBP-associated factor proliferating cell nuclear antigen p53-inducible gene 3 / p53-inducible gene 6 postmeiotic segregation increased 2 proline oxidase peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alpha p53 reactivation and induction of massive apoptosis phosphatase and tensin homolog p53 up-regulated modulator of apoptosis doména bohatá na prolin protein z rodiny Rad51, účástnící se opravy DNA dvouřetězcových zlomů onkogen kódující signální transduktory responzivní element reactive oxygen species sterile alpha-motif single chain FV fragments sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis superoxide dismutase 2 specifity Protein 1 simian virus 40 T-antigen transforming growth factor, beta receptor II TP53-inducible glycolysis and apoptosis regulator tat-interactive protein 60, acetyltransferáza transmembrane protein 108 tumor necrosis factor-alpha topoizomeráza 1 geny kódující proteiny p53/p63/p73 vitamin D3 receptor vascular endothelial growth factor A wild-type p53, přirozeně se vyskytující typ p53 xeroderma pigmentosum, complementation group C
1. Úvod Problematika vzniku nádorů patří v současnosti stále mezi aktuální témata. Jelikož se na vzniku nádorů podílí velké množství faktorů, je předmětem studia vědců z celého světa najít chybějící díly této skládanky, které by pomohly objasnit úlohu jednotlivých mechanismů zahrnutých do iniciace vzniku nádorů. Jeden z nejdůležitějších faktorů, aktivně se účastnící nádorové suprese, je protein p53. Tento protein může být přirovnán k dirigentovi symfonického orchestru. Jeho hlavní úlohou je udržovat v buňce harmonii všech procesů při odpovědi na různé druhy buněčného stresu. Celkové harmonie je docíleno koordinací exprese velkého množství efektorových genů, které tímto zaujímají roli jednotlivých hráčů symfonického orchestru. Mezi efektorové geny patří i takové, co se přímo podílejí na regulaci buněčného cyklu např. p21. Pokud některý z hráčů orchestru hraje falešně (chybná regulace genové exprese) a zároveň je narušena regulace buněčného dělení, může dojít k transformaci normální buňky v buňku nádorovou.
Transkripční
aktivita
p53
je
podmíněna
sekvenčně
specifickou vazbou k DNA, do oblasti promotorů cílových efektorových genů. Expresí těchto genů poté vznikají molekuly, které se následně účastní boje proti vzniku nádorů. Ztráta zmíněných transkripčních vlastností p53 představuje nejzávažnější problém asociovaný se vznikem nádorů. Nejčastěji bývá v důsledku mutací postižena právě DNA vazebná doména proteinu. Existují však i mutanti s částečně zachovanou transkripční aktivitou. Mutantní formy p53 (mutp53) disponují celou řadou nových schopností, které propůjčují mutp53 vlastnosti onkogenu. Mezi tyto schopnosti patří mj. inhibice apoptózy, chemorezistence či zástava diferenciace. Rozpoznávání a regulace nových efektorových genů (specifických pro mutp53), interakce s jinými transkripčními faktory nebo regulace netranskripčních procesů, pak představují mechanismy, tvořící základ, pro již zmíněné onkogenní vlastnosti mutp53. Každý objev, např. nových mutací či cílových genů mutp53, významně přispívá ke specifikaci daného druhu nádoru a může ve výsledku napomoci lékařům při volbě účinného zacílení léčby.
1
1.1 Obecné znaky kancerogeneze Proces vzniku nádoru je vícestupňový proces, jehož podstatou je postupné hromadění genetických a epigenetických změn. Základní jednotkou genetické informace jsou geny, z nichž každý kóduje specifický produkt, jakým je RNA nebo protein. Pokud některý z genů podlehne mutaci, dochází jeho následnou transkripcí a translací ke vzniku produktu, jenž se svými vlastnostmi liší od produktu, který by vznikl transkripcí genu nepostihnutého mutací. Z mutací účastnících se tvorby nádorů jsou nejdůležitější mutace, které mění strukturu genů, což má za následek změnu struktury vznikajících proteinů a současně změnu míry jejich exprese (Adam et al., 2003). Bylo zjištěno, že u hlodavců jsou zapotřebí alespoň dvě genetické změny k tomu, aby došlo k samotné transformaci buňky. U lidí je transformace buněk znesnadněna a minimální počet genetických změn je odhadován na 4. (Hahn et al., 1999). Konkrétních genů, které při tvorbě nádorů podléhají mutaci, je velké množství. Mezi nejdůležitější mutace, způsobující přeměnu normální buňky v buňku nádorovou, však patří mutace protoontogenů a nádorových supresorů (antiontogenů). Protoontogeny kódují proteiny, které jsou zodpovědně za aktivaci buněčného cyklu a stimulaci proliferace, na
rozdíl
od
nádorových
supresorů,
které
udržují
buňku
v klidovém
stadiu
(Adam et al., 2003). Jak již bylo zmíněno, kancerogeneze je vícestupňový proces, který vede ke vzniku buněk, jejichž společným jmenovatelem je defekt v některé z drah, zajišťujících normální buněčnou proliferaci a homeostázu. Dosud bylo objeveno přes 100 různých druhů rakoviny. Je nutné si uvědomit, že proces vzniku nádorové buňky je charakterizován individuálním průběhem, který zahrnuje změny v buněčné fyziologii. Ukázalo se, že pro vývoj maligního nádoru musí v buňce proběhnout několik fyziologických změn, které vedou k potlačení protirakovinných obranných mechanismů. Mezi tyto změny společné pro všechny typy nádorů patří: poškození apoptózy, neomezený replikační potenciál, posílená angiogeneze, tvorba metastáz, nestabilita genomu, soběstačnost v produkci růstových signálů a necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus (obrázek č. 1). Vzhledem k množství druhů maligních nádorů, závisí jejich tvorba na tom, kolik změn proběhne, v jakém pořadí a na konkrétních genech, které jsou zasaženy (Hanahan a Weineberg, 2000). Cílem této kapitoly bylo uvědomit si, že vznik nádoru není důsledkem jednoho zásahu, ale jedná se o více zásahů, které společně umožňují vznik nádoru. 2
Obrázek č. 1. Přehled změn v buněčné fyziologii, nezbytných pro vývoj maligního nádoru (převzato a upraveno dle Hanahan a Weineberg, 2000).
1.2 Protein p53 jako nádorový supresor Nádorové supresory patří do široké skupiny molekul, jejichž primární funkcí je kontrola buněčného dělení, aktivace apoptózy a potlačení tvorby metastáz. Ztrátou některé z těchto funkcí nádorového supresoru, ať už vlivem mutace nebo poškození, může dojít ke vzniku rakoviny. Nejvýznamnějším proteinem, účastnícím se boje proti vzniku rakoviny je protein p53. Od objevu proteinu p53 uběhlo již 33 let. Zpočátku byly tomuto proteinu přisuzovány vlastnosti nádorového antigenu, a to díky jeho schopnosti interagovat s virovým SV40 T-antigenem a díky vysokým hladinám tohoto proteinu detekovaným v nádorových buňkách (Lane a Crawford, 1979; Linzer a Levine, 1979; Kress et al., 1979). Četné pokusy na myších vedly v průběhu 80. let k poznání, že p53 funguje jako pozitivní regulátor buněčné proliferace. S označením p53 jako onkogenu byly spojeny pokusy, zaměřené na kotransfekci myší p53 cDNA s plazmidy kódujícími aktivovaný Ras
3
onkogen. Výsledkem těchto pokusů byla buněčná transformace, podobná transformaci vyvolané protoonkogeny myc či E1A (Eliyahu et al., 1984, Prada et al., 1984). Koncem 80. let již bylo jasné, že cDNA klony p53, které způsobovaly buněčnou transformaci, obsahovaly ve své struktuře mutaci, a že cDNA klony wtp53 zabraňují transformaci způsobené onkogeny. Z tohoto důvodu byl protein p53 zařazen do rodiny nádorových supresorů (Finlay et al., 1989). Protein p53 hraje klíčovou roli v boji proti vzniku nádorů a je právem označován jako strážce genomu (Lane, 1992). V roce 1993 byl p53 zvolen molekulou roku (Koshland, 1993).
Protein p53 je exprimován v normálních buňkách a je lokalizován v jádře.
Tato lokalizace je důležitá pro schopnost odpovědi na podněty, navozující genotoxický stres (Okorokov et al., 2002). Jako nádorový supresor je středem signálních drah, které zajišťují kontrolu buněčného cyklu a integritu lidského genomu (shrnuto v Joerger a Fersht, 2010). Kromě schopnosti zastavovat buněčný cyklus a indukovat apoptózu, jako odpověď na různé druhy buněčného stresu, účastní se p53 dalších procesů, jako jsou reparace DNA, diferenciace a senescence (shrnuto v Colleen et al., 2010). Funkce nádorových supresorů je podmíněna schopností interagovat s DNA. P53 se váže na oblasti DNA označované jako responzivní elementy (RE) a tím způsobuje zvýšení či snížení transkripční aktivity genu, na kterém se daný RE nachází (el-Deiry et al., 1992; Funk et al., 1992).
1.3 Gen TP53 a jeho mutace TP53 je gen, kódující fosfoprotein o velikosti 53 kDa. Je lokalizován na 17. chromozomu a obsahuje 11 exonů, z nichž první se neexprimuje. Spolu s TP73 a TP63 patří do rodiny vysoce konzervovaných genů (Guimaraes a Hainaut, 2002). V obranné protirakovinné funkci má tento gen významné postavení a jeho mutace se odráží v poškození nádorové supresorové funkce proteinu p53. U lidských nádorů se mutace v genu TP53 vyskytují ve více jak 50%. Největší část tvoří bodové mutace měnící smysl kodonu, jejichž výsledkem je substituce jedné aminokyseliny za jinou. Nejvíce mutací se nachází na DNA-vazebné doméně p53, což může výrazně ovlivňovat vazbu proteinu na DNA (Guimaraes a Hainaut, 2002).
4
Mezi další změny vedoucí k inaktivaci TP53 patří ztráta alel nebo inaktivace genu virovými či buněčnými proteiny. Mutace genu TP53 můžeme rozdělit na somatické a zárodečné. K tomu, aby se mutace uplatnila při tvorbě nádoru, musí proběhnout inaktivace obou alel daného genu. Proto jsou somatické a zárodečné mutace doprovázeny ztrátou heterozygotnosti během nádorové progrese (shrnuto v Brosh a Rotter 2009). Druhou možností je dělit mutace TP53 podle jejich vlivu na termodynamickou stabilitu proteinu p53. Vzniklé mutantní formy p53 můžeme rozdělit na kontaktní a konformační mutanty. Důsledkem těchto mutací jsou poruchy schopnosti p53 sekvenčně specificky se vázat na DNA (Joerger a Fersht, 2007; Bullock a Fersht, 2001). Četnost a distribuce mutací p53 je zobrazena na obrázku č. 2. Dědičnost mutantní formy TP53, vede k predispozicím vzniku rakoviny, konkrétně rakoviny prsu, mozku a kůry nadledvinek. Tato familiární dědičnost predispozice různých druhů rakoviny je označována jako Li-Fraumeniho (LFS) a Li-Fraumeniho-like (LFL) syndrom (Li et al., 1988, Olivier et al., 2003). LFS je vzácný druh autozomálně-dominantní poruchy. Postižené rodiny vykazují vysokou incidenci při vzniku rakoviny. Zatímco somatické mutace se vyskytují téměř v každém typu rakoviny, pro LFS jsou charakteristické zárodečné mutace v jedné z alel, kódujících p53 (Levine et al., 1991, Brosh a Rotter 2009).
Obrázek č. 2. Četnost a distribuce mutací p53 (převzato a upraveno dle Bullock a Fersht, 2001). Římské číslice označují vysoce evolučně konzervované sekvence proteinu p53. Histogram mutací měnících smysl kodonu ukazuje, že 97% mutací se vyskytuje v DNA-vazebné 5
doméně. Nejčastěji frekventovaná místa mutací jsou označována jako hotspots (R175, G245, R248, R249, R273, R282).
1.4 Obecná charakteristika struktury proteinu p53 Protein se skládá celkem z 393 aminokyselin, které jsou uspořádány do čtyř hlavních domén (obrázek č. 3). Na N-terminálním konci se nachází transaktivační doména (TAD), která je zodpovědná za transkripční aktivitu tohoto proteinu. Umožňuje regulaci exprese cílových genů, ať už přímou vazbou na koaktivátory transkripce, či vazbu na komponenty bazální transkripce (shrnuto v Millau et al. 2010). Zároveň je TAD místem, kde se odehrávají četné posttranslační modifikace a interakce negativních regulátorů, jakými jsou např. MDM2, MDM4. TAD se dále dělí na tři části, kterými jsou TAD1, TAD2 a doména bohatá na prolin. (shrnuto v Joerger a Fersht, 2010). Doména bohatá na prolin obsahuje pět kopií PXXP, kde X představuje libovolnou aminokyselinu. Ukázalo se, že její přítomnost je nezbytná pro účinnou supresi buněčného růstu a je klíčová při apoptóze zprostředkované proteinem p53 (Baptiste et al., 2002; Zhu et al., 1999). Tato doména je zároveň zahrnuta do odpovědi na poškození buňky, díky zprostředkování vazby p53 na F-aktin v jaderné matrix (Okorokov et al., 2002). Další součástí domény bohaté na prolin je negativní regulační doména, která snižuje vazebné schopnosti p53 vůči DNA (Müller-Tiemann et al., 1998). DNA vazebná doména zodpovídá za interakci p53 s DNA, jeho konformaci a vazbu zinku. Mimo jiné, umožňuje vazebná doména interakci s celou škálou proteinů a účastní se tak nádorové suprese. Příkladem mohou být proteiny z rodin ASPPs, p63 a p73, které jsou zahrnuty do procesu apoptózy (shrnuto v Millau et al., 2010). Poslední část proteinu p53 tvoří C-terminální oblast. Je složená z oligomerizační domény a bazické domény. Oligomerizační doména umožňuje p53 tvorbu dimerů při kotranslačních procesech a následně tvorbu tetramerů v posttranslačních procesech (Nicholls et al. 2002). Také je zde přítomná sekvence aminokyselin tvořících NES (Nuclear Export Signal), která řídí přesun proteinu z jádra do cytoplazmy. Na bazické doméně se potom nachází několik sekvencí NLS (Nuclear Localization Signal), jejichž úkolem je naopak zprostředkovat migraci proteinu z cytoplazmy do jádra. Nachází se zde také druhá negativní autoregulační doména (Shaulsky et al., 1990). Kromě toho umožňuje
6
bazická
doména
i
sekvenčně
nespecifickou
vazbu
proteinu
na
DNA
(Wang et al., 1993).
Obrázek č. 3. Struktura proteinu p53 (převzato a upraveno dle Millau et al. 2010).
1.5 Transkripční aktivita p53 Jako transkripční faktor koordinuje wtp53 buněčnou odpověď na stresové podněty a poškození DNA prostřednictvím iniciace transkripce cílových genů. Výsledkem je především zástava buněčného cyklu, oprava DNA nebo apoptóza (Horvath et al., 2007). Transkripční aktivita p53 je podnícena přímou vazbou proteinu na DNA, do oblastí RE. Tyto oblasti jsou charakteristické tím, že obsahují dvojici invertních pentamerních sekvencí, zpravidla se vyskytujících v tandemech nebo s rozestupem 0-13 bp. RE se nachází v oblasti promotorů nebo prvních intronů efektorových genů (shrnuto v Millau et al. 2010). P53 rozpoznává a váže se na RE ve formě tetramerů. Tvorba tetramerů je umožněna díky oligomerizační doméně na C-terminálním konci proteinu. Tetramery jsou složeny z dvojice symetrických dimerů, z nichž všechny čtyři podjednotky jsou geometricky ekvivalentní (Mc Lure a Lee, 1998). Po rozpoznání a navázání tetrameru na RE dochází k regulaci genové exprese interakcí s bazálním transkripčním faktorem TFIID nebo interakcí transkripčních koaktivátorů, jako jsou p300 a CBP. Vazbou tetrameru na DNA může p53 regulovat transkripci cílových genů také nepřímo, tvorbou komplexů s jinými transkripčními faktory. Příkladem může být Sp1 (Specifity Protein 1), který jakožto transkripční faktor hraje významnou roli v regulaci důležitých biologických procesů kontrolovaných proteinem p53 prostřednictvím genu p21. Expresí genu p21 vzniká stejnojmenný protein, který je zahrnutý do progrese buněčného cyklu v savčích buňkách (shrnuto v Millau et al. 2010; Koutsondotis et al., 2001).
7
1.5.1 Regulace p53 na úrovni mRNA První stupeň v regulaci p53 tvoří změny, odehrávající se na úrovni mRNA. Transkripce genu TP53 může být iniciována jak z promotoru přítomného na prvním exonu, tak z interního promotoru nacházejícího se na intronu č. 4. Kombinací alternativního sestřihu intronů 2 a 9 společně s využitím interního promotoru na intronu č. 4 a alternativní iniciace translace, můžeme rozlišit až 9 různých izoforem p53. Alternativním sestřihem C-konce vznikají 3 izoformy: p53, p53β a p53γ. Využití alternativního promotoru vede ke vzniku izoforem se zkrácenou N-terminální částí (obrázek č. 4) (Bourdon et al., 2005).
Obrázek č. 4. Schéma lidského TP53 a izoforem p53. (A) Schéma genu, kódujícího p53 u lidí. (B) Schéma izoforem p53 teoreticky kódovaných lidským TP53 (převzato a upraveno dle Bourdon et al., 2005).
Izoforma p53i9 (p53β) vzniká alternativním sestřihem intronu 9. Na rozdíl od fulllength p53 se tato izoforma skládá pouze z 341 aminokyselin. In vitro se p53i9 není schopný vázat na DNA a in vivo vykazuje defekt v transkripční aktivitě. Příčinou těchto 8
defektů je ztráta části oligomerizační domény na C-terminální části, a tím pádem neschopnost p53 tvořit tetramery a vázat se na DNA (Murray-Zmijewski et al., 2006). Druhá izoforma zvaná p47 vzniká buď alternativním sestřihem 2. intronu nebo alternativní iniciací translace. Na rozdíl od p53i9 je p47 zkrácený o prvních 40 aminokyselin v N-terminální části proteinu. Vzhledem k tomu, že p47 obsahuje velkou část transaktivační domény, může po transfekci aktivovat genovou expresi prostřednictvím sekundární transaktivační domény. Kromě toho může p47 vykazovat dominantně negativní efekt vůči wtp53, jehož důsledkem je inhibice transkripční aktivity a p53-zprostředkované apoptózy. Ukázalo se také, že p47 může modifikovat buněčnou lokalizaci p53 a tím inhibovat jeho degradaci pomocí MDM2 (Bourdon et al., 2005).
1.5.2 Buněčná lokalizace a regulace hladiny p53 Buněčná lokalizace je dalším z faktorů významně se podílejících na regulaci transkripční aktivity p53. Nově vzniklý p53 se během G1 fáze buněčného cyklu akumuluje v cytoplazmě. Na přelomu G1/S fáze vstupuje do jádra a v S fázi se vrací opět do cytoplazmy. Protože primárně vystupuje p53 jako transkripční faktor, přispívá jeho snížená koncentrace v jádře ke snížení transkripční aktivity. Jedním z hlavních mechanismů, které zprostředkovávají přesun p53 z jádra do cytoplazmy a naopak, je
ubiquitinace
zprostředkovaná
proteinem
MDM2
(Shaulsky
et
al.,
1990;
Moll et al., 1996). Tento mechanismus hraje ústřední roli v odpovědi buňky na různé druhy buněčného stresu. Kromě MDM2 je kontrola stability a aktivity proteinu p53 zprostředkována ještě dalším proteinem (MDM4). Hlavní úlohou těchto proteinů je kontrolovat hladinu p53 a v případě zvýšené hladiny proteinu, zprostředkovat jeho degradaci na proteozomu (Goh et al., 2010). Pokud buňka nečelí stresové situaci, váže se MDM2 na transaktivační doménu proteinu p53. Tato vazba způsobí utlumení transkripční aktivity p53 zablokováním vazebného místa pro koaktivátory transkripce. Druhou vlastností MDM2 je její ubiquitin ligázová aktivita, způsobující ubiquitinaci zbytků lysinu na C-terminálním konci proteinu, což má za následek následné navození jeho degradace na proteozomu.
9
Buněčný stres způsobí aktivaci příslušných kináz, které zahajují fosforylaci zbytků serinu a threoninu na transaktivační doméně. Modifikace způsobené fosforylací, snižují schopnost vazby MDM2 k transaktivační doméně p53. Schopnost specifické vazby MDM2 utlumují také modifikace v doméně bohaté na prolin. Snížení vazebné schopnosti MDM2 vede k akumulaci p53, aby se následně mohly tvořit tetramery. Vznik tetramerů maskuje signály, jejichž úkolem je řídit přesun p53 z jádra do cytoplazmy. Výsledkem je tendence tetramerů zůstat v jádře. Nicméně studie ukázaly, že zlomek molekul p53 může zůstat v cytoplazmě, kde se účastní procesů apoptózy (shrnuto v Toledo a Wahl, 2006). Druhou molekulou spojenou s regulací p53 je MDM4, známý také jako MDMX. Tento protein je strukturou podobný MDM2, zejména v oblasti p53-vazebné domény. Díky této podobnosti je schopen MDM4 vázat se přímo na p53, avšak na rozdíl od MDM2 není schopen zprostředkovat ubiquitinaci. Při zvýšené expresi inhibuje MDM4 degradaci p53 zprostředkovanou MDM2 soupeřením o vazebné místo na p53. Další schopností MDM4 je stabilizace MDM2 prostřednictvím tvorby heterodimeru. Tento komplex zabraňuje vlastní ubiquitinaci MDM2 a zvyšuje schopnost ubiquitinace p53. (Shvarts et al., 1996; Gu et al., 2002). Kromě interakce MDM2 s wtp53, interaguje tento protein také s mutp53. Interakce MDM2 s mutp53 se liší od interakce s wtp53 v tom ohledu, že mutp53 postrádá schopnost aktivovat MDM2. Z tohoto důvodu může být v buňce nedostatečné množství proteinu MDM2, který by zajistil snížení hladiny mutp53 (Terzian et al., 2008). Zjednodušeně je působení negativních regulátorů znázorněno na obrázku č. 5.
10
Obrázek č. 5. Znázornění rozdílů v regulaci wild-type a mutantní formy p53. Za normálních podmínek je hladina p53 držena pomocí MDM2 a MDM4 na nízkých hodnotách. Buněčný stres či aktivace onkogenů mají za následek zvýšení hladiny wtp53 a mutp53. Vzniklý tetramer se poté váže na DNA a umožňuje transkripci cílového genu. Zároveň zvýšená exprese MDM2 obnovuje původní hladinu p53. Mutantní p53 není schopná této negativní regulace a může tak inhibovat wtp53, p63, p73 či jiné proteiny (převzato a upraveno podle Goh et al., 2010).
1.5.3 Posttranslační modifikace wtp53 Jako posttranslační modifikace označujeme kovalentní adici funkčních skupin k proteinu vzniklého translací. Mezi nejdůležitější modifikace p53 patří fosforylace a acetylace zbytků serinu a threoninu (Bode a Dong, 2004). Velké množství serinových a threoninových zbytků se nachází na transaktivační doméně N-terminálního konce p53 a v C-terminální části. Fosforylace umožňuje regulaci biologické aktivity stovek proteinů. Je zprostředkována proteinkinázami, mezi které patří např. ATM, ATR, CHK1, CHK2, MAPK a CK1.
Uvedené kinázy jsou aktivovány
při poškození DNA nebo následkem působení jiného stresového signálu. Výsledkem je zvýšení stability proteinu a tím pádem zvýšení jeho funkčnosti nebo ovlivnění schopnosti p53 vázat se na cílové sekvence v genomu (shrnuto v Olsson et al., 2007). Hlavním místem kde se odehrávají fosforylace, ovlivňující transkripční aktivitu p53, jsou zbytky aminokyselin Ser15, Thr18 a Ser20. Tyto aminokyseliny se nachází se na transaktivační doméně N-terminálního konce v blízkosti nebo přímo v oblastech, kde se k p53 váže MDM2. Konkrétně je fosforylace Ser15 spojená s transaktivací závislou na p53, zástavou buněčného cyklu a apoptózou, které jsou odpovědí na poškození DNA. Fosforylace Ser20 a Thr18 ovlivňují interakci mezi p53 a MDM2 tím způsobem, že zabraňují ubiquitinaci p53. Specifická vazba p53 k promotoru p53AIP1 a následná indukce apoptózy je způsobena fosforylací Ser46 (Bode a Dong, 2004; Apella a Anderson, 2001; Oda et al., 2000). Mezi další významné posttranslační modifikace patří acetylace. Acetylovány jsou především zbytky lysinu za účasti různých acetyltransferáz. Na rozdíl od fosforylací, probíhají acetylace na C-terminálním konci proteinu. Acetylace zbytků Lys370, 372, 373, 381, 382 je zajištěná heterodimery CBP/p300. Naproti tomu, Lys305 a Lys320, nacházející se v jaderné lokalizační doméně C-konce, jsou acetylovány pomocí PCAF a p300. 11
Ukázalo se, že některé acetyltransferázy (např. MYST, TIP60) jsou schopné acetylovat Lys120 v DNA-vazebné doméně proteinu p53. P53 acetylovaný v oblasti Lys120 se hromadí v oblasti promotoru proapoptotických cílových genů, jako jsou např. BAX a PUMA (shrnuto v Olsson et al., 2007). Acetylace p53 za účasti p300 a PCAF se objevuje jako odpověď na poškození DNA způsobené UV a γ záření. CBP/p300 a PCAF působí jako koaktivátory transkripce, zprostředkované proteinem p53. Vzhledem k tomu, že C-terminální oblast je zároveň místem, kde dochází k ubiquitinaci za účasti MDM2, je acetylace pravděpodobně zodpovědná za stabilizaci p53 (Bode a Dong, 2004, Olsson et al., 2007). Studie prokázaly, že acetylace různých lysinových zbytků má za následek rozdílné efekty p53 v koordinaci genové exprese při buněčné odpovědi na poškození DNA. Konkrétním příkladem může být acetylace Lys320 a Lys373. P53 s acetylovaným Lys320 preferuje vazbu k vysokoafinitním promotorům, které jsou součástí genů, účastnících se zástavy buněčného cyklu a přežití buňky (např p21). Acetylace Lys373 způsobuje preferenci p53 vázat se na nízkoafinitní promotory proapoptotických genů (např. BAX) (Knights et al. 2006). Kromě fosforylace a acetylace se v buňce odehrávají i další modifikace, jako jsou sumoylace, neddylace a methylace, které jsou rovněž zahrnuté do ovlivňování stability a transkripční aktivity p53 (shrnuto v Millau et al. 2010).
1.5.4 Interakce wtp53 s ostatními proteiny Mezi nejdůležitější proteiny, které jsou schopny interagovat s p53, patří proteiny p63 a p73. Všichni tři členové rodiny p53 vykazují značnou homologii, a to jak na úrovni genomové, tak na úrovni proteinu. Ve struktuře každého z nich se nachází transaktivační doména, DNA-vazebná doména a oligomerizační doména. Na rozdíl od p53 obsahují p63 a p73 dlouhý C-terminální konec, který navíc obsahuje motiv SAM, umožňující interakci protein-protein (Levrero et al., 2000). I přes strukturní podobnost, nejsou p63 a p73 přímo spojeny s nádorovou supresí, ale společně s p53 jsou schopny vyvolat indukci specifických cílových genů, díky ovlivňování vazebné afinity. K těmto specifickým genům patří především proapoptotické geny. Interakce p53 s p63 a p73 probíhá buď přes DNA-vazebnou doménu, nebo v oblasti 12
C-terminálního konce. Zatímco mechanismus regulace interakce p53 s p63 nebo p73 prostřednictvím DNA-vazebné domény není dosud přesně objasněn, tak interakce mezi C-terminálním koncem se ukázaly jako klíčové v regulaci transkripční aktivity p53 (shrnuto v Millau et al. 2010). Další skupinou proteinů, schopných vázat se na p53 jsou proteiny z rodiny ASPP. Tyto proteiny, podobně jako p63 a p73, zvyšují proapoptotickou funkci p53, a to jak stimulací sekvenčně specifické vazby k DNA, tak stimulací transaktivačních schopností p53 vůči proapoptotickým genům. ASPP se primárně váží na nízkoafinitní oblasti, které se vyskytují v promotorech proapoptotických genů, jako jsou BAX a PIG-3. To vysvětluje, proč se ASPP neváží k promotorům genů spojených se zástavou buněčného cyklu (např. p21waf1), jejichž transaktivace probíhá především prostřednictvím vysokoafinitních oblastí (Samuels-Lev et al., 2001).
1.5.5 Přehled nejlépe charakterizovaných efektorových genů wtp53 Před začátkem kapitoly si je nutné uvědomit, že efektorové geny zmíněné v kapitole jsou jen malou částí genů, regulovaných proteinem p53. Bylo zjištěno, že p53 RE jsou přítomny na více jak 60 genech (Horvath et al., 2007). Při pokusech mapování lidského genomu bylo objeveno dalších 582 vazebných míst pro p53 a 98 nových efektorových genů. Počet vazebných míst pro p53 se odráží hlavně v diverzitě procesů, jejichž regulace se tento protein účastní (obrázek č. 6) (Wei et al., 2006). První skupinou genů, ve kterých můžeme najít p53 RE, jsou geny zahrnuté do oprav poškozené DNA. Při poškození DNA následkem působení UV záření, dochází k mobilizaci reparačního mechanismu, který zajišťuje následnou excizi poškozených nukleotidů. Excize poškozených nukleotidů (NER) může probíhat na úrovni celého genomu nebo na úrovni transkripce, kdy se přednostně opravují poruchy, které blokují transkripci DNA řetězce. Role p53 v NER je taková, že jako transkripční faktor stimuluje expresi genů, jejichž produkty jsou následně zahrnuty do regulace tohoto mechanismu. Příkladem mohou být proteiny XPC, DDB1 a DDB2 (Adimoolam a Ford, 2001). Dalším opravným mechanismem je MMR (MisMatch Repair), zajišťující opravu chybně zařazených bází. Součástí tohoto mechanismu jsou proteiny MLH1 a PMS2. Následkem poškození DNA dochází ke zvýšení exprese obou proteinů působením p53. 13
Obrázek č. 6. Schéma některých efektorových genů p53, jejichž exprese je zvýšená při odpovědi na různé druhy stresových podnětů (převzato a upraveno dle Millau et al. 2010).
MLH1 a PMS2 tvoří heterodimer a za účasti dalších enzymů jsou začleněny do opravy chybně zařazených bází v DNA řetězci. Kromě MMR se MLH1 a PMS2 podílí také na apoptóze. Podle rozsahu poškození je v určitém kontrolním bodě rozhodnuto, zda je možné poškozenou DNA ještě opravit, nebo zda má dojít k apoptóze (Chen a Sadowski, 2005). Jeden z mechanismů, který zajišťuje opravu DNA dvouřetězcových zlomů, se nazývá homologní rekombinace (HR). Hlavní komponentou tohoto procesu je protein Rad51. P53 se váže k promotoru genu kódujícího tento protein a negativně ovlivňuje jeho transkripci (Arias-Lopez et al., 2006). Druhou skupinou genů, jejichž exprese je regulována proteinem p53, jsou geny podporující likvidaci reaktivních forem kyslíku. Mezi produkty těchto genů patří mimo jiné dva metaloproteiny SOD2 (Superoxide Dismutase 2) a GPX1 (Glutathione Peroxidase-1). Exprese obou proteinů je pozitivně regulována proteinem p53. V savčích buňkách se SOD vyskytuje ve dvou izoformách a katalyzuje dismutaci superoxidových aniontů na H2O2. GPX1 je největší izoformou z rodiny GPX a katalyzuje rozklad H2O2 na H2O a O2. Hladina ROS má svůj význam také při regulaci apoptózy. V souvislosti s touto skutečností byly identifikovány dva geny PIG-3 a PIG-6. Gen PIG-6 kóduje konkrétně enzym POX (Proline Oxidase), který zvyšuje intracelulární hladinu ROS. Výsledkem je potom následná oxidativní degradace mitochondriálních komponent a apoptóza (Polyak et al., 1997; Maxwell a Kochevar, 2008).
14
Třetí skupinou genů s p53 RE jsou geny spojené s apoptózou. Mezi nejvýznamnější patří již v předchozích kapitolách zmíněné BAX a PUMA. BAX obsahuje dva p53 RE a kóduje proapoptotický protein, který navozuje buněčnou smrt uvolněním cytochromu C (Oltvai et al., 1993). Gen PUMA kóduje proapoptoticé proteiny z rodiny BCL-2 a je lokalizován v mitochondriích. Při apoptóze jsou potom tyto proteiny spojené s uvolňováním cytochromu c z mitochondrií a aktivací Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor 1) (Nakano a Vousden, 2001). Asi nejvýznamnějším mechanismem regulovaným proteinem p53 je kontrola buněčného cyklu. Tato kontrola probíhá především prostřednictvím inhibice cyklin dependentních kináz (CDKs) nebo PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) proteinem p21. Odlišné inhibiční funkce p21 jsou způsobené vazbou proteinů k odlišným doménám. Zatímco CDKs jsou inhibovány vazbou k N-terminální doméně p21, tak inhibice PCNA probíhá na C-terminální části. Výsledkem inhibice je potom zástava buněčného cyklu na přelomu G1 a S fáze (Gibbs et al., 1997). Kromě genu kódujícího p21, můžeme najít p53 RE i v genu GADD45. P53 RE je lokalizován na třetím intronu tohoto genu. Regulace exprese GADD45 proteinem p53, jako reakce na různé druhy poškození DNA, umožňuje zástavu buněčného cyklu na přelomu G2/M fáze (Jin et al., 2002). S regulací rozmanitých procesů, mezi které patří také kontrola buněčného cyklu, je spojen ještě jeden gen, a to APC (Adenomatous Polyposis Coli). Ukázalo se, že regulace exprese tohoto genu je závislá na fosforylaci serinových zbytků p53, což potvrzuje důležitost posttranslačních modifikací pro správnou funkci p53 (Jaiswal a Narayan, 2001). Zajímavým objevem byla účast proteinu p53 v autofágii. Autofágie je katabolický proces vedoucí k lysosomální degradaci cytoplazmatických komponent. Příkladem může být degradace mitochondrií poškozených ROS. Díky schopnosti zprostředkovat buněčnou atrofii či dokonce buněčnou smrt, slouží autofágie jako záložní mechanismus pro proces apoptózy. Autofágie je negativně regulována centrální protein kinázou mTOR (mammalian Target Of Rapamycin), která integruje signály, jakými jsou např. nutriční status, teplota, koncentrace kyslíku aj. (shrnuto v Jin, 2005). Regulace aktivity mTOR probíhá na základě zvýšení hladiny p53. Protein p53 se váže na RE genu PTEN (Phosphatase and Tensin homolog). Tento gen je jedním z mnoha inhibitorů mTOR, pozitivně přispívající k aktivaci autofágie (Feng et al., 2005). Ukázalo se, že se protein p53 účastní i regulace buněčného metabolismu. Děje se tak prostřednictvím indukce exprese genu TIGAR (TP53 Induced Glycolysis and 15
Apoptosis Regulator), který snižuje hladinu fruktosa-2,6-bisfosfátu (Fru-2,6-P). Snížením intracelulární hladiny Fru-2,6-P dochází k inhibici anaerobní glykolýzy a celkovému snížení hladiny ROS v buňce. Nízká hladina ROS v buňce zajišťuje ochranu před ROS senzitivní apoptózou vyvolanou p53 (Bensaad et al., 2006). Poslední zmínkou v souvislosti s regulačními schopnostmi p53, bude schopnost p53 regulovat některé druhy mikro RNA (miRNAs). Mikro RNA jsou malé nekódující RNA. Vznikají transkripcí genů kódujících miRNA za účasti RNA polymeráz I a II. Primární transkript (pri-miRNA) je nadále upraven nukleárním enzymem Drosha z rodiny RNáz III za vzniku prekurzorové miRNA (pre-miRNA). Z jádra putuje pre-miRNA do cytoplazmy, kde se po zpracování enzymem Dicer začleňuje do miRNA proteinových komplexů (miRNPs). MiRNPs jsou potom schopny vázat se na částečně komplementární vazebná místa lokalizovaná v 3´ netranslatovaných oblastech cílových mRNA. To umožňuje destabilizaci či inhibici translace cílových mRNA. Oba procesy vedou ke snížení exprese proteinu, kódovaného danou mRNA. Protein p53 řídí konkrétně transkripci miR-34a a miR-34b\c, které jsou zahrnuty do procesu apoptózy, senescence a zástavy buněčného cyklu (shrnuto v Hermeking, 2007).
1.6 Mutantní p53 a jeho regulace Zatímco wtp53 je v normálních tkáních udržován na nízké hladině díky MDM2 zprostředkované degradaci, tak oproti tomu mutp53 se v nádorových buňkách často nachází ve vysokých hladinách (Iggo et al., 1990; Haupt et al., 1997). Mutantní p53 bývá v nádorových buňkách poměrně stabilní. Stabilita mutp53 je podmíněna neschopností této formy proteinu transaktivovat MDM2, avšak schopnost MDM2 vázat se na mutp53 a jeho následná degradace zůstává zachována (Cadwell a Zambetti, 2001; Midgley a Lane, 1997). Nicméně pokusy na myších, které exprimovaly mutp53 prokázaly, že v normálních buňkách je mutp53 poměrně nestabilní. Navíc velké množství buněčných linií s vysokou expresí mutp53 obsahuje také vysokou hladinu MDM2. I přes to však nedokáže MDM2 u některých linií degradovat mutp53. Tyto poznatky vedly k tvrzení, že neschopnost mutp53 transaktivovat MDM2 není základní příčina stability této formy v nádorových buňkách, a že mutp53 získal nové schopnosti (tzv. „gain of function“), umožňující přispívat k maligní progresi (Olive et al., 2004; Peng et al., 2001).
16
Stejně jako regulace hladiny wtp53 při nádorové supresi, tak regulace hladiny a stability mutp53 hraje významnou roli při vzniku nádorů. Akumulace mutp53 v nádorových buňkách výrazně zvyšuje jejich onkogenní potenciál, a proto není divu, že každý nově objevený modulátor hladiny mutp53 je předmětem podrobných studií (shrnuto v Brosh a Rotter, 2009). Jedním z genů zahrnutých do regulace hladiny mutp53 je již jednou zmíněný PTEN. Společně s p53 patří PTEN mezi nejčastěji mutované nádorové supresory v lidských nádorech (Stambolic et al., 2001). PTEN má možnost regulovat jak wtp53, tak mutp53. Regulace wtp53 spočívá ve zvýšení nádorových supresorových funkcí tohoto proteinu, a to po předchozím navázání wtp53 na promotor PTENu, což má za následek zvýšení jeho exprese. Mezi další způsoby regulace wtp53 zajištěné PTENem patří ochrana před degradací wtp53, umožněná inaktivací MDM2, inhibice transkripce MDM2, či přímá interakce s wtp53 a jeho stabilizace (Mayo et al., 2000; Freeman et al., 2003; Chang et al., 2004). Na druhou stranu bylo zjištěno, že v glioblastomových liniích se zvýšenou hladinou mutp53, vykazoval PTEN opačný efekt než u wtp53. Konkrétně došlo ke zvýšení buněčné proliferace a buněčného přežití, v důsledku inhibice degradace mutp53 proteinem MDM2 nebo prostřednictvím přímé vazby MDM2 k mutp53 a zvýšení jeho stability (Li et al., 2008). Dalším nádorovým supresorovým genem inaktivovaným u mnoha nádorů v průběhu kancerogeneze je p16INK4a. Ztráta exprese tohoto genu může taktéž přispívat ke vzniku různých druhů nádorů, a to stabilizací mutp53 (Terzian et al., 2008). Je známo, že mutp53 interaguje s heat-shock proteiny, mezi které patří například HSP90 a HSP70. V případě mutp53 ovlivňují tyto proteiny především správné skládání proteinu a jeho stabilitu (Wegele et al., 2004). Do regulace stability mutp53 je zároveň zahrnuta i CHIP ubiquitin ligáza (Carboxyl-terminus of Hsp70 Interacting Protein). Mechanismus regulace je takový, že snížení hladiny HSP90 podporuje vznik rozložených frakcí molekul mutp53, které dále mohou interagovat s HSP70 a následně být degradovány pomocí CHIP (Muller et al., 2008). Vzhledem k tomu, že se HSP90 často vyskytuje v nádorových buňkách ve vysokých hladinách, můžou inhibitory tohoto proteinu hrát významnou roli při léčbě nádorů (Kamal et al., 2003). Pro onkogenní vlastnosti mutp53 je dalším důležitým parametrem jeho buněčná lokalizace. Stejně jako wtp53, je mutp53 obvykle lokalizován v jádře (Shaulsky et al., 1990). Existují však případy, kdy je mutp53 lokalizován v cytoplazmě, což závisí na typu 17
mutanta a stresových signálech, které řídí lokalizaci p53 (Rotter et al., 1983). Přesun mutp53 z jádra do cytoplazmy je zajištěn opět stejným způsobem jako u wtp53. Po MDM2 zprostředkované ubiquitinaci zbytků lysinu v C-terminální a DNA vazebné doméně proteinu, dochází prostřednictvím NES k exportu mutp53 z jádra do cytoplazmy. Bylo zjištěno, že zejména konformační mutanti p53 jsou náchylnější k ubiquitinaci, nutné pro účinný export mutp53 z jádra (Nie et al., 2007). V souvislosti s buněčnou lokalizací mutp53 je nutné zmínit, že mutp53 lokalizovaný v cytoplazmě je také zodpovědný za inhibici autofágie v nádorových buňkách (Maiuri et al., 2009).
1.7 Získání onkogenních vlastností mutp53 (gain of function) K ustanovení konceptu gain of function (GOF) došlo na základě zjištění, že mutp53 disponuje novými biochemickými a biologickými vlastnostmi, kterými se liší od wtp53. Mezi onkogenní vlastnosti mutp53 můžeme zařadit např. genetickou nestabilitu, angiogenezi, buněčnou proliferaci, zástavu diferenciace či rezistenci k chemoterapii (obr. č. 7). K získání těchto vlastností může dojít působením celé řady mechanismů, z nichž mezi nejdůležitější patří inaktivace proteinů p63, p73, ale i wtp53 a interakce zahrnující vazbu proteinu na DNA. Mechanismy spojené s vazbou proteinu na DNA probíhají buď pomocí specifické vazby na struktury v DNA, nebo interakcí s transkripčními faktory (obr. č. 7). Kromě těchto základních mechanismů jsou do iniciace a šíření nádorů zapojeny další mechanismy, jakými jsou např. inaktivace dráhy ATM, aktivace topoizomerázy 1, inhibice autofágie, aktivace dráhy NF-κB či kooperace s Ras při buněčné transformaci (obr. č. 7) (shrnuto v Brosh a Rotter 2009).
1.7.1 Interakce s p63 a p73 Asi
mezi
nejdůležitější
mechanismy
GOF,
které
se
významně
podílí
na onkogenních vlastnostech mutp53, patří interakce s proteiny p63 a p73. Stejně jako je tomu u p53, existují i tyto proteiny v několika izoformách, se kterými může mutp53 interagovat a tím inhibovat jejich funkce (Gaiddon et al., 2001). Kromě primární účasti obou proteinů v apoptotických procesech, přispívají tyto proteiny také k regulaci cílových genů, zahrnutých do regulace buněčné proliferace, adheze, diferenciace aj. (shrnuto 18
v Deyoung a Ellisen, 2007). Zároveň se ukázalo, že exprese mutp53 ovlivňuje u některých nádorových linií, citlivost k chemoterapeutikům vyvolávajícím apoptózu, právě díky inhibici p73 (Bergamaschi et al., 2003).
Obrázek č. 7. Vybrané onkogenní vlastnosti mutp53 a jejich výchozí mechanismy. Modrý kruh reprezentuje onkogenní fenotypy, spojené s působením mutp53. Vnější kruh vyobrazuje vlastnosti mutp53, které tvoří základ pro fenotypy vyjmenované v modrém kruhu
(převzato a upraveno z Brosh a Rotter 2009).
1.7.2 Vazba mutp53 na DNA a interakce s transkripčními faktory Dalším významným GOF mechanismem je schopnost mutp53 regulovat transkripci specifických genů. Prvním takovým identifikovaným genem byl MDR-1, zodpovědný za
chemorezistenci
nádorových
buněk,
který
je
pozitivně
regulován
mutp53
(Chin et al., 1994). Mutp53, které ztratily schopnost DNA specifické vazby k DNA, 19
mohou
regulovat
transkripci
cílových
genů
pomocí
interakce
se
sekvenčně
specifickými transkripčními faktory. Kromě proteinů p63 a p73 můžeme mezi tyto transkripční faktory zařadit i proteiny Sp1 a Ets1 (Gualberto a Baldwin, 1995). Oba transkripční faktory interagují i s wtp53, avšak výsledný vliv mutp53 a wtp53 na Sp1 a Ets1 je antagonistický. Zatímco wtp53 inhibuje Sp1 dependentní aktivaci transkripce, tak mutp53 působí aktivačním účinkem (Bargonetti et al., 1997; Kim et al., 2003). Podobně, jako je tomu u Sp1 a Ets1, reagují wtp53 a mutp53 (p53R175H a p53R273H) i s dalším transkripčním faktorem, a to NF-Y. NF-Y je heterotrimerní transkripční faktor, který se váže na CCAAT sekvence, nacházející se v 30% eukaryotických promotorů. Promotory obsahující CCAAT sekvence jsou alespoň zčásti regulované NF-Y a jedná se především o geny spojené s řízením buněčného cyklu (Di Agostino et al., 2006). Zajímavá je i interakce hot-spot mutantní formy p53R175H s receptorem pro vitamin D3 (VDR). Tento mutant se váže na RE přítomný v promotoru VDR, čímž zvyšuje jak jeho jadernou lokalizaci, tak transaktivační aktivitu. Bylo zjištěno, že buňky exprimující wtp53, podléhají v přítomnosti vitaminu D3 apoptóze, zatímco buňky exprimující mutp53 vykazují antiapoptotický účinek. To však neplatí pro všechny typy mutantů, což ukazuje jak důležitá je identifikace dalších mutací p53, které přispívají ke zvrácení terapeutického účinku vitaminu D (shrnuto v Olivier et al., 2009). Ukázalo se, že mutp53 je také zahrnutý do aktivace genů, které hrají roli při odpovědi na různé druhy zánětlivých reakcí. Důležitou molekulou v rámci zánětů je jaderný faktor NF-κB, který jakožto transkripční faktor reguluje expresi prozánětlivých cytokinů a různé druhy imunoregulačních molekul (Kopp a Ghosh, 1995). Bylo zjištěno, že přítomnost mutp53 v nádorových buňkách vede ke zvýšení odpovědi NF-κB vůči nádorovému nekrotickému faktoru α (TNFα). Zvýšená transkripční aktivita NF-κB tedy může vést k nádorové progresi, v důsledku chronického vystavení buněk zánětlivým cytokinům (Weisz et al., 2007). Několik GOF vlastností mutp53 není podmíněno vazbou proteinu na DNA, ale spočívá v regulaci netranskripčních procesů. Příkladem můžou být kontaktní mutanti p53R248W a p53R273H, kteří se vážou na MRE11 (meiotic recombination 11) a inhibují buněčnou odpověď k opravě dvouřetězcových DNA zlomů (Song et al., 2007).
20
1.7.3 Ztráta funkce nádorového supresoru ( loss of function) Velké množství mutací proteinu TP53 má za následek ztrátu jeho transkripční aktivity doprovázenou buď částečnou, nebo úplnou ztrátu funkce wtp53. Míra ztráty transkripční aktivity wtp53 se liší v závislosti na typu mutanta. Například mutantní forma p53-175P postrádá schopnost vyvolat apoptotickou odpověď, avšak stále může indukovat zástavu buněčného cyklu (Rowan et al., 1996). S úplnou ztrátou transkripční aktivity wtp53 souvisí pojem dominantně negativní efekt (DNE). Přibližně 80% nejběžnějších mutantů je schopno vyvolat DNE vůči wtp53, a to i v případě, že druhá alela kódující wtp53 je stále přítomná (Petitjean et al., 2007). Děje se tak prostřednictvím tvorby heterooligomerů mezi mutp53 a wtp53, které se nemohou sekvenčně specificky vázat na DNA a aktivovat cílové geny (obr. č. 8). Tvorba heterooligomerů závisí na poměru wtp53 a mutp53 v jádře (Chan et al., 2004). V normálních buňkách je wtp53 syntetizován v cytoplazmě v podobě dimerů a přesouvá se do jádra, kde se seskupuje do funkčních tetramerů, které se váží na p53 vazebné oblasti chromatinu. V případě heterozygotních buněk záleží na hladinách exprese obou proteinů. Pokud se hladina mutp53 a wtp53 udržuje na nízké úrovni, tak schopnost wtp53 tvořit tetramery a regulovat transkripci cílových genů zůstává zachována. V opačném případě brání vznik heterotetramerů v aktivaci cílových genů (obr. č. 8) (shrnuto v Goh et al., 2010).
Obrázek č. 8. Model kodominance mutp53 a wtp53. (A) Vyobrazení transportu wtp53 z cytoplazmy do
jádra, kde
vzniklé
tetramery
zahajují
p53 dependentní
transkripci.
(B) Nízká hladina mutp53 ještě umožňuje wtp53 tvořit tetramery a aktivovat cílové geny. (C) Vysoká exprese obou proteinů způsobuje tvorbu heterotetramerů, neschopných vázat se DNA a indukovat transkripci cílového genu (převzato a upraveno z Goh et al., 2010).
21
1.8 Využití znalostí mutací TP53 v klinické praxi Prognostický a prediktivní význam mutací TP53 je značně rozdílný pro různé druhy nádorů (Bertheau et al., 2008). Predikce senzitivity daného nádoru na daný druh léčby má pro onkology zásadní význam. Jakákoliv odpověď nádoru asociovaná s léčivy, ať už cytotoxická či cytostatická, výrazně přispívá k celkové prognóze (Guarneri et al., 2006). Mutace TP53 mohou rovněž sloužit jako biomarkery pro cílenou léčbu. Pro volbu správného terapeutického postupu je třeba brát ohled na rozsah poškození struktury či funkce p53 a zároveň na to, o jak agresivní druh mutace se jedná. Nicméně agresivnost nádoru s mutp53 je ovlivněna i dalšími faktory, mezi které patří především tkáňová specifita, jiné genetické mutace a genetické pozadí (Soussi, 2007). Bylo objeveno několik molekul, které jsou schopny reaktivovat nádorové supresorové funkce p53 u široké škály mutantů. Mezi tyto molekuly patří např. scFVs (single chain FV fragments), CP-31398 nebo PRIMA-1. ScFVs jsou deriváty anti-p53 monoklonálních protilátek PAb421 a 11D3, které mohou stabilně interagovat s p53 a obnovit schopnost některých mutp53 vázat se na DNA in vitro (Caron de Fromentel et al., 1999). Molekula CP-31398 dokáže u mutp53 obnovit aktivní konformaci wtp53 a tím navrátit některé supresorové vlastnosti p53 in vivo (Bykov et al., 2005). Podobnými vlastnostmi disponuje PRIMA-1, která indukuje mutp53 závislou apoptózu, navrací mutp53 nativní konformaci, transaktivační vlastnosti a inhibuje růst nádorů in vivo (Bykov et al., 2002). I přes značný pokrok v porozumění struktury a funkce p53, nebyly dosud objeveny prostředky, které by měly výrazný vliv na kontrolované řízení nádorové progrese a terapii. Vzhledem k faktu, že mutace TP53 se vzájemně liší ve svém biologickém účinku a mohou se během nádorové progrese objevovat v různých stádiích, neexistuje jednotný postup, který by se dal aplikovat ve všech klinických souvislostech. Proto hraje shromažďování informací o mutacích TP53 do databází významnou roli, pro určení účinného terapeutického postupu při léčbě rakoviny.
22
1.9 Cíle bakalářské práce 1. Příprava a analýza stabilních klonů s potlačenou expresí mutp53, odvozených od glioblastomových linií U251 (R273H), Onda10 (G245S) a Onda11 (R273C).
2. Vliv exprese mutp53 na onkogenní chování vybraných glioblastomových linií. 3. Návrh cílových genů mutp53 pro expresní studie u vybraných glioblastomových linií.
23
2. Materiál
2.1 Použité chemikálie Pro vypracování praktické části byly použity následující chemikálie: Monoklonální myší protilátka DO-1 (věnovaná laboratoří Dr. Vojtěška), monoklonální myší Anti-β-Actin protilátka (A5441 Sigma), sekundární myší protilátka značená křenovou peroxidasou (A2304 Sigma), NaCl (Penta), KCl (Penta), etidiumbromid (Sigma), agaróza (Serva), etanol (Merck), G418 (PAA Laboratories GmbH), Effectene Transfection Reagent (Qiagen), tekutý dusík (Cryometal), 1x PLB lyzační pufr (Promega), fenol/chloroform/ isoamylalkohol (Penta), 3 M octan sodný (Penta), pufr pro Taq DNA polymerázu (Top-Bio), MgCl2 (Roche), 10 mM dNTP mix (Sigma), Taq DNA polymeráza (Biozyn), Bradfordovo činidlo, BSA (Sigma), 40 % akrylamid (Serva), EDTA (Sigma), TEMED (Sigma), APS (Sigma), triton (Sigma), Tween 20 (Fluka), 2-butanol, nitrocelulosová membrána BioTrace NT (Pall Corporation), sušené mléko (Laktino), chemiluminescenční roztoky (ECL, Amersham Pharmacia Biotech), DMEM (Invitrogen), trypsin (Invitrogen), FBS (Sigma), roztok pyruvátu sodného (S11-003, PAA Laboratories GmbH), L-Glutamin 100X (25030-024, Invitrogen), penicilin /streptomycin 100x (P11010, PAA Laboratories GmbH), 0,005 % krystalová violeť (Simgma).
2.2 Složení roztoků a pufrů 50x TAE – 2 M Tris; 1 M kyselina octová; 50 mM EDTA, pH 8 1x TAE – 2 % roztok 50x TAE 10x PBS – 1,37 M NaCl; 27 mM KCl; 43 mM Na2HPO4; 14 mM K2HPO4, pH 7,4 1x PBS – 10 % roztok 10x PBS 10x RB – 250 mM Tris; 1,92 M glycin; 1 % SDS; pH 8,3 1x RB - 10 % roztok 10x RB 10x BB (blotting buffer) – 480 mM Tris; 390 mM glycin; 0,37 % SDS 1x BB – 48 mM Tris; 39 mM glycin; 0,037 % SDS, 20 % methanol
24
PBSmléko – 5 % váhy sušeného mléka v 1x PBS PBST – 0,05% Tween v 1x PBS 6x LB (nanášecí pufr)- 40% sacharóza; 0,2% bromfenolová modř; 0,2% xylencyanolová violeť 4x CSB (nanášecí pufr) – 100 mM Tris pH 6,8; 20% glycerol, 4% SDS, 200mM p - merkaptoethanol, 0,1% bromfenolová modř 5 % SDS-PAGE – 5 % akrylamid, 125 mM 1M Tris pH = 6,8; 0,1 % SDS 12,5 % SDS-PAGE – 12,5 % akrylamid, 350 mM Tris pH = 8,8; 0,1 % SDS, 41,5 ml destilované H2O
2.3 Použité přístroje Autokláv (Chirana) Blotovací aparatura - Mini-protean Tetra system (BIORAD) Centrifuga MiniSpin plus (Eppendorf) Elektroforetická vana - SubCell GT (BIORAD) Flow box (Telstar Biostar) Luminiscenční analyzační systém - LAS 3000 (Fujifilm) Mikroskop (Nikon) Mikrovlnná trouba (Sencor) Minicentrifuga – Spectrofuge mini (Labnet) SDS-PAGE aparatura - Mini-protean Tetra system (BIORAD) Spektrofotometr - Libra S22 (Biochrom) Termoblok - Thermomixer compact (Eppendorf) Transiluminátor - Ultra Violet Products TM36 (Herolab) Třepačka (Biosan) Termocykler – PTC – 200 (DNA Engine) Váhy (Kern) Vodní lázeň (Elma) Vortex (IKA) Zdroj napětí - BIO-RAD PowerPac 1000 (BIORAD) Inkubátor - CO2 Incubator BC 190 (Salvis Lab)
25
2.4 Použité buněčné linie Základní glioblastomové linie použité při vypracovávání praktické části: U251 – mutace R273H (273 Arg
His) (Van Meir et al., 1994)
Onda 10 – mutace G245S (245 Gly
Ser) (Koga et al, 1996)
Onda 11 – mutace R273C (273 Arg
Cys) (Koga et al, 1996)
Usi 12 – potlačená exprese p53 pomocí shRNA (Brázdová et al., 2009) Usi 16 – linie s nepotlačenou expresí p53 (Brázdová et al., 2009) Osi 10 - potlačená exprese p53 pomocí shRNA (Brázdová et al., 2009) U87 – linie exprimující wtp53 (Van Meir et al., 1994)
2.5 Použité plazmidy Plazmid pSuper je expresní vektor, který obsahuje oligonukleotidovou sekvenci, kódující krátkou shRNA (short hairpin RNA). Po transfekci vektoru dochází transkripcí k přepisu shRNA a po jejím rozštěpení enzymem Dicer vzniká funkční siRNA, která je komplementární k p53 mRNA. Vzniklý siRNA duplex se váže na komplex RISC, který degraduje mRNA. Tímto způsobem je zajištěno např. potlačení exprese p53 v buňce plazmidem pSuper-p53 (Brummelkamp TR et al., 2002). Plazmid
pCI-neo
nesoucí
gen
pro
rezistenci
(Brondyk, 1994).
Obr. č. 9. Restrikční mapa plazmidu pSuper (obr. převzat z http://www.oligoengine.com) 26
k antibiotiku
neomycin
Obr. č. 10. Restrikční mapa plazmidu pCI-neo (obr. převzat z http://www.promega.com)
2.6 Použité primery při PCR Primery použité pro amplifikaci plazmidu pSuper: BT7 (Forward) 5´ GCGCGTAATACGACTCACTA 3´ BT3 (Reverse) 5´ CGCAATTAACCCTCACTAAAG 3´
Primery použité pro amplifikaci plazmidu pCI-neo: PCI (Forward) 5´ GACCGCCATGTTGGCATTGATT 3´ PCI (Reverse) 5´ CCAGTGCCTCACGACCAACTTCT 3´
27
3. Metody 3.1 Transfekce plazmidů pSuper a pCI-neo Buněčné linie U251 byly transfekovány 1.8 μg plazmidu pSuper-p53 (pSuper) a 0.2 μg plazmidu pCI-neo (Oligoengine). Transfekce byla provedena pomocí effectinového transfekčního činidla (Qiagen). Buňky byly umístěny na tři 10 cm misky. Za dva dny po transfekci bylo k buňkám přidáno antibiotikum 0,4 mg/ml G418 (PAA Laboratories GmbH). Po 4 týdnech byly získány rezistentní klony, které byly použity pro další propagaci a práci.
3.2 Práce s tkáňovými kulturami Kultivace buněk U251, Onda 10, Onda 11 probíhala na Petriho miskách o průměru 5 a 10 cm, v 5 % živném médiu DMEM (37 °C, 5 % CO2). Izolace jednotlivých klonů probíhala následovně. Z buněk bylo slito živné médium a byly promyty 1x PBS. Jednotlivé klony byly izolovány pomocí sterilních klonovacích kroužků, které byly připevněny pomocí vazelíny na místa kolonií. Buňky byly poté uvolněny z podkladu 0,25 % trypsinem a přeneseny do nového živného média. Kultivace probíhala v prostředí selekčního média.
3.3 Příprava peletu savčích nádorových linií Buňky na misce (10 cm) byly třikrát promyty 1x PBS. Po promytí byly buňky setřeny z misky stěrkou, omytou 20 % ethanolem, a přeneseny do sterilních 2 ml mikrozkumavek. Následně byly buňky centrifugovány (151 g, 4 °C, 10 min). Supernatant byl odsán, pelet zmražen v tekutém dusíku a následně uchováván při -80 °C.
28
3.4 Izolace genomové DNA pomocí fenol-chloroformové extrakce Buňky (sklizené z 10 cm misek) byly zlyzovány přidáním 100 μl lyzačního pufru (1x) a ponechány 15 min při pokojové teplotě. Poté byly buňky centrifugovány (14129 g, 25 °C, 15 min). Supernatant byl odebrán do čisté mikrozkumavky. Následovala extrakce DNA roztokem fenol/chloroform/isoamylalkoholu (25:24:1) v objemovém poměru 1:1. Směs byla třepána 5 min na třepačce a poté centrifugována (14129 g, 25 °C, 3 min). Horní vrstva s DNA byla odebrána do 100 μl vody a byla provedena opětovná extrakce. DNA byla v čisté mikrozkumavce srážena (24 hod, -20 °C) desetinou objemu 3 M octanu sodného (pH = 5) a 2,5 násobkem 100 % ethanolu vychlazeného na -15 °C. Následně byl vzorek DNA centrifugován (14129 g, 4 °C, 30 min) a pelet dvakrát promyt, 2,5 násobkem původního objemu roztoku, 75 % ethanolu. Pelet byl vysušen při 55 °C, rozpuštěn v 50 μl vody a třepán 1 hod na třepačce při 37 °C.
3.5 Kontrola integrace plazmidů do genomové DNA pomocí PCR V genomové DNA byla přítomnost plazmidů pSuper a pCI-neo kontrolována pomocí metody PCR a specifických primerů. Nejdříve byly připraveny dva mastermixy s rozdílnými primery. Složení reakční směsi pro 1 reakci:
H2 O pufr pro Taq DNA polymerázu (10x) MgCl2 (25 mM) dNTP mix (10 mM) horní (5‘) primer – BT3 (10 μmol/μl) dolní (3‘) primer – BT7 (10 μmol/μl) horní (5‘) primer – pCI-F (10 μmol/μl) dolní (3‘) primer – PCI-R (10 μmol/μl) Taq DNA polymeráza DNA templát
Směs 1 (μl) 15,25 2,50 2,50 0,50 1,00 1,00 0,25 1,00
Směs 2 (μl) 15,25 2,50 2,50 0,50 1,00 1,00 0,25 1,00
K 25 μl mastermixu bylo přidáno 1 μl DNA templátu. Jako pozitivní kontrola byl použit 1 μl plazmidů pBSK a PCI-neo v 25 μl mastermixu. Vzorek negativní kontroly byl tvořen 1 μl vody + 25 μl mastermixu. Reakční směsi byly zvortexovány, krátce 29
zcentrifugovány na minicentrifuze a umístěny do termocykleru. PCR probíhala podle protokolu: 94 °C – 2 min 94 °C – 30 s 25x
55 °C – 30 s 72 °C – 1 min 72 °C – 10 min
3.6 Elektroforéza DNA v agarózovém gelu Po skončení PCR bylo ke vzorkům přidáno 5 μl nanášecího pufru (6x LB). Vzorky byly zvortexovány, krátce zcentrifugovány a 7,5 μl každého vzorku bylo naneseno na 1 % agarózový gel, zalitý 1x TAE. Elektroforéza probíhala 30 min, při 120 V.
3.7 Detekce DNA v agarózovém gelu Detekce DNA byla provedena barvením gelu v 1 μg/ml roztoku etidiumbromidu, který je, jakožto interkalační činidlo, schopný interkalovat se do dsDNA. Agarózový gel byl 20 min ponořen v roztoku etidiumbromidu. Poté byl gel promýván 20 min ve vodě a následně vyfocen na dokumentačním systému firmy Herolab při excitační vlnové délce 302 nm.
3.8 Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové Pro
stanovení
koncentrace proteinů
bylo
využito
kolorimetrické
reakce
Bradfordova činidla s aromatickými a bazickými zbytky aminokyselin proteinů. Vzniklý komplex byl poté detekován na spektrofotometru při vlnové délce 595 nm.
30
Nejdříve
byla
vytvořena
koncentrační
řada
proteinu
BSA
(1
mg/ml)
o koncentracích 0,5; 1, 2, 5 a 10 μg/μl. K 798 μl vody bylo přidáno 2 μl stanovovaného proteinu a doplněno do 1 ml Bradfordovým činidlem. Jako blank bylo použito 800 μl vody. Roztoky byly inkubovány 15 min a následně byla změřena absorbance při 595 nm. Z naměřených hodnot byla vytvořena kalibrační přímka a z ní odečtena koncentrace měřených vzorků.
3.9 Dělení proteinů metodou SDS-PAGE Podle zjištěné koncentrace proteinů v jednotlivých vzorcích byly namíchány roztoky o stejném objemu, se shodným množstvím celkového proteinu. Ke každému vzorku byla přidána 1/4 objemu roztoku 4x CSB. Vzorky byly následně krátce centrifugovány, denaturovány v termobloku (5 min, 99 °C) a poté opět krátce centrifugovány. Mezi důkladně očištěná skla byla nalita asi 5 cm vysoká vrstva separačního gelu (10 ml 12,5 % SDS-PAGE; 50 μl 10 % APS; 25 μl Temed), která byla převrstvena roztokem 2-butanolu. Po ztuhnutí vrstvy byl butanol odsán filtračním papírem, nalit koncentrační gel (2,5 ml 5 % SDS-PAGE, 25 μl 10 % APS; 12,5 μl Temed) a vložen hřeben. Zpolymerovaný gel se skly byl vložen do aparatury a zalit elektroforetickým pufrem (1x RB). Následně byl vytažen hřeben, promyty starty a naneseny vzorky. Elektroforéza probíhala podle protokolu: 15 min 50 V, 15 min 100 V a 1 hod 150 V.
3.10 Přenos proteinů na membránu Pro přenos proteinů na nitrocelulosovou membránu byla použita metoda elektroblottingu. Na blotovací kazetu byly umístěny jednotlivé prvky v pořadí: hubka, 2x whatman papír, gel, membrána, 2x whatman papír, hubka. Blotovací kazeta byla poté umístěna do aparatury společně se zásobníkem ledu a naplněna po okraj blotovacím pufrem (1x BB). Elektroforéza probíhala 90 min při 150 V.
31
3.11 Imunodetekce proteinů na membráně Po skončení elektroblotu byla nitrocelulosová membrána třepána s 5 % (w/v) odtučněným mlékem v 1x PBS, aby došlo k vyvázání volných vazebných míst molekulami kaseinu (1 hod). Za hodinu bylo mléko slito a membrána byla třepána (12 hod, 4 °C) v primární myší protilátce DO-1 proti proteinu p53, zředěné v 5 % odtučněném mléku (1:100). Podobným způsobem byl detekován i β-aktin, pomocí monoklonální myší anti-β-aktin protilátky, ředěné v 5 % odtučněném mléku (1:10000). Membrána byla 3x po 5 min promyta v 1x PBST a následně inkubována se sekundární myší protilátkou, značenou křenovou peroxidasou (1 hod), naředěnu v 5 % odtučněném mléce (1:10000). Po inkubaci byla membrána opět 3x po 5 min promyta v 1x PBST. Detekce p53 a β-aktinu byla provedena pomocí chemiluminiscenčního reakčního kitu ECL. Membrána byla převrstvena roztokem připraveným smícháním složek ECL1, ECL2 (1:1) a chemiluminiscence byla zachycena přístrojem LAS 3000.
3.12 Test tvorby kolonií v měkkém agaru Tato metoda využívá schopnosti buněk tvořit kolonie, při jejich rozsuspendování v agaru. Nejdříve byla připravena spodní vrstva 0,5 % agarózy. V mikrovlnné troubě byla rozvařena 1 % agaróza, která byla následně autoklávována a přemístěna do vodní lázně, kde byla udržována při teplotě 40 °C v tekutém stavu. Poté byla agaróza smíchána s DMEM médiem, obohaceným 20 % FBS, 1 mM glutaminem a 1x penicilin/streptomycin, v takovém poměru, abychom získali 0,5 % agarózu. Na každou misku bylo naneseno 3 ml 0,5 % agarózy, kterou jsme nechali ztuhnout. Horní vrstva byla tvořena 0,4 % agarózou, která byla připravena stejným způsobem, jako 0,5 % agaróza, ovšem jednotlivé složky byly smíchány v jiných poměrech. Na horní vrstvu bylo použito 1,6 ml 0,4 % agarózy, do které byl zároveň přidán testovaný počet buněk. Počet buněk v 1 ml byl spočítán pod mikroskopem v Bürkerově komůrce. Do agaru bylo dáno 2 x 104 buněk. Následovala inkubace buněk s 5% DMEM (2 měsíce, 37 °C, 5 % CO2). Nakonec byly buňky barveny 30 min v 0,005 % krystalové violeti a vyfoceny na přístroji LAS 3000.
32
4. Výsledky
4.1 Analýza exprese p53 v glioblastomových liniích Pro naši studii byly vybrány dostupné glioblastomové linie s různým statutem p53: U87 (wtp53) (Van Meir et al., 1994), Onda 11 (R273C) (Koga et al, 1996), U251 (R273H) (Van Meir et al., 1994). Dále byly použity již dříve vytvořené linie Usi 12 (shRNA) (Brázdová et al., 2009), Osi 10 (shRNA) (Brázdová et al., 2009) a kontrolní linie Usi 16 (Brázdová et al., 2009). Potlačení exprese p53 bylo docíleno transfekcí plazmidu pSuper-p53, nesoucí krátkou oligonukleotidovou sekvenci, kódující tzv. shRNA, která po transfekci podléhá in vivo transkripci. ShRNA je štěpena enzymem Dicer za vzniku funkční molekuly siRNA. Molekula siRNA se váže na komplementární sekvenci (mRNA proteinu p53) a výsledný duplex je navázán na komplex RISC, jehož ribonukleasová aktivita způsobuje degradaci komplementárního vlákna siRNA (Brummelkamp TR et al., 2002). Linie Usi 12 (shRNA) a Usi 16 jsou, odvozené od linie U251 (R273H). Linie Usi 12 je charakteristická potlačenou expresí p53, na rozdíl od linie Usi 16, která má zachovanou expresi p53. Podobným způsobem byla připravena i linie Osi 10 (shRNA) z Onda 11 (R273C). Analýza exprese proteinu p53 byla provedena pomocí metod SDS-PAGE a následné imunodetekce. Buňky byly kultivovány na 10 cm miskách (5 % DMEM 37 °C, 5 % CO2).
Po kultivaci byly buňky sklizeny, získané pelety zlyzovány v 1x PLB
(Promega) lyzačním pufru a byla změřena koncentrace celkového proteinu dle Bradfordové. Poté byly připraveny vzorky, obsahující 60 μg celkového proteinu. Vzorky byly
naneseny
na
dvojici
SDS-PAGE
gelů
a
proteiny
následně
přeneseny
na nitrocelulosovou membránu. Jedna membrána byla inkubována s monoklonální protilátkou DO-1 proti p53. Druhá membrána byla inkubována s monoklonální anti-β-aktin protilátkou proti β-aktinu. Kontrola exprese β-aktinu byla provedena z důvodu ověření stejného množství proteinu ve všech vzorcích. Proteiny byly nakonec na membránách detekovány pomocí chemiluminiscenčního kitu ECL a chemiluminiscence byla zachycena přístrojem LAS 3000 (obr. č. 11).
33
p53
β-aktin
Obr. č. 11 Ověření exprese proteinu p53
Výsledek potvrdil, že mateřské linie Onda 11 a U251 si zachovaly schopnost vysoké exprese mutp53. Největší akumulace mutp53 byla pozorována u linie Onda 11. Systém potlačení exprese p53 u linie Onda 11 (R273C) zde fungoval bez problémů. Signál p53 u linie Osi 10 (shRNA) byl v porovnání s mateřskou linií velmi slabý. Stejně tak tomu bylo i u dvojice U251 (R273H) a Usi 12 (shRNA), kdy množství mutp53 v mateřské linii bylo výrazně vyšší, než v linii odvozené. Kontrolní linie Usi 16 obsahovala velké množství proteinu p53, které dokonce převyšovalo množství p53 u linie U251. Linie U87 (wtp53) poskytovala slabý signál p53, což potvrzuje správnou funkci regulačních mechanismů wtp53, které udržují za normálních podmínek, hladinu p53 na relativně nízké úrovni.
4.2 Příprava a analýza stabilních klonů Stabilní klony byly připraveny z linie Onda 10 (Koga et al, 1996) nesoucí mutaci G245S. Pomocí efektinového transfekčního činidla byly buňky Onda 10 trensfekovány plazmidy pSuper-p53 (Brummelkamp TR et al., 2002) a pCI-neo (Brondyk, 1994). K potlačení exprese p53 byl použit plazmid pSuper-p53. Plazmid pCI-neo, sloužil jako selekční marker k vytvoření stabilních klonů rezistentních k neomycinu. Buňky byly kultivovány na 10 cm miskách (5 % DMEM 37 °C, 5 % CO2). Selekce klonů byla provedena přidáním antibiotika 0,4 mg/ml G418 (PAA Laboratories GmbH). Po 48 hod bylo pomocí klonovacích kroužků vyzvednuto dohromady 37 klonů (P1-P37), z kterých
34
však přežila pouze část. Pro další postup byly vybrány klony P1, 17, 31, 32, 33, 34, 35. Tyto klony rostly výrazně pomaleji než původní linie Onda 10. Podobným způsobem byly připraveny i kontrolní klony ODS 3 a ODS 7 vzniklé transfekcí plazmidů pSuper a pCIneo. Cílem při přípravě těchto klonů bylo získat stabilní klony vystavené stejnému buněčnému stresu produkovanému plazmidem pSuper. Pro analýzu exprese p53 v získaných klonech, byly buňky pod selekčním tlakem propagovány a připraveny pelety, u kterých byla změřena koncentrace proteinů dle Bradfordové. Poté byly připraveny vzorky obsahující 40 μg celkového proteinu. Po skončení SDS-PAGE byly proteiny přeneseny na nitrocelulosovou membránu. První
membrána
byla
inkubována
s monoklonální
anti-β-aktin
protilátkou.
Druhá membrána byla inkubována s monoklonální protilátkou DO-1 proti p53. Proteiny byly
na
membránách
detekovány
pomocí
chemiluminiscenčního
kitu
ECL
a chemiluminiscence byla snímána přístrojem LAS 3000 (obr. č. 12).
p53
β-aktin
Obr. č. 12 Ověření exprese proteinu p53
Z výsledků je patrné, že mateřská linie Onda 10 (G245S) si zachovala relativně vysokou hladinu exprese p53. Z testovaných klonů si zachovaly vysokou expresi p53 klony P32 a P33. Pro další práci byly proto tyto klony použitelné maximálně jako kontrola. Signál p53 u klonů P1 a P31 byl o něco nižší, než u předchozí dvojice což značí, že zde nedošlo k úplnému potlačení exprese p53. Redukce exprese p53 byla pravděpodobně úspěšná u klonů P1, P17, P35, P34. První trojice klonů poskytovala nejslabší signál p53, zároveň při dostatečném signálu β-aktinu. Žádný signál proteinu p53 nebyl pozorován u klonu P34, ale byla zde zároveň nízká hladina kontroly β-aktinu. Důvodem bylo zřejmě nižší množství naneseného proteinu. Signál p53 klonu ODS 3 byl srovnatelný se signálem původní linie Onda 10. Vhodnými kandidáty pro další postup tedy byly klony P1, P17, P34 a P35. 35
4.2.1 Analýza integrace plazmidů pSuper a pCI-neo do genomu klonů pomocí PCR Pro analýzu integrace plazmidů pSuper a pCI-neo do genomu linie Onda 10 (G245S) (Koga et al, 1996) byly vybrány klony P1, 10, 14, 17, 31, 32, 33, 34, ODS 3 a ODS 7. U všech klonů byla, z množství buněk na 10 cm miskách, izolována genomová DNA. Kontrola integrace plazmidu pSuper do genomu klonů byla provedena pomocí PCR za účasti specifických primerů BT7 (Forward) a BT3 (Reverse), kdy po amplifikaci vzniká fragment o délce 370 bp. Pro kontrolu integrace plazmidu pCI-neo do genomu vybraných klonů byly použity primery PCI (Forward) a PCI (Reverse), které dávají za vznik fragmentu o délce 740 bp. Do 25 μl mastermixu byl vždy přidán 1 μl templátu. Pro kontrolu byly amplifikovány také samotný plazmid pCI-neo a plazmid pBluescript. Jako negativní kontrola sloužila voda. Po skončení PCR byla provedena elektroforéza všech vzorků v 1 % agarózovém gelu v 1x TAE pufru.
1000 bp
pCI-neo
500 bp
Obr. č. 13 Amplifikace plazmidu pCI-neo
Integrace plazmidu pCI-neo do genomu vybraných klonů byla úspěšná. Zmíněný plazmid bylo možné po amplifikaci detekovat v každém z klonů (obr. č. 13). Podařilo se nám tedy připravit stabilní klony rezistentní k neomycinu.
36
Integrace plazmidu pSuper do genomu klonů již nebyla tak účinná, jak v případě pCI-neo (obr. č. 14). Jako vhodní kandidáti pro další analýzy se jevily klony P17 a P34. Kromě dvojice klonů P17 a P34 byla integrace plazmidu pSuper do genomu úspěšná i u kontrolních klonů ODS 3 a ODS 7, u kterých byl detekovatelný silný signál plazmidu pSuper. Získané výsledky také z velké části souhlasí s výsledky získanými při imunodetekci, kdy exprese proteinu p53 byla u klonu P17 potlačena na 10 % původní exprese mateřské linie Onda 10. Zároveň byla u tohoto klonu detekována vysoká hladina plazmidu pSuper-p53. U klonu P34 nebyl detekován žádný signál vůči proteinu p53 a signál plazmidu byl rovněž velmi slabý. Podobně tomu bylo u klonů P33 a P35, které poskytovaly relativně slabý signál plazmidu pSuper. Vzhledem k tomu, že množství p53 bylo u klonu P35 poměrně nízké, je možné, že tento klon obsahoval plazmid pSuper-p53, ale při PCR reakci nebyla plazmidová DNA dostatečně zamplifikována.
1000 bp 500 bp
pSuper pBSK
Obr. č. 14 Amplifikace plazmidu pSuper
37
4.3 Vliv exprese mutp53 glioblastomových linií
na
onkogenní
chování
vybraných
Byl proveden test tvorby kolonií v měkkém agaru. Schopnost buněk tvořit kolonie ne na pevném povrchu, ale při rozsuspendování v agaru, je jednou ze známek buněčné transformace. Do 5 cm misek byla, ve flow boxu, nalita vrstva 0,5 % agarózy smíchaná DMEM médiem obohaceným 20 % FBS, 1 mM glutaminem a 1x penicilin/streptomycin. Horní vrstva byla tvořena 0,4 % agarózou, ve které byl rozsuspendován testovaný počet buněk (2 x 104). Za 8 týdnů byly buňky obarveny 0,005 % krystalovou violetí a vyfoceny na přístroji LAS 3000. Pro analýzu byly vybrány linie U251 (R273H), Usi 12 (shRNA), Onda 11 (R273C), Osi 10 (shRNA), Onda 10 (G245S) a klon P1. (obr. č. 15). U251
Usi 12
Onda 11
Osi 10
38
Onda 10
P1
Obr. č. 15 Vyfocené linie po obarvení
Schopnost tvořit kolonie v měkkém agaru byla potvrzena u linií U251, Onda 10 a Onda 11. Největší kolonie bylo možné pozorovat u linie U251. Zároveň zde dobře fungoval systém potlačení exprese p53, protože linie Usi 12 tvořila výrazně menší kolonie. Stejně tomu bylo i v případě systému Onda 11 / Osi 10. Množství kolonií u klonu P1 bylo ve srovnání s mateřskou linií výrazně nižší, což by nasvědčovalo negativnímu vlivu transfekce plazmidů pSuper-p53 a pCI-neo na růst tohoto klonu.
4.4 Návrh cílových genů mutp53 pro expresní studie u vybraných glioblastomových linií Návrh cílových genů mutp53 byl proveden za účelem výběru kandidátních genů, vhodných pro další analýzy u ostatních linií Onda 11 (R273C) / Osi 10 (shRNA) či Onda 10 (G245S ) / P17, P34 (shRNA). Pro analýzu cílových genů mutp53 byla zpracována dostupná data z microarray, vytvořená pro článek Brázdová et al., 2009, uložená na GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Pomocí DNA microarray analýzy lze sledovat expresní hladiny velkého množství genů současně. Výsledky DNA microarray byly rozděleny do třech excleovských souborů, ve kterých byla porovnávána genová exprese systému linií U251/Usi 12, U251/Usi 16 a Usi 12/Usi 16. Pro další analýzy bylo navrženo několik cílových genů mutp53 popsaných v literatuře, a to konkrétně geny PCNA (Deb et al., 1992), PPARGC1A, NRG1, FRMD5, JAK2, TMEM108 (Brázdová et al., 2009) VEGFA (Khromova et al., 2009), TGFBR2 (Kalo et al., 2007). Zmíněné geny jsou součástí rozmanitých procesů, ke kterým patří např. 39
regulace angiogeneze (VEGFA), buněčné proliferace (PCNA), energetického metabolismu (PPARGC1A) a jiných procesů. Geny, jejichž transkripční aktivita je v důsledku mutp53 snížena jsou v tabulce č. 1 zvýrazněny červenou barvou, zatímco geny označené zelenou barvou vykazují zvýšení transkripční aktivity působením mutp53.
Cílový gen mutp53
U251 / Usi 12
U251 / Usi 16
Usi 12 / Usi 16
Pozorovaný efekt
FRMD5
0,459
0,670
1,459
↓
PPARGC1A
0,317
0,743
2,343
↓
NRG1
0,358
1,614
1,714
↓
TMEM108
0,226
0,187
0,827
↓
JAK2
0,550
0,999
1,818
↓
TGFBR2
0,426
0,626
1,471
↓
VEGFA
1,434
1,199
0,836
↑
PCNA
0,785
0,842
1,073
-
Tabulka č. 1 Poměry exprese cílových genů mutp53 u vybraných glioblastomových linií
a výsledný vliv na transkripční aktivitu cílového genu. Z analýzy vyplývá, že pro další studie bychom preferenčně vybrali geny FRMD5, PPARGC1A, NRG1, JAK2, TGFBR2 a VEGFA, protože rozdíly v expresi těchto genů se výrazně lišily u linie s potlačenou expresí p53 (Usi 12) a linie mateřské (U251).
40
5. Diskuze Cílem experimentální části bylo analyzovat mechanismy působení mutp53 v glioblastomových liniích U251, Onda 10 a Onda 11 prostřednictvím analýzy stabilních klonů s potlačenou expresí mutp53. V prvním kroku bylo nutné linie získat, analyzovat a v dalším kroku navrhnout vhodné kandidátní geny, které by mohly být regulovány mutp53. K vytvoření stabilních linií s potlačenou expresí p53 byla provedena transfekce plazmidy pSuper-p53 (Brummelkamp TR et al., 2002) a pCI-neo (Brondyk, 1994). Plazmid pSuper zde sloužil jako prostředek k potlačení exprese p53 na proteinové úrovni, zatímco plazmid pCI-neo sloužil jako selekční marker k vytvoření stabilních klonů. Po transfekci jsme získali systémy linií, u kterých jsme následně analyzovali míru exprese p53 a úspěšnost integrace plazmidů pSuper a pCI-neo do genomu. Míru exprese p53 na proteinové úrovni jsme analyzovali u glioblastomových linií s různým statutem p53, a to konkrétně u základních linií U87 (wtp53) (Van Meir et al., 1994), Onda 10 (G245S) (Koga et al, 1996), Onda 11 (R273C) (Koga et al, 1996), U251 (R273H) (Van Meir et al., 1994) a linií odvozených, které obsahují stabilně integrovaný plazmid pSuper-p53: Usi 12 (shRNA) (Brázdová et al., 2009), Osi 10 (shRNA) (Brázdová et al., 2009) a Usi 16 (Brázdová et al., 2009). U linie U87 jsme potvrdili velice nízkou expresi p53, můžeme říci wtp53, díky práci kolegů, kteří kontrolovali její status na úrovni mRNA i genomové. Předpokládáme, že regulační mechanismy, typické pro nádorové linie s wtp53 zde fungují, a proto bez stresového signálu je hladina wtp53 velice nízká. Získané výsledky analýzy linií s mutp53 se shodovaly s předcházejícími pozorováními (Brázdová et al., 2009). U linie Usi 12 (shRNA) jsme pozorovali značnou redukci exprese proteinu p53 vzhledem k mateřské linii U251 (R273H) i po 4 letech od získání této linie. Ještě výraznější rozdíl jsme zaznamenali u systému Onda 11 (R273C) / Osi 10 (shRNA), kdy exprese p53 v mateřské linii silně převyšovala expresi proteinu v linii odvozené, zatímco kontrolní linie Usi 16 si zachovává relativně vysokou expresi p53. Z těchto výsledků vyplývá, že před 4 lety získané linie jsou charakteristické stále stabilní, velice nízkou, hladinou p53 (pro Usi 12 a Osi 10). Hlavním předmětem naší studie bylo získat podobně stabilní linie odvozené od glioblastomové linie Onda 10 nesoucí rozdílný typ mutace, a to G245S mutaci měnící
41
konformaci proteinu. Analýza exprese p53 na proteinové úrovni v linii Onda 10 a v odvozených klonech P1-37 byla provedena pomocí SDS-PAGE a imunodetekce. Nejnižší expresi p53, vzhledem k mateřské linii jsme zaznamenali u klonů P1, P17, P35, P34 a kontrolní linie ODS3. U klonu P34 jsme zároveň pozorovali nízký signál β-aktinu. Hladina exprese p53 klonu P17 byla dokonce potlačena až na 10 % hladiny p53 u původní linie Onda 10. V dalším kroku jsme ověřili integraci plazmidů pSuper-p53 a pCI-neo do genomu klonů odvozených od mateřské linie Onda 10 (G245S). Integrace plazmidu pCI-neo byla úspěšná v případě všech klonů. Při analýze integrace plazmidu pSuper poskytovaly nejlepší výsledky klony P17 a P34. U klonu P34 jsme zaznamenali malé množství plazmidu pSuper-p53, který ovšem neposkytoval při imunodetekci žádný signál. Z tohoto důvodu nelze rozhodnout, zda byla exprese p53 u tohoto klonu potlačena pomocí shRNA-p53 či nanesení malého množství celkového proteinu na gel SDS-PAGE. Za vhodného kandidáta pro další analýzy bylo možné považovat i klon P35, který ovšem obsahoval velmi malé množství plazmidu pSuper-p53, ale při imunodetekci poskytoval slabý signál p53, zároveň při silném signálu β-aktinu. Příčinou nízkého množství pSuper-p53 zde byl pravděpodobně nedostatek DNA templátu potřebného pro amplifikaci. Ostatní analyzované klony by bylo možné použít maximálně jako kontrolu, protože se nám u těchto klonů nepodařilo potlačit expresi p53. Jako kontrolní linie byly také vytvořeny klony ODS3 a ODS7, které měly úspěšně integrovaný plazmid pSuper (bez oblasti pro tvorbu shRNA proti p53). Získání stabilních linií P1-37 odvozených od linie Onda 10 bylo mnohem zdlouhavější, než u linií Usi 12 a Osi 10. Zároveň úroveň potlačení exprese p53 u klonů Usi 12 a Osi 10 je mnohem nižší, než u klonů odvozených od linie Onda 10. Linie U251 i Onda 11 obsahují mutaci v kodonu R273, zatímco linie Onda 10 nese mutaci v kodonu G245. Je možné, že jsme nezískali dostatečné množství stabilních klonů. Také je ale možné, že zde určitou roli může hrát právě druh mutace p53 či konformace proteinu. V předposlední části naší studie jsme se zabývali vlivem exprese mutp53 na onkogenní chování vybraných glioblastomových linií a s tím spojenou schopností buněk tvořit kolonie na měkkém agaru. Pro analýzu jsme použili linie U251 (R273H)/Usi 12 (shRNA), Onda 11 (R273C)/Osi 10 (shRNA), Onda 10 (G245S)/ klon P1. Zjistili jsme, že potlačení exprese p53 u vybraných glioblastomových linií snižuje jejich transformační potenciál. Zajímavá studie byla provedena skupinou Puca et al. 2007, kteří na měkkém agaru testovali transformační potenciál
glioblastomové linie U373MG (R273). 42
Potlačit tvorbu kolonií se jim podařilo reaktivací mutanta R273H treatmentem ZnCl2. Tato reaktivace zároveň zvýšila chemosenzitivitu U373MG. Na závěr jsme se věnovali výběru cílových/kandidátních genů mutp53, vhodných pro analýzu mechanismu působení mutp53 v glioblastomových liniích Onda 10 a Onda 11. Při návrhu jsme vycházeli z dat z DNA microarray analýz použitých pro článek Brázdová et al., 2009, kde byly srovnávány míry exprese genů u linie U251 (R273H) vzhledem k liniím Usi 12 (nízká hladina p53) či U251 vzhledem ke kontrolní linii Usi 16 (vysoká hladina p53). Pro tuto glioblastomovou linii je známo, že mutant p53R273H je lokalizován v jádře linie U251, kde se sekvenčně specificky váže na DNA a účastní se regulace genové transkripce. Výsledkem je buď inhibice, nebo stimulace transkripce cílového genu. Cílem naší analýzy bylo navrhnout cílové/kandidátní geny mutp53, které budou regulovány právě v systému U251/Usi 12, ale nebudou regulovány v systému U251/ Usi 16 a následně pak studovat expresi těchto kandidátních genů na našem modelu Onda10/P17 či Onda11 /Osi 10. Za vhodné zástupce z analyzovaných cílových genů mutp53 byla jednak vybrána pětice genů, publikovaných v Brázdová et al., 2009 (FRMD5, PPARGC1A, NRG1, TMEM108 a JAK2). Společným jmenovatelem pro všechny tyto geny je snížená transkripční aktivita v důsledku akumulace mutp53 v jádře. Geny FRMD5 a TMEM108 kódují transmembránové proteiny a u systému U251/ Usi 12/ Usi 16 byla exprese obou genů vyšší u linie Usi 12 (shRNA). To znamená, že v mateřské linii U251 (R273H) byla exprese těchto genů potlačena mutp53. V práci Brázdová et al., 2009 byl pozorován výrazný rozdíl v transkripční aktivitě u genů NRG1, PPARGC1A a JAK2. Gen NRG1 je zahrnutý do celé řady procesů spojených s vývojem nervové soustavy. Sekvenčně specifickou vazbou mutp53 dochází k inhibici transkripční aktivity tohoto genu. Stejně tomu je i u genu PPARGC1A, zahrnutého do regulace energetického metabolismu buněk (Brázdová et al., 2009). JAK2 kóduje specifickou tyrosin kinázu zapojenou do signálních drah spojených s receptory cytokinů. Transkripční aktivita byla u těchto genů až 2,3x vyšší u linie Usi 12 (shRNA), než v mateřské linii. Potlačení mutp53 tedy pro tyto geny znamenalo robustní zvýšení genové exprese. Míra exprese TMEM108, kódujícího další transmembránový protein již nebyla u linie Usi 12 tak vysoká, avšak pořád převyšovala expresi genu u mateřské linie. Jako zástupce genů zahrnutých do procesů angiogeneze a s ní spojeným šířením nádorů byl vybrán gen VEGFA. Khromova et al., 2009 zjistili, že zvýšená exprese hot-spot mutantů (R175H, R273H, R248W) podporovala vznik nových cév u střevního nádoru 43
a tím urychlila jejich růst. VEGFA je tedy genem, jehož transkripční aktivita je stimulována mutp53. Tento fakt byl potvrzen i v případě analyzovaného systému U251/ Usi 12/ Usi 16, kde exprese VEGFA byla výrazně nižší u linie Usi 12 (shRNA), což značí, že v mateřské linii byl tento gen stimulován. Z cílových genů popsaných v Brosh a Rotter 2009 jsme vybrali gen TGFBR2, který je reprimován mutp53. Z literatury je známo, že je tento gen zahrnutý do procesů zástavy buněčného cyklu, negativní regulace proliferace a aktivace drah vedoucích k buněčné smrti. Kalo et al., 2007 zjistili, že mutp53 potlačuje expresi tohoto genu. Ke stejnému výsledku jsme dospěli i v případě systému U251/ Usi 12/ Usi 16, kdy transkripční aktivita byla mnohonásobně vyšší v lini Usi 12 (shRNA), tím pádem v mateřské linii došlo k represi transkripční aktivity. S onkogenním chováním je často spojována také exprese genu PCNA. Deb et al., 1992 prokázali zvýšenou expresi PCNA u virů, transfekovaných vektory, díky kterým poté dochází k expresi mutp53. Exprese mutp53 vyvolala zvýšení transkripční aktivity PCNA. Tento gen může být regulován jak wtp53, tak mutp53. Zatímco wtp53 působí jako inhibitor transkripce, tak mutp53 působí opačným účinkem, kdy zvýšená transkripční aktivita vede k aktivaci buněčné proliferace. V našem analyzovaném systému U251/ Usi 12/ Usi 16 byla exprese PCNA poměrně vyrovnaná. Proto se k dalším analýzám nedoporučuje. Z analýzy dat z microarray vyplývá, že mezi geny vhodné pro další testování patří: PPARGC1A, FRMD5, NRG1, TMEM108, JAK2, TGFBR2 a VEGFA. Tento výčet genů je však jistě neúplný. Na základě získaných výsledků můžeme říci, že modelový systém Onda 10/P17, U251/Usi 12 a Onda 11/Osi 10 je vhodný pro analýzu kandidátních genů.
44
6. Závěr Soubor základních glioblastomových linií U87 (wtp53), Onda 11 (R273C), U251 (R273H) byl společně s liniemi odvozenými, Usi 12 (shRNA), Usi 16, Osi 10 (shRNA) podroben analýze exprese proteinu p53. Zjistili jsme, že původní linie si zachovaly poměrně vysokou expresi p53 ve srovnání s odvozenými liniemi Osi 10 a Usi 12 s potlačenou expresí p53. Vysokou hladinu exprese si zachovala také kontrolní linie Usi 16. U linie U87, exprimující wtp53 byla hladina p53 na nízké úrovni, na základě čeho můžeme spekulovat, že v těchto buňkách mohou být zachovány regulační mechanismy známé pro normální buňku. Hlavním cílem práce bylo získat linie s potlačenou expresí G245S odvozené od glioblastomové linie Onda 10. Tato linie byla transfekována plazmidy pSuper-p53 a pCIneo. Po selekci byly přeživší klony (P1-P37) podrobeny společně s mateřskou linií nejdříve analýze exprese p53 na proteinové úrovni a následně analýze integrace plazmidů pSuperp53 a pCI-neo do genomu vzniklých klonů. Nejnižší expresi p53 jsme zaznamenali u klonů P1, 17, 34 a 35, které jsme zároveň vybrali jako vhodné kandidáty pro další analýzy. Mezi projevy onkogenních mechanismů působení p53 v nádorové buňce patří podpora tumorigeneze. Proto jsme analyzovali chování našeho systému linií Onda 11 (R273C)/Osi 10 (shRNA), U251 (R273H)/Usi 12 (shRNA), Onda 10 (G245S)/ klon P1 v testu tvorby kolonií v měkkém agaru. Zjistili jsme, že u linií s potlačenou expresí mutp53 pomocí shRNA dochází ke snížení transformačního potenciálu vzhledem k mateřským liniím. Tedy linie Usi12, Osi10 a P1 vykazovaly výrazně snížený potenciál růstu v tomto médiu. Pro studium mechanismu účinku mutantních proteinů p53 na vznik a rozvoj glioblastomů jsme se pokusili navrhnout možné kandidátní geny, které mohou být v těchto buňkách řízeny mutp53. Z dostupných dat z DNA microarray u systému linií U251/Usi 12 /Usi 16 jsme pro další analýzy vybrali geny: TGFBR2, PPARGC1A, NRG1, FRMD5, JAK2, TMEM108 a VEGFA jejichž transkripční aktivita je regulována mutp53. Získané výsledky potvrzují onkogenní charakter mutp53 a příprava stabilních klonů by mohla pomoci pochopit mechanismy působení mutp53 např. prostřednictvím nalezení nových cílových genů.
45
7. Seznam použité literatury Adam Z., Vorlíček., Koptíková J. „Obecná onkologie a podpůrná léčba.“ 1. vydání. Praha: Grada Publishing, 2003. 787s. ISBN 80-247-0677-6 Adimoolam, Shanthi, and James M Ford. “P53 and DNA Damage-inducible Expression of the Xeroderma Pigmentosum Group C Gene.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, no. 20 (October 1, 2002): 12985–12990. Appella, E, and C W Anderson. “Post-translational Modifications and Activation of P53 by Genotoxic Stresses.” European Journal of Biochemistry / FEBS 268, no. 10 (May 2001): 2764–2772. Di Agostino, Silvia, Sabrina Strano, Velia Emiliozzi, Valentina Zerbini, Marcella Mottolese, Ada Sacchi, Giovanni Blandino, and Giulia Piaggio. “Gain of Function of Mutant P53: The Mutant p53/NF-Y Protein Complex Reveals an Aberrant Transcriptional Mechanism of Cell Cycle Regulation.” Cancer Cell 10, no. 3 (September 2006): 191–202. Arias-Lopez, Carmen, Iciar Lazaro-Trueba, Peter Kerr, Christopher J Lord, Tim Dexter, Marjan Iravani, Alan Ashworth, and Augusto Silva. “P53 Modulates Homologous Recombination by Transcriptional Regulation of the RAD51 Gene.” EMBO Reports 7, no. 2 (February 2006): 219–224. Baptiste, Nicole, Philip Friedlander, Xinbin Chen, and Carol Prives. “The Proline-rich Domain of P53 Is Required for Cooperation with Anti-neoplastic Agents to Promote Apoptosis of Tumor Cells.” Oncogene 21, no. 1 (January 3, 2002): 9–21. Bargonetti, J, A Chicas, D White, and C Prives. “P53 Represses Sp1 DNA Binding and HIV-LTR Directed Transcription.” Cellular and Molecular Biology (Noisy-LeGrand, France) 43, no. 7 (November 1997): 935–949. Bensaad, Karim, Atsushi Tsuruta, Mary A Selak, M Nieves Calvo Vidal, Katsunori Nakano, Ramon Bartrons, Eyal Gottlieb, and Karen H Vousden. “TIGAR, a P53inducible Regulator of Glycolysis and Apoptosis.” Cell 126, no. 1 (July 14, 2006): 107– 120. Bergamaschi, Daniele, Milena Gasco, Louise Hiller, Alexandra Sullivan, Nelofer Syed, Giuseppe Trigiante, Isik Yulug, et al. “P53 Polymorphism Influences Response in Cancer Chemotherapy via Modulation of P73-dependent Apoptosis.” Cancer Cell 3, no. 4 (April 2003): 387–402. Bertheau, Philippe, Marc Espié, Elisabeth Turpin, Jacqueline Lehmann, LouisFrançois Plassa, Mariana Varna, Anne Janin, and Hugues de Thé. “TP53 Status and Response to Chemotherapy in Breast Cancer.” Pathobiology: Journal of Immunopathology, Molecular and Cellular Biology 75, no. 2 (2008): 132–139. Bode, Ann M, and Zigang Dong. “Post-translational Modification of P53 in Tumorigenesis.” Nature Reviews. Cancer 4, no. 10 (October 2004): 793–805. 46
Bourdon, Jean-Christophe, Kenneth Fernandes, Fiona Murray-Zmijewski, Geng Liu, Alexandra Diot, Dimitris P Xirodimas, Mark K Saville, and David P Lane. “P53 Isoforms Can Regulate P53 Transcriptional Activity.” Genes & Development 19, no. 18 (September 15, 2005): 2122–2137. Brady, Colleen A, and Laura D Attardi. “P53 at a Glance.” Journal of Cell Science 123, no. Pt 15 (August 1, 2010): 2527–2532. Brázdová, Marie, Timo Quante, Lars Tögel, Korden Walter, Christine Loscher, Vlastimil Tichý, Lenka Cincárová, Wolfgang Deppert, and Genrich V Tolstonog. “Modulation of Gene Expression in U251 Glioblastoma Cells by Binding of Mutant P53 R273H to Intronic and Intergenic Sequences.” Nucleic Acids Research 37, no. 5 (April 2009): 1486–1500. Brondyk B. “pCI and pSI mammalian expression vectors. ” Promega Notes Magazine. 1994;49:7–12. Brosh, Ran, and Varda Rotter. “When Mutants Gain New Powers: News from the Mutant P53 Field.” Nature Reviews. Cancer 9, no. 10 (October 2009): 701–713. Brummelkamp, Thijn R, René Bernards, and Reuven Agami. “A System for Stable Expression of Short Interfering RNAs in Mammalian Cells.” Science (New York, N.Y.) 296, no. 5567 (April 19, 2002): 550–553. Bullock, A N, and A R Fersht. “Rescuing the Function of Mutant P53.” Nature Reviews. Cancer 1, no. 1 (October 2001): 68–76. Bykov, Vladimir J N, Natalia Issaeva, Alexandre Shilov, Monica Hultcrantz, Elena Pugacheva, Peter Chumakov, Jan Bergman, Klas G Wiman, and Galina Selivanova. “Restoration of the Tumor Suppressor Function to Mutant P53 by a Low-molecular-weight Compound.” Nature Medicine 8, no. 3 (March 2002): 282–288. Bykov, Vladimir J N, Natalia Issaeva, Nicole Zache, Alexandre Shilov, Monica Hultcrantz, Jan Bergman, Galina Selivanova, and Klas G Wiman. “Reactivation of Mutant P53 and Induction of Apoptosis in Human Tumor Cells by Maleimide Analogs.” The Journal of Biological Chemistry 280, no. 34 (August 26, 2005): 30384–30391. Cadwell, C, and G P Zambetti. “The Effects of Wild-type P53 Tumor Suppressor Activity and Mutant P53 Gain-of-function on Cell Growth.” Gene 277, no. 1–2 (October 17, 2001): 15–30. Caron de Fromentel, C, N Gruel, C Venot, L Debussche, E Conseiller, C Dureuil, J L Teillaud, B Tocque, and L Bracco. “Restoration of Transcriptional Activity of P53 Mutants in Human Tumour Cells by Intracellular Expression of Anti-p53 Single Chain Fv Fragments.” Oncogene 18, no. 2 (January 14, 1999): 551–557.
47
Deb, S, C T Jackson, M A Subler, and D W Martin. “Modulation of Cellular and Viral Promoters by Mutant Human P53 Proteins Found in Tumor Cells.” Journal of Virology 66, no. 10 (October 1992): 6164–6170. Deyoung, M P, and L W Ellisen. “P63 and P73 in Human Cancer: Defining the Network.” Oncogene 26, no. 36 (August 9, 2007): 5169–5183. el-Deiry, W S, S E Kern, J A Pietenpol, K W Kinzler, and B Vogelstein. “Definition of a Consensus Binding Site for P53.” Nature Genetics 1, no. 1 (April 1992): 45–49. Eliyahu, D, A Raz, P Gruss, D Givol, and M Oren. “Participation of P53 Cellular Tumour Antigen in Transformation of Normal Embryonic Cells.” Nature 312, no. 5995 (December 13, 1984): 646–649. Feng, Zhaohui, Haiyan Zhang, Arnold J Levine, and Shengkan Jin. “The Coordinate Regulation of the P53 and mTOR Pathways in Cells.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, no. 23 (June 7, 2005): 8204– 8209. Finlay, C A, P W Hinds, and A J Levine. “The P53 Proto-oncogene Can Act as a Suppressor of Transformation.” Cell 57, no. 7 (June 30, 1989): 1083–1093. Freeman, Daniel J, Andrew G Li, Gang Wei, Heng-Hong Li, Nathalie Kertesz, Ralf Lesche, Andrew D Whale, et al. “PTEN Tumor Suppressor Regulates P53 Protein Levels and Activity Through Phosphatase-dependent and -independent Mechanisms.” Cancer Cell 3, no. 2 (February 2003): 117–130. Funk, W D, D T Pak, R H Karas, W E Wright, and J W Shay. “A Transcriptionally Active DNA-binding Site for Human P53 Protein Complexes.” Molecular and Cellular Biology 12, no. 6 (June 1992): 2866–2871. Gaiddon, C, M Lokshin, J Ahn, T Zhang, and C Prives. “A Subset of Tumor-derived Mutant Forms of P53 Down-regulate P63 and P73 Through a Direct Interaction with the P53 Core Domain.” Molecular and Cellular Biology 21, no. 5 (March 2001): 1874–1887. Gibbs, E, Z Kelman, J M Gulbis, M O’Donnell, J Kuriyan, P M Burgers, and J Hurwitz. “The Influence of the Proliferating Cell Nuclear Antigen-interacting Domain of p21(CIP1) on DNA Synthesis Catalyzed by the Human and Saccharomyces Cerevisiae Polymerase Delta Holoenzymes.” The Journal of Biological Chemistry 272, no. 4 (January 24, 1997): 2373–2381. Goh, Amanda M, Cynthia R Coffill, and David P Lane. “The Role of Mutant P53 in Human Cancer.” The Journal of Pathology (September 27, 2010). Gu, Jijie, Hidehiko Kawai, Linghu Nie, Hiroyuki Kitao, Dmitri Wiederschain, Aart G Jochemsen, John Parant, Guillermina Lozano, and Zhi-Min Yuan. “Mutual Dependence of MDM2 and MDMX in Their Functional Inactivation of P53.” The Journal of Biological Chemistry 277, no. 22 (May 31, 2002): 19251–19254.
48
Gualberto, A, and A S Baldwin Jr. “P53 and Sp1 Interact and Cooperate in the Tumor Necrosis Factor-induced Transcriptional Activation of the HIV-1 Long Terminal Repeat.” The Journal of Biological Chemistry 270, no. 34 (August 25, 1995): 19680–19683. Guarneri, Valentina, Kristine Broglio, Shu-Wan Kau, Massimo Cristofanilli, Aman U Buzdar, Vicente Valero, Thomas Buchholz, et al. “Prognostic Value of Pathologic Complete Response After Primary Chemotherapy in Relation to Hormone Receptor Status and Other Factors.” Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology 24, no. 7 (March 1, 2006): 1037–1044. Guimaraes, D P, and P Hainaut. “TP53: a Key Gene in Human Cancer.” Biochimie 84, no. 1 (January 2002): 83–93. Hahn, W C, C M Counter, A S Lundberg, R L Beijersbergen, M W Brooks, and R A Weinberg. “Creation of Human Tumour Cells with Defined Genetic Elements.” Nature 400, no. 6743 (July 29, 1999): 464–468. Hanahan, D, and R A Weinberg. “The Hallmarks of Cancer.” Cell 100, no. 1 (January 7, 2000): 57–70. Haupt, Y, R Maya, A Kazaz, and M Oren. “Mdm2 Promotes the Rapid Degradation of P53.” Nature 387, no. 6630 (May 15, 1997): 296–299. Hermeking, Heiko. “P53 Enters the microRNA World.” Cancer Cell 12, no. 5 (November 2007): 414–418. Horvath, Monica M, Xuting Wang, Michael A Resnick, and Douglas A Bell. “Divergent Evolution of Human P53 Binding Sites: Cell Cycle Versus Apoptosis.” PLoS Genetics 3, no. 7 (July 2007): e127. Chan, Wan Mui, Wai Yi Siu, Anita Lau, and Randy Y C Poon. “How Many Mutant P53 Molecules Are Needed to Inactivate a Tetramer?” Molecular and Cellular Biology 24, no. 8 (April 2004): 3536–3551. Chang, Chun-Ju, Daniel J Freeman, and Hong Wu. “PTEN Regulates Mdm2 Expression Through the P1 Promoter.” The Journal of Biological Chemistry 279, no. 28 (July 9, 2004): 29841–29848. Chen, Jiguo, and Ivan Sadowski. “Identification of the Mismatch Repair Genes PMS2 and MLH1 as P53 Target Genes by Using Serial Analysis of Binding Elements.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, no. 13 (March 29, 2005): 4813–4818. Chin, K V, K Ueda, I Pastan, and M M Gottesman. “Modulation of Activity of the Promoter of the Human MDR1 Gene by Ras and P53.” Science (New York, N.Y.) 255, no. 5043 (January 24, 1992): 459–462. Iggo, R, K Gatter, J Bartek, D Lane, and A L Harris. “Increased Expression of Mutant Forms of P53 Oncogene in Primary Lung Cancer.” Lancet 335, no. 8691 (March 24, 1990): 675–679. 49
Jaiswal, A S, and S Narayan. “P53-dependent Transcriptional Regulation of the APC Promoter in Colon Cancer Cells Treated with DNA Alkylating Agents.” The Journal of Biological Chemistry 276, no. 21 (May 25, 2001): 18193–18199. Jin, Shengkan. “P53, Autophagy and Tumor Suppression.” Autophagy 1, no. 3 (December 2005): 171–173. Jin, Shunqian, Tong Tong, Wenhong Fan, Feiyue Fan, Michael J Antinore, Xiaocheng Zhu, Lucia Mazzacurati, et al. “GADD45-induced Cell Cycle G2-M Arrest Associates with Altered Subcellular Distribution of Cyclin B1 and Is Independent of P38 Kinase Activity.” Oncogene 21, no. 57 (December 12, 2002): 8696–8704. Joerger, A C, and A R Fersht. “Structure-function-rescue: The Diverse Nature of Common P53 Cancer Mutants.” Oncogene 26, no. 15 (April 2, 2007): 2226–2242. Joerger, Andreas C, and Alan R Fersht. “The Tumor Suppressor P53: From Structures to Drug Discovery.” Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2, no. 6 (June 2010): a000919. Kalo, Eyal, Yosef Buganim, Keren E Shapira, Hilla Besserglick, Naomi Goldfinger, Lilach Weisz, Perry Stambolsky, Yoav I Henis, and Varda Rotter. “Mutant P53 Attenuates the SMAD-dependent Transforming Growth Factor Beta1 (TGF-beta1) Signaling Pathway by Repressing the Expression of TGF-beta Receptor Type II.” Molecular and Cellular Biology 27, no. 23 (December 2007): 8228–8242. Kamal, Adeela, Lia Thao, John Sensintaffar, Lin Zhang, Marcus F Boehm, Lawrence C Fritz, and Francis J Burrows. “A High-affinity Conformation of Hsp90 Confers Tumour Selectivity on Hsp90 Inhibitors.” Nature 425, no. 6956 (September 25, 2003): 407–410. Khromova, N V, P B Kopnin, E V Stepanova, L S Agapova, and B P Kopnin. “P53 Hot-spot Mutants Increase Tumor Vascularization via ROS-mediated Activation of the HIF1/VEGF-A Pathway.” Cancer Letters 276, no. 2 (April 18, 2009): 143–151. Kieser, A, H A Weich, G Brandner, D Marmé, and W Kolch. “Mutant P53 Potentiates Protein Kinase C Induction of Vascular Endothelial Growth Factor Expression.” Oncogene 9, no. 3 (March 1994): 963–969. Kim, Ella, Willy Günther, Kimio Yoshizato, Hildegard Meissner, Srenja Zapf, Rolf M Nüsing, Hirotaka Yamamoto, Erwin G Van Meir, Wolfgang Deppert, and Alf Giese. “Tumor Suppressor P53 Inhibits Transcriptional Activation of Invasion Gene Thromboxane Synthase Mediated by the Proto-oncogenic Factor Ets-1.” Oncogene 22, no. 49 (October 30, 2003): 7716–7727. Knights, Chad D, Jason Catania, Simone Di Giovanni, Selen Muratoglu, Ricardo Perez, Amber Swartzbeck, Andrew A Quong, et al. “Distinct P53 Acetylation Cassettes Differentially Influence Gene-expression Patterns and Cell Fate.” The Journal of Cell Biology 173, no. 4 (May 22, 2006): 533–544.
50
Koga, H, S Zhang, K Washiyama, T Ichikawa, K Onda, and T Kumanishi. “Analysis of P53 Gene Mutations in Human Glioma Cell Lines.” Nōshuyō Byōri = Brain Tumor Pathology 13, no. 1 (April 1996): 1–10. Kopp, E B, and S Ghosh. “NF-kappa B and Rel Proteins in Innate Immunity.” Advances in Immunology 58 (1995): 1–27. Koshland, D E, Jr. “Molecule of the Year.” Science (New York, N.Y.) 262, no. 5142 (December 24, 1993): 1953. Koutsodontis, G, I Tentes, P Papakosta, A Moustakas, and D Kardassis. “Sp1 Plays a Critical Role in the Transcriptional Activation of the Human Cyclin-dependent Kinase Inhibitor p21(WAF1/Cip1) Gene by the P53 Tumor Suppressor Protein.” The Journal of Biological Chemistry 276, no. 31 (August 3, 2001): 29116–29125. Kress, M, E May, R Cassingena, and P May. “Simian Virus 40-transformed Cells Express New Species of Proteins Precipitable by Anti-simian Virus 40 Tumor Serum.” Journal of Virology 31, no. 2 (August 1979): 472–483. Lane, D P. “Cancer. P53, Guardian of the Genome.” Nature 358, no. 6381 (July 2, 1992): 15–16. Lane, D P, and L V Crawford. “T Antigen Is Bound to a Host Protein in SV40transformed Cells.” Nature 278, no. 5701 (March 15, 1979): 261–263. Lane, David, and Arnold Levine. “P53 Research: The Past Thirty Years and the Next Thirty Years.” Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2, no. 12 (December 2010): a000893. Levrero, M, V De Laurenzi, A Costanzo, J Gong, J Y Wang, and G Melino. “The P53/p63/p73 Family of Transcription Factors: Overlapping and Distinct Functions.” Journal of Cell Science 113 ( Pt 10) (May 2000): 1661–1670. Li, F P, J F Fraumeni Jr, J J Mulvihill, W A Blattner, M G Dreyfus, M A Tucker, and R W Miller. “A Cancer Family Syndrome in Twenty-four Kindreds.” Cancer Research 48, no. 18 (September 15, 1988): 5358–5362. Li, Yunqing, Fadila Guessous, Sherwin Kwon, Manish Kumar, Opeyemi Ibidapo, Lauren Fuller, Elizabeth Johnson, et al. “PTEN Has Tumor-promoting Properties in the Setting of Gain-of-function P53 Mutations.” Cancer Research 68, no. 6 (March 15, 2008): 1723–1731. Linzer, D I, and A J Levine. “Characterization of a 54K Dalton Cellular SV40 Tumor Antigen Present in SV40-transformed Cells and Uninfected Embryonal Carcinoma Cells.” Cell 17, no. 1 (May 1979): 43–52. Maiuri, M C, E Tasdemir, A Criollo, E Morselli, J M Vicencio, R Carnuccio, and G Kroemer. “Control of Autophagy by Oncogenes and Tumor Suppressor Genes.” Cell Death and Differentiation 16, no. 1 (January 2009): 87–93.
51
Maxwell, Steve A, and Gerald J Kochevar. “Identification of a P53-response Element in the Promoter of the Proline Oxidase Gene.” Biochemical and Biophysical Research Communications 369, no. 2 (May 2, 2008): 308–313. Mayo, Lindsey D, Jack E Dixon, Donald L Durden, Nickolas K Tonks, and David B Donner. “PTEN Protects P53 from Mdm2 and Sensitizes Cancer Cells to Chemotherapy.” The Journal of Biological Chemistry 277, no. 7 (February 15, 2002): 5484–5489. McLure, K G, and P W Lee. “How P53 Binds DNA as a Tetramer.” The EMBO Journal 17, no. 12 (June 15, 1998): 3342–3350. Midgley, C A, and D P Lane. “P53 Protein Stability in Tumour Cells Is Not Determined by Mutation but Is Dependent on Mdm2 Binding.” Oncogene 15, no. 10 (September 4, 1997): 1179–1189. Millau, Jean-François, Nathalie Bastien, and Régen Drouin. “P53 Transcriptional Activities: A General Overview and Some Thoughts.” Mutation Research/Reviews in Mutation Research 681, no. 2–3 (June 2009): 118–133. Moll, U M, A G Ostermeyer, R Haladay, B Winkfield, M Frazier, and G Zambetti. “Cytoplasmic Sequestration of Wild-type P53 Protein Impairs the G1 Checkpoint After DNA Damage.” Molecular and Cellular Biology 16, no. 3 (March 1996): 1126–1137. Muller, P, R Hrstka, D Coomber, D P Lane, and B Vojtesek. “Chaperone-dependent Stabilization and Degradation of P53 Mutants.” Oncogene 27, no. 24 (May 29, 2008): 3371–3383. Müller-Tiemann, B F, T D Halazonetis, and J J Elting. “Identification of an Additional Negative Regulatory Region for P53 Sequence-specific DNA Binding.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, no. 11 (May 26, 1998): 6079–6084. Murray-Zmijewski, F, D P Lane, and J-C Bourdon. “P53/p63/p73 Isoforms: An Orchestra of Isoforms to Harmonise Cell Differentiation and Response to Stress.” Cell Death and Differentiation 13, no. 6 (June 2006): 962–972. Nakano, K, and K H Vousden. “PUMA, a Novel Proapoptotic Gene, Is Induced by P53.” Molecular Cell 7, no. 3 (March 2001): 683–694. Nie, Linghu, Mark Sasaki, and Carl G Maki. “Regulation of P53 Nuclear Export Through Sequential Changes in Conformation and Ubiquitination.” The Journal of Biological Chemistry 282, no. 19 (May 11, 2007): 14616–14625. Nicholls, Chris D, Kevin G McLure, Michael A Shields, and Patrick W K Lee. “Biogenesis of P53 Involves Cotranslational Dimerization of Monomers and Posttranslational Dimerization of Dimers. Implications on the Dominant Negative Effect.” The Journal of Biological Chemistry 277, no. 15 (April 12, 2002): 12937–12945.
52
Oda, K, H Arakawa, T Tanaka, K Matsuda, C Tanikawa, T Mori, H Nishimori, et al. “p53AIP1, a Potential Mediator of P53-dependent Apoptosis, and Its Regulation by Ser46-phosphorylated P53.” Cell 102, no. 6 (September 15, 2000): 849–862. Okorokov, Andrei L, Carlos P Rubbi, Su Metcalfe, and Jo Milner. “The Interaction of P53 with the Nuclear Matrix Is Mediated by F-actin and Modulated by DNA Damage.” Oncogene 21, no. 3 (January 17, 2002): 356–367. Van Meir, E G, T Kikuchi, M Tada, H Li, A C Diserens, B E Wojcik, H J Huang, T Friedmann, N de Tribolet, and W K Cavenee. “Analysis of the P53 Gene and Its Expression in Human Glioblastoma Cells.” Cancer Research 54, no. 3 (February 1, 1994): 649–652. Olive, Kenneth P, David A Tuveson, Zachary C Ruhe, Bob Yin, Nicholas A Willis, Roderick T Bronson, Denise Crowley, and Tyler Jacks. “Mutant P53 Gain of Function in Two Mouse Models of Li-Fraumeni Syndrome.” Cell 119, no. 6 (December 17, 2004): 847–860. Olivier, M, A Petitjean, V Marcel, A Pétré, M Mounawar, A Plymoth, C C de Fromentel, and P Hainaut. “Recent Advances in P53 Research: An Interdisciplinary Perspective.” Cancer Gene Therapy 16, no. 1 (January 2009): 1–12. Olivier, Magali, David E Goldgar, Nayanta Sodha, Hiroko Ohgaki, Paul Kleihues, Pierre Hainaut, and Rosalind A Eeles. “Li-Fraumeni and Related Syndromes: Correlation Between Tumor Type, Family Structure, and TP53 Genotype.” Cancer Research 63, no. 20 (October 15, 2003): 6643–6650. Olivier, Magali, Monica Hollstein, and Pierre Hainaut. “TP53 Mutations in Human Cancers: Origins, Consequences, and Clinical Use.” Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2, no. 1 (January 2010): a001008. Olsson, A, C Manzl, A Strasser, and A Villunger. “How Important Are Posttranslational Modifications in P53 for Selectivity in Target-gene Transcription and Tumour Suppression?” Cell Death and Differentiation 14, no. 9 (September 2007): 1561–1575. Oltvai, Z N, C L Milliman, and S J Korsmeyer. “Bcl-2 Heterodimerizes in Vivo with a Conserved Homolog, Bax, That Accelerates Programmed Cell Death.” Cell 74, no. 4 (August 27, 1993): 609–619. Parada, L F, H Land, R A Weinberg, D Wolf, and V Rotter. “Cooperation Between Gene Encoding P53 Tumour Antigen and Ras in Cellular Transformation.” Nature 312, no. 5995 (December 13, 1984): 649–651. Peng, Y, L Chen, C Li, W Lu, and J Chen. “Inhibition of MDM2 by Hsp90 Contributes to Mutant P53 Stabilization.” The Journal of Biological Chemistry 276, no. 44 (November 2, 2001): 40583–40590. Petitjean, Audrey, Ewy Mathe, Shunsuke Kato, Chikashi Ishioka, Sean V Tavtigian, Pierre Hainaut, and Magali Olivier. “Impact of Mutant P53 Functional Properties on
53
TP53 Mutation Patterns and Tumor Phenotype: Lessons from Recent Developments in the IARC TP53 Database.” Human Mutation 28, no. 6 (June 2007): 622–629. Polyak, K, Y Xia, J L Zweier, K W Kinzler, and B Vogelstein. “A Model for P53induced Apoptosis.” Nature 389, no. 6648 (September 18, 1997): 300–305. Puca, Rosa, Lavinia Nardinocchi, Manuela Porru, Amos J Simon, Gideon Rechavi, Carlo Leonetti, David Givol, and Gabriella D’Orazi. “Restoring P53 Active Conformation by Zinc Increases the Response of Mutant P53 Tumor Cells to Anticancer Drugs.” Cell Cycle (Georgetown, Tex.) 10, no. 10 (May 15, 2011): 1679–1689. Rotter, V, H Abutbul, and A Ben-Ze’ev. “P53 Transformation-related Protein Accumulates in the Nucleus of Transformed Fibroblasts in Association with the Chromatin and Is Found in the Cytoplasm of Non-transformed Fibroblasts.” The EMBO Journal 2, no. 7 (1983): 1041–1047. Rowan, S, R L Ludwig, Y Haupt, S Bates, X Lu, M Oren, and K H Vousden. “Specific Loss of Apoptotic but Not Cell-cycle Arrest Function in a Human Tumor Derived P53 Mutant.” The EMBO Journal 15, no. 4 (February 15, 1996): 827–838. Samuels-Lev, Y, D J O’Connor, D Bergamaschi, G Trigiante, J K Hsieh, S Zhong, I Campargue, L Naumovski, T Crook, and X Lu. “ASPP Proteins Specifically Stimulate the Apoptotic Function of P53.” Molecular Cell 8, no. 4 (October 2001): 781–794. Shaulsky, G, A Ben-Ze’ev, and V Rotter. “Subcellular Distribution of the P53 Protein During the Cell Cycle of Balb/c 3T3 Cells.” Oncogene 5, no. 11 (November 1990): 1707– 1711. Shaulsky, G, N Goldfinger, A Ben-Ze’ev, and V Rotter. “Nuclear Accumulation of P53 Protein Is Mediated by Several Nuclear Localization Signals and Plays a Role in Tumorigenesis.” Molecular and Cellular Biology 10, no. 12 (December 1990): 6565–6577. Shvarts, A, W T Steegenga, N Riteco, T van Laar, P Dekker, M Bazuine, R C van Ham, et al. “MDMX: a Novel P53-binding Protein with Some Functional Properties of MDM2.” The EMBO Journal 15, no. 19 (October 1, 1996): 5349–5357. Sigal, A, and V Rotter. “Oncogenic Mutations of the P53 Tumor Suppressor: The Demons of the Guardian of the Genome.” Cancer Research 60, no. 24 (December 15, 2000): 6788–6793. Song, Hoseok, Monica Hollstein, and Yang Xu. “P53 Gain-of-function Cancer Mutants Induce Genetic Instability by Inactivating ATM.” Nature Cell Biology 9, no. 5 (May 2007): 573–580. Soussi, T. “P53 Alterations in Human Cancer: More Questions Than Answers.” Oncogene 26, no. 15 (April 2, 2007): 2145–2156. Stambolic, V, D MacPherson, D Sas, Y Lin, B Snow, Y Jang, S Benchimol, and T W Mak. “Regulation of PTEN Transcription by P53.” Molecular Cell 8, no. 2 (August 2001): 317–325. 54
Sun, Wanpeng, and Jian Yang. “Functional Mechanisms for Human Tumor Suppressors.” Journal of Cancer 1 (2010): 136–140. Terzian, Tamara, Young-Ah Suh, Tomoo Iwakuma, Sean M Post, Manja Neumann, Gene A Lang, Carolyn S Van Pelt, and Guillermina Lozano. “The Inherent Instability of Mutant P53 Is Alleviated by Mdm2 or p16INK4a Loss.” Genes & Development 22, no. 10 (May 15, 2008): 1337–1344. Toledo, Franck, and Geoffrey M Wahl. “Regulating the P53 Pathway: In Vitro Hypotheses, in Vivo Veritas.” Nature Reviews. Cancer 6, no. 12 (December 2006): 909– 923. Wang, Y, M Reed, P Wang, J E Stenger, G Mayr, M E Anderson, J F Schwedes, and P Tegtmeyer. “P53 Domains: Identification and Characterization of Two Autonomous DNA-binding Regions.” Genes & Development 7, no. 12B (December 1993): 2575–2586. Wegele, H, L Müller, and J Buchner. “Hsp70 and Hsp90--a Relay Team for Protein Folding.” Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 151 (2004): 1–44. Wei, Chia-Lin, Qiang Wu, Vinsensius B Vega, Kuo Ping Chiu, Patrick Ng, Tao Zhang, Atif Shahab, et al. “A Global Map of P53 Transcription-factor Binding Sites in the Human Genome.” Cell 124, no. 1 (January 13, 2006): 207–219. Weisz, Lilach, Alexander Damalas, Michalis Liontos, Panagiotis Karakaidos, Giulia Fontemaggi, Revital Maor-Aloni, Marina Kalis, et al. “Mutant P53 Enhances Nuclear Factor kappaB Activation by Tumor Necrosis Factor Alpha in Cancer Cells.” Cancer Research 67, no. 6 (March 15, 2007): 2396–2401. Zhu, J, J Jiang, W Zhou, K Zhu, and X Chen. “Differential Regulation of Cellular Target Genes by P53 Devoid of the PXXP Motifs with Impaired Apoptotic Activity.” Oncogene 18, no. 12 (March 25, 1999): 2149–2155.
55
