4 1 (http://www.tools.neb.com/NEBcutter2/htm). Analisis kesamaan, filogenetik, dan profil berdasarkan urutan nukleotida dan deduksi asam amino dengan Mt2 dari spesies lain menggunakan program MAFFT ver.6.0. (http://align.bmr.kyushu-.ac.jp/mafft/online/ server/) (Katoh et al. 2005). Analisis urutan nukleotida untuk mencari ORF (open reading frame) menggunakan program BESTORF (http://www.softberry/bestorf/). Analisis domain terkonservasi pada cDNA MmMt2 menggunakan program conserved domain NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ structure/cdd/wrpsb.cgi).
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi RNA total dari daun RNA total dari M. malabatrichum berhasil diisolasi dari daun muda. Kuantifikasi RNA total dengan spektrofotometer pada λ260 menunjukkan bahwa total RNA yang berhasil diisolasi berkisar antara 242-360 µg setiap gram bahan tanaman (Tabel 1). Tabel 1 Hasil isolasi RNA total No
Bahan
Absorban pada λ260
1
2 3
0.5 g daun muda (MD1) 0.5 g daun muda (MD2) 0.5 g daun muda (MD3)
0.451
λ280 0.265
Rasio λ260/ λ280
Total RNA (µg/g sampel)
1.70
360.4
2
3
28S 18S Gambar 2 Elektroforesis RNA total dari daun muda MD1 (1), MD2 (2), dan MD3 (3).
Sintesis cDNA PCR dengan primer spesifik gen aktin digunakan sebagai kontrol untuk melihat keberhasilan sintesis cDNA dan kemurnian RNA total dari hasil reaksi RT. PCR dengan menggunakan primer untuk ekson1-ekson2 dari gen aktin (ActF dan ActR) dan menggunakan cetakan cDNA, menghasilkan pita DNA yang berukuran sekitar 450 pb (Gambar 3). M 1 2 3 450 pb
Gambar 3 Hasil PCR aktin menggunakan cDNA total MD1 (1), MD2 (2), dan MD3 (3) sebagai cetakan.
Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2 dengan primer spesifik Amplifikasi fragmen cDNA MmMt2 dilakukan dengan menggunakan cDNA total dari daun (cDNA MD2) sebagai cetakan dan primer spesifik Mt2F dan Mt2R. Hasilnya ialah satu fragmen cDNA yang berukuran sekitar 250 pb (Gambar 4). M MmMt2
0.303
0.162
1.87
242.4
0.315
0.190
1.66
252.0
Kualitas RNA total dianalisis dengan melakukan elektroforesis di gel agarosa terdenaturasi oleh formaldehida dengan buffer MOPS 1x. Hasil elektroforesis tersebut menunjukkan adanya 2 pita dominan yang merupakan RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S (Gambar 2).
250 pb Gambar
4
Fragmen MmMt2 hasil PCR menggunakan cDNA MD2 sebagai cetakan.
Pengklonan cDNA MmMt2 ke dalam pGEM®-T Easy Setelah 16 jam di media seleksi, E.coli yang ditransformasi dengan hasil ligasi antara pGEM®-T Easy dan cDNA MmMt2 menghasilkan koloni putih dan biru (Gambar 5).
15
koloni putih koloni biru Gambar
5
1 M
Koloni E. coli DH5α yang ditransformasi dengan hasil ligasi pGEM®-T Easy dan cDNA MmMt2 yang tumbuh di media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG.
cDNA MmMt2 yang menyisip pada pGEM®-T Easy di dalam koloni E. coli putih dikonfirmasi dengan PCR yang selanjutnya disebut PCR koloni. PCR koloni terhadap koloni putih menghasilkan fragmen berukuran sekitar 250 pb yang sama dengan cDNA MmMt2 hasil isolasi dengan PCR (Gambar 6A). Selain itu, konfirmasi cDNA sisipan juga dilakukan dengan pemotongan DNA plasmid rekombinan yang telah Analisis cDNA MmMt2 Berdasarkan urutan nukleotida dari kodon awal (ATG) sampai dengan kodon akhir, diperoleh cDNA MmMt2 yang 1
diisolasi dari koloni putih menggunakan enzim EcoR1 yang mengapit daerah penyisipan. Pemotongan tersebut menghasilkan dua fragmen yaitu fragmen berukuran sekitar 3000 pb yang merupakan vektor pGEM®-T Easy dan fragmen berukuran sekitar 250 pb (Gambar 6B). M
2 3000 pb
250 pb
250 pb A
B
Gambar 6 Hasil analisis sisipan cDNA MmMt2 dengan PCR koloni (A) dan pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan EcoR1 (B).
berukuran 246 pb ORF yang menyandikan 81 asam amino dengan 14 Cys (Gambar 7).
1
ATG TCT TGC TGT GGA GGA AAC TGC GGA TGT GGA TCT GGC TGC AAG Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Lys
45 15
46 16
TGC GGC AAC GGT TGT GGA GGT TGC AAA ATG TAC CCT GAC TTG GGA Cys Gly Asn Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Leu Gly
90 30
91 31
TTC TCC GGC GAG ACA ACC ACA ACT GAG ACT TTT GTC TTG GGC GTT Phe Ser Gly Glu Thr Thr Thr Thr Glu Thr Phe Val Leu Gly Val
135 45
136 46
GCA CCG GCG ATG AAG AAT CAG TAC GAG GCT TCA GGG GAG AGT AAC Ala Pro Ala Met Lys Asn Gln Tyr Glu Ala Ser Gly Glu Ser Asn
180 60
181 61
AAC GCT GAG AAC GAT GCT TGC AAG TGT GGA TCT GAC TGC AAG TGT Asn Ala Glu Asn Asp Ala Cys Lys Cys Gly Ser Asp Cys Lys Cys
225 75
226 76
GAT CCT TGC ACC TGC AAG TGA Asp Pro Cys Thr Cys Lys End
246
Gambar 7 Urutan nukleotida cDNA MmMt2 dari kodon awal (ATG) sampai dengan kodon akhir serta deduksi asam aminonya.
Analisis keberadaan situs pemotongan enzim restriksi pada cDNA MmMt2 menunjukkan bahwa pada cDNA MmMt2 mempunyai situs BbvI, BsaBI, BtsCI, TseI, FokI, ApeKI, CspCI, HpyCH4III, PshAI,
BsrFI, SgrAI, AcuI, BtgZI, MboII, SfaNI, Cac8I, danHpy188I (Gambar 8). Selain itu, tidak ada situs restriksi yang terdapat pada situs multi pengklonan (MCS: multiple cloning sites). sites sites sites sites sites).
6 2
Gambar 8 Peta restriksi yang terdapat pada cDNA MmMt2.
Berdasarkan hasil analisis kesejajaran lokal dengan program BLAST (Lampiran 4 dan 5), diambil Mt2 dari beberapa spesies yang memiliki tingkat kesamaan (max indent) lebih dari 70% termasuk MaMt2 dan GmMt2 (kedelai kultivar Slamet) untuk penyusunan pohon filogenetik berdasarkan kesamaan urutan nukleotida Mt2 dan deduksi asam aminonya (Gambar 9 dan Gambar 10). Berdasarkan pohon filogenetik tersebut, cDNA MmMt2 memiliki kekerabatan yang sangat dekat dengan AtMt2A dari Arabidopsis
thaliana, MaMt2 dari M. affine, GmMt2 dari kedelai kultivar Slamet, BjMt2 dari Brassica juncea, dan BoMt2 dari Brassica oleracea. Selanjutnya, kelima spesies yang sangat dekat kekerabatannya tersebut dianalisis perbandingan motif asam amino Cys-nya (Tabel 2) dan profil domain (Gambar 11). MmMT2, AtMT2A, MaMT2, dan GmMT2 dimasukkan dalam satu kelompok (selanjutnya disebut kelompok MmMT2) karena memiliki kesamaan urutan nukleotida dan asam amino. dan asam amino.
Gambar 9 Pohon filogenetik berdasarkan urutan nukleotida dari Mt2 berbagai spesies.
27
Gambar 10 Pohon filogenetik berdasarkan urutan asam amino dari MT2 berbagai spesies.
Tabel 2 Perbandingan ORF dan motif asam amino Cys pada kelompok MmMT2 (MmMT2 dari M. malabatrichum, AtMT2A dari A. thaliana, MaMT2 dari M. affine, dan GmMT2 dari kedelai kultivar Slamet), BjMT2 dari B. juncea, dan BoMT2 dari B. oleracea
Kelompok MmMT2
BjMT2
BoMT2
ORF aa 1 1 fragment(s) 1 – 246 1 aa MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGETTTTETF ** *x* *x* *xx* VLGVAPAMKNQYEASGESNNAENDACKCGSDCKCDPCTCK*x* *x* *x* ORF aa 1 1 fragment(s) 1 – 243 80 aa MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGESTTTETF ** *x* *x* *xx* VFGVAPAMKNQYEASGEGVAENDACKCGSDCKCDPCTCK*x* *x* *x* ORF aa 1 1 fragment(s) 1 – 243 80 aa MSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGELTTTETF ** *x* *x* *xx* VFGVAPTMKNQHEASGEGVAENDACKCGSDCKCDPCTCE*x* *x* *x*
38
1 2 Gambar 11 Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara MmMT2, MaMT2, GmMT2, dan AtMT2A (1); serta BjMT2 dan BoMT2 (2).
Pembahasan RNA total yang diisolasi dalam penelitian ini mempunyai kemurnian dari kontaminan protein yang baik karena mempunyai rasio OD260/OD280 berkisar antara 1.66 dan 1.87. Menurut Saunders & Parker (1999), rasio OD260/OD280 sebesar 1.8 sampai 2.0 menunjukkan RNA total yang diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi. Berdasarkan rasio tersebut, maka MD2 yang mempunyai tingkat kemurnian paling tinggi selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA total. Hasil elektroforesis RNA total (Gambar 2) menunjukkan adanya dua pita dominan. Hal ini menunjukkan bahwa RNA total mempunyai integritas yang baik. RNA total yang berhasil diisolasi digunakan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA melalui reaksi transkripsi balik (reverse transcription/RT). Oligo(dT) digunakan sebagai primer spesifik reaksi ini supaya hanya mRNA yang disintesis dan diamplifikasi menjadi cDNA karena ciri khas mRNA ialah memiliki ujung poli-A. PCR dengan primer spesifik gen aktin digunakan sebagai kontrol untuk melihat keberhasilan sintesis cDNA dan kemurnian RNA total dari kontaminan DNA genom. Amplifikasi DNA genom ekson1-ekson2 akan menghasilkan fragmen berukuran sekitar 600 pb karena intron yang terdapat antara ekson1 dan ekson2 ikut teramplifikasi. Teramplifikasinya cDNA dengan primer ActF dan ActR dengan ukuran 450 pb tersebut menunjukkan bahwa sintesis cDNA total melalui proses transkripsi balik telah berlangsung dengan baik. Hal ini juga membuktikan bahwa RNA total yang telah diisolasi mempunyai kualitas yang baik karena terbebas dari kontaminasi DNA genom. E. coli galur DH5α yang ditransformasi dengan hasil ligasi cDNA MmMt2 dengan pGEM®-T Easy diseleksi dalam media yang mengandung ampisilin, Xgal, dan IPTG. E. coli yang tumbuh dalam media seleksi tersebut disebut transforman
(mengandung vektor plasmid pGEM®-T Easy). Koloni E. coli putih ialah E. coli yang mengandung plasmid rekombinan (plasmid pGEM®-T Easy yang membawa cDNA MmMt2), sedangkan koloni biru ialah E. coli yang mengandung plasmid nonrekombinan (hanya mengandung plasmid pGEM®-T Easy) (Gambar 5). Gen lacZ menyandikan βgalaktosidase (β-gal) yang mengubah substrat X-gal menjadi berwarna biru. Bila cDNA MmMt2 berhasil menyisip pada gen lacZ, maka gen lacZ tidak dapat berekspresi sehingga muncul koloni E. coli yang berwarna putih. Bila tidak terdapat fragmen yang menyisip pada gen lacZ, maka gen lacZ akan berekspresi membentuk koloni berwarna biru. Pengurutan nukleotida terhadap cDNA MmMt2 dilakukan melalui dua arah menggunakan primer T7 dan SP6 (Lampiran 1). Berdasarkan keseluruhan urutan nukleotida, hanya bagian yang diapit oleh kodon awal (ATG) yang merupakan bagian dari primer Mt2F dan kodon akhir (TGA) yang merupakan bagian dari primer Mt2R, yang akan digunakan untuk analisis lebih lanjut. Analisis situs restriksi menunjukkan bahwa cDNA MmMt2 tidak mengandung situs yang terdapat pada MCS pGEM®-T Easy sehingga semua situs yang terdapat pada MCS dapat digunakan untuk mengeluarkan sisipan cDNA MmMt2 dari vektor pGEM®-T Easy. Analisis situs restriksi sangat penting untuk pemanfaatan cDNA ini dalam rekayasa genetika. Kesejajaran lokal nukleotida dan asam amino dianalisis menggunakan program BLAST. BLAST dapat digunakan sebagai alat untuk menentukan identitas suatu fragmen DNA yang belum diketahui berdasarkan tingkat homologi dengan gen atau fragmen DNA yang telah diketahui di GeneBank (Mount 2001). Hasil analisis kesejajaran lokal menunjukkan bahwa cDNA MmMt2 memiliki kesamaan 100% dengan
49
bagian AtMt2A (Nomor aksesi: NM111773) dan dengan bagian AtMt-K (U15108), 99% dengan bagian AtMt1 (X62818), 99% dengan bagian AtMt1G (D11394) dari Arabidopsis thaliana, 90% dengan bagian BjMt2 (Y10850 dari Brassica juncea, dan 88% dengan bagian BoMt (AF200712) dari B. oleracea. Analisis kesejajaran lokal cDNA MmMt2 berdasarkan nukleotida dengan BLASTn disajikan dalam Lampiran 3. Hasil analisis kesejajaran lokal berdasarkan peptida menunjukkan bahwa protein yang dideduksi dari cDNA MmMt2 (MmMT2) memiliki kesamaan 100% dengan bagian AtMT2A (P25860) dari A. thaliana, 95% dengan bagian BrMT2 (P69164) dari B. rapa, dan 95% dengan bagian BjMT2 (P69163) dari B. juncea. Analisis kesejajaran lokal peptida MmMT2 dengan BLASTp disajikan pada Lampiran 4. MmMt2 juga memiliki kesamaan urutan nukleotida dengan MaMt2 dari M. affine (Suharsono et al. in press) dan GmMt2 dari kedelai kultivar Slamet (Anwar 2008). Oleh karena urutan nukleotidanya sama, maka urutan asam amino MmMT2, AtMT2A, MaMT2, dan GmMT2 juga sama. Hal ini menunjukkan bahwa MmMT2 memiliki peranan yang sama dengan AtMT2A yaitu mengikat dan mendetoksifikasi logam berat serta membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman (Zhou & Goldsbrough 1995). Hasil deduksi asam amino dari cDNA MmMt2 (Tabel 2) menunjukkan bahwa motif urutan asam amino Cys pada MmMT2 terdiri atas Cys-Cys (residu 3-4), Cys-X-Cys (8-10, 14-16, 67-69, 73-75, 78-80) dan Cys-X-XCys (20-23). Ketiga motif tersebut merupakan tipikal komposisi Cys pada protein MT tipe 2 tanaman. Perbedaan MmMT2, BjMT2, dan BoMT2 terletak pada posisi motif Cys di dalam MT2. Pada BjMT2 dan BoMT2 posisinya ialah Cys-X-Cys (810, 14-16, 66-68, 72-74, 77-79). Analisis domain terkonservasi berfungsi untuk mengetahui pola konservasi dan perbedaan protein dalam evolusi molekular (Marchler-Bauer et al. 2002). Analisis domain konservasi terhadap MmMT2, MaMT2, GmMT2, dan AtMT2A (kelompok MmMT2), BjMT2, dan BoMT2 menunjukkan bahwa domain yang terkonservasi adalah dari asam amino ke-25 sampai dengan asam amino ke-79 walaupun mempunyai urutan yang berbeda (Gambar 11). Urutan asam amino kelompok MmMT2, BjMT2, dan BoMT2 termasuk ke dalam metallothionein 2 superfamily. Namun ada perbedaan letak metallothionein 2
superfamily pada dua kelompok urutan asam amino tersebut. Pada kelompok MmMT2, metallothionein 2 superfamily dijumpai pada asam amino ke-25 sampai urutan ke-80. Sedangkan pada BjMT2 dan BoMt2, metallothionein 2 superfamily dijumpai pada asam amino ke-25 sampai urutan ke-79.
SIMPULAN cDNA MmMt2 telah berhasil diisolasi dengan ukuran 246 pb dan menyandikan 81 asam amino. MmMt2 ini memiliki urutan nukleotida yang sama dengan AtMt2A dari A. thaliana, MaMt2 dari M. affine, dan GmMt2 dari kedelai kultivar Slamet. MmMT2 diduga memiliki peranan yang sama dengan AtMT2A yaitu mengikat dan mendetoksifikasi logam berat serta membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman.
SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui ekspresi MmMt2. cDNA MmMt2 yang telah berhasil diisolasi dapat digunakan sebagai pelacak yang digunakan dalam hibridisasi northern.
UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini didanai oleh DIPA Biotrop tahun 2005 dengan judul ”Construction of Genomic Library and Isolation of Gene Involved in the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma” dengan contract agreement No: 13.1/PSRP/SPPEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir. Suharsono, DEA.
DAFTAR PUSTAKA Anwar Y. 2008. Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi Metallothionein dari Kedelai Kultivar Slamet [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple and efficient method for isolation RNA from pine trees. Plant Mol Biol Rep 11:113-116.
